SI8011553A8 - Postopek za pripravo nonapeptidnih in dekapeptidnih derivatov hormonov za sproščanje luteinizirajočega hormona - Google Patents

Description

POSTUPAK ZA DOBIVANJE NONAPEPTIDNIH I DEKAPEPTIDNIH

DERIVATA HORMONA ZA OSLOBADJANJE LUTEINIZIRAJUČEG

HORMONA

Oblast tehnike u koju spada pronalazak

Pronalazak spada u oblast sinteze peptida i odnosi se na postupak za sintezu novih nonapeptidnih i dekappeptidnih derivata hormona za oslobadjanje luteinizirajučeg hormona

Tehnički problem

Tehnički problem koji je rešen predmetnim pronalaskom jeste postupak za dobivanje novih nonapeptidnih i dekapeptidnih derivata opšte formule (I) kao što je detaljno objašnjena u daljem tekstu. Derivati gornje formule (I) nisu dosada opisani u literaturi pa je i sam postupak nov i originalan.

Stanje tehnike

Ltftainltirajudi heKBN» <LS) 1 fellkul&rul otimulirajudi hormon (FSH) oelobadjaju ea is predajeg dela hipofize pod kontrolam hormona sa oslobadjanje LK-RH koji se proizvodi u regionu hipotalamusa. LK i FSH dajetvuju na polno čelije tako da stimulišu sintezu oteroldnih hornona i atimulišu ae zre vanje gameta. Pulsatllno oslobadjanje LH-RK, pa tako i oslobadjanje LH i FSH, kontroliSa reproduktivni ciklus kod domačih fivotinja i ljudi. Dalje, LS-RJ3 im efekta u placenti, u oalobadjaaju HCG, i direktno aa polnim )

dalijama. /tnalo»! agonist* LH-RH korisni so s« kontrolu plodnosti pornodu dva mehanisma dejstva. Hiška dosa analog LU-AM mogu atlaulisatl ovulacijo 1 korisna su sa tretiranja hipotalamusu* i ovulatorne plodnosti · Dopunski se »og koristiti s* hipogooadna stanja 1 inpotanciju, 1 stimuli3 spematogenesu 1 andogenu prolsvodnjn kod «uljaka. Parado slalno, veda dosa vrlo analnih 1 dngotrajnlh analoga I4B-R imaju suprotan efekat 1 blokira Ju ovulaolju kod Menki 1 po tlaku Ju sperma togeaesu kod nuljoka. V vesi sa ovim efek tima je potiski van je normalnih nivoa cirkulacije seksualnih steroida goaadaog porekla, ukljufiujudi i emoajlvanjo tetine pcsaodnog organa kod mul jaka i Kenki, Kod doiaadih Sivofcinja ova paradoksalen efekat proraovlMe porast tetine u situaoljaiaa tova, etirraliSe abortus kod gravldnih Sivotinja i ug lavnem, dejstvu j e kao sterilni stiaulant.

Priročni hromon koji oalobadja hormon LS-Ra je deka peptid koji ee sastoji od priročnih. «mino-kiselina (koje imaju L-kor.figuraciju iauzev ehlralne eslno-klaeline gllaina). Njegova sekvenca je eločeča» (piro) Glu-HiaTrp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-i31y^>->ai2. Proučevani su ratogi analogi ovog prirodnog materijala i pokesalo se je <2a Velika večina ovih ina nečovoljnu bioloSku aktivnost da bi bila kliniSki korisna. Poka salo se je da iarvssne izabrane modifikacijo iiaaju blogotvoran efekat na blloSku aktivnost. 'Ja lok o naj značajni ja modifikacija dobiva se dobiva neajanjun ostatka u S—poioSaju od Gly u D-a»ino kiselinu. Na primor, zamena Gly ostatka U 6-poloSaju aa £-Ala, b-Lcu, O-Phe iii fr-Trp vodila je do serija analoga LH—RH aa povečanezi aktivnofidu u vesi ea Idf-RH.

Vidi M. Monahan, et al, Blochesa*, 12, 4616 (1973) I aa /D Alaf/-LHRH; J. λ. Vilchaa-Martinaa, at al, Biochea. Bloghys« Rae. Cogan., S», 122« (1974) sa /O*lau⁶/LffiUi i daa«ly^l0/i>-L«u^e, Fro NHKt’/IJ»H/ o. I. Coy, at al,

J« kad, Cha»., 19, 423 (1976) »a */l>-Fha/LBRH/ i w„ vala, at al, Clinical Kndoerlnplogv, Sth Supp., Blackveell Salantlfla Fublioatlen«, Cteford, Raglaad (1976), p, 2615 and B. B, Ccy, at al; Bloeban, Blophys« Ras, c oren., «7,

57« (1979) sa /D-Trp*/I2ma.

Farad aufttlnekih povečanja ^e aktivnosti dobivenih gorsponanutl» eupatitucijnna α položaj« 6, dalja povečanja u aktivnosti oogu aa postldl ali&lalaaaje&i Gly-MH₂ u položaj’ 10 tako da ·© dobija nonapeptld kao alkil«, cikloalkil»

111 tluoroalkll«araid, 111 eaaencR Gly»BH₂ ·* alfa-asagllci aaldoou Vidi, na priiaer, M, Tujino, at al, Biochem, Slophya Ras« Ccmct., 49, S$3 (1972), O. H. Coy, ^et al, Blochea*. 14, 1848 (1975) I A. S. Outta, at al, J. Chara, Soc. Perkln I, 1979, 379.

Zenona &»rcfetil»leucina «mesto leuclnskog ostatka u položaju 7 vodi do povedane stabilnosti preša. en=imat3koj degradaciji. Vidi, na primer, H, Ilng et al, Biochem. Bigp Raa, Cesaa., 63, 801 (1975).

Zamana triptofanskog ostatka u položaju 3 sa 3»(l»nsf fcll)-.3>alaninop vodi do povečanja bioloSkc snage. Vidi, na priner, K. U. Pr acad. et al, J. Med. Chera., 19, 492 (1976) 1 Ϊ. Yabe, Chem. Phana. Buli., 24 (12), 3149 (197S)

Tlro«inski ostatak u položaju 5 ao&e ao ga&aniti aa fanllalaninosa ill 3- (l»penta£luorofenil)-L-nlnninou i

- 4 3Λ ouštinekim ladrSavanjan biološka aktivnosti. Vidi, na primer, N. fanaihata, «t al, Biochem, Elophya, Ran. Comeb., 16, 377 (1973).

Bilo bi poželjno da ee naprave dalji LH-R3 koji imaju čak i vedi etapen biološke aktivno«ti od ranije opisano 1 koji «e sw>gu koristiti kliaičkl aa livotinjaa» i ljp&teaa,

Opis rešenja tehničkog problema sa primerima izvodjenja *·

Sadašnji pronalazak se odnosi na postupak za dobivanje novih nonapeptidnih i dekapeptidnih derivata LH-RH. Odredjenije sadašnji pronalazak se odnosi na postupak za dobivanje derivata LH-RH koji imaju, u 6-položaju, specifične ostatke neprirodnih D-amino-kiselina koji sadrže lipofilne karbociklične ostatke, naročito ostatke koji sadrže dva lli više karbociklična aril (iii perhidroaril) prstena iii fenil (iii cikloheksil) prsten koji je visoko alkil supstituisan.

Specifičnije jedinjenja obezbedjena postupkom iz sadašnjeg pronalaska su nonapeptldi i dekapeptidi formule :

(X) iajlhors fanoaoeatafei pritavati)iv» soli» \ - i

V Ja triptofll, fanllalaall 111 Xl«naftil)«^-alaallA * ί· ^roril, fsnilalsail ill >(l-p*nt»flw>ro£anil)· l>alanllj

X je D-aisinokiou li ruski ostatak

O e

-HH-CH-Cca₂ t>

Λ V u ho jo j je 8, (a)radikal koji sadrži karbcciklidni aril i-iahran ia grupe koja sadrži naftil, a&tril, fluor«ali, fenaatril, bifexdJ.il, benzh idr il i fenil supafcituison aa tri iii vile niže alkil grupe pravog nizaj iii

Cb) zaaideni karbociklišSai radikal iaabraa ir grupo koja aadrži oiklohekail supafciiuisaa sa tri ill više aiisj alkil grup« pravog niza, porhldroaaifcil# porhidrobifeailil, parhdldro-2,2-difenihn«tiX 1 adaaantil;

Y je leuail, izoleucll, ncr-leuoil lli ir~3a»til-lauailj je gllcinamid iii -KH-a^l, gde je

R¹ niSi alkil, cikloalkil, fluoroniSialkil iii

-TCJC-NS·»² gde je

R² vodonik iii niži alkil.

Kao ito je naaaadoao goro 1 rodi podoanoeti « opisivanjo <rvo< prooalaaka, konvoaoiooolao skrodooioo s« rasno obidno aaino klaellae koriste sokao ito jo oglrmcn prihvadono α peptidnoj nauči kao Sto jo proporudono u IU>AC-XUaOoeeisalon en Bieefceeaical Ronenolatwro, glochewi»try, 11, 1726 (1972) i prototavljaju l^aoine-kiselina sa isusotkos nohiralne anino-kioelino glicina i sa dalji* i sure tkam aaine-kiaeli^a o f-položaju osnadonih aa X. 8ve peptida· sekvenc« koja au ovde opeaonuto napisane eu preča uglavnom or lova Jeno j koncepciji prazia kojoj je N-terminalno nnino-kiaeiina na lavo a C-terminalna amino—kieelina na dna no.

Kako »ΰ ovG^ koristi_e tsmin famaesutaki prihvatljiv coli* odnesi so na soli koji sadrSavaju Saljcr.u bioloSku aktivnost ©anovneg j>!lnjonja i na daju nikakva nesoljene toksikološke efekte. Primeri takvih soli aa (a) adicione soli za kiselinarai obraaovane sa naorganakin kiaslinaiaa, na primer, h ler ©vodeničnem kis alineja, bro&ovedoniČncaa. kiseliacra, sumporncea kiaelincra, fosforne» kisa lin C^, aaotocs kiseilnera i sličnim# i soli obrazoveno sa organskim kisalinama kao što su, na priaer, s ir četna kislina, oksalna kiselina, vinska kiselina, d Hibama klaziina, mala inska kiselina, fuiunrna kiselina, glukonska kiselina, li&uaskA kis«lina, jabučna kiselina, /urnama kiselina, askorbinska kiselina, benzoeva kisslina, taninska kisolina, panoineka kiselina, alginska kiselina, poliglntaniuska kiselina, naftalinsulfoaake kiseline, naftalindieulfenake kiselina, poligalakturonska kiselina# (b) soli sa polivalantnia metalnim kat j on ima kao Sto au cink, kalcij ura, bizmut, bariju», oa gnusi Jusa, aluminiju», bakar, kobalt, nikl, kadmiju» i ali Sni# lli sa organski» kat jemo» koji je ohra~ sovan iz H,W'-aibmzileU3^n-diaadL»a lli etilendlsraina i, lli (o) kombinacije (a) i (b), n.pr., ciak-tanatna so i slično.

Kako se ovde koristi temin ·η1Μ1 alkil» odnosi se na aasidenu ugljovodoniftnu grupu pravog lli rafivastog niza koja ima od 1 do 4 ugljeaikov^ atocaa kao Sto au, na mer, »etil, etil, n-propil, izopropil, n-butil, izobutil.

- 7 a «o—butil 1 taro-butilj termin ^cikloalkil grupa* odnosi se na oiklifinu aaaidenu ugljvodoničnu grupu koja iaa od 3 do 6 ugl j «pikovih atona, na priraar, ciklopropil, oiklobutil, olklopenfcil i oiklohakail, temin fluoronllialkll* odnosi se na nilu alkil grupu u kojoj j« jedan iii vi So Vodenikovih atoaa aasaanjen ea fluorost, kao što ®u, na priaer, fcrifluorosaetil, pontailuoreetil, 2,2,2-trifluoo* roetil i slično.

Kako aa ovde korlati *na£til* ukljuduje 1* i 2-aa£feil; antril ukljuduje 1·, 2- i 9-antril/ ”fluorenil· uključuje .2-, 3-, 4- i 9-fluorenil/ fenantril* ukljuSuje 2-, 3* 1 s-f«umt_ru, 1 ·<ω«ΜΒ*11· ukljttSuje ι- 1 W4«MaUl.

Postupak iz sadašnjeg pronalaska poželjno obezbedjuje jedinjenja gde ja X 3-(2*na£til)-Dj»alanil ill 3~(2,4,6*trfcietil£«ail)*^* lan 11/ b je glicinaaid iii -osat/ v ja triptofll iii fenilalaall/ H j« tirozil i T je leuoll iii H-aetll-leueil.

Baročito au poMalJna jedinjenja (pire) <31u-aia-7rp*ee6r-T!fr*X2-«aitil)-£^ilanil-ALettArg-Pr <K3 ly*SH₂, (pire) aiu-Hia-Trp*S«r-Tyr-> (2~nafUl}-D-alanil-KHaatll~ hae-Arg*Pre*41ySS_2< (piro) 01a-«ie*Phe-Sar*try>* (2*saftil)«j>*«lanil*icu-Argfre*aiyw»₂r (pire) eiu*Hia-rrp*eer*>gyr*3· Cb 4, t-triMetilfenil) -Dj* alanil-JLeu-Arg-Pro-air-Kg., *

(pire) 31u-Hie~Trp-Ser*Tyr~>-(2*»aiUl)~£*al*all-L«uArg-tro-aast, i (pire) eix^Hi^Trp-Ber-Tyr->-(>*na4ul)-^alazU.l-N2aatil* Leu-Arg-Pro-KHKt, i njihove faraMentskl prihvatljive aoli.

- 3 l<!aroč±to jc požicljaji (ylro)Glu~Hie-7rp~Ser-Tyr“3(2-aaf tl 1) ~i>~&lanil-Izau-Ar g-?r o-G ly- SiH₂ i njti-jova farna· ceutski prihvatljive aoli.

Jedinjenja i naročito njihove aoli, ispoljavaju neočuklvaao snažni ju i dugotrajniju bil-ZU! agon; 3 tičku aktivnost u pored jen ju sa pratho&nisi najsaažniji» LK-aa agonistiaa, naiaa {piro)Glu-Hl3~Trp-Ser~Tyr*P^Trp· 3βτ·ΑΧ3**Ρχο·Ο1γ·2ίΒ₂ i odgovara j udi© polistilami do©. Prhama cera snage su sposobnost sa parolJalnu ill kosopletzio potiakivaaje estruaa kod odraslih Sunki pacoVU sa aoraalnira ciklus «a (odred j Ivan u toku 3~nedeljnog pe-» rloda) peoodu potkoSne inekcije koja se daje 2 puta dnevno

Drugi bloesaji koji ea koriste sa LB»R& analoge 1 koji su kcacifcdeni sa jedinjenja is sadaSnjag pronalaska uk1Judujui (a) indukcija ovulacije aa disatrua iii proestrus Seukana paoova ponodu potkoča iaakoije (kippel et al, rrog. 8oo. gxp» SiOl» Med., 143, 1113 (1173)1, (b) Lli i 7&ti oelebadjanje posodu dispergovaziih deli j· •kih kultura prednjeg dela hlpoflse kao Sto je »areno readieirnneesejos (vale, et al, jfodoerlnologv, 31, 562 (1372)), i (o) LH i rSH eslcbadjanje u periferna cirkulaciju ovar lek toni Kovanih, steroldtna tre tiranih paoova kao reak· olja aa intraveneanu inakeiju kao Sto se «eri radioisuno· •sejo» (hrlnura, et al, WUtoriooXoqg, 30, 163(1372)),

Ha viSan nivou. aktivnost ovih Jedinjenja mote se denenotrlratl in vivo potiskivanjen epematogenese i eJLrkulaeiJe i nivo* testosterona u testis Ina kao r

• 9 1 drasatifinian vanj «mri veličina prootata na palma koji pata od benigna hipertrofija prostate.

Zbog gornjeg, -jedinjenja sa mogu koristiti u rasni» situacijama u kojima jo važna kontrola LH i VSH, iii direktno? gonadnog dejstva, ukljudujudi:

risjoloSke korianosti (efekti nlakih doza) indukcija ovulacije kod anovulatome neplodnosti i aa tajmiranu ovulacija kod Šenki sisara;

terapija neplodnosti »bog nes&dovoljavajude lutaalna funkcija kod Sena;

terapija hipogonadotropne iii hipogonadne neplodnosti kod ljudi oba pola;

terapija aindresaa cistlSni jajnici/nimfosuinije kod stoke; indukcija iii pojadavanj« seksualno? ponašanja ill «ara*» plja impotencije/£ rigidnosti.

Paradoksalne korlanoatl_(efekti vigOkih.doaa)

- kontracepcija ženki;

- potiskivanje iii odlaganje ovulaoije;

- indukcija parturieije;

* sinhroniraoija ovulacije; <

* suprasija astvusa^

- pratealja rasta kad tanki slsara;

·. '' ;r.,_ * luta«lisa> lndukolja Baastroauljei ~ abortivno dejstvo u rano», prom deluj * terapija endenetrlose;

- terapija dojfianib tusora 1 cista;

- terapija policiatifinog sindroma u jajnlelma 18tein* &eventhal);

«- terapija karcincoa u terasa;

terapija htnigno hipertrofije prostato i karcinoma prostat«/

- kontracepcija mufjaka/

- terapija bolesti koj« nasiajn pretaranona praisvodnjoc gonndnlh hormona na oba pola/

- funkcionalna kastracija kod mufjaka životinja sa pro« iavodnju hrane/

- potiskivanje praznjenja proestrusa.

Dalje, ova jedinjenja kao i UI-&B jedinjenja is predje Saje nauke demona tr ir* ju ime nad ju j udu novu korianost kao abortivna sredstva očevidno inhibiranje» nivo* cirkulacije -iCG i im ju direkten utic a j na placento* Efakat na placento »eS« «ugerir&ti kerlnneat protiv beriufeerciaessn*

Jedinjenja obezbedjena postupkom iz sadašnjeg pronalaska imaju različite korisne primene. Tako se mogu koristiti ₅. na inhibiranje ovulacij·' teetiranje <mdoi»trlese<

.1 * b . ’ · ·* '·' · i-ti^<.'· ·<” ita.. i \ ; ·^:· m ' · /'?»' *' · * 'ΛΛ ’· ·''<»£’ t redukcijo veličine prostata ill inhibiranje apersiatogenese kod paoljenta-slsara kojem je potrebno takvo tretiranje, pri 3eau poeenuto tretiranje obuhvata davanje poaoenutom pacijentu eflkaana količine jedinjenja la sadašnjeg postupka ' kao Mto je ovde opisano 111 famnoeutskog preparata knji aadrki to jedinjenje· Prilikom koriščenja i \

’v

... _z- j ,··,.·. · < - ' A'·' '

- 11 efikaan« količina j (Hlinjen ju is postupka iii f arsiaceutekl preparat koji eadrMi to jodinjunje daj« s« pacijenfcu kojem Ja takvo tretiranj« potrebno, Ova jedinjenja lli preparati aogu ee davati na mkcji od rasnih načina savisno od apeolfičnog krajnjeg koriščenja, uhljučujudl oralni, pareafceralni (koji ukljuoujo potkoSno, intrasanakularno 1 intravanosno davanje)_f vaginalni {naročito aa kontracapeiju), rektalni, bukalni (uključujudi podjeei&ai), 111 iatranasalni, Rajpedeeaiji način u dairaa eInčaJu eavlelde od pr lasne, odredjeaog aktivnog saatojka, paeljeata tt pitanju, i procene lekarn, Jedinjenje 1X1 preparat note ea tako d ja davati poatodu formulacija ra lagano oelobadjanj», depo 111 iaplaat fosaulaoija kao 3to Jo potpunije opisano ni 2«.

Uglavnom sa prlaene koje su gore opisane, koje ec takoevane paradoksalne* 111 priaeae visokih dose, podesno Je davati aktivni aaatojak u koUčlaeea Intedju oko 0.01 1 100 ^og/kg telesne teilne na dan, poMeljno iasaedju oko 0,1 1 5,0 ^ug/kg telesne taline na daa. Ovo davanje »e nože pestiči jednim (tavanjem u teku dana, raspodelom u nekoliko dosa 111 laganl» oelobadjanjem a «liju poatlsaaja aejeflkaaaijih romltata.

'< V·.'· ' . . .. I ‘ * . f , .

Tačaa doaa 1 opaeg davanja «vik jedinjenja i preparata obavent* de zavisltl od potreba pejedlnefinegpadjenta koji ee trativa, od tipa tretiran ja, stepena bolesti 111 po· treba 1, naravno, od premene lakara* Uglavnom, paren teral·· nO davanje «ahtava alte dete od drugih postupaka davanja fcejl vile aavioe od apeetpelJo« /

Sedajta ja Jedinjenja ee debro podnoee 1 relativno e» natoksična, '(«pr^sent« tlvna jodiitnjcnja pokasuju υ.\_;θ vrednoati potkoSnia» davanje.» nd levima znatno iznad 40 »g/kg, što je vrlo veliki faktor bezbednostl u odnosu na potrobne terapautak« doto.

Za koriščenje jedinjenja iz pronalaska formulišu se u farma— ceutake preparat« koji aadr?« kao aktivni saatojak jodinjenje is aadašnjeg postupka , pri četau preparati, obuhv&tuju takvo jedinjenje u smaM sa faraaceutski prihvatljivim, na toksičnim nosačem. Xao 3 to jo »pccaenufco gore, takvi preparati »ogu a« napraviti za koriščenje $a parenteralno (potkoino, intramuskulamo iii intravenozno) davanje naročito u obliku tečnih rastvora iii auspenzija; za koriščenje u vaginalnem 111 rektalno» davanju naročito u pol učvrstiš» obliciaa kao što su kresovi i supozitorije; za oralno iii bukalno davanje naročit© u obliku tableta lli kapsula; tli za intranazalno davanje naročito u obliku prahova, nazalnih kapi iii aerosolov».

preparati ae mogu podesno davati u jediničnora dozsom obliku 1 aogu ae napraviti aakejim od dobro poznatih postupaka u farmaceutskoj tehnioi, na priaer, kao Sto je opisano u ReMington'a Pharmaceutical Sciences, Mačk Puhllshiag Coapany, Saston, PA., 1970. Formulacije aa parenteralno davanje mogu zadržati kao oblfine aaatejke vodu iii slani rastvor, polialkileoglikole kao Sto je polietilenglikol, ulja bil J nog porekla, hidrogeaizovane naftalina i slično. Formulacije ca vaginalno lli rektalno davanje, n.pr., supozitorije, rogu aadrlati kao sastojke, n.pr., polial* kileaglikole, vazelin, kskao feuter, i slično. Formulacije i t

•',7\^τ-?τ4'ζ

- 13 <« sa davanje lnhulacljc&i nogu biti čvrste i sadrSs kao •«stojka, aa pribor, laktoasu lli Rogu biti vodeni lli uljoni raatvori sa'davanje u obliku naralnlh kapi. Sa buklan© davanje tipični sastojci ukljuSuju Medere, kalciju» stearat, nagnasijua-stearat, praSeIatiniraai ckrob i alidao.

Naročito je potaljno da a« jedinjenja saju paoijentu u toku produSonih vremenskih perioda, na primer, period« od jedne nedeljo do jedna godine od prvog davanje. Mogu aa koristiti raaličiti oblici sa laguno oslobadjenje, depo lli irsplaat abllsl. Na priamr, desni oblik asota eadržatt farmaaeutskl prihvatljivu netekslčnu so jedinjenja koje ima ni sak stepen rastvorljivoeti u ta lesnim fluidima, na primer, (a) neka adicione ae se kise linama san nekam polibaaaaa kiaelinea keo Sto au fosforna kisalina, sua&ocrna kina lina, limonska kise line, vinska kiselina, leninska kiselina, psnolneka kiselina, alglnska kiselina, poliglutaminska kiseline, naftalin laone111 naftalin-disulfon.sk· kiseline, poligalakturonaka kiselina i slitaoj (b) so ea katJono« takvog polivalentnog metala kao Ito eu cink, kale 1 jam, bissut, bariju», magnesijua, aluminijum, baker, kobalt, nikl, kaAaijum 1 »lični, ill sa nekim organskim kat Jonasa koji Je obrasoven ia, n.pr., Κ,Μ'-dlbensiletilsndlamlna ill etileadiamlna/ iii (o) kosbinaelje (a) 1 (b), n «pr«, oink-t&nataa eo· Celje, Jedinjenja is sedataj»g pronalaska 111, potaljno, takve relativno nerastvorna so kao Ito su one koje su bal opisane, mO£u se foruulisatl a oblik gela, a* primer, aluminijum· aoeostearatnog gela sa, n,pr», eesaaovtm uljem, koji je r

podestan za inekoije. Naročito poželjene aoll su cinkove soli, cink-tanatne soli, paoaoatne soli, 1 slične. Drugi tip depo formulacije za lagano oalohadjanje ra inekcije sadržade jedinjenje lli so koje ja dispergcr/ane lli kapsulirano u n« toksično®, ne-antigenom po Umoru koji sa lagano degradira kao Sto j® polimer poliialečna kise lina/poliglikolna kiselina/ aa porimer, kao Sto ja opisano n V.S. 3,773,919. jedinjenja lli, poželjno, relativno naraatvorne soli kao Sto su ono koje su opisana gore mogu sa formulisati u pilula sa holosterolskca osnovom, naročito sa koriščenja na živofciajaraa. Dodatno formulacija sa sporo oslobadjanje, lsapl&nt lli depo formulacijo, n.pr., lipozorai, dobro su poznati u literaturi. Vidi, na primer, “Sustainad and Coatrollad Relaaso Drug £elivery Syetem»*, J. R. Robinson od., Marcel Dekker, Zno,, Nev Tork, 1978. Odred jena referenca xa jedinjenja LII-SS tipa može ee nadi, na primer, υ U.S. 4,010,129,

Polipeptid! se mogu Blatetisov a ti makojim tehnikama koje su poznate e trača jadrna u peptično j nauči, a ja jan izvod mnogih takvih pristupefinih tehnika nože se nadi n J. U. Stevard *** ?· 0« tewaff

it?! an sintez» peptid« u čvratoj Časi i x, lahke, “The feptldee* Vol. 1, Acadeaim Press (Sev Tork), itd5 sa klasične sinteze n rastvoru,

Uglnvnosu, ovi postupci obuhvata ju sakvenoljalne dodavanja jedne lli vil<^ aalne-klsellaa ill podesnc

- 25 lažtičenih anino-klaelina rostudara paptidncsn nixu. GermaIno, bilo amino lli karboksilna grupa prv*t aEiino-kisaline &titi so »o podesnom zaStitnom grupom. ZoStidosia lli derivatizova· na amino-· k iaa lina aoSo so tada opoj iti za neki inertan čvrst nosač ill aa koristi u raetvoru dodavanja®: sledeče aalao-klse· lina u sekvenci koja is» kcmplcsentarnu (amino ill karboksil«* nu) grupu koja je podesno zaStičen«, ped u3loviaa koji su podesni za obrezovanje amidne voza· ZaStitna grupa se tada uklanja iz oetatka novo dodane aaino-kiaelina i tada se doda sledeča astlno-kisolina (podesno zadtlčena), i tako daljo.

9o3to su sve amiao-klseline koje ae Sele spojene u pravi Inn sekvencu, a&koje preostale >&3tltne grupo (i »akoji čvrst nosač) uklanjaj« se sekvencijalno iii konkurentno, tako da se dobiva finalni polipeptid. Jednoatavnen modifikacijo» ovog oplteg postupka, susguče je da sa doda vifce od jedne araino-kiselJLn® rastočem nizu, na primer, kuplovenj&m (pod uslovima koji ne recemlzuju hirala« centre) za5 tiče neg trlpep» tida sa pravilno zaSfcičeni» dipeptido» tako da se obrezuje, posle uklanjanja zafitite, neki pentapeptid.

Naročito poS«1jan poatupak sa pravljenje jedinjenja lz sadalnjeg pronalaska uključuje sintearu peptida u čvrsto j fazi· υ ovom naročito poiel j no» postupku alfavanlao funkcija amin o-kise lina St iti se nooodu grupe koja je osetljiva na kiseline 111 basu. takve zaStitne grupe treba da Imaju osebi· ne da su stabllue pod oslovima sa obrasovunje peptidne vese, a da se nogo lako uklanjati be» satsarsa ja raatudeg peptidnog · niza lli raeesdsaelje »akojih hlrelnlh centar« boji s« u »jenu aalase* Podesne saStltne grupe su j^utllokeikarbcnil (Boo), ’ t lu benziloksikarbonil (Cbz), bifenilizopropilokelkarbcnil, _t-orni lok 3 ikarbon.il, izobomilokaikasboail, alfa,alfa-<Hmti 13,5-diaia tokaiben ai loka ikarboni1, o-ni trofenils u li enil,

2—cijano-jt-butl lokaikarbonil, 9-£luoroniliaetiloksikarbonil i olična, naročito t-butilokaikarboail (Boo).

Naročito požoljne grupo za zaštitu bočnog niza su, sa arginin« nitro, ^-toluolsulfonil, 4-:o,otok3ibenaolauifonil, Cbz, Boc i adaaantilokaikarconil# zn tirozini benzil, o—bresao·· benziloksikarbonil, 2,6-dihlorobenzil, isopropil, cikloheksil, ciklopentil i acetil/ za sarin t benzil i to trahidr opiranil/ za histidin t benzil, r—toluolaulfcnil i 2,4-dinitrofanil.

C-Tarsiinalna anino-kiaalina spaja so za podestan čvrst nosač. Podesni Čvrsti nosači koji su korieni u gornjoj sintez; au oni materijall koji su inertni na reageaae i reakcione uslov« nostopenih roakoija kondenzacija-uklanjanje zaštite, a takodje su nerastvorni u koriMenira sredinama. Podesni čvrsti nosači su polimer hlororaetilpolistirol-divinilbenaol, polimer hidroksiiuetil-polistirol-divinilbeazol, i slični, naročito polimer hlorouetil-poliatirol-14 dlvinilbenzol.

* \

Za »peoijalan slučaj kada js C-tereinua jedinjenja gllcinamid naročito koristan nosač je polimer banzhidr ila»iao-poli a tir ol· divioilbeazol koji au opisali V* Rivftill·,«! «Ι,ΒοΙν, Chia. Aota., 54, 3772 (1971). Spajanj« za hlorenstil peilaiiroldivinilbenzolski tip smole vrli n« pemodu roakotj« zaStldene aiaiao-kiseline, naročito dooranino-kiseline, kao Sto je njena cezijumova, tetrazaetiltaonljUA, trietilaacniju«, 4_r5-dlasobiciklo/5.4.0/undeo-S-an iii «lična so n etanolu, acetonitrilu, B,B-dimetilformim|du (BKfj, i «lična, naročito ceaijumova so u DMF, sa hlor ometli zmolom na povifienoj t«»* c

( peraturl, na primer, «a iztodju oko 43 1 69°C, p-oiželjr.o oko 50°C, tok on oko 12 do 48 časova, poželjno oko 24 Časa. t^^^-Soo-amino-kiaeiina spaja se za benzhidrilaminsku a;aolu pomoču MflV-dlciklohiiksilkftrbodlinida (LCC)/1-hidrokslbenzotriazola (KBT) preko kuplovanja tokom oko 2 do oko 24 Sasa, poželjno oko 12 Caaova na temperaturi lznedju oko 1C i 50°C, požaljno 25°G u takvoia rastvaraču kao Sto je dlhlorometan lli DJrfF, poželjno dihlorometan, Kuplovanja sukcoeivnih saStičenlh aiaino-kiselina aože sa vršiti u nakc® autessatsko» polipeptidnon sintetiaatoru kao Sto ja dobro posnato u nauči, □klanjanje X^iža~xa$titnih grupa može se vršiti u prisustvu, na primor, rastvora trifluorosirčetne kiseline u oetilenhlori du, hlorovodonika u diokaanu, hlorovodonika u sirdetnoj kiaelini, iii drugog jako kise log rastvora, poželjno 503 trlfluorosirdatna kiseline u dihloroaatann na temperaturi oko obiSne. Svaka zaStidena aeino-k isa lina se poželjno uvodi u približno 2.5 solarno® viSku i kuplovanje eo može vršiti u dihlorometanu, amesana dihlororaetan/DNF, DKF i a ličnim, naročito u roetilenhloridu na temperaturi oko obiSne.

Sredstvo aa kuplovanje je normalno DCC u dlhlorocoetanu ali nože biti N,N^r-dl-izp-propilkarbodiiraid iii drugi karbodiimid iii saaos talno lli n prisustvu H3T, P-hldrokaisukcln* lmlda, drugih N-hidrokaiiaida 111 oksiaa- Alternativno aa mogu koristiti saštideni aktivni estri amino»kieelina (&.pr·, p-nitrofenil, pentafluorofenll i slični) lli simetrični anhidridi.

Na kraju sintese u čvratoj lasi potpuno saštideni polipeptid odvoji «e od anale· Kada je vosa xa aosaS smele hepsllestarekog tipa, raskidan^e je pomodn amlnollse ea nekim alkllaalnoei iii fluoroelkllamlnom s« peptide ea pr«*· linakici C-terminuscw, ill jv.dnoliaon ve, na primer, amonij: metanolom iii amoni jok/a tandem sa peptida aa glicinekim C-toroininsora na temperaturi lamedju oko 10 i 50°C, poželjno oko 25°C, tokom'izmedju oko 10 i 50°C, poSoljno oko 25°C , tokom izmedju 12 i 24 2aaa, poeMljno oko IR časova. Alternativno »a peptid moža osvojiti sa smele trans-as tarifi kacijom, n.pr., aa motanolcsn 1 satiri asonolisom. ZaŠtičeni peptid može sa prečistiti u ovom trenutku hreenatografijom na silika-gelu. Uklanjanje (bočni niz) zaMtitnih grupa ia polipeptida vrSl se tre tiranjem proizvoda minoliza sa, na primer, aniiidrovanim tečnim fluorovodonikom u prisustvu aaizola lli drugog hvataČa karbon!jum jona, tretiranjera sa kompleksen fluorovodonik/piridin, tretiranjem aa tris(trif luoroacetil)boroa 1 trifluorosirčetaoa» kiselinom, redukcijam sa Vodenikom i paladij umen* na ugljaniku ill polivinilpirolidonu, ill redukcija« sa natrijumom u tednom amonijaku, poeSljno sa tečnim fluorovedouikosa i anizolo® na temperaturi izmedju -10 i ♦io°c_r pofeljao oko 0°c, tokaje isaedju oko 15 minuta 1 1 časa, pošeljno oko 30 minuta.

Za g lici nek e terminalne peptid« na bsaahidrilaminskim smolama, raški dan j e smole i fare uklanjanja aaMtite »ogu se spojiti u jednu fazo koriščenjem tečaog fluorovodoaika 1 anizola kao ato j· opisano gore« 3?eptid koji je pefcpuao oslobodjen začtito «e tada prečisti pomoču sekvence hromatografskih faza korlčsajem «akojeg od iii svih sledečih tipov«) jonska rasmena na slabo basanj smeli u acetat»«« oblikuj hidrofobna adsorptivna hrcaatografija na neder!vati sovanom polis feirol-divinilbeniolu (na primer, Anberlite ΧλΟ) t sAlika-gel adsorptivns hrcmatografljej jonoizmeujivm* čka kromatografija na karboksimetiloelulotij particiooa hromatografiJa, n.pr., na Sephadem G-25, 111 sunrotr.ozii.i-* «lena distribucija; tečna Kromatografija visokih performah' si (HBLC), naročito IIPLC u ra varano j fazi na oktil- iii oktadeailailil-ailioijuradloksidnoj koloni aa vezanem fazoa.

Ako aa koristi racenaka amino-kiselina u ^-položaju, finalni nonapepfcidni iii dekapeptidni proizvodi se cdvajaji i žaljeni peptid koji sadrži £—anino-?<isolinu u ?S-polo£aju iaoluja aa i prečisti# poleljno za vreas© gore opisanog hro· «atografskobf postupka.

Pravljenje peptida koji imaju C**teradLnalse araglicia»ko amida požeijno e« vrSi koriščenja» poaaatih peptičnih intermedijera. Ovo je opisano de tal jni ja u Primeru 3.

Tako sa u drugo» aspektu sadašnji pronalazak odnosi n» postupak »a pravljenja jedinjenja formule (piro)Glu-Uis-V-Ser-W-X-Y-Arg-Pro-2 fl) i njihovih farmaceutski prihvatljIvih soli# u kojoj ja V triptofil/ fanllalanil lli 3-(1-aaftil)-L-alanil;

W ja tirosil, feni la lan 11 iii 3- (1-pentafluorofenil)JL-nlanllj

X je Q-asd.no kieelinski ostatak o

-U1S-CH-C~ l

tt kaj oj je R (s) radikal koji sadršl kkrboolklidni aril laabran 1· grup« koja sadrži naftil, antril, fluorenil, fenantril, • r bifenilil, banzhidrll i fenil supstituiaan »a tri iii vi δα ničih alkil grupa pravog niza; iii (b) zasičeni karbociklični radikal izobran iz grupe koja eadrči cikloheksil supstituisan sa tri iii vi2o niSih alkil grupa pravog niza, perhidronaftil, perhidrobifenilil, porhiIro-2,2-difenilraetil i adamantil;

X ja l®ucil, isolAUOil, nor-laucil iii Sf-jnetil-leuoill

S j« glicinamid iii ~K3-R¹, g d® je

R¹ niži alkil, cikloalkil, fluoro niži alkil iii

O

-TO-OSM-iT gde ja

R² vodonik iii niii alkil, pri čemu postupak obuhvata) (i) uklanjanje salti fenih grupa i, opciono, kovalentno vesanog dvrsto? nosada sa saitideaog polipeptida tako da ee dobiva jedinjenja formula (X) iii njegova so, i opciono (ii) konverziju jedinjenja formule (I) u farmaceutski prihvatiJivu so, iii (iii) konverziju soli jedinjenja formule (J) u fenaaceute prihvatijivu eo, iii (iv) razlaganje soli jedinjenja formule (X) u Slobodan polipeptid formule (X) Sledeči primeri dati au da onogude atruflnjacima potpv nije razumevanje i praktifcoveaje eadattnjeg pronalaska·

Oni ne treba da budu shvadeni kao ogranifienje obl» pronal* ska, ved jedino slufte da ga iluetmju»

U balon anten u au&nlel koji sadrli 0.1 1 apeolutnog etanola (destilisan i* nagne si jw*etoksida) doda ae

1,92 g. netalnog natrijama» Kada razvijanje vodonika pre* '' - ' 'U ' ^;

Bt*ne, doda aa 10.21 g. etil 2-acetaniido-2-ciJanoacetata i 13.26 g. 2-bro:aowetilna£ talina. Rastvor ee zagreva na refleksu 1 čas i tada se ohladi. Etanol ea ukloni pod scanjenlai pritiskom i ostatak sa aakupi u otilacetatu. Organski sloj se ispere aa dva partija od po 50 al. vode, jednosa partijca od 30 ml. zaaidenog natrijurn-hlorida i suši sa preko magna* zijuo-aulfata. nastvor sa filtruje, rastvarač aa ©tera pod smanjaaisi pritiskom i ostatak se hidrolisuje u 100 ati. koncentrovana hlor©vodenična kiseline na refluksu tokom 2

Sasa.

Smeša od hidrolize «shladi se i talog sirovog proizvoda ae Clltruja. Sirovi proizvod se ponovo rastvori u 0.5 adhc 1. vrude vode koja aadrSi 5 ml. koncentrovana blorcvodonična kiseline tretirana ea aktivnim ugljea, i pH raatvora se pode« el na 6 sa končentrovani® amoni j ux®-hi dr oksidom. Talog se filtruje i suši u vakumu tako da se dobiva ll.J g. Slatog

3-{2-naftil)-£,I^alanina tačke topljenja 23Č-232^eC.

Ponavljanje» gornjeg postupka, ali samncet 2-broi»x5metilnaftalina sa «tehiorcetrijskl ekvivalentno» količino» l-broaometi Ina ftal ina,

9-brcsoosie tl lan tr eoena,

9-brooczQetilfluoreaa,

2-bronoraetilfltMrena/

2- broa«iaeti lantraoeaa,

1-brosnae» ti lan tracaos, alfa-hloroisodureaa_t

4-broncsM ti Ibifenila, l-bromosnetiladajaantana,

3- bronosH» ti lf enantreaa, r

l-hlorometll-2,4,6-tri- (n-butil)benzola, i l-hlorf»netil-2, 3,.4,5,6-r>entaiuetilbenzola, dobivaju au sladače amino-fciseline:

3-(l-naftil)-D,L-alanin, t.t. 135-137°C, 3~(9-antril)-D,Ir*alenin, t.t. 290°C (HC1 so),

3· f luorsnil )~D, L-alariin,

3-(2-fluarenil)-D,L-alanin, t.t. 264—259°C,

3-(2-antrll)-D,L-alanin,

3- (l-antril)-b,L-alanir.,

3-{2,4,6-trimetilfenil)-n,L-alanin, t.t, 235-237°C,

3-(4-bi£enilil)-D,L-alanin, t.t. 290°C_#

3-(l-adasanfcil)-D, L*alanin,

3-(3-£eaantril)-P,L-alanin,

3- (2, 4,6-tri (n-butil) fenll)-D,I>alanin i 3-(2,3,4,5,6-pentaciatil£enil)-D,L-alanln,

Preparat B

Rastvor 18.2 g. 1,1-difenilatilena, 25.3 g. metil alfa iaetoksi-li-benzilokaikArbonilglicinata i 1,5 g. 2-naftalinsulfonsks kiselina u 300 ral. suvog benzola refluksuje sa 2 dana. Sirovi proizvod se proč isti na koloni silicijumove kiseline koriščenjem gradienta CHjClj preraa (7H₂Cl₂/2tOAe (18Π). Prečiščeni netil 2-/l-(2,3-di£eniletilenil)/-Khen si loke ikarboni Igli cina t s« hidrolituje n odgovarajudu kiselinu aa rastvor o® 10.9 g KOH α 350 ral 101 vodenog metanol«. Dobivena sirova kiselina se rastvori u 100 ral. 95« etanola koji sadrži 3 ral. kono. SCI i hidrogenizuje se u prisustvu 2 g. 10« Pd ne uglju toka« 24 deta tako da ae dobiva 2.4 g. 3-(2,2-či£enila»«til)*D,L~«lanina, t.t.

235-337°C

J

Prečarat C

Rastvoru 12.9 g. 3-(2-naftil)-D,L-alanina u 120 ml, 1 M MaOa doda ae 6.23 ni. acatanhldrida i dd ml. IM NaOH tokom 1/2 časa aa 0°C. pH ab počasi na 2 sa k one. ECI i dobiveni talog sa filtruje. čvrsta a upa taa ca s< rekristališe is 601 vodenog etanola tako da se dobiva 12>3 g* li-acjotil-3- (2-nafti; D,L-alanina.

Rastvoru 13 g. ove N-aoetil-aaJLno-klaeline u 240 ni. suvo4 metanola doda se 15.8 ni. bor-tri fluori da starata 1 smeša se refluksuje l čaa. Alkohol »e Ispari, doda se 290 aj vode i rastvor se ekstrahuje aa etilaoetatcs*. organski sloj se Ispere sa vodenem basom i kis« lino«, suSi se preko filtruje se i ispari ae do ulja. Krlstaliaaeija ovog ulja is sneše etilacetat/heksan daje 14.2 g. metil H-ac«til-3-(2naftil)-D,L-alaninata, t.t. 79-80%.

Ponavljanjem gornjeg postupka ali šamanom 3-(2-naftil)D, L-alanina sa s teh lome tri j ski ekvivalentno® količino»

3-(1-naftil)-d,L-alanina,

3- (2~fluorenll)~D, L-alanina,

3-(2-an trii)-n, L-alanina,

3-(i-antril)-D,L-alanlaa, i 3-(2_f2*difenilneti1)-D,L-alanina, dobivaju se »etil N-*četi1-3-(1-naftil)-D,t-alaninat, t.t. 97.5-98%, »etil W-aa»tll-W2-fluorenll)-D,X<*al»fti»at, t.t. 170-171% metil »-aoetll-3-(2-antril)*D,L»alaninat, i »etil I*-acetil«3-(3,2-difeallmetil)*»D,li-alanlnat, t.t. 113-114%, c

Preparat υ

Hantvor 6.5 metil if-acetil-3- (2-rtaf til) -D, L~-alaninat u sme 31 300 ml. dimcitilsuliokaida, 120 ml. 1 M -^^c~ 1 700 r.l.

tretira ne aa 33.6 mg. analna aubfcillzina u 3 mi. 0.1 M XC1. pH ae odrfava na 7 poraoču autasaatske titračije sa C .2 F NaOJi pcuoču Hačioneter stat ur«djaja. Poale 30 minuta sakupi ae 70 ml. NaOH rastvara i hidroli3a aa zaustavi. Rastvor ao aaalkali aa 12 g. NaECO^ i ekstrahuje so sa stila četa tora. Organski sloj j« sadržao metil K-acetil»3-(2-naftil)-Γ-alani nat. Kristalizacije is etilacetata/hsksana dala je 2-utu ftvrstu supat&ncu, t.t. 80-8l°C,

Ova se prevede u elobodnu amino»kiselinu i tada u N-Boc aaino-kisalinu na sledeči načint

Rastvor 2.5 g. metil y-acetil-3—(2-aa£til)-D-*laninata α 60 al. 6K HCI aagreva se na 120-130° tokoa 3 časa i ohladi se na sobnu temperaturo. Sao talog koji sa obratuje ae sokup i rekriataliiu is 50 al H^o koja sadrži 1 tal 12 El 1531 neutralisacijoci sa NU^OH wt pH S, i suli se u vakurau tako ča ee dobiva 1.2 g 3-(2-neftil)-J>alani»a, t.t. 242-244°, /jJ²⁵ 26.6° (o 0.5, CU₃CQ₂H).

hiettani rastvor 3-(2-n*ftil)»J>-alanlna u «me Bi 53 ral IN NaOH, 10 al HjO i 20 ml dioksena trativa aa aa 1.48 g dt-tar<m»butlldlkarbonata i 0.22 g. aagnesijum-oksida na 0°* posle 1.5 časa doda se JoB 0.3 c di-tego-btuildlkarbonata i smela se pasti da dodje na sobnu temperaturo. Čvrsta sapatanea ae odvoji filtracijam i filtrat se koncentruje aa 50 al. Ovaj vodeni rastvor se dovede na pH 2,3 sa NaHSO* ek strahuj e se ea etilaoetate^» Organski sloj ss ispere £'

aa 51 NaUSO^, vodou i aa zasičenim ras tvorca soli. Etilacatat·* ni rastvor ao »uči preko magnezijum~eul£ata, filtruje ec i koncentruje do ulja koje kristališe is ®tar/heksana tako da se dobiva 1.3 g N-Boc 3-(2-nai’til)-D-aliLnina, t.t. 90-91°, /<>/^⁵ - 32.€° (c 0.8, >!eOH).

Ponavljanjem gornjeg postupka ali eamaccn metil N-acatil3~{2-aa£til)-D,L-alaninats sa a to h teras tri jaki ekvivalentna^ količino» netil N-acatil-3*(l~naftil)-D,L-alaninata, metil N-acstil-3— (2-f lucrenil) -D,2>alaninata, netil H-ecetil-3-(2-antrii)-D,L-alaninata, i metil M-acotil-3-(2,2-difenilmatil)-D,L-alaninata_< dobivaju ae sledeče ^alf ^a-Boc aaino-kiceline, preko odgo* varajudih alobodnlh kiselina (amino)x

N-Boc-3-(l-naftil)-D-alanin, t.t. 92-93¾, / 54.8° (o 0.5 M* OH)_t

N-Boc-3~ (2-£luorofenil)-r>-alanin, t.t, 141-163°C (map.),

H—Boc—3—(2—antrii)—D—alanin, i

M—Boc-3—(2-antril)-E>-alanin, t.t. 133~154°C.

Preparat; S ϋ Parr boau sa hidrogenlzaoiju stavi se 0.85 g. 3-(2-na£til)-t>-alanina, 100 al. 2 Jj hlorovodcoidne kiselina i 0.85 g. kdansovog katalizatora (PtO^). Rastvor se peku je pod SO lb/ln² gasa tokoa 20 daea u Parr aparatu sa hldrogealzaelju. Smejte «e ««greva da ae raatvori beli talog i filtruje «e kros dlatoaejsku sealju. Koncentracija rastvora pod snanjeni* pritiskaš i sati* liofilinacija is voda daje 0.8 g. 3-(2* perhidrt»s£til)-D-alaaina kao hej* supstance t.t· 230232¾.

Ovaj «a ter i Ja 1 «e rastvori u sneli 3.2 al. ljJ-MaOH, ml. vode i 15 r.l. tliokaana, i tretira so ca 0.14 g. 1ΐ<;0

0.R5 g. dl-tarc-butildikarbonata. Poalo 1 5aaa na 0°G i časa na 25°C. suspenzija se filtruja, koncentruje do suv» ped emanjanis: pritiskom, oatatak ae rastvori u vodi, ie*>-»r« sa aa dietilatrar. i sakiseli na ρΠ 2 aa NaHSO^. Kaki Sel jeni vodeni »loj se ekstrahuje tri puta sa etilacetaton 1 «kntrakti ae spoje, suš« ae preko flltruju, i koncentruju tako da se dobiv« 0.75 g. M-Boc-3-(2-perhidronaftil)-sslanina kao belo ulje.

Deo od 0.1 g. ovog »atarljala rastvori so u 5 lal. tetrahldrofurana i titruj« so na 0°C sa avoSo napravljenim diaao»etanom dok svetlo Suta boja ne hudo postojana. Reakcija se gasi sa 1 rcl 3irdetne kiseline, rastvarač ae izpari i ostatak ae raspodeli issiedju 75 ml. etilacetata i 75 sl. vode.

Organski sloj se ispere sa 5% NaHCOj, vodom, zasičenih rastvoro» NaCI i su3i ae preko HgSO^. Rastvor e« filtruje, koncentruje pod smanjenin pritiskom, i stavi se na preparativnu plode sa tanko«lojnu hromatografiju (debela 750 /U, ailika-gel 20 x 29 cm.). Ploda ae razvije za dihloronatancaa/etilacetatOK (18/1) 1 traka proizvoda se odvoji, 8ilika-gel is trak« proizvod« se ispere sa dihlorcraetaaen/etilaoetatoa (9 >1) na and Steklenem levku i filtrat ee koncentruje tako da se dobiva 04 g, »etil N-Boe-S- (2-perhidronaftil,-D-alaninat kao svetlo Žuto ulje.

Ovaj materijal se dobiva kao smela dva isosnera u 2 položaju per hi dr on af talinsko? jezgra. Ova dikstereolsomerna jedinjenja se noga odvojiti na koloni sa tednu hroaatografija sa visoki» perfomansaaa (Liohroeorb silika-gel 60, \

mikrona) sa atilaoetatoa/heksano» (l i9) kao eluento» i hidrolizuje 3β v. alobodnu kiselinu, N-Boc—J-(2-perhldronaftil)“I>alanin.

Ponavljan jer.: gprnjoj postupka ali zamenom 3-(2-na.ftil)P~alanina ja atohioretrijaki ekvivalentna^ kollBlnoa

3- (l-na£ til) -B-alunina,

3- (2,2-difenilu-3til)-P-alanina,

3-(2,4,T-trim«tiIfenil)-P,L-alanina,

3-(4-bif4ailil)-D, L-alanina,

3-(2,4, S-tri (n-butil) fenil)-D,L-alanina, i 3-(2,3,4,5, δ-p en tarna ti lfenil)-D,L-alanina, dobivaju oa sledeč® N-Boc amino-kiselinat N-3oo-3-(1-parki dron* f ti 1)-D-alanin,

N-Boc-3- (perbidro-2,2-diJ;aniLaetil)-D-alanin,

H-Boc-3-(2 _f4,b-trinatileikloheksll)-D,L~alanin.

S-Boc-3-(porhldro-4-blfenilil)-D,L-alanin, S-Bo€r-3-(2,4,6-trl(n-butil)oiklQh«keil)-D,l-alanin, i N—Boc—3— (2,3,4,5,6-pent*3»tilcikloheksil)-D,L-*lanin.

Primer 1

U reakclonl sud Beckman 990 Peptide 3ynhasiKsr-a stavi s· 0.8 g. (0.8 ranol.) benshldrilamino-polietirol-divinilbensol smole (Lab Systems, Inc.) kao 9to j« opisano u Rivaill gore. Amino-kiseline se dodaju sekvencijalno n« ovu siaolu, poraočn programa ra einteru, kako sledit

Paza 1 ispiranja sa CH^Cl^ l pufc 1.5 min.

30* CPjCO^H/CH^Clj— put

1*5 min..

uklanjanje eaStite so» cf₃co₂h/ch₂ci₂— ispiranja oa CH₂Cl₂ put 3 puta min, 1.5 min*

Λ, τ

L·	10 -< triedJaaiin/CH Cl , ii »	2 puU	1.5 inin.
6	ispiranje sa Ci4.,Cl t	3 puta	i.j min.
7	_aUa ‘ .
rastvor N -doc-amino-kiseline	i put	edicija
0	raaivor MtN’-diclklohek3iikarbod&taida	1 put	edicija
9	Ispiranje sa CH Cl l držanje— * 2	1 put	reakcija kuplovanja
	kuplovanje		2 časa
10 ispiranje sa CH3Cl„— adicija •m Z*	1 put	1,5 min.
11	ispiranje sa CP. ^Ci^ lb	3 puta	1.5 min.
12	Ispiranje sa etanolom	3 puta	1.5 min.
13	iepiranjo aa. CHqCl «‘H' X	3 puta	1.5 min.

Faze 1-13 komplatiraju ciklus knplovanja za jednu amijjo-kiaelinu a kotaplutnoat reakcije se prevarava pomoču olnhidrinskog postopka opisanog u

2. Kaiser. et al». Anah Blochem.. 34. 595 (1970).

Smola ae kupluje sekveecijalco sa 2.5 molamlm viškom svake zaštlčene amioO-kiselioe i CCC. Tako se smola tretira a& vreme sukcealvnlh ciklusa kup*· lovanja sa

0.433 g. θοο<4γ-ϋΗ,

O. i32 g. Occ-Fro-OH,

0.537 g. boe-Arg{ Tožil)-Ui,

0.463 g. Boc-Leu-uH.

0.504 g. floc-3-( ’.-naftU)-L>-Aianina i 0.272 g. l-tddrokalberjaoiriazola, 0.724 g. N-3oc/--2-bromotenzUoksitauri)onll~L-tirozlna,

0.59 g· Bbc-SeriBeaadlJ-OH^

0.600 g, Oec-Trp-υΗ, ,

0.654 0. BwMUa( fosil )-0H, I

0.524 g. piroglutaraloske Me^jfae· ' ? ' <2'·‘A:·”.'g;, ·

Smola a* ukloni U reaketoneg sede« ispereses« ¹ sedi ^u vakumu tako da ae dobiva 2.0 g. zalili eo» poUpeptid&esmele·

FeMpeptldal proizvod se IstovremeMI ttfcžoei ae smele i potpuno «e oslobodl zaitite trettroajem sa anhidrovaoira tečalm HF« $***&* ²*° ^g· «Mtfčeoe poilpeptidae smele i 2 ml. anlzola (hvet«Č) e Kel*F reefectoaom «udu tretira ae sa 20 ml. redgetUleanog (is CoF^) sAtridrevaneg teiaog M/ oe 0°C tokom 30 minuta. MF ee ispari u vakumu i ostatak (piro)-Oh>H<a-Trp-iier-Tyr-3-(2- 29 naftil) -jJ-alanii-Leu—Ary-i’ix>-'jly-NH^z, u obliku njegovo HF soli, is pero ae aa atroin. Ostatak se tada ekstrahuje sa glacijalnom sircetnom kiaelinom. fcJurtrakt sa si rčetnom kiselinom ae Uefilizira do prinosa od 0.8 g. siroveg rnaterijala.

Sirovi polipeptid ae naneso na 4 X 40 cm. Atnberlila ΧΑΟ-4 kolonu (kopolimer polistirol-4^ diviniibenzoi) i eluira se sa konkavnim gradientom i« vode (0.3 1.) prema etanolu ( i 1.). epruvete koje &edrž« frakcije iz istisoute zapremine 690 ml. do 1,170 ml. se sakupe i odvoje do suva tako da se dobiva 490 mg. delimično preči&čeaog polipeptida.

bsorak od 150 mg. parcljaino prečiščenog proizvoda podvrgne se particionoj kromatografiji na 3 x 50 cm. koloni Sopbades G-25 koriščenjem raetvaračkog sistema l-buteaol/toiooi/sirčet&a kisehaa/voda koji aedrži 1.5> piridiai u odooslma 10:25:12:18. Ciste frakcije se sakupe na basi tankoslojne kromatografije (silike-gei, 3uGH/H,O/HQAc/StOAci 1:1:1:1) i HPLC (5 mikrona, jireversaa laza, okladecilsilil pakovanje« 40^ 0.03 M Nli^0Ac/60> acetOBltril). Zeljen! proizvod izlazi iz kolone u frakcijama iz istLsnut» zepremim od 1,000 ndo 1,400 ml (tU 0. i). ciste frakcije ae sakupe» izpere se do »uve, zakupe se »h₂o. i liofiliziraju tako da se dobiva 57 mg. čLstog piro-giutemU-hiatidiltriptefll-eeril-tirozil- 3- (3-naftli) - G-alanii-leucU-erginll-propil-glicinajaida, u «Miku «Ilci«» «dl » dri««»» kljunom, - 27.4° (c 0.9, HOAc),

t.t. 185-193°C (rasp.).

Primer 2

Za «laterni analoga aa C-tonatnateini , korUčon je program stekam ideottfan aa eol» keji >epls«a u Primora 1« Becfcman99Q SiMhetfaar reekcteal sed se napadaa 2.13 g. Iktt-?n>~O-smele, nepravnem reakcijam ekvimolernlfe odnosa suva cezjjumeve soli Soc-Pre-OH aa hloro* metll-pellattrol/1^ divteUbaosolom (Lab Sy«tems, Žbc·)· Količina 09010 Boe-Pno-O-Šmolo aadržala jo 1.4 metel. protina.

Smola ao kupluje eekveocijalno aa 2.5 motenim viškom svake zaiti-? čem emfao-kteeiiae i OCC. Tako, smola neguj« aa vreme kaudjlli ciklusa kuplnmo>«a

- 30 ·

1.61 g. Boc-Ary(r<xdl)-OH,

0.73 g. Uoc-Leu-cH H. O, 'j.‘Mg. 3oc-3-(;.-naflU)-i)-alanlnom 1 0.49 g. 1-Mdroksibe<iziotriazoia,

1.75 g. N-’5oc-C/-;’-bro4nobesixik>ksiluirbonll-L-iiroxina, t 1.11 g. «oc-Ser(Benzil )-0H.

v’ σνοπι momentu niateze količina aaiiičene polipeptidna atnoie se podali na pola i jedna polovina *e tretira kom plati ranjem sekvenci Jalne reakcija sa

0.57 g. Boc-Trp-uH,

0.77 g. Boc-Mia( fosil )-OH, i 0.21 g« piroglutaininske kiselina·

Smola aa ukloni is reakcioaog »uda, ispare ae aa CH Ci,, i suši se u vskumu tako da se dobiva 2.26 g. zaatičene poUpeptidne smole.

Zaitičeol polipeptid se raskine aa smele aroonolizoro «a 25 rol. etilaratoa tokom 18 časova na 2°C. EtUamin se pusti da ispari i smola se ekstrahuje sa metanolom· Metanol aa ispari tako da se dobiva 1.39 g. piro-<31u~HLs(FexH)-Tn Ser (B«azil)-Tyr( 2-broou»tcoai}okaikarbonil)‘*3->( S-aaftlO-D-alaeil-Leu-Arg(Tosil J-kro-NH-CH .^CH .

Sirovi poiipepti i se oelobodi zastite tretiranjem aa »mesom 3 ml. anizola i 30 ml. redestiliaaaog (la CePp anhidrovanog tečnog HF na 0°C. tokom 30 minuta u Kel-K reakcionom sudu. 1IF ae ispari u vakurau i ostatak ae ispere «a etrom. Ostatak »e rastvori u 2 M sircetnoj kiselini I Uoftiizira tako da se dobiva 0.82 g. sirovog (piro)-C»iu-Hi»-Trp>-Ser-Tyr-3-(2~naitU)-b-alaainaLeu-Arg-Pro-NH-CH CH u obliku adkdone soli sa kiselinama· Finalno prečisč« λ· «a vanje postiže se preparativnom tečnem hromatografi jun sa visokim perforoaaosa uzorka od 20 g. na 0.9 x 550 mm. koloni 40-50 ^u. oktadeeilsilllovanog silicijum-dlokaida (Merck, UchroprepC _a). «3ueal je bio 64% 0.03 MHH CAc/36* acetonitril· U četiri probe prečisti se ukupno 61 mg. sirovog materijala.

Posla tri UettUzecije U vode, dobiva so 15 mg« Člstog piroglutan^l-hidtidil·· trtptofU«eerli-tirosil- 3- (2-aaftll )-u-elanll-ieucll-arginU-prolin etilarolda u obliku njegove adlcioae soli sa sirčetnom Heeltoero, t.t. 180~190°C,

-57.2* (C 1.1, HOAc). _χ

Ponavljanjem gornjeg raskidanje, ali zamenom etilamina sa stehiometrij*aken» kohčfaem:

- 31 n-butilamlna, c i klor propil a m in a, ciidobeksUaraina, trtfluoromaUlajnina, peniafluoroatllamina, i

2.2.2- trliluoroeUlamina dobi vaju aa odgovarajuči n-butilamid, ciklopropllaniid, cikloheksilaraid, triflueroroetl lamih, paniafluoroetilamih i

2.2.2- <riilt»roeiUamid goro apo&enufiog noaapeptiha.

Primer 3

Jedinjenja Formule l u kojima je Z -NH-CNH-G mogu ee napraviti klaaični m rojenji ma sa &lntexu.

Na primer, može &e koriatili sledeči prilaz kada J® AsaGljrNH^’¹

-NH-NH-C-NH j o 2

O (piro) Gl u-Hla-Trp-Ser“Tyr-O M e (>) /

(piro) (au-HU-Trp-Ser-T/r-N^ i

<plro)Qu-iUs-Trj^'Ser~tyr-3-( 2-βλΛ11) -L>«Ala-Lott_$ Arg-Pro-Aga-Cl^NH^

Cha-leu-Arg-Pro-AaaGl/NH,

aoc-3-(2^Ba£tii)-D-Ala-IeeA rghftra-AeaGl jr-NH.

kao Slobodan peptid iii ao.

Kuplovanja pojedinaflnih fragmenata može aa vršiti postupkom porodu acilazida (J. Monzel, et al, Coli. Czech. Chem. Coaaa, 26, 2333 (1971)), pomoču DCC/K3T kuplovanja iii pomoču dr ugl Ji tehnika kuplovanja fragmenata slab odn lh od rucezalzacl je. Jedinjenja (1) 1 (2) au pozaata (M. Fujino, et al, Sloohaia. Blophya,Rea,Ccra»., 57, 1248 (1974) i A.3. Dutta, et al., J. Chen, Soc. Perkin Z, 1979, 379), Jedinjenje (3) ae pravi iz (2) pomoču uklanjanja Cba i nitro grupa hidrogenollzora, 1 zatia kuplovanjem sa if-Boo-3-(2-naf til)-Dalaninom koriščenjem DCC/HBT iii drugog sredstva »a kuplovanje kao Sto je poznato u nauči, Vidi Dutta, et al, supra, sa slične LH-au analogne sintese.

Slično, koriščenjem drugih amino-kiselina uaeafco K-*3ce3- (2-naftil)-£>-alanI»a, mogu se napraviti druga jedinjenja Formule I, n.pt.

(piro) Glu-Hla-Trp-8er-Tyr-3- (2-naf til) -D-Ala—H—iaatil-LauArg-Pro-AxaGlyNH₂ 1 (piro) aiu-His-Trp-Ser-Tyr-3- (2,4,6-trimetilfenil)-l>*AlaLeu«Arg-Pro-Aza01yNH₂. Takodje, prilikom pravljenja jedinjenje (2), koriBdenje AzaQly~MH-altti alkil umesto Asa-01y-HH₂ daje odgovarajuči peptid sa Ase01y-lfH-niBim alkil terminusom, n.pr., (piro) Olu-His-Trp-Ser-Tyr—3· (2-naftil) -D-kla-Lou-Ar gPro-Aa«aly-Et, (piro) Glu-Uie-Trp-Ser-Tyr- 3- (2-naftil) -D-Ala-N-meti 1-LeoArg-P»o-AsaGly-Et i (piro)Glu-Bls-Trs>-Sar-Tyr-3* (>, 4,6-»trit»tilf enil)-i>AlaLeu*Arg-Fro-AzaGly-iit,

-I

Primer 4

Ponavljanjem postupka iz Priirera 1 i koriščenjem Ul D-auino-kiseline' lli D,i,-anino-ki»allno u položaju 6 (u poslodnjer: aludaju, uz odvajanje diaetereolzoiaemih peptida «a vretr^ liror.ua tografi je), uz zaiaenu sa odgovarajudin axaino-kist.-liniiaia u sekvenci sinteza u čvrstoj fazi, mogu ski dobiti aladodi dekapuptidi koji se izoluju i k arak bar išu kao adialona soli sa sirdetncaa kisa linčem pir o-g lu tami 1-histidi1-triptofi1-3eri1-tirozil-3-(2-na fti 25

D-alanil-fi-iaetillettail-arginil-prolil-glioinaaid, /, / -26.€

D (C-l, HOAo) f pl r o-g 1 ut asdL 1-h i a tidi1- fen ilalani1-sor i 1- tir oz i 1- 3- (2-n&£ ti1)-D-alani1-leuoil-argini1-pro11l-giicinaaidt piro-glutaail-histidil-3-(l-naf til)-L-alanil-seril-tiroal 3-(2-naitil)-D-alanil-leuoil-argiail-prolil-glicinaKid j, pir©-glutani1-histi di1-triptofi 1-aeri1-fenilalani1-3-(2naftil)-D-alanil-leucil-orginil-prolil-glioinaaidi plro-giutajail-hietidil-triptofil-aeril-3-(1-pentaf luorof enil) -L-a lani 1-3- (2-naf til)-D-alanil-la ucil-argini 1-glic in— amid/ piro-gluta»il-hiatidil-triptofil-e«ril-tiroxil-3-(lnaftiD-D-alanil-leuall-arginil-prolil-glioinaiald, t.t. 173-5°C, /./^⁵ -28.1° (00.8, HOAo);

piro-glutami 1-his tidi 1-trlptofil-seril-tiroxll-3-(2an tr i 1) -D-a lan i 1- laueil-ar gin i 1-pro li 1-g licJLnamid t pir©-glutamil-hiatidll~trlptotfil-s®rll-tlrozil-3-(2fluotreniD-Oalanil-ieuoil-arginii-prolil-glioinamid, /i/J⁵ * 25.8° (C-l, BQAo)# piro-glutaaii 1-hia tidil-triptof il-a«rll-fcixozi 1-3- {3-£enantr 11) -I>-alanll-leucil-ar<jiail—prolil-glicinaasld;

pir o-glutami l-hi> ti dil-tr ip tat il-eeri 1-tiroai 1* 3- (4-b if e2*5 r niliD-D-alacil-leucil-arginll-prolil-glicinasiid, / -33.7 (C-l, HOAc);

piro-glutaiail-hiatidil-triptofil-aeril-tircail-l-(2,2difttnilootil) —O—alaail-leuoil-arginil—prolil—glicinaraid s, piro-glutamil-hiatidil-txiptoiil-aeril-tiroail-3-(1-adaaaatii)-D-alanil-leuoil-arginil-prolil-glic±naaid;

piro-glutaznil-hiatidil-triptof il-a«ril-tirosil-3- (3,4,9triaetilieall) -D-alanil-leocil-arginil-prelll-glicinamid, /</²⁵ -42.1° (C-l, KOAa);

pixo-gltttaail-hiBtidii-tripto£il-aeril-tl3eoall-3-/2,4,9tri- (n-butil) t anil/-&-alanil-leaoil-arginil-prolil-glioinamid;

piro-glatawil-hi»tidil-feript»£iX-eeril-tiro«il->- (2,3,4,

5,6-peatarnatilfaail) -D-alaail-leucil-arginil-parolil-glicinaaid piro-glutanll-hiatidil-triptofil-»«ril-tirozil-3- (2,4, Strie® tile ik lohekei 1) -Oalan.il- laueil-arg inil-proli 1-g lic inamid/ pire-glatanil-hiatldll-trlptof il-eeri1-tiroail-3-/2,4,6tri (xrd>util) oikl<&ek>il/-D-alanll-lettcil-arginil-prolil-glieiaavid;

plro-glatamil-hiatidil-tripbofil-e«rll-tiroail*3-(per hidreX«iuMetil)-o-aXanil-leiMil-as?Ml»proXll->9XielMatid;

) s :

pire-? lutaail-hiatidil-triptofil-eeril-tirosil-3- (perbi* j; · l dre-2-naftil)-t>aXaniX*leuoiXrargialX»prelll-?li<)i3iiB&i4f, f pire-glutajKil-hiatidil»triptefil-eerll-tiroBil-3-(4-perhidr«toif«nilil)-E>-alanil-lettei3i«Mur?inil-prelil<lieinaald», >

piro-glut-mib-liiatidil-tripto^il-eeril-tirosil-a- (perhi- | dre—2,2-di£eni3n«til)-E>-alanii—leoeil—arginil—parolil—glioin— amid;

«» τ

Piro-glutamil-hietidl1-trIptofi1-a©ri1-tironi1-3- (2na£ ti1)-0-alau il-Izoleuci1-arg in il-proli1-g lio inamid} i

piro-glutamil-histidi l-tripto£il-««ril-tiroxIl-3- (2-naf— til) -D-alan i l-nor leuoil-axrginil-prolil-gllcinanid.

grimag 5

Ponavljanjem postupka is Primera 2 i koriščenje» lli D-a»iao-klaeline iii D,x^>amino-kieeline u pololaju δ (α poslednje» «lučaju, uz odvajanje diaatareolsomernih peptida aa vreme hronatograflje), sa koriščenje» ©dgovarajučih asinokieelina u sekvenci sinteze u Svrstoj £aai, doblvaju ao sledeči nonapeptidi koji se nogu iz o lova ti i karakterieati u obliku njihovih adioionih soli aa airčetala kiselinamat piro-g lutami 1-hia tidil- ferip tofil-eeril-feirosll-3- (l-na£ til D-alanil-leocil-arginil-prolin u obliku etilanida, n-butilamida, olklopropilaaida, oiklohekallaatida, trlfluorometllamida, pentafluoroetilaaida i 2,2,2-trifluoroetilaaida, plro-glutamil-histidll-feailalanil-eeril-tirosil-S(3-naftil)-D-alanll-leuoil-arginil-prolin u obliku njegovog etllamida, t.t. 180-l90®C. /a/*⁵ -37.2® (Ol, 10t HOM), n-butilaalda, ciklopropllaaida, eikloheksilanida, trifluoronetilaadLda, pentafluoroetilaaida 1 2,2,2-trif luoroetilaaida, piro-glutami l-histidil-3- (1-naf til) -L-alanil-aeril-tlroail-3-(2»aaftil)-P-alanil-leuoll-arginil-jafOlin u obliku njegovog o ti lani da, t.t. 1ŠO-170°C, -45.2¾ (C»l,

HOkc), n.butilamlda, clkloprogdlaatda, eiklohekailaaida, triflnovonetilamlda, pentafluoroetilamlda i 2,2,2-triflueroefeilaialda, \ *· piro-glutaodl-hia tidil-tripto£il-8«rIl-fanilalanil-3(2-naftll)-D-alanil-leuoil-arginil-prolin u obliku njegovog etilauaida, n—butilamida, ciklopropilaiaida, ciklohoksilanida, trifluorom«tilamida, pentafluoro«tilaraida i 2,2,2-trif lucro« bi lasal da, piro-glutaiail-hlstidil-triptofil-eeri 1-3- {1-poutaf Inercij eni1-L-alani1-3-{2-nafti1)-D-alanil—leuci1-arginil-prolin u obliku njegovog etllaralda, n-butilaraida, eiklopropilasaida, cikloh«kaliamida, trif luorcaaatilaraida, pentaflucroetilaiaida i 3,2,2-trifluoroetilaaalda,

P ixo~g lutaai 1-hia tidi 1-triptof i 1-aer il-tir osi 1-3- {1-aatri 1) b-alanil-leucil-argluil-pcolin u obliku njagovog otilaraida, n-hutilaraida, oiklopropllaaida, eikloheksllamida, trifluoroiaatllamlda, pentafluoroetilaadda i 2,2,2-triflueroetllanlda, pir o-g lutaail-hia tidil-triptofll-ieril-tiroai1- 3- (2-fluoreni 1)-D-alani 1-1«uoll-arginil-prolin u obliku njagovog etilaalda, n-butilanida, ciklopropi lasal da, cikloheksilamida, trifluoroaetilastiida, peatafluoroetilamida i 3,2,2-trifluoroetilaadLda, plro-glutaai 1-hia tidll-triptofil-seril-tirozil-3- (3-f enantril)-D-elanil-leucil-argixxi3j-prcli» u obliku ajegovog etilamida, n-butilaadda, clkloprepllaaidA, cikloheksllasdlda, trifluoreraetilemida, peatafluoroetilaadLda i 2,2,2-trifluoroetilamlda, plco-glutoal 1-hia tidll-trlptofll-Mril-tlrosi 1-3- (4-blf enllil)-I>alanil-leucil«argiail-prolia u obliku njegovog etllaralda, n-butllamlda, oikloprcpllkraida, ©iklohekailaciida, trlfluoroaetilamida, pentafluoroetilaraida i 2,2,2-triflucroetilamida, \ piro-glutaral1-hia tidil-triptofll-aerll-tiroail-3- (2,2-diF

feniliAatilJ-D-al&nil-leucil-arginil-prolin u obliku njagovog etilaalda, t.t. 176-20S°C, 33.7° (C-l, 103 3CAc), n-but amida, ciklooropilamida, ciklohekailaiaida, trifluoromatilanid pentafluorootilaraida i 2,2,2-trif luoroetilaaida, piro-glutanil-his tidi l-triptofil-soril-tirozil-l- (l-adaa&nt±l)-b-alartii-laucl 1-arginil-prolin u obliku njegovog otilaai· da, n-butilamida, ciklopropilamida, ci k 1 oh ek e i lami da, trifluo: aetilaaiida, pantafluoroatilaaida i 2,2,2-trifluorootllaaida, piro-glntaciil-hietidil-triptofil-aeril-tirosil-3-(2,4,6trim»tllfenil)-D-alaail-leucil-arginil-prolin u obliku ajegovog e ti lami da, n-butilaj&ida, ciklopropilaiaida, ciklchekeilaaida, triiluoroHjetilaaida, pantaf luoroe ti lazaida i 2,2,2triiluoroetilaeida, piro-gluta®ll-hl«tidil-triptofil-aeril-tirozil-/2,4,6tri-(n—butil)fenil/-D-alanil-l«uoil-arginil-prolin u obliku njegovog etilauida, n-butilaiaida, ciklop ropi lami da, oiklohekel aeida, trifluoconetilaraida, pen ta fluoro· ti lani da i 2,2,2trif luoroe tilat&ida, piro-glutaail-hiBtidil-tripbofii-ekMril-ti rosil-3-(2,3,4,5,6pentamitilfeniD-o-alanil-leusil-arginil-prolin u obliku njegovog ·tilaaida, n-butl laaida, ciklopropilandda, ciklohekeilamida, trifluoroiaeti laaida, pentafluoroetilaaida i 2,2,2triiluoso· ti laaida, plro-glutaiail-histidil~triptoiil-e«rll-tiro»il-3- (2,4,6trieetllciklohekaiD-b-alanil-leucil-arginil-prolin u obliku njegovog e tl laaida, n-kuUlamida, eiklopropllarald«, ciklohekallanlda, triiluoroaotllaaida, penfcailuoroetilamida I 2,2,2trifluatoetilaaida, firo-glutamil-hietidi1-triptofil-eeril-tiroii1-3-/2,4,8tri (n-butll) olkloh<kail/*l>*alanil-leu«ll-arginil-prolin

u obliku njogovcg etilamida, r-bvtilamidu, ciklopropilarlda, ciklohekaildnida, tri£lunro;aetilaralda, pon ta fluor oe ti lar.i da i 2,2,2— trifluorootilamida, piro-glutaiiil-hiatldil-triptofil-aaril-ti rosil- 3- (parhidro-l-na£til)-0-alanil-leucll-arginil-prolia u obliku njegovog etilauaida, a-hutilaxaida, clkiopropilaaida, pentafluoroeti amida A 2,2,2-trifluor»atilainida, piro-glutandLl-histidil-triptofil-sarll-tirosil-j- (perhidro 2-naf til)-Kalani l-Ieucil-arginil-prolin u obliku njegovog e ti lasi da, n-butilaaida, ciklepropilaiaida, oiklohek3i lanida, tri fluorom» til amida, pentafluoroatilanida i 2,2,2-trifluorostilamida, piro-glutaail-hli» tidil-tr iptof il-3«ril-tiro»il-3- {4-perhidrobifeniliD-L^alanil-laucil-argiail-prolin u obliku njegovog etilaoida, n-butilamida, clJUopropilandLda, cikloheksil« axoida, fcrifluoroaetilamida, peatafluoroetilamida i 2,2,2tr1fluoroetllanida, piro-glu taai 1-h ia t i di 1-tr ip tofi 1-eer i 1-tir oai 1-3- (per h idro2,2-difeniliaetil)-D-alanil-leuoil-arginil-jpropil» u obliku sjsgovog etilamida, n-butllamida, ciklopropilaadLda, ciklohekailaoida, tri fluoro»· ti lami da, peatafluoroetilamida i 2,2,2« trifluoroetilamida, piro-glut«all-histi4il*tr$ptaifil*e«ril-<ire«il->- (2-naftil) l>ealaiU>9nMrttilU«eilwvl*Un^iia^ oblita bjogovog tali* amida, k«t. i7O-lS5°e, Λ/²⁵ *·ι<Λ (00.7, 1Q% sofceb n* o betilamida, clklopropilaoida, ciklofeeksilamida, tztfluoromtailamlAa, pontafluorootilamid* i 3,3,2-triflucroetilamidm, plrc-glotaiail-histldil-triptofi 1-seril-tiroiil-l- (2*naftil} D-alamil-lsolAucil-argiAll-prolin m obliku ajegovog etil&al»*da, c-butilamida, olkloprcpiUuai^·, Mkloheksilamid«, tri* r ' fluorometilatalda, pentafluoroofcllaznida i 2,2,2-trifluoroα tl lami da, i plro-ulatamil-hlstiJil-triptofil-saril-tirozil-3-(2-n^f til) D-alanil-norleuoil-arginil-prolin u obiiku njegovog atllaroida, n-butilaadda, ciklopropilamida, cikloheksilaffilda, trlfluorometllanlda, pentaf luoroetilamida i 2,2,2-trifluoroetilar.iida.

Primer β

Λ. Raetvor 0.1 g soli (piro(Glu-His-Txp-Ser-Tyr-3-(2-naftil)-D-Ala-Ldu-Arg-Pro*Gly-(Vidi Primer 1) »« fluorovodoηίλοπ rastvori ae u 30 ni vodo 1 propusti se kroz kolonu sa 50 g Dowez 3 anjonoimaajivačke smole koja je prethodno ekvilibriaana aa sirčetaetn klaelinoa i isparaaa sa dejcnizovane® vodom. Kolona ae eluira sa dejoatsovaaoa vodom i la tek so liofiliaira tako da se dobiva odgovarajuča so sa airčetne« ki ae linota (piro) G lu-3 is-Trp~Ser-Tyr- J- ( 2-nnfti 1) —D-A la-L® uArg-Pre-Gly~ua₂, /J™ -27.5° (C 0.S, HOAc) .

Ponavljanjem gornjeg postupka ali koriččenjesta drugih kiselina uaeato sirčetne kiseline sa vreme ekvilihraolje amle, nogu ae dobiti, na primer, odgovarajuče soli sa hlorcvodonlčnoa kiselinom, broaovodonlčncn kiselinom, «uspomaa kis e lino», fosforno» kiselino», osetnem klselineaa, beasoevoa klsellae» i sličnim.

Slično se mogu napraviti adicione soli sa kiaellnaaa drug jedinjenja Formule Z.

B. ϋ slučaju soli niške rastvorljivosti u vodi, ove se ηοφΒ napraviti taloMenjen is vode koriščenjem Željene kiseline Ka primer* \ ,

Cink-tanatna ao -rastvor 10 iag (piro)Glu-Hia-Trp-SerTyr-3- (2-naf til)-D-Ala-Lou-Axg-Pro-Gly-?iH₂# soli sa s irčatnom kiselinom rastvori sa u 0.1 al. vode I tretira se sa rastvo· scan 9 mg taninake kiseline u 0.08 al 0.25 H KaOH. Trenutno a« doda rastvor 5 ng SnSO^ heptahidrata u 0.1 al voda rastvoru LH-RH analoga,

Dobivena suspansija aa rarblaii aa 1 al vode i talog o e cantrifugira. Freaideaa tečnost ae odekantuje i ostatak sc i3pexa dva puta sa partijama od 1 »1 vode centrifugiranjem talog a i dekantovaajan preaidane tečnosti. Talog se suši u vakumu tako da ae dobiva 15 mg reešovite cink—tanatne soli gore imenovano? LH-RH analoga.

Ramoatna so - rastvoru 50 ag (piro)Glu-Hie-Trp-Sar-Tyr3-(2-naftil)-l>-Ala-Leu-Arg-Pro-<31y-wa₂, soli sa sirčetnom kise linčem, u smeSl 1.6 ni etanola i 5,1 al 0.25 M NaOH doda se rastvor 11 ag parnoinoka kiseline β 0.3 al 0.25 M NaOH. Rastvarači so odvoje na smnjeoon pritisku 1 ostatak ae auapenduje u 2 mi vode, eentrifugira se, 1 presičena teč no at se odekantuje. Talog ee ispere ea 1.5 ηΙ,Η^Ο, oentrifugira se 1 prešide«c tečnost se odekantuje. Talog so eufli u vakunu teko da se dobiva 54 ng pamoatne soli gore imenovano? LH-RH analoga.

Ha eličan način mogu se napraviti druge soli niške rastvorljlvoeti u vodi.

C. Dobivanje adicione soli sa kisellnena is slobodnog peptida.

Bas tvoru 50 a? (piro) Glu^Mia-Trp-Ser*Tyr-3-(2-naf til)0-llft-Leu-Arg-Pre-Gly-Ka₂ α oblika elobodne base doda se . . c . .

ml lli airdetno kiaoiine. Dobiveni reatvor ae liofilizira tako da ea dobiva 50 ing. soli gora iraanovanog LH-RH analoga ea alrdetnom kiselinom.

Na sličan način, zamnora nirčetne kiaoldLne 3a drogira ki so linama {u siahioraetrijaki ekvivalentnim količinam u odnosu na peptid} dobivaju 3© druge adicione soli jodinjenja Formule (I), na primer, soli sa hlorovodoničnom kisalinča br«ROVcxloniiinom kiselinom, sumpomom kiaolinesa, foafernerc kisal tnom, fosfornem kiealJLncm, azotnom ki Solinom.

D. Dobivanja aoli β* metalnim katjonora, n.pr./ cinkava ao Raa tvoru 50 rag (piro)01u-d.is-Trp-3er-Tyr-3- (2-naftil)* IJ-Ala-Leu-Arg-Pro-Gljf-Kiij* aa slrčetno« kiaolino.a u att&o&i 9.4 ral 0.25 M KaOK, 0.3 jal vode i 1 ral etanola doda a« rastvor 15 ag ZnSO^ heptahidrata u 0.2 ral vodo. Taloj s« centrifugira i pre Bičana tečnost sa odekantuje. Talog s« ispare ea 1 tol vodo centrifugiranjem i dekantovanjer. prosi dene tečnosti. Talog se auSi u vakunu tako da se dobiva 48 »g clnkove soli gore laenovaneg RH-LH analoga,

Sa sličan način mogu s« napraviti soli sa drugim polivalentnira katjoalna, n.pr., kaleljuacm, biausutom, barijunca, nagnatijunca, alualraljeao«, bakkoa, kobaltom, nikloa, kadaijuaom i alilnira.

raiasuJL

Rastvor 50 rag (piro) fllu^His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naf til)D-kla-L«u-Arg-Pro-Gly-sa₂, soli sa sirdetacm kiselinom, u 23 ral vod« propasti sa kros kolenu od 50 g Dowex 1 (jao besna, kva ternama amonijem aujonskoisasajivačka smola) koja je bila akvilibrissna sa raatvoro» NnOH da se dopuni suprotni Uidrokaidni jon. Kolona so eluira sa 150 ral vode i eluant se Iiofilizira tako da ao dobiva 45 rag odgovarajudeg polipeptida kao 3lobodna baza«

Ha allčaa način druga adicione soli jedinjenja Formule (I) z n.pr., one «poiaenute u Primeru 6, raogu ne prevesti u odgovarajuče slobodnu baza.

Primer 8

Slede tipični farmaceutski preparati koji eadrS», kao aktivni sastojak, Ll-lVi analog is eadažnjag pronalaska, na primer, (piro) Glur-Hi3~Trp-Sar«<Eyy-3- (2-aaftiD-D-alaailLo«-Arg-Pro-aiy-NH₂, sanostalno ill u obliku farmaceutski prihvatljive soli, n.pr«, adicione soli sa slrdetnom ki&oli» aoa, cinkove soli, cink-tanatne soli, itd.

A. Formulacija sa tablete ta bukalno (n.pr., podjezično) davanje j

1.

LHH1H analog

Kompriraujudi Sodar, DS? Kalcijura-atearat

LH-RU analog Kompriraujudi Aeder, USP MAgae si j urar*· fceuat

3. LS-A3 analog

Manitol, 88»

Magnezi juau-atear at, 08P PreSeletinisireni akoob, 88»

4. LH-BH analog Laktoza, DSP

PreMelatlnlsiranl škrob, 08» Magneaijua-atearat, 88»

2.

50.0 /Ug, 96.0 mg

4.0 rag .0 rag

98.5 mg 1.5 mg

25.0 ^ug

88.5 tsg 1.5 a?

30,0 «g

200.0 /Ug 83.3 rag 15.0 rag

1.5 mg

Postupak ^aa proizvodnju

a. Lli-Ri; analog se rastvori u vodi, u sadovoljavajudoj količini Ja ec obraaujo mokra granulacija kada ae meča ea 3e<J«rnim dalora saatojaka. I'OJle potpunog maSanja, granulaci ee »uši na ollttci auSaSa aa fluidnim slojem, Suva granulacija e« tada saje da se rasbiju saakakvl veliki agrogati i tada ae xao3a sa preostalim komponentama. Granulacija s© tada sablja na atandardnoj malini sa tablo tiran ja do speci £ična težine tablet«.

b. U ovom postupku za proizvodnju, sv« formulacija d« uk lj uči vati 0.01% želatina, US?, želatin ča sa najpre rutv rili u vodenom rastvaraču aa granulaoiju, a onda sa doda Lh-RH analog. Preostala faza su kao u (a) gore.

Formulacija 4 »o 2« aa takodja koristiti kao tableta ; oralno davanje.

3. Dugotrajna formulacija za intramuakularne inokcije.

1. Pugotrajne Χ.Η. jnekcije - gel u »ezaroovon ulju

LU-λΠ analog	1.0 mg
A lunini jura-aoaaetaarat, USP	20.0 jag
Sezamovo ulj« q.s. do	1.0 mg

Aluminij uia-ročnost e ar at sa spoji sa sezamovim ulj «m 1 zagreva se na 125°C aa raaSanjejn dok ae ne obrazuje bister Mut rastvor. SmaSa se tada autoklavira radi sterilnosti i ostavi s« da se hladi. LH-RH analog a« tada doda aseptično sa okraden. Naročito poSeljnt RH—IH analosl su soli nitke rastvorijivosti, n.pr,, ©Inkove soli, ciak-tanatne soli, panoatne soli, i slične. Ova ispoljavaju dugotrajnu akti·* vnoet.

2.	Lugotrajn« Χ.Μ. inekciio - mikrokapsule u polimeru
	koji aa EioSe blodegijadlrati
	LH-RH analog	1%
	25/75 glikozid/laktidni kopolimer (0.5 unutrašnji viskozitet)	935
Mikrokapaule (0-150^u) gornje formulacije suspendovana
	□e k atrosa	5.0t
	CMC, natrijum	0.5¾
	Benailalkohol	0.9%
	iveen 80	9.1%
	Voda, prečiščena g.a.	100.0%
25	»g mlkrokapsula suspendovač« se u 1.0	ral nosača.
C.	Vodeni rastvor za intrauauskularaa inekcije
	LB—RH analog	23 sag
	želatin, neantigenski	5 mg
	Voda aa inekcije, g.s do	100 ral
Rastvoriti želatin i LH-RH analog u vodi	Sa inekcije,
sterilno filtrov«ti rastvor.
D.	Vodeni rastvor za naaalno davanje
	LH-RH analog	250 mg
	Peketroza	5 g
	Benzilalkohol	0,9 g
	Voda, prečiSdana g.a do	100 ral

Rastvoriti LE-RH analog, dekatrozu, beazilalkohol u prečiMenoj vodi 1 q.s. do aapreraiae.

B. Formulacija sa rektalno davanje \

- 43 Nosač supozitorije za rektalno davanje

LU-R11 analog 500 /U*J

Wltenaol K15 20.0 gra.

UI-RB analog sa spoji ea raatvorca a topi jenog Viitepsol ill 5, dobro so meša i Islij» se u kalupe sa 2 g.

PRIMER 3

Supreslj« «struna na paoovu

POSTOPAK: ženko pacova (Hilltop, Sprague Dasrley, približno 200 g. sa ofcvoreaia vaginama) s« gruplšu po to Sini po 5/kavea i po 2 kavaza/grupa. Pacoviraa sa daju pctkolae Aneksije, dva puta dnevno (izuzev kao 3 to ja naznačeno ni Se) tokom 14 dana. Uziaaju aa dnevni vaginalni razmazi da je odredi faza ciklusa astruaa i bale S« se telesne teSine 9, 1 i 2 nadalje. ZbalaSi se procenat ženki koje pokazuju paroijalnu aupreeiju estruac (t.j., samo diestrusa 1 pro«Štrusa ali ne astrusa) od dana <4 i procenat Šenki koja pokazuju koranlotnu aupresiju estrusa (t.j., sarao diastruu od dana 4. doz« sa isvoda is kallbraoione prave linij« prooentnlh poda taka o supreeiji eatrusa. UHRS «nalezi sa daju kao njihova acetatne soli u flsioločkcm slano« rastvoru koji sadrtl 0.11 volovsko? seruma albumina. Sapremina inekeije bila ja 0.2 «X « «melosi su bili pri*· sutai u 0.05, 0,1,0.2 iii 0.4 ^ug. Kontrola (fiziološki slani rastvorkoji sadrSi BSA) nije pokaživa!« suprestju astma«.

4ο

LDj-θ vreč η oa ti za pareijalnu i kompletna a upr ί-Vat ju aatruaa su sledeča;

Jedjnjanje ,^50 (^ug/inj ♦ ) (piro) G lu-ΐί ia-Tr9-Sar-Tyx- 3- (2-naf ti 1) t^alanil-Lau-Arg-Pro-KL^ 0.08

(piro)Glu-nis-Trp-Ser-T/r-l-(2-naftil)D- a lani 1- Lei u-Arg-Pr o-NHEt	0.22
(piro) Glu-.ii3-Trp—5er—7yr—3—(2-Ba£til)D—a 1 an i 1- L- ;<e Le u-Ar g-Pro-<3ly—	0.07
(piro) Clu-Hia-Trp-Ser*'jyr-3- (2~na£til) D— n la n i 1-L-? ie Lo u-Arg-Pro-USBfc	0.12
(piro) Glu-ί 'ia-Trp-eer-Tyr-3* (2,4,6-trimeti lf eni 1) -D-alanll-Leu-Ar^-Pro-Ol^-NH^	0.03
(piro) Glu-Hia-Trp-Ser-č^r-S- (1-naftil) D—alani1-Lo u-Arg-Pro-Gly—NH	0.3
(piro) Glu-iiie-Trp-Sar-Tyr-3- (9-aatril,P-alani1-Leu-Arg-Bro-aiy-NH2	0.27
(piro) Glu-ni3-Trp-Ser-?yr-3- (4-bifenilil)0-a lani 1-Le u-Ar g-Paro-OlT-MHj	0.28*
(piro) Glu-His~?rp-8er-Tyr-3* (2-f luosrenil) D-alanil-Leu-Arg-Fro-Gljf-MHj	0.40*
(piro)Glu-Hls-Trp-Ser-Tyr~J-(2,2-difenilne ti 1) -D-β lan i l-Leu-Arg-Jbr o-Gi^-KHBt	0.11
(piro) Glu-Hi3-Tzp~8er-Tyr-3- (2,4, 6-trim tllfenil) -D-alanil-l(-Maiaur<Ar9-Pro-H}ly-XH2	0.35*
(piro)-0lu-Hia-3- (i-Kaf t±l)-ir»alanil-8«r-
Tyr-3-(2-naftil)-l>alanJLl-iao-Ar<j»Pro-HKKt 0.16

a - ia ova jedinjenja davanje je bilo Jedncs» dnevno.

\

Ι’ΧΙΜΟ 10

Grupi od Seat 3vajcarakih Webeter aiSeva (Simonuoa) koji teže po oko 25 yraxno, daje so potkožnora inckcijor..

0.25 ml vodenog rastvora (piro)Glu-Hi8-Trp-Ser-Tyr-3- (2-naf til)-D-alanil-Leu-Arg-Pro-Gly-JU_? u obliku acetatno soli. boxa je bil« 40 mg/kg iii oko 1 rag/ioiS. /J. Sevi au oamatrani dva puta dnevno na aortnost tokom 21 dana. Niau aapaSeni letalni efekti. LDgg je sato veča od 40 ag/ktf·

Najbolj! način za upotrebu pronalaska u privredi koji je poznat

Prijaviocu

Pronalazak se može najbolje primeniti ako se striktno prati sledeči postupak :

Smeša 2.0 g zaštičene polipeptidr.e smule formula :

(piro)Glu-His(tožil)-Trp-Ser(benzil)-Tyr-3-2-naftil-D-Ala-32-fluorenil-Leu-Arg(2,6-dihlorobenzil)-glicinamid-nosač i 2 ml. anizola (hvatač) u Kel-F reakcionom sudu tretira se sa 20 ml. redistilisane (iz CoF^) tečne HF na 0°C tokom 30 minuta. HF se ispari u vakumu i ostatak (piro)'-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3(2-naftil)-D-alanil-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2, u obliku HF soli, ispere se sa etrom. Ostatak se tada ekstrahuje sa glacijalnom sirčetnom kiselinom. Sirčetno kiselinski ekstrakt se liofilizira tako da se dobiva 0.8 g. sirovog materijala. Sirovi polipeptid se stavi na 4 x 40 cm. Amberlite XAD-4 kolonu (polistirol-4% divinilbenzolni kopolimer) i eluira se sa konkavnim gradientom iz vode (0.5 1.) prema etanolu (1 litar). Epruvete koje sadrže frakcije iz izlazne zapremine 690 ml do 1470 ml. se sakupe i ispare do suva i na ovaj način se dobiva 490 mg. prečiščenog peptida. Ako je potrebno, ovaj peptid se dalje prečisti konvencionalnim tehnikama koje se koriste za prečiščavanje peptida.

Claims (2)

1, Postupak za dobivanje nonapeptidnih i dekapeptidnih derivata hprmona za oslobadjanje luteinizirajuceg hormona/* opšte formule (I):

(piro)Glu-His-V-Ser-Tyr-X-Y-Arg-Pro-Z (I) i njihovih farmaceutski prihvatljivih soli, pri čemu je u formuli (I):

V triptofil, fenilaldjiil iii 3-(l-naftil)-L-alanil;

X je 3-(x')-D-aldshil gde r je 2-naftil, 1-naf til, 2-fluorenil,

2,2-difenilmetil, '4-bifenil, 2,h,6-trimetilfenil i 9-antril;

Y je leucil iii N-metil-L-leucul; i

Z je glicinamid, glicinetilamid iii etilamin;

naznačen time, što jedinjenje opšte formule:

(piro)Glu-His-(r₁)-V-Ser-(r₂) Τ>κ-(Γ,ρ-Χ-Υ-Α^(Γ^)~ΡΓ0-(Ζ)_η_3 gde su V,X i Y kao što je definisano napred, Z je glicil, n je 0 iii 1, r^ je tožil, je benzil. je 2-brombenziloksikarbonil iii 2,6-dihlorbenzil, r.j je tožil i S je kovalentno vezan čvrsti nosač takav kao što je benzhidrilamino-polistiroldivinil-benzol smola, reaguje za sredstvom za uklanjanje zaštitnib· grupa i smole takvim kso Što je tečni anhidrpavnifluorovodonik u anizoiu ua -faeapornbur^i—ed 0^6· iii aminoližom sa etilaminom^na ^T.'-»mperaturi od.0+2% se odvoji smela , a zatim se uklon® zastHAč- grupe sa anhidrovanim tečnim fluorovodonikom u anizolv temperaturi 0°C, tako da se dobija jedinjenje formule (T) ko j g, se po potrebi prevodi sa kiselinom u svoju farmaceutszi prihvatljivu so.