PT99458B

PT99458B - Processo para a concepcao e para a preparacao de antagonistas da hormona libertadora da hormona de luteinizacao (lhrh)

Info

Publication number: PT99458B
Application number: PT99458A
Authority: PT
Inventors: Xiao Shaobo
Original assignee: Asta Medica Ag
Priority date: 1990-11-10
Filing date: 1991-11-08
Publication date: 1999-02-26
Also published as: DE69125024D1; UA41300C2; DE69125024T2; NO931697D0; YU48831B; SI9111779B; CA2095932C; SK45393A3; CN1061605A; DK0564466T3; FI933156A7; KR930703353A; LT3971B; CA2095932A1; GR3023389T3; ES2100965T3; EP0564466A1; AU662496B2; SK281319B6; HRP920585A2

Description

DESCRIÇÃO peptidos

A presente invenção refere-se a novos aos seus derivados que possuem uma estrutura química exacta. A presente invenção descreve também métodos para a sua preparação e diversas aplicações. A hormona de libertação da hormona de luteinização hipotalâmica (HLHL) actua sobre a glândula pituitária anterior para estimular a secreção da hormona da luteinização (HL) e a hormona de estimulação folicular (HEF). 0 análogo antagonístico da HLHL actua sobre a pituitária anterior rapidamente, tem uma acção duradoura, pode ser utilizado segura e reversivelmente como contraceptivo ou pode ser utilizado selectivamente para a

supressão	da secreção da gonadotropina. Para esse tipo de
aplicação	os antagonistas da HLHL são superiores aos
agonistas.	Até ao presente foram concebidos e sintetizados

mais de dois mil análogos da HLHL, entre os quais o análogo Nal-Arg demonstrou possuir uma actividade bastante elevada de anti-fertilidade. Contudo o análogo Nal-Arg demonstrou possuir também uma poderosa actividade libertadora da histamina (ALH). Verificou-se que provocava edema transitório no focinho e nas extremidades das ratazanas quando administrado num regime de dosagem correspondente a 50-100

vezes a	dose terapêutica. Os resultados de experiências
clínicas	demonstraram efeitos sistémicos associados à
histamina,	Outros antagonistas da HLHL contendo DArg⁶ ou

DLys⁶ exibem efeitos secundários idênticos, sendo o valor da DE50 para a ALH inferior a 1 μg/ml. A presente invenção proporciona novos antagonistas HLHL que possuem uma

actividade anti-ovulatória (AAO) bastante elevada e uma actividade libertadora de histamina (ALH) bastante fraca e efeitos secundários desprezíveis.

conteúdo e os exemplos da presente invenção descrevem as questões seguintes:

A metodologia do projecto da presente invenção baseia-se na semelhança topológica existente entre a 1 2 3 molécula do composto original ([NAc-D2Nal , DpCIPhe , D3Pal ,

Ser⁴, Tyr⁵, DArg⁶, Leu⁷, Arg⁸, Pro⁹, DAla¹⁰]NH₂ (II)) e um neuropeptido, a Substância P, que proporciona a modificação das áreas alcalina e lipofílica na molécula do composto original para proporcionar novos antagonistas que possuem simultaneamente elevada AAO e fraca ALH. 0 termo modificação agora referido significa o ajustamento ou a 5 6 substituição dos aminoácidos na área da sequência Tyr -DArg g

-Arg no terminal C e dos ácidos aromáticos no terminal N do composto de fórmula (II) . Mais especificamente, o projecto consiste em introduzir um grupo alcalino adequado e em substituir os aminoácidos não naturais nas posições 2,3,5,6,8 do composto de fórmula (II).

Seguidamente refere-se também métodos e exemplos da presente invenção,

1. Introdução de D3pal que é um aminoácido aromático que possui uma alcanilidade adequada em substituição de DArg no composto de fórmula (II) para

Ί proporcionar ο análogo de fórmula (III) : [NAc-D2Nal ,

DpCIPhe², D3Pal³, Ser⁴, Tyr⁵, D3Pal⁶, Leu⁷, Arg⁸, Pro⁹, DAla¹⁰]NH₂

2. Introdução de Arg em substituição de 5

Tyr no composto de formula (III) para proporcionar o composto de fórmula (IV): [NAc-D2Nal^>', DpCIPhe², D3Pal³,

5 6 7 8 9 10

Ser , Arg , D3Pal , Leu , Arg , Pro , DAla ]NH₂

3. Introdução de Dphe' ou dos seus derivados DXCH₂Phe em substituição de D3pal no composto de fórmula (IV) para proporcionar o composto de fórmula (V):

[NAc-D2Nal¹, DpCIPhe², DPhe³, Ser⁴, Arg⁵, D3Pal⁶, Leu⁷, Arg⁸,

10 3

Pro , DAla ]NH₂, ou seus análogos de grupo (DXCH₂Phe ).

4. Introdução de DPhe ou seus derivados em substituição de D3Pal no composto de fórmula (III) para proporcionar o composto de fórmula (V [NAc-D2Nal¹,

DpCIPhe², DPhe³, Ser⁴, Tyr⁵, D3Pal⁶, Leu⁷, Arg⁸, Pro⁹,

3

DAla ]NH₂, ou seus análogos de grupo (DXCH₂Phe ).

Foram ja sintetizados diversos novos antagonistas de HLHL de fórmula [NAc-D2Nal”', AA², AA³, Ser⁴, AA⁵, AA⁶, Leu⁷, AA⁸, Pro⁹, DAla¹⁰]NH₂ em que o símbolo AA representa aminoácidos de origem natural ou não natural que são expressados sob as formas D- ou L-ArAla.

Mais especificamente a simbologia utilizada significa o seguinte·.

AA = D-pCIPhe, D-ArAla, DPhe, Ar-Ala, DXCH₂PHe;

AA = D3Pal, Ar-Ala, D-ArAla, DPhe, D-XCH2Phe;

AA = Arg, DMap, Pip, Tyr, Pal, Mop, Tep, Map, Phe, Eap, Pap, Bap, DMop;

AA⁶ = D3Pal, D-Ar-Ala, D-XCH₂Phe_; g

AA = Pip, Mop, Tep, Map, Eap, Pap, Bap, Arg;

em que

R₂'N-,

RR'N-:

em que
R'	= ch₃-,	ch₃ch₂-, c₃h₇-,	C4H9-, H-;
R	= CH₃-,	ch₃ch₂-, c₃h₇-,	C₄H₉-, H-;
Os	antagonistas da HLHL obtidos utilizando 0

método anteriormente descrito, os quais constituem um peptido para fins medicinais, podem ser utilizados para tratar doenças do sistema endócrino reprodutivo, tais como a edometriose, a puberdade precoce das crianças e para tratar o cancro da próstata e o cancro da mama, e podem ser utilizados também como contraceptivos masculinos ou femininos para o controlo da natalidade, ou podem ser utilizados na diagnose e no tratamento da infertilidade, etc.. Esses peptidos para fins medicinais podem ser formulados como injecções normais, cápsulas injectáveis ou podem assumir o aspecto de outras formulações para aplicação prática.

Descrição pormenorizada da presente invenção

No fenómeno natural de libertação da histamina no corpo, o neuropeptido designado por susbtância P desempenha uma função muito importante, estando o correspondente valor de DE50 para a ALH compreendido entre 5 e 15 μΜ. A estrutura química da substância P (SP) é a seguinte: [Arg¹, Pro², Lys³, Pro⁴, Gin³, Gin³, Phe⁷, Phe³, 9 10 11

Gly , Leu , Met ]NH₂. O estudo da relação entre a sua

2 3 estrutura e a ALH demonstrou que a sequência Arg -Pro -Lys no terminal N na molécula da SP é essencial para a sua ALH devido ao facto de a supressão desses três aminoácidos da molécula abolir completamente a sua ALH. Pelo contrário, a supressão de um, dois ou três aminoácidos manteve a ALH a um nível correspondente a um quarto da AH da própria SP. A supressão adicional dos resíduos Phe e phe , originou a redução da ALH para 4% e para 0.57% dos valores ~ 5 6 correspondentes a SP. A supressão adicional do resíduo Gin ' não originou nenhuma alteração significativa da ALH. Os resultados anteriores permitem concluir que a área lipofílica em torno do resíduo phe ' determina o valor da ALH, estando esta área implicada na ligação da molécula da SP aos receptores da célula mastóide.

Conforme referido antes, os análogos *1 6 (D2Nal , DArg ) da HLHL demonstraram uma ALH bastante elevada, possuindo a sua estrutura molecular uma semelhança £ 7 ρ topológica com a SP: a sequência DArg -Leu -Arg naquela 1 2 3 parece corresponder a sequência Arg -Pro -Lys nesta, mas possuem um par de resíduos aminoácidos fortemente alcalinos entre os quais se encontra presente um resíduo aminoácido η /· neutro, isto é, os dois análogos [D2Nal , DArg ] da HLHL e da SP contêm dois resíduos aminoácidos fortemente alcalinos cuja relação entre si corresponde à posição 1,3. Por outro lado, considera-se que um grupo de resíduos aminoácidos aromáticos

8 daquela sequência corresponda à área do resíduo Phe ' na SP em termos de determinação da amplitude da ALH.

objectivo da presente invenção reside era dois aspectos: um deles consiste em modificar a área da sequência Tyr⁵-DArg⁶-Arg⁸ no terminal C e noutro aspecto consiste em proporcionar o ajustamento fino dos ácidos aromáticos após optimização da modificação da área alcalina no terminal C. Utiliza-se como composto original o composto [NAc-D2Nal¹, DpCIPhe², D3Pal³, Ser⁴, Tyr⁵, DArg⁶, Leu⁷, Arg⁸, 9 10

Pro , DAla ]NH2 o qual demonstrou possuir uma AAO de 100% para dose de 0.5 pg em óleo de milho e de 57% para a dose de 0.25 p,g.

Em primeiro lugar, o resíduo DArg⁶ no composto de fórmula (II) pode ser substituído por ácidos aromáticos neutros ou fracamente alcalinos tais como D3Pal, D6Qal, tetra-hidro-triptofano, metil-triptofano. Obtem-se o composto de fórmula [Nac-DNal\ DpCIPhe², D3Pal^3/6,

6 DAla ]HLHL(III) quando se introduz o resíduo D3Pal em substituição do resíduo DArg⁶ na fórmula (II). O composto de fórmula (III) demonstrou uma AAO de 100% para a dose de 3 μg e de 83% para a dose de 1 μg (em óleo de milho) e o seu valor DE50 para a ALH foi de 9,8 μg/ml, muito melhor do que para o análogo Nal-Arg (0 valor DE50 para a ALH era inferior a 1 μς/ιηΐ. Admite-se que a alcalinidade de toda a molécula possa igualar ou estar próxima da correspondente a um par de

resíduos arginina no sentido de proporcionar uma elevada AAO.

Uma vez que a posição 5, tal como a posição 6, não está implicada ao receptor, é possível inserir nessa posição 5 uma ampla variedade de aminoácidos incluindo a arginina. Foi concebida e projectada uma série de novos análogos. Por ~ 5 exemplo, a introdução de resíduo Arg substituindo o resíduo

Tyr no composto de fórmula (III) proporcionou o composto de fórmula [NAc-DNal¹, DpClPhe², D3Pal³'⁶, Arg⁵, DAla¹⁰] HLHL (IV). Tanto o composto de fórmula (IV) como o composto de fórmula (II) contêm dois resíduos arginina, mas a distância entre os dois resíduos arginina no composto de fórmula (IV), cuja relação geométrica passou para a posição 1,4, isto é, existem dois outros aminoácidos entre esses dois resíduos arginina, ficou maior do que no composto de fórmula (II). Em consequência, foi possível reduzir a ALH e, por outro lado, devido à presença dos dois resíduos arginina, a AAO não ficou inferior à do composto de fórmula (II). 0 resultado de um bioensaio efectuado com o composto de fórmula (IV) demonstrou que o valor DE50 para a ALH é de 35 μg/ml, ao passo que a AAO foi de 50% para a dose de 0.125 μg (óleo de milho), de 85% para a dose de 0.25 μg e de 100% para a dose de 0.5 μg.

Isto permitiu constatar pela primeira vez que antagonistas da HLHL exibem ura valor de DE5Q para a AAO que é igual ou inferior a 0.125 μς. Em consequência, uma outra concepção teve como base a estrutura do composto de fórmula (IV).

6

Existem quatro resíduos alcalinos, D3Pal^J/

8 e Arg ' , na molécula de fórmula (IV) ao passo que a molécula de fórmula (II) contém apenas três resíduos alcalinos. Por essa razão é razoável substituir um resíduo D3Pal por um aminoácido neutro; por outro lado, o composto de fórmula (IV) demonstrou uma hidrofilicidade muito forte pelo que a redução da hidrofilicidade por introdução de um aminoácido hidrofóhico substituindo o resíduo DPal no composto de fórmula (IV) poderia ser benéfica para a retenção do fármaco no corpo e consequentemente para o prolongamento da duração eficaz. Foram depois concebidos novos análogos por substituição do resíduo D3Pal no composto de fórmula (IV). 0 melhor desses compostos possui a fórmula o número especificado de NAc-D2Nal¹, DpCIPhe², DPhe^{3 *}, Arg⁵, D3Pal⁶,

3

DAla ]HLHL (V) na qual o resíduo DPhe substitui o resíduo

D3Pal . 0 composto de fórmula (V) demonstrou possuir 100% de AAO para a dose de 1 ^g (em solução salina) igual à do composto original de fórmula (IV), ao passo que a ALH foi reduzida a metade: o valor DE50 para a ALH foi de 7.4 ^g/ml.

Outra substituição por introdução do resíduo

DPhe em substituição do resíduo DClPhe reduziu a lipofilicidade desta área na molécula e reduziu-a a ALH.

6 7

Admite-se que a sequência Arg -D3Pal -Leu g

-Arg no terminal C do composto de fórmula (IV) desempenhe

uma função essencial no sentido de desencadear a libertação da histamina. 0 resíduo D3Pal combina a aromaticidade, a alcalinidade e a hidrofilicidade numa mesma molécula, e é também estereoaceitável nos antagonistas da HLHL para a ligação ao receptor. De modo idêntico, a concepção de novos aminoácidos não naturais que possuem a mesma característica do resíduo D3Pal pode proporcionar melhores antagonistas da HLHL do que os compostos de fórmulas (IV) ou (V).

A modificação dos aminoácidos naturais, lipofílicos e aromáticos, por exemplo, a fenil-alanina, por exemplo, recorrendo ao método a seguir descrito no parágrafo intitulado Sínteses de Novos Aminoácidos Não Naturais, proporciona uma série de novos aminoácidos que combinam aromaticidade, hidrofilicidade e alcalinidade numa molécula e podem ser expressos pela fórmula: R<|R2NCH2C6H4CH2CH(NH)CO2H (VI), em que os radicais R^ e R2 podem ser iguais ou diferentes, podem ser cíclicos ou de estrutura em cadeia e podem conter também um heteroátomo. Com a modificação dos radicais R-| e R2 é possível obter uma série de aminoácidos os quais demonstram possuir características especiais, hidrofilicidade e alcalinidade sistemicamente modificadas. A introdução desses aminoácidos na posição 5, 6, 8 do composto de fórmula (IV) proporcionou três séries de novos antagonistas da HLHL. Os resultados do bioensaio demonstram que cada série proporciona pelo menos um novo antagonista que

8 demonstraram que os resíduos Arg ou Lys não são exibe 100% de AAO para a dose de 1 μ9, idêntica à do composto de fórmula (IV), ao mesmo tempo que a ALH foi significativamente reduzida. Como exemplo refere-se o composto de fórmula (VII): [NAc-D2Nal¹, DpClphe², D3Pal³, Ser⁴, Mop⁵, D3Pal⁶, Leu⁷, Arg⁸, Pro⁹, DAla¹⁰]-NH₂ o qual demonstrou a 100% de AAO para uma dose de 1 μg, um valor DE50 correspondente a 14.7 μ9/ΐΐΐ1 para a ALH, admitindo-se que é melhor do que o composto de fórmula (V). Ao preparar-se o

O composto de fórmula (VI) por substituição do resíduo Arg no composto de fórmula (IV), verificou-se que a diminuição da intensidade da ALH estava positivamente correlacionada com o cumprimento do radical R no composto de fórmula (VI) pelo que o valor DE50 para a ALH pode eventuaimente ser superior a 200 μg/ml, sendo possível dissolver facilmente esse tipo de compostos em soluções aquosas e admitindo-se a sua utilização clínica sem problemas de formulação. Esses resultados essenciais para os antagonistas da HLHL altamente poderosos. O centro alcalino adequado na posição 8 pode garantir uma elevada AAO, ao mesmo tempo que a actividade que induz as células mastóides a libertar a histamina foi notavelmente reduzida quando o centro alcalino anteriormente referido exibia um significativo bloqueio especial.

A presente invenção que combina simultaneamente a modificação dos terminais N e C

2

proporciona melhores antagonistas da HLHL.

processo de síntese é ilustrado conforme se indica a seguir:

1. Síntese de Novos Aminoácidos Não Naturais

Concebeu-se e sintetizou-se mais de 60 séries ou casos únicos de aminoácidos de configuração D ou L em conformidade com as quatro vias de síntese representadas no esquema a seguir indicado. A estrutura desses aminoácidos não naturais está representada pelas fórmulas estruturais gerais indicadas no mesmo esquema. Alguns desses aminoácidos possuem isoladamente alcalinidade, hidrofilicidade e aromaticidade ao passo que outros possuem todas essas propriedades na mesma molécula.

Via I

ArNH

H01

NaNO.

ArN+Gl

ArGH₂Cl + HC(C00Et)₂

NaOEt

NH-Ac

CH₂=GHC00H d,l- ArGH_oGHG00H <- I σι

ArCH₂C(COOEt)₂

NH-Ac

NaOH/EtOH

GOONa nh₅/h₂o

ArCH_o-G-CQ0Et <- I

NH-Ac d,l- ArCH₂CHC00H

I

NH_O

Ac₂0 d,l- ArGH_oC

I

GHGOOH

COOH

I

Ar-CH₂-C-C00Et

NH-Ac

d- ArGH_oCHG00Et <- I

NH-Ac

1ArGH_oGHG00H <-1 zx

HGl

NH-Ac

HG1 d- ArGH₂0HG00H nh₂-hgi dibutilo| dicarbonato d- ArGH_oCHG00H <- I

NH-Boc

1dibutilo

ArGH₂CHC00H nh₂-hgi dicarbonato

1- ArGH-GHGOOH <- I

NH-Boc

^TH-Boc

D ou L-ArCH₂-GH-C00H

Via I

Via II D ou L-Ar0H_o-0H-G00H ² \

NH-Boc em que “ ©ô,

tfN-,

RR*N- 15 d, 1

Via III a-

-/Qy CHpÇHCOOH

X^y/ W

EtOH

SOGl, *

/-CHpÇHOOOEt

-GHpÇHCOOH nhqch₅

Znci,

GH^OGH-Gl' l 3 C

Amina Secundária a- xch₂HGl a- xch,

HGl

1) dicarbonato d- XCH,

Via III D x= a- G1GH,

-GH^GHGOOEt ^NHGGH, õ ⁵

EtOH

-GH_oGHG00Et

IGGH, li 3 0

3H_?ÇHCOOH nfe₂-Hcl

2) H⁺

SOG1

ZnGl,

2/Et0H

1- -CHpÇHCOOEt

NHCGH, nhçgh.

'

CH₅OGH₂C1

1- G1GH

OHGOOEt

Amina

Secundária

1- XCH,

NHGCH, n 3 O

EtOH :o 0H₂ÇHG00Et π 3 0

HGl

Ο-GHpÇHGOOH I-XCHp (O/GH.GHGGOH NH-Boc _πηΊ V-V NH_O-HG1

HGl

1) dicarbonato

1- XGHz

2) H⁺

em que

D> -GH₂ÇHG00H ou L-X0H₂ ^<^y-GH₂gHG00H \_/

R^H-, RR’N- 16

KHCO,

Ar-GHO + σθΗ^-ΟΟ-ΝΗΟΗ^Ο^-^-θ²* Ar-CH-C-C^ ² Lo- \o₆h₅

HCl cone.

Via IV ♦Ar-CH₂-0H-G0₂H

NH-OO-CgH^

->Ar-OH=C-GOpH _±nh-oo-c₆h₅ ^Pd/C

Isómero D

6NHG1

I 9,

Ar-GH_oGH-G-0H <-1 nh₂ (Aminoácido D)

Isómero L 6NHG1 ▼ 9

Ar-GH₀GH-G-OH

NH₂ (Aminoáciclo L)

Y = (GH₅)₂N-, (GH₅GH₂)₂N-, (GH₅GH₂GH₂)_nN-, ^GH5 ( '''.CH)/-, (CH₅GH₂CH₂GH₂)₂N-,

GHoO-,

Y_/

2. Síntese do Peptido

Inicia-se a síntese a partir do terminal C o peptido resina de cloridrato de benzidril-amina (resina BHA) utilizando o método da síntese peptídica em fase sólida introduzido por Merrifield. Trata-se de um processo de três passos incluindo a fixação, o acoplamento e a clivagem. 0 dicloro-metano (DCM) é o solvente principal utilizado para se efectuar lavagens entre passos consecutivos da reacção ao passo que o álcool isopropílico (AIP) e a N,N-dimetilformamida (DHF) são também utilizados quando for necessário. Utilizando como catalisador um excesso de diciclo-hexil-carbo-di-imida (DCC), efectua-se a reacção de acoplamento ao mesmo tempo que se adiciona uma quantidade adequada de 1-hidroxi-benzotriazol (HOBT). 0 grau de acoplamento verificado na reacção é verificado pelo método da ninidrina de Kaises. Depois processa-se a segunda reacção de acoplamento no caso de se observar um resultado positivo no teste Kaises. Efectua-se a clivagem da cadeia peptídica separando-a da resina e utilizando ácido fluorídrico anidro (HF) em presença de anisol após se ter completado todas as reacções necessárias sobre a resina, removendo-se simultaneamente todos os grupos de protecção temporários. Após a lavagem com acetato ou com éter, obtêm-se os antagonistas da HLHL sob a forma de produtos impuros por extracção com uma solução aquosa de ácidos acético seguindo18

- se

a liofilização. 0 rendimento conseguido foi superior a

50%.

3. Purificação do Peptido (1) Purificou-se o peptido por cromatografia de impregnação de gel ou por cromatografia fraccional sobre silica numa coluna com uma altura compreendida entre 66 cm e 100 cm procedendo-se ao controlo de verificação por UV/CCF. Os antagonistas da HLHL purificados uma vez, foram obtidos após a liofilização das fracçóes principais. Conseguiu-se um rendimento compreendido entre 50 e 90% e foi possível obter uma pureza superior a 90%.

(2) Foi ainda possível purificar mais o peptido por cromatografia em líquido de elevado rendimento (CLER) num aparelho de Waters recorrendo a uma coluna C18 de fase inversa (7.8 x 300 mm) (μ-Bondapak 84176). O rendimento conseguido neste passo foi de 20-50% ao mesmo tempo que a pureza foi superior a 99%.

4. Análise da Pureza do Peptido (1) Análise por CCF.

Efectuou-se esta análise sobre uma folha de plástico revestida por gel de silica 60 F254 com uma altura compreendida entre 5 e 10 cm. Verificou-se sempre a existência de uma mancha única ao efectuar-se o processamento com cinco sistemas solventes diferentes.

(2) Análise por CLER.

Observou-se sempre um pico único ao fazer-se a eluição com dois tipos de sistemas solventes utilizando-se sempre o aparelho de Waters para CLER em coluna analítica (μ-Bondapak 27324) efectuando-se o controlo de verificação por UV 210. A dimensão da amostra foi de 10-200 μς.

5. Análises dos Aminoácidos do Peptido

Em conformidade com o método de PICO-TAG desenvolvido por Waters Company procedeu-se a uma pesagem . 5 exacta, numa balança com a escala de 10 g, de uma quantidade de 50 μ9 de uma amostra que havia sido submetida a secagem no vácuo durante 2 horas. Após dissolução em água adicionou-se uma aliquota de 10 μg a um tubo de reacção no qual estava contido ácido clorídrico (contendo 1% de fenol) de modo a obter-se uma proporção de 1:1, em conformidade com o manual.

O tempo de reacção variou entre 22 e 24 horas à temperatura de 105°C em recipiente estanque que havia sido preenchido com azoto e submetido à acçao de bomba de vácuo para se remover o oxigénio do tubo de reacção. Adicionou-se isotiocianato de fenol para remoção do grupo amino após evaporação do ácido clorídrico em excesso. Depois submeteu-se a análise utilizando um aparelho de CLER equipado com uma coluna analítica para aminoácidos PICO-TAG e procedeu-se à verificação do controlo por UV254. Calculou-se o teor de cada aminoácido e a proporção molar relativa para se obter a composição em aminoácidos da amostra tomando como

base de comparação a área integrada de cada aminoácido relativamente à amostra H padrão de Waters. Utilizou-se também o método de transformação clássico de cromatografia de promoteiónica em ninidrina (IEN) como elemento de controlo tendo sido obtidos os mesmos resultados. Contudo, refere-se que foi necessário dez vezes mais amostra para se conseguir um resultado satisfatório.

6. A Avaliação da Actividade Biológica

Utilizou-se o método da anti-ovulação da ratazana de Corbin. Nesta experiência utilizou-se ratazanas fêmea adultas e saudáveis da estirpe SD (200-250 g da massa corporal). Os animais foram mantidos à temperatura compreendida entre 22 e 24°C no regime ciclíco de luz/escuridão correspondente a 14h/10h respectivamente. Os animais foram alimentados com uma ração normalizada e tiveram água à sua disposição ad libitum. Nesta experiência foram utilizadas as ratazanas que demonstraram possuir dois ciclos menstruais consecutivos de 4 dias conforme determinado por exame do exsudado vaginal. Administrou-se peptidos (antagonistas da HLHL) às ratazanas ao meio dia do dia da ovulação, segundo doses diferentes em solução salina. No dia seguinte as ratazanas foram sacrificadas e procedeu-se ao exame dos correspondentes oviductos em ambos os lados com auxílio de um microscópio de dissecação para se determinar o número de óvulos. As ratazanas foram divididas em vários

grupos em conformidade com o regime de dosagem, sendo cada grupo constituído por 10 ratazanas e sendo o grupo de controlo constituído por 9-10 ratazanas às quais foi administrada apenas uam quantidade igual de solução salina. A actividade anti-ovulatória (AAO) traduz-se pela expressão seguinte:

Número de ratazanas sem ovulação AOA = ---------------------------------- x 1 00%

Número total de ratazanas tratadas

7. Avaliação da Actividade Libertadora de Histamina (1) Teste de libertação de histamina (TLH) in vitro:

Nesta experiência utilizou-se ratazanas macho da estirpe SD adultas e saudáveis (200-250 g de massa corporal) alojadas nas mesmas condições. Após terem sido anestesiadas com C0₂ procedeu-se à lavagem da correspondente cavidade peritoneal com 50 ml de meio PIPES AC contendo 20 unidades de heparina. Após a centrifugação a 200xg durante 8 minutos e à temperatura de 4°C, procedeu-se novamente à lavagem das células e finalmente preparou-se nova suspensão 5 segundo uma concentração variável entre 8 e 24 x 10 leucócitos/ml em meio PIPAS AC. Esta suspensão continha aproximadamente entre 5 e 10% de células mastóides. As células lavadas foram utilizadas imediatamente após a sua recolha e foram pré-aquecidas durante 5 minutos à temperatura de 37°C antes de serem introduzidas com o auxílio de uma pipeta, em tubos de polistireno em aliquotas de 0.3 ml contendo 0.3 ml de peptido diluído. Essas misturas foram incubadas durante 15 minutos à temperatura de 37°C e depois interrompeu-se a reacção por centrifugação a 400 xg durante 15 minutos e à temperatura de 4°C. Procedeu-se à avaliação do teor dos sobrenadantes em histamina pelo método de ensaio fluorométrico manual após a extracção sucessiva com n-butanol e n-heptano. 0 teor em histamina pode ser determinado a partir da curva normalizada da histamina (veja-se mais adiante). É possível calcular a percentagem de libertação de histamina pela expressão seguinte:

E-B libertação de histamina (%) = ----- x 100%

C-B em que o símbolo E representa a leitura fluorométrica da amostra experimental, o símbolo B representa a leitura fluorométrica de amostras que apenas contêm células e tampão e o símbolo C representa a leitura fluorométrica de amostras

completas (células tratadas com HCIO4).	a	curva padrão
	É possivel determinar
traçando um	gráfico dos valores DO num	fluorometro a	350
nm/450 nm	(activação/fluorescência)	em	presença	de
concentrações	da solução diluída em série	do	cloridrato	de

histamina pesado com precisão. 0 parâmetro relativo r da curva padrão da histamina pode atingir o valor 0.9998 e a concentração de histamina detectável inferior foi de

0.5 ng/ml.

O valor DE50 do peptido pode ser obtido a partir das curvas dose/resposta obtidas traçando o gráfico da libertação da histamina em função da concentração do peptido em papel semi-logarítmico.

Todas as amostras peptídicas devem ser testadas com células mastóides provenientes de um mínimo de 3 ratazanas diferentes.

(2) Teste da actividade anafilactóide cutanea (TAC):

Nesta experiência foram utilizadas ratazanas fêmea da estirpe SD adultas e saudáveis (250 g de massa corporal). Injectou-se as ratazanas intravenosamente com azul de Evan (1 ml de uma solução a 0.05%). Imediatamente após injectou-se intradermalmente 0.05 ml de uma solução peptídica (5, 0.5 e 0.05 pg/ml, respectivamente) e de uma solução salina (controlo) numa secção rapada sobre o dorso dos animais. Decorridos 30 minutos após a injecção procedeu-se ao sacrifício das ratazanas e examinou-se a pele da região dorsal. Os diâmetros das lesões foram medidos em milímetros em duas direcções perpendiculares utilizando um nonío para medir diâmetros. O diâmetro do grupo de controlo foi normalmente inferior a 5.5 mm. Também é possível medir por espectrofotometria a quantidade de azul de Evan que fica impregnada na pele proveniente dos vasos sanguíneos. Procede24

-se ao corte da pele correspondente à área lesionada e mergulha-se numa mistura de acetona/solução salina (7:3, Vol/Vol), durante a noite. Após centrifugação no dia seguinte mede-se o teor de azul de Evan no sobrenadante utilizando um espectrofotometro (UV-260) a 610 nm em presença de uma solução de referência constituída por acetona/solução salina

(7:3). Cada	peptido foi testado no mínimo em 3	ratazanas
diferentes.	Concebeu-se e sintetizou-se uma	diversidade
de novos	antagonistas da HLHL recorrendo	ao método
anteriormente	descrito. Resumindo, a nova estrutura dos
antagonistas	da HLHL foi obtida por substituição	simples ou
múltipla dos	diversos aminoácidos naturais e não naturais

enumerados nos parágrafos antecedentes.

Uma parte dos exemplos dos novos antagonistas da HLHL assim obtidos encontra-se ilustrada no quadro 1.

DTap

Tep DMop DTep

DPCIPha

DPClPho DMop__P,ip

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Aplicações da Presente Invenção:

1. Depois de terminados os estudos toxicológicos e farmacológicos pré-clínicos é possível aplicar estes novos antagonistas da HLHL, que possuem uma elevada eficácia terapêutica e fracos efeitos secundários, em situações clínicas de modo a desenvolver novos produtos medicinais para o tratamento de endometriose e de outras perturbações do sistema endócrino reprodutivo incluindo a puberdade precoce das crianças, o cancro da próstata e o cancro da mama. Uma vez que esses compostos suprimem a secreção da gonadotropina por competirem no receptor com a HLHL endógena e ainda pelo facto de actuarem rápida, reversível e seguramente, permite, também o desenvolvimento de um novo tipo de contraceptivos para homens ou mulheres. Além disso podem ser utilizados no tratamento da infertilidade e para abolir selectiva e reversivelmente a função da glândula pituitária no que diz respeito à secreção da gonadotropina.

Tratando-se de um tipo de peptidos utilizáveis em medicina, os antagonistas da HLHL agora descritos não sao provavelmente administrados por via oral. Contudo, é fácil prepará-los numa forma pulverulenta liofilizada que se dissolve facilmente numa solução salina para injecção intravenosa, sub-cutãnea ou intramuscular (iv, sc ou im).

Além disso estudou-se também sistemas do fornecimento de longa duração tais como as cápsulas injectáveis biodegradáveis. Essas cápsulas podem ser implantadas subcutanearaente utilizando uma seringa especial e serão absorvidas pelos tecidos após a libertação de todo o seu teor peptídico não sendo necessário recorrer à remoção cirúrgica. 0 sistema de fornecimento de longa duração é especialmente útil para a administração de análogos da HLHL a longo prazo em situações clínicas.

Os dados seguintes constituem os resultados da análise dos exemplos (tomando três análogos de fórmulas IV, V e VII como exemplos típicos):

(1) Pureza

Cromatografia de camada fina (CCF):

Observou-se apenas uma mancha simples em cada cromatograma processado em cinco sistemas solventes diferentes.

Cromatografia em líquido de elevado rendimento (CLER):

Observou-se apenas um pico simples em cada cromatograma, tendo a eluição sido feita com dois sistemas solventes diferentes.

Os valores do parâmetro Rf e o tempo de retenção TR encontram-se indicados no Quadro 2, tomando-se também como referências as Figuras 1 a 4.

Quadro 2 Resultados da Análise Cromatográfica dos Antagonistas HLHL

Análogos	CLER TR1 (min)	TR2 I	Rf1	Rf2	CCF Rf3	Rf4	Rf5
IV	7.55	5.26	0.23	0.21	0.31	0.19	0.65
V	7.90	8.11	0.32	0.30	0.35	0.30	0.69
VII	16.19	9.58	0.17	0.08	0.16	0.40	0.12

rtsnxnxeausitw

Solução A + 80% de acetonitrilo.

Sistema solvente 2:

A solução A é uma solução aquosa contendo KH2PO4 0.01 M (pH 3)

A solução B é uma solução A a 20% + 80% de acetonitrilo.

Sistema solvente para a CCF:

1. nBuOH/EtOAC/HOAC/H₂O (5:5:1:3)

2. nBuOAC/nBuOH/HOAC/H₂O (2:8:2:3)

3. nBuOAC/HOAC/H₂O (4:1:5), fase superior

4. nBuOH/HOAC/H₂O (4:1:2)

5. nBuOH/EtOAC/HOAC/H₂O (1:1:1:1)

Amostra IV

Amostra V

Amostra VII

Figura

Resultados da CCF dos antagonistas da HLHL de fórmulas IV, V e VII em cinco sistemas diferentes

Figura 2: Dados espectrais da CLER de fase inversa para a amostra pura do antagonista da HLHL de fórmula IV.

Condições:

coluna: μ-Bondapak C18 (3.9 mm x 30 cm) fase móvel: A, 0.1 M NH₄OAC (pH 7)

B, 20% de A + 80% de acetonitrilo variação do gradiente.· B desde 10% até 100% em 15 minutos débito: 2 ml(minuto detector: UV 229 nm

Figura 3: Dados espectrais da CLER para a amostra pura do antagonista da HLHL de fórmula V.

Condições:

coluna: μ-Bondapak C18 (3.9 mm x 30 cm) fase móvel: A, 0.1 M NH4OAC (pH 3)

B, 20% de A + 80% de acetonitrilo variação do gradiente: B desde 40% até 100% em 15 minutos débito: 2 ml(minuto detector: UV 210 nm

Figura 4: Dados espectrais da CLER para a amostra pura do antagonista da HLHL de fórmula VII.

Condições:

coluna: μ-Bondapak C18 (3.9 mm x 30 cm) fase móvel: A, 0.1 M NH4OAC (pH 3)

B, 20% de A + 80% de acetonitrilo variação do gradiente: B desde 40% até 100% em 15 minutos débito: 2 ml(minuto detector: UV 210 nm (2) Análise dos aminoácidos

Efectuou-se esta análise em conformidade com um método IEN clássico e em conformidade com o novo método do PicoTag, estando os resultados indicados no Quadro 3 e nas Figuras 5 e 6.

Quadro 3: Composição em aminoácidos dos antagonistas da HLHL

Análogos	•ζ Métodos	Scr	Arg	Ala	Pro	Leu	Phe.	Pa[	pClPhc	• Niir
IV	• γεν'·	0; SG	2.05· 1.01	0.99	1- 13		4-		.,.ΛΦ
Pico —TAG	0.92	2-25	0.91	1.01	0-91			' -1- '	4*
V	IEN	0.81	2.02 .1-03	1.03	1.12	0-99			'+···'
Pico—TAG.	0.68	2.26	0.93	lz2V'		•1..00-.	•J-	>	t T .·
vn	_ IEN	0.9Ϊ-:	·. 0..9I	1-00	-ι;00-	1-09			-1 '

ND: Não determinado

Figura 5

Espectro PICO-TAGTM do antagonista da HLHL de fórmula IV

Figura 6: Espectro PICO-TAGTM do antagonista da HLHL de fórmula V

(3) Resultados do bioensaio ^^_íS^^fg'

Os resultados dos bioensaios incluindo a actividade anti-ovulatória para doses diferentes e para os valores correspondentes a DE5Q da actividade libertadora da histamina in vitro encontram-se ilustrados no Quadro 4 no qual estão enumerados como exemplos 26 antagonistas.

Quadro 4. Resultados dos bioensaios dos novos antagonistas da HLHL tomando como base uma estrutura original*

	Aminoácidos Substituidos		%	AOA^g			ALH (ú9/ml) DE₅₀ ± DP
0.125	0.25	0.5	1 .0	2.0
1	Composto original		50	75	100		3.5	± 0.38
2	D-Phe		29	60	100		7.4	± 0.98
3	DPhe, DPhe				0		18.5	± 7.00
A	DTyr, Lys	-			40		5.1	± 2.15
5	D-Phe					60	35.0	± 5.05
6	Map			29			24.8	x 4.47
•7	Eap			43			12.0	± 0.50
8	Pap			0			9.6	± 0.19
9	Bap			14			23.5	±5.78
10	D-Map			12.3			18.3	± 2.38
11	Tep			14			36.8	± 5.68
12	Pip	17	33	71	100		9.4	± 1.63
13	Mop			25	. 100		14.7	± 2.70
14	D-Map			14			19.5	± 2.50
15	D-Eap			1.4			13.0	±1.00
16	D-Tep			71			22.5	± 3,25
1-7	D-Pip			0	- 50	57	7.6	± 2.48
18	D-Mop		33	67	100		> :	11
19	Map			57	100		5.4	± 1.22
20	Eap				29		56.9	± 15.1
21	Pap				50	88	70.4	± 26.8
22	Bap				0		> ;	23o
23	Tep			25	100		6.6	± 2.13
24	Pip				43		2-7.5	± 2,50
25	Mop				71		52.5	± 17.5
26	D-Map				0		28.0	± 9.00

* A estrutura original é: [NAc-D2Nal\ DpClphe², D3Pal³,

6789 10

Ser⁴, Arg , D3Pal , Len^z, Arg°, Pro , DAla ]NH₂ os

Conforme se ilustrou e descreveu antes, antagonistas da HLHL concebidos e sintetizados em conformidade com a presente invenção exibem propriedades muito boas. Verificou-se que sao puros por análises de CCF ou de CLER. As suas composições estão correctas, isto é, são exactamente as que foram concebidas. A sua actividade anti-fertilidade é elevada: podem inibir a ovulação da ratazana quando injectadas subcutaneamente (s.c.) segundo regimes de dosagem compreendidos entre 0.1 e 2.0 (ig na véspera da ovulação. O seu efeito secundário associado à histaraina é fraco: o correspondente valor DE50 para a actividade libertadora da histamina in vitro (dose eficaz necessária para que as células mastóides da ratazana libertem 50% de histamina) está compreendida entre 5 e 300 ^g/ml; a lesão por eles induzida no teste anafilactóide cutâneo efectuado nas ratazanas é tão pequena quanto necessário em termos clínicos. A sua solubilidade em água é bastante boa, e todos os bioensaios foram efectuados em solução salina pelo que são fáceis de formular para injecções em situações clínicas. Também são fáceis de formular em sistema de fornecimento de longa duração entre os quais se considera preferíveis as microcápsulas injectáveis para supressão a longo prazo da gonadotropina e da hormona gonadal. Em consequência, podem ser utilizados como contraceptivos seguros, reversíveis e altamente eficazes tanto para homens como para mulheres.

Também podem ser utilizados para o tratamento de diversas doenças associadas com perturbações dos sistema endócrino reprodutivo tais como o cancro da próstata e o cancro da mama dependentes de hormonas, para o tratamento da endometriose e da puberdade precoce das crianças. Também são úteis para o tratamento da infertilidade. Os novos antagonistas da HLHL agora descritos também podem ser utilizados para efeitos de pesquisa fisiológica e farmacológica relativamente ao sistema reprodutivo, tal como sucede num estudo da função da glândula pituitária, com o efeito das hormonas gonadais ou com o efeito das gonadotropinas ou da HLHL sobre o comportamento sexual, etc..

ABREVIATURAS

Enumera-se seguidamente as abreviaturas que foram utilizadas no texto da memória descritiva da presente invenção.

Ala alanina

AAO actividade antiovulatória

Arg arginina

Bap dibutil-amino-metil-fenil-alanina

Boc t-butil-oxi-carbonilo

BuOAC acetato de butilo

TAC teste anafalactóide cutâneo

DCC didiclo-hexil-carbo-di-imida

DCM diclorometano

D2Nal

D3Pal

DpCIPhe

DpFPhe

D6Qal

DMF

Eap ^de50

EtOA

HEF

Glu

Gly

His

HOBT

CLER

ALH

TLH

IEN

API

HL

HLHL

Leu

Lys

D-β-(2-naftil)-alanina

D-β-(3-piridil)-alanina p-cloro-D-fenilalanina p-fluoro-D-fenilalanina

D-β-(6-quinolil)-alanina

N,N-dimetil-formamida dietil-amino-metil-fenil-alanina dose eficaz para uma resposta a 50% acetato de etilo hormona estimuladora do folículo ácido glutâmico glicina histidina

1-hidroxibenzotriazol cromatografia em líquido de elevado rendimento tratamento com ninidrina actividade libertadora da histamina teste de libertação da histamina cromatografia de permuta de iões com tratamento posterior em coluna álcool isopropílico hormona da luteinização hormona libertadora da hormona de luteinização leucina lisina

Map	dimetil-amino-metil-fenil-alanina
Met	metionina
Μορ	morfolino-metil-fenil-alanina
nBuOH	álcool n-butílico
SN	solução salina normal
Pap	dipropil-amino-metil-fenil-alanina
Phe	fenil-alanina
Pip	piperidino-metil-fenil-alanina
PIPES	piperazina-Ν,Ν'-bis[2-ácido sulfonico]
Pro	prolina
Rf	débito
DP	desvio padrão
Ser	serina
TFA	ácido trifluoro-acético
CCF	cromatografia de camada fina
TR	tempo de retenção
Trp	triptofano
Tyr	tirosina
Tep	tetra-hidropirrolil-metil-fenil-alanina

Claims

REIVINDICAÇÕES

- 1^a Processo para a sintetização de antagonistas da LHRH caracterizado pelo facto de se efectuar o processamento em reservatório de um antagonista da LHRH bastante poderoso de fórmula II [NAc-D
2Nal\ DpCIPhe², D3Pal³, Ser⁴, Tyr⁵, Arg⁶, Leu⁷, Arg⁸,

9 10

Pro , DAla ]NH₂ que constitui o composto original e se modificar as áreas alcalinas e lipofílicas da molécula de um composto de fórmula II, para proporcionar novos antagonistas da LHRH que possuem elevada actividade anti-ovulatória (AAO) e fraca actividade libertadora de histamina (ALH) tomando como base a sua semelhança topológica com a molécula de um neuropeptido conhecido por Substância P.

- 2â Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se ajustar e substituir a 5 6 8 sequência Tyr -DArg -Arg no terminal C e os aminoácidos aromáticos no terminal N do composto de fórmula II.

- 3^a -

Processo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores caracterizado pelo facto de se introduzir um grupo alcalino na posição 2, 3, 5,6,8 e se

inserir um aminoácido não natural nessas mesmas posições.

. 4a .

Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se substituir DArg⁶ no composto de fórmula II por D3Pal de alcalinidade adequada para proporcionar o análogo de fórmula III:

[NAc-D2Nal¹, DpCIPhe², D3Pal³, Ser⁴, Tyr⁵, D3Pal⁶, Leu⁷, Arg⁸, Pro⁹, DAla¹⁰]NH₂.

- 5^ Processo de acordo com as reivindicações 1 e

4, caracterizado pelo facto de no composto de fórmula III se 5 5 substituir Tyr por Arg para proporcionar um composto de fórmula IV:

[NAc-D2Nal¹, DpCIPhe², D3Pal³, Ser⁴, Arg⁵, D3Pal⁶, Leu⁷, Arg⁸, Pro⁹, DAla¹⁹]NH₂.

- Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo facto de no composto de fórmula IV se
3 3 substituir D3Pal por DPhe para proporcionar um composto de fórmula V:

[NAc-D2Nal¹, DpCIPhe², DPhe³, Ser⁴, Arg⁵, D3Pal⁶, Leu⁷, Arg⁸,

9 10

Pro , DAla ]NH₂

- 7^ Processo de acordo com a reivindicação 4. caracterizado pelo facto de no composto de fórmula III se

5 *

3 3 substituir D3Pal por DPhe para proporcionar um composto de fórmula (V):

[NAc-D2Nal¹, DpCIPhe², DPhe², Ser⁴, Tyr⁸, D3Pal⁸, Leu⁷, Arg⁸,

9 1 o

Pro , DAla ]NH₂.

- 8a Processo de acordo coma reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se obter um composto de fórmula geral [NAc-D2Nal¹, AA², AA³, Ser⁴, AA⁵, AA⁶, Leu⁷, AA⁸, Pro⁹, DAla¹⁰]NH2.

na qual AA representa aminoácidos de origem natural o,u nao natural de fórmula D- ou L-ArAla, em que

Q@.

sendo e R₂, N-, RR'N- ·.

em que

R' = CH₃-, CH₃CH₂-, C₃H₇-, C4H9-, H-;

R = CH3-, CH₃CH₂-, C3H7-, C4H9-, H-;

. ₉§ .

Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo facto de

AA² = D-pCIPhe, D-ArAla, DPhe, Ar-Ala, DXCH₂Phe;

AA² = D3Pal, Ar-Ala, D-ArAla, DPhe, D-XCHghe;

AA⁵ = Arg, DMap, Pip, Tyr, Pai, Mop, Tep, Map, Phe, Eap, Pap, Bap, DMop;

AA⁶ = D3Pal, D-Ar-Ala, D-XCH₂Phe;

AA² = Pip, Tep, Map, Eap, Pap, Bap, Arg:

X e R₂’N-, RR'N-;

em que

R' = CH₃-, CH₃CH₂-, C₃H₇-, C4H9-, H-;

R = CH₃-, CH₃CH₂-, C₃H₇-, C4H9-, H-;

- 10& Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo facto de se obter o peptido de sequência [N-AC-D2Nal¹, P-Cl-D-Phe², D3Pal³, Ser⁴, Mop⁵, D3Pal⁶, Leu⁷, Arg⁸, Pro⁹, D-Ala¹⁰]NH₂.

- 11^a Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo facto de se obter o peptido de sequência [N-AC-D-2Nal¹, D-Phe², D3Pal³, Ser⁴, Mop⁵, D3Pal⁶, Leu⁷, Arg⁸, Pro⁹, D-Ala¹⁰]NH₂.

- 12a Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo facto de se obter o peptido de sequência [N-AC-D-aNal¹, P-Cl-D-Phe², D3Pal³, Ser⁴, Arg⁵, D3Pal⁶, Leu⁷, Pap⁸, Pro⁹, D-Ala¹°]NH₂.

- 13^â Processo para a preparação de uma composição farmacêutica, caracterizado pelo facto de se incorporar uma quantidade eficaz de um composto quando preparado de acordo i -» com qualquer das reivindicações anteriores e um veículo farmaceuticamente aceitável.

A requerente reivindica a prioridade do pedido chinês apresentado em 10 de Novembro de 1990, sob o