PT95742B

PT95742B - Processo de preparacao de peptidos analogos do gnrh

Info

Publication number: PT95742B
Application number: PT95742A
Authority: PT
Inventors: Carl A Hoeger; Jean Edouard Frederic Rivier; Paula Guess Theobald; John S Porter; Catherine Laure Rivier; Wylie Walker Vale Jr
Original assignee: Salk Inst For Biological Studi
Priority date: 1989-10-30
Filing date: 1990-10-30
Publication date: 1997-09-30
Also published as: KR920702351A; EP0500695A1; AU6739290A; ATE163430T1; NZ235812A; JPH05503689A; IL96094A0; US5169932A; IL96094A; IE903881A1; PT95742A; WO1991006543A1; AU633384B2; CA2066184A1; DE69032070D1; EP0500695A4; EP0500695B1

Description

MEMÓRIA DESCRITIVA

presente invento refere-se, em geral, a péptidos tendo aminoácidos não naturais e à preparação de novos aminoácidos não naturais, que podem ser derivados de diaminoácidos, tais como Lys, Orn, Dpr e Dbu. Mais particularmente, refere-se a análogos da GnRH tendo tais aminoácidos não naturais, que podem ser preparados quer em tais péptidos totalmente montados quer para incorporação em tais péptidos como parte do processo de sintese, de elongação de cadeia, usual.

Num aspecto mais particular, o presente invento refere-se a péptidos que inibem a função das gónadas e a libertação das hormonas esteroidais, progesterona e testosterona e também a péptidos que promovem a libertação de tais esteróides, assim como aos processos de promoção ou impedimento da ovulação.

ANTECEDENTES DD INVENTO

A glândula pituitária está ligada por um pedunculo à região na base do cérebro, conhecida como □ hipotálamo. São libertadas pela glândula pituitária, em particular, a hormona foliculestimulante (FSH) e a hormona luteinizante (LH), algumas vezes referidas como gonadotrofinas ou hormonas gonadotróficas. Estas hormonas regulam, em combinação, o funcionamento das gónadas para produzirem testosterona nos testículos e progesterona e estrogénio nos ovários e regulam, também, a produção e maturação de gâmetas.

A libertação de uma hormona, pelo lobo anterior da glândula pituitária, requer normalmente uma libertação prévia de uma outra classe de hormonas, pelo hipotálamo. Uma das hormonas hipotalâmicas actua como um factor que desencadeia a libertação das hormonas gonadotróficas, particularmente LH e esta hormona é aqui referida como GnRH embora também tenha sido referida como LH-RH e como LRF. A GnRH foi isolada e caracterizada como um decapéptido tendo a seguinte estrutura;

pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2

Os péptidos são compostos que contêm dois ou mais aminoáci—

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dos nos quais o grupo carboxilo de um ácido está ligado ao grupo amino do outro ácido. A -fórmula para a GnRH, como representada acima, está de acordo com a representação convencional de péptidos, onde o terminal amino aparece à esquerda e o terminal cai— boxilo à direita. A posição do resíduo de aminoácido é identificada por numeração, dos resíduos de aminoácido, da esquerda para a direita. No caso da GnRH, a porção hidroxilo do grupo carboxilo da glicina, no terminal C, foi substituída por um grupo amino (ΝΗο>, i.e., o terminal C está amidado. As abreviaturas para os resíduos de aminoácido individuais, acima, são convencionais e são baseadas no nome trivial do aminoácido, por exemplo, pGlu é ácido piroglutâmico, Glu é ácido glutâmico, His ê histidina, Trp é triptofano, Ser é serina, Tyr é tirosina, Gly é glicina, Leu é leucina, Nle é norleucina, Orn é ornitina, Arg é arginina, Har é homoarginína, Pro é prolina, Sar ê sarcosina, Phe é fenilalanina, Ala é alanina, Vai é valina, Nva é norvalina, Ile é isoleucina, Thr é treonina, Lys é lisina, Asp é ácido aspártico, Asn é asparagina, Gin é glutamina e Met é metionina. Exceptuando a glicina, os aminoácidos dos péptidos do inventa estão na configuração L, salvo indicação em contrário.

Há motivos para se desejar impedir a ovulação em mamíferos fêmeas e a administração de análogos da GnRH, que sâo antagonistas da função normal da GnRH, têm sido utilizados para suprimir ou atrasar a ovulação. Por este motivo os análogos da GnRH, que são antagonistas da GnRH, estão a ser investigados para a sua utilização potencial como um contraceptivo ou para a regulação dos períodos de concepção. Ds antagonistas da GnRH podem também ser utilizados para o tratamento da puberdade precoce e da endometriose. Tais antagonistas mostraram, também, ser úteis na regulação da secreção de gonadotrofinas em mamíferos machos e podem ser empregues para parar a espermatogénese, por exemplo, como contraceptivos masculinos para o tratamento de autores de ofensas sexuais masculinos, e para o tratamento da hipertrofia da próstata. Mais especificamente, os antagonistas da GnRH podem ser utilizados para tratar tumores dependentes de esteróides, tais como tumores da próstata e da mama. Na fêmea, eles podem ser tam71 74S

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-5bém utilizados para o hirsutismo.

Por outro lado, os agonistas da GnRH actuam da mesma maneira que a GnRH na promoção da libertação de LH e da FSH e são considerados valiosos os agonistas que exibem uma maior biopotência e/ou uma duração de acção mais longa.

Num aspecto, é desejável proporcionar péptidos melhorados que ou são fortemente antagonistas da GnRH endógena e impedem a secreção de LH e a libertação de esteróides pelas gónadas de mamíferos, ou são agonistas fortes da GnRH. De particular interesse são os compostos que são mais eficazes in vivo quando administrados oralmente.

SUMÁRIO DQ INVENTO presente invento proporciona aminoácidos não naturais que podem ser preparados de novo ou por modificação de um péptido ou péptido protegido-resina, previamente preparados contendo a sequência global desejada que inclui um ou mais resíduos de aminoácidos que vão ser modificados. Ds aminoácidos preferidos, do invento, contêm um grupo guanidino modificado.

Num outro aspecto particular, o invento proporciona péptidos que inibem a libertação de gonadotrofinas em mamíferos, incluindo humanos e proporciona também processos de inibição da libertação de esteróides pelas gónadas de mamíferos machos e fêmeas. 0 invento proporciona também análogos da GnRH melhorados que são agonistas fortes da GnRH e que podem ser utilizados para promover os processos de reprodução dos mamíferos. Como mencionado acima, estes antagonistas da GnRH podem ser utilizados para inibir a produção de gonadotrofinas e hormonas sexuais sob várias circunstâncias, incluindo a puberdade precoce, a neoplasia dependente de hormona, a dismenorreia, a endometriose e os tumores dependentes de esteróides.

invento proporciona aminoácidos não naturais tendo a fórmula U* seguinte:

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-6II

HO-C-CH-(CH₂) n-N-C-X

NH₂ ^R1 ^R2 onde n é um número inteiro de 1 a 6 e é preferivelmente 1,2,3 ou 4; Y = N—CN, N-CONHR9, S, 0 ou CH-N0₂, onde R₉ é H, Ac, alquilo (preferivelmente Cj a C4), naftilo, piridilo, pirimidilo, pirazinilo, indolilo, quinolinilo ou imidazolilo, grupos alquilo e cíclicos que estão não substituídos ou substituídos (preferivelmente por cloro, fluoro, bromo, amino, nitro, alquilo (C| a C4) e alcoxi (C_x a C₄)); X = NH, 0, S, N₃,M_t-(CH_q)_p-M₂ ou M₁-(CH₂)_p?-M₂(CH₂)_p»’-M₃, onde Mj é NRjq, N, 0, S ou CHR₃ em que R₃ é metilo, etilo, propilo, fenilo, piridinilo, pirimidinilo ou purinilo; q = 1 ou 2; p, p’ e p” são números inteiros entre O e 6; Rj^ é H, metilo, etilo, propilo, fenilo ou fenilo substituída (preferivelmente por Cl, F, N0₂ ou NH₂); e M₂ e M₃ = Mj, COOH, C0NH₂, COOR3 ou CN (preferivelmente X é NH, 0 ou S); R| = H, alquilo (preferivelmente Cj a C^ e mais preferivelmente Cj a C4), alquilo modificado (preferivelmente Cj a C5, cujo carbono terminal está substituído com NH₂, OH, Cl, Br ou F, ou é substituído por CF₃ ou CF₂CF₃), alcenilo (preferivelmente C₂ a C4), tal como CH₂CH = CHR₃, alcinilo (preferivelmente C₂ a C4), tal como CH₂C = = CR₃, arilo tal como benzilo, tolilo, p-aminobenzilo(analinilo) e pCl-benzilo ou uma ligação directa a X; R₂ = Ri, OH, NH₂, NHRj, heterociclo (preferivelmente como ilustrado a seguir) ou desR₂, com R₂ sendo desR₂ quando X = N₃. Opcionalmente, R₂ e X podem estar interligados, ou R| e R₂ podem estar ligados um ao outro através de uma ponte de metileno ramificada ou não ramificada, do tipo -(CH₂)_ffl- ou —(CH₂)_m-M-(CH₂)_ffl’-. Numa tal porção Rj — R₂, m e m’ são números inteiros de 1 a 6 e, preferivelmente, de 1 a 3 e M = NH, 0, S ou CHR4, em que R4 é alquilo inferior ou arilo e é preferivelmente metilo, etilo, propilo, fenilo ou pCl-fenilo, com M sendo, preferivelmente, 0 ou S. Mais preferivelmente, quando R^ e R₂ estão interligados, eles formam um anel heterocíclico de 5,6 ou 7 membros, com a porção N-C—X da fórmula U*. Se for desejado formar um péptido cíclico, XR₂ pode conter uma parte de um outro diaminoácido dentro do mesmo péptido, por exemplo, o grupo omega

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50453 amino do resíduo da posição 5 tal resíduo de aminoácido não

-7pode estar ligado dessa -Forma a um natural na posição 8.

A modificação da função amino primária especificada, de um dado aminoácido ou péptido, é realizada por tratamento do péptido apropriadamente protegido ou do aminoácido com um(uns) reagente(s) apropriado(s). Os pêptidos ou aminoácidos em que Y é N-CN (aqui referidos como cianoguanidinas) são preparados por reacção de um grupo amino com o ácido difenilcianocarbonimídico (I):

Q-NH₂ + PhO-C-OPh------> Q-NH-C-OPh (I) (II) no qual 0“ é utilizado para representar, duma forma lata, a porção principal de um péptido ou um aminoácido tendo um grupo amino primário (tal como o aminoácido que está descrito acima) como uma parte da fórmula U*.

péptido ou o aminoácido tendo a porção N-substituído-N’—ciano-Q—feni1isoureia (II) pode ser, depois, ou isolado ou adieionalmente funcionalizado por reacção com um segundo HXR₂» nucleófilo, para produzir os pêptidos ou os aminoácidos contendo cianoguanidina tendo a fórmula (III):

N-CN N-CN

II

Q-NH-C-OPh + HXR₂ ----> G-NH-C-XR₂ (II) (III)

Por exemplo,

N—CN

II

G-NH-C-OPh + NH₂CH_:(II)

N-CN

II

---G-NH-C—NHCHt (III) (porção aminoraetiΙοί anoguanidi no)

Por exemplo, quando HRX₂ = H₂N-CH₂-piridina, o resultado é:

N-CN

G-NH-C-HNCH₂ (porção 3-aminometilpiridilcianoguanidino)

Este grupo pode ser também referido como N-g—ciano—N-g’-3—metil71 748

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-Βpiridilguanidino (nomenclatura IUPAC).

Tais compostos podem ser hidrolisados sob condições ácidas, para produzirem compostos que também são biopotentes—por exemplo:

N-CN

Q-NH-C-NHCH₃ n-c-nh₂

TFA ||

----> Q-NH-C-NHCH3 °C

As versões hidrolisadas, referidas aqui como incluindo o grupo N—g’-amido, podem, também, ser sintetisadas, directamente, por reacção de derivados de fosgénio com porções tendo uma função guanidino.

Se HXR2 for um grupo amino de um outro péptido ou proteína, obter-se-á um dímero péptido-péptido ou um dímero péptido-proteína conjugados pela porção cianoguanidina. Se HXR₂ for o grupo amino primário do terminal N ou o grupo amino da cadeia lateral de um outro aminoácido, no mesmo péptido, obter—se-á um péptido cíclico (IV) ligado através da porção cianoguanidina:

N-CN

II

Qi-NH-C

I

Q₂----NH (IV) no qual Q| e Q₂ representam os restos de dois resíduos de aminoácido, no mesmo péptido. A ciclização através do derivado cianoguanidina é, preferivelmente, efectuada enquanto parte do péptido—resina, em oposição à subsequente ciclização do péptido 1i near.

Surge um caso especial quando -XR₂ contém um segundo sítio nucleofílico e X tem a forma geral: Mi-(CHq)p-M₂ ou Mi-(CH₂)p>-Μ₂-(0Η₂)ρ’»-M3, onde Mj, M₂ e M3 são individualmente NH, N, 0, S, ou CHR3, com p, p’, p” sendo 0,1,2 ou 3 e q sendo 1 ou 2. Exemplos de tais nucleófilos incluem H₂NNH₂, CH₃HNNH₂, CH3HNNHCH3, H₂N0H e H₂N-CH₂-CH₂0H. Neste caso, a porção cianoguanidina que é

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—9— formada pode ser convertida no correspondente heterociclo (V) que se forma a partir do intermediário inicial por reacção do grupo amino na posição omega com o grupo ciano, tal como:

N-CN

NH₂

N-C=Mo

Q-NH-C-M₁-(CH₂)p-M₂ --->

Q-NH-C—M|—(CH₂)ρ (V)

Por exempla, quando —XR₂ = -HNNH₂,

N-CN

II o-nh-c-hnnh₂ --->

N--C

O-NH-C N \ /

N

H

NH₂ (porção 1,2,

4-triazolo)

Além disso, quando -XR₂ = CH3NNHCH3

NH /

N-CN N---C

II II II

Q-NH-C-CH3NNHCH3 ---> O-NH-C N-CH₃ ΐ

CH₃

Quando XR₂ contém um grupo ácido carboxílica ou o equivalente, particularmente um éster carboxílico ou uma amida carboxílica, é formada uma porção heterocíclica, tal como uma porção semelhante a pirimidina saturada (VI), por reacção do grupo carboxílico com o grupo amino secundário (Rj), quando Mj é N, e são formadas porções heterocíclicas de 6 membros, similares, quando Mj é □ ou S. Por exemplo, R₂ pode ser Mi-(CH₂)_p-M₂ com M₂ = COOH, COOCH3 ou C0NH₂ e p sendo um número inteiro entre 1 e

4. Por exempla, num tal caso onde está presente um grupo ácido carboxílico alifático e p=2:

3-p ép t i do-2-(c i a(VI) noimino)—4—oxo—he— xa-hidropirimidino

748 50453 — ΙΟ-

Ν—CN

N-CN -ΝΗ-ΐ-Ν(CHr>)_n—COOH

x. p

-> Q-N NH

-C CH₂\_CH/

Se F?2 incluir um ácido carboxílico aromático substituído em orto, por exemplo ácido benzóico (q=l e p=6), é formada a correspondente espécie semelhante à quinazolina (VII):

N-CN

I!

Q-NH-C-X-0COOH ---> Q-N

N-CN

II c

(VII)

Tal ácido benzóico pode ser adicionalmente substituída e tais substituiçGes podem criar, em qualquer uma das outras 4 posiçGes do anel, como mostrado, a correspondente porção semelhante a quinazolina substituída que é considerada ser equivalente à não substituída. X’ pode ser H, Cl, Br, F, NHCH3 ou SCH3 e R7 e Rg podem ser H, CH3 ou CH2CH3.

As moléculas nas quais X=N3 ε Ro é desR2 (i.e. com delecção) são úteis para fotomarcação por causa da actividade do grupo -N3 e são formadas por reacção da porção (II) com azida de sódio (NaN₃).

Os péptidos nos quais Y é 0 (aqui referidos como ureias) ou

S (aqui referidos como tio-ureias) são preparados pelo procedimento bem conhecido no qual o grupo amino da cadeia lateral, desejado, é tratada com um isocianato ou um isotiocianato apropriado para se obter, respectivamente, tais ureias ou tio-ureias.

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-110

II q-nh₂ + o=c=nr₂-> g-nh-c-nhr₂ ou s

II q-nh₂ + s=c=nr₂--> g-nh-c-nhr₂

Os péptidos ou os aminoácidos nos quais Y é CH-N0₂ (aqui referidos como diaminonitroetilenos) são preparados por conversão da correspondente ureia numa carbodiimida;

|| tosil-Cl

Q-NH-C-NHR'? piridina

-> Q-N=C=NR₂ seguida por tratamento com o anião nitrometano (preparado pela acção do hidreto de sódio sobre o nitrometano em DMF seca) como é descrito na generalidade em F. Meimas, et al.. Svnthesis. 509-510 (19S5):

C

G-NH=C=NR₂ + CH₃N0₂ + NaH -> j|

G-NH-C-NH-R₂

Uma sintese alternativa que pode ser utilizada é a que se segue:

G-NH₂ h-c-no₂

II

CH3S-C-SCH3

H-C-NCH

QNH-C-SCH3

H-C-NO2

H-c-N0₂ nhr₂

QNH-C-SCH3 q-nh-c-nh-r₂

Geralmente, de acordo com o presente invento, são sintetizados péptidos que são antagonistas ou agonistas da GnRH, i.e., eles inibem fortemente a secreção de gonadotrofinas pela glândula pituitária de mamíferos, incluindo humanos, e/ou inibem a libet—

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— 12—

tação de esteróides pelas gónadas, ou promovem -Fortemente tal secreção ou libertação. Estes péptidos são análogos da GnRH, contendo um ou mais aminoácidos não naturais da -Fórmula U* na posição 5 e/ou na posição ά e/ou na posição 8. Um antagonista deve ter uma substituição na posição 1, preferivelmente desidroPro ou β-d-ou 2-naftil)-D-alanina (a partir daqui β-D-lNAL ou Í3-D-2NAL), uma substituição na posição 2 na forma de uma D-Phe modificada e uma substituição na posição 3, preferivelmente na forma de D-3PAL, {3-D-NAL, D-Trp, substituido ou não substituido. A posição 5 pode ser ocupada por (a) Tyr, <b> uma Phe ou uma Tyr halogenada ou metilada, (c) Arg, (d> Lys na qual o grupo amino da cadeia lateral está acilado por 3-carboxipiridina (ácido nicotínico) ou por 2— ou 4—carboxipiridina, i.e. Lys (cpd) , preferivelmente Lys(3cpd) que é, também, referida como LysíNic), (e) His ou íf) o resíduo do aminoácido U*. Qs agonistas têm uma substituição na posição 6 que é U* e os antagonistas podem ter U* ou uma tal Lys substituída ou acilada na posição 6. Em vez da Leu na posição 7, ambos podem ter Nle, NML, Phe, Nva, Met, Tyr, Trp ou PAL, dos quais a Phe ou Trp podem ser substituídos. Os. antagonistas podem ter também uma substituição opcional na posição 8, que pode ser, preferivelmente, U* ou isopropil-Lys, i.e., íILys) ou Lys(Ipr), na qual o grupo amino da cadeia lateral é substituído por isopropilo, e uma substituição na posição 10, tal como D-Ala. Está presente, em cada pêptido do invento, pelo menos um resíduo de um aminoácido da fórmula U*.

A D-Phe modificada, na posição 2, proporciona uma actividade antagonística aumentada como resultado das modificações específicas presentes no anel benzeno. As substituições simples para o hidrogénio, no anel, são preferivelmente feitas na posição para ou 4, mas também podiam ser feitas quer na posição 2, quer na posição 3, as substituições são seleccionadas de entre cloro, fluoro, bromo, metilo, metoxi e nitro, com cloro, fluoro e nitro sendo os preferidos. As substituições com dicloro são nas posições 2, 4 ou 3, 4 do anel. 0 átomo de carbono α pode também ser meti lado, por exemplo (C^aMe/4Cl)Phe. 0 substituinte na posição 1 está preferivelmente modificado de modo que o seu grupo

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amino α contém um grupo acilo, tal como formilo (For), acetilo (Ac), acrililo (Acr), vinilacetilo (Vac) ou benzoilo (Bz), com acetilo e crililo sendo os preferidos. PAL e D-PAL representam os isómeros L e D da piridilalanina onde o carbono β da Ala está ligado à posição 2, 3 ou 4, preferivelmente à posição 3, do anel piridina. Quando a β-D-NAL está presente na posição 1 e R5 não é Arg, está preferivelmente presente na posição 6, se U* não estiver presente, um resíduo de D-aminoácido hidrofílico, tal como 4—NH2—D-Phe, 4—guanidino—D—Phe, D-His, D-Lys, D—Qrn, D—Arg, D-Har(Homoarginina) ou D-PAL. Quando a desidroPro está presente na posição 1, está preferivelmente na posição 6, se U* não estiver presente, a D-PAL ou D-isómero de um aminoácido lipofílico, tal como D-Trp, D-Phe, Fof—D-Trp, N02^-D-Trp, D-Leu, D-Ile, D-Nle, D-Tyr, D-Val, D-Ala, dialqui1Arg, dialqui1-Har, D-Ser(QtBu), β-D-NAL ou (imBzl)D-His.

Estes análogos da GnRH são muito solúveis a um pH imediatamente abaixa do pH fisiológico, i.e. de cerca de 4,5 a cerca de 6 e podem ser, assim, formuladas e administrados na forma concentrada, facilitando muito a administração a um pH de cerca de 5 a

7,4 o qual é, presentemente, preferido. Qs antagonistas inibem a ovulação em mamíferos fêmeas quando administrados a níveis baixos no proestro e são também eficazes para produzirem a reabsorção de óvulos fertilizados se administrados logo após a concepção. Os antagonistas são também eficazes para o tratamento contraceptivo de mamíferos machos e para o tratamento de tumores dependentes de esteróides. Os agonistas são substancialmente mais potentes do que a GnRH nativa.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS CONCRETIZAÇÕES PREFERIDAS

Como previamente mencionado, os aminoácidos não naturais são representados pela fórmula U*:

Y

II II

HO-C-CH-(CH₂)n-N-C-X

I I I

NH₂ Rl R2 e há, pelo menos, um tal resíduo em cada péptido do invento, no

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qual X, Y, Rj e R2 são como previamente definidas.

Mais especificamente, os antagonistas da GnRH, do presente invento, são representados pela fórmula <Fi> seguinte;

G—AAj— ίA) D—Phe^- AA3— Ser—AA₃—AA^.—AAy—AAq—Pro—AAjq na qual G é hidrogénio ou um grupo acilo tendo 7 ou menos átomos de carbono; AAj é desidroPro, D-pGlu, (A)D-Phe, (B)D-Trp, Pro ou β-D-NAL, A é H, Cl, F, N0₂, CH₃, QCH3, C«Me/4Cl, Cl₂ ou Br; B é H, N0₂, NH₂, OCH3, F, Cl, Br, CH₃, NⁱⁿFor ou NⁱⁿAc; AA₃ é U*, D-PAL, β-D-NAL ou (B)D-Trp; AA₅ é U*, Tyr, (C)Arg, Lysícpd), Ornícpd), Dbuícpd), Dprícpd), (A)Phe, í3I)Tyr ou His; AA^ é U*, β-D-NAL, (B)D-Trp, (A’)D-Phe, (D)D-Orn, (D)D-Lys, (D)D-Dbu, (D)D-Dpr, D-Har, D-Tyr, ÍE)D-His, D-PAL, ÍOD—Arg ou um isómero D lipofílico, adequado; A’ é A, NH₂, NHCH3 ou gua; C é H ou alquilo inferior; D é B, cpd ou um grupo arilo; E é H, ínBzl ou diritrofenol; AAy é Nle, Leu, NML, (A) Phe, Met, Nva, Tyr, (B)Trp ou PAL; AA₈ é U*, ÍC’)Arg, (C’)Har ou ILys; C’ é H ou dialquilo inferior; AA₁₀ é D—Ala-NH₂, Gly-NH₂, AzaGly—NH₂ ou NHÍR); R é alquilo inferior, preferivelmente CH₂CH₃; e U* é definido como acima. Quando AAj é β—D—MAL e AA5 não é Arg, então AA^, é, preferivelmente, U*, 4-NH₂-D-Phe, D-Lys, D-Orn, D-Har, D-His, 4—gua-D—Phe, D-PAL ou D-Arg.

Por desidroPro, deve entender-se 3,4-desidroprolina,

Por β-D-NAL, deve entender—se isómero D da alanina que é substituído por naftilo no átomo de carbono β, i.e., também 3-D-NAL. Preferivelmente, a β-D-NAL é empregue onde a ligação ao naftaleno está na posição 2 da estrutura em anel; contudo, pode também ser utilizada a β-D-lNAL. PAL representa a alanina que está substituída com piridilo no átomo de carbono β, preferivelmente a ligação faz-se na posição 3 do anel piridina. Quando é empregue o D-Trp substituída, as substituições simples para o hidrogénio são, preferivelmente, feitas na posição 5 ou na posição 6, as quais são seleccionadas de entre cloro, fluoro, bromo, metilo, amino, metoxi e nitro, com cloro, fluoro e nitro sendo os preferidos. Alternativamente o azoto do índolo pode ser acilado, por exemplo, com formilo ÍN*ⁿFor ou IFor-) ou com acetilo. 0 «ttgfecj*

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-15/<

NⁱⁿFor-D-Trp e o 6N02-D-Trp são os resíduos substituídos preferidos. Por NML deve entender—se N^aCH3-L-Leu. Por Dbu deve entender-se ácido alfa, gama-diaminobutírico e por Dpr deve entender—se ácido a,β-diaminopropiónico. Quando a desidroPro está presente na posição í, está, preferivelmente, presente na posição 5 a Tyr ou o U* e está na posição 6 um resíduo lipofílico. Por 4-gua—D-Phe deve entender—se um resíduo da D—Phe tendo uma guanidina substituída na posição para. Por azaGly-NH₂ deve entendei—se NHNHC0NH₂. 0 grupo guanidino de um resíduo Arg, na posição 5 ou 6, pode ser substituido por alquilo inferior,

i.e., 1 a 4 átomos de carbono, por exemplo, propilo(Pr). Quando a D-Lys, o D-Dbu, o D-Dpr ou a D-0rn estão presentes na posição 6 e não fazem parte de um aminoãcido não usual U*, o seu grupo amino da cadeia lateral pode ser acilado por um grupo acilo que pode ser alifático, heterocíclico ou aromático, por exemplo ácido nicotínico, ou pode ser substituído por um grupo arilo não tendo mais do que í anel fenilo.

Mais especificamente os agonistas da GnRH, do invento, são representados pela Fórmula (F₂) seguinte; pGlu—His—Trp—Ser—Tyr— -(LJ) — AA7—Arg—Pro-ΑΑιθ, na qual AA7 e AAjq são definidos como anteriormente; preferivelmente AA7 é Leu ou NML e AA^q é NHCH₂CH₃.

Globalmente, o invento proporciona, assim, análogos da GnRH tendo a Fórmula (F₃>:

6-AA-AA₂-AA’-Ser-AA5-AA£_>-AA7-AAg-F^,ro-AAio na qual AA é pGlu ou AAj; AA₂ é His ou (A)D-Phe; AA’ é Trp ou AA₃; e todos os outros são definidos como anteriormente.

Os péptidos do presente invento podem ser sintetisados por síntese em solução, clássica, mas são preferivelmente sintetisados por uma técnica em fase sólida. Pode ser utilizada uma resina clorometilada ou uma resina hidroximetilada; contudo, é empregue preferivelmente uma resina de metilbenzo-hidrilamina (MBHA), uma resina de benzo-hidrilamina (BHA) ou uma outra resina adequada, conhecida na arte, que proporciona directamente uma amida ou uma amida substituída, no terminal 0, após clivagem, quando é

74S 50453 — 16— desejada um tal terminal C. Por exempla, as péptidos tenda uma amida substituída no terminal C são preferivelmente sintetisados utilizando uma resina de N-alquilaminometilo coma mostrado na Patente dos Estados Unidos N2 4 56? 967, concedida em 11 de Fevereiro de 1986. A síntese em fase sólida é conduzida de maneira a se adicionar passo-a-passo aminoácidos à cadeia, da maneira descrita em detalhe na Patente U.S. ND 4 211 693. Os grupos protectores da cadeia lateral, como são bem conhecidos na arte, são preferivelmente incluídos como parte de qualquer aminoácido que tem uma cadeia lateral partieularmente reactiva e, opcionalmente, no caso de outros , tais como Trp, aminoácidos que devem ser acoplados à cadeia que está a ser construída sobre a resina. Tal síntese proporciona o péptido-resina intermediário completamente protegido.

Os intermediários químicos feitos, geralmente, de acordo com o invento podem ser representados pela fórmula: xl-AA-AA2ÍX^)—U3— -Ser (X³)-U5~U^-AA7(X² ou X⁷) -Ug-Pro-X⁸ na qual: U3 é U’ ou AA’(X²); U5 é U’ ou AA5(X⁴ ou X⁵); U6 é li’ ou AA₆(X⁴ ou X⁵ ou X⁶); Ug é U’ ou AAg(X⁵ ou X⁶); U’ é Lys(X^a), Orn(X^a), Dbu(X^a) ou Dpr(X^a); é um grupo protector amino α do tipo conhecido por ser útil na arte, na síntese a passo-e-passo de polipéptidos e quando G na composição peptídica desejada é um grupo acilo particular, aquele grupo pode ser utilizado como o grupo protector. De entre as classes de grupos protectores amino α abrangida por X¹estão (1) os grupos protectores do tipo acilo, tais como formilo (For), trifluoroacetilo, ftalilo, p-toluenossulfonilo (Tos), benzoílo (Bz), benzenossulfonilo, ditia-succinoílo (Dts), o-nitrofenilsulfenilo (Nps), tritilsulfenilo, o—nitrofenoxiacetilo, acrililo (Acr), cloroacetilo, acetilo (Ac) e Ύ-clorobutirilo; (2) os grupos protectores do tipo uretano aromático, por exemplo, benziloxicarbonilo (Z), fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc) e benziloxicarbonilo substituído, tal como p—clorobenziloxicarbonilo (C1Z), p-nitrobenziloxicarbonilo, p-bromobenziloxicarbonilo e p-metoxibenziloxicarbonilo; (3) os grupos protectores do tipo uretano alifático, tais como terc-butiloxicarbonilo (Boc), diisopropiImetoxicarbonilo, isopropiloxicarbonilo, etoxicarbonilo e e 71 748 50453

aliloxicarbonilo; (4) os grupos protectores do tipo cicloalquiluretano, tais como ciclopentiloxicarbonilo, adamantiloxicarbonilo e ciclo-hexiloxicarbonilo; (5) os grupos protectores do tipo tiouretano, tais como feniltiocarbonilo; (6) os grupos protectores do tipo alquilo, tais como alilo (Aly), trifenilmetilo (tritilo) e benzilo (Bzl); (7) os grupos trialquilsilano, tais como trimetilsilano. Quando X é hidrogénio o grupo protector amino α preferido é o Boc.

o .do é hidrogénio ou um grupo protector para o azoto/indolo de Trp, tal como Bz, Ac ou For. Em muitas sínteses não há necessidade de se proteger o Trp e tal protecção não é utilizada se estiver presente em qualquer outra parte do péptido um D-Trp acilado.

X3 é um grupo protector para o hidroxilo da cadeia lateral da Ser ou da Thr, por exemplo Ac, Bz, tritilo, DCB ou éter benzílico (Bzl) e é, preferivelmente, Bzl.

X⁴ é hidrogénio ou um grupo protector para o grupo hidroxilo fenólico da Tyr seleccionado de entre o grupo constituído por tetra-hidropiranilo, terc-butilo, tritilo, benzilo, Z, 2-bromobenziloxicarbonilo (2BrZ) e 2,6-diclorobenzilo (DcB). 0 2BrZ é o preferido.

X5 é um grupo protector para um grupo guanidino da cadeia lateral, tal como aquele na Arg ou na Har, ou para o grupo imidazolo da His, tal como nitro, Tos, tritilo, adamantiloxicarbonilo, Z e 2,4-dinitrofenol (Dnp), ou X⁵ pode ser hidrogénio, o que significa que não há protecção nos átomos do grupo da cadeia lateral. 0 Tos é geralmente o preferido.

X⁶ é um grupo protector para um grupo amino da cadeia lateral, tal como Z ou 2C1Z; X^a é uma subclasse de X^ compreendendo grupos protectores tais que podem ser removidos sem a remoção de outros grupos protectores da cadeia lateral de modo a permitir ao grupo amino omega participar, em seguida, nas reacções, para construir o resíduo de aminoácido não natural, é, preferivelmente, utilizado um grupo lábil a bases, tal como Fmoc, metilsulfoniletiloxicarbonilo (Msc) ou trifluoroacetilo (Tfa);

-18contudo, pode também ser possível utilizar um grupo lábil à hidrazina, tal como ftaloílo.

II c

n-q

o ou um grupo lábil a tio, tal como Nps ou Dts.

X7 é hidrogénio ou um grupo protector para Met, tal como oxigénio; Met é, geralmente, deixado desprotegido.

X® pode ser Gly-NH-Esuporte de resinai, D-Ala-NH-Esuporte de resinai ou N(A)-Esuporte de resinai; X^a pode também ser uma amida de Gly ou de D-Ala ou uma amida substituída ligada directamente a Pro ou a NHNHC0NH₂.

critério para a selecção dos grupos protectores da cadeia lateral para X^ - X? é o de o grupo protector dever ser estável ao reagente sob as condições de reacção seleccionadas para a remoção do grupo protector amino « (preferivelmente Boc) em cada passo da síntese. Qs grupos protectores não devem ser geralmente, separados sob condições de acoplamento, mas devem ser removíveis após completa a síntese da sequência de aminoácidos desejada sob condições de reacção que não vão alterar a cadeia peptídica.

Quando o grupo X^a é Gly-NH-Esuporte de resinai ou D—Ala—NH— -Esuporte de resinai, uma ligação amida liga Gly ou U-Ala a uma resina de BHA ou a uma resina de MBHA. Quando o grupo X^a é N(A)— -Esuporte de resinai, uma ligação amida substituída liga Pro a uma resina de N—alquilaminometilo (NAAM). Quando X^a é AzaGly-NH₂, o péptido ê preferivelmente feito por síntese, clássica, em solução como descrito na Patente U.S. N2 4 234 571.

Quando G é acetilo, por exemplo, na fórmula final,' pode ser possível empregá-lo como o grupo protector X¹ para o grupo amino ./? α/ ' -ί--- agaff·».

748 50453 —19— α da β-D-NAL ou qualquer que seja o aminoácido utilizado na posição 1 por adição deste antes da ligação deste último aminoácido à cadeia peptidica. Contudo, é preferivelmente realizada uma reacção com o péptido sobre a resina (após desbloqueamento do grupo amino « enquanto os grupos da cadeia lateral permanecem protegidos), por exempla por reacção com ácido acético na presença de diciclo-hexilcarbodiimida DCC ou, preferivelmente, com anidrido acético ou por uma outra reacção adequada, como é conhecidos na arte.

Assim, o invento proporciona também um processo de preparação de um péptido, tendo o referido péptido a fórmulas

G-AA-AA2“AA’—Ser—AAg-AA^-AAy-AAg-Pro-AAiQ, na qual, pelo menos, um de AA⁷, AA5, AA^ e AAg é U* e os símbolos são como acima mencionados, processo esse que compreende: (a) a formação de um péptido intermediário tendo a fórmulas X^-AA—AA2(X^)-U3-Ser(X³)-u5-u₆-AAy(X² ou X⁷)—Ug—Pro—X⁸, na qual: U3 é LP ou AA’(X²); U5 é U’ ou AA^(X⁴ ou X5); U6 é U’ ou AA₆(X⁴ ou X⁵ ou X⁶); Ug é U’ ou AAg(X⁵ ou X⁶); U’ é Lys(X^a), 0rn(X^a), Dbu(X^a) ou Dpr(X^a); X¹ é hidrogénio ou um grupo protector amino α; X² é hidrogénio ou um grupa protector de um azoto de indolo; X³ ê um grupo protector de um grupo hidroxilo de Ser ou Thr; X⁴ é hidrogénio ou um grupo protector de um grupo hidroxilo fenólico de Tyr; X^ é hidrogénio ou um grupo protector de uma cadeia lateral de guanidino ou imidazolo; X^ é um grupo protector de uma cadeia lateral de amino primário, do qual X^a é um subgrupo que é removível sem a remoção de outros grupos protectores; X⁷ é hidrogénio ou um grupo protector de Met; X⁸ é Gly-NH-Csuporte de resinai, D-Ala-NH-Csuporte de resinai, N(A)~Esuporte de resina3, uma amida de Gly ou de D-Ala ou uma amida substituída directamente ligada a Pro ou a NHNHCONH2; desde que, contudo, pelo menos um de U3, e U5, U^ e Ug seja ou Lys(X^a), Orn(X^a), Dbu(X^a) ou Dpr(X^a); (b) a remoção de, pelo menos, um X^a para desproteger um grupo amino primário da cadeia lateral de, pelo menos, um resíduo de aminoácida do referido intermediário; (c) a reacção do referido grupo amino primário da cadeia lateral, desprotegido, para construir o referido resíduo num tendo a fórmula LJ*; e (d) a separação de todos

74S 50453

CG, —···“os grupos X* a X? restantes e/ou a clivagem de qualquer suporte de resina incluído em Χθ.

A purificação do péptido é efectuada por cromatografia de permuta iónica numa coluna de CMC, seguida por cromatografia de partição utilizando o sistema de eluição: n-butanol: ácido acético 0, IN (razão em volume de 1:1) numa coluna com enchimento Sephadex G-25, ou por utilização da HPLC, como conhecida na arte e especificamente descrito em J. Rivier, et al.. J. ChromatoqraPhv. 28S (1984) 303-328.

Os antagonistas do invento são eficazes a níveis inferiores a 100 microgramas por quilograma de peso corporal, quando administrados subcutaneamente cerca do meio dia no dia do proestro, para impedir a ovulação em ratazanas fêmeas. Para a supressão prolongada da ovulação, pode ser necessário utilizar níveis de dosagem no intervalo de cerca de O,1 a cerca de 2,5 miligramas por quilograma de peso corporal. Estes análogos são particularmente solúveis a pH fisiológicos e podem ser, assim, preparados como soluções relativamente concentradas, para administração. Os antagonistas são também eficazes para parar a espermatogénese quando administrados a mamíferos machos numa base regular e podem ser, assim, utilizados como contraceptivos. Uma vez que estes compostos vão reduzir os níveis de testosterona (uma consequência indesejável no macho sexualmente activo, normal), é aconselhável administrar dosagens de reposição de testosterona, juntamente com o antagonista da GnRH. Estes antagonistas podem, também, ser utilizados para regular a produção ds gonadotrofinas e de esteróides sexuais para outros fins, como anteriormente indicado.

Nas fórmulas seguintes, os resíduos U* são definidos em termos do resíduo de aminoácido original, tendo um grupo amino na cadeia lateral mais a modificação em questão que é descrita nos parênteses à frente. Preferivelmente, o resíduo original é incot— porado na cadeia peptídica principal, por exemplo Lys ou D-Lys ou Orn, Dbu, Dpr ou um seu isómero D e é modificado enquanto parte da cadeia peptídica que ainda está ligada à resina, para formar o resíduo do aminoácido U* desejado. Contudo, como anteriormente indicado, o aminoácido não natural U*, adequadamente protegido,

748 50453

pode ser adicionado como parte do processo de elongação de cadeia, usual.

No que respeita aos grupos amino da cadeia lateral, modificados, dos aminoácidos Lys, Orn, Dbu e Dpr, são utilizadas as abreviaturas seguintes:

act = acetilaminotriazolo

2amp = 2-aminometilpiridilcianoguanidino

3amp = 3-aminometilpiridilcianoguanidino

4amp = 4-aminometilpiridilcianoguanidino bcg = aminobutilcianoguanidino bzcg = aminobenzilcianoguanidino bur = N-g-amido, N-g⁷-butilguanidino chcg = aminociclo-hexilcianoguanidino ecg = aminoetilcianoguanidino icg = amino-isopropilcianoguanidino hcg = amino-hexilcianoguanidino hicg = histaminilcianoguanidino mcg = aminometilcianoguanidino ncg = aminoetil—(1 ou 2)-naftilcianoguanidino mncg = aminometi1—(1 ou 2)-naftilcianoguanidino

Ocg = O-fenilcianoguanidino pcg = aminopropilcianoguanidino

Sbcg = tiobutilcianoguanidino tcg = 3-amino-l,2,4-triazolo trcg = indoletilaminocianoguanidino (triptaminocianoguanidino) mpcg = metilpiridilcianoguanidino

EXEMPLO I (SEGUE TABELA I)

Os pêptidos, como os indicadas na Tabela I, tendo a fórmula:

Ac—Í1-D-2NAL- (4C1) D-Phe-D-3PAL-Ser-AA₅-AA₆-Leu-AAg-Pro-D-Ala-NH₂ são preparados pelo processo de fase sólida referido acima.

£2

748 50453

-22—

TABELA I

1	aa₅ Lys(icg)	aa₆ D-Lys(icg)	aa₈ ILys
2	“ (mcg)	·’ (mcg)	II
3	(chcg)	(chcg)	11
4	“ ítcg)	(tcg)	u
5	(pcg)	” (pcg)	II
6	*' <2amp)	“ (2amp)	II
7	“ (3amp)	” (3amp)	11
8	“ (4amp)	*’ (4amp)	II
9	“ (hcg)	- (hcg)	II
10	(ecg)	(ecg)	II
11	·' (Ocg)	R-D-2NAL	II
12	- (bcg)	II	II
13	Lys(Nic)	D-Lys(Nic)	Lys(bcg)
14	Lys(bcg)	I3-D-2NAL	II
15	il	D-Lys(bcg)	Arg
16	Tyr	B-D-2NAL	Lys(icg)
fase	Para fins de exemplo, é, sólida, representativa	em seguida, descrita uma síntese em , do Pêptido NS 1 anterior, que é
referido como EAC-B-D-2NAL¹,	(4C1)D-Phe², D-3PAL³,	Lys(icg)⁵, D-

-Lys(icg)^, ILys®, D-Ala^3-GnRH. Este pêptido tem a fórmula seguinte: Ac-R-D-2NAL-(4C1)D-Phe-D-3PAL-Sei—Lys (isopropilcianoguanidi no) -D-Lys(isopropilcianoguanidino)-Leu-Lys(isopropi1)-Pro-D-Ala-NHo.

É utilizada uma resina de MBHA e a D-Ala protegida com Boc é acoplada à resina durante um período de cerca de 2 horas, em CH2C12j utilizando um excesso de 3 vezes de derivado Boc e DCC como um reagente de activação. 0 resíduo de D-Ala liga-se ao resíduo MBHA por uma ligação amida.

A seguir ao acoplamento de cada resíduo de aminoácido, é realizada a lavagem, o desbloqueamento e a ligação do resíduo de aminoácido seguinte, de acordo com o plano seguinte utilizando uma máquina automática e começando com cerca de 5 gramas de resina:

748 50453 •/7 !;

PASSO b

S

REAGENTES E QPERAgSES_TEMPOS DE MISTURA., MIN Lavagem com CH2Cl2^-S0 ml (2 vezes) 3

Lavagem com metanol (MeOH)-30 ml.(2 vezes) 3

Lavagem com CH2Cl2^_S0 ml (3 vezes) 3

TFA a 50 por cento mais 1,2-etanoditiol a por cento em 0Η₂εΐ2^-Τ0 ml. (2 vezes) 10

Lavagem com álcool isopropílico + etanoditiol a 17.-80 ml. (2 vezes) 3

TEA a 12,5 por cento em CH₂C1₂ ^_7O ml.

(2 vezes) 5

Lavagem com Me0H-40 ml (2 vezes) 2

Lavagem com CH₂C1₂-8O ml (3 vezes) 3

Boc-aminoácido (10 mmoles) em 30 ml de dimetilformamida (DMF) ou de CH₂C1₂, dependendo da solubilidade do aminoácido protegido, particular, (1 vez) mais DCC (10 mmoles) em CH₂Cl2 30-300

Lavagem com Me0H-40 ml. (2 vezes) 3

Trietilamina (TEA) a 12,5 por cento em

CH₂C1₂-70 ml. (1 vez) 3

Após o passo 3, pode ser retirada uma alíquota para um teste com ninidrina, como é bem conhecido na arte; se o teste for negativo, prosseguir para o passo 4 para a remoção do grupo Boc antes da ligação do aminoácido seguinte; se o teste for positivo ou levemente positivo, repetir os passos 9 a 11.

plano acima é utilizado para o acoplamento de cada um dos aminoácidos do péptido do invento após ter sido ligado o primeiro aminoácido. A protecção com N^aBoc é utilizada para cada um dos aminoácidos restantes durante toda a síntese. A N®Boc-p-D-2NAL é preparada por um processo conhecido na arte, por exemplo como descrito em detalhe na Patente U.S. Νθ 4 234 571, concedida em 18 de Novembro de 1980 ou está comercialmente disponível a partir de Synthe Tech, Oregon, U.S.A. As cadeias laterais da Lys na posição 5 e da D-Lys na posição 6 são protegidos com Fmoc. É utilizado o Bzl (éter benzílico) como um grupo protector da cadeia lateral para o grupo hidroxilo da Ser. È utilizada a Boc-Lys (Ipr) para a

748

50453

24·

posição 8. Após desbloqueamento do grupo amino α no terminal N utilizando ácido trifluoroacêtico (TFA), a acetilação é realizada utilizando um largo excesso de anidrido acético em diclorometano.

A seguir a se completar a construção do péptido e a acetilação do terminal IM, está presente o seguinte intermediário: Ac—β—D—2NAL— (4C1)D—Phe—D—3F'AL—Ser (Bzl) —Lys (Fmoc)—D—Lys (Fmoc)—Leu— —Lys(Ipr)-Pro-D-Ala-NH-Csuporte de resina de MBHA1. Os aminoácidos não naturais nas posições 5 e ó são formados por realização, em simultâneo, das reacções seguintes com as cadeias laterais desprotegidas dos resíduos Lys. 0 grupo protector Fmoc é removido a partir de ambos os resíduos por tratamento do péptido—resina com piperidina a 20 por cento em DMF durante 5 minutos, depois lavagem com DMF, depois tratamento com mais piperidina (DMF durante 20 minutos). Após lavagem da resina com DMF, CH3OH, CH₂C1₂ e, finalmente, com DMF, o grupo amino recentemente libertado é tratado com um largo excesso (>10 vezes) de cianocarbonimidato de difenilo (PCI) em DMF. Subsequentemente, o péptido é, então, submetido à lavagem padrão (ver Passos 10—11) e, depois, tratado com isopropilamina dissolvida em DMF, durante 24 horas, a cerca de 22^eC para completar a formação da porção amino—isopro— pilcianoguanidino; este passo pode ser repetido para alguns dos reagentes mais impedidos.

A clivagem do péptido da resina e a desprotecção da cadeia lateral da Ser ocorrem muito rapidamente a 0°C com HF. É adicionado anisolo, como um depurador, antes do tratamento com HF. Após a remoção do HF sob vácuo, a resina é extractada com ácido acético a 50X e as lavagens são liofilizadas para produzir um pó de péptido em bruto.

A purificação do péptido é então efectuada por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), como conhecido na arte e especificamente descrito em J. Rivier, et al.. J. Chromatoqraphy, 288 (1984) 303-328.

péptido é considerado homogéneo utilizando a cromatografia em camada fina e vários sistemas de solventes diferentes, assim como por utilização da cromatografia líquida de alta pressão de

748 50453

-25•Fase inversa e de uma solução aquosa de fosfato de tr ieti lamónio, mais acetonitrilo. A análise de aminoácidos do péptido purificado, resultante, é compatível com a fórmula para a estrutura preparada, mostrando valores substancialmente inteiros para cada aminoácido da cadeia; a análise por espectroscopia de massa também é compatível. A rotação óptica é medida num polarímetro fotoeléctrico, como

Cal = —2,8 ± 0,5 (c=l, ácido acético a 50%).

D

Os outros péptidos da Tabela I são sintetisados e purificados similarmente. Os péptidos são ensaiados in vivo e podem ser, também, testados in vitro. Se realizado, o teste in vitro é realizado utilizando células da pituitária de ratazanas dissociadas, mantidas em cultura durante 4 dias antes do ensaio. Os níveis de LH medianos em resposta à aplicação de péptidos são avaliados por doseamento radioimunológico específico para a LH de ratazana. Os discas de controlo das células só recebem uma medida que é de 3 nanomolar em GnRH; os discos experimentais recebem uma medida de 3 nanomolar em GnRH mais uma medida tendo o presente antagonista padrão para fins de comparação i.e. CAc-desidroPro^, (4F)D-Phe², D-Trp³»^ó3-GnRH ou o péptido de teste, em concentrações variando entre 0,01 e 10 nanomolar. A quantidade de LH segregada pelas amostras só tratadas com GnRH é comparada com aquela segregada pelas amostras tratadas com o péptido mais GnRH. A capacidade do péptido de teste para reduzir a quantidade, de LH libertada por 3 nanomolares de GnRH é comparada àquela do presente péptido padrão.

teste in vivo determina a eficiência para impedir a ovulação em ratazanas fêmeas. Neste teste, é injectado um número preciso de ratazanas Sprague-Dawley fêmeas, maduras, por exemplo cinco a dez, tendo cada uma um peso corporal de 225 a 250 gramas, com uma dosagem em microgramas precisa de péptido em solução salina, em água bacteriostática, em polietileno-glicol, óleo de milho ou em misturas das substâncias referidas com etanol, cerca do meio-dia do dia do proestro. 0 proestro é a tarde da

748 50453 r/, ovulação, é utilizado um grupo de ratazanas fêmeas, separado, como controlo, ao qual não é administrado o péptido. Cada uma das ratazanas fêmeas de controlo teve a ovulação na “noite do proestro; das ratazanas tratadas, é registado o número das que tiveram a ovulação. Cada um dos péptidos è considerado totalmente eficaz para impedir a ovulação de ratazanas fêmeas a uma dose de cerca de 500 microgramas.

Todos os péptidos registados na Tabela I são considerados

eficazes	no bloqueio da secreção	da LH induzida	por	8nRH, in
vitro, a	uma concentração bastante	> razoável. Todos os péptidos
são considerados eficazes para impedir a ovulação	de	mamíferos
fêmeas a	baixas dosagens. A Tabela	A, seguinte, mostra	os resul-
tados dos	testes in vivo de alauns	destes antagonistas	da GnRH:
	TABELA	A
Pépt i do	Ratazanas que		Ratazanas que
No	Dosaqem têm ovulação	Dosaqem	têm	ovulação
1.	2,5 0/9	1,0		0/5
2.	2,5 6/6	2,0		2/10
3.	2,5 7/9	2,0		1/10
4.	2,5 0/6	2,0		1/10
5.	2,0 1/10
6.	2,5 0/6	1,0		7/17
7.	2,5 3/20
8.	2,5 5/19	1,0		5/5
9.	2,5 0/6	1,0		5/5
10.	2,5 5/8	2,0		1/10
12.	2,5 6/7	5,0		9/10
13.	5,0 5/12	10,0		3/5
15.	2,5 0/4	1,0		8/18
	EXEMPLO	II
Os péptidos como os indicados	na Tabela II, tendo	a fórmula:

Ac-desidroPro-(A)D-Phe-AA3-Ser-AA₅-fí-D-2NAL-Leu-AA_s-Pro-D-Ala-NH2 são preparados pelo processo em fase sólida referido acima.

71 748	ίο..... '7 a
50453	-27-
TABELA	II
	A AA₃	aa₅	AAg
17	4C1 &-D-2NAL	Tyr	Lys(bcg)
18	II II	II	(ecg)
19	4F (lFor)D-Trp	(2F)Fhe	Orn
20	II II	Tyr	Dpr(2ncg)
21	II II	(2N0₂)Phe	Dbu(icg)
22	(iAc)D—Trp	(2CH-r)Phe	< 2amp)
23	4Br	Tyr	(3amp)
24	II II	(2Br)Phe	(4amp)
25	H D-Trp	(2Cl)Phe	0rn(2mncg)
26	4N0₂ (5CH₃)D-Trp	<3Cf-H)Phe	(hcg)
27	“ (5F)D-Trp	His	Lys(tcg)
28	2,4C1₂ (5C1)D-Trp	(3F)Phe	Dpr(trcg)
29	(6N0₂)D-Trp	(3Br)Phe	Orn(lncg)
30	C«Me/4Cl Í5OCH₃)D-Trp	(31)Tyr	“ <pcg)
31	3,4C1₂ (5NH₂)D-Trp	(3Cl)Phe	Dpr(chcg)
Todos os péptidos registados	na Tabela II são	considerados
eficaz	es no bloqueio da secreção	da LH induzida	por GnRH, in

vitro. a uma concentração bastante razoável. Todos os péptidos são considerados eficazes para impedir a ovulação em mamíferos fêmeas a dosagens baixas.

EXEMPLO III

Os péptidos, como indicados na Tabela III, tendo a fórmula: G-&-D-2NAL-(4C1)D-Phe-D-3PAL-Ser-Tyr-AA₆-Leu-AAg-Pro-AA₁₀, são preparados pela processo em fase sólida referido acima:

(SEGUE TABELA III)

748 50453

TABELA III

	5	aa₆	AAg	AAio
32	Ac	D-Arg	Lys(bcg)	D-Ala-NH₂
33	Ac	D—Lys(bcg)	Arg	ti
34	For	D-Tyr	Lys(icg)	Gly-NH₂
35	Bz	(Et)D-Arg	Orn “	tl
36	Ac	D-Lys	” (ecg)	II
37	Vac	D—Har	¹¹ (mcg)	II
38	Acr	(4gua)D-Phe	Dpr(2ncg)	AzaGly-NH₂
39	Ac	D-Crn	(chcg)	D-Ala-NH₂
40	Acr	D-His	(tcg)	II
41	Ac	(Bu)D-Arg	Dbu(lmncg)	II
42	11	(Bz)D-Orn	Í2amp)	11
43	Vac	(4NH₂>D-Phe	(4amp)	11
44	Bz	(Ac)D-Lys	(trcg)	AzaGly-NH₂
	Todos os	péptidos registados na Tabela III são	considerados
eficazes no	bloqueio da secreção	da LH induzida por GnRH, in
vitrc	t, a uma	concentração bastante	razoável. Todos	os péptidos
são	considerados eficazes para impedir a ovulação	em mamíferos

fêmeas a dosagens baixas.

EXEMPLO IV

Os péptidos, como os indicados na Tabela IV, tendo a fórmula: Ac-AA|—(4C1)D-Phe-D-3PAL—Ser-Tyr—D-Arg-AAy-AAg-Pro—D-Ala-NH₂ são preparados pelo processa em fase sólida referido acima.

(SEGUE TABELA IV)

748 50453

	TABELA IV
	ΑΑχ	aa₇	AA_e
45	P-D-2NAL	Leu	Lys(bcg)
46	(lAc)D-Trp	Met	(2amp)
47	(óBríD-Trp	Tyr	“ (3amp)
48	Í5F)D-Trp	Nle	(4amp)
49	(6N0₂>D-Trp	Met	Orn(chcg)
50	(5C1)D-Trp	Tyr	<P<=g)
51	(4C1)D-Phe	Phe	Dpr(pcg)
52	(4F)D-Phe	(4F)Phe	(tcg)
53	(2,4C1₂)D—Phe	NML	Dbu(mcg)
54	desidroPro	Nle	(2ncg)
55	B-D-2NAL	Leu	Lys(Ocg)
56	(60CH₃)D-Trp	(lFor)Trp	Orn(lncg)
57	Í5NH₂)D—Trp	Nva	íecg)
58	(4N0₂)D-Phe	NML	(lmncg)
59	desidroPro	<6N0₂)Trp	Dbu(hicg)

Todos os péptidos registados na Tabela IV são considerados eficazes no bloqueio da secreção da LH induzida por GnRH, in vitro. a uma concentração bastante razoável. Todos os péptidos são considerados eficazes para impedir a ovulação em mamíferos fêmeas a dosagens baixas.

EXEMPLO V

Os péptidos, como os indicados na Tabela V, tendo a fórmula: Ac-ΑΑχ-(4C1>D-Phe-AA₃-Ser-AA₅-AA₆-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH₂ são preparados pelo processo em fase sólida referido acima.

(SEGUE TABELA V)

748

50453	-30- TABELA V
	AAj	AA₃	aa₅	aa₆
60	B-D-2NAL	D-3PAL	Lys(bcg)	R-D-2NAL
61	H	(6N0₂)D-Trp	Ii II	(Dnp)D-His
62	1!	D-Trp	(ecg)	(4gua)D—Phe
63	desidroPro	B-D-2NAL	Orn	(6N0₂)D-Trp
64	tt	β-D-lNAL	“ (mcg)	D-Vai
65	R-D-2NAL	ílFor)D-Trp	“ (tcg)	(Pr)D-Arg
66	ti	11	Dbu(bcg)	(5NH₂)D—Trp
67	desidroPro	D-Trp	(2amp)	D-Tyr
68	II	D-2PAL	(4amp)	D-Nle
69	11	(1Ac)D-Trp	** (hcg)	(4F)D—Phe
70	Pro	D-3PAL	Lys(pcg)	β-D-lNAL
71	(1For)D-Trp	1!	“ íchcg)	(4NHCH-)D-Fhe
72	B-D-2NAL	11	Dpr(hcg)	UHcW-Orn
73	II	11	“ (Ocg)	<4NH₂>D-Phe
74	β-D-1NAL	(6Br)D-Trp	“ (tcg)	(1For)D-Trp
75	(6CH₃)D-Trp	D-4PAL	(bzcg)	D-4PAL
	Os péptidos	registados na Tabela	V são considerados eficazes
na	bloqueio da secreção da LH induzida por GnRH,	in vitro, a uma
concentração bastante razoável. Todos	os péptidos	são considera-
dos	eficazes para	impedir a ovulação ι	em mamíferos	fêmeas a dosa-

gens baixas.

EXEMPLO VI

Os péptidos, como os indicados na Tabela VI, tendo a fórmulas G-AAj-(4C1)D-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-AA₆-Leu-AA_S-Pro-D-Ala-NH₂ são preparados pelo processo em fase sólida referido acima.

(SEGUE TABELA VI)

748 50453

/'/ β->~.

TABELA VI

G	AA\|	AA_Ó	AA_S
76	Ac	desidroPro	D-Lys(bcg)	Lys(bcg)
77	Ac	B-D-2NAL	(5-D-2NAL	(3amp)
78	Ac	R-D-2NAL	D-Vai	” (tcg)
79	Acr	Pro	D-Ser(OtBu)	·* (chcg)
80	H	desidroPro	(imBzl)D-His	(ecg)
81	Bz	(4Br)D—Phe	(5C1)D-Trp	Orn
82	11	D-pGlu	(6Br)D-Trp	(bzcg)
83	For	R-D-1NAL	(Me)D-Arg	“ (Ocg)
84	II	desidroPro	D-Har	(4amp)
85	Vac	fí—B-2NAL	(Bz)D-Lys	(chcg)
86	Ac	(Arg⁵)	B-D-2NAL	Lys(Ocg)
67	H	desidroPro	D-Ala	(tcg)
	Os péptidos	registados na	Tabela VI são	considerados ef

cazes no bloqueio da secreção da LH induzida por 5nRH, in vitro. a uma concentração razoável. Todos os péptidos sSo considerados eficazes para impedir a ovulação em mamíferos fêmeas a dosagens baixas.

EXEMPLO VII □s péptidos, como os indicados na Tabela VII, tendo a fórmula: Ac-fl-D-2NAL- (4C1) D-Phe-D-3PAL-Ser-AA₅-AA₆-Leu-AA₈-Pro-D—Ala—NH₂ são preparados pelo processo em fase sólida referido acima.

TABELA VII

	aa₅	aa₆	AA_S
88	Arg	D-Lys(bcg)	Arg
69	II	D-Lys(Ocg)	II
90	Orn(bcg)	(4gua)D-Phe	(Et₂)Arg
91	Lys(2ncg)	D-Lys(2ncg)	ILys
92	Orn(bzcg)	(bzcg)	Har
93	Lys(act)	“ (act)	ILys
94	(hicg)	(hicg)	ILys

(CONTINUA)

748 50453

—X*?—

95	Lys(trcg)	D-Lys(trcg)	ILys
96	Lys(bcg)	D-Lys(bcg)	ILys
97	II	II	D-3PAL	(EtPr)Har
98	II	II	D-Lys(Nic)	(Me2>Arg
99	Orn(tcg)	D—Lys(tcg)	(MeBu)Arg
100	Lys(Sbcg)	“ (Sbcg)	ILys

Os péptidos registados na Tabela VII são considerados eficazes no bloqueio da secreção da LH induzida por GnRH, in vitro. a uma concentração razoável. Todos os péptidos são considerados

eficazes	para impedir	a ovulação em mamíferos fêmeas a dosagens
baixas.		EXEMPLO VIII
Os	péptidos, como os indicadas na Tabela	VIII, tendo a
fórmula;	AC-B-D-2NAL-(4C1)D-Phe-D-3PAL-Ser-AA₅-AA₆-Leu-AA₈-Pro-D-
-Ala-NHo	são preparados pelo processo em fase	sólida referido
acima.		TABELA VIII
	aa₅	aa₆	AAg
101	Qrn(bcg)	D-Orn(bcg)	ILys
102	Orn(bcg)	D-Orn(2amp)	ILys
103	Orn(tcg)	D-Orn(tcg)	ILys
104	Orn(bcg)	(1-D-2NAL	ILys
105	0rn(2mpcg)	{1-D-2NAL	ILys
106	Lys(Nic)	D-Lys(Nic)	Lys(bur)
107	Lys(2ncg)	D-Lys(2ncg)	ILys
108	Lys(bzcg)	D-Lys(bzcg)	ILys
109	Lys(icg)	D-Lys(icg)	Arg
110	Orn(icg)	D-Orn(icg)	ILys
Todos os péptidos	registados na Tabela VIII	são consideradas
eficazes	no bloqueio	da secreção da LH induzida por GnRH, in
vitro. ,	a uma concentração bastante razoável. Todos os péptidos

são considerados eficazes para impedir a ovulação em mamíferos fêmeas a dosagens baixas.

748 50453

EXEMPLO IX

Os péptidos, como os indicados na Tabela IX, tendo a fórmula: Ac-{3-D-2NAL- (4C1) D-Phe-AAj-Ser-AAg-AAxj-Leu-AAg-Pro-D-Ala -NH₂ são preparados pelo processo em fase sólida referido acima.

TABELA IX

AA?	aa₅ Tyr	aa₆ D-Arg	AAg Arg
111	D-Lys(bcg)
112	D—Lys(2amp)	Tyr	D-Arg	Arg
113	D-Lys(tcg)	Tyr	D-Arg	Arg
114	D-Lys(bcg)	Arg	Í3-D-2NAL	Arg
115	D-Lys(tcg)	Arg	D-D-2NAL	Arg
116	D-Lys(bcg)	Tyr	D-Arg	ILys
117	D—Lys(tcg)	Tyr	D-Arg	ILys
118	D-Lys(bcg)	Tyr	B-D-2NAL	ILys
119	D—Lys < bcg)	Tyr	D-3PAL	ILys
120	D-Lys(2mpcg)	Tyr	D-3PAL	ILys
121	D-Lys(bcg)	Tyr	D-Arg	Arg
122	D—Lys(bcg)	Lys(bcg)	D-Lys(bcg)	ILys
123	D-3PAL	Lys(bur)	I3-D-2NAL	Arg
124	D-Lys(bcg)	Tyr	B-D-2NAL	Lys(bcg)
125	D—0rn(2amp)	Tyr	D-3PAL	Lys(2amp)
	Todos os péptidos	registados	na Tabela IX são	considerados
eficazes no bloqueio	da secreção	da LH induzida \|	por GnRH, in
vitrc	1, a uma concentração bastante	razoável. Todos	os péptidos
são	considerados eficazes para impedir a ovulação	em mamíferos

fêmeas a dosagens baixas.

Na Tabela B seguinte são mostrados os resultados dos testes in vivo de antagonistas seleccionados a partir dos anteriores:

(SEGUE TABELA B)

71 748 50453	—34— TABELA B	0 T Ratazanas que têm ovulação
Péptido Nfi	Dosaqem	Ratazanas que têm ovulação	Dosaqem
17.	10	6/8	15	7/10
33.	2,5	4/17
55.	10	6/7	25	2/5
60.	2,5	4/14	1,0	8/10
86.	2,5	4/15	5,0	5/5
88.	2,5	0/4	1,0	4/15
	10	0/8
89.	10	2/18
93.	2,5	5/10
94.	1,0	7/11
96.	1,0	9/12
101.	2₅ 5	0/5	1,0	5/8
102.	2,5	2/9
103.	2,5	5/7
104.	2,5	6/B
105.	2,5	0/5
106.	5,0	0/7
111.	2,5	1/11	1,0	0/5
			0,5	5/7
112.	1,0	4/8
113.	1,0	5/6
114.	5,0	4/5
115.	2,5
lló.	2,5	0/6	1,0	2/8
117.	10	0/6	5	2/5
122.	10	4/6
123.	10	1/10	5	0/6
		EXEMPLO X
0s	péptidos,	como os indicados na	Tabela X,	tendo a fórmula:

pGlu-His-Trp-Sei—Arg-AA^-AAy-Arg-Pro-AAio são preparados pelo procedimento em fase sólida referido acima.

748 50453

—35—

TABELA X

aa₆	aa₇	ΑΑΐφ
126	D-Lys(bcg)	Leu	Gly-NH₂
127	I!	(ecg)	11	II
128	1!	(pcg)	II	II
129	I!	(hcg)	II	AzaGly-NHo
130	II	(tcg)	tt	NHCH₂CH₃
131	II	(4amp)	II	II
132	II	(3amp)	NML	II
133	II	(2amp)	II	II
134	li	(chcg)	Leu	Gly-NH₂
135	11	(Ocg)	II	II
136	D-Orn(bcg)	II	II
137	II	(tcg)	NML	AzaGlyNH₂
138	II	(mcg)	II	NHCH₂CH₃
139	D-Dbu(2amp)	II	NHCH3
140	II	(chcg)	Leu	nhch₂ch₂ch₃
141	tl	(bzcg)	11	Gly-NH₂
142	D-Dpr(ecg)	II	II
143	II	(hicg)	NML	II
144	II	(trcg)	II	nhch₂ch₃

Ds péptidos descritos na tabela X são considerados eficazes para causarem a libertação da LH e da FSH em ratazanas fêmeas. Todos eles são consideradas substancialmente mais eficazes que a GnRH nativa.

EXEMPLO 145

Um intermediário peptídico tendo a fórmula: Ac-β—D-2NAL-(4C1)D-Phe-D-3PAL-Ser(Bzl)-Lys(Fmoc)-D-3PAL—NML-Lys(Dts)-Pro-D-Ala-NH-Esuporte de resinai é preparado pelo procedimento em fase sólida que foi, de um modo geral, referido acima. 0 intermediário é, então, tratado com piperidina para remover o grupo protector Fmoc e é, subsequentemente, feito reagir com PCI como descrito anteriormente. Em seguida é removido o grupo protector Dts do amino da cadeia lateral do resíduo Lys na posição 8, utilizando um tiol adequado, tal como fl-mercaptoetanol ou tiofenol (PhSH),

748

em DMF, e é dado ao pêptido-resina a lavagem padrão. Subsequentemente, é mantido a 22°C durante 10-60 minutos ou até que o teste com a ninidrina seja negativo para permitir que a reacção prossiga até ao final, efectuando a ciclização do grupo amino primário da cadeia lateral da Lys® e da porção cianoguanidino que foi anteriormente formada na cadeia lateral da Lys^. A desprotecção e a clivagem são, então, realizadas como descrito previamente. A seguir à purificação por HPLC, como descrito previamente, o antagonista da GnRH é testado. D péptido é considerado eficaz para impedir a ovulação em mamíferos fêmeas a dosagens baixas.

EXEMPLO 146

Um intermediário peptídico tendo a fórmulas Ac—β—D—2NAL— - (4C1)D-Phe-D-3PAL-Ser(Bzl)-Orn(Fmoc)-D-Trp-Leu-Lys(Nps)-Pro-D-Ala-NH-Esuporte de resinai é preparado pelo procedimento em fase sólida, referido acima. 0 intermediário peptídico é tratado com um tiol adequado, como descrito no Exemplo 145, para formar a porção cianoguanidino por reacção do PCI com o grupo amino da cadeia lateral do resíduo Lys na posição 8, e é depois ciclizado com o grupo amino da cadeia lateral, desprotegido, da Drn na posição 5 a seguir à remoção do grupo protector Fmoc. A seguir à clivagem e à purificação por HPLC, como descrito previamente, o antagonista da GnRH é testado. 0 péptido é considerado eficaz para impedir a ovulação em mamíferos fêmeas a dosagens baixas.

EXEMPLO 147

Um intermediário peptídico tendo a fórmula: Ac—β—D-2NAL— -(4C1)D-Phe-D-3PAL-Ser-Bzl-Tyr(2BrZ)-D-Lys(Fmoc)-Leu-Lys(Ipr)—Pro-D-Ala-NH-Csuporte de resinai é preparado pelo procedimento em fase sólida referido acima. A seguir à remoção da protecção Fmoc, o intermediário peptídico é feito reagir, como foi, de um mogo geral, descrito no Exemplo 1, utilizando isocianato de naftilo em vez de PCI para formar a porção naftilureia como o grupo amino da cadeia lateral do residuo D—Lys na posição 6. A seguir à clivagem e à purificação por HPLC, como descrito previamente, o antagonista da GnRH é testado. 0 péptido é considerado eficaz para impedir a ovulação em mamíferos fêmeas a a dosagens baixas

7^8 50Α53

Um intermediário peptídico tendo a fórmula: Ac-|!-D-2NAL-(4C1)D-Phe-D—3PAL-Ser(Bzl)-Tyr(2BrZ)-D-Lys(Fmoc)-Leu-Lys(Ipr)-Pro-D-Ala-NH-Esuporte de resinai é preparado pelo procedimento em fase sólida, referido acima. A seguir à remoção da protecção Fmoc, o intermediário peptídico έ feito reagir, como foi, de um modo geral, descrito no Exemplo I, utilizando isotiocianato de naftilo em vez de PCI para formar a porção naftiltioureia com o qrupo amino da cadeia lateral do resíduo na posição 6. A seguir à clivagem e à purificação por HPLC, coma descrito previamente, o antagonista da GnRH é testado. 0 péptido é considerada eficaz para impedir a ovulação em mamíferos fêmeas a dosagens baixas.

EXEMPLO 149

Um intermediário peptídico tendo a fórmula: Ac-{1-D-2NAL-(4C1)D-Phe-D-3FAL-Ser(Bzl)-Tyr(2BrZ)-B~Lys(Fmoc)-Leu-Lys(Ipr)—Pro—D—Ala—NH-Esuporte de resinai é preparado pelo procedimento em fase sólida, referido acima. A seguir è remoção da protecção Fmoc, o intermediário peptídico é em primeiro lugar, feito reagir utilizando éter 2-bromoet i 1,2’-(Bocam ino) etil ico dissolvido em BMP durante í hora ou até que o teste com ninidrina seja negativo, para ligar o átomo de carbona ao grupo amino da cadeia lateral pela remoção do halogéneo para formar: Q-NH-(CH₂)₂ ^-0^_ —(CH₂)₂-NH(Boc). Este composto é então feito reagir, como foi de um modo geral, descrito no Exemplo I, utilizando PCI para formar a porção cianoguanidino com o grupo amino secundário da cadeia lateral do resíduo na posição 6. Em seguida é removido o grupo de protecção Boc e o qrupo amino primário reage com o grupo -OPh para dar o composto:

N-CN

II

O-N-C-NH I (CH2>2-0-(CH2>2 A seguir à clivagem e ã purificação por HPLC como descrito previ£ mente o antagonista da. GnRH é restado. 0 péptido ê considerado efi caz para impedir a ovulação em mamíferos femeas a dosagens baixas.

748 50453

EXEMPLO 150 (Boc)Dpr é feito reagir com o PCI, como no Exemplo I, para produzir

NHÍBoc) N-CN

I II

H-C-CH?-N-C-OPh que foi então feito reagir com

I I

COOH H hidrazina dissolvida em DMF durante i a 2 dias à temperatura ambiente, lavado com DMF e isto foi depois repetido para substituir o grupo -OPh com a formação concomitante do heterociclo:

NH₂

NHÍBoc) N - D ι ii s h-c-ch₂-nh-c n j ^N^

COOH H que é particularmente útil como um substituto para a His nas sínteses peptidicas.

A seguir à purificação dos péptidos, alguns deles são adi— cionalmente caracterizadas sendo submetidos a cromatografia líquida de alto rendimento sobre sílica C|g (Vydac 0,46 x 25 cm) utilizando um caudal de 1,7 ml/min e um gradiente de 35% a 85%, em volume de Tampão B durante um espaço de tempo de 50 minutos com o restante sendo Tampão A. O Tampão A é uma solução de trietilamina a 0,3% ív/v) e ácido fosfórico a 0,17. em água a pH

7,0; o Tampão B é acetonitrilo em Tampão A, a 60%, em volume. A

Tabela C seguinte mostra quando é que os péptidos específicos eluiram a partir da sílica Cjg tendo um tamanho de partícula de 0 cerca de 5# e um tamanho de poro de 300 A quando submetidos a um gradiente de Tampão B de 35% até Tampão B a 85% (em volume, com o restante sendo Tampão A) durante 50 minutos, a um caudal de 1,7 ml por minuto e, em seguida, a 85%, isocraticamente, durante 10 min..

(SEGUE TABELA C)

748 50453

-39—

TABELA C

Péptido NS

1.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

10.

11.

12.

13.

15.

17.

32.

Tempo de Eluição

26.56

47.6 20,32 w5,6 31,04 28,96 27,74 54,24 30, 86 56,9 46,78 33,4 41,1

49.6

40.56 35,84

Os péptidos do invento são muitas vezes administrados na forma de sais não tóxicos, farmaceuticamente aceitáveis, tais como sais de adição de ácido, ou de complexos metálicos, por exemplo, com zinco, bário, cálcio, magnésio, alumínio ou semelhantes (que são considerados como sais de adição para os fins deste pedido de patente) ou de combinações dos dois. SSo exemplos de tais sais de adição de ácido o: hidrocloreto, hidrobrometo, sulfato, fosfato, nitrato, oxalato, fumarato, gluconato, tanato, maleato, acetato, citrato, benzoato, succinato, alginato, malato, ascorbato, tartarato e semelhantes. Por exemplo, uma solução aquosa do péptido pode ser tratada repetidamente com ácido acético IN e, depois, liofilizada para produzir o seu sal de ácido acético. Se o ingrediente activo é para ser administrado na forma de comprimido, o comprimido pode conter um diluente farmaceuticamente aceitável que inclui um ligante, tal como tragacante, amido de milho ou gelatina; um agente desintegrante, tal como ácido algínico; e um lubrificante, tal como estearato de magnésio. Se é

-CÁ

748 50453

-40ÍA ‘/ f desejada a administração na forma liquida, pode ser utilizada um edulcorante e/ou um saborizante como parte do diluente farmaceuticamente aceitável e pode ser efectuada a administração intravenosa em solução salina isotónica, soluções de tampão fosfata ou semelhantes.

As composiçSes farmacêuticas conterão, normalmente, o péptido em conjunção com um portador farmacêuticamente aceitável, convencional. Normalmente, a dosagem será de cerca de 10 microgramas a cerca de 2,5 miligramas do péptido por quilograma do peso corporal do hospedeiro quando dado intravenosamente; embora as dosagens orais venham a ser mais elevadas, considera-se que a natureza destes compostos pode permitir uma administração oral eficaz. Globalmente, o tratamento de sujeitos com estes péptidos é geralmente realizado da mesma maneira que o tratamento clínico utilizando outros antagonistas ou agonistas da GnRH e utilizando um portador adequado no qual o péptido é solúvel.

Pode, também, ser desejável distribuir o análoga da GnRH durante períodos de tempo prolongados, por exemplo, durante períodos de uma semana até um ano a partir de uma administração única, e podem ser utilizadas formas de dosagem de depósito (depot) ou implantação de libertação lenta. Por exemplo, uma forma de dosagem pode conter um sal não tóxico, farmaceuticamente aceitável, do composto, o qual tem um baixo grau de solubilidade nos fluidos corporais, por exemplo, um sal ds adição de ácido com um ácido polibásico; um sal com um catião metálico polivalente; ou uma combinação dos dois sais. Um sal relativamente insolúvel, pode também ser formulado num gel, por exemplo, um gel de estearato de alumínio. Uma formulação de depósito de libertação lenta, adequada, para injecção pode também conter o análogo da GnRH ou um seu sal disperso ou encapsulado num polímero não tóxico ou não antigénico, de degradação lenta tal como um polímero de ácido poliláctico/ácido poliglicólico, por exemplo, como descrito na Pat. U.S. N2 3 773 919. Estes compostos podem também ser formulados em implantações silásticas.

Estes péptidos podem ser administrados intravenosamente, subscutaneamente, intramuscularmente, oralmente, percutaneamente,

748 50453

por exemplo intranasalmente ou intravaglnalmente a mamíferos, para alcançarem a inibição e/ou o controlo da fertilidade e também em aplicações que têm em vista a supressão reversível da actividade das gónadas, tal como para o tratamento da puberdade precoce ou durante a terapia por radiação ou a quimioterapia. Eles são, também, úteis para o tratamento de tumores dependentes de esteróides. As dosagens eficazes podem variar com a forma de administração e a espécie particular de mamífero a ser tratado. (Jm exemplo de uma forma de dosagem típica é uma solução de água bacteriostática contendo o pêptido, solução que é administrada parentericamente para proporcionar uma dose no intervala de cerca de 0,1 a 2,5 mg/kg de peso corporal, por dia. A administração oral do pêptido pode ser dada quer na forma sólida quer na forma líquida.

Embora o invento tenha sido descrito com respeito às suas concretizações preferidas, deve-se subentender que as mudanças e , como modifícaçôes, tais/as que serão óbvias para aqueles que têm uma perícia normal nesta arte, podem ser feitas sem se afastarem do âmbito do invento que é descrito nas reivindicações que estão apensas em anexo. Por exemplo, podem ser empregues nos péptidos do invento outras substituições conhecidas na arte que não depreciem significativamente a eficácia dos péptidos. A D-2PAL e a D-4PAL são consideradas equivalentes a D-3PAL. Ds substitutos na posição 6, descritos na Tabela VI são considerados equivalentes, conhecidos na arte anterior e podem ser incluídos nos péptidos do invento. A Phe substituída, tal como (4FíPhe, pode ser utilizada em vez da Phe na posição 7. A butilLys e a dietilLys são consideradas equivalentes à Ilys; contudo, a Ilys é preferida quando nem o U* nem a Arg estão na posição 8. Outros residuos de aminoácidos hidrofóbicos podem também, ser empregues na posição 1, preferivelmente na forma de isómero D e são considerados equivalentes àqueles especifiçados. Além disso, os análogos podem ser administrados na forma de seus sais não tóxicos, farmaceuticamente ou veterinariamente aceitáveis, como anteriormente indicado, os quais são considerados equivalentes.

74Β 50453

-42As características particulares do invento sSo realçadas nas reivindicações que se seguem.

Claims

REIVINDICAgSES

1 - Processo de preparação de um péptido ou de um seu sal não tóxico tendo a fórmula: G-AA-AA₂~AA’-Se?—AAg-AA^-AAy-AAg-Pro“AAjo na qual G é hidrogénio ou um grupo acilo tendo 7 ou menos átomos de carbono; AA é AAj ou pGlu; AAj é desidro-Pro, D-pGlu, (A)D-Phe (B)D-Trp, Pro, ou β-D-Nal; A é H, Cl, F, N0₂, CH₃, 0CH₃, C«Me/ /4C1, Cl₂ ou Br; B é H, N0₂, NH₂, 0CH₃, F, Cl, Br, CH₃, NⁱⁿFor ou NⁱⁿAc; AA₂ é His ou (A)D-Phe; AA’ é AA₃ ou Trp; AA₃ é U*, D-Pal, β-D-NAL ou (B)D-Trp; AA5 é U*, Lysícpd), Ornícpd), Dbu(cpd) Dpr(cpd), Tyr, (C)Arg, (A)Phe, (3I)Tyr ou His; C é H ou alquilo inferior; AA^ é U*, β-D-NAL, (B)D-Trp, (A’)D—Phe, (D)D-Orn, (D)D-Lys, (D)Dbu, (D)D-Dpr, D-Har, D-Tyr, (E)D-His, D-Pal, (C)D-Arg, D—Leu, D—Ile, D—Nle, D-Val, D-Ala, ou D-Ser(OtBu); A’ é A, NH₂, NHCH₃ ou gua; D é G, cpd ou um grupo arilo; E é H, imBzl ou dinitrofenol; AA7 é Nle, Leu, NML, (A)Phe, Met, Nva, Tyr, (B)Trp ou PAL; AAg é U*, ILys (C’)Arg ou (C’)Har; C’ é H ou dialquilo inferior; AA₁₀ é D-Ala-NH₂, Gly-NH₂, NHNHC0NH₂ ou NHÍR); R é alquilo inferior; e Ll* é

0 Y

II II

HQ-C-CH-(CH₂)_n-N-C-X

I I I

NH₂ Rl R₂ onde n é um número inteiro de 1 a 6; Y = N—CN, N-CONHR9, S, 0 ou CH-N0₂ onde R9 é H, Ac, alquilo, naftilo, piridilo, pirimidilo, pirazinilo, indolilo, quinolinilo ou imidazolilo, estando os grupos alquilo e cíclicos não substituídos ou substituídos; X é NH, D, S, N₃, Mi(CH_q)pM₂ ou Μ_χ-(CH₂)_p’-M₂ÍCH₂)_p”-M₃, onde M_t é NRiq N, 0, S ou CHR₃ em que R₃ é metilo, etilo, propilo, fenilo, piridinilo, pirimidinilo ou purinilo; q é 1 ou 2; p, p’ e p” são números inteiros entre 0 e 6; Riq é H, metilo, etilo, propilo, fenilo ou fenilo substituído; e M₂ e M₃ são Μχ, COOH, C0NH₂, COOR3 ou CN; Ri é H, alquilo, (CH₂)n’^’ ’ alcenilo, alciniio, arilo ou uma ligação directa a X; n’ é 1, 2, 3 ou 4; X” é CH₂NH₂, CH₂0H, CH₂C1, CH₂Br, CH₂F, CF₃ ou CF₂CF₃; R₂ é R_x, OH,

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NH₂, NHRj, heterociclo ou desR₂, sendo R₂ desR₂ quando X é N₃; contudo, desde que R| e R₂ estejam, opcionalmente, interligados, um ao outro, via uma ponte ramificada ou não ramificada, sendo Rj-R₂ -(CH₂)_m- ou -ÍCH₂)_m-M-(CH₂)_m?- onde me m’ são números inteiros de 1 a 6 e M é NH, 0, S ou CHR4, sendo R4 arilo ou alquilo inferior, desde que, adicionalmente, Y e R₂ estejam, opcionalmente, interligados; e ainda adicionalmente desde que, pelo menos, um de AA3, AA5, AA& e AAg seja U*; caracterizado por compreender:

(a) a formação de um péptido intermediário tendo a fórmula: Xl-Aft-AA₂(X5)-U₃-SerίΧ³)-υ₅-υ_ώ-ΑΑ₇(Χ^Ξ ou X⁷)-Ug-Fro-X⁸ na qual: U₃ é U’ ou AA’(X²); U5 é U’ ou Aã5(X⁴ ou X⁵); U6 é U’ ou AA₆(X⁴ ou X⁵ ou X⁶); Li⁸ é U’ ou AAgíX⁵ ou X⁶); U’ é Lys (X^a), Orn(X^a), Dbu(X^a) ou Dpr(X^a); X* é hidrogénio ou um grupo protector de α-amino; X² é hidrogénio ou um grupo protector de um azoto de indole; X³ é um grupo protector de um grupo hidroxilo de Ser ou Thr; X⁴ é hidrogénio ou um grupo protector de um grupo hidroxilo fenólico de Tyr; X³ é hidrogénio ou um grupo protector de um grupo guanidino ou imidazole; X⁶ é um grupo protector de um grupo amino primário; X^a é um grupo protector de um grupo amino primário que é lábil às bases, lábil à hidrazina ou lábil a tio; X⁷ é hidrogénio ou um grupo protector de Met; X⁸ é Gly-NH—[suporte de resinai, D-Ala-NH-Esuporte de resinai, N(A)-[suporte de resinai, uma amida de Gly ou de D-Ala ou uma amida substituída, directamente ligada a Pro; desde que, contudo, pelo menos um de U₃, ^u5» ^u6 ^{e U}S seja ^Ly^s (X^a)» Orn(X^a), Dbu(X^a) ou Dpr(X^a); (b) a remoção de, pelo menos, um X^a para desproteger um grupo amino primário da cadeia lateral de, pelo menos, um resíduo aminoácido do referido péptido intermediário; (c) a reacção do referido grupo amino primário da cadeia lateral, desprotegido, para transformar o referida residuo num tendo a fórmula U*; e (d) a separação de quaisquer grupos a X⁷, restantes, e/ou a clivagem de qualquer suporte de resina incluído em X⁸.
2 — Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por U5 ser U’.

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3 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por Ug ser U’.
4 - processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por U3 ou Ug serem U’.
5 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por Ug e Ug serem U^?.
6 - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por AAg, nc referido péptido, ser Li* e conter uma porção cianoguanidino a qual incorpora um grupo amino de cadeia lateral que faz parte de AAg.
7 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido péptido ter a fórmula:

pSlu-His-Trp-Ser-Tyr-(U)-AA7-Arg-Pro-AA|0, na qual NML e AA₁₀ é NHÍR).
8 - Processo de acordo com a reivindicação 1, por o referido péptido ter a fórmula:

AA7 é Leu ou caracteri zado

G-AAj-ίA)B—Phe—AA3—Ser-AAg—AAg—AA7—AAg—Pro—AA

9 - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado

por AAg ser U*. 10 — Processo de acordo com a reivindicação S, caracterizado por AAg ser U*. 11 - Processo de acorda com a reivindicação 8, caracterizado por AAg ser U*. 12 - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por aa₃ ser U*. 13 - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por AAj ser β—D—2NAL, (A) ser 4C1 ou 4F e AA3 ser D—3PAL. 14 - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por AAg ser D—Trp, D—PAL, β—D—NAL, ÍimBzDD—His ou Í6NO₂)D—Trp e AAg ser U*. 15 — Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado

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50453 —46— por U* conter uma porção cianoguanidina ε n ser 1,2,3 ou 4.

16 - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por U* ser Lys(bcg).

17 - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por U* ser Lys(icg).

18 - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por ΑΑθ ser Arg, G ser Ac e (D) ε (E) serem ambos H.

19 - Processa de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por U* ser Lys(2amp).

20 — Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por U* ser Lys(pcg).

21 - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por AAg ser ILys.

22 - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por U* ser Lys(tcg) e AAg ser Arg.

23 - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por AA5 ser LysíNic), AA^> ser U* e AAg ser ILys.

24 - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por U* ser Orn(icg).

Lisboa.