PT96688B - Processo de producao de peptidos contendo pelo menos duas ligacoes de ciclizacao - Google Patents

Description

Processo de produção de péptidos contendo pelo menos duas ligações de ciclização para que

THE SALK INST1TUTE FOR BIOLOGICAL STUDIES, pretende obter privilégio de invenção em Portugal.

presente invento refere-se ao processo de produção de péptidos contendo pelo menos duas ligações de ciclização entre dois dos três grupos Ri~R₃., R4-R10 θ ^{ου um seu sal nao} tóxico, os quais tem a fórmula I;

X~Rl~(A)D-Phe-R₃-R₄-R₅-R₆-R₇-R₈-(E)Pro-R_1Q-NH₂ na qual X é hidrogénio, cu um grupo acilo com 7 átomos de carbono ou menos, Rj_ é B-D-2NAL, desidropro, D-Cys, D-Abu, D-Asp, D-Glu, D-Lys, D-Orn, D-Dbu ou D-Dpr; A é H,C1, F, Νθ2> CH3, OCH₃, C^aMe/4Cl, Cl2 ou Br; R3 é B-D-2NAL, D-3PAL, D-Trp, D-Cys, D-Abu, D-Asp, D-Glu, D-Lys, D-Orn, D-Dbu ou D-Dpr; R4 é Ser, Cys, Asp, Glu, Orn, Dbu, Dpr ou Abu; Rc, é Tyr, Glu, Hgl ou Hhg; R8 é β-D-NAL., (B)D-Trp, (A’)D-Phe, (D)D-Har, D-Tyr, (C)D-Hís, D-Pal, (D)D-Arg, D-Leu, D-Ile, D-Val, D-Nle, D-Ala, D-Pro, D-Ser(OtBu), ou D-Nva; A^? é A, NH2, NHCH₃ ou gua; B é H, N0₂, NH₂, 0CH₃, F, Cl, Br, CH₃, N*ⁿFor ou NⁱⁿAc; C é H, imBzl ou dinitrofenilo; D é H ou di-alquilo inferior; Ry é Nle, Leu, NHL, Phe, Met, Nva, Tyr, Trp ou PAL; R₈ é (D)Arg, (D)Har, Hly, Hhl ou Lys; E é H, OH ou desidro; e R^q é Gly, D-Ala, Cys, Asp, Glu, Orn, Dbu, Dpr ou Abu; com a condição, contudo, de que quando R₄ é Cys ou Abu, R₁₀ é Cys

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ou Abu; quando Rq. é Asp ou Slu, é Orn, Dbu ou Dpr; quando Eq,

Dbu ou Dpr, Rjq é Asp ou Glug quando Rg é Slu, Rg é Lys;

é Orn auando

Doe um grupo protector

Rj_ é D~Cys ou D-Abu, R3 é D-Cvs ou D-Afou; quando Ej. é -Asp ou D-Glu, R3 é D-Lys, D-Orn, D-Dbu ou D-Dpr; e quando Rj_ D-Lys, D-Orn, D-Dbu ou D-Dpr, R3 é D-Asp ou D-OXu; caracterizado por compreender (a) a formação de um composto intermediário com a •fórmula II s

Xl-R₁-(A)D“Phe-R3(X²)-R4{X³)-R5(X⁶)-R6(X⁴ ou X⁵)-R7(X² ou X⁴ ou X? )--Rg ( χ8)-(E5Pro-R^çj (X·-¹)~·χ9 na q_Uai χΐ é hidrogénio ou um grup protector de amino alfa:; X² é hidrogénio ou um grupo protector de um azoto de Índole; X··-' é uma ligação directa., hidrogénio ou um grupo protector de Cys ou de um grupo amino ou carboxilo cadeia lateral X⁴ é hidrogénio ou grupo protector pra hidroxilo fenólico de Tyr; X³ é hidrogénio ou um grupo de uma cadeia lateral guanidino ou imidazols; é um grupo protector. lábil às bases, de uma cadeia lateral carboxilo ou uma ligação directa; X² é um grupo protector de Met; X^s é um grupo protector., lábil às bases,, de um amino de cadeia lateral ou é uma ligação directa; e é seleccionado de entre o grupo consistindo em 0-CH2“( resina de suporte),, -NH-(resina de suporte)., ésteres e amidas; (b) separação de um ou mais dos grupos X·*· a X^ e/ou clivagem de qualquer resina de suporte incluída em X⁹; (c) opcionalmente, criação de uma ligação de ciclização entre um tios tr'ê'5 grupos referidos, se ainda não estiver presente, e, se desejado, (d) conversão do péptido resultante num seu sal não tóxico,,

Os péptídos preparados ds acordo com o presente invento inibem a secreção de gonadotropinas pela glândula pituitária e inibem a libertação de esteroides pelas gónadas,, £

Iii

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MEMÓRIA DESCRITIVA presente invento refere-se a péptidos que inibem a libertação de gonadotropinas pelas glândulas pituitárias dos mamíferos, incluindo os humanos, e a processos para impedir a ovulação e/ou a inibição da produção de esteróides» Particularmente, o presente invento é dirigido a péptidos que inibem a função gonadal e a libertação de hormonas esteróides, progesterona e testosterona»

ANTECEDENTES DD INVENTO

A glândula pituitária está ligada por uma haste a uma região na base do cérebro conhecida como o hipopotálamo» Particularmente, são libertadas pelas glândulas pituitárias a hormona estimuladora do folículo (VSH) e a hormona luteinizante (LH), algumas vezes referidas como gonadotropinas ou hormonas gonadotrópicas» Estas hormonas combinadas regulai?! o funcionamento das gónadas para produzirem testosterona nos testículos e progesterona e estrogénio nos ovários, e também regulam a produção e maturação de gametas«

A libertação de uma hormona pelo lobo anterior da glândula pituitária, requer normalmente uma libertação prévia de uma outra classe de hormonas produzidas pelo hipotálamo» Uma ' das hormonas hipotalamieas age como um factor que desencadeia a produção de hormonas gonadotrópicas, particularmente da LH, sendo esta hormona aqui referida como GnRH, apesar de também ter sido referida como LH-RH e como- LRF» A GnRH foi isolada e caracterizada como um decapéptido com a seguinte estruturas pGlu-His-T rp-Ser-Tyr-G1y-Leu-Arg-Pro-GIy-NH2

Os péptidos são compostos que contêm dois ou mais aminoácido nos quais o grupo carboKilo de um ácido está ligado ao grupo amino do outro ácido» A fórmula da GnRH, como representada anteriormente, está de acordo com a representação convencional dos péptidos, na qual o terminal amino aparece á esquerda e o terminal carboxilo à direita» A posição do resídua de aminoácido é identificada numerando os resíduos de aminoácidos da esquerda

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para a direita. IMo oaso da GnRH, a porção hidróxilo do grupo carboxilo da glicina no terminal C_;! foi substituída por um grupo amino (NHg). As abreviaturas para os resíduos de aminoácidos individuais aminoécido comuns são convencionais e baseadas no nome vulgar do e.g. F'glu é o ácido piroglutãmico, Glu é o ácido glutãmico, His é a histidina, Trp é o triptofano.. Ser é a serina, Tyr é a tirosina, Gly é a glicina, Leu é a.leucina, Mie é a norleucina, Orn é a ornitina, Arg é a arginina, Pro é a prolina, Sar é a sarcosina, Phe é a fenilalamina, Ala é a alanina, Val é a valina, Nva é a norvalina, Ile é a isoleucina, Thr é a treonina, Lys é a Usina, Asp é o ácido aspártico, Asn é a asparagina, Glu é a glutamina,, Cys é a cisteína, e Met é a mstionina» Excepto a glicina, os aminoácidos que aparecem nos péptidos do invento estão na configuração L, a não ser que outra coisa seja indicada„

Há razBes para impedir a ovulação nos mamíferos fémea, e tem sido usada a administração de análogos da GnRH que são antagonistas da função normal de GnRH para suprimir ou atrasar a ovulação. Por esta razão, estão a ser investigadas os análogos de GnRH que são antagonistas da GnRH quanto ao seu uso potencial como um contraceptivo ou para regulação dos períodos de concepção. Os antagonistas da GnRH podem também ser usadas no tratatamenta da puberdade precoce e endometriose. Verificou-se também que estes antagonistas são úteis para regular a secreção de gonadotropinas nos mamíferos macho e podem ser usados para parar a espermatogénese, . e.g, como contraceptívos masculinos., e para tratamento da hipertrofia prostática. Mais especificamente, os antagonistas da

GnRH podem ser usados para tratar tumores dependentes de esteróides, tais como os tumores mamários, cerebrais e prostátié desejável criar péptidos melhoradas que sejam antagonistas fortes da GnRH endógena, que impeçam a secreção dá LH e a libertação de esteróides pelas gónadas dos mamíferos, e proporcionar, também, compostos que sejam biologicamente eficazes in vivo quando administrados oralmente,,

-ji-} rf / rf‘... rfl.

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SUMÁRIO DQ INVENTO

O presente invento proporciona péptidos que inibem a produção de gonadotropinas nos mamíferos, incluindo os humanos,, e também proporciona processos para a inibição da libertação de esteróides pelas gónadas dos mamíferos macho e fêmea. Os análogas da GnRH melhorados são fortes antagonistas da GnRH e possuem um efeito inibidor nos processos de reprodução dos mamíferos5 assim,, eles são referidos cômo antagonistas da GnRH. Estes análogos podem ser usados para inibir a produção de gonadotropinas e hormonas sexuais em várias circunstâncias, incluindo puberdade precoce, neoplasia dependente de hormona, dismenorreia, endometriose e tumores dependentes de esteróides.

Geralmente, de acordo com o presente invento, são sintetisados péptidos gue inibem fortemente a secreção de gonadotropinas pela glândula pituitária de mamíferos, incluindo humanos, e/ou inibem a produção de esteróide pelas gónadas. Estes péptidos são cíclicos e são preferencialmente análogos bicíclicos ou tricíclicos da GnRH nos quais há pelo menos duas ligaçSes covalentes, i.e., entre os pares de resíduos seguintes? o resíduo na posição 4 e o resíduo na posição 10, o resíduo na posição 5 e o resíduo na posição S, e o resíduo na posição 1 e o resíduo na posição 3. Certos péptidos bicíclicos que não têm uma ligação covalente . entre os resíduos nas posiçSes 1 e 3 deverão ter uma substituição na posição 1, de preferência dèsidroPro ou (3-(1- ou 2-naftil)-U~alanina (a partir daqui (3-D-1NAL ou (3-D-2NAL) e uma substituição na posição 3, de preferência na forma de D~Trp, D-3PAL, (3-D-2NAL ou (3-D-1MAL substituidos ou não substituídos .Todos os péptidos possuem preferencialmente uma substituição na posição 2 na forma de um resíduo de D-Phe modificado. A substituição na posição 4 pode ser Cys, um diaminoácido com não mais do que cinco átomos de carbono, um aminoácido dicarboxílico, tal como Asp ou Glu, ou Abu. A posição 5 é preferencialmente ocupada por Glu e a posição 8 por Lys quando estes 2 resíduos estão ligados covalentementej no entanto, opcionalmente, podem ser usados nestas posiçSes os resíduos seguintes? ácido homoglutãmico (Hg 1)§ ácido homo-homoglufãmico (Hhg),i.e„, ácido 1,7-dicarhaxi-2--amino - heptanôico,

7'7¹ ‘~^l *í ”ΐ

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homolisina (Hly) e homo-homolisina (Hhl) ou ácido 1 -carboxi-2,8-diamino-octanóico. 0 péptido tem também uma substituição na posição 6, pode ter uma substituição opcional na posição 7, tal como Nle, NML, Phe,, Nva, Met,, Tyr,, Trp,, ou PAL, e pode ter uma modificação opcional de Pro na posição 9„ A substituição na posição 10 é complementar do resíduo da posição 4 » Para compostos tricíclicas e alguns compostos bicíclicos, são complementares os resíduos nas posições 1 e 3, como foi indicado na generalidade com aqueles nas posições 4 e 10j no entanto, pode ser preferido usar uma ligação dicarba, entre estes dois resíduos, de comprimento maior do que aquele proporcionado por um par de resíduos Abu»

A D-Phe modificada na posição 2 proporciona um aumenta da actividade antagonista, como resultado das modificações específicas presentes no anel benzénico» Substituições simples para o hidrogénio no anel são de preferência feitas na posição 4 ou para-, mas podem ser também na posição 2 ou 3;; as substituições são com grupos seleccionados de entre cloro, fluoro, bromo, metilo, metoxi e nitro, sendo preferidos o cloro, fluoro e nitro» As susbtituições com dicloro são nas posições 2,4 ou 3,4 do anel» 0 carbono alfa também pode ser meti lado, e„g« (C^aMe/4Cl5Phe„ 0 substituinte da posição 1 é de preferência modificado para que o seu grupo amino alfa contenha um grupo acilo, tal como o formilo (For), acetilo(Ac), acrililo(Acr), vinilacetilo(Vac) ou benzoilo (Bz), com preferência para o acetilo e acrililo» PAL e D-PAL representam os isómeros L- e D- da piridilalanina onde o carbono β de Ala está ligado ã posição 2, 3 ou 4, de preferência à posi-

„ <1# „ -·»·	no	anel da piridina» Quando	Í3-D-NAL	está presente	na
posição	.1,	está pre f e renc i a1mente	presente	na posição ó	um
resíduo	de	D-aminoácido hidrofí1ico,	tal como	o 4NH2-D-Phe,,	Z!.-·

-guanidino-D-Phe, D-His, D-Arg, D-Har(Homoarginina) ou D-PAL»

Quando	o desidroPro	está pres	>en te	na posição 3.,	um isómero-D	de
um aminoãcido lipofíl	ico, tal	como	V. Maw VH 4~», í o D-lrp, D—Phe	, For-D-Trp,	no2
-D-Trp,	D-Leu, D-Ile,	D-Nle, E	í-Tyr,	D-Vai, D-Ala,	D-Ssr(OtBu),	β-

mas

-D-NAL ou (imBzl)D-His está preferencialmente na posição 6, pode ser usado o D-PAL»·

7? 715 493.11

-/-

Estes antagonistas da SnRH são activos quando administrados oralmente comparativamente aos antagonistas da GnRH já disponíveis. Os péptidos inibem a ovulação dos mamíferos fêmea quando administrados a baixos níveis no proestro e são também eficazes para causar a reabsorção dos ovos fertilizados, se administrados pouco após a concepção. Estes péptidos são, também., eficazes para o tratamento contraceptivo de mamíferos macho s para o tratamento de tumores dependentes de esteróides e outros.

DESCR]

DETALHADA DAS CONCRETlZAgóES PREFERIDAS

Mais especificamente, certos péptidos bicíclicos preferidos no presente invento são representados pela fórmula I seguintes

X-R j_- (A) D-Phe-Ry-Rzj-G 1 u-R₆-R₇-Lys- (E) Pro-R _;l0-MH₂ onde X é hidrogénio ou um grupo acilo com 7 ou menos átomos de carbono? R^ é desidroPro, D-pGlu, (A)D-Phe, (B)D-Trp, Pro, ou p-D-NAL-? A é H, Cl, F, N0₂, CH₃, 0CH₃, C^aMe/4Cl, Cl2 ou Br? B é H, N02, NH2, 0CH3, F, Cl, Br, CH3, WⁱⁿFor ou NⁱⁿAc? R3 é D-PAL, Í3-D-NAL ou (B5D—Trp§ R4 é Cys, Asp, Glu, Orn, Dbu, Dpr ou Abu? R/_;i é B-D-NAL, (B)D-Trp, (A')D~Phe, (D)D-Har, D-Tyr, (C)D-His, D-PAL, (D)D-Arg, D-Leu, D-Ile, D-Val, D-Nle, D-Ala, D-Pro, D-Ser(OtBu) ou D~Nva? A' é A, NH₂, NHCH₃, ou gua? C é H, imBsl ou dinitrofenol? D é H ou di-alquilo inferior? Ry é Mie, Leu, MML, Phe, Met,

Nva, Tyr, Trp ou PAL? Ε έ H, OH ou desidro e R^q é Cys, Asp, Slu,

Orn, Dbu, Dpr ou Abu? desde que, no entanto, quando R4 for Cys ou

Abu, R|q seja Cys ou Abu? quando R4 é Asp ou Slu, Ρχη é Orn, Dbu ou Dpr? e quando R4 é Orn, Dbu ou Dpr, R^q

Rj. é (3-D-NAL, então Ra é preferencialmente D-His, 4-gua-D-Phe, D-PAL ou D~Arg« Como riormente, Hgl ou Hhg podem substituir Slu na posição 5 e Hly ou Hhl podem substituir Lys na posição 8.

é Asp ou Slu. 4~NH₂-D-Phe, indicado aqui

Quando D—Har, an tePor desidroPro entende-se 3,4-desidro-prolina, CgHyO₂M» Como β-D-NAL entende-se o isómero D da alanina que é substituído com naftilo no átomo de carbono B, i.e.., também 3-D-NAL» 0 (3-D-2NAL é usado preferencialmente e a ligação ao naftaleno é na posição 2 na estrutura do anel? no entanto, o (3-D-1NAL também pode ser usado.’ PAL representa alanina substituída com piridilo no átomo de ,} / ·£μ Λ,

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carbono β? a ligação é de pref erência à posição 3 do anel piridina» Quando é usado o D-Trp substituído, podem ser feitas substituições simples do hidrogénio em ambas as posições 5 e 6, que são seleccionadas de entre cloro,, fluoro, bromo, metilo, amino, metóxi e nitro, com preferência para o cloro, fluoro e nitro» Alternativamente, o azoto do indolo pode ser acilado, e.g» com -formilo (N^xnFor- ou lFor~) ou com acetilo » 0 IM^xnFor-D-Trp s o 6ND₂-D~Trp são os resíduos substituídos preferidos» Quando o D-ftrg ou o D-Har estão presentes na posição ó, ou o Arg está presente na posição 8, a cadeia lateral guanidino pode estar di-substituída com alquilo inferior (C^ a C4), de preferência dietilo» Por NML entende-se W^aCH^—L—Leu» Por Abu entende-se o ãcido 2-aminobutírico e por Dbu o ãcido 2,4-diaminobutírico» Por Dpr entende-se ãcido 2,3-diaminopropiónico» Quando o desidroPro estã presente na posição 1, na posição 6 estã preferencialmente um resíduo lipofílico» Por 4-gua-D-F'he entende-se um resíduo de D~Phe com um grupo guanidino substituído na posição para»

Podem ser produzidos outros péptidos monocíclicos e bicíclicos biologicamente activos, que têm uma ligação covalente entre os resíduos, nas posições 1 e 3, e podem, opcionalmente, ter essa ligação entre os resíduas nas posições 4 e 10 ou entre as posições 5 e 8» Tais péptidos podem ter a guinte, com o conhecimento de que haverá uma ligação de ciclização entre os resíduos R^ e R3 e entre Rg e Rg, ou entre R4 e R^os fórmula secava lente o pc i on a1men te, uma c-[ . |---------1

Χ-Ρχ- (A) D-Phe-RvRq-Rg-R^-Rv-Lys- (E) Pro-Rjj-j-NH'?

L _ _ ?__________J onde X é hidrogénio ou um grupo acilo com 7 ou menos átomos de carbono? R_x é D-Cys, D-Abu, asp, glu, hgl, hhg, lys, hly, hhl, orn, dbu ou dpr? A é H, Cl, F, IM0₂, CH₃, 0CK₃, C^aMe/4Cl, Cl₂ ou Br? R3 é D-Cys, abu, asp, glu, hgl, hhg, lys, hly, hhl, orn, dbu ou dpr? Rq é Ser, Cys,Asp, Glu, Orn, Dbu, Dpr ou Abu? Rg é Tyr ou Glu? R₆ é β-D-NAL, (B)D-Trp, (A')D-Phe, (D)D-Har, D~Tyr, (C)D-His D-PAL, (D)D-Arg, D-Leu, D-Ile, D-Val, D-Nle, D-Ala, D-Pro, D-Ser(OtBu), ou D-Nva? A' é A, NH₂, NHCH3 ou gua? B é H, N0₂, NH₂ OCH3, F, Cl, Br, CH-!·, MⁱⁿFor ou N^xnAc? C ê H, imBzl ou dinitrofe

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-9nol? D é H ou dialquilo inferior? R7 é Nle, Leu, Nt*IL, Phe, Met-, Nva, Tyr, Trp ou PAL? E é H, OH ou desidro? Rg ê (D)Arg, (D)Har ou Lys e R|q é Gly, D-Ala, Cys, Asp, Glu, Orn, Dbu, Dpr ou Abu? rto entanto desde que quando R/j for Cys óu Abu, Rj_q seja Cys ou Abu? quando R4 for Asp ou Glu, R^q seja Orn, Dbu ou Dpr? quando R4 é OrnDbu ou Dpr,, Rj_q ê Asp ou Glu? quando R5 é Glu, Rg é Lys? e desde que além disso quando R_x for D-Cys ou D-Abu, R₃ seja D-Cys ou D-Abu? quando R^ for asp, glu, hgl ou hhg, R₃ seja lys, hly, hhl, orn, dbu ou dpr? e quando R| for lys, hly, hhl, orn, dbu ou dpr, R₃ seja asp, glu, hgl ou hhg. Pelas designações em letra minúscula e„g„ asp, entende-se que o resíduo pode ser o isómero L ou o D, i.e» L-Asp ou D-Asp? no entanto, os isómeros D são preferidos nas duas posições i e 3»

Em certos péptidos tricíclicos preferidos, a fórmula é geralmente como se referiu anteriormente, com a excepção de que R-_t é D-Cys, D-Abu, D-Asp, D-Glu, D-Hgl, D-Hhg, D-Lys, D-Hly, D-Hhl, D-Qrn, D-Dbu ou D-Dpr e R₃ é um resíduo complementar seleccionado de entre o mesmo grupo? no entanto, nos péptidos tricíclicos pelo menos 2 das 3 ligações de ciclização deverão ser, de preferêneia, 3.igações amida e/ou dicarba» A fórmula seguinte é representativa de certos péptidos tricíclicos particularmente preferidas3 1 I 1-i

Lys-ί E)Pra-R_lc

X—R^— (A 3 D—Phe—R₃—R4—63. u—Rg—R·

NH₂ onde X é hidrogénio ou um grupo acilo com 7 ou menos átomos de carbono? Ρχ é D-Cys, D-Abu, D-Asp, D-©lu, D-Hgl, D-Hhg, D-Lys, D-Hly, D-Hhl, D-Qrn, D-Dbu ou D-Dpr? A é H, Cl, F, N0₂, CH₃, 0CH₃ C^aMe/4Cl, Cl₂ ou Br? R₃ é D-Cys, D-Abu, D-Asp, D-Glu, D-Hgl, D-Hhg, D-Lys, D-Hly, D-Hhl, D-Orn, D-Dbu ou D-Dpr? Rq. é Cys, Asp, Glu, Orn, Dbu, Dpr ou Abu? R& é β-D-NAL, (B)D-Trp, (A')D-Phe, (D)D-Har, D~Tyr, (C3D-H.1.S, D-PAL, (D)D-Arg, D-Leu, D-Ile, D-Val D-Nle, D-Ala, D-Pro, D-Ser(OtBu), ou D-Nva? A' é A, NH₂, NHCH3 ou gua? B é H,N0₂, NH₂, OCH3, F, Cl, Br, CH₃, N^ir'For ou NⁱⁿAc? C é H, imBzl ou dinitrofenol? D é H ou di-alquilo inferior? R-- é Nle, Leu, NHL, Phe, Met, Nva, Tyr, Trp ou PAL? Ε έ H, OH ou desidro e Rj.0 é Cys, Asp, Glu, Orn, Dbu, Dpr ou Abu? no entanto, desde que quando R4 for Cys ou Abu, R^q seja Cys ou Abu? quando R/j for Asp

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ca ou Glu» R;|.q seja Qrn, Dbu ou-Dpr; e quando Rq. for Orn, Dbu, ou Dpr» Rxq seja Asp ou Glu, e, desde que, também quando R^ for D--Cys ou D-Abu, R3 seja D-Cys ou D-Abu; quando R^ for D-Asp, D-GIu D-Hgl ou D-Hhg, R₃ seja D-Lys, D-Hly, D~Hhl, D-Orn, D-Dbu ou D· -Dpr; e quando R^ for D-Lys, D-Hly, D-Hhl, D-Orn, D-Dbu ou, D-Dpr, R₃ seja D-Asp,, D-Glu, D-Hgl ou D-Hhg»

Pode ser desejável ter uma ligação de ciclização entre os dois resíduos nas posiçSes í e 3, mais longa, do que a ligação dioarba entre 05 dois resíduos D-Abu e nesse oaso podem ser sintetizados péptidos com a fórmulas |-(Ch'₂) n j

X— IMHCHCO— (A) D—Phe—NHCHCO—Rzj.—Fi!=,—R^j—Ry—Rq— (E) Pro—P^Q—NH₂ onde X é hidrogénio ou um grupo acilo oom 7 ou menos átomos de carbono:! A é H, Cl, F, IM0₂, CH₃, OCI-Í3, C^aMe/4Cl, Cl₂ ou Br; n = 4 a lí; R4 é Ser, Cys, Asp, Glu, Orn, Dbu, Dpr ou Abu; Rg é Tyr, Glu, Hgl ou Hhg; R_à é Í3-D-NAL, (B)D-Trp, (A')D-Phe, (D)D-Har, D-Tyr, (C)D-His, D-PAL, (D)D-Arg, D-Leu, D-lle, D-Val, D-IMle, D-Ala, D-Pro, D-Ser(OtBu), ou D-IMva; A' é A, MH₂, NHCH3 ou gua; B é H, N0₂, MH₂, 0CH₃, F, Cl, Br, CH₃, IMⁱⁿFor ou NⁱⁿAc; C é H, imBzl ou dinitrofenol; D é H ou dialquilo inferior, Ry é Nle, Leu, NlíL, Phe, Met, Wva, Tyr, Trp ou PAL; E é H, OH ou desidro; Rg é (D)Arg, (D)Har, Lys, Hly ou Hhl e R^q é Gly, D-Ala, Cys, Asp, Glu, Orn, Dbu, Dpr ou. Abu; desde que no entanto, quando R4 for Cys ou Abu, ele esteja ligado a Rj_q que será Cys ou Abu; quando R4 é Asp ou Glu, ele está ligado a R3.0 que á Orn, Dbu ou Dpr; quando R4 é Orn, Dbu ou Dpr, ele está ligado a R^q que é Asp ou Glu; e quando Rg é Glu, Hgl ou Hhg, ele está ligado a Rg que é Lys, Hly ou Hhl» Quando os resíduos nas posiçSes 1 e 3 são ambos Abu, n - 4; no entanto, de preferência n = 7 a 9« Tal péptido pode ser monocíclico, dicíclico ou tricíclico»

Gs péptidos do presente invento podem ser sintetizados pela sintese em solução clássica ou por uma técnica de fase sólida usando uma resina clorometilada, uma resina hidroximetilada, uma resina de metilbenzidrilamina (MBHA), uma resina de benzidrilamina (BHA) ou qualquer outra resina adequada conhecida na arte,, A jl **ί*

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sintese em fase sólida é conduzida de maneira a haver uma adição por passos dos aminoãcidos è cadeia, de uma forma descrita, em detalhe,, na Patente dos E.U.A. N24.211.693. Os grupos protectores das cadeias laterais como são bem conhecidos na arte, são preferencialmente adicionados aos resíduos a serem usados na síntese, tendo cadeias laterais particularmente lábeis, e podem, opcionalmente, ser adicionados a outros, tais como Trp, antes destes aminoãcidos serem acoplados à cadeia a ser construída na resina,, Esta síntese produz o peptido-resina intermédio totalmente protegido.

Os intermédios químicos geralmente feitos de acordo com o invento para produzirem os péptidos bicíclicos preferidos, podem ser re p resent ad os pe1a Fórmu1a 11s _xl-_Rt.__(ft)_D_.phe-R3(X²)-R4(X³)“R5(X^è5-R6^^{x4 ou} X⁵)“R7<X² ou X⁴ ou X⁷) -Rg (X⁸)-(E) Pro-R₁₀ (X³) -X⁹,, onde s

X-®· é um grupo protector do amino alfa do tipo conhecido como útil na arte da síntese por passos de polipéptidos e quando X é um grupo acilo particular na composição péptidica desejada, ele pode ser usado como grupo protector. Juntamente com as classes de grupos protectores do amino alfa abrangidos por estãos (1) os grupos protectores do tipo acilo, tais como o formilo (For), trifluoroacetilo, ftalilo, p-toluenossulfonilo(Tos), benzoílo(Bz), ben zen ossu 1 f on i lo, o-n i t rof en i 1 su 1 f en i 3. α (Nps) , t r i t i 1 su 1 f en ilo, o-nitrofenoxiacetilo, acrililoCAcr), cloroacetilo, acetilo(Ac) e Y-clorobutiriloii (2) os grupos protectores do tipo uretano aromáticos, e„g., benziloxicartaonilo(Z) ,, f luorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc) e benziloxicarbonilo substituído, tal como p-clorobenziloxi-carbonilo(Clz), p-nitrobenziloxicarbonilo, p-bromotaenziloxicarbonílo e p-metoxibenziloxicarbonilo? (3) os grupos protectores uretano alifáticos, tais como o terc-butiloxicarbonilo (Boc), di-isopropilmetoxicarbonilo, isopropiloxicarbonilo, etoxicarbonilo e aliloxicarbonilo? (4) os grupos protectores do tipo cicloalquilo-uretano, tais como o ciclopentiloxicarbonilo, adamantiloxicarbonilo e ciclo-hexiloxicarbonilo? (5) os grupos

213 ί ο—

protectores do tipo tio-uretano, tais como o feniltiocarboniloíi (6) os grupos protectores do tipo alquilo, tais como o alilo(Aly)_? trifeniImetilo(tritilo) e benzilo(Bzl)(7) os grupos trialquilsilano, tais como o trimetilsilano» 0 grupo protector do amino alfa preferido é o Boc, particularmente quando X é hidrogénio»

X-^ é hidrogénio ou um grupo protector adequada para o azoto do indolo do Trp, tal como o Bz«

X·-· é um grupo protector para o grupo sulfidrilo do Cys, de preferência p-metoxibensiIo(MeObzl), p-metilbenzi lo, acetamidometilo, tritilo ou Bzl§ ou um grupo protector adequado para uma cadeia lateral amino e»g» 2C1--Z ou t-amiloxicarbonilo? ou um grupo protector, de preferência lábil à hidrazina, adequado para uma cadeia lateral carboxilo, tal como o OBzl(estér de benzilo)!! ou é uma ligação directa onde a forma cíclica resulta de uma ligação carba ou dicarba»

X^z!· é hidrogénio ou um grupo protector para o grupo hidroxilo fenólico de Tyr seleccionado de entre o grupo que consiste de tetra-hidropiranilo, terc-butilo» tritilo, benzilo, Z, 2-bromobenziloxicarboniIo(2Brz) e 2,ó-diclorotaenzilo(DCB)» 0 2Brz é preferido»

X5 é um grupo protector para um grupo guanidino da cadeia lateral, tal como aquele na Arg, ou para o grupo imidazole da His, tal como o nitro, Tos, Tritilo, adamantiloxicarbonilo, Z e

2,4-dinitrofenilo(DNP) ou X⁵ pode ser hidrogénio, o que quer dizer que não há protecção dos átomos dos grupos da cadeia lateral ,, D Tos ê normalmente o preferido»

X^è é hidrogénio ou um grupo protector lábil às bases para um grupo carboxilo da cadeia lateral, de preferência éster de fluoreniImetilo(OFm), ou é uma ligação covalente.

X⁷ é hidrogénio ou um grupo protector para Met, tal como o oxigénio»

Χθ é um grupo protector lábil ás da cadeia lateral, de preferência Fmoc bases para um grupo amino ou é uma. ligação cova len72 21 49311

te»

X⁷ Dade ser Q-CH^-Csuporte ds resina], -MH-[suporte de resinaj, OH, éster ou NH2» critério para a selecção dos grupos protectores da cadeia lateral para χ2~χ8 é o de o grupo protector ser estável ao reagente sob as condiçSes de reacção seleccionadas para a remoção do grupo protector do amino alfa (de preferência Boc) em cada passo da síntese» 0 grupo protector não deverá ser separado sob as condiçSes de acoplamento, mas deverá ser removido após completada a síntese da sequência de aminoácidos desejada sob condiçSes de reacção que não irão alterar a cadeia do péptido» Os grupos protectores tf e Χθ devem ser removíveis, em algumas sínteses, sem a remoção do grupo protector X''„

Quando o grupo X⁷ é -0-CH2~[suporte de resina], é representada a porção éster de um dos muitos grupos funcionais de um suporte de· resina de poliestireno,. Quando o grupo tf é -IMH-Csuporte de resina], uma ligação amida liga Rj f$ a uma resina BHA ou a uma resina MBHA»

Quando X é acetilo, por exemplo, na fórmula final, pode ser possível usá-lo como o grupo protector X^· para o grupo amino alfa do D-MAL ou de qualquer aminoácido usado na posição 1, adicionando-o antes do acoplamento do último aminoácido â cadeia do péptido» Mo entanto, a reacção realiza-se preferencialmente com o péptido na resina (após o desbloqueamento do grupo amino alfa enquanto os grupas da cadeia lateral continuam protegidos), e»g„ por reacção com ácido acético na presença de diciclo-hexilocarbodiimida (DCC) ou preferencialmente com anidrido acético ou por outra reacção adequada conhecida na arte»

Ma produção dos péptidos bicíclicos preferidos, uma ciclização é de preferência efectuada no resíduo 6 do péptido intermédia enquanto é uma parte da péptido-resina» Depois desta ciclização ser efectuada, a síntese do decapéptido está completa» Se estiver a ser sintetizado um péptido tricíclico ou se estiver a ser estabelecida uma ligação amida entre 03 resíduos das posiçSes 1 e 3, a ciclização pode ser realizada na resina entre

213 49311

Qs resíduos das posições 1 e 3» 0 péptido protegido- é , então, clivado adequadamente da resina., e„g„, duma resina hidroximetilada ou de um suporte de resina clorometilada, por amonólise, como é hem conhecido na arte,, para se obter a amida intermediária totalmente protegida,, ou alternativamente, duma resina da benzidrilamina com ácido fluorídrico (HE) provocando a desprotecção bem como a clivagem do péptido»

Os passas finais da ciclização para o análoga peptídico da GnRH dependem do tipo de ligação que se pretende entre os resíduos nas posições 4 e 10? devem, também,, ter em consideração a ligação amida entre os resíduos nas posições 5 e S bem como qualquer ligação que opcionalmente possa ter sido formada entre os resíduos das posições 1 e 3. É normalmente preferível realizar o último passo da ciclização de maneira a formar a ligação entre as posições 4 e 10 dos resíduos seguido da clivagem da resina, Esta forma dissulfureto da ligação é obtida por oxidação,, usando uma solução de ferricianeto, de preferência como a descrita em Rivier et al» , Biopolymers„ Vol» 17 (1978), 1927-38, ou por oxidação com ar, ou de acordo com outros processos conhecidos»

Quando a ciclização é através ds uma ligação amida entre um grupo amino da cadeia lateral do resíduo da posição 4 e um grupo carboxilo da cadeia lateral do resíduo da posição 10 (que’ pode ser preferido), ou vice-versa, é preferível sintetizar o páptido protegido numa resinai MBHA ou BHA e derivar o éster de benzilo da cadeia lateral do ácido carboxílico em hidrazida enquanto o péptido ainda estiver ligado à resina» Isto pode ser conseguida pela utilização de OBzl como grupo protector para o carboxilo da cadeia lateral 'do resíduo a ser envolvido na ponte de ligação amida» A seguir a esta activação selectiva de hidrazina, faz-se a desprotecção do resto dos grupos protectores da cadeia lateral e a clivagem da resina» Depois realiza-se a reacção para conseguir a ciclização, por tratamento com nitrito de isoamilo e um ácido forte, tal com o HC1, obtendo-se a azida que por sua vez reage com o grupo amino livre da cadeia lateral do resíduo da posição 10, após um passo de neutralização, gerando—se a ligação amida»

4931,1

Os análogos da GnRH incluindo o equivalente dos resíduos de cisteína modificados nas posiçSes 4 e 10, nos quais a ligação dissulíurefo foi substituída pela ligação CH₂? referidos como dicarba. Se apenas um dos grupas sulfidrilo foi substituída por um grupo CH₂, ele ê referido como carba, e„g„, [carba^, Cys-^j-GnRH. Em geral, as ciclizaçííes de péptidos desta forma global são exemplificadas nas seguintes Patentes dos E.U.A. 4,,115.554,, (19 de Setembro de 1978)? 4,,133.805 (9 de Janeiro de 1979)« 4.140.767 (20 de Fevereiro de 1979) ? 4,,161,,521 ( 17 de Julho de 1979)5 4.191.754 (4 de Março de 1980)§ 4,,238.481 (9 de Dezembro de 1980)? 4.244.947 (13 de Janeiro de 1981)? e 4.261.885 (14 de Abril de 1981).

Do 'ponto de vista do péptido final, constata-se que a posição que seria ocupada por um resíduo Cys têm em vez disso um resíduo de alfa amino-ácido butírico (Abu). Quando se preparam péptidos com uma ligação dicarba ou carba-S ou uma ligação dicarba de cadeia mais longa, pode ser usado α processo referido nas duas Patentes dos E.U.A. N° 4.161.521 ou N2 4.703.106 (a divulgação destas patentes é aqui incorporada para referência)5 em ambos os casos, no intermediário de Fórmula 11, X³ é uma ligação directa ao outro resíduo»

Assim, por exemplo, o invento proporciona também, um processo para produzir certos péptidos foicíclicos preferidos ou um seu sal não tóxico tendo, estes péptidos a Fórmula Is

I I

X-R_i- (A) D~Phe~R₃~R₄~G 1 u-R₆-R₇-Lys- (E) Pro-Ri₀-NH₂ onde X é hidrogénio ou um grupo acilo com 7 ou menos átomos de carbono? Rj é desidroPro, D-pGlu, (A)D-Phe, (B)D-Trp, Pro, ou 8-D-NAL5 A é H, Cl, F, N0₂, CH3, OCH3, C^sMe/4Cl, Cl2 ou Br? B é H, M02, WH2, 0CH3, F, Cl, Br, CH3, NⁱⁿFor ou MⁱⁿAc? R3 é D-PAL, β-D-NAL ou (B)D-Trp? R4 é Cys, Asp, Glu, Qrn, Dbu, Dpr ou Abu? R& é β-D-NAL, (B)D-Trp, <A')D~Phe, (D)D-Har, D-Tyr, (C)D-His, D-PAL, (D)D-Arg, D-Leu, D-Ile, D-Val, D-Nle, D-Ala, D-Pro, D-Ser(OtBu), ou D~Nva ? A' dinitrofenilos

A, NH·-?, NHCH3 ou gua 5 imBzl ou

D é H ou dialquilo inferior? R7 é Mie, Leu, NML,

Phe, Met, Nva, Tyr, Trp ou PAL? Ε é Η, 0H ou desidro e Rio é Cys, —16“

z ai! i o

49311

Asp, Glu, Orn,, Dbu, Dpr, ou Abu;

desde que, no entanto quando Rq.

for Cys ou Abu, R^q seja Cys ou Abu; quando Rq. for Asp ou Glu, Rjlq seja Orn, Dbu ou Dpr; e quando Rzj. for Orn, Dbu ou Dpr, R^q seja Asp ou Glu; este processo compreende (a) formação de um composto intermediário com a Fórmula 11s _xi-_Rl_(_Ajn-Phe-R₃(X²)-R4(X³ 5-G1u(X^ó)-R6(X⁴ ou X ⁷)-Lys(X ⁸)-(Ε)Pro-Rχ q(X³) - X ⁹

X’³ )-Ry ( ou

X⁴

OU onde X·!· é hidrogénio ou um grupo protector de amino alfa; X² é hidrogénio ou um grupo protector para um azoto do indolo; X-^:‘ é uma ligação directa, hidrogénio ou um grupo protector de Cys ou de um grupo carboxilo ou amino da cadeia lateral, X⁴ é hidrogénio ou um grupo protector de um grupo hidroxilo fenólico de Tyr; X'-’ é hidrogénio ou um grupo protector de uma cadeia lateral imidazolo ou guanidino; X& é um grupo protector, lábil às bases para um carboxilo da cadeia lateral ou uma ligação directa; X^z é um grupo protector de Met; X^s é um grupo protector, lábil às bases para um amino da cadeia lateral ou uma ligação directa; e X⁹ é seleccionado de entre o grupo formado por 0-CH2~(suporte de resina), ~NH-(suporte de resina), ésteres e amidas; (b) separação de um ou mais grupos Xl a χ8 e/ou clivagem de qualquer suporte de resina incluído em X⁹; (c) criação opcional de uma ligação de ciclização entre Rq. e R^q, caso não esteja já presente e, . se desejado, (d) conversão do péptido resultante num seu sal não tóxico. De preferencia, o intermediário para certos péptídos bicíclicos preferidos t.ê'm a Fórmula (III) s _xi„_Rl„_(A)D-Phe-R₃<X²)-R4(X³5-Glu-R6(X⁴ ou X⁵)-R7(X² ou X⁴ ou X ^z)-Lys-(E)Pro-R (X³ 5 -X⁹ onde X& e Χθ na Fórmula (II) constituem uma ligação amida directa. Preferivelmente o intermediário para certos péptídos tricíclicos preferidos tê'm

X¹ -R j - (A) D-Phe-R₃~R₄ ( X’-') -G1 X^z)”Lys-(E)Pro-Rio(X³)-X⁹ a Fórmula (I11A); U-R&(X⁴ ou X³)-Ry(X² ou X⁴ ou

A purificação do péptido pode ser feita através de cromatografia de permuta iónica numa coluna CMC, seguida de cromato

21 49311

-17tr _

grafia de partição usando o sistema de eluiçãos π-butanol; ácido acético O,1N (razão em volume lai) numa coluna cheia com Sephadex G-25s no entanto, ela realiza-se preferencialmsnte usando HPLC, como é conhecido na arte e especificamente referido em J. Rivier, et al. J.Chromatography, 289 (1984) 303-328.

Os péptidos do invento são eficazes a níveis inferiores a 100 microgramas por quilograma de peso corporal quando administrados próximo do meio-dia do dia do proestro, para impedir a ovulação em ratazanas fêmea. Para uma supressão prolongada da ovulação, pode ser necessário usar niveis de dosagem na gama de 0,1 a 2,5 miligramas por quilograma de peso corporal. Estes antagonistas são também eficazes para parar a espermatogéness, quando administrados a mamíferos macho numa base regular, podendo, deste modo, ser usadas como contraceptívos. Uma vez que estes compostos irão reduzir os níveis de testosterona (uma consequência indesejada nos machos normais, activos sexualmente5, será razoável admi nistrar doses de testosterona para compensação, juntamente com o antagonista da GnRH» Estes antagonistas podem também ser usados para regular a produção de gonadotropinas e esteróides sexuais para outros fins, como aqui indicado anteriormente»

Os péptidos bicíclicos, como os indicados na TABELA I, com a fórmula s

Ac-R_x (401) D-Phe~R₃-R₄-G lu-R₆-Leu~Lys~Pro-R₁₀-NH₂ são preparados pelo processo de fase sólida anteriormente referido.

(SEGUE TABELA)

21 49311

-IS·

TABELA I

Ri	R-í·	R4	Ró	R10
1	Í3-D-2NAL	D-Trp	Asp	D-Arg	Dpr
	Η	IS	Dpr	II	Asp
“Jl*	u	D-3PAL.	Asp	I3-D-2NAL	Dpr
4	dèsidroPro	D-Trp	Cys	!<	Cys
5	(3-D-2NAL	II	u	IC	i>
6	H	D-3Pal	Dpr	D-3PAL	Asp
7	li	Si	Orn	i!	Asp
8	dèsidroPro	{3-D2NAL	Asp	(3-D-2NAL	Dpr
9	n	D-3PA1	H	D-Tyr	Dpr
10	B-D-2NAL	D-Trp	Glu	D-2PAL	Dpr
11	II	ts	Dbu	(4gua)D-Phe	Asp
12	ti	H	u	!!	li
13	dèsidroPro	fi	II	D-Ala	Glu
14	D-Trp	D-4PAL	li	D-Phe
13	D-pBIu	D-Trp	Drp	D-Ile	!t
16	D-Phe	D-2PAL	Ii	D-Val	Asp
	Como exempl	0 vsi	ser descrita, a seguir, uma síntese
representativa em	fase sólida do	Péptido NQ 1 anterior	, que é re—
ferido como (Ciclo 4-10,	5-8) [Ac	-(3-D-2MAL1, (4CI ) D-Ph	B2, D-Trp0,
Asp	Glu^, D-Arg	6, Lys8,	Dpr1·0]-	GnRH,, Este péptido tem a fórmu-
la	seguinte s
Ac-	Í3-D-2NAL- (4C1) D-Phe-D·-·	•Trp-Aíkp-	G1 u-D-Arg-Leu-Lys-Pro·	-Dpr-NHg

Os outros péptidos são sintetizados e purificadas de forma idêntica»

São usadas cinco gramas de uma resina BHA e o Dpr com Boc é acoplado à resina durante um período de 2 CH2CI2 usando um excesso do 3 vezes do derivado de Boc como um reagente activador» 0 resíduo de Dpr liga-se ao de BHA através de uma ligação amida» protegido horas em e de DCC resíduo

A seguir ao acoplamento de cada resíduo de aminoácido realiza-se a lavagem, o desbloqueamento e o acoplamento do próximo resíduo de aminoácido, de acordo com o esquema seguinte,

-19''F ' 7/ ^ **7 r? 3

49311 usando urn aparelho automático? quando se parte de cerca de 5 gramas de resinas

PASSO

REAGENTES E OPERAÇÕES

TEMPOS DE MISTURA, MINUTOS

9

Lavagem com CH₂CL„₂~80 ml (2 vezes)

Lavagem com metanol(MeOH)-30 ml (2vezes) Lavagem com CH₂C1₂-8O ml (3 vezes)

TFA a 507» mais 1,2-etanoditiol a 57, em CH₂C1₂-7O ml (2 vezes)

Lavagem com álcool isopropilico + etanoditiol a 17-80 ml (2 vezes)

TE A 12,,57, em CH₂CI₂~70 ml (2 vezes)

Lavagem com MeOH-40 ml (2 vezes)

Lavagem com CH₂C1₂-8O ml (3 vezes) Boc-aminoácido (10 mmoles) em 30 ml de DMF ou de CH₂C1₂, dependendo da solubilidade do aminoácido protegido particular,, (1 vez) mais DCC (10 mmoles) em CH₂C1₂ Lavagem com MeQH™40 ml (2

30-300 vezes ,J

TEA 12,57, em CH₂CL₂-70 ml (1 vez) Lavagem com Me0H-30 ml (2 vezes) Lavaqem com CHqCl^-SO ml (2 vezes)

Se a síntese for realizada manualmente, depois do passo 13 pode ser retirada uma alíquota para um teste de ninidrina. Se o teste é negativo, avançar para o segundo passo 1 pare mento do aminoácido seguinte? se o teste é positivo ou ligeiramente positivo, voltar atrás e repetir os passos 9 a 13» esquema anterior é usado para o acoplamento de cada um dos aminoãcidos do pêptido do invento,, após o primeiro aminoácido ter sido ligado» A protecção com N^aBoc é usada para cada um dos aminoãcidos restantes, durante a síntese» 0 N^aBoc-B-D-2NAL é preparado por um processo conhecido na arte, e.g» como o descrito em detalhe na Patente E„U»A» N2 4.234.,571, concedida em 18 de

Novembro de 1980» A cadeia lateral de D-Arg é protegida com Tos,,

Usa-se Fmoc como um grupo protector de cadeia lateral para o grupo amino de Lys? enquanto que Z é usado para proteger o grupo

213 49311

20' ~ 2 2'amino da cadeia lateral de Dpr» Q carboxilo da cadeia lateral de Glu é protegido com OFm, enquanto que o carboxilo da cadeia lateral de Asp é protegido com OBzl» 0 N^aBoc~í3-D“2NAL é introduzido como aminoâcido final» 0 Boc-D-Arg(Tos) que tem baixa solubilidade em CH2CI2 é acoplado usando uma mistura de DMFsCHoClo.

A seguir à construção, sobre uma resina MBHA de um intermediário hexapéptido com a fórmulas

Boc-Glu{OFm)-D-Arg(Tas)-Leu-Lys(Fmoc)-Pro~Dpr(Z)- suporte de resina MBHA» A desprotecção dos resíduos Glu e Lys e a ciclização inicial são realizadas por tratamento com 50 ml de píperidina a 20Z em volume em DMF durante 1 hora a cerca de 22°C, seguido de lavagem» Depois o péptido-resina, cerca de 5 meq»(2,2 g) de BOP [he xaf1uoro f osfa to de ben zotr ia zo1i1-N-ox i t ris(d imeti1amino)-f osfónio] e 15 meq» de dí-isopropiletilamina, são suspensos e agitados durante 2 horas á temperatura ambiente para efectuar a ciclização entre as cadeias laterais de Glu e Lys» 0 péptido-resina é filtrado e, depois, lavado com DMF, MeOH, CHç?, Cl£ e MeOH. A seguir, o grupo protector Boc é removido do hexapéptido cíclico e a síntese do decapéptido é completada para produzir o intermediário 5

Boc-(3-D-2NAL-(4C1) D-Phe-D-Trp-Asp(OBz1)|-—-| ™GIu“D-Arg(Tos)-Leu-Lys-Pro~DprCZ) suporte de resina MBHA.

Depois do desbloqueamento do grupo amino alfa do terminal N com ãcido trifluoroacético (TFA), consegue-se a acetilação usando um grande excesso de anidrido acético em diclorometano» A seguir suspende-se, cerca de 4 g de resina de peptidilo protegida, à temperatura ambiente, em 40 ml de DMF e adiciona-se 1 ml de hidrazina anidra (excesso de 30--40x) com agitação continua» É borbulhada azoto através da mistura reaccional e realiza-se agitação continua num vaso fechado durante 48 horas» A resina é filtrada, lavada com DMF, MeOH, CH2CI2 e MeOH e finalmente é seca,

Tratam-se a 0°C durante 60 minutos cerca de 4 g de péptido protegido-hidrazida-resina com 10-15 ml de HF destilado, na precomo depurador, para remoção dos e clivagem do péptido da resina» 0 e o péptido é precipitado com éter recolhido,, dissolvido em 50 ml de » é_?então₅ purificado usando RP—HPLC •W' γη

49311

-21sença de 1,5 ml de anisolo restantes grupos protectores HF é removido sob alto vácuo etílico anidro. □ sólido é CH₃CNsH₂0 (.1 s 1) e 1 iof i 1 izado antes da ciclização final» em 1.5 ml de Adicionam-se

Disso!vem-se 1.000 mg do péptido-hidrazida arrefece-se até -25^QC e borbulha-se N₂ gasoso»

DMF,

0,56 ml (cerca de 2,25 mmoles) de HC1 4W em dioxano e, finalmente.

adicionam-se 105 μΐ (cerca de 0.,78 mmoles) de nitrito de isoamilo durante 10 minutas» A agitação a -25°C continua durante 3 horas» A solução de azida é diluída com 1000 ml de DMF pré-arrefecids (~25°C)? adiciona-se Ν,N— diisopropiletilamina em porções adequadas para se obter um pH final de 7,8» 0 pH é verificado e reajustado várias vezes»

A solução é guardada a 4°C durante 3 dias e, depois, é evaporada até à secura sob alto vácuo» 0 resíduo é triturado em presença de éter etílico.. □ sólido é recolhido e seco sob vácuo»

A purificação final do péptido é então efectuada por duas separações RP-HPLC» A primeira usa, preferencialmente, um sistema tampão TEAP (fosfato de trietilamónio) e a segunda usa um sistema tampão TFA, como descrito detalhadamente no artigo de J» Chromatoqraphy.

Considera-se o péptido como homogéneo usando cromatografia em camada fina e vários sistemas de solventes diferentes, bem como usando a cromatografia líquida de alta pressão de fase inversa e uma solução de fosfato de trietilamónio aquoso mais acetonitrilo. A análise de aminoácidos do péptido purificado, resultante, é consistente com a fórmula para a estrutura preparada mostrando valores substancíalmente inteiros para cada aminoácido na cadeia» A rotação óptica do Péptido NS 1 é medida num polarímetro fotoeléctricô e obtém-se t0(3^-=-49,5°±1(0=1, ácido acético a 50%).

Quando um péptido, como o NS 4, tem uma segunda ligação de ciclização na forma de uma ligação dissulfureto entre as cadeias *7Γ? 1

493ί 1

./77Ζ laterais dos resíduos nas posiçSes 4 e 10, essa ligação pode ser feita por oxidação do decapéptido cíclico com ar após a sua remoção da resina. Como exemplo de um processo adequado, o intermediário é preparado com a fórmulas Boc-desidro- Pro-(4C1}D-Phe-D-Trp-Cys (MeOBz 1) -ΘÍu~í3-D-2MAL-Leu-Lys-Pro-Cys (MeOBz 1) - suporte de resina MBHA»

Após a desprotecção do amino alfa e acetilação como descritas anteriormente, a clivagem do péptido da resina e a desprotecção das cadeias laterais de Cys é prontamente realizada a 0°C com HF, com adição de anisolo como depurador, antes do tratamento com HF» Depois da remoção do HF sob vácuo, extracta-se a resina com ácido acético a 507», e o péptido lavado ê, então, oxidado com ar durante cerca de 24 horas a cerca de 22°C para criar uma ligação dissulfureto entre os resíduo?» Cys em cada molécula» Por último, realiza-se a liofilização para proporcionar um pó de péptido em bruto»

Os péptidos são ensaiados in vivo e também testados in vitro usando células de pituitárias» de ratazana dissociadas mantidas em cultura durante 4 dias antes do ensaio» Os níveis do intermediário LH em resposta à aplicação de péptidos são ensaiados por doseamento radioimunológico, específica para a L.H da ratazana» Os discos de controlo das células recebem apenas uma medida que é de 3 nanomolar em GnRH5 os discos experimentais recebem uma medida de 3 nanomolar em GnRH mais uma medida com o presente antagonista padrão para fins comparativos, i»e. [Ac-desidroPro¹, (4F)D-Phe², z

D_Trp·'!>°]-GnRH ou o péptido de teste, em concentrações variando de 0,01 a 10 nanomolar» A quantidade de LH segregada nas amostras tratadas só com GnRH é comparada com a que é segregada nas amostras tratadas com o péptido mais GnRH» A capacidade do péptido de teste para reduzir a quantidade de LH libertada por 3 nanomolar de GnRH é comparada com a do presente péptido padrão» teste in vivo determina a eficácia na prevenção da ovulação em ratazanas fêmea» Neste teste, um número especificado de ratazanas Sprague-Dawley fêmea, adultas, e»g» de cinco a dez, tendo cada uma um peso corporal de 225 a 250 gramas, é injectada

213 49311

...a

Cí com uma dose especificada em mierograma de péptido em solução salina ou em água bacteriostâtica,, cerca do meio-dia no dia do proestro. 0 proestro é a tarde da ovulação» é usado um grupo separado de ratazanas fêmea como controlo ao qual não se administra o péptido» Cada uma das ratazanas fêmea de controlo têm a ovulação na noite do proestro; registà-se o número de ratazanas tratadas que têm ovulação» □ Péptido NS 1 é considerado como sendo significativamente eficaz para impedir a ovulação nas ratazanas fêmea_? numa dose muito baixa; ê considerado como sendo totalmente eficaz numa dose de cerca de 500 microgramas por kg de peso corporal s pode ser eficaz a cerca de 100 pg/kg»

Todos os péptidos listados na TABELA I são considerados eficazes para bloquear a secreção da LH induziada por GnRH in vitro numa concentração razoável_s e todos são consideradas eficazes para impedir a ovulação dos mamíferos fêmea em doses razoáveis»

EXEMPLO XI

Os péptidos, como indicados na TABELA ΪΪ, de fórmulas

I-H

Ac-desid roPro-· (A3 D-Phe-D-SPAL-Rq, - R g - D -· T r p - L e u - R g —P ro—R j. f_}—IMHj são preparadas pelo processo de fase sólida referido anteriormen te.

TABELA II

17	A 4F	Rq. Cys	Rg Glu	F;8 Lys	Rio Cys
IS	11	Dpr	11	Hly	Asp
19	401	□rn	1!	Hhl	t!
20	11 > -	Dbu	Hgl	Lys	Glu
21	11	11	11	Η1 v	'.Zz p
99	(I	Dpr	ti	Hhl	It
	4Br	il	Hhg	ii	Glu
24	11	Dbu	1!	Lys	11
oca jL i J	H	!!	1!	Hly	Asp
QÁ .A.O	4M02	!S	Glu	(2	11
27	Si	Asp	il	Hhl	Dpr
28	2,403-2	u	u	15	Dbu
89	It	Glu	Hgl	ti	It
30	Calíe/4C1	Abu	n	Lys	Cys
31	3 ? 40 3.2	Cys	ii	Hhl	Abu

Os testes in vitro eXou in vivo dos péptidos especifiçados

Ζ X di. X Ο

49311

24na Tabela II mostram que os péptidos listados na Tabela II são

considerados efica	zes para	bloquear a. secreção de	LH	induzida por
GnRH	, in vitro,, numa concentração razoável» Todos	os	péptidos são
considerados efica	zes para	impedir a ovulação nos	mamíferos fémea
em dosagens baixas	»
			EXEMPLO III
	Os Péptidos,	como os	indicados na TABELA III	, ds	·· fórmulas
X-(3-	D-2iMAL-(4Cl )D~	Phe-D-SPAL-Rç-G í u~R6-NML~-Lys-Pr	o-
^10	-nh2
são	preparados pelo processo de fase-sólida refer	ido	anteriomen-
te.			TABELA III
	X	Rq.	P‘6		R10
32	Ac	Cys	D-Arg		Abu
33	Ac r	Abu	D-Tir		Abu
34	For	Asp	H		Dpr
“Ρ* E»	Bz	H	D-Arg		Dbu
36	Ac	Dpr	D-His		Asp
37	Vac	H	(Eb? j D-Har Λ·*·		Glu
38	Acr	Orn	(4gua)D-Phe		Π
	Ac	Dbu	D-3PAL.		Asp
40	Acr	Cys	D-His		Cys
41	Ac	Orn	(Et2)D-Arg		Asp
42	ÍÍ	Dpr	D-2PAL.		lí
43	Vac	H	(4NH2)D—Phe		Glu
44	Bz	G1 u	D-Har		Dpr

Os péptidos tais como os NSs 32 e 33 são sintetizados usando os ensinamentos gerais da Patente dos E,,U„A» NS 4,,161,,521»

Os testes in vitro e/ou in vivo dos péptidos especificados na Tabela III mostram que os péptidos listados na Tabela III são considerados eficazes no bloqueio da secreção de LH induzida por GnRH, in vitro, numa concentração razoável,, Todos os péptidos são considerados eficazes para impedir a ovulação nos mamíferas fémeas em dosagens baixas.

49311

EXEMPLO IV

Qs péptidos, como os indicados na TABELA IV-, de fórmulas

Ac-Ri	-(4C1 )D-Phe-D-Ti-	-p-Rzp-SÍu	-D-3PAL··-	•R7—Lys-	(G)Pro-
4'io-	NH2
são	preparados pelo	processo	de fase-sólida	referido	an ter
men te
		TABELA IV
	R1	R4		r7	G	R10
45	[3-D2NAL	Asp		Nle	H	Dpr
46	(lAc)D-Trp	it		Met	OH	!i
47	(6Br)D-Trp	1!		Tyr	H	Dbu
48	(5F)D-Trp	Π		Nle	desidro	ti
49	(6N02)D-Trp	li		Met	ii	Dbu
50	(5C1)D-Trp	ll		Tyr	H	Dpr
51	(401)D-Phe	it		Phe	ii	Orn
c=-~7. d	(4F)D-Phe			4F-D-PK	£$ 11	i!
53	(2,4CI2)D-Phe	Glu		NML	OH	ii
54	desidroPro	21		Nle	ii	Dbu
55	|3—D-2NAL	I)		Trp	H	il
56	Í8OCH3)D-Trp	H		Leu	u	Dpr
57	(5NH2)D-Trp			Nva	Ji	il
58	(4N02)D-Phe	ti		NML	ti	21
59	desidroPro	U		Tyr	OH	tl
	Todos os péptidos list	ados na	Tabela	IV são consider

eficazes para bloquear a secreção de LH induzida por GnRH, in vitro,, numa concentração razoável „

Todos os péptidos são considerados eficazes para impedir a ovulação nos mamíferos fémea em dosagens baixas»

EXEMPLO V

Os péptidos, como os indicadas na TABELA V, de fórmulas Ac-R|- (4F 5 D“Phe-F<3”R4“G Íu-R^“Tyr-Lys-Pro~-R|f)“NH₂ são preparados pelo processo de fase sólida referido anteriormente»

49311

26W..<jíX~3gss >Χ^Ζ' &

TABELA V

	Ri	R3	R4	R6	Rio
60	0-D-2NAL	(6N02)D-Trp	Cys	D-Arg	Cys
61	11	(5CH3 5 D-Trp	u	(DMP)D-His	Abu
Δ*”*	H	(5OCH3)D-Trp	!t	(4gua)D-Phe	Cys
63	desidroPro	0-D-2NAL	íi	( 6N02 ) D—Trp	1{
64	1!	0-D-liMAL	H	D-Val	Abu
65	0-D-2NAL	(IFor)D-Trp	(1	(Et2)D-Arg	ii
66	(1	(5F)D-Trp	Abu	(5NH2)D-Trp	Cys
67	desidroPro	C501)D-Trp	ii	D-Tyr	Abu
68	11	D-2PAL	Glu	D-Mle	Dbu
69	n	(lAc)D-Trp	ii	(4F)D-Phe	Orn
70	Pro	D-3PAL.	Asp	(3-D-1NAL	Dbu
71	(IFor ) D-Trp	12	it	(4NHCH3)D-Phe	Dpr
72	(3-D-2NAL	li	Cys	(Ipr2)D-Arg	Cys
73	u	(5NH2)D-Trp	ii	(4NH2 5D-Phe	Abu
74	0-D-1NAL	(6Br)D-Trp	ii	(IFor)D-Trp	Cys
75	Í6CH3)D-Trp	D-4PAL	Asp	D-4PAL	Dbu
	Os testes	in vitro e/ou	in vivo	dos péptidos especif

na na

Tabela V mostram que os péptidos listados considerados eficazes para bloquear a secreção de LH induzida por GnRH, in vitro, numa concentração razoável. Todos os péptidos são considerados eficazes para impedir a ovulação nos mamíferos fêmea, em dosaqens baixas» absli

EXEMPLO VI

Os péptidos» como os indicados na Tabela VI, de fórmulas X-Rj. - (4F 5 D-Phe~D-Trp-R₄~G íu“R₆-Leu-Lys~Pro~R₁₀“NH₂ são preparados pelo processo de fase sólida referido anteriormente »

49::	213 511				(5%
			TABELA	VI
	X	R1	R4	r6	R10
76	Acr	desidroPro	Asp	D-Val	Dpr
77	Ac	ii	Dpr	Í3-D-2NAL	Asp
7G	Ac	Í3-D-2NAL	Cys	(MeEt)D-Arg	Cys
79	Ac r	Pro	Glu	D-Ser(OtBu)	Orn
30	H	desidroPro	Dpr	(imBsI)D-His	Asp
3.1	Bz	(4Br)D-Phe	tl	(5C1)D—Trp	Glu
32	n	D-pGlu	íl	(áBr)D--Trp	ϋ
83	For	Í3-D-.1NAL	11	D-Nva	Asp
84	l<	desidroPro	Cys	(Ipr2)D—Har	Abu
85	Vac	Í3-D-2NAL	í{	D-Pro	Cys
86	Íl	D-Phe	Dbu	D-Ile	Asp
87	H	desidroPro	ii	D-A 1 a	Glu
	Testes	in vitro e/ou	in vivo	dos péptidos es	peeificados

Tabela VI mostram que os péptidos listados na Tabela VI são considerados eficazes para bloquear a secreção da LH induzida por GnRH, in vitro, numa concentração razoável. Todos os péptidos são considerados eficazes para impedir a ovulação nos mamíferos fêmea em dosaaens baixas.

EXEMPLO VII

Os péptidos, como os indicados na TABELA VI1, de fórmulas .AC“R₁-(4Cl)D“Phe“R3-Rzi”GÍuR_é>-LeU“Lys-PrQ-R₁o-NH₂ são preparados pelo processa de fase sólida referido anteriormen te .

(SEGUE TABELA)

TABELA VII

R1	r3	Rq.	Ré	R10
88	desidroPro	(6N02)D-Trp	Asp	β-D-NAL	Dpr
89	J!	it	ii	D-Val	ti
90	Π	(ÓF)D-Trp	!!	(4gua)D-Phe	ii
91	ti	!!	ii	D-Nva	ti
92	U	(50CH3)D-Trp	tl	D—Pro	ii
93	!!	ii	!i	D-2PAL	!t
94	(3-D-2NAL	(lAc)D-T rp	Glu	(Me2).D-Har	ii
95	ii	(IFor)D-T rp	ii	(5CH3)D-Trp	Dbu
96	desidroPro	(6Br)D-Trp	Abu	D-Nle	Cys
97	ti	ii	ii	D-Leu	Abu
98	ii	(6CH3)D-Trp	ϋ	B-D-2NAL	Cys
99	ii	(6NH2) D~ Γrp	Asp	(4NH2)D-Phe	Dpr
100	ϋ	<5MH2)D-Trp	il	D-A la	Si
	Testes ln	vitro e/ou in vivo	cios	péptidos especific	z «tcl os

Tabela VII mostram que os péptidos listados na Tabela VII são considerados eficazes para bloquear a secreção ds LH induzida por GnRH, in vitro» numa concentração razoável. Todos os péptidos são considerados eficazes parei impedir a ovulação nos mamíferos fêmea em dosagens baixas»

EXEMPLO VIII

Os péptidos» como os indicados na TABELA VIII, de fórmulas Ac-Rj. - (4F) D-Phe-D-3“PAL~R4”QÍu-R₆“R7Lys-PrO“R₁₀™MH₂ são preparados pelo processo de fase sólida referido anteriormente.

(SEGUE TABELA)

“/rp 49311	TABELA VIII	/S) '7 J3L.
	Ri	R4	R?	r7	Rio
101	B-D-2NAL	Cys	(5N02)D-Trp	Leu	Cys
102	II	2!	D-3PAL	It	Abu
103	ii	Abu	P-D-2NAL	IS	Cys
104	1»	li	(Et-Bu)D-arg	ii	Abu
105	desidroPro	11	p~D~2NAL	3PAL	Cys
106	H	Dpr	(4N02)D-Phe	Tyr	G1 u
.107	B-D-2NAL	Dbu	D-3PAL	NML	II
108	H	Dpr	β-D-lNAL	4PAL	Glu
108	ii	Orn	<imBz1)D-His	Leu	ÍJ
110	ti	Asp	<ÓNO2)D-Trp	IS	Dpr
111	11	Glu	D~Tyr	ii	!Í
X12	ii	il	<iFor)D-Trp	Phe	Dbu
113	1!	11	(ÓF)D-Trp	NML	il
114	(CaMe/
	4C1)D-Phe	ii	<40)D-Phe	Nle	Orn
115	Pro	Asp	< imBz1)D~His	Met	1!
lló	desidroPro	ii	(ÓOCH3)D-Trp	Nva	Dbu
117	11	ii	(5CH3)D-Trp	ii	Dpr
XIS	ii	11	(.1 Ac) D-Trp	(4F)Phe	ϋ
119	u	ϋ	D-Nle	NML	Dbu
120	Η	Cys	D-Arg	Nle	Abu
121	Π	ii	B-D-2NAL	T rp	Cys
	Pro	Dpr	(2S 40 2) D-Phe	Nva	Asp
	I3-D-2NAL	II	β-D-lNAL	Tyr	ii
124	11	Dbu	<50 ) D-Trp	Met	{{
	(4C1)D~Phe	ii	(4Br)D-Phe	3PAL	(sal
					acetato)
	Os péptidos	descri	tos na TABELA VIII	são testados in vivo
para	se determinar	· a sua	eficácia para impedir a ovulação nas ra-
tazanas fêmea. Considera	-se que todos eles	impedem	a ovulação na;

ratazanas fêmea em doses baixas e são totalmente eficazes numa dose de cerca de 500 microgramas.

48311

4/

1/'. Bfvs,.

•X ΠίΊ /4

L^AsaasSlSS⁸

-30tr

EXEMPLQ XX

	Os péptido-	s, como os indicadas	na TABELA XX, de fórmulas
Ac-R-i ·- (4C 3.) D-Phe-R-r-Kv-GíU-Í3-D-2MAL- J- I T	Lsu-Lys-i	Pra™Rio““NH2
ScÍO	preparados	pelo processo de fase sólida	referido	anterior-
ΓΠΕ’Π Ί’.© it
		TABELA 1	À
	Ri	r3	R4	Rio
126	D-Glu	D-Lys	Glu	Dbu
127	D~Dbu	D-Hg 1	tl	Orn
128	D-Cys	D-Abu	Asp	Dbu
128	D-Asp	D-0rn	ll	Dpr
130	u	D—Hly	Cys	Cvs
131	D-Glu	D-Lys	H	Abu
132	D-Hhg	D-Hhl	Orn	Asp
133	D-Cys	D-Cys	Asp	Dbu
134	D-Dpr	D-Asp	Cys	Cys
135	D-Hly	D-Glu	u	Abu
136	D-Orn	D-Asp	Orn	Asp
137	D-Hhl	D-Hhg	tt	21
138	D-Abu	D-Abu	Asp	Dpr
138	D-Atau	D-Cys	I!	ll
1 ^ιΌ	D-Hg 1	D-0 rn	Abu	Cys
	Os péptidos tricíclicos são produzidos	da forma aqui expli-
cada	anteriormente na generalidade	através	dos passos de sin-
teti	zação do	péptidorresina que contém o	haxapéptido	cíclico.
como	referido	no EXEMPLO I. Depois	são adicionados os 1	11timos 4
resíduas apropriados. Por exemplo.	no caso	do Péptido	NQ 126,
depois da remoção do grupo protector	Boc do	hexapéptido	cíc1ico,
a síntese do de	capéptido é completada para produzir o intermediã-
rio í
Boc·-	D-Glu(OFm)-	(4C1)D-Phe-D-Lys(Fmoc	)~G1u(OBz13-G 3. u- (3 -D-	“ Í2 ÍM A L·. L & u. ““
•-Lys	—Pro—Dbu(Z 3	- suporte de resina MBHA»
	A seguir à	construção do intermediário	decapéptido	completo
na	resina MBHA, realiza-se a desp	rotecção	e ciclização dos

A

P- ií* >;z /z

49313.

31· resíduos D-Glu e D-Lys por tratamento semelhante à desprotecção e ciclização dos resíduos Glu e Lys, i.e», por tratamento oom piperidina, seguido de lavagem, tratamento com BOP e diisopropiletilamina para se efectuar a ciclização entre as cadeias das extremos de D~Glu e D-Lys» 0 péptido-·-res ina é filtrado, lavado com DMF, MeOH, CH₂C1₂ e MeOH»

Após o desbloqueamento do grupo amino alfa no terminal N usando ácido trifluoroacético (TFA), consegue-se a acetilaçáo usando um largo excesso de anidrido acético em diclorometano. Depois, a resina de peptidilo protegida é suspensa à temperatura ambiente em DMF e é adicionada hidrazina anidra com agitação continua enquanto se borbulha azoto., Após 48 horas, a resina é filtrada, lavada com DMF, MeOH, CH₂C1₂ e MeOH, seca s tratada com HF destilado, na presença de anisolo como depurador, para remoção dos grupos protectores restantes e clivar o péptido da resina» Depois da remoção do HF, o péptido é precipitado com éter etílico anidro, recolhido e liofilizado» é então purificado usando a RR-HPLC, como no EXEMPLO I, antes da ciclização final, que é efectuada da forma referida no EXEMPLO I para se conseguir a terceira ligação amida» A purificação final do péptido tricíclico é então realizada como foi referido no Exemplo 1»

Ma produção de um péptido, tal como o NQ 133, a ligação dissulfureto entre os resíduos D-Cys nas posiçffes 1 e 3 é realizada de preferência por oxidação antes da conversão do péptido linear na azida»

Testes in vitro e/ou in vivo dos péptidos especificados na Tabela IX mostram que os péptidos listados na Tabela IX são considerados eficazes para bloquear a secreção da LH induzida por GnRH, in vitro» numa concentração razoável» Todos os péptidos são considerados eficazes para impedir a ovulação em mamíferos femea em dosagens baixas» •XEMPLO X fórmulas

Ac-D-eiu-(4C1)D-Phe-D-Lys-R₄-R₅-B-D-2NAL-Leu-R_s-Pro-R₁₀-NH₂

Os péptidos bicíclicos, como os indicados na TABELA X, tíe

4931	.1	·χι·»—i			Fr
com	uma segunda	ligação de ciclização entre	R5 RS	ou Rzj.
	preparados	pelo processo de fase	sólida	referido anter
te»
		TABELA X
	r5	r8	R/j.		R10
141	Glu	Lys	Ser		D-Ala
142	11	Hly	H		Gly
143	Hgl	H	Orn		ss
144	. Si	Hhl	Dbu		D-Ala
145	Hhg	II	Dpr	)
146	Tyr	Har	ss		Dbu
147	ti	(Et2)Har	Abu		Cys
148	H	Arg	Asp		Dbu
149	H	(Ipr2)Har	Glu		Dpr
150	St	(Et2)Arg	Cys		Cys
151	11	(Ipr2)	Abu		Abu
152	IS	Arg	Orn		Asp

Testes in vitro e/ou in vivo dos pêptidos especificados na Tabela X mostram que os pêptidos listados na Tabela X são considerados eficazes para bloquear a secreção da LH induzida por BnRH in vitro numa concentração razoável. Todos os pêptidos são considerados eficazes para impedir a ovulação nos mamíferos f@mea em dosagens baixas»

EXEMPLO XI

Os pêptidos monocíc licos,, como os indicados na TABELA XI, de fórmulas

I-1

Ac-Rj_~ (4015 i)”Phe~R3”Ser-Tyr-R_<i₎“Leu-Arg-Pro“Rj q-MH₂ são preparados pelo processo de fase sólida referido anteriormente „ “7-T? D « / ttU ll», «'«

49311

TABELA XI

		Ri	R3	r6	R10
153		D-Asp	D-Lys	Í3-D-2MAL	D-Ala
154		D-Glu	u	H	I!
155		D-Orn	D-Glu	ti	Gly
156		D-Glu	D-Orn	It	D-Ala
157		Orn	Asp	D-3PAL	SI
158		Asp	Dpi-	D—Arg	II
159		ll	Lys	(3-D-2NAL	II
160		Glu	D-Lys	51	!i
161		D-Abu	D-Abu	D-3PAL	Gly
162		D-Lys	Glu	u	tl
163		D-Asp	Dbu	D-Leu	D-Ala
164		D-Glu	D-Hly	D-3PAL	D-Ala
165		D-Lys	D-Hg 1	ti	Gly
166		D-Glu	D-Hhl	D-Arg	D““Als, -
167		Lys	Hg 1	D-3PAL	ii
168		Hly	ti	D-Arg	Si
169		Hhg	Hly	(3-D-2MAL	I!
170		it	Hhl	ii	It
	Testes in vitr0	e/ou in vivo dos	péptidos	es pec i f i c ad os
Tabela	XI mostram 1	que os péptidos 1	istados	na Tabela XI
cons	iderados eficazes	para bloquear a	secreção	da LH induzida

GnRH, ln vitro , numa concentração razoável,, Todos os péptidos são considerados eficazes para impedir a ovulação nos mamíferos fêmea em dosagens baixas.

EXEMPLO XI1

Os péptidos monocíc1icos, bicíclicos e tricíclicos, como os indicados na TABELA XII, de fórmula úWn

I Ί

Ac-NHCHCO- (401) D-Phe-NHCHC0-R₄-R₅-(3~D-2NAL-Leu-Rg-1 com os resíduos nas posiçSes 1 e 3 na forma do isómero D, uma segunda ligação de ciclização entre Rg e Rg ou Rq. e presente nos Péptidos 168-172 e com uma segunda e terceira ligaçSes de —y '7 Ί* ~T

49311

34~

ciclização presente nos Péptidos 173-176, são preparados pelo processo de fase sólida referido anteriormente»

TABELA XII

	n	r4		r5	RS		R10
171	7	Ser		Tyr	Arg		D-A la
172	5	H			(I pr2) Har	Gly
173	8	Orn		u	(Et?)Arg		l!
174	6	Dbu		H	Arg		D-Ala
175	10	Ser		Glu	Lys		H
176	9	(t		Hg 1	Hly		Gly
177	7	Abu		Tyr	CEt2)Har		Cys
178	11	Asp		II	Arg		Dbu
179	9	Glu		íí	Har		Dpr
180	8	Cys	•	Glu	Lys		Cys
181	?	Abu		II	Hly		Abu
182	11	Orn		Hgl	tt		Asp
183	10	Glu		Hhg	Hhl		Dbu
	Testes	in vitro	e/ou	in vivo dos péptidos espec	ifiçados	na
Tabela XII	mostram	que os péptidos	XxsL-sdos nà	Tabe	Ia XII	são
considerados	eficazes	para	bloquear a	, secreção da	LH	induzida	por
BnRH,	in vitro, numa	concentração raz	oável» Todos	os	péptidos	são
considerados	GS T X C cH àE OS	para	impedir a	OVUI SÇ-dkO fiOS	mamíferos femea
em do	saoens t	i*/ «X· t Ϊ h«/ S

Os péptidos do invento são muitas vezes administrados na aceitáveis, metálicos, tais ε » y » , (que forma de sais não tóxicos, farmaceuticamente como, sais de adição de ácido ou de complexos com zinco, bário, cálcio, magnésio, alumínio ou semelhantes são considerados como sais de adição para os propósitos deste pedido), ou combinações dos dois» Exemplos de tais sais de adição de ácido são o hidrocloreto o hidrobrometo, o sulfato, o fosfato, o nitrato, o oxalato, o fumarato, o gluconato, o tanato, o maleato, o acetato, o citrato, o benzoato, o succinato, o alginato, o malato, o ascorbato, o tartarato e semelhantes» Por exemplo, uma solução aquosa do péptido pode ser tratada repetidamente com ácido acético IN e depois liofilizada para dar o sal do ácido —y/η·, u ·ζτ ><m JL 'tf‘

49311

EZ ·..> iJ

tf acético» Se o Ingrediente activo é para ser administrado na forma de um comprimido, o comprimido poderá conter um diluente farmaceuticamente aceitável que inclui um ligante, tal como o tragacanto, amido de milho ou gelatinaρ um agente desintegrante, tal como o ácido algínicoí; e um lubrificante, tal como o estearato de magnésio» Se for desejada a administração na forma líquida, pode ser usado um edulcorante e/ou saborizante como parte do diluente farmaceuticamente aceitável, e pode ser efectuada a administração intravenosa em solução salina isotónica, soluçSes de tampão fosfato ou semelhantes»

As composiçSes* farmacêuticas conterão normalmente o péptido conjuntamente com um transportador convencional, farmaceuticamente aceitável» Normalmente, a dosagem será de cerca de 10 microgramas a cerca de 2,5 miligramas de péptido por quilograma de peso corporal do hospedeiro quando administrada intravenosamente? embora as dosagens orais sejam maiores, admite-se que a natureza cíclica destes compostos permitirá uma maior eficácia da administração oral» Globalmente, o tratamento de sujeitos com estes péptidos realiza-se geralmente da mesma maneira que o tratamento clínico usando outros antagonistas da GnRH com um transportador adequado no qual o péptido é solúvel„

Pode também ser desejada distribuir o análogo da GnRH durante períodos de tempo prolongados, por exemplo, durante perío dos de uma semana a um ano, numa administração única e podem ser utilizadas formas de dosagem de libertação lenta, de depósito (depoi} ou implantaçSes» Por exemplo» uma forma de dosagem pode conter um sal não tóxico, farmaceuticamente aceitável, do composto que tem um baixo grau de solubilidade nos fluidos do corpo, por exemplo, um sal de adição de ácido com um ãcido polibásico? um sal com um catião metálico polivalente? ou a combinação dos dois sais» Um sal relativamente insolúvel pode, também, ser formulado num gel, por exemplo, um gel de estearato de alumínio.

Uma formulação pode, também, para ss 1 inj ecção disperso de depósito de libertação lenta conter o análogo de GnRH ou um seu ou encapsulado num polímero não antigénico ou não tóxico de degradação lenta, tal como um polímero de poli(ácido glicólico)/

poli(ácido láctico) por exemplo, como o descrita na Pat. E.U.A. NS 3.773.9.19. Estes compostos podem, também, ser formulados em implantações de silástico.

Estes péptidos podem ser administrados a mamíferos intravenosamente, subcutanemante, intramuscularmente, oralmente, percutaneamente, e.g», intranasalmente ou intravaginalmente para se atingir a inibição da fertilidade e/ou o controlo, e também em aplicações que necessitam da supressão reversivel da actividade gonadal, tal como para o tratamento da puberdade precoce ou durante a terapia química ou por radiação» eles são também úteis para tratamento de tumores dependentes de esteróides» As dosagens efectivas variarão com a forma de administração e com a espécie particular de mamífero a ser tratada» Um exemplo de uma forma de dosagem típica é uma solução em água bacteriostática contendo o péptido, solução essa que é administrada para proporcionar uma dose no intervalo de cerca de 0,1 a 2,5 mg/kg de peso corporal» A administração oral do péptido pode ser dada na forma sólida ou líquida»

Os	resu1tados dos	testes in vivo	da seleccão	dos antagonista
•Sn Lo F* i. o r	•es são referido	s na Tabela B	seguinte s
		TABELA B
Péptido	Dosagem	Ratazanas		Ratazanas
IMS	na	com Ovulação	ua	com Ovulação
i»	50	0/7		1/7
	10	0/10	5	2/10
	*·? 4„ ? v.«	9/10
·«* a	100	1/8	50	2/8
153»	500	0 Z 7	100	0/5
	25	1/11	10	2/8
154»	500	0/7	100	0/7
156	100	0/10	50	0/8
	••qc rf!· w	5/10
.1.58»	500	3 Z b	1.00	4/5

Apesar de o invento ter sido descrito em relação a concretizações preferidas, deve-se entender que podem ser feitas alte / ul «I. ·μ^:

4931.1 ./-s

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rações e modificações, como.será óbvio para aqueles peritos nesta arte, sem afastamento do âmbito deste invento, o qual é apresentado nas Reivindicações aqui incluídas» Por exemplo» a utilização da ligação de ciclização entre os resíduos nas posições 1 e 3 pode produzir péptidos biologicamente potentes sem a presença da segunda ligação de acompanhamento» Outras substituições conhecidas na arte que não diminuam significativamente a eficácia dos péptidos, também podem ser usadas nos péptidos do invento» 0 D-2PAL e D-4PAL. são considerados equivalentes de D-3PAL» Phe substituido, tal como (4F)Phe, pode ser usado em vez de Phe na posição 7; Phe substituido, tal como (2Cl)Phe, pode ser usado em vez de Tyr na posição 5» Podem, também, ser usados outros residuos de aminoácido hidrofóbico na posição 1, de preferência na forma de isómero D, e são considerados equivalentes aqueles espec i f ica d os»

As caracteristi c as particulares deste invento são realçadas nas Reivindicações que se seguem»

Claims (8)

1. REI V 1 N D 1 C A g QE S lã» Processo de produção de pêptidos contendo pelo menos duas ligações de ciclização entre dois dos três grupos Ri“R₃!> R/|.“Riq e Rg—Rg, ou de um seu sal não tóxico., os quais tem a fórmula Is l-----77^__1 r--_ ------------1

   X—Ri — (A)D”Phe—Rt—R4—Rg—Ra—R7—Rg— (E)Pro—Ri β—iMH?

   L7______J na qual X é hidrogénio, ou um grupo acilo com 7 átomos de carbono ou menos, Rj_ é I3-D-2NAL desidroPro, D-Cys, D-Abu, D~Asp, D-Glu, D-Lys, D-Orn, D-Dbu ou D-Dpr; A é H, CL, F, N0₂, CH₃, 0CH₃, C^aMeX4Cl, Cl₂ ou Br; R₃ é (3--D-2NAL, D-3PAL, D-Trp, D-Cys, D-Abu, D-Asp, D-Glu, D-Lys, D-Orn, D-Dbu ou D-Dpr; R4 é Ser, Cys, Asp, Glu, Orn, Dbu, Dpr ou Abu; Rg é Tyr, Glu, Hgl ou Hhg; R& é Í3--D-MAL, (B)D-Trp, (A')D~Phe, (D)D-Har, D-Tyr, (C)D-His, D-PAL, (D)D-Arg, D-Lsu, D-lle, D-Val, D-Nle, D-Ala, D-Pro, D-Ser(OtBu), ou D-Nva; A’ é A, NH₂, NHCH_S ou gua; B é H, SM0₂, NH₂, 0CH₃, F, Cl, Br, CH₃, N*ⁿFar ou hPⁿAc; C é H, imBzl ou dinitrofenilo; 1) é H ou di-alquilo inferior; Ry é Nle, Leu, NML, Phe, Met, Nva, Tyr, Trp ou PftL; Rg é (D)Arg, (D)Har, Hly, Hhl ou Lys; E é H, OH ou desidro; e Rj_q é Gly, D-ftla, Cys, Asp, Glu, Orn, Dbu, Dpr ou ftbu; com a condição, contudo, de que quando R4 é Cys ou Abu, R^o é Cys ou Abu; quando R4 é Asp ou Glu., R^fj ê Orn, Dbu ou Dpr; quando R4 é Orn, Dbu ou Dpr, R^q é Asp ou Glu; quando Rg é Glu, Rg ê Lys; quando Rj, , é D-Cys ou D-Abu, R₃ é D-Cys ou D-Abu; quando Ρχ é D-Asp ou D-Glu, R₃ é D-Lys, D-Orn, D-Dbu ou D-Dpr; e quando Rj. é D-Lys, D-Orn, D-Dbu ou D-Dpr, R₃ é D-Asp ou D-Glu; caracterizado por compreender (a) a formação de um composto intermediário com a fórmula 11 s

   X¹-R1-<A)D-Phe-R3(X²)'R.4{X³)“Rg(X⁶}”Rg(X⁴ ou X⁵)-R7(X² ou X⁴ ou X²)-Rg(XS)-(e)Pro-R10(X³)-X9 na qual X^· é hidrogénio ou um grupo protector de amino alfa; X² é hidrogénio ou um grupo protector de um azoto de indolo; X·-' é uma ligação directa, hidrogénio ou um grupo protector de Cys ou de um grupo amino ou carboxilo de cadeia lateral X⁴ é hidrogénio ou grupo protector para um grupo hidroxilo fenólico de Tyr; X⁵ é hidrogénio ou um grupo protector de uma cadeia lateral guanidino y X 49311

   -39.3 ou imidazole? X^& é um grupo protector, lábil âs bases, crê uma ~y cadeia lateral carboxilo ou uma ligação directa? X'' é um grupo protector de Met? Χθ é um grupo protector, lábil às bases, ds um amino de cadeia lateral ou é uma ligação directa,, e 3 ê seleccionado de entre o grupo consistindo em 0-CH₂-(resina de suporte), -NH-(resina de suporte), ésteres e amidas? (b) separação de um ou mais dos grupos X-*· a X® e/ou clivagem de qualquer resina de suporte incluída em (c) opcionalmente, criação de uma ligação de ciclização entre um dos três grupos referidos, ainda não estiver presente, e, se desejada, (d) conversão péptido resultante num seu sal não tóxico» do
2. 2ã» Processo de acordo com a reivindicação 1, por uma ligação de ciclização estar entre R-j. e R3»
3. 3â» Processo de acordo com a reivindicação 2, por Rj_ ser D-Glu ou D-Hgl e R3 ser D-Lys ou D-Hly»
4. 4ã« Processo de acordo com a reivindicação 2, por Rj. ser D-Cys e R3 ser D-Cys»
5. 5ã» Processo de acordo com a reivindicação 2, por Rj ser D-Abu e R3 ser D-Abu» caracterizado carac terizado carac terizado carac terizado óã. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 2-5, caracterizado por estar presente uma segunda ligação de ciclização entre R4 e Ρχο»
6. 7â« Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 2-5, caracterizado por estar presente uma segunda ligação de ciclização entre R5 e Rg»

   Sã. Processo de acordo com a reivindicação 6» caracterizado por estar presente uma terceira ligação de ciclização entre R5 e

   Rq »
7. 9ã» Processo de acordo com a reivindicação 1.

   ca r ac t e r i z ad o por o referido péptido ter a fórmulas

   AC-Í3-D-2NAL- (4C1) D-Phe-D-Trp-Asp-G 1 u-D-Arg-Leu-Lys-Pro-Dpr-ΓΜΗο ?

   49311

   40~~

   Ac—p-D—2.NAL-(4C3. )D-Phe-D“3PAL~Asp-Glu-D“Arg-Leu~Lysr--1

   Pro-Dpr—ΝΗ₂ “. ou _

   Ac-desidroPro- ί 4C1) D-Phe~D-Trp~Cys~Glu-fê-D-2NAL-Leu-LysC?

   Ρ r ο—C y s—Ν Η ₂..
8. 10ã» Processo de produção de péptidos que podem conter uma ou mais ligações de ciclização adicionais entre os grupas R4-R10 e Rg~Rg, ou de um seu sal não tóxico,péptidos que têm a fórmula |—íCH₂)_n-1

   X-NHCHCD-(A)D-Phe-NHCHCG-R4“R₅“R_á~R₇-R₈“(E)Pro-R₁₀~NH₂ na qual X é hidrogénio, ou um grupo acilo com 7 átomos de carbono ou menos, A é H,C1, F, ND₂, CH₃, 0CH₃, C^aMe/4Cl, Cl₂, ou Br? n = 4 a 11? R₄ é Ser, Cys, Asp, Glu, Qrn, Dbu, Dpr ou Abu? Rg é Tyr, Glu, Hgl ou Hhg? Rg é Í3-D-NAL, (B)D-Trp, ÍA')D~Phe, (D)D-Har, D-Tyr, (C)D-His, D-PAL, (D)D-Arg, D-Leu, D-Ile, D-Val, D-Nle, D-Ala, D-Pro, D-Ser(OtBu), ou D-Nva? A' é A, NH₂, NHCH3 ou gua? B Cl, Br» CH3, NⁱⁿFor ou MⁱⁿAc? C é H, é H, NQ₂, NH₂, 0CH₃, F imBzl ou dinitrofenilo? D é ou di-alquilo inferior? R)

   Nle.

   Phe, Met, Nva, Tyr, Trp ou PAL? E é H, OH ou desidro? R_s é (D)Arg, (D)Har, Lys, Hly ou Hhl é R₁₀ é Gly, D-Ala, Cys, Asp, Glu, Qrn, Dbu, Dpr ou Abu? desde que, contudo, quando R₄ é Cys ou Abu, está ligado a R^q que é Cis ou Abu? quando R₄ έ Asp ou Glu, está ligado a Rj_q que é Qrn, Dbu ou Dpr? quando R₄ é Qrn, Dbu ou Dpr, está ligado a R^o que é Asp ou Glu? e quando Rg é Glu, Hgl ou Hhg, está ligado a Rg que é Lys, Hly ou Hhl? caracterizado por compreender (a) a formação de um composto intermediário com a fórmula Hs

   NML •(CHo),

   X¹-NHCHC0TA)D-Phe-NHCHCQ-R4(X³)-Rg(X^ó)-R6(X⁴ ou X⁵)~R7(X² ou X⁴ ou X⁷)-Rg( X⁸)-(E}Pro-R_1Q(X³)-X⁹ na qual X¹ é hidrogénio ou um grupo protector de amino alfa?

   hidrogénio ou um grupo protector de um azoto de indolo?

   x-~·

   X·* é uma ligação directa, hidrogénio ou um grupo protector de Cys ou de um grupo amino ou carboxilo de cadeia lateral? X⁴ ê hidrogénio ou um grupo protector de um grupo hidroxilo fenólico de Tyr? X^ é hidrogénio ou um grupo protector de uma cadeia lateral guanidino

   493.il ou imidazole? X⁸ é um grupo protsetor, lábil às bases, de uma cadela lateral carboxilo ou ê uma ligação directa? X⁷ é um grupo protector de Met? X⁸ é um grupo protector, lábil às bases, de um _X9 amino de cadeia lateral ou é uma ligação directa? e seleccionado de entre o grupo consistindo em O-Ch‘2” (resina suporte), -NH-(resina de suporte), ésteres paração de um ou mais dos grupos X·*· a X qualquer resina de suporte incluída em X⁸?

   é de e amidas? (b) see/ou clivagem de (c) opcionalmen te, criação de uma ligação de ciclização entre um dos três grupos referidos, se ainda não estiver presente, e, se desejado» (d) conversão do péptido resultante num seu sal não tóxico.