SK281319B6

SK281319B6 - Peptid a jeho použitie na výrobu liečiva

Info

Publication number: SK281319B6
Application number: SK453-93A
Authority: SK
Inventors: Shaobo Xiao
Original assignee: Tianjin Municipal Research Institute For Family Planning
Priority date: 1990-11-10
Filing date: 1991-11-08
Publication date: 2001-02-12
Also published as: CA2095932C; CA2095932A1; PT99458A; ZA918847B; KR100244624B1; AU8861291A; FI933156A0; NZ240505A; ES2100965T3; SI9111779B; ATE149520T1; SI9111779A; DK0564466T3; EP0564466B1; LV10106B; YU48831B; KR930703353A; DE69125024T2; HRP920585A2; UA41300C2

Abstract

Peptid vykazujúci sekvenciu [NAc-D2Na11, AA2, AA3, Ser4, AA5, D3Pal6, Leu7, AA8, Pro9, DAla10]NH2, kde zvyšok AA2 je zvolený zo súboru zahrnujúceho DpClPhe2 a DPhe2, zvyšok AA3 je zvolený zo súboru zahrnujúceho D3Pal3 a DPhe3, zvyšok AA8 je zvolený zo súboru zahrnujúceho Arg8 a Pap8 a zvyšok AA5 je zvolený zo súboru zahrnujúceho Mop5, Arg5 a Tyr5, pričom keď AA5 je Mop5 a potom AA2 je DpClPhe2 a DPhe2, AA3 je D3Pal3 a AA8 je Arg8; keď AA5 je Arg5 a AA3 je DPhe3, potom AA2 je DpClPhe2 alebo DPhe2 a AA8 je Arg8; keď AA5 je Arg5 a AA3 je D3Pal3, potom AA2 je DpClPhe2 a AA8 je Pap8; a keď AA5 je Tyr5, potom AA2 je DpClPhe2 alebo DPhe2, AA3 je DPhe3 a AA8 je Arg8. Použitie tohto peptidu, ktorý antagonizuje pôsobenie hormónu uvoľňujúceho luteinizačný hormón (LHRH) na výrobu liečiva na liečenie porúch reprodukčného endokrinného systému a rakoviny prostaty a prsníka a antikoncepčného činidla, ako aj činidla na diagnostikáciu a liečenie neplodnosti.ŕ

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka peptidu antagonizujúceho pôsobenie hormónu uvoľňujúceho luteinizačný hormón a jeho použitia na výrobu liečiva.

Doterajší stav techniky

Hormón uvoľňujúci luteinizačný hormón (LHRH) v hypotalame pôsobí na prednú časť podmozgovej žľazy tak, že stimuluje sekréciu luteinizačného hormónu (LH) a folikulámeho stimulačného hormónu (FSH). Antagonistický analóg LHRH pôsobí na prednú časť hypofýzy rýchlo, jeho účinok je dlhodobý a môže sa bezpečne a reverzibilne používať na antikoncepciu alebo selektívne potláčanie sekrécie gonadotropínu. Na taký spôsob aplikácie sú antagonisty LHRH vhodnejšie ako agonisty. Až doteraz sa navrhlo a syntetizovalo viac ako 2000 analógov LHRH, z ktorých analóg „Nal-Arg“ vykazuje značne vysokú účinnosť proti plodnosti. Analóg „Nal-Arg“ však vykazuje aj veľmi silnú účinnosť pri uvoľňovaní histamínu (HRA). U potkanov, pri podaní dávky 50 až lOOx vyššej, ako je dávka terapeutická, spôsobuje prechodné opuchy prednej tlamičky a končatín. Výsledok klinickej skúšky ukazuje, že dochádza k systemickým účinkom, ktoré sú spojené s uvoľňovaním histamínu. Iné antagonisty LHEH obsahujúce DArg⁶ alebo DLys⁶ vykazujú podobné vedľajšie účinky; ich hodnoty EDSO v prípade HRA sú nižšie ako 1 pg/ml. Vynález sa týka nových antagonistov LHRH, ktoré vykazujú veľmi vysokú antiovulačnú účinnosť (AOA) a veľmi nízku účinnosť pri uvoľňovaní histamínu (HRA) a majú zanedbateľné vedľajšie účinky.

Podstata vynálezu

Predmetom vynálezu je peptid vykazujúci sekvenciu [NAc-D2Nal', ΛΑ², AA³, Ser⁴, AA⁵, D3Pal⁶, Leu⁷, AA⁸, Pro⁹, DAla¹⁰]NH₂, kde zvyšok AA² je zvolený zo súboru zahrnujúceho DpCIPhe² a DPhe², zvyšok AA³ je zvolený zo súboru zahrnujúceho D3Pal³ a DPhe³, zvyšok AA⁸ je zvolený zo súboru zahrnujúceho Arg⁸ a Pap⁸ a zvyšok AA⁵je zvolený zo súboru zahrnujúceho Mop⁵, Arg⁵ a Tyr⁵, pričom keď AA⁵ je Mop⁵ a potom AA² jc DpCIPhe² a DPhe², AA³ je D3Pal³, a AA⁸ je Arg⁸; keď AA⁵ je Arg⁵ a AA³ je DPhe³, potom AA² je DpCIPhe² alebo DPhe² a AA’ je Arg⁸; keď AA⁵ je Árg⁵ a AA³ je D3Pal³, potom AA² je DpCIPhe² a AA⁸ je Pap⁸; a keď AA⁵ je Tyr⁵, potom AA² je DpCIPhe² alebo DPhe², AA³ je DPhe³ a AA⁸ j e Arg⁸.

Výhodné uskutočnenia tohto peptidu vykazujú sekvenciu [NAc-D2Nal', DpCIPhe², DPhe’, Ser⁴, Arg⁵, D3Pal⁶, Leu⁷, Arg⁸, Pro⁹, DAla¹⁰]NH₂;

[NAc-DŽNal¹, DpCIPhe², DPhe³, Ser⁴, Tyr⁵, D3Pal⁶, Leu⁷, Arg⁸, Pro⁹, DAla^l0]NH₂;

[NAc-DŽNal¹, DpCIPhe², D3Pal³, Ser⁴, Mop⁵, D3Pal⁶, Leu⁷, Arg⁸, Pro⁹, DAla¹⁰]NH₂;

[NAc-D2Nal‘, DPhe², D3Pal’, Ser⁴, Mop⁵, D3Pal⁶, Leu⁷, Arg⁸, Pro⁹, DAla‘°]NH₂; alebo [NAc-D2Nal‘, DpCIPhe², D3Pal³, Ser⁴, Arg⁵, D3Pal⁶, Leu⁷, Pap⁸, Pro⁹, DAla'°]NH₂.

Predmetom vynálezu je ďalej použitie niektorého z uvedených peptidov na výrobu liečiva na liečenie porúch reprodukčného endokrinného systému a rakoviny prostaty a prsníka.

Napokon je predmetom vynálezu aj použitie niektorého z uvedených peptidov na výrobu liečiva na použitie ako antikoncepčného činidla a na diagnostikáciu a liečenie neplodnosti.

Metodológia navrhovania a konštrukcie zlúčenín podľa vynálezu je založená na topologickej podobnosti medzi molekulou rodičovskej zlúčeniny [NAc-D2Nal’, DpCIPhe², D3Pal³, Ser⁴, Tyr⁵, DArg⁶, Leu⁷, Arg⁸, Pro⁹, DAla¹⁰]NH₂(zlúčenina vzorca II) a neuropeptidom, látkou P. Táto metodológia zahrnula modifikáciu zásaditej aj lipofilnej oblasti v molekule rodičovskej zlúčeniny za vzniku nových antagonistov, ktoré majú vysokú AOA pri nízkej HRA. Pod pojmom „modifikácia“ sa rozumie prispôsobenie alebo substitúcia aminokyselín v oblasti Tyr⁵-DArg⁶-Arg⁸ pri N-konci a aromatických kyselín pri N-konci zlúčeniny vzorca (II).

Táto konštrukcia zahŕňa konkrétne zavádzanie vhodných zásaditých skupín a substitúciu neprirodzených aminokyselín do polôh 2, 3, 5, 6 a 8 zlúčeniny vzorca (II).

Peptidové antagonisty LHRH podľa vynálezu predstavujú peptidové liečivá, ktoré možno použiť na liečenie porúch reprodukčného endokrinného systému, vrátane endometriózy, predčasnej puberty detí, rakoviny prostaty a prsníka a ako prostriedok na reguláciu počatia pre obidve pohlavia alebo na diagnostikáciu a liečenie neplodnosti atď. Toto peptidové liečivo môže byť upravené do podoby normálnych injekcií, injektovateľných kapsúl alebo iných prípravkov vhodných na skutočnú aplikáciu.

Neuropeptidová látka P hrá veľmi dôležitú úlohu v prirodzenom priebehu uvoľňovania histamínu v tele. Jej ED₅₀pre HRA je 5 až 15 μΜ. Chemická štruktúra látky P je nasledujúca [Arg¹, Pro², Lys’ Pro⁴, Gin⁵, Gin⁶, Phe⁷, Phe⁸, Gly⁹, Leu , Met^(1I)]NH₂. Štúdia vzťahu medzi štruktúrou a HRA ukázala, že pre HRA je dôležitá sekvencia Arg’-Pro²-Lys³ pri N-konci molekuly látky P, pretože deléciou týchto troch aminokyselín z molekuly sa úplne zruší jej HRA. Naproti tomu pri delécii jednej, dvoch alebo troch aminokyselín pri C-konci zostane zachovaná HRA z jednej štvrtiny v porovnaní so samotnou látkou P. Ďalšia delécia Phe⁸ a Phe⁷má za následok zníženie HRA najprv na 4 % a potom na 0,57 % účinnosti látky P. Ďalšia delécia Gin⁵ a Gin⁶ nespôsobuje podstatnú zmenu HRA. Z uvedených údajov je zrejmé, že lipofílná oblasť okolo Phe⁷ a Phe⁸ určuje hodnotu HRA a že sa táto oblasť podieľa na väzbe molekuly látky P na receptor mastocytu.

Ako už bolo uvedené, (D2Nal*, DArg⁶)analógy LHRH vykazujú veľmi vysokú HRA, čo je spôsobené topologickou podobnosťou ich molekulovej štruktúry s látkou P. Zdá sa, že sekvencia Darg⁶-Leu⁷-Arg⁸ v týchto analógoch zodpovedá sekvencií Arg‘Pro²Lys³ pri látke P. Obidve tieto sekvencie obsahujú dvojicu silne zásaditých zvyškov aminokyselín, medzi ktorými je umiestnený iba jeden neutrálny zvyšok aminokyseliny, t. j. ako (DŽNal¹, DArg⁶)analóg LHRH, tak aj látka P obsahuje dva silné bázické zvyšky aminokyselín, ktorých vzájomná poloha je 1,3. Naproti tomu zhluk zvyškov aromatických kyselín v uvedenom analógu pravdepodobne zodpovedá oblasti Phe^7,8 pri látke P, pokiaľ sa týka určujúceho vplyvu na výšku HRA.

Vývoj a príprava peptidov podľa vynálezu zahŕňa dva aspekty: jedným z nich je modifikácia oblasti Tyr’-DArg⁶-Arg⁸ pri C-konci a druhým z nich je jemné prispôsobenie aromatických kyselín po optimalizácii modifikácie bázickej oblasti pri C-konci. Ako rodičovská zlúčenina sa pritom používa zlúčenina zloženia [NAc-D2Nal‘, DpCIPhe², D3Pal³, Ser⁴, Tyr⁵, DArg⁶, Leu⁷, Arg⁸, Pro⁹, DAla¹⁰]NH₂(II), ktorá vykazuje AOA 100 % (0,5 pg) v kukuričnom oleji a 57 % (0,25 pg).

V zlúčenine vzorca (II) sa najprv môže DArg⁶ nahradiť

SK 281319 Β6 slabo bázikcou alebo neutrálnou aromatickou kyselinou, ako je D3Pal, D6Qal, tetrahydrotryptofán alebo metyltryptofán. Zlúčenina vzorca (III) INac-D2Nal', DpCIPhe², D3Pal³, Ser⁴, Tyr⁵, D3Pal⁶, Leu⁷, Arg⁸, Pro’, DAla‘°]NH2 sa získa pri nahradení DArg⁶ v zlúčenine vzorca (II) pomocou D3Pal⁶. Zlúčenina vzorca (III) vykazuje AOA 100 % (3 pg) a 83 % (1 pg) v kukuričnom oleji a jej hodnota ED50 pre HRA je 9,8 pg/ml, čo je hodnota omnoho lepšia než v prípade „Nal-Arg“ analógu (ktorého ED₅₀ pre HRA je nižšia než 1 pg/ml). Zdá sa, že na dosiahnutie vysokej AOA by mala byť bázicita celej molekuly rovnaká alebo približne rovnaká, ako je bázicita arginínovej dvojice. Pretože sa poloha 5 ani poloha 6 nepodieľa na väzbe k receptoru, môže sa do polohy 5 vložiť celý rad aminokyselín, vrátane arginínu. Podľa vynálezu bol skonštruovaný rad nových analôgov. Tak napríklad pri substitúcii zvyšku Tyr⁵ zvyškom Arg⁵ v zlúčenine vzorca (III) sa získa zlúčenina vzorca (IV) [Nac-D2Nal', DpCIPhe², D3Pal³, Ser⁴, Arg⁵, D3Pal⁶, Leu⁷, Arg⁸, Pro⁹, DAla*°]NH₂. Ako zlúčenina vzorca (IV), tak aj zlúčenina vzorca (V) obsahuje dva arginínové zvyšky, ale vzdialenosť medzi týmito arginínovými zvyškami v zlúčenine vzorca (IV) je väčšia než v zlúčenine vzorca (II), pretože v zlúčenine vzorca (IV) je geometrický vzťah arginínových zvyškov 1,4, t. j. medzi týmito dvoma arginínovými zvyškami sú dva zvyšky iných aminokyselín. Tým dochádza k zníženiu HRA a na druhej strane, vďaka prítomnosti dvoch arginínových zvyškov, AOA by nemala byť nižšia než AOA zlúčeniny vzorca (II). Na základe biologického stanovenia so zlúčeninou vzorca (IV) bola zistená hodnota ED₅₀ pre HRA 3,5 pg/ml, zatiaľ čo AOA je 60 % pr 0,12 pg (v kukuričnom oleji), 85 % pri 0,25 pg a 100% pri 0,5 pg.

Prvý raz sa u antagonistov LHRH dosiahla hodnota ED₅₀ pre AOA ktorá je rovná 0,125 pg alebo nižšia. Ďalšia konštrukcia bola teda založená na zlúčenine vzorca (IV).

V molekule vzorca (IV) sa nachádzajú štyri bázické zvyšky D3Pal^3,6 a Arg^5,8, zatiaľ čo zlúčenina vzorca (II) obsahuje iba 3 bázické zvyšky. Je preto rozumné nahradiť jeden zvyšok D3Pal zvyškom neutrálnej aminokyseliny. Zlúčenina vzorca (IV) na druhej strane vykazuje veľmi silnú hydrofilitu a jej zníženie substitúciou Dpal zvyškom hydrofóbnej aminokyseliny v zlúčenine vzorca (IV) by bolo prospešné pre retenciu liečiva v tele a na predĺženie času účinnosti. Bola teda syntetizovaná nová séria analôgov substitúciou D3Pal³ v zlúčenine vzorca (IV). Najlepšou látkou z tejto série je zlúčenina vzorca (V) [Nac-DŽNal¹, DpCIPhe², DPhe³, Ser⁴, Arg⁵, D3Pal⁶, Leu⁷, Arg⁸, Pro⁹, DAla‘°]NH2, v ktorej bol zvyšok D3Pal³ substituovaný zvyškom DPhe³. Zlúčenina vzorca (V) vykazuje 100 % AOA pri 1 pg (vo fyziologickom roztoku), čo je hodnota rovnaká, ako má rodičovská zlúčenina vzorca (IV), zatiaľ čo HRA je znížená o polovicu: ED50 pre HRA je 7,4 pg/ml.

Ďalšia substitúcia zvyšku DCIPhe² zvyškom DPhe² má za následok zníženie lipofilify tejto oblasti molekuly a zníženie HRA.

Sekvencia Arg⁵-D3Pal⁶-Leu⁷-Arg⁸ pri C-konci zlúčeniny vzorca (IV) zrejme hrá dôležitú úlohu pri spustení uvoľňovania histamínu. D3Pal v sebe v jedinej molekule spája aromatické vlastnosti, bázicitu a hydrofilitu a je tiež stereoprijateľná v LHRH antagonistoch pre väzbu k receptoru. Podobne konštrukcia novej série neprirodzených aminokyselín, majúcich rovnaký charakter ako D3Pal, môže viesť k lepším antagonistom LHRH, ako sú zlúčeniny vzorca (IV) alebo (V).

Modifikácia prírodnej lipofilnej aromatickej aminokyseliny, napríklad fenylalanínu, ktorá sa môže uskutočňovať napríklad spôsobom uvedeným ďalej v časti nazvanej „Syntéza nových neprirodzených aminokyselín“, vedie k sérii nových neprirodzených aminokyselín, v ktorých sa spájajú v jednej molekule aromatickosť s hydrofilitou a bázicitou. Tieto aminokyseliny sa dajú vyjadriť vzorcom (VI)

R]R₂NCH₂C₆H₄CH₂CH(NH)COOH (VI), kde každý zo symbolov R, a R₂, ktoré môžu byť rovnaké alebo rôzne, predstavuje lineárny alebo cyklický zvyšok, ktorý prípadne môže obsahovať tiež heteroatóm. Modifikáciou zvyškov R( a R₂ je možné získať sériu aminokyselín, ktoré vykazujú systematicky zmenenú bázicitu, hydrofilitu a stereocharakter. Zavedením týchto aminokyselín do polôh 5, 6 a 8 zlúčeniny vzorca (IV) viedlo k získaniu troch sérií nový antagonistov LHRH. Biologické výsledky ukázali, že v každej sérii sa nachádzal prinajmenšom jeden nových antagonista vykazujúci 100 % AOA pri 1 pg, podobne, ako je AOA zlúčeniny vzorca (IV), zatiaľ čo HRA bola podstatne znížená. Ako príklad je možné uviesť zlúčeninu vzorca (VII) |Nac-D2Nal', DpCIPhe², D3Pal³, Ser⁴, Mop⁵, D3Pal⁶, Leu⁷, Arg⁸, Pro’, DAla¹⁰]NH2, ktorá vykazuje 100 % AOA pri 1 pg a ED50 14,7 pg/ml pre HRA, čo je hodnota lepšia než v prípade zlúčeniny vzorca (V). Keď sa vykoná substitúcia zvyšku Arg⁸ v zlúčenine vzorca (IV) zvyškom aminokyseliny všeobecného vzorca (VI), je hodnota poklesu HRA v pozitívnej korelácii s dĺžkou substituenta R v aminokyseline všeobecného vzorca (VI), takže hodnota ED5o pre HRA môže byť vyššia ako 200 pg/ml. Zlúčeniny tohto typu sa dajú ľahko rozpúšťať vo vodnom roztoku a očakáva sa, že bude možné ich klinicky využiť bez toho, aby vznikali ťažkosti so spracovaním na prípravky. Výsledky ukazujú, že Arg⁸ alebo Lys⁸ nie sú podstatné pre vysokú účinnosť antagonistov LHRH. Vhodné bázické centrum v polohe 8 môže zaistiť vysokú AOA, zatiaľ čo účinnosť indukujúca v mastocytoch uvoľňovanie histamínu je pozoruhodne znížená, keď bázické spomenuté centrum obsahuje podstatnú stereozábranu.

Pri modifikácii N- aj C-konca spôsobom podľa vynálezu sa získajú lepšie antagonisty LHRH.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Na obr. 1 sú znázornené výsledky analýzy TLC antagonistov IV, V a VII s použitím piatich rôznych vyvíjacích systémov.

Na obr. 2 je znázornené HPLC spektrum na reverznej fáze v prípade čistej vzorky antagonistu LHRH IV. Spektrum bolo namerané za týchto podmienok:

Stĺpec: p-Bondapak C18 (3,9 mm x 30 cm) Mobilná fáza: A, 0,1M NH₄OAc (pH 7);

B, 20 % A + 80 % acetonitrilu Gradientový postup: od 10 % koncentrácie B do 100 % B za 15 minút.

Prietok: 2 ml/min.

Detektor: UV 229 nm.

Na obr. 3 je znázornené HPLC spektrum na reverznej fáze v prípade čistej vzorky antagonistu LHRH V. Spektrum bolo namerané za týchto podmienok:

Stĺpec: p-BondapakC18 (3,9 mm x 30 cm)

Mobilná fáza: A, 0,01M KH₂PO₄ (pH 3);

B, 20 % A + 80 % acetonitrilu

Gradientový postup: od 40 % koncentrácie B do 100 %B za 15 minút.

Prietok: 2 ml/min.

Detektor: U V 210 nm.

Na obr. 4 je znázornené HPLC spektrum na reverznej fáze v prípade čistej vzorky antagonistu LHRH VII. Spek3

SK 281319 Β6

trum bolo namerané za týchto podmienok:

Stĺpec: μ-Bondapak C18 (3,9 mm x 30 cm)

Mobilná fáza: A, 0,01M KH₂PO₄ (ph 3);

B, 20 % A + 80 % acetonitrilu

Gradientový postup: od 40 % koncentrácie B do 100% B za 15 minút

Prietok: 1 ml/min.

Detektor: UV 210 nm.

Na obr. 5 je znázornené spektrum PICO-TAGTM antagonistu LHRH IV.

Na obr. 6 je znázornené spektrum PICO-TAGTM antagonistu LHRH V.

Syntetický postup je ilustrovaný ďalej:

1. Syntéza nových neprirodzených aminokyselín

Štyrmi syntetickými postupmi, ktoré sú znázornené v nasledujúcej schéme, bolo navrhnuté a syntetizované viac ako 60 sériových a nesériových D- a L-aminokyselín.

Štruktúra týchto neprirodzených aminokyselín je charakterizovaná pomocou všeobecných štruktúrnych vzorcov, ktoré sú uvedené v tejto schéme. Niektoré z týchto aminokyselín obsahujú bázické miesta, niektoré hydrofilné miesta a niektoré aromatické miesta a niektoré z nich obsahujú všetky tieto miesta v jednej molekule.

Dráha 1 Dráha 2 d-ArCH,CHC00Et I NH-AC

P I HC1

NH₂-HC1 dl butyl dikarbonát

1-ArCH^CttCOOH

NH-AC

1-ArCH|CHCQOH nk₂-hci dlbutyldikarbonát

- ArCH^CHCOOH

NH-floc

NH-Boc

Dráha I D alebo L-Ar-CH2-CH-COOH, kde

ArNH_z

HC1 | MaNO_z

ArCHjCl * HCtCOCEtlj

NaOEt | NH-AC

AľNjCl’ j CHj«eHOOH

ArCH₉CHC00H I Cl <3.1- ArCH₉CHC00H ²l NHj

Ac₂o

ArCH₉C(COOEt),

I

NH-AC ( MaOM/EtOH

COONa

I ArCH₅-C-COOEt 'l

NH-AC

H*

Dráha ir d alebo u-ArCH2-cH-coow, kde

d, 1 - ArCH,CMCOOH I

NH-Ac

SOClj/EtOH

COOH

Ar-CH,-C-COO£t ² I

NH-AC

a

Dráha m d

NHCOCHj

CH,CHCOOEt I NHCOCHj

SK 281319 Β6

Ar-CH₂CHC0₂CH₃

Ar-CH₂CHC0₂H

NHC0C_KH<

D-izomér j flNHCl

LHHCOCjHj izomér

I 6NHC1

4-C1CMj-

MHCOCHj

SOClj/UCH

Ar-CHj

CH-CO-QH I nh₂ (o-aminokyselina)

Ar-CH^CH-CO-OH

NHj (L“aminokyselina)

NKCOCHj

ZnCl₂ i CH₃OCH₂Cl

Dráha IV D^iebo L Ar-CH,-CH-COOH. kde I nh₂ ' . ©or .

'O, Q. 9-, sekundárny IttOH amín

CtOH d- XCH sekundárny amín

HjCHCOOEt I NHCOCHj

CH,CHCOOH l NH-aoc

dikarbonát

CH-CHCOOH I NHj’HCl <CH₃)₂N-, (CH₃CH₂)jN-, (gm₃ch₂ch₂)₂n-,

Dráha III

D-flieboL -xch₂-

CH,CHCOOEt I MHCaCH-j

Y

Gz~\

O N--λ___r

DHC1

XCH

.j dibutyl’dikarbonát

-XCH

CH,CHCOOH

I

NH₂ HC1

HH-6OC

Ar-CHO+C_eH₅-CO-HHCH₂C0₂tí

Dráha iv o KHCOg II

Ar-CH«C-C *CjO \

2. Syntéza peptidov

Syntéza začína na C-konci peptidu a vykonáva sa postupom v tuhej fáze na benzylhydrylaminhydrochloridovej (BHA) živici spôsobom, ktorý zaviedol Merrifield. Jedná sa o trojstupňový postup, ktorý zahŕňa zakotvenie, kondenzáciu a odštiepenie. Ako hlavné rozpúšťadlo na premývanie medzi jednotlivými stupňami reakcie sa používa dichlórmetán (DCM) a ak je to potrebné, používa sa tiež izopropylalkohol (IPA) a Ν,Ν-dimetylformamid (DMF). Kondenzačná reakcia je katalyzovaná nadbytkom dicyklohexylkarbodiimidu (DCC), pričom sa pridáva vhodné množstvo 1-hydroxybenzotriazolu (HOBT). Stupeň kondenzačnej reakcie sa sleduje Kaisesovou ninhydrínovou metódou. Ak sa pri Kaisesovej skúške nemeria pozitívny výsledok, uskutoční sa kondenzácia druhý raz. Peptidový reťazec sa odštiepi od živice s použitím bezvodého fluorovodíka (HF) za prítomnosti anizolu, po ukončení všetkých potrebných reakcií, ktoré majú na živici prebehnúť, pričom súčasne dôjde k odštiepeniu všetkých, dočasne prítomných chrániacich skupín. Po premytí etylacetátom alebo éterom sa LHRH antagonisty ako surové produkty, získajú extrakciou vodnou kyselinou octovou, po ktorej sa uskutoční lyofílizácia. Výťažok je vyšší ako 50 %.

kone, hci *r-cn»c-eo,H

I ² hh-co-c₆h₅

H,

Ar-CH,-CH-C0 Pd/C |

NH-CO-CgHg

SOC1_2_ subtilisin

Ar-CH, CHC0₂CH₃ '“

Μ·ΟΗ | pH 7,6 nhcoc₆h_s

3. Purifikácia peptidu

1. Peptid sa čistí gélovou chromatografiou alebo rozdeľovacou chromatografiou na silikagéli s použitím stĺpca s výškou 60 až 100 cm, pričom monitorovanie sa vykonáva pomocou UV žiarenia a chromatografie na tenkej vrstve.

Jedenkrát prečistené antagonisty LHRH sa získajú lyofllizáciou hlavných frakcií. Výťažok je 50 až 90 % a čistota môže byť nad 90 %.

2. Potom sa peptid prečistí vysoko účinnou kvapalinovou chromatografiou (HPLC) na zariadení Waters, s použitím stĺpca s reverznou fázou C18 (7,8 x 300 mm, μ-Βοηdapak 84176). Výťažok v tomto stupni je 20 až 50 %, pričom dosiahnutá čistota nie je nižšia ako 99 %.

4. Analýza peptidu na čistotu

1. analýza TLC

Táto analýza sa uskutočňuje na plastovom liste s nánosom silikagélu 60 F254 s výškou 5 až 10 cm. Po vyvíjaní piatimi rôznymi rozpúšťadlovými systémami vykazujú všetky peptidy jedinú škvrnu.

2. Analýza HPLC

S použitím elúcie dvoma druhmi rozpúšťadlových systémov a zariadenia na vysoko účinnú kvapalinovú chromatografiu Waters s analytickým stĺpcom μ-Bondapak 27324 vykazujú všetky peptidy pri monitorovaní UV 210 jediný pík. Veľkosť vzorky je 10 až 200 pg.

5. Analýza aminokyselín v peptide

Metódou PICO - TAG, ktorá bola vyvinutá firmou Waters Company, sa 50 pg vzorky, ktorá bola 2 hodiny sušená pri zníženom tlaku, odváži na analytických váhach s presnosťou na 10'⁵ g. Vzorka sa rozpustí vo vode a alikvotný diel (10 pg) sa umiestni do skúmavky, do ktorej bola predložená podľa predpisu 1 : 1 kyselina chlorovodíková (obsahujúca 1 % fenolu).

Reakcia prebieha 22 až 24 hodín pri 105 °C v uzavretej nádobe, ktorá bola vopred naplnená dusíkom a evakuovaná, aby sa zo skúmavky odstránil kyslík. Pridá sa izotiokyanát na derivatizáciu aminoskupiny, ktorá prebehne po odparení nadbytku kyseliny chlorovodíkovej. Analýza sa vykonáva pomocou pristroja na vykonávanie HPLC, vybaveného stĺpcom na analýzu aminokyselín PICO - TAG, pričom monitorovanie sa uskutočňuje pomocou UV 254. Vypočíta sa obsah každej aminokyseliny a jej relatívny mólový podiel, aby sa zistilo aminokyselinové zloženie vzorky. Meranie sa vykonáva na základe porovnania integrovanej plochy pre každú aminokyselinu s integrovanou plochou štandardnej vzorky H firmy Waters. Na kontrolu sa tiež používa klasický postup dcrivatizácic s ioncxom a ninhydrínom (IEN), ktorý poskytuje rovnaké výsledky. Na dosiahnutie uspokojivého výsledku je však pri poslednej uvedenej metóde potrebné 10-násobné množstvo vzorky.

6. Hodnotenie biologickej účinnosti

Používa sa Corbinova antiovulačná metóda na potkanoch. Pri tomto pokuse sa použijú zdravé dospelé potkanie samice SD (s telesnou hmotnosťou 200 až 250 g). Všetky zvieratá sa chovajú pri 22 až 24 °C v režime 14 hodín svetlo/10 hodín tma. Podáva sa im štandardné krmivo a voda ad libitum. Na tento experiment sa môžu používať potkany vykazujúce aspoň dva za sebou nasledujúce štvordenné cykly estru, čo sa zistí skúškou vaginálneho výteru. Potkanom sa podajú peptidy (LHRH antagonisty) v kulminujúcej fáze proestru v rôznej dávke v roztoku chloridu sodného. Nasledujúci deň sa potkany usmrtia a ich vajcovody na obidvoch stranách sa prezrú disekčným mikroskopom, aby sa zistil počet vajíčok. Potkany sa rozdelia do niekoľkých skupín podľa dávkovania, pričom každá skupina zahŕňa približne 10 potkanov. Kontrolná skupina, v ktorej potkany dostávajú rovnaké množstvo roztoku chloridu sodného, zahŕňa 9 až 10 potkanov. Antiovulačná účinnosť (AOA) sa zistí z nasledujúcej rovnice:

. počet neovulujúc ich potkanov

AOA=— ---------------------x 100 celkový počet ošetrených potkanov

7. Hodnotenie účinnosti na uvoľňovanie histamínu

1. Skúška uvoľňovania histamínu (HRT) in vitro:

Pri tejto skúške sa používajú zdravé dospelé samce potkanov SD (s telesnou hmotnosťou 200 až 250 g), ktoré sa chovajú za rovnakých podmienok, aké boli uvedené. Po anestetizácii oxidom uhličitým sa peritoneálna dutina premyje 50 ml média PIPES AC, obsahujúceho 20 jednotiek heparínu. Po 8-minútovom odstreďovaní pri 200 x g pri °C sa bunky znova premyjú a nakoniec resuspendujú na koncentráciu 8 až 24 x 10⁵ leukocytov, celkom, v ml média PIPAS AC. Táto suspenzia obsahuje približne 5 až 10 % mastocytov. Premyté bunky sa použijú ihneď po odobratí a minút sa predhrievajú na 37 °C, nato sa 0,3 ml alikvotnej vzorky odpipetujú do polystyrénových skúmaviek, ktoré obsahujú 0,3 ml zriedeného peptidu. Zmesi sa 15 minút inkubujú pri 37 °C a potom sa reakcia zastaví 15-minútovým odstreďovaním pri 400 x g, pri 4 °C. Supematant sa skúša na obsah histamínu manuálnou fluorometrickou metódou po extrakcii najprv n-butanolom a potom n-heptánom. Obsah histamínu sa môže zistiť zo štandardnej krivky pre histamín (pozri ďalej). Percentuálny podiel uvoľneného histamínu je možne vypočítať z nasledujúcej rovnice:

E - B podiel uvoľneného histamínu (%) =-----x 100 ’

C — B kde E predstavuje fluorometrický údaj nameraný pri experimentálnej vzorke, B predstavuje fluorometrický údaj nameraný pri vzorke obsahujúcej iba bunky a tlmič a C predstavuje fluorometrický údaj „úplnej“ vzorky (bunky ošetrené kyselinou chloristou).

Štandardnú krivku je možné zostrojiť vynesením fluorometrických hodnôt OD pri 350 nm/450 nm (aktivácia/fluorescencia) proti koncentrácii sériovo zriedeného roztoku presne odváženého hydrochloridu histamínu. Relatívny parameter r histamínovej štandardnej krivky môže mať hodnotu 0,9998. Najnižšia zistiteľná koncentrácia histamínu je 0,5 ng/ml.

Hodnotu ED₅o peptidu je možné získať z krivky závislosti dávka - odpoveď, ktorá sa získa vynesením množstva uvoľneného histamínu proti koncentrácii peptidu na semilogaritickom papieri.

Všetky peptidové vzorky by mali byť skúšané s mastocytmi prinajmenšom od troch rôznych potkanov.

2. Skúška kutánnej anafylaktickej účinnosti (CAT)

Pri tejto skúške sa používajú zdravé dospelé potkanie samice SD (s telesnou hmotnosťou 250 g). Potkanom sa intravenózne vstriekne Evanova modrá (1 ml, 0,05 % roztoku). Ihneď nato sa potkanom do oholeného miesta na chrbte vstriekne 0,05 ml roztoku peptidu (s koncentráciou 5, 0,5 a 0,05 pg/ml) a roztoku chloridu sodného (kontrolný pokus). 30 minút po injekcii sa potkany usmrtia a prezrie sa im koža na chrbte. Priemer lézií v mm sa zmeria v dvoch na seba kolmých smeroch pomocou meradla s nóniom. Priemer je u kontrolného zvieraťa obvykle nižší ako 5,5 mm.

Môže sa tiež spektrofotometricky odmerať množstvo Evanovej modrej, ktorá prenikne do kože z ciev. Koža z oblasti lézie sa odreže a ponorí cez noc do zmesi acetónu a roztoku chloridu sodného (7 : 3, objemovo). Po odstredení sa nasledujúci deň spektrofotometricky odmeria obsah Evanovej modrej v supernatante oproti referenčnému roztoku acetón/roztok chloridu sodného (7 : 3). Na meranie sa používa spektrofotometer UV 260 a pracuje sa pri 610 nm. Každý peptid sa skúša minimálne na troch rôznych pot6 kanoch.

Opísaným spôsobom sa navrhnú a skonštruujú rôzne nové antagonisty LHRH. Nová štruktúra týchto antagonistov sa dosiahne jednoduchou alebo niekoľkonásobnou substitúciou rôznymi prirodzenými alebo neprirodzenými aminokyselinami uvedenými v predchádzajúcich odsekoch.

Časť príkladov nových antagonistov LHRH, ktoré boli týmto spôsobom získané, je ilustrovaná v tabuľke 1.

Tabuľka 1 časť príkladov podľa vynálezu

.H. líp	U ! .. 1	AA		...	Al 1	U,	A.· <	B ΙΑ 1.
TMU	Mt.-t.lH.HtS>>·.		a«t	—LU	i.ri	L··	Ar· .
				.'t	Β.Α»		11»
				.r»	βκ·»		*1»
					íľll
		OFIR			B.·»		.1,
					01..1
				Ar#	B>,.>
					B I..I		'ii
					»H«I>
		·»»«		»rf	»R»B		i.
		o.ei.k.			0.1»		Hl,
				.r.
				;;;	tm·»
					....
	Bpr.t.				ort·»		H..
	·**·				ΒΗ·Ρ
				I·.	BMIP		»<· (i.
					BT>.
					»1».
	B.C1M
	B.ci.*				_::ľ		Pip
				:::	01».l on·»
					0 J. 11
					BJ.il
					»1·»		.1.
		B.IU		tri	Bi·,
		.rr_k.		'			H·.
		»r».		*'O	0!..		...
		M.,		1.»	«...

Aplikácia vynálezu

1. Po dokončení preklinickej farmakologickej a toxikologickej štúdie sa môžu tieto nové antagonisty LHRH, ktoré majú vysokú terapeutickú účinnosť a nízke vedľajšie účinky, používať v klinickej praxi na vývoj nových liečiv, ktoré sú určené na liečbu endometriosis a porúch reprodukčného endokrinologického systému, vrátane predčasnej puberty u detí, rakoviny prostaty a rakoviny prsníka. Pretože tieto látky potláčajú sekréciou gonadotropínu tým, že súťažia o receptor s endogénnym LHRH a pôsobia rýchlo, vratne a bezpečne, je možné ich použiť pri vývoji nových antikoncepčných prostriedkov pre obidve pohlavia. Tiež sa dajú použiť na liečbu neplodnosti a selektívne a reverzibilné vyradenie podmozgovej žľazy z funkcie prostredníctvom sekrécie gonadotropínu.

Vzhľadom na to, že sa jedná o peptidové liečivá, nie je orálne podávanie antagonistov LHRH, ktoré sú opísané, pravdepodobné. Je však ľahko možné ich spracovať na lyofílizovaný prášok, ktorý je dobre rozpustný v roztoku chloridu sodného za vzniku injekčného roztoku, ktorý sa dá podávať intravenózne, subkutánne alebo intramuskuláme.

Študované je tiež použitie dlhodobo pôsobiacich dodávkových systémov, ako sú biodegradovateľné, injektovateľné kapsuly. Tieto kapsuly je možné implantovať sub kutánne pomocou špeciálnej injekčnej striekačky, pričom po uvoľnení ich celého peptidového obsahu sa absorbujú okolitým tkanivom bez toho, aby bolo nutné ich chirurgicky odstraňovať. Dlhodobé pôsobiace dodávkové systémy sú zvlášť užitočné pri dlhodobom podávaní analógov LHRH v klinickej praxi.

Ďalej sú uvedené výsledky analýz namerané v niekoľkých prípadoch, pri ktorých sa ako typické príklady použili analógy vzorca (IV), (V) a (VII).

1. Čistota

Chromatografia na tenkej vrstve (TLC) na každom chromatograme, ktorý bol vyvíjaný piatimi rôznymi rozpúšťadlovými systémami, sa vyskytuje iba jediná škvrna.

Vysoko účinná kvapalinová chromatografia (HPLC) Na každom chromatograme eluovanom dvoma rôznymi rozpúšťadlovými systémami sa vyskytuje iba jediný pík.

Hodnoty Rf a retenčné časy TR sú uvedené v tabuľke 2 spolu s odkazmi na obr. 1 až 4.

Tabuľka 2

Chromatografická analýza výsledných antagonistov LHRH

Analógy	TRI	HPLC	Rf2	TLC
TR2 (min)	Ml	RÍ3	Rf4	RÍ5
IV	7,55	5,26	0,23	0,21	0,31	0,19	0,65
V	7,90	8,11	0,32	0,30	0,35	0,30	0,69
VII	16,19	9,58	0,17	0,08	0,16	0,40	0,12

Roztok A + 80 % acetonitrilu

Rozpúšťadlový systém 2: ¹

Roztok A: 0,01M KH₂PO_4> vo vode (pH 3)

Roztok B: 20 % roztoku A + 80 % acetonitrilu

TLC rozpúšťadlový systém: ^!

1. nBuOH/EtOAc/HOAc/H₂O (5 : 5 ; 1 :1)

2. nBuOAc/nBuOH/HOAc/H₂O (2 : 8 : 2 : 3)

3. nBuOAc/HOAc/H₂O (4:1: 5), horná fáza

4. nBuOH/HOAc/H₂O (4 . 1 : 2)

5. nBuOH/EtOAc/HOAc/H₂O (1:1:1:1)

2. Analýza aminokyselín

Analýza sa uskutočňuje klasickou metódou IEN a novou metódou PICO-TAG. Výsledky sú uvedené v tabuľke 3 a na obr. 5 a 6.

Tabuľka 3

Zloženie aminokyseliny v antagonistoch LHRH

Analóg	metóda Ser	Arg	Ala	Pro	Leu	Phe Pal pCIPhe Nal
	IEN	0,86	2,05	1,01	0,99	1,13		+	+	ND
IV	PICO-
	TAG	0,92	2,25	0,91	1,01	0,91		+		·♦·
	IEN	0,81	2,02	1,03	1,03	0,12	0,99	+	+	+
V	PICO-
	TAG	0,68	2,26	0,93	1,29	1,04	1,00	+	+	♦
VI	IEN	0,91	0,91	1,00	1,00	1,09		+	+	ND

ND: nestanovená

3. Výsledky biostanovení

Výsledky biostanovení, vrátane antiovulačnej účinnosti pri rôznych dávkach a hodnôt ED₅₀ pre účinnosť vzťahujúcu sa na uvoľňovanie histamínu in vitro, sú ilustrované v tabuľke 4, v ktorej je uvedených 26 antagonistov ako príklady.

SK 281319 Β6

Tabuľka 4

Výsledky biostanovení nových antagonistov LHRH založených na rodičovskej štruktúre*

substituované’ aminokyseliny	4 ΑΟΑ/μρ	1,0 2,0	HRA E^Dsa	± SEM
0, 125 0,25	0,5
i	rod iČ	SO	7S	100	3,5	♦ 0,38
a	DPh·	29	eo	100	7,4	± 0,98
3	OPh·,DPh·			0	16,5	t 7,00
4	DTyr, Lys			40	5,1	i 2,15
9	D-Ph·			60	36 ,0	i 5,05
β	Map		29		24,8	t 4,47
3	Eap		43		12,0	í 0.50
e	Ρ·Ρ		0		9.6	£0,19
9	Bap		14		23,5	£ 5 ,78
1C	0-Map		12,3		18,3	£ 2,38
n	Tep		1 4		36,8	±5,68
12	Ptp	17 33	7 t	ioo	9 ,4	£ 1,63
13	HOp		25	100	14,7	Ϊ 2,70
14	D-M4P		1 4		19,5	£ 2,50
1 S	D-Cap		14		13 ,0	£ 1,00
14	Ď-Tap		7 1		22,5	£ 3 ,39
17	O-hlp		0	SO 57	7 ,6	£2,48
1β	D-Hop	33	67	100		t l
19	Mep		57	100	• ,4	±1,22
2 0	Eap			29	56,9	± 15,1
2 1	Pap			50 88	70, 4	£ 26 ,8
22	Bap			0	>	235
23	Tep			100	6,6	±2,13
24	P1p			43	27,5	± 2,50
25	hop			71	52,5	£ 17,5
ÍL·	Q-Hao			0	26.0	i 9.00

* Rodičovská štruktúra je: [NAc-D2Nal', DpCIPhe², D3Pal³, Ser⁴, Arg⁵, D3Pal⁶, Leu⁷, Arg⁸, Pro⁹, DAla'°]NH₂SEM = smerodajná odchýlka

Ako je ilustrované a opísané, vykazujú antagonisty LHRH navrhnuté a syntetizované podľa vynálezu veľmi dobré vlastnosti. Podľa analýz TLC alebo HPLC sú čisté. Ich zloženie je správne, t. j. zodpovedá zloženiu navrhnutému. Majú vysokú účinnosť proti plodnosti: môžu inhibovať ovuláciu potkana po subkutánnej injekcii v dávke 0,1 až 2,0 mg v čase vrcholiaceho proestra. Ich vedľajší účinok, ktorý sa prejavuje uvoľňovaním histamínu, je nízky: Hodnota ED₅₀, ktorá sa vzťahuje na účinnosť uvoľňovania histamínu in vitro (účinná dávka, ktorá má za následok uvoľnenie 50 % histamínu z mastocytov potkana) je v rozmedzí od 5 do 300 pg/mi; lézia indukovaná týmito látkami pri kutánnej anafylaktickej skúške u potkana je taká malá, ako je to nutné v klinickej praxi. Rozpustnosť týchto látok vo vode je veľmi dobrá, všetky biologické stanovenia boli vykonávané v roztokoch chloridu sodného. To sa prejavuje ľahkou spracovateľnosťou týchto látok na dlhodobo pôsobiace dodávkové systémy, z ktorých sú na dlhodobé potlačenie gonadotropínu a gonadálnych hormónov najúčelnejšie injektovateľné mikrokapsuly. Látky podľa vynálezu je teda možné používať ako vysoko účinné, reverzibilné a bezpečné antikoncepčné prostriedky pre obidve pohlavia. Tiež je možné ich používať na liečbu rôznych chorôb, ktoré majú vzťah k poruchám reprodukčného endokrinologického systému, ako je rakovina prostaty závislá od hormónov, rakovina prsníka, endometrióza a predčasná puberta detí. Účinné sú tiež pri liečbe neplodnosti. Nové antagonisty LHRH, ktoré sú predmetom tohto vynálezu, je tiež možné používať v základnom výskume reprodukčnej fyziológie a farmakológie ako pri štúdiách funkcie hypofýzy, účinku gonadálnych hormónov a gonadotropínov alebo LHRH na sexuálne správanie atď.

Skratky

V texte tohto opisu sa používajú nasledujúce skratky:

Ala AOA Arg Bap	alanín antiovulačná účinnosť arginín dibutylaminometylfenylalanín
Boe	t-butyloxykarbonyl
BuOAc	butylacetát
CAT	kutánny anafylaktický test
DCC	dicyklohexylkarbodiimid
DCM	dichlórmetán
D2Nal	D-P-(2-naftyl)alanín
D3Pal	D-p-(3-pyridyl)alanín
DpCIPhe	p-chlór-D-fenylalanín
DpFPhe	p-fluór-D-fenylalanín
D6QA1	D-P-(6-chinolyl)alanín
DMF	N,N-dimetylformami d
Eap	dimetylaminometylfenylalanín
ED50	účinná dávka 50 % odpoveď
EtOAc	etylacetát
FSH	hormón stimulujúci folikuly
Glu	glutámová kyselina
Gly	glycin
His	histidin
HOBT	1 -hydroxybenztriazol
HPLC	vysoko účinná kvapalinová chromatografia ninhydrínová derivatizácia
HRA	účinnosť na uvoľňovanie histamínu
HRT	skúška uvoľňovania histamínu
IEN	ionexová chromatografia s dodatočnou kolónou
IPA	izopropylalkohol
LH	luteinizačný hormón
LHRH	hormón uvoľňujúci luteinizačný hormón
Leu	leucín
Lys	lyzín
Map	dimetylaminometylfenylalanín
Met	metionín
Mop	morfolinometylfenylalanín
nBuOH	n-butylalkohol
NS	normálny roztok chloridu sodného
Pap	dipropylaminofenylalanín
Phe	fenylalanín
Pip	piperidinometylfenylalanín
Pipes	piperazín-N,N’-bis[2-etánsulfónová kyseli- na]
Pro	prolín
Rf	toková rýchlosť
SE	smerodajná odchýlka
Ser	serín
TFA	trifluóroctová kyselina
TLC	chromatografia na tenkej vrstve
TR	čas retencie
Trp	tryptofán
Tyr	tyrozín
Tep	tetrahydroperrolylmetylfenylalanín
NAc-D₂Nal‘	N-acetyl-D-2-haftylalanín

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

1. Peptid vykazujúci sekvenciu [NAc-DŽNal¹, AA², AA³, Ser⁴, AA⁵, D3Pal⁶, Leu⁷, AA⁸, Pro⁹, DAla¹⁰]NH₂, kde zvyšok AA² je zvolený zo súboru zahrnujúceho DpCIPhe² a DPhe², zvyšok AA³ je zvolený zo súboru zahrnujúceho D3Pal³ a DPhe³, zvyšok AA⁸ je zvolený zo súboru zahrnujúceho Arg⁸ a Pap⁸ a zvyšok AA⁵ je zvolený zo súboru zahrnujúceho Mop , Arg⁵ a Tyr⁵, pričom keď AA⁵ je Mop⁵ a potom AA² je DpCIPhe² alebo DPhe², AA³ je D3Pal³, a

SK 281319 Β6

AA⁸ je Arg⁸; keď AA⁵ je Arg⁵ a AA³ je DPhe³, potom AA²je DpCIPhe² alebo DPhe² a AA⁸ je Arg⁸; keď AA⁵ je Arg⁵ a AA³ je D3Pal³, potom AA² je DpCIPhe² a AA⁸ je Pap⁸; a keď AA⁵ je Tyr⁵, potom AA² je DpCIPhe² alebo DPhe², AA³ je DPhe³ a AA⁸ je Arg⁸.

2. Peptid podľa nároku 1, vykazujúci sekvenciu [NAc-D2Naľ, DpCIPhe², DPhe³, Ser⁴, Arg⁵, D3Pal⁶, Leu⁷, Arg⁸, Pro⁹, DAla^!o]NH₂.

3. Peptid podľa nároku 1, vykazujúci sekvenciu [NAc-D2Nal‘, DpCIPhe², DPhe³, Ser⁴, Tyr⁵, D3Pal⁶, Leu⁷, Arg⁸, Pro⁹, DAla'°]NH₂.

4. Peptid podľa nároku 1, vykazujúci sekvenciu [NAc-D2Nal\ DpCIPhe², D3Pal³, Ser⁴, Mop⁵, D3Pal⁶, Leu⁷, Arg⁸, Pro⁹, DAla¹⁰]NH₂.

5. Peptid podľa nároku 1, vykazujúci sekvenciu [NAc-D2Nal', DPhe², D3Pal³, Ser⁴, Mop⁵, D3Pal⁶, Leu⁷, Arg⁸, Pro⁹, DAla'°]NH₂.

6. Peptid podľa nároku 1, vykazujúci sekvenciu [Nac-D2Nal', DpCIPhe², D3Pal³, Ser⁴, Arg⁵, D3Pal⁶, Leu⁷, Pap⁸, Pro⁹, DAla'°]NH₂.

7. Použitie peptidu podľa niektorého z nárokov 1 až 6 na výrobu liečiva na liečenie porúch reprodukčného endokrinného systému a rakoviny prostaty a prsníka.

8. Použitie peptidu podľa niektorého z nárokov 1 až 6 na výrobu liečiva na použitie ako antikoncepčného činidla a na diagnostikáciu a liečenie neplodnosti.