DE2726276A1

DE2726276A1 - Polypeptid

Info

Publication number: DE2726276A1
Application number: DE19772726276
Authority: DE
Inventors: Anand Swaroop Dutta; Michael Brian Giles
Original assignee: Imperial Chemical Industries Ltd
Current assignee: Imperial Chemical Industries Ltd
Priority date: 1976-10-12
Filing date: 1977-06-10
Publication date: 1978-04-13
Also published as: FR2367737A1; DE2726276C2; US4124703A; GB1526367A; AU2744277A; JPS5346972A; JPS6229440B2; FR2367737B1; AU503893B2; NZ184731A

Description

Polanpeptid Priorität: 12. Okt. 76 - Großbritannien

Di· Erfindung bezieht sich auf ein Polypeptide auf seine Herstellung und auf pharmazeutische und Veterinäre Zusammensetzungen, die ein solches Polypeptid enthalten. Die Erfindung bezieht sich insbesondere auf ein Polypeptid, das die Ovulierungswirkung von Luliberin Inhibiert. Luliberin ist der international anerkannte Name für LH-RF (Luteinising Hormone Releasing Factor) (J. Biol. Chem., 1975, 2^0, 3215).

Es ist bekannt (D.H. Coy, F. Labril, M. S a vary, E. I. Coy und A.V. Schally, Molecular and Cellular Endocrinology, 1976, Jg, 201-208), daß der Einbau von D-Phenylalanin anstelle der Histidin- und Glycinreste an der 2- bzw. 6-Stellung des LuIi-

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berinmoleküls eine Verbindung, nämlich [D-Phe » D-Phe^I-LuIiberin, ergibt, die Luliberinantagonisteigenschaften besitzt. Es wurde nunmehr gefunden, daß der weitere Einbau von Azaglycin anstelle des Glycine in der 10-Stellung eines solchen Analogons eine Verbindung ergibt, die überraschenderweise ein kräftigerer Antagonist gegenüber den Wirkungen von LuIiberin ist«

Gegenstand der Erfindung sind also ein Polypeptid der Formel:

l-Glu-A-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Leu-Arg-Pro-Azgly-NH,, I

worin A für den D-Phe- oder D-Trp-Rest oder für eine direkte Bindung steht, sowie die pharmazeutisch oder Veterinär zulässigen Säureadditionasalze davon.

In der obigen Formel I und in der gesamten Beschreibung sind die Arainosäurereste durch ihre Standardabkürzungen bezeichnet (Pure and Applied Chemistry, 1974, ÜO, 317). Wenn die jeweilige Konfiguration der Aminosäure nicht angegeben ist, dann besitzt die Aminosäure, abgesehen von Azgly, die natürliche L-Konfiguration. Azgly ist die Abkürzung, die zur Beschreibung der Verbindung Azaglycin der Formel HpN.NH.COOH verwendet wird, die als Analogem von Glycin H₂N.CH₂.COOH angesehen werden kann, wobei die Methylengruppe durch eine Gruppe der Formel NH ersetzt ist. Die mit Azaglycinamid benannte Verbindung 1st somit auch als Semicarbazid H₂N.NH.CONH₂ bekannt.

Spezielle erfindungsgemäße Verbindungen sind solche, worin A für D-Phe steht, A für D-Trp steht und A für eine direkte Bindung steht.

Die bevorzugte erfindungsgemäße Verbindung ist diejenige, worin A für D-Phe steht.

Spezielle pharmazeutisch oder Veterinär zulässige Säureadditionssalze sind beispielsweise Hydrochloride, Phosphate, Citrate oder Acetate.

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Das erfindungsgemäße Polypeptid kann durch Verfahren hergestellt werden, die an sich für die Herstellung von chemisch analogen Verbindungen bekannt sind. Somit betrifft die Erfindung weiterhin die in der Folge angegebenen Verfahren, wobei A die oben angegebene Bedeutung besitzt:

(a) Entfernung ein oder mehrerer herkömmlicher Peptidschutzgruppen von einem geschützten Polypeptid, so daß eine Verbindung der Formel I entsteht.

(b) Umsetzung von Rlu-OH, mJiu-A-OH, L_Glu-A-Trp-OH, Rlu-A-Trp-Ser-OH, Qlu-A-Trp-Ser-Tyr-OH, L-Glu-A-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-OH, Rlu-A-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Leu-OH, L-Glu-A-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Leu-Arg-OHoderQlu-A-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Leu-Arg-Pro-OH oder eines geeigneten aktivierten Derivats derselben mit H-A-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Leu-Arg-Pro-Azgly-NH₂, H-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Leu-Arg-Pro-Azgly-NH₂, H-Ser-Tyr-D-Phe-Leu-Arg-Pro-Azgly-NH₂, H-Tyr-D-Phe-Leu-Arg-Pro-Azgly-NH₂, H-D-Phe-Leu-Arg-Pro-AZgIy-NH₂, H-Leu-Arg-Pro-Azgly-NH₂, H-Arg-Pro-Azgly-NH₂, H-Pro-Azgly-NH₂ bzw. H-Azgly-NH₂ oder einem geeigneten aktivierten Derivat derselben in einer Standardpeptidkupplungsreaktion.

(c) Umsetzung eines geeigneten Derivats einer Carbonsäure der Formel:

^uGlu-A-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Leu-Arg-Pro-Azgly-OH II mit Ammoniak.

Beim Verfahren (a) können so viele Schutzgruppen im Ausgangsmaterial vorliegen, als Radikale vorhanden sind, die geschützt werden müssen, beispielsweise einige oder alle derjenigen Radikale, die im Produkt als freie Radikale der Formel OH oder als basische Radikale der Formel NH vorliegen.

Beim Verfahren (a) kann die Schutzgruppe oder können die Schutzgruppen solche sein, wie sie in einem Standardhandbuch der Peptidchemie beschrieben sind, wie z.B. N. Bodansky und H.A. Ondetti, "Peptide Synthesis", Interscience, New York,

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1966, Kap. IV; F.M. Finn und K. Hofmann, "The Proteins", Bd. II, hrsg. von H. Neurath und R.L. Hill, Academic Press Inc., New York, 1976, S. 106; "Amino-acids, Peptides and Proteins" (Specialist Periodical Reports), The Chemical Society, London, Bde. 1 bis 8. Verschiedene Verfahren zur Entfernung der Schutzgruppen sind auch in diesen Büchern beschrieben.

Beim Verfahren (a) ist eine besonders brauchbare NH-Schutzgruppe das Benzyloxycarbonylradikal und ist eine besonders brauchbare OH-Schutζgruppe das Benzylradikal. Beide diese Gruppen können leicht durch Hydrogenolyse entfernt werden, beispielsweise in Gegenwart eines Palladium-auf-Holzkohle-Katalysators .

Beim Verfahren (a) ist eine weitere besonders brauchbare NH-Schutzgruppe das t-Butoxycarbonylradikal und ist eine weitere besonders brauchbare OH-Schutζgruppe das t-Butylradikal. Beide diese Gruppen können leicht durch Behandlung mit einer Säure, wie z.B. Chlorwasserstoff oder Trifluoroessigsäure, entferat werden.

Beim Verfahren (a) ist eine weitere besonders brauchbare NH-Schutzgruppe das Benzyloxycarbonyl- oder t-Butoxycarbonylradikal und ist eine besonders brauchbare OH-Schutζgruppe das t-Butylradikal· Diese Schutzgruppen können leicht durch Behandlung mit HBr in Essigsäure entfernt werden.

Das Schutzgruppenabspaltungsverfahren (a) kann auch die Abspaltung von einem Harz umfassen, das bei einer Festphasensynthese gemäß Merrifield (R.B. Merrifield, Advances in Enzymology, 1969, ^2_t 221) verwendet wird.

Beim Verfahren (b) kann Jede der Standardpeptidkupplungsreaktionen verwendet werden, beispielsweise solche, die in einem Standardhandbuch der Peptidchemie beschrieben sind, wie z.B. im obigen Handbuch von Bodansky und Ondetti, Kap. V, und in den oben erwähnten Bänden 1 bis 8 der Specialist

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Periodical Reports der Chemical Society.

Beim Verfahren (b) ist eine besondere Kupplungsreaktion eine Azidkupplung, eine Aktivesterkupplung oder eine Kupplung, bei der N_tN'-Dicyclohe3cylcarbodiimid und 1-Hydroxybenztriazol eine Holle spielen* Eine bevorzugte Kupplungsreaktion ist eine Azidkupplung, und insbesondere eine solche Kupplung, welche die Ser-Tyr-Peptidbindung bildet.

Beim Verfahren (c) ist ein geeignetes aktiviertes Derivat des Ausgangsmaterials beispielsweise ein Ester. Im Falle der Verwendung eines aktivierten Derivats kann die Reaktion dadurch zustande gebracht werden, daß man das aktivierte Derivat mit Ammoniak in Gegenwart eines Verdünnungsmittels oder Losungsmittels in Kontakt bringt.

Die Ausgangsmaterialien für die Verwendung beim erfindungsgemäßen Verfahren können aus bekannten Verbindungen durch Standardpeptidkupplungsreaktionen, durch Standardpeptidschutzreaktionen und durch Standardpeptidschutzgruppenabspaltungsreaktionen hergestellt werden, wie es Fachleuten allgemein bekannt ist, beispielsweise so, wie es in den Beispielen 1 bis 3 beschrieben ist.

Wie bereits festgestellt, besitzt das erfindungsgemäße PoIypeptid Luliberinantagonisteigenschaften, d.h., daß es die Wirkungen von Luliberin inhibiert, die Wirkungen eines normalen Hormons, das durch den Hypothalamus abgegeben wird und das auf die Hypophyse wirkt und diese zur Abgabe von Luteinisierungshormon (LH) und von Follikelstimulierungshormon (FSH) veranlaßt. Diese beiden Hypophysenhormone spielen bei der Steuerung von reproduktiven Prozessen eine Rolle, wobei letzteres, nämlich FSH, auf die Ovarien wirkt, um die Reifung von Follikeln zu fördern, und wobei ersteres, nämlich LH, die Ovulation induziert. Diese Inhibierungswirkung kann durch die Wirkung eines erfindungsgemäßen Polypeptide bei der Verhinderung einer Ovulation in mit Androgen sterilisierten Batten nit konstantem östrus demonstriert werden, wenn

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es gleichzeitig mit Luliberin (0,5 pg/Ratte) injiziert wird, oder aber durch das Vermögen, bei gleichzeitiger Dosierung mit Luliberin die Abgabe von LH und FSH in das Blutplasma von unreifen männlichen Ratten, gemessen durch doppelte Antlkörperradioimmunoassay, zu inhibieren. Das erfindungsgemäße Polypeptid kann deshalb zur Fruchtbarkeitsregelung verwendet werden.

Der obige Test an mit Androgen sterilisierten Hatten wird wie folgt ausgeführt:

Mit Androgen sterilisierte weibliche Ratten, die durch Behandlung am 3*« 4·. und 5* Tag ihres Lebens mit 100 ug Testosteronpropionat vorbereitet werden, besitzen einen beständigen östrischen Vaginalschleim und zahlreiche präovulatorische follikeln in den Ovarien. Die Verabreichung von Luliberin verursacht die Abgabe von reichlich ovulatorischem LH und FSH, was durch die Anwesenheit von Ova in den Fallopiantüben und frischen Corpora lutea in den Ovarien festgestellt werden kann. Diese Wirkung von Luliberin wird vollständig blockiert, wenn ein Polypeptid der Formel I gleichzeitig verabreicht wird.

Alle in dieser Beschreibung exemplifizierten Verbindungen zeigen keine sichtbaren toxischen Wirkungen, wenn sie in mindestens der 4fachen Menge ihrer geringsten aktiven Dosis verabreicht werden. Insbesondere die bevorzugte erfindungsgemäße Verbindung, das ist diejenige von Beispiel 1, zeigt keine sichtbaren toxischen Wirkungen, wenn sie in der 20fachen Menge ihrer geringsten wirksamen Dosis verabreicht wird.

Gemäß der Erfindung wird weiterhin eine pharmazeutische oder Veterinäre Zusammensetzung vorgeschlagen, die als aktiven Bestandteil das erfindungsgemäße Polypeptid gemeinsam mit einem pharmazeutisch oder Veterinär zulässigen Verdünnungsmittel oder Trägermittel enthält.

Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können die verschiedensten Formen aufweisen, beispielsweise eine für orale oder

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buccale Verabreichung geeignete Form, wie z.B. Tabletten, Kapseln, Lösungen oder Suspensionen; eine für nasale Verabreichung geeignete Form, wie z.B. Schnupfmittel, Nasensprays oder Nasentropfen; eine für vaginale oder rektale Verabreichung geeignete Form, wie z.B. Suppositorien; oder eine für parenterale Verabreichung geeignete Form, wie z.B. sterile injizierbare Lösungen oder Suspensionen.

Im allgemeinen können die obigen Zusammensetzungen in üblicher Weise unter Verwendung herkömmlicher Exzipienzien hergestellt werden. Jedoch kann es im Falle einer für orale Verabreichung geeigneten Zusammensetzung zweckmäßig sein, einen Belag vorzusehen, um den aktiven Polypeptidbestandteil vor den Wirkungen von Enzymen im Magen zu schützen.

Eine bevorzugte erfindungsgemäße Zusammensetzung ist eine solche für orale Verabreichung in Einheitsdosierungsform, wie z.B. eine Tablette, eine Kapsel, ein Trank oder ein Bolus, welche 25 mg bis 5 S und vorzugsweise 100 mg bis 1 g eines Polypeptide je Einheitsdosis enthalten, oder eine für parenterale Verabreichung geeignete Form, die 50 ug bis 10 mg Polypeptid je ml und vorzugsweise 100 ug bis 1 mg Polypeptid je ml Lösung enthält.

Eine parenterale Zusammensetzung ist vorzugsweise eine Lösung in isotonischer Kochsalzlösung oder in isotonischer Dextroselösung, nötigenfalls auf pH 5 bis 9 gepuffert, oder eine Lösung oder Suspension in Öl, wie z.B. in Maisöl oder polyäthoxyliertem Ricinusöl. Alternativ kann die parenterale Zusammensetzung eine solche sein, die für eine langsame Abgabe sorgt, in welchem Fall die Menge des Polypeptide je Einheitsdosierung im allgemeinen größer ist, als sie erforderlich ist, wenn eine übliche injizierbare Formulierung verwendet wird. Eine bevorzugte parenterale Formulierung mit langsamer Abgabe enthält 1 pg bis 10 mg eines Polypeptide je Einheitsdosierung.

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Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen werden im allgemeinen derart verabreicht, daß die tägliche orale Dosis 500 ug/kg bis 200 mg/kg und die tägliche parenterale Dosis, beispielsweise durch intravenöse, subkutane oder intramuskuläre Injektion oder Infusion, 2 ug/kg bis 1 mg/kg beträgt. Beim Menschen entsprechen diese Dosen einer gesamten täglichen Dosis von 35 mg bis 14 g bei oraler Verabreichung und einer gesamten täglichen Dosis von 140 ug bis 70 mg bei parenteraler Verabreichung. Bei Verabreichung über die mukösen Membranen wird die Dosis zwischen den oben für orale und parenterale Verabreichung angegebenen Dosen liegen.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert:

In den Beispielen bezieht sich R- auf die absteigende Dünnschichtchromatografie (TLC) auf Silicagelplatten (Kieselgel G). Die bei dieser Chromatografie verwendeten Lösungsmittelsysteme waren Butan-1-ol/Essigsäure/Wasser (4:1:5 V/V) (R_fA), Butan-1-ol/Essigsäure/Wasser/Pyridin (15:3:12:10 V/V) (R_fB), Butan-2-ol/3 % G/V wäßriges Ammoniumhydroxid (3:1 V/V) (R_fC), Acetonitril/Vasser (3:1 V/V) (R^D), Aceton/Chloroform (1:1 V/V) (R_fE), Chloroform/Äthanol (1:4 V/V) (R_fF), Cyclohexan/Ithylacetat (1:1 V/V) (R_fG), Cyclohexan/Äthylacetat/Methanol (1:1:1 V/V) (R_fH), Chloroform/Methanol/Wasser (11:8:2 V/V) (RfK), Chloroform/Methanol (19:1 V/V) (R_fP) und Chloroform/Methanol (9:1 V/V) (R_fQ). In all diesen Fällen wurden diese Platten unter UV-Licht untersucht und mit Fluorescamin, Ninhydrin und Chlor-Stärke-Jodid-Reagenzien behandelt. Wenn nichts anderes angegeben ist, dann besagt dies, daß durch diese Verfahren ein einziger Spot für R. ermittelt wurde.

Säurehydrolysate aller in dieser Beschreibung erhaltenen Produkte wurden dadurch hergestellt, daß das Peptid oder geschützte Peptid mit 6 η Salzsäure, die 1 % G/V Phenol enthielt, in einem verschlossen evakuierten Rohr 16 st auf 100°C erhitzt wurde. Die Aminosäurezusammensetzung eines jeden Hydrolysate wurde nit einem LoCarte-Aminosäure-Analyser bestimmt.

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Die Bestimmung stimmte in jedem Fall mit der erwarteten Zusammensetzung überein. Der Ausdruck "in der üblichen V/eise aufgearbeitet", der in diesen Beispielen verwendet wurde, besagt, daß nach der Reaktion jeder feste Rückstand durch Filtration entfernt wurde, das Filtrat unter 4-0⁰C zur Trokkene eingedampft wurde, der Rückstand in Äthylacetat mit einer 20%igen Citronensäurelösung, Wasser, gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und wiederum Wasser gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet wurde, und das Äthylacetat dann in Vakuum abgedampft wurde, wobei die Verbindung zurückblieb.

In den Beispielen wurden die folgenden Abkürzungen verwendet:

OCP - 2,4-,5-Trichlorophenylester BzI - Benzyl

Z - Benzyloxycarbonyl

BOC - t-Butoxycarbonyl

"Sephadex" ist ein Warenzeichen.

Beispiel 1 Synthese von Ij-Pyroglutamyl-D-phenylalanyl-L-tryptophyl-L-

seryl-L-tyrosyl-D-phenylalanyl-L-leucyl-L-arKinyl-Ir-prolylaza glycin-amid

Zu einer auf O⁰C abgekühlten und gerührten Suspension von 0,275 mMol L-Pyroglutamyl-D-phenylalanyl-L-tryptophyl-L-eerin-hydrazid in 1,0 ml Dimethylformamid wurde 5»92 m Chlorwasserstoff in Dioxan in einer Menge von 1,1 mMol zugegeben. Die nach einigen Minuten Rühren erhaltene klare Lösung wurde weiter auf -20⁰C abgekühlt, worauf 0,29 mMol t-Butylnitrit zugegeben wurden. Das Rühren wurde 20 min bei -20⁰C fortgesetzt, und die Lösung wurde durch Zusatz von 1,1 mMol Triäthylamin neutralisiert. Ein auf -20°C vorgekühltes Gemisch von 0,25 mMol L-Tyrosyl-D-phenylalanyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolylazaglycin-amid-dihydrochlorid (erhalten durch Hydrogenolyse von N-Benzyloxycarbonyl-O-benzyl-L-tyrosyl-D-phenylalanyl-L-leucyl-(N^<u-nitro)-L-arginyl-L-prolylaza-glycin-amid

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in 80 % V/V wäßrigem Methanol während 40 st über 5 % G/G Palladium-auf-Holzkohle in Gegenwart von 2 Äquivalenten Chlorwasserstoff) und 0,25 mMol Triethylamin in 1,0 ml Dimethylformamid wurde zugegeben. Das Gemisch wurde 24 st bei 4°C gerührt· Das Reaktionsgemisch wurde direkt auf eine "Sephadex" LH-20-Kolonne unter Verwendung von Dimethylformamid als Eluiermittel aufgegeben. Das Peptid wurde weiter durch Verteilungschromatografie auf "Sephadex" G-25 gereinigt, wobei das Lösungsmittelsystem n-Butanol/Essigsäure/Wasser/Pyridin (5:1:5:1 V/V) verwendet wurde, Ausbeute 59,2 %, R_fA 0,55» Papierelektrophorese bei pH 2,1 zeigte einen ein zigen Fleck, R^ (relativ gegenüber Luliberin) 0,46.

Die Ausgangsmaterialien für die Verwendung im obigen Verfahren können so erhalten werden, wie es im folgenden Schema 1 angegeben ist·

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4-

OJ	OJ	OJ
ac	te
2	2	2

(VJ

ac

a:

ac

se ο

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ο ac ο

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O O PQ

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OJ 33 2

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ΚΛ

ff

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Stufe . Zu einer gerührten und auf O⁰C gekühlten Suspension von 24,9 g (100 mMol) N-Benzyloxycarbonyl-L-prolin, 11»2 g (100 mMol) Semicarbazid-hydrochlorid und 14,5 ml (100 mMol) Triäthylamin in 200 ml Dimethylformamid wurden 20,6 g (100 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid zugegeben, und das Rühren wurde 16 st bei 4°C fortgesetzt. Dicyclohexylharnstoff wurde durch Filtration entfernt, und das Piltrat wurde auf ein kleines Volumen eingedampft· 200 ml Wasser wurden zugegeben, und die Lösung wurde mit 3mal je 50 ml Äthylacetat extrahiert. Das Produkt fiel aus der wäßrigen Lösung in ungefähr 1 st aus. Umkristallisation aus wäßrigem Methanol ergab das Dipeptidamid (16,5 g» 53,9 %), Fp 189 bis 190⁰C, [aj|⁴ -43,6° (c 1,4 in Dimethylformamid), R_fD 0,5*, B_fi" 0,52, R_fH 0,38, R_fK 0,78.

Stufe ^ . Katalytisch^ Reduktion über 5 % G/G Palladium-auf-Holzkohle in 80%igem (V/V) wäßrigem Dimethylformamid während 6 st bei Raumtemperatur in Gegenwart von 2 Äquivalenten Chlorwasserstoff.

Stufe ^ . Eine Lösung von 13,5 g (42,3 mMol) N^t-Butoxycarbonyl-N^i-nitro-L-arginin , 9,81 g (47 mMol) L-Prolylazaglycin-amid-hydrochlorid, 11,5 g (85 mMol) 1-Hydroxybenzotriazol und 6,58 ml (47 mMol) Triäthylamin wurde auf O⁰C abgekühlt, und 9,13 g (44,4 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid wurden zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei 4°C gerührt und zur Entfernung von festem Material filtriert, worauf das Filtrat in Vakuum zur Trockene eingedampft wurde. Der Rückstand wurde zwischen Äthylacetat und Wasser durch Gegenstromverteilung (4 Übergänge) verteilt. Die wäßrigenPhasoiwurden vereinigt und zur Trockene eingedampft, und der Rückstand wurde zwischen n-Butanol und 5%iger (G/V) wäßriger Essigsäure durch Gegenstromverteilung (12 Übergänge) verteilt. Das durch Abdampfen der vereinigten n-Butanolphasen erhaltene rohe Peptid wurde durch Silicagelkolonnenchromatografie unter Verwendung von 5%igem (V/V) Methanol in Chloroform, 10%igem (VA) Methanol in Chloroform und 20%igem (V/V) Methanol in Chloroform als Eluierlösungsmittel gereinigt. Die das Produkt

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enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und zur Trockene eingedampft, und eine wäßrige Lösung des Rückstands wurde durch eine Anionenaustauschharzkolonne (AG 1x-2) hindurchgeführt, um das N^-t-Butoxycarbonyl-N^i-nitro-arginin zu entfernen. Die Kolonne wurde dann mit Wasser gewaschen, und die vereinigten wäßrigen Phasen und die Waschflüssigkeiten wurden gefriergetrocknet, wobei das Azapeptidderivat erhalten wurde, Ausbeute 13,82 g (69 %), Fp 135-136°C, R_fA 0,49, R_fB 0,65, R_fC 0,46, R_fD 0,64, R_fF 0,35, R_fH 0,19, RfK 0,86.

Stufe ^ . Das N-t-Butoxycarbonylderivat wurde in Äthylacetat aufgelöst und mit 3 η HCl in Äthylacetatlösung (4 Äquivalente) 1 st bei Raumtemperatur behandelt.

Stufe ® . Eine Lösung von 7,41 g (24,8 mMol) N-Benzyloxycarbonyl-D-phenylalanin und 3,62 g (25 mMol) L-Leucin-methylester in 100 ml Äthylacetat wurde auf O⁰C abgekühlt, und 5,15 ß (25 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid wurden zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei 4°C gerührt. Die übliche Aufarbeitung und anschließende Umkristallisation des Rückstands aus Athylacetat/Petrolather (Kp 60-80⁰C) ergab das Dipeptid (9,1 g, 86 %), Fp 123-124⁰C, [⁰O^⁶ -18,7° (c 2,1 in Methanol), R_fD 0,76, R_fE 0,65, R_fF 0,74, R_fH 0,73.

Stufe ® . Katalytische Reduktion über 5%iger (G/G) Palladiumauf-Holzkohle in Äthanol, das 1 Äquivalent Chlorwasserstoff , enthielt, während 5 st.

Stufe ^ . Zu einer gerührten Lösung von 4,89 g (8,36 mMol) N-Benzyloxycarbonyl-0-benzyl-L-tyrosin-2,4,5-trichlorophenylester und 2,5 g (7,6 mMol) D-Phenylalanyl-L-leucin-methylester-hydrochlorid in Dimethylformamid wurden 1,1 ml (7,6 mMol) Triethylamin zugegeben, und das Rühren wurde über Nacht bei Raumtemperatur fortgesetzt. Das Triäthylaminhydrochlorid wurde abfiltriert, und das Filtrat wurde zur Trockene eingedampft· Umkristallisation des Rückstands aus wäßrigem Methanol ergab das Tripeptidderivat, 3,6 g (69,7 %), Pp bis 184°C, R_fD 0,82, R_fE 0,69, R_fH 0,78, R_fP 0,71, R_fQ 0,82.

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Stufe ^ . Eine Lösung von 3,42 g (5»04 mMol) des vorstehenden Methylesters und 60 mMol Hydrazinhydrat in 30 ml Dimethylformamid wurde 4 st bei Raumtemperatur gerührt und auf ein kleines Volumen konzentriert, worauf das Hydrezid durch Zusatz von 500 ml Wasser ausgefällt wurde. Es wurde abgetrennt, mit Wasser, Methanol/Äther (1:4 V/V) und Äther gewaschen und getrocknet. Ausbeute 2,94 g (85,9 %), Fp 179 bis 180°C, RfA 0,81, R_fB 0,79, R_fC 0,88, R_fD 0,69, R_fE 0,49, R_fF 0,65, RfH 0,67, RfP 0,25, R_fQ 0,57.

Stufen ^ und ™ . Eine Lösung von 1,83 ml (11 mMol) 6,02 m Chlorwasserstoff in Dioxan wurde zu einer Lösung von 1,86 g (2,75 mMol) N-Benzyloxycarbonyl-O-benzyl-L-tyrosyl-D-phenylalanyl-L-leucin-hydrazid in 5 ml Dimethylformamid bei -20⁰C zugegeben, worauf sich der Zusatz von 0,33 ml (2,89 mMol) t-Butylnitrit anschloß. Nach 2 min wurde eine auf -20⁰C vorgekühlte Lösung von 1,89 ml (13,5 mMol) Triethylamin und 1,02 g (2,5 mMol) N^-Nitro-L-arginyl-L-prolylaza-glycin-amidhydrochlorid in 10 ml Dimethylformamid zugegeben, und das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei 4°C gerührt. Die übliche Aufarbeitung ergab das Hexapeptidderivat, das weiter durch Silicagelkolonnenchromatografie (120 g) unter Verwendung von 5 % V/V Methanol in Chloroform, 10 % V/V Methanol in Chloroform und einem Gemisch aus Chloroform/Methanol/Wasser (11:8:2 V/V) als Eluierlösungsmitteln gereinigt wurde, Ausbeute 0,74· g (29,3 #), Fp 137-139°C, RfA 0,68, R_fB 0,72, R_fC 0,58, R_fD 0,62, R_fH 0,39, RfK 0,95.

Stufe ^ . Zu einer heftig gerührten und auf -20°C abgekühlten Lösung von 33,84 g (100 mMol) N-Benzyloxycarbonyl-L-tryptophan und 11,0 ml (100 mMol) N-Methylmorpholin in 200 ml Tetrahydrofuran wurden 9,0 ml (95 mMol) Äthylchloroformiat zugegeben. Nach 2 min wurde eine auf -20⁰C vorgekühlte Lösung von 17,10 g (110 mMol) L-Serin-methylester-hydrochlorid und 12,1 ml (110 mMol) N-Methylmorpholin in I50 ml Dimethylformamid zugegeben, und das Rühren wurde 30 min bei -20⁰C und dann 3 st bei Raumtemperatur fortgesetzt. Die übliche Aufarbeitung ergab ein Ul. Zwei Kristallisationen aus Äthyl-

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acetat/Petroläther (Kp 60-80⁰C) ergaben das Dipeptidderivat (30,53 g, 69,5 %), Fp 140,5-WC, [oc]²^ _₂2,13°C (c 1,4 in Dimethylformamid)·

Stufe ^ . Katalytische Reduktion in 80%igem (V/V) wäBrigem Dimethylformamid über 5%iger (G/G) Palladium-auf-Holzkohle während 5 st.

Stufe ^ . Eine Lösung von 2,99 g (10 mMol) N-Benzyloxycarbonyl-D-phenylalanin, 3,41 g (10 mMol) L-Tryptophyl-L-serinmethylester-hydrochlorid, 2,70 g (20 mMol) 1-Hydroxybenzotriazol und 1,40 ml (11 mMol) Triethylamin in Dimethylformamid wurde auf 0⁰C abgekühlt, und 2,27 g (11 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid wurden zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 72 st bei Raumtemperatur gerührt und dann in der üblichen Weise aufgearbeitet. Der Rückstand wurde aus heißem Äthylacetat umkristallisiert. Ausbeute 4,89 g (83,4 %), Pp 195-197°C, 0,86, R_fB 0,81, R_fC 0,85, R_fD 0,72, R^ 0,37, R_fF 0,63, 0,67, R_fP 0,15, R_fQ 0,53.

Stufe vy . Katalytische Reduktion mit 5%iger (G/G) Palladiumauf-Holzkohle in einem Gemisch aus Ithanol/Dlmethylformamid (1:1 V/V) während 5 st bei Raumtemperatur in Gegenwart von 1,1 Äquivalenten Chlorwasserstoff.

Stufe ^? . Eine Lösung von 2,62 g (8,5 mMol) L-Pyroglutaminsäure^, 4,5-trichlorophenylester, 3,75 g (7,7 mMol) D-Phenylalanyl-L-tryptophyl-Ii-serin-methylester-hydrochlorid und 1,08 ml (7,7 mMol) Triethylamin in 30 ml Dimethylformamid wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt und dann in Vakuum zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde mit Äthylacetat und Wasser trituriert und abfiltriert, mit Methanol/ Äther (1:5 V/V) und Äther gewaschen und getrocknet. Das rohe Peptid wurde aus Methanol/Äther kristallisiert. Dabei wurde das Tetrapeptidderivat erhalten, 2,15 g.(49,3 %),Pp 194-196°C, 0,68, R_fB 0,76, R_fC 0,70, R_fD 0,66, R_fH 0,38, R_fQ 0,18.

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Stufe ^ . Eine Lösung von 2,03 g (3,6 mMol) L-Pyroglutamyl-D-phenylalanyl-L-tryptophyl-L-serin-methylester in 20 ml Dimethylformamid wurde mit 72 mMol Hydrazinhydrat behanelt. Nach 6 st wurde das Lösungsmittel durch Abdampfen in Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde mit Wasser trituriert, abfiltriert, mit Wasser, Methanol/Äther (1:5 VA) und Äther gewaschen und getrocknet, wobei das Tetrapeptidhydrazid erhalten wurde, 173 g (84,7 %), Fp 234°C (Zersetzung), R^ 0,58, R_fB 0,81, R_fC 0,58, R_fD 0,66, R^ 0,70.

Beispiel 2 Synthese von L-Pyroglutamyl-D-tryptophyl-L-tryptophyl-L-seryl- L-tyrosyl-D-phenylalanyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolylaza-

glycin-amid

30 ul (0,25 mMol) t-Butylnitrit wurden zu einer auf -20⁰C abgekühlten und gerührten Lösung von 15^ mg (0,25 mMol) L-Pyroglutamyl-D-tryptophyl-L-tryptophyl-L-serin-hydrazid und 170 ul (1 mMol) 5,9 m HCl in Dioxan in 2 ml Dimethylformamid zugegeben. 142 ul (1 mMol) Triäthylamin wurden nach 20 min zugesetzt, worauf sich der Zusatz einer auf -20⁰C vorgekühlten Lösung von 197 mg (0,25 mMol) L-Tyrosyl-D-phenylalanyl-L-leucyl-Ii-arginyl-L-prolylaza-glycin-amid-dihydrochlorid (hergestellt-wie in Beispiel 1) und 36 μΐ (0,25 mMol) Triäthylamin in 2 ml Dimethylformamid anschloß. Das Reaktionsgemisch wurde bei 4°C über Nacht gerührt. Es wurde dann auf eine "Sephadex" LH-20-Kolonne aufgebracht, die dann mit Dimethylformamid eluiert wurde. Das Peptid wurde weiter durch Verteilungschromatografie auf "Sephadex" G-25 gereinigt, wobei das Lösungsmittelsystem n-Butanol/Essigsäure/Wasser/Pyridin (5:1:5:1 V/V) verwendet wurde, Ausbeute 30 %_% R_fA 0,49, Papierelektrophorese bei pH 2,1 und 6,5 zeigte einen einzigen Spot, R_f (relativ zu Luliberin) 0,48 (pH 2,1), 0,23 (pH 6,5).

Die im obigen Verfahren verwendeten Ausgangsmaterialien können so erhalten werden, wie es im folgenden Schema 2 angegeben ist.

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r-t

to-

bO U"

Q)

(M

CM

CVJ

CQ

CAJ

CO

u a>

(U

r—o

- 17 80981 5/0520

IO

Stufe ^y . Wie Stufe ^ . Umkristallisiert aus Methanol. Aus beute C8 %, Fp 150-151⁰C, R₁Jl 0,80, R_fB 0,78, R_fC 0,86, R_fD 0,74, R_fE 0,33, R_fP 0,69, R_fH 0,69, R_fQ 0,35-

Stufe ^ . Katalytische Reduktion mit 5%iger(G/G) Palladiumauf Holzkohle in 80%igem (V/V) wäßrigem Dimethylformamid während 5 st bei Raumtemperatur in Gegenwart von 1 Äquivalent Chlorwasserstoff.

Stufe ™ . Wie Stufe ^ . Ausbeute 85 %, Fp 244-246°C, R_fA 0,67, R_fB 0,74, R_fG 0,68, R_fD 0,65-

Stufe ^y . Wie Stufe ™ . Ausbeute 86,1 %, Fp 234-235°C

Beispiel 3

Synthese von L-PyroKlutaniyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-phenylalanyl-L-leucyl-L-arKinyl-L-prolylaza-glycin-amid

Eine Lösung von 104 mg (0,25 mMol) L-Pyroglutamyl-L-tryptophyl-L-serin-hydrazid in 2 ml Dimethylformamid wurde auf -20°C abgekühlt, und 170 pl (1,0 mMol) 5,9 m HCl in Dioxan wurden zugegeben, worauf sich der Zusatz von 30 ul (0,275 mMol) t-Butylnitrit anschloß. Nach 20 min Rühren wurde die Lösung mit 142 ul (1,0 mMol) Triäthylamin neutralisiert. Ein auf -20⁰C vorgekühltes Gemisch von 197 mg (0,25 mHol) L-Tyrosyl-D-phenylalanyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolylaza-glycin-amid-dihydrochlorid (hergestellt wie in Beispiel 1) und 36 pl (0,25 mMol) Triäthylamin in 2 ml Dimethylformamid wurde zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 24 st bei 4°C gerührt und dann direkt auf eine "Sephadex" LH-20-Kolonne aufgebracht. Die Kolonne wurde mit Dimethylformamid eluiert. Das Peptid wurde weiter durch Verteilungschromatografie auf "Sephadex" G-25 gereinigt, wobei das Lösungsmittelsystem n-Butanol/Essigsäure/Wasser (4:1:5 V/V) verwendet wurde, Ausbeute 32 %, R^ 0,45, Papierelektrophorese bei pH 2,1 und 6,5 zeigte einen einzigen Spot, R_f (relativ zu Luliberin) 0,57 (pH 2,1) bzw. 0,66 (pH 6,5).

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Die im obigen Verfahren verwendeten Ausgangsmaterialien können erhalten werden, wie es im folgenden Schema 3 angegeben ist.

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ti

SiO -

f\J

60

U CU

OJ

2:

OJ

33

OJ

bO U

ZS

CU I Q

CQ

Φ CO

a u

φ ε:

CU

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Stufe ^ . Eine Lösung von 3,4- g (11 mMol) L-Pyroglutaminsäure-2,4,5-trichlorophenylester, 3»42 g (10 mMol) L-Tryptophanyl-L-serin-methylester-hydrochlorid und 1,42 ml (10 mMol) Triethylamin in 30 ml Dimethylformamid wurde 48 st bei Raumtemperatur stehen gelassen. Dimethylformamid wurde in Vakuum abgetrennt, und der Rückstand wurde mit Äthylacetat/Wasser trituriert, gesammelt, mit Wasser, Methanol/Äther (5:1 V/V) und Äther gewaschen und getrocknet. Ausbeute 1,82 g (43,6 %), Pp 198°C, R₁JL 0,64, R_fB 0,73, R_fC 0,63, R_fD 0,64, R_fH 0,28, R_fQ 0,11.

Stufe ^ . Eine Lösung von 1,66 g (4 mMol) L-Pyroglutamyl-L-tryptophanyl-L-serin-methylester in 20 ml Dimethylformamid wurde mit 20 mMol Hydrazinhydrat 24 st lang bei Raumtemperatur behandelt. Das Lösungsmittel wurde in Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde aus Methanol kristallisiert. Dabei wurde das Tripeptidhydrazid erhalten, Ausbeute 1,09 g (68 %), Ep 230-231^eC (Zersetzung).

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Claims

Patentansprüche:

/ 1 .j Polypeptid der Formel:

LGlu-A-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Leu-Arg-Pro-Azgly-NHp I

worin A für D-Phe, D-Trp oder eine direkte Bindung steht, sowie die pharmazeutisch und Veterinär zulässigen Säureadditionssalze davon.
2. Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß A für D-Phe steht.
3· Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß A für D-Trp steht.
4. Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß A für eine direkte Bindung steht.
5_# Verfahren zur Herstellung eines Polypeptide nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man

(a) ein oder mehrere herkömmliche Peptidschutzgruppen von einem geschützten Polypeptid entfernt, so daß eine Verbindung der Formel I entsteht;

(b) GIu-OH, GIu-A-OH, Glu-A-Trp-OH, Glu-A-Trp

Ser-OH, ßi_u-A-Trp-Ser-Tyr-OH ,Rlu-A-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-OH , Glu-A-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Leu-OH ,Qlu-A-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Leu-Arg-OH, Gjlu-A-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Leu-Arg-Pro-OH, .oder ein geeignetes aktiviertes Derivat davon mit H-A-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Leu-Arg-Pro-Azgly-NH₂ »H-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Leu-Arg-Pro-Azgly-NH₂,H-Ser-

Tyr-D-Phe-Leu-Arg-Pro-Azgly-N^.H-Tyr-D-Phe-Leu-Arg-Pro-Azgly-NH₂,H-D-Phe-Leu-Arg-Pro-Azgly-NH₂,H-Leu-Arg-Pro-Azgly-NH₂,H-Arg-PrO-AZgIy-NH₂₄H-PrO-AZgIy-NH_{2 b2W#} H-Az₈Iy-NH₂ oder einem

geeigneten aktivierten Derivat davon in einer Standardpeptidkupplungsreaktion umsetzt; oder

(c) ein geeignetes Derivat der Carbonsäure der Formel:

*—Glu-A-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Leu-Arg-Pro-Azgly-OH II mit Ammoniak umsetzt.

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ORIGINAL INSPECTEO
6. Pharmazeutische oder Veterinäre Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Polypeptid nach Anspruch 1
gemeinsam mit einem nicht-giftigen pharmazeutisch oder
Veterinär zulässigen Verdünnungsmittel oder Trägermittel enthält.
7. Zusammensetzung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine für orale Verabreichung geeignete Form aufweist.
8. Zusammensetzung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine für parenterale Verabreichung geeignete Form aufweist.

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