DE3700166A1 - In der 6-stellung einen aromatischen aminocarbonsaeurerest aufweisende nonapeptidaethylamide beziehungsweise decapeptidamide, verfahren zur herstellung derselben und diese enthaltende arzneimittel beziehungsweise vermehrungsbiologisch wirksame mittel sowie ihre verwendung - Google Patents

In der 6-stellung einen aromatischen aminocarbonsaeurerest aufweisende nonapeptidaethylamide beziehungsweise decapeptidamide, verfahren zur herstellung derselben und diese enthaltende arzneimittel beziehungsweise vermehrungsbiologisch wirksame mittel sowie ihre verwendung

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DE3700166A1
DE3700166A1 DE19873700166 DE3700166A DE3700166A1 DE 3700166 A1 DE3700166 A1 DE 3700166A1 DE 19873700166 DE19873700166 DE 19873700166 DE 3700166 A DE3700166 A DE 3700166A DE 3700166 A1 DE3700166 A1 DE 3700166A1
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Istvan Dr Teplan
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Description

Die Erfindung betrifft neue in der 6-Stellung einen aromatischen Aminocarbonsäurerest aufweisenden Nonapeptidäthylamide beziehungsweise Decapeptidamide, ein Verfahren zur Herstellung derselben und diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel, insbesondere mit das luteinisierende und das follikelstimulierende Hormon freisetzenden Wirkung, beziehungsweise vermehrungsbiologisch wirksame Mittel sowie ihre Verwendung.
Die in diesem Text in den Formeln verwendeten Abkürzungen entsprechen der in der Peptidchemie akzeptierten Nomenklatur, wie sie zum Beispiel in J. Biol. Chem., 241 [1966], 527 definiert ist. Die in diesem Text vorkommenden Abkürzungen haben dementsprechend folgende Bedeutung:
Allgemeine Begriffe
HPLC:Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie TLC:Dünnschichtchromatographie UV:Ultraviolett
Dabei sind unter den Aminosäuren beziehungsweise Aminosäureresten oben und im folgenden die betreffenden L-Aminosäuren beziehungsweise L-Aminosäurereste zu verstehen.
Es ist eine allgemeine Eigenschaft des Gonadoliberines (Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2; im Fachschrifttum auch als Gonadotropin freisetzendes [releasing] Hormon, GnRH sowie als das luteinisierende und follikelstimulierende Hormon freisetzendes Hormon, [LH/FSH-RH] bezeichnet) und seiner bekannten Derivate, das luteinisierende und das follikelstimulierende Hormon (LH und FSH) freizusetzen.
Zu Beginn der achtziger Jahre wurde bekannt, daß sich die Struktur des Gonadoliberines bestimmter Fische und Vögel von der Gonadoliberinstruktur der Säugetiere unterscheidet (J. A. King und R. P. Miller, J. Biol. Chem. 257 [1982], 10 722 bis 10 728; South-African Journal of Science 78[1982], 124; N. Sherwood und Mitarbeiter, Proc. Natl. Acad. Sci. 80[1983], 2 794 bis 2 798). Diese Abweichungen betreffen im Falle der Vögel die Aminosäure in der 8-Stellung und im Falle der Fische die Aminosäure in der 7- beziehungsweise 8-Stellung.
Aus dem Schrifttum ist auch bekannt, daß die Gonadoliberinderivate, die in der 6-Stellung statt des Glycines eine D-Aminosäure mit hydrophober aliphatischer oder aromatischer Seitenkette enthalten, eine im Vergleich zu Gonadoliberin stärkere Wirkung zeigen (J. Sandow und Mitarbeiter, Control of Ovulation, Butterworth, Londen, 1978, Seiten 49 bis 70; A. V. Schally, D. H.Coy, D. A. Meyers, Ann. Rev. Biochem. 47 [1978], 89 bis 128).
Ferner ist es bekannt, daß die biologische Wirkung des Gonadoliberines noch erhöht werden kann, wenn die Glycinamidgruppe in der 10-Stellung durch eine aliphatische Amidgruppe ersetzt wird (M. Fujino und Mitarbeiter, J. Med. Chem. 16 [1973], 1 144 bis 1 147).
Von Momany (F. A. Momany, J. Amer. Chem. Soc. 98 [1976], 2 990 bis 2 996 und J. Amer. Chem. Soc. 98 [1976], 2 996 bis 3 000 wurde der Energieinhalt der unterschiedlichen möglichen Konformationen des Decapeptides untersucht und nachgewiesen, daß der niedrigste Energieinhalt bei einer räumlichen Anordnung, in der das Molekül bei dem Glycin oder D-Alanin in der 6-Stellung U-förmig gebogen ist (β-turn), auftritt. Von anderen Forschern (R. M. Freidinger, D. F. Veber, P. D. Schwenk, J. R. Brooks, R. Saperstein, Science 210 [1980], 656 bis 658) wurde ein GnRH-Derivat der Formel in welchem diese Raumstruktur durch Austausch des Glycines in der 6-Stellung gegen γ-Lactam fixiert wurde, synthetisiert.
Im Vergleich zum nativen Gonadoliberin hat diese Verbindung eine größere biologische Wirksamkeit.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue Gonadoliberinderivate bereitzustellen, die eine vorteilhaftere pharmakologische beziehungsweise biologische, insbesondere das luteinisierende und follikelstimulierende Hormon freisetzende, Wirkung zeigen als die bekannten Verbindungen und nicht nur im Falle von Säugetieren, sondern auch zur Vermehrung anderer Gattungen, zum Beispiel Fischen und Reptilien, geeignet sind, wobei bei ihnen an der Stelle des in der 6-Stellung befindlichen Glycines eine Aminosäure, die nicht nur die vorteilhafteste Raumstruktur fixiert, sondern daneben auch den die biologische Wirkung steigernden aromatischen Ring enthält und nicht zur Racemisierung neigt, eingebaut ist, ein Verfahren zu deren Herstellung und diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel beziehungsweise vermehrungsbiologisch verwendbare Mittel sowie ihre Verwendung zu schaffen.
Das Obige wurde überraschenderweise durch die Erfindung erreicht.
Die Erfindung beruht auf der überraschenden Feststellung, daß das Obige erreicht werden kann, wenn an Stelle der in der 6-Stellung befindlichen Glycingruppe des Gonadoliberines o-Aminobenzoesäure (Anthranilsäure) oder m-Aminobenzoesäure eingebaut wird. Im ersteren Fall ist es die Verbindung der Formel und im letzteren Fall die Verbindung der Formel
Ferner beruht die Erfindung auf der überraschenden Feststellung, daß die Wirkung dieser Gonadoliberinderivate noch weiter gesteigert werden kann, wenn die in der 10-Stellung befindliche Glycinamidgruppe gegen eine Alkylamidgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatom(en) ausgetauscht wird.
Schließlich beruht die Erfindung auf der überraschenden Feststellung, daß beim Austausch der im Gonadoliberin in der 8-Stellung beziehungsweise in der beziehungsweise den 7- und/oder 8-Stellung(en) befindlichen Aminosäure(n) gegen bestimmte andere Aminosäuren Gonadoliberinderivate, die nicht nur zur Vermehrung von Säugetieren, sondern auch zur Vermehrung anderer Gattungen geeignet sind, erhalten werden.
Gegenstand der Erfindung sind daher neue in der 6-Stellung einen aromatischen Aminocarbonsäurerest aufweisende Nonapeptidäthylamide beziehungsweise Decapeptidamide der allgemeinen Formel
Glp-His-Trp-Ser-Tyr-X1-X2-X3-Pro-X4 (I)
worin,
X1 einen o-Aminobenzoesäure- oder m-Aminobenzoesäurerest darstellt,
X2 für einen Rest von Leucin, Tryptophan oder Phenylalanin steht,
X3 einen Rest von Arginin, Leucin oder Glutamin bedeutet,
X4 einen Glycylamid- oder Äthylamidrest darstellt,
Glp für einen Rest von Pyroglutaminsäure steht,
His einen Rest von Histidin bedeutet,
Trp einen Rest von Tryptophan darstellt,
Ser für einen Rest von Serin steht,
Tyr einen Rest von Tyrosin bedeutet und
Pro einen Rest von Prolin darstellt,
sowie ihre Säureadditionssalze.
Bei diesen in der 6-Stellung einen aromatischen Aminocarbonsäurerest aufweisenden Nonapeptidäthylamiden beziehungsweise Decapeptidamiden handelt es sich anders ausgedrückt um in der 6-Stellung einen aromatischen Aminocarbonsäurerest aufweisende Gonadoliberinderivate.
Besonders bevorzugte erfindungsgemäße Nonapeptidäthylamide beziehungsweise Decapeptidamide sind
[Aa6,Gln8,desGly10]-gonadoliberinäthylamid,
worin
Aa für einen Rest von Anthranilsäure steht,
desGly das Fehlen des Glycylrestes von Gonadoliberin bedeutet,
Gln einen Rest von Glutamin darstellt und
die Zahlen die betreffenden Stellungen des Gonadoliberines mit den angegebenen Abweichungen von ihm bedeuten,
[Aa6,desGly10]-gonadoliberinäthylamid,
worin
Aa für einen Rest von Anthranilsäure steht,
desGly das Fehlen des Glycylrestes von Gonadoliberin bedeutet und
die Zahlen die betreffenden Stellungen des Gonadoliberines mit den angegebenen Abweichungen von ihm bedeuten,
[Mab6]-gonadoliberin,
worin
Mab für einen Rest von m-Aminobenzoesäure steht und
die Zahl 6 die 6-Stellung des Gonadoliberines mit der angegebenen Abweichung von ihm bedeutet,
[Aa6]-gonadoliberin,
worin
Aa für einen Rest von Anthranilsäure steht und
die Zahl 6 die 6-Stellung des Gonadoliberines mit der angegebenen Abweichung von ihm bedeutet,
[Aa6,Trp7,Leu8-gonadoliberin,
worin
Aa für einen Rest von Anthranilsäure steht,
Trp die oben angegebene Bedeutung hat,
Leu einen Rest von Leucin darstellt und
die Zahlen die betreffenden Stellungen des Gonadoliberines mit den angegebenen Abweichungen von ihm bedeuten, und
[Mab6, Phe7, Gln8]-gonadoliberin
worin
Mab für einen Rest von m-Aminobenzoesäure steht,
Phe einen Rest von Phenylalanin bedeutet,
Gln einen Rest von Glutamin darstellt und
die Zahlen die betreffenden Stellungen des Gonadoliberines mit den angegebenen Abweichungen von ihm bedeuten,
sowie ihre Säureadditionssalze.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen, welche dadurch gekennzeichnet ist, daß
  • a) die passenden, gegebenenfalls geschützten, Aminosäuren beziehungsweise Salze beziehungsweise Derivate derselben mittels schrittweiser Kondensation und/oder Fragmentkondensation in entsprechender Kombination kondensiert und die gegebenenfalls vorhandenen Schutzgruppen entfernt werden oder
  • b) unter Anwendung des Verfahrens der Peptidsynthese an einer festen Phase die passenden, gegebenenfalls geschützten, Aminosäuren beziehungsweise Salze beziehungsweise Derivate derselben in der entsprechenden Reihenfolge schrittweise an einen festen Träger kondensiert, die Endprodukte sauer oder basisch von dem festen Träger abgespalten die gegebenenfalls vorhandenen Schutzgruppen vor, während oder nach dem Abspalten entfernt werden,
worauf gegebenenfalls in an sich bekannter Weise die gegebenenfalls erhaltenen Nonapeptidäthylamide beziehungsweise Decapeptidamide der allgemeinen Formel I in Säureadditionssalze überführt werden und/oder gegebenenfalls in an sich bekannter Weise die gegebenenfalls erhaltenen Säureadditionssalze der erhaltenen Nonapeptidäthylamide beziehungsweise Decapeptidamide der allgemeinen Formel I in die entsprechenden freien Nonapeptidäthylamide beziehungsweise Decapeptidamide der allgemeinen Formel I und/oder in andere Salze überführt werden.
Besonders vorteilhaft wird, insbesondere bei der Variante a) des erfindungsgemäßen Verfahrens ein geschütztes Pentapeptidazid der Formel
Glp-His-Trp-Ser-Tyr-N3
worin Glp, His, Trp, Ser und Tyr die oben angegebenen Bedeutungen haben, mit einem Tetra- oder Pentapeptid der allgemeinen Formel
X1-X2-X3-Pro-X4
worin X1 , X2, X3 und X4 die oben angegebenen Bedeutungen haben, kondensiert.
Zweckmäßig wird die schrittweise Kondensation an einen festen Träger gemäß der Variante b) des erfindungsgemäßen Verfahrens mittels Carbodiimid- oder Aktivesterkopplung durchgeführt.
Nach der Variante b) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird zweckmäßig als fester Träger ein Benzhydrylaminharz oder chlormethyliertes Polystyrolharz verwendet. Ferner wird zweckmäßig das Abspalten des Schutzgruppen aufweisenden Endproduktes vom Träger durch Behandeln mit Fluorwasserstoff oder durch Äthylammonolyse durchgeführt.
Zweckmäßig sind die Salze der erfindungsgemäßen Nonapeptidäthylamide beziehungsweise Decapeptidamide solche mit physiologisch verträglichen Säuren.
Gegenstand der Erfindung sind auch Arzneimittel beziehungsweise vermehrungsbiologisch verwendbare Mittel, welche durch einen Gehalt an 1 oder mehr erfindungsgemäßen Verbindung(en) als Wirkstoff(en), zweckmäßig zusammen mit 1 oder mehr üblichen pharmazeutischen Träger-, Streck- und/oder Hilfsstoff(en) gekennzeichnet sind. Diese können in an sich bekannter Weise hergestellt werden, zum Beispiel in der Weise, daß erfindungsgemäße Nonapeptidäthylamide und/oder Decapeptidamide der allgemeinen Formel 1 und/oder ihre Säureadditionssalze mit üblichen Träger-, Streck- und sonstigen Hilfsstoffen vermischt und zu für Heilzwecke und/oder vermehrungsbiologische Zwecke geeigneten Präparaten zubereitet werden.
Die erfindungsgemäßen Nonapeptidäthylamide und/oder Decapeptidamide der allgemeinen Formel I und/oder ihre Säureadditionssalze werden Rindern zweckmäßig in Dosen von 5 bis 200 µg intramuskulär, subkutat oder intravenös injiziert. Für Fische beträgt die als intramuskuläre oder subkutane Injektion verabreichte Dosis zweckmäßig 0,1 bis 100 µg.
Die Hauptvorteile der Erfindung sind wie folgt:
  • A) Die erfindungsgemäßen Gonadoliberinderivate sind, wie an Rindern und Fischen vorgenommene vermehrungsbiologische Versuche ergaben, wirksamer als die bekannten Gonadoliberinderivate.
  • B) Die in der 6-Stellung befindliche Aminobenzoesäure weist kein Asymmetriezentrum auf, das heißt, daß es zu keiner Racematbildung kommen kann. Dadurch ist das Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Gonadoliberinderivate einfacher und mit weniger Aufwand verbunden.
  • C) o- und m-Aminobenzoesäure sind mit wesentlich weniger Aufwand herstellbar als die in den bekannten Gonadoliberinderivaten die gleiche Funktion ausübenden D-Aminosäuren.
  • D) Bei der Variante a) des erfindungsgemäßen Verfahrens können sämtliche Endprodukte aus einem einzigen Zwischenprodukt, nämlich dem Pentapeptid, von welchem sich das Pentapeptidozid der Formel II ableitet, hergestellt werden.
Die Erfindung wird an Hand der folgenden Beispiele näher erläutert. Die dünnschichtchromatographischen R f -Werte wurden an Kieselgel (DC Alufolie, Merck) mit folgenden Lösungsmittelgemischen bestimmt:
Beispiel 1
[Aa6,Gln8,desGly10]-gonaliberinäthylamid {Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Aa-Leu-Gln-Pro-NHEt}
a) Boc-His(DNP)-Trp-OMe (M = 622,62)
21,12 g (50 mMol) Boc-His(DNP)-OH werden in 100 ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird auf 0°C gekühlt und unter Rühren mit 10,32 g (50 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid und 7,66 g (50 mMol) N-Hydroxybenztriazol versetzt. Das Gemisch wird bei 0°C 10 Minuten lang gerührt und dann der ausgefallene Dicyclohexylharnstoff abfiltriert.
12,74 g (50 mMol) H-Trp.OMe.HCl werden in 70 ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird auf 0°C gekühlt und mit 6,94 g (50 mMol) Triäthylamin versetzt. Man rührt 5 Minuten und filtriert dann vom ausgefallenen Triäthylamin-hydrochlorid ab.
Die beiden Lösungen werden vereinigt und über Nacht bei 0°C gerührt. Anderntags wird der ausgefallene DCU abfiltriert und die Lösung zur Trockne eingedampft. Der ölige Rückstand wird in 500 ml Äthylacetat gelöst. und die Lösung wird dreimal mit 100 ml eiskalter einmolarer Kaliumbisulfatlösung, dann fünfmal mit gesättigter Natriumbiscarbonatlösung und schließlich zweimal mit 100 ml 10 Gew.-%iger Kochsalzlösung ausgeschüttelt. Die organische Phase wird über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und dann zur Trocke eingedampft. Die kristalline Substanz wird aus Äthylacetat unter Zugabe von Petroläther umkristallisiert. Man erhält 27,70 g (89%) der Titelverbindung, die bei 119-122°C schmilzt. [α] = +14,1° (c = 1, DMF)R = 0,62; R = 0,41.
b) H-His(DNP)-Trp-OMe.2HCl
Molekulargewicht der freien Base: 522,49
Molekulargewicht des Dihydrochlorids: 595,41
24,9 g (40 mMol) des Dipeptids Boc-His(DNP)-Trp-OMe werden in 100 ml Methanol gelöst und zu der Lösung 100 ml 4n methanolische Salzsäure gegeben. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur 30 Minuten lang stehengelassen, wobei das Dipeptidesterhydrochlorid ausfällt. Es wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und dann getrocknet.
Ausbeute: 21,91 g (92%), Schmp.: 198-202°C.[α] = 0,49° (c = 1, DMF), R = 0,46; R = 0,18.
c) Glp-His(DNP)-Trp-OMe (M = 633,60)
4,85 g (36,8 mMol) L-Pyroglutaminsäure, 7,58 g Dicyclohexylcarbodiimid und 5,63 g N-Hydroxybenztriazol werden in 100 ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird bei 5-10°C 10 Minuten lang gerührt, dann wird der ausgefallene DCU abfiltriert.
20,84 g (35 mMol) H-His(DNP)-Trp-OMe.2HCl werden in 100 ml Dimethylformamid gelöst und zu der Lösung 9,72 ml (70 mMol) Triäthylamin zugegeben. Nach 5 Minuten Rühren wird das Triäthylaminhydrochlorid abfiltriert. Die beiden Lösungen werden vereinigt und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Anderntags wird das Gemisch mit 90 ml Aceton versetzt, die sich ausscheidende unlösliche Substanz wird abfiltriert. Die durch Verdampfen des Filtrates erhaltene ölige Substanz wird mit Äthylacetat verrieben, filtriert und dann getrocknet. Nach dem Trocknen werden die Kristalle dreimal mit 25 ml Wasser gewaschen und erneut getrocknet. Die Substanz kann durch Auflösen in kochendem Äthylacetat und Abkühlen der Lösung umkristallisiert werden. Ausbeute: 18,42 g (83,1%)Schmp.: 148-151°C, [α] = +5,2° (c = 1, DMF)R = 0,53; R = 0,38.
d) Glp-His-Trp-OMe (M = 466,50)
15,84 g (25 mMol) des geschützten Tripeptids Glp-His(DNP)-Trip-OMe werden in einem Gemisch aus 100 ml Dimethylformamid und 40 ml Wasser gelöst. Zu der Lösung werden 4 ml Mercaptoäthanol zugegeben, und der pH-Wert wird mit Triäthylamin auf 8 eingestellt. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur 30 Minuten lang stehengelassen und dann im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der ölige Rückstand wird mit Äther verrieben, filtriert und getrocknet. Die Substanz wird in wenig Methanol gelöst und durch Zusatz von Äther umkristallisiert.Ausbeute: 10,92 g (93,6%), [α] = +4,04° (c = 0,42, DMF), R = 0,30
e) Glp-His-Trp-N2H3 (M = 466,51)
9,33 g (20 mMol) des Tripeptids Glp-His-Trp-OMe werden in 250 ml Methanol gelöst und zu der Lösung 20 ml 98%iges Hydrazinhydrat zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird bei 40°C 3 Stunden lang, bei Raumtemperatur über Nacht gerührt, am nächsten Tag wird das Produkt abfiltriert, mit kaltem Methanol gewaschen und dann getrocknet. Ausbeute: 7,58 g (81,2%), Schmp.: 166-169°C, [α] = -22,3° (c = 0,5, DMF)R = 0,50; R = 0,14.
f) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-OMe (M = 716,8)
7,0 g (15 mMol) Glp-His-Trp-N2H3 (Produkt des Schrittes e) werden in 60 ml DMF gelöst und zu der auf 0°C gekühlten Lösung unter Rühren 7,5 ml (45 mMol) 6 n Salzsäure zugegeben. Dann werdenn langsam 1,035 g (15 mMol) Natriumnitrit in Form einer wäßrigen gesättigten Lösung zugetropft. Das Gemisch wird bei 0°C weitere 15 Minuten lang gerührt und dann mit der Lösung von 4,78 g (15 mMol) H-Ser-Tyr-OMe.HCl in 15 ml DMF versetzt. Der pH-Wert wird mit 6,25 ml (45 mMol) Triäthylamin auf neutral eingestellt, das Gemisch bei 0-4°C über Nacht gerührt und anderntags im Vakuum zur Trockne eingedampft. Das ölige Produkt wird mit Äther verrieben. Man erhält 12,1 g (100%) einer pulverförmigen Substanz, deren Chromatogramm zwar zwei geringfügige Verunreinigungen ausweist, die jedoch ohne weitere Reinigung zu dem gut kristallisierenden Hydrazid umgesetzt werden kann. Eine aus Methanol umkristallisierte Kontrollprobe der Substanz hat folgende physikalische Parameter:
Schmp.: 188-190°C, [α] = -3,48° (c = 1, DMF)R = 0,58; R = 0,26.
g) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-N2H3 (M = 716,8)
12 g roher, pulverisierter Pentapeptidester Glp-His-Trp-Ser-Tyr-OMe werden in 200 ml Methanol gelöst und zu der Lösung 10 ml 98%iges Hydrazinhydrat zugegeben. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Die Kristalle werden abfiltriert und im Exsikkator über konzentrierter Schwefelsäure getrocknet. Die getrocknete kristalline Substanz wird in 250 ml 0,5 n Salzsäure gelöst. Die Lösung wird mit gesättigter Natriumcarbonatlösung auf pH 8 eingestellt und bei 0°C 2 Stunden lang stehengelassen. Dann werden die Kristalle abfiltriert, mit eiskaltem Wasser gewaschen und schließlich getrocknet. Ausbeute: 6,12 g (auf beide Schritte bezogen 56,9%), Schmp.: 205-206°C.[α] = 21,51° (c = 1, DMF)R = 0,39; R = 0,14
Hydrazinstickstoff: berechnet: 3,91%;
gefunden: 3,79%, 3,76%.
h) H-Gln-Pro-NHEt.TFA (M = 367,3) (Boc: 370,49)
10 g (70 mMol) Prolinäthylamid (erhalten durch Hydrieren von 72 mMol Z-Pro-NHEt) werden in 100 ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird mit Triäthylamin auf pH 8 eingestellt und mit der Lösung von 32 g (87 mMol) Boc-Gln-ONP in 100 ml Dimethylformamid versetzt. Das zurückbleibende Öl wird in 50 ml 30 gew.-%iger, mit Dichlormethan bereiteter TFA-Lösung aufgelöst und die Lösung bei Raumtemperatur 20 Minuten lang stehengelassen. Dann wird im Vakuum eingedampft und das zurückbleibende Öl mit Äther verrieben. Ausbeute: 15,9 g (62%).
Schmp.: nicht meßbar (stark hygroskopische Substanz)[α] = -44,4° (c = 1, Methanol)R = 0,32; R = 0,37, R = 0,21.
i) Z-Leu-Gln-Pro-NHEt (M = 518,57)
7 g (26 mMol) H-Gln-Pro-NHEt.TFA werden in 50 ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird auf 0°C gekühlt und mit Triäthylamin auf pH 8 eingestellt. Nach Zugabe der Lösung von 14 g (27,3 mMol) Z-Leupentachlorphenylester in 40 ml Dimethylformamid wird das Gemisch bei +4°C über Nacht gerührt. Anderntags wird das Reaktionsgemisch im Vakuum eingedampft und der Rückstand in 70 ml Äthylacetat gelöst. Die Lösung wird dreimal mit 15 ml kalter, 0,01 n Natronlauge, dann dreimal mit 15 ml Wasser extrahiert. Sämtliche Extrakte wrden vereinigt und zweimal mit 10 ml Äthylacetat ausgeschüttelt. Die organischen Phasen werden vereinigt, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird mit Äther verrieben, die Festsubstanz abfiltriert, mit Äther gewaschen und im Vakuum getrocknet.
Ausbeute: 10,4 g (77%), Schmp.: 84-88°C
[α] = -32,8° (c = 1, Methanol), R = 0,90.
j) H-Leu-Gln-Pro-NHEt.HBr (M = 465,5)
7,6 g (14,6 mMol) Z-Leu-Gln-Pro-NHEt werden in 50 ml Eisessig gelöst und zu der Lösung 70 ml 4n eisessigsaurer Bromwasserstoff zugegeben. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur 90 Minuten lang stehengelassen und dann unter Rühren langsam in 800 ml eiskalten Äther einfließen gelassen. Es wird 30 Minuten lang nachgerührt und dann der Niederschlag abfiltriert. Das Produkt wird im Exsikkator über Phosphorpentoxyd getrocknet. Ausbeute: 7,9 g, Schmp.: 147°C[α] = -72,8° (c = 1, 2n Essigsäure)R = 0,30; R = 0,82.
k) Boc-anthranilsäure (M = 237,27)
Die Lösung von 4 g (30 mMol) Anthranilsäure in 20 ml Dimethylformamid wird mit Triäthylamin auf pH 8 eingestellt, mit 9 g tert.-Butyloxycarbonat versetzt und bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Das Lösungsmittel wird eingedampft und das zurückbleibende viskose Öl in 50 ml Äthylacetat gelöst. Die organische Phase wird dreimal mit 20 ml eiskalter 0,01 n Schwevelsäure und dann dreimal mit 20 ml Wasser gewaschen, dann über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft. Das zurückbleibende viskose Öl kristallisiert im Kühlschrank. Ausbeute: 5,7 g (80%), Schmp.: 91-93°C,R = 0,87; R = 0,79.
l) Boc-Aa-Leu-Gln-Pro-NHEt (M = 603,85)
Die Lösung von 2,3 g (5 mMol) H-Leu-Gln-Pro-NHEt.HBr in 10 ml DMF wird auf 0°C gekühlt und mit Triäthylamin auf pH 8 eingestellt. Dann werden zu der Lösung 750 mg (5,5 mMol) N-Hydroxybenztriazol, 1,1 g (5,5 mMol) DCC und schließlich langsam, tropfenweise die Lösung von 1,3 g (5,5 mMol) Boc-anthranilsäure in 5 ml DMF zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird bei Raumtemperatur 48 Stunden lang gerührt. Nach Abfiltrieren vom ausgeschiedenen DCU wird die Lösung im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird in 50 ml Äthylacetat gelöst und dreimal mit 20 ml 10 gew.-%iger Citronensäure, dreimal mit 20 ml Wasser, dreimal mit 20 ml gesättigter Natriumbicarbonatlösung und schließlich mit 20 ml gesättigter Kochsalzlösung ausgeschüttelt. Die organische Phase wird über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft. Der ölige Rückstand wird mit Äther verrieben. Die sich abscheidende blaßgelbe, pulverförmige Substanz wird abfiltriert und mit Äther gewaschen. Ausbeute: 2,4 g (80%), Schmp.: 119-121°C, R = 0,91
Aminosäureanalyse: Gln 0,97, Pro 1,03, Leu 1,00, Aa 0,92.
m) H-Aa-Leu-Gln-Pro-NHEt.TFA (M = 599,63)
603 mg (1 mMol) Boc-Aa-Leu-Gln-Pro-NHEt werden in 10 ml einer mit Dichlormethan breiteten 30 gew.-%igen TFA-Lösung gelöst. Die Lösung wird bei Raumtemperatur 20 Minuten lang gerührt. Die Trifluoressigsäure wird im Vakuum schnell entfernt, der Rückstand wird mit Äther verrieben und getrocknet.Ausbeute: 515 mg (86%), R = 0,52.
n) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Aa-Leu-Gln-Pro-NHEt (M = 1188,48)
358 mg (0,5 mMol) des gemäß Schritt g) hergestellten Pentapeptids Glp-His-Trp-Ser-Tyr-N2H3 werden in 10 ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird auf 0°C gekühlt und unter Rühren mit 0,34 ml 6 n Salzsäure und dann tropfenweise mit der konzentrierten wäßrigen Lösung von 37,7 mg Natriumnitrit versetzt. Nach 5 Minuten wird dem Gemisch eine auf 0°C gekühlte Lösung zugesetzt, die aus 230 mg (0,5 mMol) des Tetrapeptids H-Aa-Leu-Gln-Pro-NHEt, 1 ml Dimethylformamid und 0,34 ml Triäthylamin hergestellt wurde. Erforderlichenfalls wird das Gemisch mit Trifluoressigsäure neutralisiert, dann bei 0°C 2 Stunden lang gerührt und dann auf Raumtemperatur erwärmen gelassen. Das Lösungsmittel wird im Vakuum entfernt und der Rückstand an einer mit Sephadex G-25 gefüllten Säure (2 × 95 cm) mit 0,2 n Essigsäure chromatographisch gereinigt. Die Abtrennung wird durch bei 280 nm gemessene UV-Absorption und dünnschichtchromatographisch verfolgt. Die entsprechenden Fraktionen werden gesammelt und lyophilisiert.
Ausbeute: 315 mg (52%)R = 0,58; R = 0,83; R = 0,72
Aminosäureanalyse: Ser 0,91, Gln 2,03, Pro 0,95, Leu 1,00 Tyr 1,10, His 1,02, Trp 0,81, Aa 0,95
Beispiel 2
[Aa6,desGly10]-gonadoliberinäthylamid {Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Aa-Leu-Arg-ProNHEt}
a) Z-Arg(NO2)-Pro-NHEt (M = 465,47)
Zu der Lösung von 3,24 g (22,8 mMol) Prolinäthylamid in 70 ml Tetrahydrofuran werden 7,33 g (20,7 mMol) Z-Arg(NO2)-OH und 1,034 g N-Hydroxybenztriazol zugegeben. Das Gemisch wird unter Eiskühlung mit der Lösung von 5,34 g (25,9 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid in 50 ml Tetrahydrofuran versetzt und dann 5 Stunden lang unter Eiskühlung, weitere 20 Stunden lang bei Raumtemperatur gekühlt. DCU wird abfiltriert und mit Tetrahydrofuran gewaschen. Das mit der Waschflüssigkeit vereinigte Filtrat wird im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird in Chloroform gelöst und die Lösung dreimal mit 35 ml eines im Volumverhältnis von 1 : 5 bereiteten Gemisches aus konz. Ammoniak und Wasser, dann zweimal mit 20 ml Wasser, dann dreimal mit 35 ml n Salzsäure und schließlich noch zweimal mit 20 ml Wasser gewaschen. Die organische Phase wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert, das Trockenmittel noch mit Chloroform nachgewaschen und dann die Chloroformlösung eingedampft. Der Rückstand wird in einem Gemisch aus 35 ml THF und 50 ml Äthylacetat gelöst, die Lösung filtriert und der Filterrückstand mit 30 ml eines im Volumverhältnis von 1 : 2 bereiteten Gemisches von Tetrahydrofuran und Äthylacetat gewaschen und dann die organische Phase eingedampft. Zu dem zurückbleibenden festen Schaum werden 100 ml Diäthyläther zugegeben. Das Produkt wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und im Vakuum getrocknet. Ausbeute: 9,69 g (98%), Schmp.: 125°C[α] = -42,5° (c = 1, Methanol)R = 0,5; R = 0,72
b) Z-Leu-Arg(NO2)-Pro-NHEt (M = 578,65)
5,6 g (11,73 mMol) des geschützten Dipeptidäthylamids Z-Arg(NO2)-Pro-NHEt werden in 30 ml Eisessig gelöst. Zu der Lösung werden 55 ml 4 n eisessigsaurer Bromwasserstoff zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird bei Raumtemperatur 90 Minuten lang stehengelassen, dann mit 250 ml wasserfreiem Äther versetzt und erneut eine Stunde lang stehengelassen. Die Lösung wird vom ausgefallenen Feststoff dekantiert, und zu dem Rückstand werden 100 ml Äther zugegeben. Nach 15 Minuten wird filtriert. Das Produkt wird mit reichlich Äther gewaschen und dann im Vakuum über Phosphorpentoxyd und Natriumhydroxyd getrocknet. Man erhält 6,44 g einer etwas hygroskopischen Substanz.
6,04 g (11,0 mMol) des erhaltenen Dipeptidäthylamid-hydrobromids werden in 150 ml Chloroform suspendiert und zu der Suspension 5,5 ml Triäthylamin zugegeben. Die Substanz beginnt in Lösung zu gehen. Um das zu beschleunigen, werden weitere 2,5 ml Triäthylamin zugegeben. Anschließend läßt man die mit 65 ml Chloroform bereitete Lösung von 6,4 g Z-Leu-OPCP in das Reaktionsgemisch einfließen und rührt das Gemisch über Nacht. Das Gemisch wird mit n Salzsäure, mit gesättigter Kochsalzlösung, mit 2 n Ammoniak und schließlich erneut mit gesättigter Kochsalzlösung extrahiert. Dann wird die organische Phase über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird mit Äther verrieben. Die Festsubstanz wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und im Vakuum getrocknet. Man erhält 5,5 g (84,6%) Rohprodukt.
Das geschützte Tripeptidäthylamid wird unter leichtem Erwärmen in 30 ml Äthylacetat gelöst. Die Lösung wird mit Aktivkohle geklärt, die abfiltrierte Kohle wird zweimal mit 10 ml Äthylacetat gewaschen. Das Filtrat wird in Portionen mit 75 ml Diäthyläther versetzt. Ein Öl scheidet sich aus, das schnell fest wird. Nach zwei Stunden wird das Produkt abfiltriert, zuerst mit einem im Volumverhältnis von 2 : 3 bereitetem Gemisch aus Äthylacetat und Äther, dann mit reinem Äther gewaschen und im Vakuum getrocknet.
Ausbeute: 4,7 g (74,3%), Schmp.: 116-118°C[α] = 57,0° (c = 1, Methanol)R = 0,74; R = 0,49.
c) H-Leu-Arg(NO2)-Pro-NHEt.HBr (M = 537,4)
1,18 g (2 mMol) des Tripeptids Z-Leu-Arg-(NO2)-Pro-NHEt werden in 10 ml eisessigsaurem Bromwasserstoff gelöst. Die Lösung wird bei Raumtemperatur eine Stunde lang gerührt und dann mit 100 ml wasserfreiem Äther verrieben. Nach dem Filtrieren wird die gelbliche, pulverförmige Substanz im Exsikkator getrocknet. Man erhält in einer Menge von 1,30 g ein blaßgelbes, hygroskopisches Produkt. R = 0,14.
d) Boc-Aa-OPFP (M = 403,32)
Zu der auf 0°C gekühlten Lösung von 2,4 g (10 mMol) Boc-anthranilsäure in 20 ml THF wird unter Rühren die Lösung von 2,2 g (11 mMol) DCC und 2,0 g Pentafluorphenol in 10 ml Tetrahydrofuran zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird bei 0°C 3 Stunden lang, bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Die Lösung wird filtriert und der Rückstand in 30 ml Äthylacetat gelöst. Die Lösung wird dreimal mit 10 ml eiskalter 10 gew.-%iger Citronensäure, dreimal mit 10 ml kaltem Wasser, dreimal mit 10 ml gesättigter Natriumbicarbonatlösung und schließlich noch dreimal mit 20 ml Wasser gewaschen. Die organische Phase wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft. Das verbleibende Öl kristallisiert bei +4°C.
Ausbeute: 3,06 g (76%)R = 0,90; R = 0,85.
e) Boc-Aa-Leu-Arg(NO2)-Pro-NHEt (M = 675,75)
1,07 g des Tripeptidsalzes H-Leu-Arg(NO2)-Pro-NHEt.HBr werden in 5 ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird auf 0°C gekühlt und mit der Lösung von 0,28 ml (2 mMol) Triäthylamin und 806 mg (2 mMol) Boc-Aa-OPFP in 5 ml Dimethylformamid versetzt. Der pH-Wert der Lösung wird mit TEA auf 8 eingestellt. Man läßt die Lösung sich erwärmen und rührt bei 20°C 48 Stunden lang, wobei man den pH-Wert mit TEA auf etwa 8 hält. Das Dimethylformamid wird im Vakuum entfernt und der Rückstand in 50 ml Äthylacetat gelöst. Die Lösung wird dreimal mit 20 ml 10 gew.-%iger Citronensäure, dreimal mit 20 ml Wasser, dreimal mit 20 ml gesättigter Natriumbicarbonatlösung und schließlich noch mit 20 ml gesättigter Kochsalzlösung gewaschen. Die organische Phase wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum eingedampft. Das zurückbleibende Öl wird mit Äther verrieben und das feste Produkt abfiltriert.
Ausbeute: 1,05 g (77,8%)R = 0,90; R = 0,91; R = 0,96.
f) Boc-Aa-Leu-Arg-Pro-NHEt (M = 630,74)
1,0 g (1,5 mMol) des Tetrapeptids Boc-Aa-Leu-Arg(NO2)-Pro-NHEt wird in 50 ml 50 gew.-%iger Essigsäure gelöst und in Gegenwart von 400 ml 10 gew.-%iger Palladiumaktivkohle 4 Stunden lang hydriert. Der Katalysator wird abfiltriert, die Lösung eingedampft und der Rückstand mit Äther verrieben.
Ausbeute: 779 mg (82,5%)R = 0,45.
g) H-Aa-Leu-Arg-Pro-NHEt.(TFA)2 (M = 724,67)
630 mg (1 mMol) des Tetrapeptids Boc-Aa-Leu-Arg-Pro-NHEt werden in 5 ml Trifluoressigsäure gelöst. Die Lösung wird bei Raumtemperatur 20 Minuten lang gerührt, dann die Trifluoressigsäure im Vakuum schnell entfernt und der Rückstand mit Äther verrieben. Das Produkt wird abfiltriert und getrocknet.
Ausbeute: 648,5 mg (89,5%)R = 0,34; R = 0,76.
h) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Aa-Leu-Arg-Pro-NHEt.CH3COOH (M = 1276,5)
358 mg (0,5 mMol) des gemäß Schritt g) des Beispiels 1 hergestellten Pentapeptids Glp-His-Trp-Ser-Tyr-N2H3 werden in 10 ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird auf -10°C gekühlt und unter Rühren tropfenweise mit 0,34 ml 6 n Salzsäure und dann mit der gesättigten wäßrigen Lösung von 37,7 mg Natriumnitrid versetzt. Nach 5 Minuten wird eine auf -10°C gekühlte Lösung zugesetzt, die aus 362,3 mg (0,5 mMol) des Tetrapeptids H-Aa-Leu-Arg-Pro-NHEt.(TFA)2, 1 ml Dimethylformamid und 0,34 ml Triäthylamin bereitet wurde. Das Reaktionsgemisch wird bei -5°C eine Stunde lang und dann bei 0°C eine Stunde lang gerührt. Man läßt die Temperatur auf Raumtemperatur ansteigen, entfernt das Lösungsmittel im Vakuum und reinigt den Rückstand an einer mit Sephadex G-25 gefüllten Säule (2 × 95 cm) chromatographisch mit 0,2 n Essigsäure. Die entsprechenden Fraktionen werden gesammelt und lyophilisiert.
Ausbeute: 365,7 mg (57,3%)R = 0,65; R = 0,49; R = 0,69
Aminosäureanalyse: Ser 0,87, Glu 0,99, Pro 1,02, Leu 1,00, Tyr 0,97, His 1,03, Trp 0,82, Aa 0,91, Arg 1,01.
Beispiel 3
[Mab6]-gonadoliberin {Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Mab-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2}
a) Boc-metaaminobenzoesäure (Boc-Mab)
1,0 g (7,5 mMol) m-Aminobenzoesäure wird in 10 ml Dimethylformamid gelöst. Der pH-Wert der Lösung wird mit Triäthylamin auf 8 eingestellt, und zu dem Gemisch werden 2,5 g tert.-Butyloxycarbonat zugegeben. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur einen Tag lang gerührt und dann auf die im Schritt k) des Beispiels 1 beschriebene Weise aufgearbeitet.
Ausbeute: 1,4 g (80,9%)Schmp.: 92°C, R = 0,88; R = 0,84.
b) Boc-Mab-Leu-Arg(NO2)-Pro-Gly-NH2 (M = 704,78)
1,5 g (2,5 mMol) H-Leu-Arg(NO2)-Pro-Gly-NH2-trifluoracetat (N. Yanaihara et al., J. Med. Chem. 16, 373 /1973/) werden in 10 ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird auf 0°C gekühlt und mit Triäthylamin auf pH 8 eingestellt. Dann werden 383 mg (2,5 mMol) N-Hydroxybenztriazol und 515 mg (2,5 mMol) DCC zugesetzt. Schließlich wird tropfenweise die Lösung von 593 mg (2,5 mMol) Boc-Mab in 3 ml Dimethylformamid zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird bei Raumtemperatur 48 Stunden lang gerührt. Der ausgeschiedene DCU wird abfiltriert und das Filtrat im Vakuum eingedampft. Das zurückbleibende Öl wird in 30 ml Äthylacetat gelöst und die Lösung dreimal mit 10 ml 10 gew.-%iger Citronensäure, dreimal mit 10 ml Wasser, dreimal mit 10 ml gesättigter Natriumbicarbonatlösung und schließlich mit 10 ml gesättigter Kochsalzlösung gewaschen. Die organische Phase wird über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft. Der ölige Rückstand wird mit Äther verrieben. Die weiße kristalline Substanz wird abfiltriert und mit Äther gewaschen.Ausbeute: 1,2 g (68%). Schmp.: 132-133°C, R = 0,43.
c) Boc-Mab-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 (M = 659,78)
1,0 g (1,5 mMol) Boc-Mab-Leu-Arg(NO2)-Pro-Gly-NH2 wird auf die im Schritt f) des Beispiels 2 beschriebene Weise von der Schutzgruppe befreit.Ausbeute: 775 mg (78,3%), R = 0,52.
d) H-Mab-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2.(TFA)2 (M = 753,72)
670 mg (1 mMol) des Pentapeptidamids Bod-Mab-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 werden in 5 ml Trifluoressigsäure gelöst. Die Lösung wird bei Raumtemperatur 20 Minuten lang gerührt. Dann wird die Trifluoressigsäure unter Vakuum entfernt. Das zurückbleibende Öl wird mit Äther verrieben, das Produkt abfiltriert und getrocknet.
Ausbeute: 689 mg (91,5%)R = 0,50; R = 0,53; R = 0,42.
e) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Mab-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 (M = 1244,39)
358 mg (0,5 mMol) des gemäß Schritt g) des Beispiels 1 hergestellten Pentapeptids Glp-His-Trp-Ser-Tyr-N2H3 werden in 10 ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird auf -10°C gekühlt und unter Rühren zuerst mit 0,34 ml 6 n Salzsäure, dann tropfenweise mit der konzentrierten wäßrigen Lösung von 37,7 mg Natriumnitrit versetzt. Nach 5 Minuten wird die auf -10°C gekühlte Lösung von 377 mg (0,5 mMol) H-Mab-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2.(TFA)2 in 1 ml Dimethylformamid zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird bei 0°C 2 Stunden lang gerührt. Dann läßt man die Temperatur auf Raumtemperatur ansteigen. Anderntags wird das Gemisch im Vakuum eingedampft. Das rohe Dekapeptid wird an einer mit Sephadex G-25 gefüllten Säule (2×95 cm) mittels eines im Volumverhältnis von 15 : 1 : 4 : 20 bereiteten Gemisches aus n-Butanol, n-Propanol, Essigsäure und Wasser chromatographisch gereinigt. Der Substanzgehalt der Fraktionen wird dünnschichtchromatographisch beziehungsweise durch Messung der UV-Absorption bestimmt. Die das Dekapeptid enthaltenden Fraktionen werden lyophilisiert. Die Reinigung wird mit verdünnter Essigsäure wiederholt.
Ausbeute: 323 mg (52%)R = 0,31; R = 0,49; R = 0,62.
Aminosäureanalyse: Ser 0,91, Glu 1,03, Pro 0,97, Gly 1,10, Leu 1,00, Tyr 0,97, His 1,05, Trp 0,87, Mab 0,90, Arg 1,11.
Beispiel 4
[Aa6]-gonadoliberin {Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Aa-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2}
M = 1244,39
a) Synthese
Die Verbindung wird durch das allgemein bekannte Verfahren der Peptidsynthese an der festen Phase (Merrifield, R. B., J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2151 /1963/) hergestellt.
0,75 g (0,3 mMol) Benzhydrylamin.HCl-Harz (0,4 mMol/g, Pierce) läßt man 2 Stunden lang in Dichlormethan quellen. Beim Acylieren mit Aminosäuren wird jeweils der folgende Zyklus wiederholt:
Nach jedem Schritt wird ein Ninhydrintest durchgeführt. Werden freie Aminogruppen gefunden, so muß der Zyklus von der 5. Zeile ab wiederholt werden (Ninhydrintest nach Kaiser, E. et al., Anal. Biochem. 34, 595-598 /1970/). Nach dem letzten Schritt erhält man 344 mg (65%) Glp-His(Tos)-Trp-Ser(oBzl)-Tyr(oBzl)-Aa-Leu-Arg(Tos)-Pro-Gly-Peptidharz (Molmasse des geschützten Peptids: 1764, 92).
b) Abspaltung mit Fluorwasserstoff
Die Entfernung der Schutzgruppen und die Abspaltung des Peptids vom Harz werden in einem Schritt, mit flüssigem, wasserfreiem Fluorwasserstoff vorgenommen (Sakakibara, S. et al., Bull. Soc. Japan 40, 2164-2167 /1967/). Zu dem im vorhergehenden Schritt erhaltenen Peptidharz werden 5 ml Anisol und 100 ml Dithiothreit zugegeben und schließlich 20 ml HF in das Gemisch kondensiert. Bei 0°C wird eine Stunde lang gerührt und dann der HF mittels eines Stickstoffstromes entfernt. Der Rückstand wird in wasserfreiem Äther suspendiert und dann filtriert. Die Festsubstanz wird mit 50 gew.-%iger Essigsäure gewaschen. Das mit der Waschflüssigkeit vereinigte Filtrat wird bei 37°C eingedampft. Das erhaltene Decapeptid. HF-Salz (371 mg) wird einer Gelchromatographie unterzogen.
c) Gelchromatographie
Die im vorhergehenden Schritt erhaltene Substanz wird an einer mit Sephadex G-25 gefüllten Säule (2,5×100 cm) gereinigt. Als Eluiermittel dient 20 gew.-%ige Essigsäure. Die Trennung wird durch bei 280 nm gemessene UV-Absorption sowie dünnschichtchromatographisch verfolgt. Die das Decapeptid enthaltenen Fraktionen werden gesammelt und lyophilisiert.
Ausbeute: 202 mg (54%)
d) Präparative HPLC
Es wird eine präparative HPLC-Säule (Whatman) mit den Abmessungen 2,5×45 cm verwendet, die C18-Silikagel LRP-1 der Teilchengröße 13-24 µm enthält. Das Gleichgewicht wird mit einem Gemisch aus 15 Vol.-% Methanol und 85 Vol.-% 20 gew.-%iger Essigsäure eingestellt. Nachdem sich das Gleichgewicht eingestellt hat, werden 202 mg der gelchromatographisch gereinigten Substanz, gelöst in dem gleichen Lösungsmittelgemisch, auf die Säule aufgegeben. Eluiert wird mit einem linearen Konzentrationsgradienten, der mit einer Zusammensetzung von 15 Vol.-% Methanol und 85 Vol.-% 20 gew.-%iger Essigsäure beginnt und einer Zusammensetzung von 25 Vol.-% Methanol und 75 Vol.-% 20 gew.-%iger Essigsäure endet. Dann wird mit einem Gemisch von 40 Vol.-% Methanol und 60 Vol.-% 20 gew.-%iger Essigsäure und schließlich mit einem Gemisch aus 80 Vol.-% Methanol und 20 Vol.-% 20 gew.-%iger Essigsäure eluiert. Die Durchflußmenge beträgt 2 ml/min, der Druck 3,5×105 Pa. Die Fraktionen werden bei 280 nm nachgewiesen und ihr Gehalt wird dünnschichtchromatographisch kontrolliert. Nach dem Lyophilisieren erhält man das reine [Aa6]-gonadoliberin in einer Menge von 123 mg (61,0%). Schmp.: 185-192°C[α] = -63,2° (c = 1, 0,1 n Essigsäure), R = 0,17
Aminosäureanalyse: Ser 0,92, Glu 1,03, Pro 1,1, Gly 0,97 Leu 1,00, Tyr 0,95, His 1,08, Trp 0,83 Aa 0,90, Arg 1,05.
Beispiel 5
[Aa6,Trp7,Leu8]-gonadoliberin {Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Aa-Trp-Leu-Gly-NH2}
Die Verbindung wird mit der im Beispiel 4 beschriebenen Methode hergestellt.Ausbeute: 35%, R = 0,57.
Aminosäureanalyse: Ser 0,91, Glu 1,02, Pro 0,97, Gly 1,00, Leu 0,98, Tyr 1,03, His 0,93, Trp 1,82 Aa/Mab 0,90.
Beispiel 6
[Mab6,Phe7,Gln8]-gonadoliberin {Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Mab-Phe-Gln-Gly-NH2}
Die Verbindung wird mit der im Beispiel 4 beschriebenen Methode hergestellt.Ausbeute: 43%, R = 0,63.
Aminosäureanalyse: Ser 0,93, Glu 2,02, Pro 1,12, Gly 1,00, Tyr 0,97, Phe 1,07, His 0,95, Trp 0,87, Aa/Mab 0,89.
Beispiel 7
Herstellung einer Injektionslösung zur intramuskulären, subkutanen oder intravenösen Verabreichung
  • a) Ein Gonadoliberinderivat der allgemeinen Formel I, wie [Aa6,Gln8,desGly10]-gonadoliberinäthylamid, wird in einer Konzentration von 1-10 mg/ml in destilliertem Wasser, physiologischer Kochsalzlösung oder einem wäßrigen Puffer gelöst. Die Lösung wird steril filtriert und dann in 50-500 µg Substanz entsprechenden Volumina in Ampullen gefüllt. Die Lösung wird lyophilisiert, und die Ampullen werden verschlossen.
    Der Inhalt der Ampulle wird vor der Behandlung durch Zugabe von 1-10 ml destilliertem Wasser frisch gelöst und das der notwendigen Dosis entsprechende Volumen der Lösung injiziert.
  • b) Ein Gonadoliberinderivat der allgemeinen Formel I, wie [Mab6]-gonadoliberin, wird in einer Konzentration von 20-500 µg in physiologischer Kochsalzlösung oder Benzylalkohol gelöst, in Ampullen gefüllt, und die Ampullen werden verschlossen. Die Lösungen werden unmittelbar für Injektionszwecke verwendet.

Claims (14)

1.) In der 6-Stellung einen aromatischen Aminocarbonsäurerest aufweisende Nonapeptidäthylamide beziehungsweise Decapeptidamide der allgemeinen Formel Glp-His-Trp-Ser-Tyr-X1-X2-X3-Pro-X4,6(I)worin
X1 einen o-Aminobenzoesäure- oder m-Aminobenzoesäurerest darstellt,
X2 für einen Rest von Leucin, Tryptophan oder Phenylalanin steht,
X3 einen Rest von Arginin, Leucin oder Glutamin bedeutet,
X4 einen Glycylamid- oder Äthylamidrest darstellt,
Glp für einen Rest von Pyroglutaminsäure steht,
His einen Rest von Histidin bedeutet,
Trp einen Rest von Tryptophan darstellt,
Ser für einen Rest von Serin steht,
Tyr einen Rest von Tyrosin bedeutet und
Pro einen Rest von Prolin darstellt, sowie ihre Säureadditionssalze.
2.) [Aa6,Gln8,desGly10]-gonadoliberinäthylamid,
worin
Aa für einen Rest von Anthranilsäure steht,
desGly das Fehlen des Glycylrestes von Gonadoliberin bedeutet,
Gln einen Rest von Glutamin darstellt und
die Zahlen die betreffenden Stellungen des Gonadoliberines mit den angegebenen Abweichungen von ihm bedeuten, und seine Säureadditionssalze.
3.) [Aa6,desGly10]-gonadoliberinäthylamid,
worin
Aa für einen Rest von Anthranilsäure steht,
desGly das Fehlen des Glycylrestes von Gonadoliberin bedeutet und
die Zahlen die betreffenden Stellungen des Gonadoliberines mit den angegebenen Abweichungen von ihm bedeuten, und seine Säureadditionssalze.
4.) [Mab6]-gonadoliberin,
worin
Mab für einen Rest von m-Aminobenzoesäure steht und
die Zahl 6 die 6-Stellung des Gonadoliberines mit der angegebenen Abweichung von ihm bedeutet, und seine Säureadditionssalze.
5.) [Aa6]-gonadoliberin,
worin
Aa für einen Rest von Anthranilsäure steht und
die Zahl 6 die 6-Stellung es Gonadoliberines mit der angegebenen Abweichung von ihm bedeutet, und seine Säureadditionssalze.
6.) [Aa6,Trp7,Leu8-gonadoliberin,
worin
Aa für einen Rest von Anthranilsäure steht,
Trp die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung hat,
Leu einen Rest von Leucin darstellt und
die Zahlen die betreffenden Stellungen des Gonadoliberines mit den angegebenen Abweichungen von ihm bedeuten, und seine Säureadditionssalze.
7.) [Mab6,Phe7,Gln8]-gonadoliberin,
worin
Mab für einen Rest von m-Aminobenzoesäure steht,
Phe einen Rest von Phenylalanin bedeutet,
Gln einen Rest von Glutamin darstellt und
die Zahlen die betreffenden Stellungen des Gonadoliberines mit den angegebenen Abweichungen von ihm bedeuten, und seine Säureadditionssalze.
8.) Verfahren zur Herstellung der Verbindungen nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man
  • a) die passenden, gegebenenfalls geschützten, Aminosäuren beziehungsweise Salze beziehungsweise Derivate derselben mittels schrittweiser Kondensation und/oder Fragmentkondensation kondensiert und die gegebenenfalls vorhandenen Schutzgruppen entfernt oder
  • b) unter Anwendung des Verfahrens der Peptidsynthese an einer festen Phase die passenden, gegebenenfalls geschützten, Aminosäuren beziehungsweise Salze beziehungsweise Derivate derselben in der entsprechenden Reihenfolge schrittweise an einen festen Träger kondensiert, die Endprodukte sauer oder basisch von dem festen Träger abspaltet und die gegebenenfalls vorhandenen Schutzgruppen vor, während oder nach dem Abspalten entfernt,
worauf man gegebenenfalls in an sich bekannter Weise die gegebenenfalls erhaltenen Nonapeptidäthylamide beziehungswise Decapeptidamide der allgemeinen Formel I in Säureadditionssalze überführt und/oder gegebenenfalls in an sich bekannter Weise die gegebenenfalls erhaltenen Säureadditionssalze der erhaltenen Nonapeptidäthylamide beziehungsweise Decapeptidamide der allgemeinen Formel I in die entsprechenden freien Nonapeptidäthylamide beziehungsweise Decapeptidamide der allgemeinen Formel I und/oder in andere Salze überführt.
9.) Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man ein geschütztes Pentapeptidazid der Formel Glp-His-Trp-Ser-Tyr-N3,6(II)worin Glp, His, Trp, Ser und Tyr die im Anspruch 1 angegebenen Bedeutungen haben, mit einem Tetra- oder Pentapeptid der allgemeinen FormelX1-X2-X3-Pro-X4,6(III)worin X1 , X2 , X3 und X4 die im Anspruch 1 angegebenen Bedeutungen haben, kondensiert.
10.) Verfahren nach Anspruch 8 b) oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß man als festen Träger ein Benzhydrylaminharz oder chlormethyliertes Polystyrolharz verwendet.
11.) Verfahren nach Anspruch 8 b) oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß man das Abspalten des Schutzgruppen aufweisenden Endproduktes vom Träger durch Behandeln mit Fluorwasserstoff oder durch Äthylammonolyse durchführt.
12.) Arzneimittel beziehungsweise vermehrungsbiologisch verwendbare Mittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt an 1 oder mehr Verbindung(en) nach Anspruch 1 bis 7 als Wirkstoff(en), zweckmäßig zusammen mit 1 oder mehr üblichen pharmazeutischen Träger-, Streck- und/oder Hilfsstoff(en).
13.) Verwendung der Verbindungen nach Anspruch 1 bis 7 zur Herstellung von das luteinisierende und das follikelstimulierende Hormon freisetzenden Arzneimitteln beziehungsweise vermehrungsbiologisch verwendbaren Mitteln.
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