DE2321174C2 - Nonapeptidamid und Verfahren zu ihrer Herstellung - Google Patents
Nonapeptidamid und Verfahren zu ihrer HerstellungInfo
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Description
Die Erfindung betrifft neue Nonapeptidamide mit starker ovulationsfördernder Wirkung. Die neuen
Nonapeptidamide haben die allgemeine Formel
H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-A,-Gly-A2-Arg-Pro-Y
in der A. für Tyr oder Phe, A2 für Leu, lie, Nie oder Met
und Y für NHR steht, worin R ein geradkettiger oder verzweigter Alkylrest mit 1 bis 3 C-Atomen ist oder eine
Pyrrolidinogruppe ist.
Die Erfindung umfaßt ferner die pharmazeutisch unbedenklichen Salze der Nonapeptidamide sowie ein
Verfahren zur Herstellung der neuen Verbindungen.
In dieser Beschreibung stehen (Pyr)Glu, His, Trp, Ser, Tyr, Phe, GIy, Leu, He, Nie, Met, Arg und Pro für »Reste«
von L-Pyroglutaminsäure, L-Histidin, L-Tryptophan, L-Serin, L-Tyrosin, L-Phenylalanin, Glycin, L-Leucin,
L-Isoleucin, L-Norleucin, L-Methionin, L-Arginin bzw.
L-Prolin. Unter dem »Rest« ist ein Radikal zu verstehen, das von der entsprechenden «-Aminosäure durch
Eliminierung des OH-Teils der Carboxylgruppe und des Η-Teils der oc-Aminogruppe abgeleitet ist. Beispielsweise
stellt im Falle von L-Arginin
HN
H3N
C-NHCH2Ch2CH2CHCOOH
NH2
das durch die Formel H2N-A-COOH dargestellt
werden kann (worin NH2 der «-Aminorest ist), das
Radikal ( — NH- Λ — CO — ) einen »Rest« von L-Arginin
dar und wird als » — Arg — « abgekürzt. Die Abkürzungen für die anderen vorstehend genannten
«-Aminosäuren haben die entsprechende Bedeutung, wie sie vorstehend für L-Arginin dargelegt wurde.
Der vorstehend genannte Substituent R, d. h. der geradkettige oder verzweigte Alkylrest, der 1 bis 3
C-Atome enthält, kann ein Methylrest, Äthylrest, n-Propylrest oder Isopropylrest sein.
Es ist seit vielen Jahren bekannt, daß der Hypothalamus
Faktoren enthält, die bei höherer Konzentration die Sekretion der tropen Hormone aus der Hypophyse
steuern. Kürzlich wurde anschließend an die Isolierung eines Thyrotropin freigebenden Hormons (TRH=Thyrotropin-releasing
hormone) ein Hormon, das die Sekretion des luteinisierenden Hormons fördert, in reiner Form aus Schweinen und Schafen extrahiert und
als Decapeptid der Struktur H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Por-Gly-NH2
identifiziert (A. V.
Schally und Mitarbeiter, Biochem. Biophys. Res. Commun., 43,1334 [1971]; R. Gnillemin und Mitarbeiter,
Proc. Nat. Acad. Sei., USA, 69, 278 [1972]). Dieser
Feststellung folgte die Synthese einer Anzahl ähnlicher Peptide. Außerdem wurden biologische Tests mit diesen
analogen Peptiden durchgeführt. Jedoch verringert selbst eine geringfügige Modifikation der vorstehend
genannten Aminosäurezusammensetzung stark die physiologische Aktivität des Peptids, und die vorstehende
chemische Struktur wird als wesentlich für die Genese maximaler physiologischer Aktivität angesehen
(A. V. Schally und Mitarbeiter, Biochem. Biophys. Res. Commun. 4,366 [1972]).
Es gelang die Synthese der Nonapeptidamide (I) sowie ihrer pharmazeutisch unbedenklichen Salze.
Überraschenderweise wurde gefunden, daß diese Verbindungen eine stärkere ovulationsauslösende Wirkung
haben als das natürlich vorkommende Decapeptid. Ferner wurde gefunden, daß diese Verbindungen auf die
Hypophyse einwirken und die Sekretion sowohl des luteinisierenden Hormons als auch des follikelstimulierenden
Hormons fördern. Ferner wurde gefunden, daß diese Verbindungen nicht nur wertvoll als Medikamente
für den Menschen, z. B. als Medikamente für die Diagnose der Hypophysenfunktion oder des Gonadotropinmangels
und für die Therapie der Amenorrhoe, sondern auch als Veterinärmedikamente insbesondere
für die Zwecke der Viehzucht sind. Der Erfindung liegen die vorstehenden überraschenden Feststellungen zugrunde.
Die Erfindung betrifft die in den Ansprüchen dargelegten Gegenstände.
Zur Vereinfachung wird mit Reagens (A) die L-Pyroglutaminsäure oder ein Peptidfragment, das eine
L-Pyroglutaminsäureeinheit an seinem N-endständigen Teil und gleichzeitig anschließend daran die Aminosäuresequenz
der allgemeinen Formel (I) enthält, bezeichnet, und die mit dem Reagens (A) zu kondensierende
Aminkomponente, die dem restlichen Teil des vorstehend genannten, als Produkt gewünschten Nonapeptidamids
(I) entspricht, als Reagens (B).
Die Reagentien (A) und (B) sind wahlweise geschützt. Das Reagens (A) hat somit die folgende Beziehung
zum Reagens (B):
Methode | Reagens (A) | Reagens (B) |
Nr. | ||
1 | H-(Pyr)Glu-OH | H-His-Trp-Ser-A,- |
GIy-A2-Arg-Pro-Y | ||
2 | H-(Pyr)Glu-His-OH | H-Trp-Ser-Aj-Gly- |
A2-Arg-Pro-Y | ||
3 | H-(Pyr)GIu-His- | H-Ser-ArGIy-A2- |
Trp-OH | Arg-Pro-Y | |
4 | H-(Pyr)Glu-His-Trp- | H-A,-Glv-A,-Arg- |
Ser-OH | Pro-Y | |
5 | H-(Pyr)GIu-His-Trp- | H-Gly-Aj-Arg-Pro-Y |
Ser-Λ,-ΟΗ | ||
6 | H-(Pyr)Glu-His-Trp- | H-A2-Arg-Pro-Y |
Ser-A,-Gly-OH | ||
7 | H-(Pyr)Glu-His-Trp- | H-Arg-Pro-Y |
Ser-A,-Gly-A2-OH | ||
8 | H-(Pyr)Giu-His-Trp- | H-Pro-Y |
Ser-A,-Gly-A,- | ||
Arg-OH | ||
9 | H-(Pyr)Glu-His-Trp- | H-Y |
Ser-A,-Gly-A,-Arg- | ||
Pro-OH |
15
20 bekannter Weise durchgeführt werden. Die Kondensation gemäß der Erfindung kann somit vorgenommen
werden, indem man in einer ersten Stufe die C-endständige Carboxylgruppe des Reagens (A) oder
die N-endständige Aminogruppe des Reagens (B) aktiviert und in der zweiten Stufe die Bildungsreakticn
der Peptidbindung zwischen dem aktivierten Reagens (A) und dem Reagens (B) oder zwischen dem Reagens
(A) und dem aktivierten Reagens (B) durchführt oder als Alternative die Bildungsreaktion der Peptidbindung
zwischen dem Reagens (A) und dem Reagens (B) in Gegenwart eines Dehydratisierungsmittels durchführt,
wobei die Reagentien (A) und (B) wahlweise geschützt sind.
Es ist ferner bekannt, daß in Fällen, in denen die vorstehend genannten funktioneilen Gruppen durch
eine oder mehrere Schutzgruppen vor der Kondensationsreaktion geschützt werden, die schützende Gruppe
oder schützenden Gruppen nach der Kondensationsreaktion entfernt werden. Beim Verfahren gemäß der
Erfindung kann die Entfernung der Schutzgruppen ebenfalls in bekannter Weise vorgenommen werden.
Es ist in diesem Zusammenhang ebenfalls bekannt, daß eine geschützte L-Glutamylgruppe der allgemeinen
Formel
Wenn eine Verbindung aus der linken Spalte als Reagens (A) verwendet wird, wird die Verbindung in der
rechten Spalte in der gleichen Zeile als Reagens (B), d. h., als entsprechende Gegenverbindung des Reagens
(A), bei der Kondensationsreaktion verwendet. Die Reagentien (A) und/oder (B) können vor der Kondensationsreaktion
geschützt oder während der Kondensationsrekation, genauer gesagt, vor der Bildungsreaktion
der Peptidbindung, aktiviert werden. Hierauf wird nachstehend ausführlicher eingegangen. Wie dem
Fachmann auf dem Gebiet der Peptidsynthese bekannt ist, können alle Arten von Peptiden durch Kondensation
einer Aminosäure oder eines Peptidfragments (d. h. <fo
eines Peptids mit weniger Einheiten) mit einer Aminosäure oder einem Peptidfragment (d. h. Peptid
mit weniger Einheiten) hergestellt werden. Eine Anzahl ausgereifter Verfahren zur Durchführung der Kondensationsreaktion
ist bereits entwickelt worden.
Beispielsweise kann man die funktioneile Gruppe oder die funktioneilen Gruppen (z. B. die Aminogruppe,
Carboxylgruppe, Hydroxylgruppe, Guanidingruppe), die an der Bildungsreaktion der Peptidbindung (d.h.
-CONH-) über die Kondensationsreaktion nicht beteiligt sind, vor der Kondensationsreaktion durch die
Schutzgruppe oder Schutzgruppen schützen. Beim Verfahren gemäß der Erfindung kann man die nicht an
der Kondensationsreaktion teilnehmenden funktioneilen Gruppen von Reagens (A) oder (B) ebenfalls nach an
sich bekannten Methoden schützen.
Bekanntlich wird vor der Bildungsreaktion der Peptidbindung die C-endständige Carboxylgruppe oder
die N-endständige Aminogruppe einer Aminosäure oder eines Peptidfragments, die an der Bildungsreaktion
der Peptidbindung beteiligt ist, aktiviert, damit sie die Bildung der Peptidbindung zustande bringt, und, wenn
die Aktivierung nicht erfolgt, die Bildungsreaktion der Peptidbindung wird in Gegenwart eines Dehydratisierungsmittels
durchgeführt. Verfahren zur Aktivierung der C-endständigen Carboxylgruppe sowie der N-endständigen
Aminogruppe sind allgemein bekannt. Das Verfahren gemäß der Erfindung kann in an sich
RCO — CH2CH2CH(NH2)CO —
in der R ein Alkoxyrest (z. B. ein Methoxyrest, Äthoxyrest, n-Propoxyrest, Isopropoxyrest oder n-Butoxyrest),
ein Aralkyloxyrest (z. B. ein Benzyloxyrest) oder eine Aminogruppe ist, sich durch Umsetzung mit
einer Base (z. B. Ammoniak) oder einer Säure (z. B. Essigsäure) leicht in die L-Pyroglutamylgruppe selbst
CO-
O H
VN
VN
umwandeln läßt, und daß die Gruppe (II) hierbei der L-Pyroglutamylgruppe selbst äquivalent ist. Beim
Verfahren gemäß der Erfindung ist vorauszusetzen, daß das L-Pyroglutamyl (d.h. H—(Pyr)Glu —) des Reagens
(A) nicht nur die L-Pyroglutamylgruppe selbst, sondern auch die geschützte L-Glutamylgruppe der Formel (II)
einschließt. Wenn H-(Pyr)Glu- des Reagens (A) die Gruppe (II) ist, läßt sich diese in an sich bekannter Weise
leicht in die L-Pyroglutamylgruppe selbst umwandeln.
Nachstehend werden einige Verfahren aufgeführt, die vorteilhaft zur Durchführung der Bildungsreaktion der
Peptidbindung gemäß der Erfindung angewandt werden können.
I) Das geschützte oder ungeschützte Reagens (A), dessen C-endständige Carboxylgruppe eine freie
Carboxylgruppe ist, wird mit dem geschützten oder ungeschützten Reagens (B), dessen N-endständige
Aminogruppe eine freie Aminogruppe ist, in Gegenwart eines Kondensationsmittels umgesetzt.
II) Das geschützte oder ungeschützte Reagens (A), dessen C-endständige Carboxylgruppe aktiviert
worden ist, wird mit dem Reagens (B) umgesetzt, dessen N-endständige Aminogruppe eine freie
Aminogruppe ist.
III) Das geschützte oder ungeschützte Reagens (A), dessen C-endständige Carboxylgruppe frei ist, wird
mit dem geschützten oder ungeschützten Reagens (B) umgesetzt, dessen N-endständige Aminogruppe
aktiviert worden ist.
Als Schutzgruppe für die innermolekulare Acylaminogruppe
der L-Pyroglutaminsäure kommen somit beispielsweise die Benzylnxycarbonylgruppe, terL-Butoxycarbonylgruppe
und Isobornyloxycarbonylgruppe, als Schutzgruppe für die Iminogruppe von L-Histidin
beispielsweise die Benzylgruppe, Tosylgruppe, 2,4-Dinitrophenylgruppe,
tert-Butoxycarbonylgruppe und Carbobenzoxygruppe, als Schutzgruppe für die Hydroxylgruppe
von L-Serin beispielsweise ätherbildende Gruppen, z. B. die Benzylgruppe und tert-Buty'gruppe,
als Schutzgruppe für die Hydroxylgruppe von Tyrosin beispielsweise ätherbildende Gruppen, z. B. die Benzylgruppe
und tert-Butylgruppe, und als Schutzgruppe für
die Guanidinogruppe von L-Arginin beispielsweise die Nitrogruppe, Tosylgruppe, Carbobenzoxygruppe, Isobornyloxycarbonylgruppe
und Adamantyloxycarbonylgruppe in Frage. Ferner kann die Guanidinogruppe von L-Arginin durch Salzbildung mit einem Proton, das von
einer Säure (z. B. Salzsäure und Bromwasserstoffsäure) abgeleitet ist, geschützt werden. Natürlich ist das Proton
im Rahmen dieser Beschreibung als zu den Schutzgruppen gehörend anzusehen.
Als Beispiele der aktivierten Form der C-endständigen Carboxylgruppe des Reagens (A) sind die
entsprechenden Säureanhydride, z. B. die gemischten Anhydride mit einem Kohlensäuremonoalkylester,
Azide und aktiven Ester (z. B. die entsprechenden Ester mit Alkoholen wie Pentachlorphenol, 2,4,5-Trichlorphenol,
2,4-Dinitrophenol, Cyanmethylalkohol, p-Nitrophenol,
N-Hydroxysuccinimid, N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid, N-Hydroxyphthalimid und N-Hydroxybenztriazol)
zu nennen. Von diesen Estern wird der N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximidester bevorzugt.
Die N-Hydroxy-S-norbornen^.S-dicarboximidester
von Aminosäuren oder Peptiden sind zwar neu, können jedoch in der gleichen Weise wie die
N-Hydroxysuccinimidester von Aminosäuren oder Peptiden hergestellt werden.
Das entsprechende Amid der phosphorigen Säure ist ein Beispiel einer aktivierten Form der N-endständigen
Aminogruppe des geschützten oder ungeschützten Reagens (B).
Als Dehydratisierungsmittel können alle Verbindungen der Art, die für die Peptidsynthese geeignet bind,
verwendet werden. Besonders bevorzugt werden beispielsweise die sogenannten Carbodiimidreagentien,
z. B. Dicyclohexylcarbodümid.
ίο Zur Durchführung der Kondensationsreaktion gemäß
der Erfindung können natürlich in einen einzelnen Reaktor
1) das geschützte oder ungeschützte Reagens (A), dessen C-endständige Carboxylgruppe frei ist,
2) das geschützte oder ungeschützte Reagens (B),
dessen N-endständige Aminogruppe frei ist,
3) der vorstehend genannte Alkohol (z. B. N-Hydroxy-5-norbornen-23-dicarboximid oder N-Hydroxysuccinimid) und
3) der vorstehend genannte Alkohol (z. B. N-Hydroxy-5-norbornen-23-dicarboximid oder N-Hydroxysuccinimid) und
4) das Dehydratisierungsmittel gegeben werden.
In diesem Fall reagiert zuerst das geschützte oder ungeschützte Reagens (A), dessen C-endständige Carboxylgruppe frei ist, mit dem Alkohol mit Hilfe des Dehydratisierungsmittels unter Bildung des geschützten oder ungeschützten Reagens (A), dessen C-endständige Carboxylgruppe aktiviert ist, worauf das letztere mit dem geschützten oder ungeschützten Reagens (B), dessen N-endständige Aminogruppe frei ist, reagiert Bei diesem Prozeß werden die Aktivierung der C-endständigen Carboxylgruppe und die Bildungsreaktion der Peptidbindung in einem Einstufenverfahren durchgeführt.
In diesem Fall reagiert zuerst das geschützte oder ungeschützte Reagens (A), dessen C-endständige Carboxylgruppe frei ist, mit dem Alkohol mit Hilfe des Dehydratisierungsmittels unter Bildung des geschützten oder ungeschützten Reagens (A), dessen C-endständige Carboxylgruppe aktiviert ist, worauf das letztere mit dem geschützten oder ungeschützten Reagens (B), dessen N-endständige Aminogruppe frei ist, reagiert Bei diesem Prozeß werden die Aktivierung der C-endständigen Carboxylgruppe und die Bildungsreaktion der Peptidbindung in einem Einstufenverfahren durchgeführt.
Für die Herstellung der vorstehend beschriebenen, als Produkte gewünschten Peptide stehen somit die
verschiedensten Kombinationen von Verfahren zur Auswahl. Eine bevorzugte Ausführungsform des Verfahrens
gemäß der Erfindung ist nachstehend schematisch dargestellt:
(I) H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-A,-Gly-OH (Reagens (A)) + DCC + HONBl
Aktivierung
H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-A,-Gly-ONBI + H-A2- Arg-Pro-Y
(Aktiviertes Reagens (A)) (Geschütztes
Reagens (B))
Reagens (B))
Bildung der Peptidbindung
H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-ArGly-A2-Arg-Pro-Y
Entfernung der Schutzgruppen
H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-A,-Gly-A2-Arg-Pro-Y
(11) H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-A|-Gly-OH ι- H-A,-Arg-Pro-Y
(Reagens (A))
+ DCC + HONBl
+ DCC + HONBl
(Geschütztes Reagens (B))
© Aktivierung
© Bildung der Peplidbindung
H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-ArGly-A2-Arg-l'ro-Y
Entfernung der Schutzgruppen
H-(Pyr)GIu-His-Trp-Ser-A|-Gly-ArArg-Pro-Y
Im vorstehenden Schema bedeuten DCC das N.N'-Dicyclohexylcarbodiimid, HONBI das N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid
und Z eine Schutzgruppe der Guanidinogruppe des L-Argininrestes.
Die Bildungsreaktion der Peptidbindung, z. B. nach den vorstehend genannten Verfahren (I), (II) oder (III),
wird im allgemeinen in einem Lösungsmittel durchgeführt. Als Lösungsmittel eignen sich beispielsweise
trockenes oder wäßriges Dimethylformamid, Dimethylsulfoxyd,
Pyridin, Chloroform, Dioxan, Dichlormethan. Tetrahydrofuran und Gemische dieser Lösungsmittel.
Die Reaktionstemperatur liegt gewöhnlich im Bereich von etwa —20° bis 3O0C, jedoch kann die
Reaktion auch bei niedrigeren Temperaturen oder unter Erhitzen durchgeführt werden.
Die beiden Ausgangsmaterialien, die eine Peptidbindung bilden sollen, werden gewöhnlich in äquimolaren
Mengen verwendet, jedoch sind gegebenenfalls auch andere Mengenverhältnisse geeignet Im allgemeinen
werden für jedes molare Äquivalent eines Ausgangsmaterials gewöhnlich etwa 1 bis 2 molare Äquivalente,
vorzugsweise etwa 1 bis 1,4 molare Äquivalente der zugehörigen Verbindung (d. h. der Gegenverbindung)
verwendet. Der Anteil des Dehydratisierungsmittels beträgt im allgemeinen etwa 1 bis 2 molare Äquivalente,
bezogen auf das Wasser, das bei der Bildungsreaktion der Peptidbindung gebildet wird.
Gute Ergebnisse werden in vielen Fällen erhalten, wenn die Reaktion etwa 6 bis 10 Stunden durchgeführt
wird.
Nach Beendigung der Bfldungsreaktion der Peptidbindung
kann das Reaktionsprodukt beispielsweise durch Ausfällung mit einem Lösungsmittel (in dem die
gewünschte Verbindung schwer löslich ist) und anschließendes Abfiltrieren der gebildeten Fällung isoliert
werden.
Wenn das Reagens (A) und/oder das Reagens (B) durch die Schutzgruppe oder Schutzgruppen geschützt
sind, enthält das Kondensationsprodukt im allgemeinen die Schutzgruppe oder Schutzgruppen in seinem
Molekül Wie bereits erwähnt, werden jedoch die Schutzgruppe oder Schutzgruppen nach üblichen
Methoden entfernt, die die Aminosäuresequenz des gewünschten Nonapepödamidderivats nicht beeinträchtigen.
Nach der Entfernung der Schutzgruppen bleibt das von Schutzgruppen freie Nonapeptidamidderivat
(I) zurück.
Als Beispiele solcher üblichen Verfahren sind die katalytische Reduktion mit einem Katalysator wie
Palladiumschwarz, Palladiumkohle oder Platin, die Säurehydrolyse beispielsweise mit Fluorwasserstoff
oder Trifluoressigsäure und die chemische Reduktion beispielsweise mit Natriummetall in flüssigem Ammoniak
zu nennen. Bei jedem dieser Verfahren kann die gewünschte Verbindung nach üblichen Methoden, z. B.
durch die oben beschriebene Ausfällung, isoliert werden.
Das in dieser Weise isolierte Endprodukt kann nach
üblichen Methoden, z. B. durch Säulenchromatographie beispielsweise an Carboxymethylcellulose und handelsüblichen
Polymerisaten für die Reinigung, z. B. an den Ionenaustauscherharzen »Sephadex®« oder »Amberlite®
XAD-2«, gereinigt werden.
In Abhängigkeit von den Reaktionsbedingungen wird die gewünschte Verbindung in Form einer Base oder als
Salz einschließlich der pharmazeutisch unbedenklichen Salze erhalten. Aus dem Salz kann die Base nach
üblichen Verfahren hergestellt werden, und die Base kann durch Umsetzung mit Säuren, die für die
Herstellung pharmazeutisch unbedenklicher Salze geeignet sind, in Salze umgewandelt werden. Als Säuren
eignen sich für diesen Zweck verschiedene anorganische Säuren, z. B. Halogenwasserstoffsäuren wie Salzsäure,
Bromwasserstoffsäure, Perchlorsäure, Salpetersäure, Thiocyansäure, Schwefelsäure und Phosphorsäure,
und verschiedene organische Säuren, z. B. Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Glykolsäure, Milchsäure,
Brenztraubensäure, Oxalsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Anthranylsäure,
Zimtsäure, Naphthalinsulfonsäure und Sulfanilsäure.
Aufgrund ihrer äußerst geringen Toxizität können die in der vorstehend beschriebenen Weise hergestellten
Nonapeptidamide oder ihre pharmazeutisch unbedenklichen Salze unbedenklich verabreicht werden. Diese
Verbindungen zeigen eine starke ovulationsinduzieren de Wirkung.
Wenn Ratten eine winzige Menge (z.B. 50 bis 500ng/100g) eines Nonapeptidamids (I) oder dessen
pharmazeutisch unbedenklichen Salzes intravenös.
intramuskulär oder subkutan erhalten, ist ein steiler Anstieg der Konzentration des luteinisierenden Hormons
und des follikelstimulierenden Hormons im Blut festzustellen.
Wenn Ratten eine Infusion von 10 bis 200ng/100g
der Verbindung intravenös oder intramuskulär erhalten, wird die Ovulation bei etwa 50% der Ratten ausgelöst.
Wenn die Ratten eine Infusion von 0,1 bis 5 μg/100 gder
Verbindung intravenös oder intramuskulär erhalten, wird die Ovulation bei 100% der als Versuchstiere
verwendeten Ratten ausgelöst, auch wenn die Ratten sich im Diöstrus befinden. Bei unveränderter Dosis ist
die intravenöse Infusion im allgemeinen doppelt so wirksam wie die subkutane Infusion.
Die vorstehenden Werte zeigen, daß die Peptide gemäß der Erfändung stärkere Hormonwirkungen
haben als das natürlich vorkommende, die Sekretion des luteinisierenden Hormons auslösende Hormon.
Injektionslösungen können durch Auflösen der Verbindungen gemäß der Erfindung in physiologischer
Kochsalzlösung hergestellt werden.
Da diese Verbindungen auch bei Verwendung in sehr winzigen Mengen eine genügende physiologische
Wirkung aufweisen, ist es zweckmäßig, sie als gefriergetrocknete Ampullenpräparate, die Mannit als
Hilfsstoff enthalten, zu verwenden.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert. In diesen Beispielen werden die
folgenden Abkürzungen mit den nachstehend genannten Bedeutungen verwendet:
Z-: | Benzyloxycarbonyl; |
IBOC-: | Isobomyloxycarbonyl; |
BOC- : | tert.- Butyloxycarbany 1; |
-OEt: | Äthylester: |
-OSU: | N-Hydroxysuccinimidester; |
-OtBu: | tert.-Butylester; |
-ONDP: | 2,4-Dinitrophenolester; |
-ONBl: | N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarbon |
säureimidester; | |
HONBl: | N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarbon |
säureamid; | |
DCC: | Ν,Ν'-Dicyclohexylcarbodiimid; |
DMF: | N,N-Dimethylformamid; |
DSC: | Dünnschichtchromatographie; |
DCHA: | Dicyclohexylamin. |
Rf 1 = Chloroform-Methanol-Essigsäure
(9:1: 0,5)
Rf 2 = Äthylacetat-Pyridin-Essigsäure-Wasser
Rf 2 = Äthylacetat-Pyridin-Essigsäure-Wasser
(60:20:6:11)
Rf 3 = n-Butanol-Athylacetat-Essigsäure-Wasser
Rf 3 = n-Butanol-Athylacetat-Essigsäure-Wasser
(1:1:1:1)
Rf 4 = n-Butanol-Essigsäure-Wasser
Rf 4 = n-Butanol-Essigsäure-Wasser
(4:1:1)
Rf 5 = n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser
Rf 5 = n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser
(30:20:6:24)
Haas Co., USA); »Sephadex LH 20« (verestertes Dextrangel, Hersteller Pharmacia Fine Chemicals,
Sweden); »Amberlite XAD-2« (makroreükuläres Styrol-Divinylbenzol-Copolymerisat)
und »Amberlite IRA-400« (Copolymerisat von tertiärem Amin, Styrol und
Divinylbenzol, Hersteller Rohm & Haas Co., USA).
Herstellung von
K) H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-NHC2H5
a) Herstellung von Z-A^(NO2J-PrO-NHC2H5
In 10 Raumteilen DMF werden 0,901 Gew.-Teile Z-Arg(NO2)-Pro-OH und 0,181 Gew.-Teile Äthylaminhydrochlorid
gelöst. Während bei 0°C gehalten wird, werden 0,38 Raumteile Triäthylamtn zugetropft. Nach
Zusatz von 0,43 Gew.-Teilen HONBl und 0,495 Gew.-Teilen DCC wird das Gemisch 5 Stunden bei 00C
und dann 10 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Der als Nebenprodukt gebildete Harnstoff wird abfiltriert
und das DMF abdestilliert. Der Rückstand wird mit Chloroform extrahiert, mit Wasser gewaschen und über
wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Das Chloroform wird abdestilliert und der Rückstand mit Äther
behandelt und aus Methanol-Äther erneut ausgefällt.
Ausbeute 0,692 Gew.-Teile; Rf 1 =0,50;
Schmelzpunkt 141° - 145°C(Zers.);
[α] " = 44,6° (C= 1, Methanol).
Ausbeute 0,692 Gew.-Teile; Rf 1 =0,50;
Schmelzpunkt 141° - 145°C(Zers.);
[α] " = 44,6° (C= 1, Methanol).
Elementaranalyse:
20
25
30
35
40
45
Für die Dünnschichtchromatographie werden die folgenden Entwicklerlösungsmittelsysteme verwendet:
50
55
60
In den Beispielen verhalten sich Gewichtsteile zu Raumteilen wie Gramm zu Kubikzentimeter. Die
Prozentsätze sind auf das Gewicht bezogen, falls nicht anders angegeben. Die folgenden Ionenaustauscherharze
werden verwendet:
»Amberlite CG-400« (Copolymerisat von tertiärem Amin, Styrol und Divinylbenzol, Hersteller Rohm&
Berechnet | für | C 52,82. | H 6,54, | N | 20,53; |
C21H31O6N | 7: | C 52.95. | H 6,77, | N | 19,65. |
gefunden: | |||||
b) Herstellung von Z-Leu-Arg(NO2)-Pro-NHC2H5
In 5 Raumteilen 25% HBr-Essigsäure werden 0,572
Gew.-Teile Z-Arg(NO2)-Pro-NHC2H5 gelöst. Die Lösung
wird 30 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Dann wird trockener Äther zum Reaktionsgemisch
gegeben und die gebildete Fällung H-Arg(NO2)-Pro-NHC2H5
abfiltriert und getrocknet. Getrennt hiervon werden 0,291 Gew.-Teile Z-Leu-OH in 5 Raumteilen
Dioxan gelöst. Unter Kühlen werden 0,247 Gew.-Teile DCC und 0,215 Gew.-Teile HONBI zugesetzt. Das
Gemisch wird 2 Stunden gerührt und der als Nebenprodukt gebildete Harnstoff abfiltriert. Zum
Filtrat wird die in der oben beschriebenen Weise erhaltene Fällung gegeben, die durch Zusatz von 3
Raumteilen DMF gelöst wird. Während gekühlt wird, werden 0,17 Raumteile Triäthylamin zugetropft, worauf
das Gemisch über Nacht bei Raumtemperatur gerührt wird. Das Lösungsmittel wird abdestilliert und der
Rückstand mit Chloroform extrahiert und mit Wasser gewaschen. Die Chloroformschicht wird über wasserfreiem
Magnesiumsulfat getrocknet und das Chloroform abdestilliert Der Rückstand wird mit Äther
behandelt und aus Methanol-Äther erneut ausgefällt
Ausbeute 0,47 Gew.-Teile (72%);
Schmelzpunkt 144° -146°C(Zers.);
Rf 1 =0,40; [λ]? = -58,0° (c= 1, Methanol).
Ausbeute 0,47 Gew.-Teile (72%);
Schmelzpunkt 144° -146°C(Zers.);
Rf 1 =0,40; [λ]? = -58,0° (c= 1, Methanol).
c) In 25% HBr-Essigsäure werden 0,165 Gew.-Teile Z-Leu-Arg(NO2)-Pro-NHC2H5 gelöst Die Lösung wird
30 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Dann wird trockener Äther dem Reaktionsgemisch zugesetzt
und die gebildete Fällung abfiltriert und gut getrocknet Diese Fällung wird in 3 Raumteilen DMF gelöst
Während gekühlt und gerührt wird, werden 0,05 Raumteile N-Äthylmorpholin zugetropft. In dieser
Lösung werden 0,19 Raumteile H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-OH-hydrochlorid
gelöst. Zur Lösung werden 0,054 Gew.-Teile HONBI und 0,062 Gew.-Teile DCC gegeben.
Das Gemisch wird 2 Stunden bei 0° und dann über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Der als Nebenprodukt
gebildete Harnstoff wird abfiltriert und das DMF abdestilliert. Der Rückstand wird mit Äthylacetat in
behandelt, wobei 0,32 Gew.-Teile eines Pulvers erhalten werden. Dieses Produkt wird auf eine Säule von
Amberlite XAD-2 aufgegeben und in einem Elutionssystem mit linearem Gradienten von 5%igem wäßrigem
Äthanol bis Äthanol desorbiert. Die Hauptfraktion wird 15
gefriergetrocknet, wobei 0,11 Raumteile reines H-(Pyr)GIu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg(NO2)-Pro-NHC2Hs
erhalten werden. Dieses Produkt wird 1 Stunde mit 4 Raumteilen Fluorwasserstoff bei 0°C in Gegenwart
von 0,02 Raumteilen Anisol und 0,02 Raumteilen 2» Mercaptoäthanol behandelt. Der Fluorwasserstoff wird
abdestilliert und der Rückstand nach der Trocknung in Wasser gelöst. Die Lösung wird durch eine Säule von
Amberlite IRA-400 (Acetatform) geleitet und dann an einer Carboxymethylcellulosesäule adsorbiert. Die Sau- 2r>
Ie wird in einem Elutionssystem mit linearem Gradienten von wäßrigem 0.005N Ammoniumacetat bis zu
wäßrigem 0,2N Ammoniumacetat eluiert. Die Hauptfraktion wird gefriergetrocknet. Hierbei werden 0,087 C2OH40O7Ns: C 5^,15, H 7,02,
Gew.-Teile reines H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly- 30 gefunden: C54-.37, H 6,98,
Leu-Arg-PrO-NHC2H5 erhalten.
Rf 3 = 0,36;
[λ];- = -56,2° (f=O,5,5% Essigsäure).
Rf 3 = 0,36;
[λ];- = -56,2° (f=O,5,5% Essigsäure).
Aminosäureanalyse:
His 0,95 (1); Arg 0,98 (1); Ser 0,95 (1);
GIu 0,98(1), Pro 1,00(1); GIy 1,00(1);
Leu l,00(l);Tyrl,00(l);NH2C2H51,10(1).
Leu l,00(l);Tyrl,00(l);NH2C2H51,10(1).
Die Klammerzahlen sind die berechneten Werte.
Beispiel 2
Herstellung von
Herstellung von
H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-NHCH3
a) Herstellung von Z-Arg(NO2)-Pro-NHCH3
In 5 Raumteilen DMF werden 0,675 Gew.-Teile Z-Arg(N02)-Pro-OH und 0,101 Gew.-Teile Methylaminhydrochlorid
gelöst Während die Lösung bei 00C gehalten wird, werden 0,21 Raumteile Triäthylamin
zugetropft Nach Zusatz von 0.322 Gew.-Teilen HONBI und 0,37 Gew.-Teilen DCC wird das Gemisch 5 Stunden
bei 00C und dann 10 Stunden bei Raumtemperatur
gerührt Der als Nebenprodukt gebildete Harnstoff wird abfiltriert und das DMF abdestilliert Der Rückstand
wird mit Chloroform extrahiert mit Wasser gewaschen und über wasserfreiem Magnesium Magnesiumsulfat
getrocknet Das Chloroform wird abdestilliert und der Rückstand mit Äthanol behandelt und aus Methanol-Äther
erneut ausgefällt
Ausbeute 0,612 Gew.-Teile (88%);
Rf 1 =030; Schmelzpunkt 137° - 143°C(Zers.);
[α]? 41,5° (c= 1,Methanol).
Ausbeute 0,612 Gew.-Teile (88%);
Rf 1 =030; Schmelzpunkt 137° - 143°C(Zers.);
[α]? 41,5° (c= 1,Methanol).
Elementaranalyse:
Berechnet für
C20H29O6N7: C 51,82, H 631, N 21,15;
gefunden: C 51,84, H 6,54, N 21,57.
gefunden: C 51,84, H 6,54, N 21,57.
60
65
b) Herstellung von Z-Leu-Arg(NO2)-Pro-NHCHj
In 5 Gew.-Teilen 25% HBr-Essigsäure werden 0,556 Gew.-Teile Z-Arg(NO2)-Pro-NHCH3gelöst. Die Lösung
wird 30 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Dann wird trockener Äther zugesetzt, worauf die
gebildeten Kristalle abfiltriert und getrocknet werden. Getrennt hiervon werden 0,312 Gew.-Teile Z-Leu-OH
in 5 Raumteilen Dioxan-Äthylacetat (1 :1) gelöst. Während die Lösung gekühlt wird, werden 0,268
Gew.-Teile DCC und 0,232 Gew.-Teile HONBl zugesetzt. Das Gemisch wird 2 Stunden gerührt. Der als
Nebenprodukt gebildete Harnstoff wird abfiltriert. Zum Filtrat werden die in der oben beschriebenen Weise
hergestellten Kristalle gegeben und durch Zusatz von 3 Raumteilen DMF gelöst. Während gekühlt wird, werden
0,17 Raumteile Triäthylamin zugesetzt. Das Gemisch wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das
Lösungsmittel wird abdestilliert. Der Rückstand wird mit Chloroform extrahiert und mit V/asser gewaschen.
Die Chloroformschicht wird über wasserfreiem Magnesiumsulfat dehydratisiert, worauf das Chloroform
abdestilliert wird Der Rückstand wird mit Äther behandelt und aus Methanol-Äther erneut ausgefällt
Ausbeute 0,45 Gew.-Teile (78%); Rf 1 =0,25.
Ausbeute 0,45 Gew.-Teile (78%); Rf 1 =0,25.
Elementaranalyse:
Berechnet für
N 19,43;
N 19.52.
N 19.52.
c) In 5 Raumteilen 25% HBr-Essigsäure werden 0,144 Gew.-Teile Z-Leu-Arg(NO2)-Pro-NHCH3 gelöst. Die
Lösung wird 30 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen, worauf trockener Äther zugesetzt wird. Die
gebildete Fällung wird abfiltriert und gut getrocknet. Sie wird dann in 3 Raumteilen DMF gelöst. Während die
Lösung gekühlt und gerührt wird, werden 0,05 Raumteile N-Äthylmorpholin zugetropft
In dieser Lösung werden 0,19 Gew.-Teile H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-OH-hydrorhlorid
gelöst. Zur Lösung werden 0,054 Gew.-Teile HONBl und 0,062 Gew.-Teile DCC gegeben. Das Gemisch wird 2 Stunden
bei 00C und dann über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Der als Nebenprodukt gebildete Harnstoff wird
abfiltriert und das DMF abdestilliert Der Rückstand wird auf eine Säule von Amberlite XAD-2 aufgegeben
und in einem Elutionssystem mit linearem Gradienten von 5%igem wäßrigem Äthanol bis Äthanol desorbiert.
Die Hauptfraktion wird gefriergetrocknet, wobei 0,137 Gew.-Teile reines H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg(NO2)-Pro-NHCH3
erhalten werden. 0,09 Gew.-Teile dieses Produktes werden mit 4 Gew.-Teilen
Fluorwasserstoff in Gegenwart von 0,02 Raumteilen Anisol und 0,02 Raumteilen Mercaptoäthanol 1 Stunde
bei 0° C behandelt Der Fluorwasserstoff wird abdestilliert und der Rückstand nach dem Trocknen in Wasser
gelöst Die Lösung wird durch Amberlite IRA-400 (Acetatform) geleitet und dann an einer Säule von
Carboxymethylcellulose adsorbiert Die Säule wird in einem Elutionssystem mit linearem Gradienten von
wäßrigem 0,005N Ammoniumacetat bis zu wäßrigem 0,2N Ammoniumacetat eluiert. Die Hauptfraktion wird
gefriergetrocknet Hierbei werden 0,06 Gew.-Teile reines H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-NHCH3
erhalten.
Rf 3=037; [α]? = -55,6° (c=0,5 5%iger wäßriger
Essigsäurelösung).
Aminosäureanalyse:
His 0,96(1); Arg 0,98 (l);Ser 0,96(1); GIu 1,00(1); Pro 1,00(1);GIy 1,00(1);
Leu 0,98(1); Ty r 0,98(1); NH2CH31,12(1).
Die Klammerzahlen sind die berechneten Werte.
Herstellung von
H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Pyrrolidid
a) Herstellung von IBOC-Pro-Pyrrolidid
In 30 Raumteilen Acetonitril werden 11,7 Gew.-Teile
IBOC-Pro-OSU und 2,3 Raumteile Pyrrolidin gelöst. Die Lösung wird über Nacht gerührt. Das Acetonitril wird
abdestilliert und der Rückstand mit Äthylacetat extrahiert. Der Extrakt wird mit Wasser gewaschen und
über wasserfreiem Natriumsulfat dehydratisiert. Das Äthylacetat wird abdestilliert Die erhaltenen Kristalle
werden aus Äthylacetat-Erdölbenzin umkristallisiert. Ausbeute 8,4 Raumteile (80,2%);
Schmelzpunkt 84° -84,5°C;
[<x] =-83,4° (c= 1.0, Methanol).
Schmelzpunkt 84° -84,5°C;
[<x] =-83,4° (c= 1.0, Methanol).
Elementaranalyse:
Berechnet für
C20H32O3N,: C 68,93, H 9,26, N 8,04;
gefunden: C 68,93, H 9,43, N 8,17.
b) Herstellung von
IBOC- Arg(N O2)- Pro- Py rrolidid
In 30 Raumteilen Trifluoressigsäure werden 6,96 Gew.-Teile IBOC-Pro-Pyrrolidid gelöst. Die Lösung
wird 30 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Zur Lösung wird trockener Äther gegeben. Das
erhaltene öl wird durch Dekantieren isoliert und in einem Exsiccator, der Natriumhydroxyd enthält, getrocknet
Getrennt hiervon werden 7,98 Gew.-Teile lBOC-Arg(NO2)-OH in 40 Raumteilen Acetonitril
gelöst. Während die Lösung bei 0°C gehalten wird, v/erden 4,0 Gew.-Teile Dinitropheno! und 4,6 Gew.-Teile
DCC zugesetzt worauf 2 Stunden gerührt wird. Der als Nebenprodukt gehildete Harnstoff wird abfiltriert
und das in der oben beschriebenen Weise erhaltene Öl dem Filtrat zugesetzt Das Gemisch wird auf 0°C
gekühlt, worauf 2,5 Raumteile N-Äthylmorpholin zugetropft werden. Das Gemisch wird über Nacht bei
Raumtemperatur gerührt. Das Acetonitril wird abdestilliert und der Rückstand an 100 Gew.-Teilen Kieselgel
adsorbiert und mit 5%igem wäßrigem Methanol desorbiert Nach dieser Reinigung wird das Lösungsmittel
abdestilliert wobei 6,0 Gew.-Teile eines Pulvers erhalten werden. Ausbeute 54,5%;
Schmelzpunkt 190° - 193°C (Zers.); [«]'.· = -59,7° (c= 1,Methanol).
Elementaranalyse:
Berechnet für
C26H43O6N7: C 56,82, H 7,88, N 17,84;
gefunden: C 57,00, H 8,26, N 17,51.
c) Herstellung von IBOC-Leu-Arg(NO2)-Pro-Pyrrolidid
In 30 Raumteilen Trifluoressigsäure werden 5,49 Gew.-Teile IBOC-Arg(NO2)-Pro-Pyrrolidid gelöst Die
60
65 Lösung wird 30 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen.
Dann wird trockener Äther zugesetzt. Die gebildete Fällung wird abfiltriert und gut getrocknet,
wobei ein Pulver erhalten wird. Getrennt hiervon werden 3,95 Gew.-Teile IBOC-Leu-OH in 20 Raumteilen
Dioxan gelöst. Während die Lösung bei O0C gehalten wird, werden 1,52 Gew.-Teile N-Hydroxysuccinimid
und 2,7 Gew.-Teile DCC zugesetzt, worauf das Gemisch 2 Stunden gerührt wird. Der als Nebenprodukt
abgeschiedene Harnstoff wird abfiltriert. Zum Filtrat wird das in der oben beschriebenen Weise erhaltene
Pulver gegeben, worauf 10 Raumteile Tetrahydrofuran zugesetzt werden. Das Gemisch wird auf 0°C gekühlt,
worauf 1,4 Raumteile Triethylamin zugetropft werden. Das Gemisch wird über Nacht bei Raumtemperatur
gerührt, das Lösungsmittel abdestillierl und der Rückstand mit Äthylacetat extrahiert. Der Extrakt wird
mit einer 5%igen wäßrigen Natriumhydrogencarbonatlösung und einer 10%igen wäßrigen Citronensäurelösung
gewaschen. Er wird dann mit Wasser gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat dehydratisiert.
Das Äthylacetat wird abdestilliert und der Rückstand mit Erdölbenzin gewaschen. Der Rückstand wird dann
aus Äthylacetat-Erdölbenzin erneut ausgefällt.
Ausbeute 5,8 Gew.-Teile;
Schmelzpunkt 185° - 186°C (Zers.);
[öl]: = -53,6° (C= 0,98,Methanol).
Ausbeute 5,8 Gew.-Teile;
Schmelzpunkt 185° - 186°C (Zers.);
[öl]: = -53,6° (C= 0,98,Methanol).
Elementaranalyse:
Berechnet für C32H54O7N8 · H2O:
C 56,45, H 8,29, N 16,46;
gefunden: C 56,97, H 8,17, N 15,25.
gefunden: C 56,97, H 8,17, N 15,25.
d) In 50 Raumteilen Methanol werden 0,22 Gew.-Teile IBOC-Leu-Arg(NO2)-Pro-Pyrrolidid gelöst. Die Lösung
wird 8 Stunden der Hydrierung in Gegenwart von Palladiumschwarz unterworfen. Das Methanol wird
abdestilliert und der Rückstand mit Äther behandelt. Das erhaltene Pulver wird in einem Gemisch von 5
Raumteilen Trifluoressigsäure und 1 Raumteil 2N HCl-Essigsäure gelöst. Die Lösung wird 40 Minuten bei
Raumtemperatur stehengelassen. Die Trifluoressigsäure wird abdestilliert, worauf trockener Äther zugesetzt
wird. Die gebildete Fällung wird abfiltriert und gut getrocknet Dieses Pulver (0,153 Gew.-Teile) wird in 3
Raumteilen DMF zusammen mit 0,24 Gew.-Teilen H-(Pyr-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-OH-hydrochlorid gelöst.
Zur Lösung werden 0,0742 Gew.-Teile DCC, 0,0644 Gew.-Teile HONBI und 0.084 Raumteile N-Äthylmorpholin
gegeben. Das Gemisch wird 5 Stunden bei 0°C und dann über Nacht bei Raumtemperatur gerührt Der
als Nebenprodukt gebildete Harnstoff wird abfiltriert Zum Filtrat wird Äthyiacetat gegeben. Die Faiiung wird
filtriert und in einer Menge von 0,26 Gew.-Teilen gewonnen. Eine Menge von 0,2 Gew.-Teilen dieses
Produktes wird an einer Säule von Amberlite® XAD-2 adsorbiert und in einem Elutionssystem mit linearem
Gradienten von 5%igem wäßrigem _Äthanol (180 Raumteile) bis zu 50%igem wäßrigem Äthanol eluiert
Die Fraktionen, die scharf abgegrenzte Zonen bei der Dünnschichtchromatographie (Kieselgel) bilden, werden
aufgefangen und gefriergetrocknet
Die Ausbeute beträgt 0,02 Gew.-Teile.
[α]? = -91,0° (c= 0,5,5% Essigsäure;
Papierchromatographie: Rf=0,72 (n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser
= 30:20:6:24).
Die Ausbeute beträgt 0,02 Gew.-Teile.
[α]? = -91,0° (c= 0,5,5% Essigsäure;
Papierchromatographie: Rf=0,72 (n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser
= 30:20:6:24).
Aminsäureanalyse:
His 1,09(1): Arg 0,96 (l);.Ser 0,82(1);
GIu 1,00(1); Pro 0,96~;);Gly 1,00(1);
Leu 1,00(1); Tyr 0,96(1).
GIu 1,00(1); Pro 0,96~;);Gly 1,00(1);
Leu 1,00(1); Tyr 0,96(1).
Herstellung von
H-(Pyr)G Iu-H is-Trp-Ser-Tyr-
Gly-Nle-Arg-Pro-NH-CH2CH3
a) Herstellung von
Z-NIe-Arg(NO2)-Pro-NH-CH2CHj
Z-NIe-Arg(NO2)-Pro-NH-CH2CHj
In 4 Raumteilen 25% Bromwasserstoff-Essigsäure werden 0,4775 Gew.-Teile Z-Arg(NO2)-Pro-NH-CH2CH3
gelöst. Die Lösung wird 30 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Dann werden 50
Raumteile trockener Äther zum Reaktionsgemisch gegeben. Die abgeschiedene Fällung wird abfiltriert, mit
Äther gut gewaschen und über Natriumhydroxyd unter vermindertem Druck getrocknet. Getrennt hiervon
werden 0,2653 Gew.-Teile Z-NIe-OH in einem Gemisch von 2 Raumteilen Äthylacetat und 12 Raumteilen
Dioxan gelöst. Während die Lösung bei 0°C gehalten wird, werden 0,197 Gew.-Teile HONBI und 0,226
Gew.-Teile DCC zugesetzt. Das Gemisch wird 3 Stunden gerührt Der als Nebenprodukt gebildete
Harnstoff wird abfiltriiert und das Filtrat zu einer Lösung der in der oben beschriebenen Weise erhaltenen
Fällung in 1 Raumteil DMF gegeben, worauf 0,28 Raumteile Triäthylamin zugetropfl werden. Das Gemisch
wird über Nacht gerührt, das Lösungsmittel abdestilliert und der Rückstand mit 100 Raumteilen
Chloroform extrahiert. Der Extrakt wird mit 5%iger wäßriger Natriumhydrogencarbonatlösung, Wasser,
0,5N Salzsäure und Wasser gewaschen und dann über wasserfreiem Magnesiumsulfat dehydratisiert Das
Chloroform wird abdeütilliert und der Rückstand mit Äther behandelt und aus Äthanol-Äther erneut
ausgefällt.
Die Ausbeute beträgt 0,41 Gew.-Teile;
Schmelzpunkt 109° -11 l°C(Zers.);
[«]-;■ = -50,4° (C= 0,5,Äthanol).
Schmelzpunkt 109° -11 l°C(Zers.);
[«]-;■ = -50,4° (C= 0,5,Äthanol).
Elementaranalyse:
Berechnet für C27H42O7N8 · 0,5 H2O:
C 54,07, H 7,22, N 18,68;
gefunden: C 53,79, H 7,09, N 18,24.
gefunden: C 53,79, H 7,09, N 18,24.
In 2 Raumteilen 25% Bromwasserstoff-Essigsäure werden 0.155 Gew.-Teile Z-Nle-Arg(NO2)-Pro-NH-CH2CH3
gelöst. Die Lösung wird 30 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Dann werden 50
Raumteile trockener Äther zum Reaktionsgemisch gegeben. Die abgeschiedene Fällung wird abfiltriert, mit
Äther gut gewaschen und über Natriumhydroxyd unter vermindertem Druck getrocknet.
Die Fällung wird in 2 Raumteilen DMF gelöst. Während die Lösung bei 0° C gehalten wird, werden 0,19
Gew.-Teile H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-OH-hydrochlorid,
0,09 Gew.-Teile HONBI, 0,103 Gew.-Teile DCC und 0,1 Raumteil N-Äthylmorpholin in dieser
Reihenfolge zugegeben. Das Gemisch wird 5 Stunden bei 0°C und 10 Stunden bei Raumtemperatur gerührt.
Der als Nebenprodukt abgeschiedene Harnstoff wird abfiltriert und das DMF unter vermindertem Druck
abdestilliert. Der Rückstand wird in 4 Raumteilen
5%igem wäßrigem Äthanol zusammen mit 0,2 Gew.-Teilen
Harnstoff gelöst Die Lösung wird an einer Säule von Amberlite XAD-2 adsorbiert und in einem
Elutionssystem mit linearem Gradienten von 5%igem ) wäßrigem Äthanol bis 80%igem wäßrigem Äthanol
desorbiert Die Hauptfraktion wird gefriergetrocknet, wobei 0,067 Gew.-Teile H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-GIy-Nle-Arg(NO2)-Pro-NH-CH2CH3
erhalten werden. Eine Menge von 0,060 Gew.-Teilen dieses Produktes
1« wird in 4 Raumteilen Fluorwasserstoff bei — 500C in
Gegenwart von 0,05 Raumteilen Anisol und 0,02 Raumteilen 2-Mercaptoäthanol gelöst Die Lösung wird
1 Stunde bei 0°C gerührt. Der Fluorwasserstoff wird unter vermindertem Druck abdestilliert und der
υ Rückstand in einem Natriumhydroxyd enthaltenden
Exsiccator getrocknet. Der Rückstand wird in 20 Raumteilen Wasser gelöst und die Lösung durch
Amberlite CG-400 (Acetatform) geleitet. Der Ablauf wird gefriergetrocknet und auf eine Säule von
-'« Carboxymethylcellulose aufgegeben. Er wird in einem
Elutionssystem mit linearem Gradienten von 0.005N Ammoniumacetat bis 0,2N Ammoniumacetat desorbiert
Die Hauptfraktion wird gefriergetrocknet, wobei 0,035 Gew.-Teile des gewünschten Produktes erhalten
werden. Dieses P. odukt wird auf eine Säule von »Sephadex LH-20« aufgegeben und mit 0,1 N Essigsäure
desorbiert. Die homogene Fraktion wird gefriergetrocknet, wobei 0,028 Gew.-Teile reines H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Nle-Arg-Pro-NH-CH2CH3
erhalten werden.
[λ] = -52,2° (c= 0,5,5%ige Essigsäure).
Aminosäureanalyse:
His 1,00(1); Arg l,02(l);Trp 1,00(1);
SerO,91 (l);Glu 1,00(1); Pro 1,05(1);
GIy 0,98 (l);Tyr 1,00(1); Nie 1,02(1).
Herstellung von
H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Phe-
Gly-Leu-Arg-Pro-NH-CH2CH3
a) Herstellung von Z-Ser-Phe-Gly-OEt
2,5 Gew.-Teile Z-Phe-Gly-OEt werden in 50 Raumteilen
Methanol gelöst. Die Lösung wird 4 Stunden der katalytischen Reduktion mit 5%iger Palladiumkohle
unterworfen. Der Katalysator wird abfiltriert und das
Lösungsmittel abdestilliert. Der Rückstand wird in 20 Raumteilen Dimethylformamid gelöst. Zur Lösung
werden 2,6 Gew.-Teile Z-Ser-ODNP gegeben. Das Gemisch wird 8 Stunden gerührt Das Lösungsmittel
wird abdestilliert und der Rückstand in Äthylacetat gelöst Das Lösungsmittel wird mit 5%iger wäßriger
Natriumhydrogencarbonatlösung, IN Salzsäure und Wasser gewaschen und dann über Magnesiumsulfat
getrocknet Das Lösungsmittel wird abdestilliert und der feste Rückstand aus Äthylacetat-Erdölbenzin
to kristallisiert
Die Ausbeute beträgt 1,75 Gew.-Teile (74,2%):
Schmelzpunkt 128° -129° C;
[«]{.· = -26,6° (c= 0,6,Äthanol).
Schmelzpunkt 128° -129° C;
[«]{.· = -26,6° (c= 0,6,Äthanol).
Elementaranalyse | C61.13, C 60,47, |
H
H |
6,20, 6,00, |
N
N |
8,91; 8,88. |
230 215/146 |
Berechnet für C24H29O7N3: gefunden: |
||||||
b) Herstellung von Z-Ser-Phe-Gly-NHNH2
1,65 Gew.-Teile Z-Ser-Phe-Gly-OEt werden in 20
Raumteilen Methanol gelöst. Zur Lösung werden 0,71 Raumteile Hydrazinhyd at gegeben. Das Gemisch wird
8 Stunden stehengelassen. Die gebildeten Kristalle werden abfiltriert und mit Methanol-Äther (1:1)
gewaschen.
Die Ausbeute beträgt 1,6 Gew.-Teile (100%);
Schmelzpunkt 191 ° -193° C;
[α]-,· = -23,0° (c= 2, DMF).
Schmelzpunkt 191 ° -193° C;
[α]-,· = -23,0° (c= 2, DMF).
Elementaranalyse:
Berechnet für
CmHvN5O6: C 57,76, H 5,95, N 15,31;
gefunden: C57.32, H 6,21, N 15,53.
c) Herstellung von
Z-Ser-Phe-Gly-Leu-
Arg(NO2)-Pro-NH-CI-bCHj
0,8 Gew.-Teile Z-Ser-Phe-Gly-NHNH2 werden in 10
Raumteilen DMF gelöst. Die Lösung wird gekühlt. Dann werden 3,5 Raumteile 2N Salzsäure zugesetzt.
Während bei — 6°C gerührt wird, wird eine wäßrige 2N
Natriumnitritlösung zugesetzt. Das Gemisch wird 10 Minuten der Reaktion überlassen. Die Fällung wird
durch Zugabe von 10 Raumteilen DMF gelöst. Zum Reaktionsgcmisch wird eine gesättigte wäßrige Natriumchloridlösung
gegeben, worauf mit Äthylacetat extrahiert wird. Der Extrakt wird mit der Waschflüssigkeit
zusammengegossen. Die Lösung wird mit 5%iger wäßriger Natriumhydrogencarbonatlösung und gesättigter
wäßriger Natriumchloridlösung gewaschen. Die Äthylacetatschicht (80 Raumteile) wird über Natriumsulfat
getrocknet und dann zu 20 Raumteilen einer Lösung von 1,04 Gew.-Teilen H-Leu-Arg(NO2)-Pro-NH-CH2CH3
in DMF gegeben. Das Äthylacetat wird in ein Eisbad abdestilliert Die erhaltene homogene
Lösung wird 2 Tage bei 3°C gerührt. Das Lösungsmittel
wird abdestilliert und der Rückstand durch Chromatographie an Kieselgel gereinigt. Das Chromatogramm
wird mit einem Lösungsmittelsystem aus Äthylacetat-Pyridin-Essigsäure-Wasser
(60 : 20 : 6 :10) entwickelt. Die aktiven Fraktionen werden zusammengegossen und
zur Entfernung der Lösungsmittel destilliert. Zum Rückstand wird Wasser gegeben. Der gebildete
Feststoff wird abfiltriert.
Die Ausbeute beträgt 0,87 Gew.-Teile (61,2%);
Schmelzpunkt 1080C;
[λ] =-59,l°(c=0,7.Äthanol).
Die Ausbeute beträgt 0,87 Gew.-Teile (61,2%);
Schmelzpunkt 1080C;
[λ] =-59,l°(c=0,7.Äthanol).
Elementaranalyse:
Berechnet für C4iH5iOnNii ■ H2O:
C 54,72, H 6,83, N 17,12:
gefunden: C 54,95, H 6,84, N 16,74.
gefunden: C 54,95, H 6,84, N 16,74.
d) 0,836 Gew.-Teile Z-Ser-Phe-Gly-Leu-Arg(NO2)-PrO-NH-CH2CH3
werden in Methanol gelöst. Zur Lösung wird 1 Raumteil IN Salzsäure gegeben. Die
Lösung wird der katalytischen Reduktion mit Palladiumschwarz unterworfen. Der Katalysator wird abfiltriert
und das Lösungsmittel abdestilliert. Der Rückstand wird in 10 Raumteilen DMF gelöst. In der Lösung
werden 0,83 Gew.-Teile H-(Pyr)Glu-His-Trp-OH und 0,36 Gew.-Teile HONBl gelöst. Das Gemisch wird auf
-5°C gekühlt, worauf 0,412 Gew.-Teile DCC zugesetzt werden. Das Gemisch wird 2 Tage der Reaktion
überlassen, worauf die Fällung abfiltriert und das DMF abdesiilliert wird Der Ruckstand wird durch Chromatographie
an einer Säule von Amberlite XAD-2 in einem Elutionssystem mit linearem Gradienten von 5%igem
wäßrigem Äthanol bis 80%igem wäßrigem Äthanol ϊ gereinigt. Die aktiven Fraktionen werden zusammengegossen
und zur Entfernung des Äthanols destilliert Die als Rückstand verbleibende wäßrige Lösung wird
gefriergetrocknet Das erhaltene Pulver wird durch lonenaustauschchromatographie an Carboxymethylcel-
K) lulose in einem Elutionssystem mit linearem Gradienten
von 0,005N bis 0,1N wäßrigem Ammoniumacetat weiter gereinigt. Die aktive Fraktion wird gefriergetrocknet,
wobei ein rein weißes Pulver erhalten wird.
Die Ausbeute beträgt 0,424 Gew.-Teile;
Die Ausbeute beträgt 0,424 Gew.-Teile;
Ii [et]: =-55° (c= 0,5,5% Essigsäure).
Aminosäureanalyse:
His 1,02(1); Arg 1,101 (l);Trp 0,91(1);
Ser0,90(l);GIu 1,00(1); Pro 1,00(1);
GIy 0,98 (1); Leu 1,00 (l);Phe 1.00(1);
Ser0,90(l);GIu 1,00(1); Pro 1,00(1);
GIy 0,98 (1); Leu 1,00 (l);Phe 1.00(1);
Älhylamin 1,06(1).
Um die Ausbeute an Trp zu ermitteln, werden alle Aminosäureanalysen durch Säurehydrolyse mit 5,7N
HCl in Gegenwart von Thioglykolsäure durchgeführt.
Herstellung von
H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Phe-
Gly-Ile-Arg-Pro-NHC2H5
a) Herstellung von
H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Phe-Gly-O\Bu
H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Phe-Gly-O\Bu
1,57 Gew.-Teile H-GIy-OtBu und 4,0 Gew.-Teile Z-Phe-OSU werden in 20 Raumteilen Äthylacetat
gelöst. Das Gemisch wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt Das Reaktionsgemisch wird mit 5%iger
wäßriger Natriumhydrogencarbonatlesung, IN Salzsäure
und Wasser gewaschen, über Magensiumsulfat dehydratisiert und unter vermindertem Druck eingeengt.
Zum Rückstand wird Petroläther gegeben. Die Fällung wird abfiltriert, wobei 3,5 Gew.-Teil (85%)
Z-Phe-Gly-OlBu vom Schmelzpunkt 78° -79°C erhalten
werden.
[«];■ =-16.7° (c= 1,0, Äthanol).
[«];■ =-16.7° (c= 1,0, Äthanol).
50 Elementaranalyse:
Berechnet für
C23H28O5N2: C 66,97,
gefunden: C 67,14,
C23H28O5N2: C 66,97,
gefunden: C 67,14,
H 6,87,
H 6,64,
H 6,64,
N 6,79;
N 6,88.
N 6,88.
7,0 Gew.-Teile Z-Phe-Gly-OtBu werden in 50
Raumteilen Methanol gelöst. Die Lösung wird unter Verwendung von Palladiumschwarz als Katalysator 5
Stunden reduziert. Das Reaktionsgemisch wird filtriert und das Filtrat durch Abdampfen des Lösungsmittels
eingeengt. Der Rückstand wird in 10 Raumteilen Acetonitril gelöst. Zur Lösung werden !,62 Gew.-Teile
Z-Ser-ODNP gegeben. Das erhaltene Gemisch wird 1
Tag bei Raumtemperatur gerührt, worauf das Acetonitril abgedampft wird. Der Rückstand wird in Äthylacetat
gelöst. Die Lösung wird mit 10%igem wäßrigem Ammoniak, IN Salzsäure und Wasser gewaschen, über
wasserfreiem Magnesiumsulfat dehydratisiert und durch
Abdampfen des Lösungsmittels eingeengt Der Rückstand wird in Petroläther aufgenommen und aus
Äthylacetat-Petroläther umkristallisiert, wobei 1,41 Gew.-Teile (70%) Z-Ser-Phe-Gly-OtBu vom Schmelzpunkt
105° - 1060C erhalten werden,
[cc]. =-26,6° (c= 0,74,Äthanol).
[cc]. =-26,6° (c= 0,74,Äthanol).
Elenientaranalyse:
Berechnet für
C2OH33O7N
gefunden:
C 62,50,
C 62,91,
C 62,91,
H 6,66,
H 6,38,
H 6,38,
N 8,41;
N 8,12.
N 8,12.
1,34 Gew.-Teile Z-Ser-Phe-GIy-OtBu werden in 50
Raumteilen Methanol gelöst Die Lösung wird 5 Stunden der katalytischen Reduktion unter Verwendung
von Palladiumschwarz als Katalysator unterworfen. Das Gemisch wird filtriert und das Filtrat eingeengt.
Der Rückstand sowie 1,27 Gew.-Teile H-(Pyr)Glu-His-Trp-OH und 0,83 Gew.-Teile HONBI werden in 20
Raumteilen DMF gelöst. Die Lösung wird mit Eis gekühlt. Nach Zugabe von 0,95 Gew.-Teilen DCC wird
das Gemisch über Nacht der Reaktion überlassen. Die Fällung wird abfiltriert und das Filtrat eingeengt. Nach
Zugabe von Acetonitril zum Rückstand wird das Gemisch erhitzt. Das abgeschiedene Pulver wird vom
Gemisch abfiltriert und aus 50%igem wäßrigem Äthanol erneut ausgefällt, wobei 1,8 Gew.-Teile (87%)
H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Phe-Gly-OtBu erhalten werden.
[Oi]: = - 20,6" (C= 1,0, DMF).
[Oi]: = - 20,6" (C= 1,0, DMF).
Elementaranalyse:
Berechnet für C40H49O9N9 · 2 H2O:
C 58,59, H 6,52,
gefunden: C 59,02, H 6,62,
gefunden: C 59,02, H 6,62,
N 15,38;
N 15,23.
N 15,23.
b) Herstellung von Z-Ile-Arg(NO2)-Pro-WHC2H5
1,43 Gew.-Teile Z-Arg(NO2)-Pro-NHC2H5 werden in
10 Raumteilen 25% HBr-Essigsäure gelöst. Das Gemisch wird 40 Minuten bei Raumtemperatur
stehengelassen. Dann werden 80 Raumteile trockener Äther zugesetzt. Die gebildete Fällung wird abfiltriert
und getrocknet, wobei ein Pulver erhalten wird.
0,795 Gew.-Teile Z-IIe-OH werden in 10 Raumteilen Dioxan gelöst. Die Lösung wird auf 00C gekühlt. Nach
Zugabe von 0,59 Gew.-Teilen HONBI und 0,68 Gew.-Teilen DCC zur Lösung wird das Gemisch 2
Stunden gerührt. Das Gemisch wird zur Entfernung der Fällung filtriert. Zum Filtrat wird das in der oben
beschriebenen Weise hergestellte Pulver gegeben. Nach Zusatz von 0,84 Raumteilen Triethylamin wird das
Gemisch 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das als Lösungsmittel verwendete Dioxan wird abgedampft.
Der Rückstand wird in 100 Raumteilen Chloroform gelöst und die Lösung mit O1IN Salzsäure, 5%iger
wäßriger Natriumhydrogencarbonatlösung und Wasser gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet
und durch Abdampfen des Chloroforms eingeengt. Der Rückstand wird mit Äther verrieben,
wobei eine Fällung gebildet wird, die aus Äthanol-Äther erneut ausgefällt wird, wobei 1,1 Gew.-Teile Z-IIe-Arg(NO2)-Pro-NHC2H5
vom Schmelzpunkt
103° -105°C (Zers.) erhalten werden.
M? = -58,1° (c= 1, Methanol).
M? = -58,1° (c= 1, Methanol).
Elementaranalyse:
Berechnet für C27H42O7N8 · 0,5 H2O:
C 54,08, H 7,23, N 18,68;
gefunden: C 53,80, H 7,15, N 18,84.
gefunden: C 53,80, H 7,15, N 18,84.
c) 0,177 Gew.-Teile Z-Ile-Arg(NO2)-Pro-NHC2H5
werden in 3 Raumteilen 25% H Br-Essigsäure gelöst Die Lösung wird 30 Minuten bei Raumtemperatur
stehengelassen und dann mit 50 Raumteilen trockenem Äther versetzt Die Fällung wird abfiltriert, mit Äther
gut gewaschen und getrocknet, wobei eine Aminkomponente erhalten wird.
0,221 Gew.-Teile H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Phe-Gly-OtBu
werden in 5 Raumteilen Trifluoressigsäure gelöst Die Lösung wird 40 Minuten bei Raumtemperatur
stehengelassen und dann mit 0,05 Raumteilen 5,7N Salzsäure und anschließend mit 50 Raumteilen Äther
versetzt. Die Fällung wird abfiltriert, getrocknet und in 3 Raumteilen DMF gelöst Die Lösung wird auf 0°C
gekühlt ur.d dann mit der in der oben beschriebenen Weise hergestellten Aminkomponente, 0,097 Gew -Teilen
HONBI, 0,111 Gew.-Teilen DCC und 0,126 Raumteiler. Triäthylamin versetzt. Das erhaltene Gemisch
wird 5 Stunden bei 0°C und dann 10 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wird zur
Entfernung des hierbei gebildeten Dicyclohexylharnstoffes filtriert. Das Filtrat wird unter vermindertem
Druck eingeengt Der Rückstand wird in 10 Raumfjilen 10%igem wäßrigem Äthanol gelöst. Die Lösung wird
oben auf eine Säule von Amberlite XAD-2 aufgegeben. Die Desorbtion wird in einem Elutionssystem mit
linearem Gradienten von 10%igem bis 80%igem wäßrigem Äthanol durchgeführt. Die das Produkt
enthaltenden Fraktionen werden aufgefangen, durch Abdampfen des als Lösungsmittel verwendeten Äthanols
eingeengt und gefriergetrocknet, wobei 0.085 Gew.-Teile H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Phe-G!y-lIe-
Arg(NO2)-Pro-NHC2H5 erhalten werden.
0,07 Gew.-Teile des Produktes werden in einem Gemisch von 0,02 Raumteilen Anisol, 0,02 Raumteilen
2-Mercaptoäthanol und 4 Raumteiien wasserfreiem Fluorwasserstoff gelöst. Die Lösung wird 1 Stunde bei
00C gerührt, worauf der Fluorwasserstoff unter vermindertem Druck abgedampft wird. Der Rückstand
wird im Exsiccator getrocknet, in 50 Raumteilen Wasser gelöst und durch eine Säule von Amberlite® IRA-400
(Acetatform) geleitet. Die von der Säule ablaufende Lösung wird gefriergetrocknet, wobei 0,075 Gew.-Teile
rohes Produkt erhalten werden. Dieses Produkt wird an einer Säule von Carboxymethylcellulose adsorbiert und
in einem Elutionssystem mit linearen Gradienten von 0.005N Ammoniumacetat bis 0,2N Ammoniumacetal
desorbiert. Die das gewünschte Produkt enthaltenden Fraktionen werden gefriergetrocknet. Das hierbei
erhaltene Produkt wird in wäßriger 0,1 N Essigsäurelösung gelöst. Die Lösung wird durch eine Säule von
Sephadex® LH-20 geleitet. Die von der Säule ablaufende Lösung wird gefriergetrocknet, wobei 0,043 Gew.-Teile
reines Produkt erhalten werden.
Rf 3 = 0,41;
[ac] = - 59,4° (C= 0,5, 5% Essigsäure).
Rf 3 = 0,41;
[ac] = - 59,4° (C= 0,5, 5% Essigsäure).
Aminosäureanalyse:
His 1,1 (1); Arg 1,1 (l);Trp 0,87(1);
Äthylamin 1,0(1); Ser 0,81 (l);Glu 1,03(1);
Äthylamin 1,0(1); Ser 0,81 (l);Glu 1,03(1);
Phe 0,97(1).
Die Klammerzahlen sind die theoretischen Werte.
Die Klammerzahlen sind die theoretischen Werte.
Herstellung von
H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Met-Arg-Pro-NHC2H5
a) Herstellung von BOC-Met-Arg-Pro-NHC2H5
1,91 Gew.-Teile Z-Arg(NO2)-Pro-NHC2H5 werden in
10 Raumteilen 25% HBr-Essigsäure gelöst Die Lösung wird 30 Minuten stehengelassen und dann mit
trockenem Äther versetzt. Die Fällung wird abfiltriert, mit Äther gut gewaschen und getrocknet, wobei eine
Aminkomponente erhalten wird.
1,75 Gew.-Teile BOC-Met-OH - DCHA werden in 100 Raumteilen Äther gelöst. Die Lösung wird zweimal
mit 50 Raumteilen einer wäßrigen 0,2N Schwefelsäurelösung gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat
getrocknet. Der Äther wird abgedampft und der Rückstand in 20 Raumteilen Dioxan gelöst Die Lösung
wird auf 0°C gekühlt und mit 0,905 Gew.-Teilen DCC und 0,79 Gew.-Teilen HONBI versetzt. Das Gemisch
wird 2 Stunden gerührt. Der gebildete Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert und das Filtrat eingeengt. Zum
Rückstand werden 5 Raumteile DMF und die gesamte Menge der in der oben beschriebenen Weise hergestellten
Aminkomponente gegeben. Die erhaltene Lösung wird gekühlt und dann mit 1,12 Raumteilen Triäthylamin
versetzt. Das Gemisch wird 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und das DMF abgedampft. Der
Rückstand wird in 100 Raumteilen Chloroform gelöst, mit 0,1 N Salzsäure, 5%iger wäßriger Natriumhyd-ogencarbonatlösung
und Wasser gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und durch Abdampfen
des Chloroforms eingeengt. Durch Zugabe von Äther zum Rückstand wird ein Feststoff gebildet. Dieser
Feststoff wird aus Äthylacetat-Äther erneut ausgefällt, wobei 1,4 Gew.-Teile BOC-Met-Arg-Pro-NHC2H5 vom
Schmelzpunkt 101° -1040C (Zers.) erhalten werden,
[α] =-64,4° (c= 1,0,Methanol).
[α] =-64,4° (c= 1,0,Methanol).
Elementaranalyse:
Berechnet WrC23H42O7N8S · 0,5 H2O:
C 47,33, H 7,42, N 19,20, 55,49; gefunden: C 47,67, H 7,23, N 18,94, S 5,48.
b)H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Met-Arg-PrO-NHC2H5
0,275 Gew.-Teile BOC-Met-Arg(N02)-Pro-NHC2H5
werden in einem Gemisch von 0,! Raumteilen 2-Mercaptoäthanol und 5 Raumteilen Trifluoressigsäure
gelöst Die Lösung wird 30 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen und dann mit 0,085 Raumteilen 5,7N
Salzsäure versetzt. Das Gemisch wird gekühlt und mit 50 Raumteilen Äther versetzt. Die Fällung wird
abfiltriert, mit Äther gewaschen, getrocknet, in DMF
gelöst und auf 0°C gekühlt Zur Losung werden 0,318
Gew.-Teile H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-OH-hydrochlorid,
0,107 Gew.-Teile HONBI, 0,124 Gew.-Teile DCC und 0,17 Raumteile N-Athylmorpholin gegeben.
Das Gemisch wird 12 Stunden gerührt Der ausgefällte Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert und das Filtrat
unter vermindertem Druck eingeengt Der Rückstand wird in 5 Raumteilen 5°/oigem wäßrigem Äthanol gelöst.
Die Lösung wird auf eine Säule von Amberlite XAD-2 ίο aufgegeben und in einem Elutionssystem mit linearem
Gradienten von 5°/oigem bis 80%igem wäßrigem Äthanol desorbiert Die Hauptfraktionen werden
gefriergetrocknet und getrocknet wobei 0,135 Gew.-Teile H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Met-Arg(NO2)-li
PrO-NHC2Hs erhalten werden. 0,1 Gew.-Teile dieses
Produktes werden in einem Gemisch von 0,02 Raumteilen Anisol, 0,02 Raumteilen Äthanol, 0,02
Raumteilen 2-Mercaptoäthanol und 6 Raumteilen Fluorwasserstoff gelöst Die Lösung wird 1 Stunde bei
0cC gerührt Der Fluorwasserstoff wird unter vermindertem
Druck abgedampft und der Rückstand im Exsiccator getrocknet. Der Rückstand wird in 20
Raumteilen Wasser gelöst und durch eine Säule von Amberlite CG-400 (Acetatform) geleitet Die aus der
Säule ablaufende Lösung wird gefriergetrocknet Der Rückstand wird in 20 Raumteilen Wasser gelöst Zur
Lösung werden 0,4 Raumteile Thioglykolsäure gegeben. Das Gemisch wird 10 Stunden bei 600C stehengelassen.
Das Reaktionsgemisch wird mit 50 Raumteilen Wasser verdünnt, an einer Säule von Carboxymethylcellulose
adsorbiert und in einem Elutionssystem von 0.005N bis 0,2N Ammoniumacetat desorbiert. Die Hauptfraktionen
werden gefriergetrocknet, wobei 0,02 Gew.-Teile des rohen gewünschten Produktes erhalten werden. Das
Produkt wird an einer Säule von Sephadex LH-20 adsorbiert und mit 0,1N Essigsäure eluiert. Die eluierte
Lösung wird gefriergetrocknet, wobei das gereinigte Produkt erhalten wird.
Dünnschichtchromatographie: Rf=0,31 (Kieselgel;
Dünnschichtchromatographie: Rf=0,31 (Kieselgel;
n-Butanol: Essigsäure : Äthylacetat: Wasser
= 1:1:1:1).
[<x]i? = -43,2° (c=25,5,5% Essigsäure).
= 1:1:1:1).
[<x]i? = -43,2° (c=25,5,5% Essigsäure).
Aminosäureanalyse:
His 0.9(1); ArgO,9(l);Trp 0,8(1);
SerO,7(l);GluO,9(l);Pro 1,1(1);
SerO,7(l);GluO,9(l);Pro 1,1(1);
GIy 1,0(1); Met 0,9(l);Tyr 0,7(1);
Äthylamin 0,9(1).
Äthylamin 0,9(1).
Die Klammerzahlen sind die theoretischen Werte.
Versuch
Versuch
Die Nonapeptidamidderivate gemäß der Erfindung wurden Ratten im Diöstrus subkutan verabreicht und
auf ihre ovulationsinduzierende Wirkung untersucht Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle genannt.
Ovulationsinduzierende Wirkung bei Ratten im Diöstrus
A, | A2 | Y | EDso(ng/100g |
Körpergewicht) | |||
Tyr | Leu | NH-CH3 | 165,0 |
Tyr | Leu | NH-CH2-CH3 | 32,0 |
Tyr | Leu | NH-CH2-CH2-CH3 | 56,0 |
Tyr | Leu | NH-CH(CH3)2 | 76,0 |
Tyr | Nie | NH-CH2-CH3 | 53,6 |
23
Tyr | Met | NH-CH2-CH3 |
Phe | Leu | NH-CH2-CH3 |
Phe | lie | NH-CH2-CH3 |
Tyr
Leu
GIy-NH2
Natürliches Decapeptid.
24
ED51, (ng/100 g
Körpergewicht)
Physikalische Daten für die n-Propylverbindung:
(«]-· = -58,8° (c= 0,5 in5% Essigsäure);
Rf 2 = 0,47; Rf 5 = 0,54.
Aminosäureanalyse:
His 0,81(1); Arg 0,97 (l);Ser 0,92(1); GIn 1,00(1); Pro 0,97 (l);Gly 1,03(1);
Leu l,05(l);Tyr 1,03(1); Propylamin 0,97 (1);Trp 0,98 (1).
35,0
84,0
115,0
215 ±12 ng
Physikalische Daten für die Isopropylverbindung:
[«.]? = -55,4° (c=0,5 in 5% Essigsäure):
Rf 2 = 0,41; Rf 5 = 0,65.
Aminosäureanalyse:
His 0,98(1); Arg 1,00 (l);Ser 0,78(1); GIn 1,00(1); Pro 0,97(1); GIy 1,03(1);
Leu 1,00 (l);Tyr 0,97 (l);Trp 0,89(1).
ifeft-iW^fa^-ffi^^^
Claims (4)
1. Nonapeptidamide der allgemeinen Formel
L-Pyroglutamyl L-Histidyl-L-Tryptophyl-L-Seryl-A]-Glycyl-A2-L-Arginyl-L-Proiin-Y
in der Ai für L-Tyrosyl oder L.-Phenylalanyl, A2 für
L-Leucyl, L-Isoleucyl, L-Norleucyl oder L-Methionyl
und Y für NHR steht, worin R ein geradkettiger oder verzweigter Alkylrest mit 1 bis 3 C-Atomen ist oder
eine Pyrrolidinogruppe ist, und deren pharmazeutisch unbedenkliche Salze.
2. Nonapeptidamid nach Anspruch 1 mit der dort
genannten Formel, in der Ai für L-Tyrosyl, A2 für
L-Leucyl und Y für NHCH2CH3 steht.
3. Nonapeptidamid nach Anspruch 1 mit der dort
genannten Formel, in der Ai für L-Tyrosyl, A2 für
L-Methionyl und Y für NHCH2CH3 steht
4. Verfahren zur Herstellung der Nonapeptidamide nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch
gekennzeichnet, daß man in an sich bekannter Weise L-Pyroglutaminsäure oder ein der in Anspruch 1
angegebenen Aminosäuresequenz entsprechendes, N-terminal einen L-Pyroglutaminsäurerest aufweisendes
Peptidfragment mit einer Aminkomponente, die dem restlichen Teil des gewünschten Nonapeptidamids
entspricht, kondensiert, wobei die beiden Reaktionspartner wahlweise eine oder mehrere
Schutzgruppen enthalten können, und die gegebenenfalls vorhandenen Schutzgruppen abspaltet
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP4268672A JPS5324423B2 (de) | 1972-04-29 | 1972-04-29 | |
JP11845272A JPS5324424B2 (de) | 1972-11-24 | 1972-11-24 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE2321174A1 DE2321174A1 (de) | 1973-11-08 |
DE2321174C2 true DE2321174C2 (de) | 1982-04-15 |
Family
ID=26382407
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE2321174A Expired DE2321174C2 (de) | 1972-04-29 | 1973-04-26 | Nonapeptidamid und Verfahren zu ihrer Herstellung |
DE2366379A Expired DE2366379C2 (de) | 1972-04-29 | 1973-04-26 | N↑α↑-geschützte N↑G↑-Nitro-L-arginyl-L-prolin-amide |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE2366379A Expired DE2366379C2 (de) | 1972-04-29 | 1973-04-26 | N↑α↑-geschützte N↑G↑-Nitro-L-arginyl-L-prolin-amide |
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---|---|
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AT (1) | AT333988B (de) |
AU (1) | AU453931B2 (de) |
CA (1) | CA1005815A (de) |
CH (1) | CH580065A5 (de) |
CS (1) | CS188162B2 (de) |
DE (2) | DE2321174C2 (de) |
DK (1) | DK147851C (de) |
ES (1) | ES414197A1 (de) |
FI (1) | FI56676C (de) |
FR (1) | FR2183021B1 (de) |
GB (1) | GB1403642A (de) |
HU (1) | HU168696B (de) |
NL (2) | NL176856C (de) |
NO (1) | NO139560C (de) |
PL (1) | PL95790B1 (de) |
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US8153661B2 (en) | 2004-09-17 | 2012-04-10 | Durect Corporation | Controlled delivery system |
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