DE2153780A1 - Verfahren zur Herstellung von Poly peptiden - Google Patents

Description

SANDOZ AG

Basel Case 100-3400

Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden

Die vorliegende Erfindung betrifft Polypeptide der allgemeinen Formel H-Cys-Ser-Asn~Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Gly-Lys--Leu-Ser-Gln-Asp~Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-Arg-Thr-Asn~Thr-Gly-X-Giy-Y-Fro-NH₀, worin X für einen Valylrest und Y für einen Alanylrest oder X für einen Alanylrest und Y für einen Valylrest steht, sowie therapeutisch v/irksame Säureadditionssalze und M-etallkomplexe der genannten Verbindungen und Verfahren zu ihrer Herstellung.

Die Polypeptide der obigen Formel können nach für die Synthese von Verbindungen dieser Art allgemein bekannten Methoden hergestellt werden, wobei die Aminosäuren in der in der obigen Foi-mel festgelegten Reihenfolge einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten miteinander verknüpft werden und bei einer geeigneten Stufe der Synthese die DisulfidbrUcke gebildet wird. Die Verknüpfung der Aminosäure

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und / oder Peptideinheiten erfolgt z. B. in der V/eise, dass man eine Aminosäure mit geschützter a-Aininogruppe und aktivierter terminaler Carboxylgruppe mit einer- Aminosäure oder einem Peptid mit freier a-Aminogruppe und freier oder geschützter terminaler Carboxylgruppe umsetzt oder dass rr.an eine Aminosäure oder ein Peptid mit aktivierter a-Amino^rup^^ und geschützter terminaler Carboxylgruppe mit einer Aminosäure oder einem Peptid mit freier terminaler Carboxylcrupr--i- und geschützter a-Aminogruppe umsetzt.

Die Carboxylgruppe kann beispielsweise durch Ue'cerführung in ein Säureazicl, --anhydrid, -imidazolid, -isoxazolid oder einen aktivierten Ester oder durch Reaktion mittels eines Carbcdijniids oder N,N'-Carbonyl-diimidazois aktiviert v/erden. Vorzugsweise wird als Kondensate cr.srnethcde die Carbodiirr.idrriethcde, die Azidrnethode, die Methode dor aktivierten Ester, die Anhydridmethode und die Merrifieldmethode verwendet.

In der letzten Stufe der Kondensation sind jedoch Methoden zu verwenden, bei denen Racemisierung nicht auftritt oder gering sehalten werden kann, vorzugsv/eine durch Yev.iir.&cn^. der A:iide oder der aktivierten Ester, wobei die Aktivier-urv; vorzugs'.;eise mit M-Iiydroxysuccinirnid vorgenommen wird.

* oder ein Peptid „...,

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An der Reaktion nicht beteiligte freie, funktioneile Gruppen können beim Aufbau des erfindungsgemässen Peptids durch die von der Synthese langkettiger Peptide her bekannten Schutzgruppen geschützt werden.

So verwendet man beispielsweise für die Blockierung der Guanidogruppe des Argininrestes beim Aufbau der nachstehend beschriebenen Teilsequenzen C,- und Cg die Carbobenzyloxygruppe, doch können auch andere geeignete Schutzgruppen, wie die Nitrogruppe, die Tosylgruppe, die p-Nitrobenzyloxycarbonylgruppe oder die 2-(lsopropyloxycarbonyl)-3,4,5j6-tetrachlorobenzoylgruppe verwendet werden. Man kann auch den Schutzeffekt der Protonisierung der Guanidogruppe bei der Synthese verwenden.

Für die Blockierung der £-Aminogruppe des Lysinrestes, beispielsweise in den nachstehend beschriebenen Teilsequenzen D, und Dp kann eine Carbo-tert.-alkyloxygruppe, vorzugsweise die Carbo-tert.-butyloxygruppe verwendet werden.

Beim Aufbau des neuen Polypeptids hat sich für die Blockierung der /3-Carboxylgruppe, beispielsweise in der nachstehend beschriebenen Teilsequenz F,, die tert.-Butyloxygruppe bewährt, doch können auch andere Schutzgruppen, wie die Methyl-

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oxy-, die Aethyloxy-, die tert.-Amyloxy-, die Amid- oder die Benzyloxygruppe verwendet werden.

Die Umwandlang einer geschützten Aminogruppe in eine freie Gruppe sowie die Umwandlung einer funktionell abgewandelten Carboxylgruppe in eine freie Carboxylgruppe im Laufe des Verfahrens zur Herstellung der neuen Polypeptide erfolgt nach an sich bekannten Methoden durch Behandlung mit hydrolysierenden bzw. reduzierenden Mitteln.

Die Ausgangsprodukte zur Herstellung der neuen Polypeptide können, sofern sie bisher nicht bekannt waren, nach den für die Peptidchemie bekannten Methoden erhalten werden, wobei die Aminosäuren einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten miteinander verknüpft werden.

Die neuen Polypeptide lassen sich auch in Form ihrer Salze gewinnen bzw. verwenden. Als Salze kommen solche mit organischen Säuren, wie beispielsweise Essigsäure, Milchsäure, Bernsteinsäure, Benzoesäure, Salicylsäure, Methansulfonsäure, Toluolsulfonsäure sowie polymere Säuren, wie Gerbsäure oder Carboxymethylcellulose und Salze mit anorganischen Säuren, wie Halogenwasserstoffsäuren, z. B. Salzsäure oder Schwefelsäure und Phosphorsäure in Frage. Unter Komplexen sind z. B.

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anorganische Verbindungen, die sich von Metallen wie Calcium, Magnesium, Aluminium, Cobalt und insbesondere von Zink ableiten lassen, zu nennen.

Die erfindungsgemäss hergestellten Polypeptide stellen ein wichtiges therapeutisches Prinzip dar. Sie senken den
Calciumplasmaspiegel und bewirken als Antagonisten des
Parathormons eine Hemmung des Knochenabbaus. Die
biologische Wirkung der neuen Verbindungen wurde an Ratten geprüft, wobei sich aufgrund der Senkung des Blut-Calciums ein Wert von 3000 bis 6000 MRC-Einheiten/mg Peptid ergab.

Die zu verabreichende Dosis hängt von.der gewünschten V/irkung sowie vcn der Applikaticnsart ab. Im allgemeinen
werden jedoch mit einer einmal zu verabreichenden Tagesdosis von 1 bis 10 Einheiten pro kg Tiergcv.'icht zufriedenstellende Resultate erzielt. Für grcssere Säugetiere beträgt die Tagesdosis etwa 70 bis 700 Einheiten, die auf einmal cder in mehreren Anteilen verabreicht werden können. Für die intramuskuläre Applikation enthält eine geeignete Verabreichungsform etwa 70 bis 700 Einheiten der V/irksubstanz, vermischt mit einem flüssigen Träger. ;

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Die erfindungsgemäss hergestellten Verbindungen sind somit indiziert bei allen Zuständen, bei welchen eine Senkung des Plasmacalciumspiegels bzw. Beeinflussung des Knochenstoffwechsels erwünscht ist, z. B. Hyperoalcämien infolge Mangels des endogenen Thyreocalcitonins durch Ausfall von Schilddrüsengewebe oder Hyperfunktion der Nebenschilddrüsen. Sie sind ferner indiziert bei allen Knoehenaffektionen, die auf einem vermehrten Abbau beruhen oder bei welchen eine Calciumfixation im Knochen erwünscht ist, z. B. Osteoporose,

Frakturen, Osteomalacie, Rachitis und renaJ bedingte Osteodystrophie, sowie insbesondere zur Kombinationstherapie mit Calcium und / oder Phosphat.

Die erfindungsgemäss hergestellten Verbindungen können als Heilmittel, z. B. in Form pharmazeutischer Präparate, Verwendung finden. Dieses enthält die genannten Verbindungen in Mischung mit einem für die parenterale Applikation geeigneten organischen oder anorganischen Trägermaterial. Sie können auch in Form eines Depotpräparates verabreicht werden.

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Es werden folgende Abkürzungen verwendet;:

Z · = Carbobenzyloxy (Benzyloxy-

oarbonyl) BzI = " Benzyl BOC ■ - s . terfc.-Butyloxycarbonyl Trfc = Trityl ·-- Triphenylmethyl

OTB = tert.-Eutyloxy

OHP = p-Nitrophenyloxy

OC? = 2,^, 5-TrichlorphGnyloxy

OMe =. Methoxy

OEL = Aethoxy

NOp = Nitro

Ser = L-Seryl

Asn = L-Asparaginyl

Asp = - L-Aspartyl

Leu = ' L-Leucyl

Thr = ' . L-Threonyl

VaI = . L-VaIy 1

Arg - - L-Arginyl · ■

GIn = . L-GIutaminyl

His = L-Histidyl '.

Pro = L-Prolyl

GIy = Glycyl

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Lys = L-Lysyl

Phe = L-Phenylalanyl

Cys = L-Cysteinyl

Ala = L-Alanyl

OSu = N-Oxysuccinimid

t.But = tert.-Butyl

In den folgenden Beispielen, welche die Ausführung des Verfahrens erläutern, den Umfang der Erfindung aber in keiner Weise einschränken sollen, erfolgen alle Teir.peraturangaben in Celsiusgraden. Der Wert c für die optische Drehung beträgt Die Aminosäureanalyse in den folgenden Beispielen ergibt, dass die einzelnen Aminosäuren in den erwarteten Verhältnissen vorliegen.

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1. Darstellung des Ausgangsmaterials

Teilsequenz A,: H-Val-Gly-Ala-Pro-NflU

Man suspendiert 27,5 g Z-Val-Gly-Ala-Pro-NEL in 550 ml Methanol und hydriert nach Zugabe von 3 ml 96 $iger Schwefelsäure in Gegenwart von 4,1 ml Eisessig und 3,1 g Palladiumkohle (10 %). Nach Filtration und Eindampfen der Lösung zeigt das Produkt (Sulfat) im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel =0,2,

Teilsequenz A₀: H-Ala-Gly-Val-Pro-NH,

a) Z-VaI-PrO-NH ₂

Man löst 75 g H-PrO-NH₂ in 85O ml Dirnethylformamid, versetzt mit 312 g Z-VaI-CCP und lässt anschliessend die Lösung für ΐβ Stunden bei Raumtemperatur stehen. Nach Eindampfen im Vakuum wird der Rückstand aus Essigester uinkristallisiert. Man erhält Z-VaI-PrO-NII₂. Smp,: [α]ρ° = -kl° in Dimethylformamid.

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b) Z-GIy-VaI-PrO-MH ₂

***ΛΛ·τ ο. /^

Man löst 190 g Z-Val-Pro-NHp in 2200 ml Methanol, gibt 85 ml 6 N methanolische Salzsäure zu, hydriert in Anwesenheit von Palladiur;)l:ohle bei 20° und Normaldruck und filtriert darauf vom Katalysator ab. Das Produkt wird mit Aether ausgefällt, gewaschen und anschliessend getrocknet. 120 g des erhaltenen H-Val-Pro-NHg.HCl (Zp: 217-218°; [o3^° = -57° in Methanol) suspendiert man in l800 ml Dimethylformamid., gibt 196 g Z-GIy-OCP, dann 6j ml Triäthylamin zu urd schüttelt für 17 Stunden bei 20°. Das ausgeschiedene Triäthylaminhydro-Chlorid wird abfiltriert und das Piltrat im Vakuum eingedampft. Den Rückstand löst man in einem Gemisch Essigester / Wasser. Nach Trocknen über Natriumsulfat und Eindampfen erhält man Z-GIy-VaI-PrO-NH₃. Smp.: 82° (mit Zers.) [a]^° = -76° in Methanol.

c) Z-AIa-GIy-VaI-PrO-NH ₂

Man löst 92 g Z-Gly-Val-Pro-KH in 2000 ml Methanol, versetzt mit 27 ml Essigsäure und hydriert bei 20° in Anwesenheit von Palladiumkohle unter Normaldruck. Man filtriert, dampft im Vakuum zur Trockne ein, löst den Rückstand in 1000 ml Dimethylformamid, gibt 100 g Z-AIa-OCP zu. schüttelt und lässt

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die Lösung 17 Stunden bei 20° stehen. Hierauf dampft man im Vakuum zur Trockne .ein und kristallisiert den Rückstand aus Essigester/Aether. Man erhält Z-AIa-GIy-VaI-PrO-NH₂, Smp. (mit Zers.), [a]^ = -51° in Dimethylformamid.

d) H-AIa-GIy-VaI-PrO-NH ₂

Man suspendiert 27,5 S Z-Ala-Gly-Val-Pro-NHp in 55Ο ml Methanol und hydriert nach Zugabe von 3 ml 96 ^iger Schwefelsäure in Gegenwart von 4,1 ml Eisessig und 3,1 g Palladiumkohle (10 <£). Nach Filtration und Eindampfen der Lösung zeigt das Produkt (Sulfat) im Dünnschichtehromatogramm an Silicagel Rf „ = 0,4.
System: Chloroform / Methanol 7 : 5 + 0,5 % Wasser

^: Z-Thr-Asn-Thr-Gly-NHNH^

Man löst 98 g Z-Thr-Asn-Thr-Gly-CEt in 1000 ml Dimethyl formamid und versetzt mit 100 ml Hydrazinhydrat. Mach l6-stüiidi5en Stehen bei Raumtemperatur wird abfiltriert

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und mit Wasser und Aether nachgewaschen. Man erhält die

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Titelverbindung, Smp.: 221°, [a]_D = -9° in Dimethylformamid,

Teilsequenz C₁: H-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH^

Man löst 1^,5 g 30C-Arg-Thrw\sn~Thr-Gly-HHKHp

in 270 ml Dip.ethylfor.T.sjnid/V.^rasser (8:2), kühlt auf -15°, gibt ^O nil einer h IT Lösung von Salzsäure in Dioxan und 2,5 ml tert.-Butylnitrit zu. Man rührt 10 Minuten bei -15°, gibt 23 ml Triethylamin zu, filtriert ab, gibt 10,5 S H-Val-31y-Ala-Pro-!jH₂ (Teilsequenz Aj zu, rührt Io Stunden bei 0°. Danach dampft nian zur Trockne ein, v.-äscht den Rückstand mit Aether und trocknet. Man löst den Rückstand in Methanol, gibt ein Zehntel Volumen Wasser und die siebenfache t'lense Chloroform hinzu und lässt die erhaltene Lösung durch eina Säule voii 500 g Xiesei^el. Nach Eluiorung mit einer steigenden Kenge an Methanol erhält man nach Eindampfen EOC-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Val-Oly-Aia-Pro-NH^ Dieses suspendiert man in 200 ml einer 4 N Lösung von Salzsäure in Dioxan und rührt v.ährend 2 Stunden bei 25°, Man dampft zur Trockne ein, löst den Rückstand in 0,2 N Essigsäure, behandelt rr.it Amberlit-IRA-^IO (Acetat-Form) und lyophilisiert die '/.'assrige Lösung. Hierauf wäccht man den Rückstand mit Aether, Essigester und v;ieder Aether

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und trocknet über Natriumhydroxid-Späne. Man erhält die Titelverbindung in Form des Diacetates, Smp.: 195° (mit Zers.), [ajp° = -64° in Dimethylformamid/HCl I N (1 : 1).

Teilsequenz C'. H-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ala-Gly-Val-Pro-NH

Analog der Arbeitsweise bei der Teilsequenz C, enthält man aus BOC-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-NHNHp und H-Ala-Gly-Val-Pro-NH₂ (Teilsequenz Ap) die Titelverbindung in

20 Form des Diacetates, Smp.: 155° (mit Zers.), [a]_D = -38° in Dimethylformamid.

Teilsequenz_C^_: Z-Thr-Asn-Thr-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH^

Zu einer auf -15° abgekühlten Lösung von 11 g Z-Thr-Asn-Thr-GIy-NHNHp (Teilsequenz B.) in 350 ml Dimethylformamid gibt man 47 ml einer 1,85 η Lösung von Salzsäure in Dioxan und 2,2 ml tert.-Butylnitrit. Man rührt 10 Minuten bei -15°, kühlt auf -30° ab, versetzt mit 12 ml Triäthylamin und filtriert zur kalten Lösung von H-Val-Giy-Ala-Pro-NHp (Teilsequenz A,) in Dimethylformamid. Nach 90 Minuten Rühren bei 0° wird im Vakuum eingeengt, mit Chloroform versetzt und das ausgefallene Material abfiltriert und getrocknet. Eine Lösung dieses Rohproduktes in Wasser-Methanol wird durch Dowex 50

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f.iltriert, mit Amberlite IRA 410 neutralisiert und darauf im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird in Acetonitril verrieben, erwärmt, filtriert und getrocknet. Man erhält die Titelverbindung, Smp.: 220° (mit Zers.) [aJβ = -28° in Dimethylformamid.

Teilsequenz C₂,: Z-Thr-Asn-Thr-Gly-Ala-Gly-Val-Fro-NH^

Analog der Arbeitsweise bei der Teilsequenz CL erhält man aus Z-Thr-Asn-Thr-GIy-NHNH₂ (Teilsequenz Β_χ) und H-Ala-Gly-Val-Pro-NHp (Teilsequenz A^) die Titelverbindung, Smp.: 206° (mit

PO

Zers.), [a]^ = -25° in Dimethylformamid,

Teilsequenz C-: Z^-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH^

Man löst 10 g Z-Thr-Asn-Thr-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-MH₂ (Teilsequenz C-J in 800 ml Methanol-Wasser, gibt 0,5 g Palladiumkohle zu und hydriert bei Normaldruck. Es wird vom Katalysator abfiltriert und im Vakuum eingedampft. Das erhaltene OeI, H-Thr-Asn-Thr-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NHg, wird in 100 ml Dimethylformamid gelöst, mit 10 g Ζ-,-Arg-OSu versetzt und 16 Stunden bei 20° stehen gelasse'n. Die Lösung wird dann im Vakuum eingeengt, das Produkt mit Aceton ausgefällt und abfiltriert. Der Rückstand wird in Aceton fein

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suspendiert, aufgekocht, filtriert und getrocknet. Man erhält die Titelverbindung, Smp.: 201° (mit Zers.), [aJ^⁰ = -15° in Dimethylformamid.

Teilsequenz C^: Z^-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ala-Gly-Val-Pro-NH,

— — — — — — — — — — — — — Q— y— ———_—__________ __

Analog der Arbeitsweise bei der Teilsequenz C_. erhält man

aus Z-Thr-Asn-Thr-Gly-Ala-Gly-Val-Pro-NHp (Teilsequenz CJ) und Z -Arg-OSu die Titelverbindung, Smp.: IS5⁰ (mit Zers.)» [α]ρ = -14° in Dimethylformamid.

Teilsequenz D.j Z-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-OH

a) H-Thr-Phe-Pro-OH

Man löst 170 g Z-Phe-Pro-OMe in 1000 ml jMethanol/KCl 1 ?ϊ, hydriert in Anwesenheit von Palladiurnkohle bei 20° und Atm. und dampft ein. Man löst den Rückstand in h00 ml Dimethylformamid, gibt bei 0° 100 ml Triäfchylamin zu, filtriert das auskristallisierto Triäthylaminhydrochlorid ab und versetzt das Filtrat mit Z-Thr-H (hergestellt aus 87 g Z-Thr-iiHiIHp durch Lösen in 100 ml N Salzsäure und Versetzen mit 55 mi N Natriumnitrit ).ifen lässt hierauf

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l6 Stunden bei 0° stehen, dampft zur Trockne ein, löst den Rucksband in Essigester, wäscht nacheinander mit verdünnter Salzsäure und verdünntem Ammoniak, trocknet und dampft ein. Man pulverisiert den Rückstand in Heptan, wäscht mit Petroläther und trocknet. Man erhält Z-Thr-Phe-Pro-OMe, Smp. 92° (Zers.),[α]_β = -16° in Dimethylformamid.

Man löst 53 g Z-Thr-Phe-Pro-OMe in 530 ml Methanol, gibt 100 ml 2 H Natronlauge zu, lässt 1 Stunde bei 25° stehen, gibt 50 ml 2 N Salzsäure zu, konzentriert auf ca. 200 ml, gibt noch 100 ml Wasser zu, stellt das pH auf 10 ein, wäscht die vrässrige Lösung zweimal mit Essigenter, stellt anschliessend mit 4 N Salzsäure auf pH 1 ein, extrahiert das ausgeschiedene Tripeptid Z-Thr-Phe-Pro-OH mit Essig-

20 ester, trocknet und dan:pft ein. Sir.p. 105°,[aj_ = -28° in Dimethylformamid. Man löst den Rückstand in einem Gemisch von 500 ml Dioxan und 100 ml Wasser und hydriert bei 20° und Normaldruck in Gegenwart eines Pallad iurnkataly sat or s. Man filtriert, dampft zur Trockne ein, wäscht den Rückstand mit Aether und trocknet. Man erhält H-Thr-?he-Pro-OH, Snip.

PO

I92⁰ (mit Zersetzung), [α]ί~ = -41° in Essigsäure (95 %).

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b) Z-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-OH

Man löst 4O g Z-His-Lys (EOC)-LeU-GIn-HK-NHp in 400 ml Dimethylformamid, kühlt auf -20°, gibt 75 ml Dioxan/HCl 2 M und ariochliessend 6 ml tert. -Butylnitrit zu, rührt 10 Minuten bei -20°, gibt 50 ml Triäthylamin und 20 g H-Thr-Phe-Pro-OH zu und lässt ΐβ Stunden bei 25° reagieren. Man dampft hierauf zur Trockne ein, v/äscht den Rückstand mit Aether, verdünnter Essigsäure, Aether und sohliesslich mit heisoc-m Essigester. Hierauf trocknet man im Hochvakuum und erhält Z-His-Lys(EOC)-LGu-Gln-^rrhr-Phc-Pro-0H, Snip.

20
200° (Zersetzung), [aJ_D = -47° in Dimethylformamid.

Teilsequenz D₀: Z-His-Lys(BOC) -Leu-Glri-Thr-Phe-Pro-NHNH^

a) Z-Gln-Thr-Phe-Pro-OMe

84,8 g Z-Thr(t.But.)-OMe werden in I500 ml Methanol gelöst und mit 125 ml 2 N Salzsäure und 10 g Palladium (10 % auf Kohle) versetzt. Nach 4-stUndiger Hydrierung wird vom Katalysator abfiltriert und vollständig eingedampft .

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61,2 g Z-GIn-OH und 25,6 g N-Hydroxysuccinimid werden in 1000 ml Aeetonitril/bimethylformamid'gelöst und auf -15° abgekühlt. Zuerst wird eine Lösung von ^5»7 g Dieyclohexylcarbodiimid in 200 ml Acetonitril dazugespült, dann das oben erhaltene HCl-H-Thr(t.But.)-0Me gelöst in Dimethylformamid unter Zusatz von 30,4 ml Triäthylamin. Unter zeitweiligem Umschütteln lässt man ca. 16 Stunden ™ bei Raumtemperatur stehen. Das auskristallisierte Triäthylaminhydrochlorid bzw. der Dicyclohexylharnstcff werden abfiltriert und das Filtrat vollständig eingedampft. Der Rückstand wird in Essigester aufgenommen und mit IN Salzsäure und Natriumbikarbonat 5 % gewaschen. Nach Trocknen über Natriumsulfat wird die organische Phase auf ein Volumen von ca. 200 ml eingeengt und mit Petroläther versetzt. Das ausgefallene OeI wird in ein Pulver umgeformt und abfiltriert. Man erhält Z-GIn-Thr(t.But.)-OMe, Smp. 106°, [a]^ = +11° In Dimethylformamid .

78,0 g Z-Gln-Thr(t.But.)-OMe werden in 800 ml Methanol gelöst und mit 65 ml Hydrazinhydrat versetzt. Nach 48 Stunden Stehen bei Raumtemperatur wird vollständig eingedampft« Der Rückstand wird mit Wasser behandelt und anschliessend

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aus Methanol/Wasser umkristallisiert. Man erhält Z-Gln-Thr (t.But.)-NHNH₂, Smp. 202°, [aJ^⁰ = -13° in Methanol.

Ί5.5 g Z-Phe-Pro-OMe werden in 750 ml Methanol gelöst und mit 55 ml 2 N Salzsäure und 12 g Palladium (10 # auf Kohle) versetzt. Nach 2-stUndiger Hydrierung.ist die berechnete Viasserstoffmenge fast quantitativ verbraucht. Vom Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat vollständig eingedampft .

49,5 g Z-Gln-Thr(t.But.)-NHNH₂ werden in 500 ml Dimethylformamid gelöst und auf -20° abgekühlt. Nach Zugabe von 77 ml 5 N Sclzsäure in Aether und 13,4 ml tert.-Butylnitrit lässt man 10 Min. weiterrühren und neutralisiert mit 54 ml Triäthylamin. Das oben erhaltene HCl'H-Phe-Pro-OMe wird in 150 ml Dimethylformamid gelöst, mit 15,4 ml Triäthylamin versetzt und zum Dipeptidazid gespült. Nach 4-stÜndigem Rühren bei Raumtemperatur wird vom auskristallisierten Triäthylaminhydrochlorid abfiltriert und das Piltrat vollständig eingedampft. Der Rückstand wird mittels Chloroform/ Methanol über eine Kieselgelsäule filtriert. Nach Kristallisation aus Essigester/Petroläther erhält man Z-Gln-Thr (t.But.)-Phe-Pro-OMe, Smp. 110°, W^ = -41° in Methanol.

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Das Tetrapeptid wird in 250 ml Trifluoressigaäure gelöst. Nach 20 Min. Stehen bei Raumtemperatur wird die Lösung auf das halbe Volumen eingeengt und das Produkt mit Aether ausgefällt. Durch Filtration und ausreichendes Waschen mit Aether erhält man nach Trocknung Z-Gln-Thr-Phe-Pro-OMe, Smp. 154°, [a}^° = -59° in Methanol.

b) Z-His-Lys(BOC)-

g Z-Lys(B0C)-0H, 48 g H-Leu-OMe und 69 g N-Hydroxysuccinimid werden in 600 ml Essigester gelöst und auf -20° abgekühlt. Eine Lösung von 65 g Dicyclohexylcarbodiimid in 500 ml Essigester wird dazugespUlt. Unter zeitweiligem Umschütteln lässt man während 16 Stunden bei Raumtemperatur stehen. Auskristallisierter Dicyclohexylharnstoff wird ab- ^ filtriert und das Piltrat vollständig eingedampft. Der feste Rückstand wird mit Wasser behandelt. Nach Umkristallisation aus Essigester/Petroläther erhält man Z-Lys(BOC)-

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Leu-OMe, Smp. 113°, f^aJ_D = -^l8° ⁱⁿ Methanol.

101,5 g Z-Lys(BOC)-Leu-OMe werden in 1000. ml Essigester gelöst und mit einer vorgekühlten Lösung von 40 ml 5 N Salzsäure in Aether in 300 ml Essigester versetzt. Nach Zugabe

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von 5 g Palladium (10 # auf Kohle) in 50 ml Dimethylformamid aufgeschlämmt wird 3 l/2 Stunden hydriert. Die berechnete Wasserstoffmenge wird dabei fast quantitativ verbraucht. Anschliessend wird vom Katalysator abfiltriert und das Piltrat eingedampft.

78,7 g Z-His-NHNHp werden in ²I-OO ml Dimethylformamid gelöst, mit I82 ml 5 N Salzsäure in Aether versetzt und auf -10° abgekühlt. Nach Zugabe von 32,5 ml tert.-Butylnitrit lässt man noch 10 Min. v/eiterrühren und neutralisiert mit 140 ml Triäthylamin.

Das oben erhaltene HCl«H-Lys(BOC)-Leu-OMe wird in 300 ml Dimethylformamid gelöst, mit 36,4 ml .Triäthylamin versetzt und zur Azidlösung gespült. Nach 4 Stunden Rühren bei Raumtemperatur wird das auskristallisierte Triäthylaminhydrochlorid abfiltriert und das Filtrat vollständig eingedampft. Man erhält ein OeI, das in Essigester gelöst wird. Nach Waschen mit Wasser wird die organische Phase über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt. An- * schliessend wird mit Petroläther gefällt und abfiltriert. Das Rohprodukt wird durch Chromatographie· an Kieselgel und Elution mit Chloroform/Methanol gereinigt. Durch Kristallisation aus Aether/Petroläther erhält man Z-His-Lys(B0C)-Leu-0Me, Smp. 146°, [a]^⁰ = -28° in Methanol.

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64,5 g Z-HIs-LyS(BOC)-LeU-OMe werden in 300 ml Methanol • gelöst und mit 15 ml Hydrazinhydrat versetzt. Nach 3 Tagen Stehen bei Raumtemperatur wird die Lösung vollständig eingedampft. Der Rückstand wird mit Essigester/n-Butanol versetzt und mit gesättigter Natriumchloridlösung mehrere Male gewaschen. Die organische Phase wird zur Trockne eingedampft und der Rückstand über eine Kieselgelsäule mit Chloroform/Methanol filtriert. Man erhält Z-His-Lys(BOC)-LeU-NHNH₂, Smp. l8l°, [a]J = -26° in Methanol.

c) Z-His-Lys(B0C)-Leu-Gln-Thr-Ph9-Pro-Mm-IH ₂

38,4 g Z-Gln-Thr-Phe-Pro-OMe werden in I500 ml Methanol/ Dimethylformamid gelöst. 10 g Palladium (10 # auf Kohle) werden in 50 rnl Wasser aufgeschlämmt und dazugespült. Nach ca. 1/2 Stunde ist die berechnete Wasserstoffmenge praktisch verbraucht. Der Katalysator wird abfiltriert und das FiI-trat eingedampft.

38,6 g Z-His-Lys(BOC)-LeU-NHNH₃ werden in 250 ml Dimethylformamid gelöst. Nach Abkühlen auf -15° werden 42 ml 5 W Salzsäure in Aether und 7,3 ml tert.-Butylnitrit zugesetzt. Es wird 10 Min. gerührt und mit 29,5 ml Triäthylamln neu-

tralisiert. Das oben erhaltene H-Gln-Thr-Phe-Pro-OMe wird in 250 ml Dimethylformamid gelöst und zur Peptidazidlösung gespült. Nach 4 Stunden Rühren bei Raumtemperatur wird das ausgeschiedene Triäthylaminhydrochlorid abfiltriert und das Filtrat vollständig eingedampft. Der Rückstand wird in Essigester/n-Butanol aufgenommen und mit 1 N Ammoniak, 1 N Schwefelsäure und mehrere Male mit Wasser gewaschen. Die organische Phase wird vollständig eingedampft und der Rückstand über eine Kieselgelsäule mit Chloroform/Methanol/ Wasser gereinigt. Man erhält Z-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-OMe, Smp. I7I⁰, ία]£ = -54° in Methanol.

45,6 g Z-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-OMe werden in 1000 ml Methanol/DimethyIformamid gelöst und mit 44 ml Hydrazinhycrat versetzt. Nach 4 Tagen Stehen bei Raumtemperatur wird die Lösung vollständig eingedampft. Der Rückstand wird in Acetonitril ausgekocht. Nach Abkühlen auf ca. 20° wird abfiltriert. Man erhält Z-His-Lys(EOC)-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-NHNH₂, Smp. 175°, [aj^° = -58° in Methanol.

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BAD

Teilseqtuenz_E₁: H-His-Lys(BOG)-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-ArK-Thr-

Asn-Thr-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH _£

Methode A

Man löst 10 g Heptapeptid (Teilsequenz ϋ_χ) in 100 ml Dimethyl formamid, dampft ein, löst den Rückstand in 100 ml Dimethylformamid, versetzt mit 15 g N-Kydroxysuccinlm-Id;, kühlt auf O° ab, gibt 5 g Dicyclohexylcarbodiimid zu, lässt 5 Stunden reagieren, filtriert den ausgeschiedenen Dicyclohexylharnstoff ab, konzentriert auf j>0 ml tind fällt den entstandenen Heptapepfcidoxysuccinimläester Z-Ki.s-Lys{BOC)-Leu-Gln-Thr-Phe-?ro-OSu durch Zusatz von Aether aus. Jiach Auswaschen mit Aether löst ir.an den Rückstand in

100 mi Dimethylfortr.amid, versetzt mit 10 g iTonapeptidamid (Teilsequenz C,) und lässt während 16 Stunden reagieren. Man gibt 5CO ml Essigaster zu und filtriert. Man löst den Rückstand in Dimethylformamid, gibt 10 ml Essigsäure zu und fällt wiederum mit Essigester. Man filtriert, vfäscht mit Sssigsster sowie Aether und trocknet. Man erhält Z-His-Lys (EOCJ-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Val-Gly-AIa-PrO-JIH₂ · 2 AcOH, [a]^ = -24° in Dimethylformamid, das man direkt in 8o #iger Sssigsäuro löst. Anschliessend werden 5 g Palladiurnkohle hinzugefügt, bei Normaldruck und

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Zimmertemperatur hydriert. Man filtriert, dampft bei 20° im Hochvakuum zur Trockne und wäscht den Rückstand mit Aether. Nach Trocknen über KOH-Spänen erhält man die Teilsequenz i,, : Triacetat, Smp.: 185° (mit Zers.), [aJp = -^2° in 1 N Essigsäure .

Methode B

Man löst 12 g Nonapeptid (Teilsequenz C₁-) in 1000 ml Dimethylformamid / Wasser, gibt 1,8 g Palladiumkohle zu und hydriert bei Normaldruck. Vom Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat im Vakuum auf 60 ml eingeengt. Diese Lösung von H-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NHg wird bei -20° aufbewahrt .

Zu einer auf -15° vorgekühlten Lösung von 10 g Z-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-NHNH₂ (Teilsequenz D₃) in 100 ml Dimethylformamid gibt man 21 ml einer 1,85 η Lösung von Salzsäure in Dioxan und 1,1 ml tert.-Butylnitrit. Man rührt 10 Min. bei -15°, kühlt auf -30° ab, gibt 6 ml Triäthyiamin zu und filtriert zur kalten Lösung von H-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Val-Gly-Aja-Pro-MxU in Dimethylformamid. Nach 90 Min. Rühren bei 0° engt man die Lösung im Vakuum ein, versetzt mit Chloroform, filtriert den Niederschlag ab, wäscht mit Chloroform, dann mit Essigester

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und trocknet. Das Rohprodukt wird in einem Gemisch von Methanol / Chloroform / Wasser gelöst und auf eine Kieselgelsäule aufgetragen. Man eluiert, vereinigt die reinen Fraktionen und dampft im Vakuum zur Trockne ein. Den Rückstand löst man in Methanol, fällt das Produkt mit Essigester, filtriert und trocknet. Man erhält Z-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH₂, Smp.: I85⁰ (mit Zers.),

[α]ρ = -29° in Dimethylformamid.

3,68 g des so erhaltenen Hexadecapeptid werden in ISO ml Dimethylformamid / Wasser gelöst, mit 3 g Palladium (10 % auf Kohle) in 10 ml Wasser aufgeschlämmt versetzt und der katalytischen Hydrierung unterworfen. Nach ca. 2 Stunden ist die berechnete Wascerstoffmonge praktisch verbraucht. Es wird vom Katalysator abfiltriert und das Filtrat vollständig eingedampft und die Teilsequenz E, erhalten.

Teilsequenz_Ep: H-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-Arg-Thr-

Asn-Thr-Gly-AIa-GIy-VaI-PrO-NH ₂

Methode A

Analog der Arbeitsweise bei Teilsequenz E, (Methode A) wird aus dem Heptapeptid Teilsequenz D, und dem Nonapeptid Teil-

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sequenz C₂ die Teilsequenz E erhalten: Triacetat, Smp.: l64^c

PO

(mit Zers.), [aj^ = -19° in Dimethylformamid.

Methode B

Man löst 20 g Nonapeptid (Teilsequenz C^) in 450 ml Dimethylformamid / Wasser, gibt 5 6 Falladiumkohle zu und hydriert bei Normaldruck. Vom Katalysator wird abfiltriert und das Piltrat im Vakuum auf 250 ml eingeengt. Diese Lösung von H-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ala-Gly-Val-Pro-NH₂ wira bei -20° aufbewahrt .

Zu einer auf -15° vorgekühlten Lösung von 24 g Z-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-NHNH₂ (Teilsequenz D₉) in 200 ml Dimethylformamid gibt man 52 ml einer 1,85 η Lösung von Salzsäure in Dioxan und 2,6 ml tert.-Butylnitrit. Man rührt 10 Minuten bei -15°, kühlt auf -30° ab, gibt 14 ml Triäthylamin zu und filtriert zur kalten Lösung von H-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ala-Gly-Val-Prc-NKp in Dimethylformamid. Nach 90 Minuten Rühren bei 0° engt man die Lösung im Vakuum ein, versetzt mit Chloroform, filtriert den Niederschlag ab, wäscht mit Chloroform, dann mit Essigester und trocknet. Das Rohprodukt wird in einem Gemisch von Methanol / Chloroform / Wasser gelöst und auf eine Kieselgelsäule aufgetragen. Man eluiert, ver-

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einigt die reinen Fraktionen und dampft im Vakuum zur Trockne ein. Den Rückstand lö-^t man in Methanol, fällt das Produkt mit Essigester, filtriert und trocknet. Man erhält Z-His-Lys (BOC)-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ala-Gly-Val-PrO-NH₂, Smp.: l8o° (mit Zers.), [a]^ = -30° in Dimethylformamid.

6,75 g des so erhaltenen Hexadecapeptid werden in 220 ml Methanol / Wasser gelöst, mit 6 g Palladium (10 ^ auf Kohle) in 20 ml Wasser aufgeschlämmt versetzt und der katalytisehen Hydrierung unterworfen. Nach ca. 2 Stunden ist die berechnete Wasserstoffmenge praktisch verbraucht. Es wird vom Katalysator abfiltriert und das Filtrat vollständig eingedampft und die Teilsequenz E_p erhalten.

Teilsequenz F₁: Trt-Gly-Lys(BOC)-Leu-Ser-Gln-Asp(OTB)-Leu-

NHNH ₂

a) Z-Asp(OTB)-Leu-OMe

Man löst I5I g Z-Asp(OTB)-OH, 54 g N-Hydroxysuccinimid in 700 ml Acetonitril und kühlt auf -20° ab. Anschliessend gibt man 96,5 g Dicyclohexylcarbodiimid, gelöst in 350 ml Acetonitril hinzu. Nach ca. 30 Minuten Stehenlassen wird

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der entstandene Dicyclohexylharnstoff abfiltriert. Zu dem Piltrat werden 71,2 g H-Leu-OMe gegeben, danach 4 Stunden stehen gelassen und am Vakuum eingedampft. Den festen Rückstand versetzt man mit Essigester / Wasser. Die organische Phase wird hierauf mit 5 % Natriumbicarbonatlösung, Wasser und mit verdünnter Schwefelsäure (pH 3) gewaschen, nach dem Neutralwaschen über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Man löst den Rückstand mit Chloroform, dem 1 $ Methanol zugesetzt wurde, und filtriert über einer Kieselgelsäule (10-fache Menge). Man erhält Z-Asp(OTB)-Leu-OMe, Smp. 58°, fa]^ = -l6° in Dimethylformamid.

b) Z-Gln-Asp(OTB)-Leu-OMe . ·

Man löst 118 g Z-Asp(OTB)-Leu-OMe in 2000 ml Methanol. Danach werden 15 g 10 % Palladium auf Aktivkohle in 6} ml 4 N Salzsäure angerührt und in die Lösung gegeben. Das Ganze wird einer zweistündigen Hydrierung bei Raumtemperatur und Normaldruck unterworfen. Hierbei werden ca. 85 ^ der theoretischen Menge V/asserstoff verbraucht. Der Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat vollständig eingedampft, wobei H-Asp(OTB)-Leu-OMe*HCl in -Form eines amorphen Schaumes erhalten wird.

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91,7 g Z-Gln-ONP und 93,8 g H-Asp(OTB)-LeU-OMe -HCl werden in 500 ml Dimethylformamid gelöst und mit 51 ml N-Methylmorpholin versetzt. Man lässt I5 Stunden bei Zimmertemperatur stehen und dampft hierauf die Lösung am Vakuum vollständig ein. Der so erhaltene Rückstand wird mit Wasser " gut verarbeitet und vom V/asser abfiltriert. Anschliessend wird aus Methanol umkristallisiert. Man erhält Z-Gln-Asp (OTB)-Leu-OMe, Smp. I89⁰ (Zers.), [aj£^u = -30° in Dimethylformamid.

c) Z-Scr-Gln-AspCOTB)-Leu-OMe

Man löst hh,k g Z-Gln-Asp(OTB)-Leu-OMe in 1200 ml Methanol/ Dimethylformamid. Danach werden 15 g 10 £iges Palladium auf Aktivkohle in 50 ml V/asser versetzt und in die Lösung gegeben. Nach ca. 2-stündiger Hydrierzelt ist die berechnete Menge an Wasserstoff fast verbraucht. Der Katalysator wird abfiltriert und das Piltrat am Vakuum eingedampft. -

21,4 g Z-Ser-NHNHp gelöst in 100 ml Dimethylformamid werden auf -20° abgekühlt und mit 50,6 ml 5.N Salzsäure in Aether und 10,3 ml tert.-Butylnitrit versetzt. Nach 10 Min. Rühren wird mit 35,6 ml Triethylamin auf pH 7,5 eingestellt

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und J>k,2 g H-GIn-ASp(OTB)-LeU-OMe in 100 ml Dimethylformamid gelöst zugegeben. Man rührt h Stunden bei 20°, filtriert vom ausgeschiedenen Triäthylaminhydiochlorid ab und dampft das Filtrat vollständig ein. Nach Behandlung des Rückstandes mit Wasser und anschliessender Kristallisation aus Wasser/Methanol wird das Rohprodukt durch Filtration über eine Kieselgelsäule mit

Chloroform/Methanol gereinigt. Man erhält Z-Ser-Gln-Asp (OTB)-Leu-OKe, Smp. 172°, [a]^ = -24° in Dimethylformamid.

Trt-Gly-Lys(POC)-Leu-NHNH..,

50,8 g Z-Lys(B0C)-Leu-OMe werden in 600 ml Essigester gelöst und nach Zugabe von 25 ml k N Salzsäure in Aether und 5 g Palladium (10 % auf Kohle) katalytisch hydriert. Nach ca. 4 Stunden ist die berechnete Wasserstoffmenge fast vollständig verbraucht. Vom Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat auf das halbe Volumen eingeengt.

53»0 g Trt-Gly-OH und 12,0 g K-Hydroxysuccinimid werden in 150 ml Dimethylformamid gelöst und auf -15° abgekühlt. Eine Lösung von 21,6 g Dicyclohexylcarbodiimid in 100 ml Acetcnitri: wird dazugespült und das Gemisch unter zeitweiligem Urcschlitteln während 3 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen.

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Vom auskristallisierten Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert und das Filtrat unter Zugabe von 25 ml N-Methylmorpholin mit der aus obiger Hydrierung erhaltenen Dipeptidlösung versetzt. Nach 16 Stunden Stehen wird vollständig eingedampft. Der Rückstand wird in-Essigester aufgenommen und bei 0° mit 1 N Schwefelsäure und 5 % Natriumbicarbonatlösung behandelt. Nach Trocknen über Natriumsulfat wird die orga-

W nische Phase vollständig eingedampft. Durch Filtration des resultierenden Schaumes über eine Kieselgelsäule mit Chloroform/Methanol erhält man Trt-Gly-Lys(BOC)-Leu-QMe

OQ

in Form eines amorphen Schaumes, [α]_β = -10° in Methanol.

Man löst den Rückstand in JOO ml Methanol, versetzt mit 17 ml Hydrazinhydrat und lässt 16 Stunden bei Raumtemperatur stehen. Nach vollständigem Eindampfen und Nachtrocknen am Hochvakuum wird mittels Chloroform/Methanol über eine Kieselgelsäule filtriert. Durch Kristallisation aus Chloroform/Petroläther erhält man Trt-Gly-Lys(B0C)-Leu-NHNH_2> Smp. 175°, [a]?° = -12° in Methanol.

e) Trt-Gly-Ly5(B0C)-Leu-Ser-Gln-Asp(0TB)-LeU-NHNH ₂

26,6 g Z-Ser-Gln-Asp(OTB)-Leu-OMe werden in 1 1 Methanol/ Dimethylformamid gelöst, mit 5 g Palladium (10 % auf Kohle)

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in 100 ml Wasser aufgeschlämmt, versetzt und der katalytischen Hydrierung unterworfen. Nach 1 Stunde ist die berechnete Wasserstoffmenge verbraucht. Der Katalysator wird abfiltr^ert und das Piltrat zur Entfernung von Methanol «eingeengt.

29,6 g Trt-Gly-Lys(BOC)-LeU-NHl-IH₂ werden in 150 ml Dimethylformamid gelöst. Es wird auf -20° abgekühlt und mit 26,2 ml 5 N Salzsäure in Aether und mit 5,3 ml tert.-Butylnitrit versetzt. Nach 10 Min. Rühren werden 18,5 ml Triäthylamin und die oben erhaltene eingeengte Lösung von K-Ser-Gln-Asp(0TB)-Leu-0Me zugegeben. Man rührt 4 Stunden bei Raumtemperatur, anschliessend wird das ausgeschiedene Triäthylaminhydrochlorid abfiltriert und das Piltrat vollständig eingedampft. Der Rückstand wird in Aether aufgenommen, zu einem Pulver verarbeitet und abgenutscht. Dieses Rohprodukt wird durch Filtration Über eine Kieselgelsäule mit Chloroform/Methanol gereinigt. Man erhält Trt-Gly-Lys (BOC)-Leu-Ser-Gln-Asp(0TB)-Leu-0Me, Sir.p. 217°, [α]^⁰ = -30° in Methanol. .

Das Heptapeptid wird in 400 ml Methanol gelöst, mit 1,4 ml Hydrazinhydrat versetzt und während 48 Stunden bei Raum-

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temperatur gerührt. Das ausgefallene Hydrazid wird abfiltriert, mit Aether gewaschen und bis zur Gewichtskonstanz

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getrocknet. Smp. 218°, [aJ_D = -16° in Dimethylformamid.

Teilsequenz G,: Trt-Gly-Lys(BOC)-Leu-Ser-GIn-A sp(OTB)-LeU-

His-Lys(B0C)-Leu-G3n-Thr-Fhe-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH^ · 2CH,C00H·5

2,43 g Heptapeptid (Teilsequenz F) werden in 30 ml Dimethylformamid gelöst. Nach Abkühlen auf -20° werden 1,45 mi 5 N Salzsäure in Aether und 0,252 ml tert.-Butylnitrit zugegeben. Man lässt noch während 10 Minuten weiterrühren und neutralisiert dann mit 1,01 ml Triäthylamin. Das Hexadecapeptid E, wird in 50 ml Dimethylformamid gelöst und zur Heptapaptidazidlösung gespült. Nach 4 Stunden Rühren bei Raumtemperatur ^ wird das ausgeschiedene Triäthylaininhydrochlorid abgesaugt und das Piltrat vollständig eingedampft. Der Rückstand wird in wenig Methanol warm gelöst und durch Zugabe von Aether gefällt. Das Rohprodukt wird an einer Kieselgelsäule chromatographiert und mit Chloroform / Methanol / Wasser eluiert. Man erhält die Titelverbindung vom Smp. 225°, OJp⁰ = -18° in Dimethylformamid.

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Teilsequenz_Gp: Trt-Gly-Lys(BOC)-Leu-Ser-Gln-Asp(OTB)-LeU-

His-Lys(B0C) -Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-Ar-g-Thr-

Asn-Thr-Gly-Ala-Gly-Val-Pro-NHg'2CH^COOH

Analog der Arbeitsweise bei der Teilsequenz G, wird aus dem Heptapeptid Teilsequens F, und dem Hexadecapeptid Teilsequenz

ΡΩ

E₂ die Titelverbindung erhalten. Smp. 216°, [aJ^ = -19° in Dimethylformamid.

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■ ⁵⁶ -

2. Darstellung der Endverbindungen

H-Cys-Ser-Asn-Leu-Scr-Thr-Cys-Vp-l-Leu-Gly-Lys-Lcu-Ser-Oln-Asp-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-Arr-Thr~Asn-Thr-G3y-Val-Gly-AIa-PrO-NH ₂

650 mg Tricosapeptid (Teilsequenz G₁) werden in 30 ml 60 folger Essigsäure gelöst und während l6 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen. Nach Zugabe von Wasser wird mehrere Male mit Aether gewaschen. Die Wasserphase eluiert man durch eine Amberlite-IRA 410•Acetat-Säule und dampft darauf die Lösung vollständig ein.

Man löst 295 mg BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-OH in IO ml Dimethylsulfoxid / Dimethylformamid, gibt 131 mg N-Hydroxysuccinimid und 59 mg Dicyclohexylcarbodiirnid zu und filtriert nach 6 Stunden Stehen vom ausgeschiedenen Dicyclohexy!harnstoff ab. Das. oben durch Abspaltung der Trb-Scbutß&ruppen erhaltene Tricosapeptid wird in 10 ml Dimethylformamid gelöst und sum Filtrat gespült. Nach 48 Stunden Stehen bei Raumtemperatur wird das Produkt durch Zugabe von Aether ausgefällt und die überstehende Lösung abdekantiert. Der Niederschlag wird in wenig Methanol gelöst und durch erneute Zugabe von Aether in ein Pulver übergeführt. Nach Absaugen und Trocknen werden 220 mg des ge-

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BAD ORIGINAL

schützten rohen Dotriacontapeptids in 4 ml eines Methylenchlorid/Trifluoressigsäure/Wasser-Gemisches gelöst. Die Lösung wird nach 1 Stunde Stehen bei Raumtemperatur vollständig eingedampft. Der Rückstand wird in 0,2 N Essigsäure aufgenommen · und auf eine Biogelsäule-P^-(lx300cm) geschichtet. Die Elution v;ird mit 0,2 N Essigsäure durchgeführt. Die vereinigten reinen Fraktionen werden eingedampft und anschliessend lyophilisiert. Man erhält die Titelverbindung, Smp. 215° (Zers.), [a]^ = -75° in 1 N Essigsäure.

Aminosäurezusammensetzung nach Säurehydrolyse (6 N, 16 Stunden) ' Asp 3,1; Thr 3,7; Ser 2,8; GIn 1,9; Pro 2,0; GIy 2,9; AIa 1,0; Cys 1,6; VaI 2,0; Leu 5,2; Phe 1,0; His 1,0; Lys 2,0; Arg 0,9.

H-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Asp-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ala-Gly-VaI-PrO-NH ₂

300 mg Tricosapeptid (Teilsequenz G₂) werden in I5 ml 60' #lger Essigsäure gelöst und während 16 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen. Nach Zugabe von Wasser wird mehrere Male mit Aether gewaschen. Die Wasserphase eluiert man durch eine Amberlite-IRA 410.Acetat-Säule und dampft darauf die Lösung vollständig ein.

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Qd

- 58 - 215378CP

Man löst I70 mg BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-OH in 5 ml Dlmethylsulfoxid / Dimethylformamid, gibt 56 mg N-Hydroxysuccinimid und 26 mg Dicyclohexylcarbodiimid zu und filtriert nach β Stunden Stehen vom ausgeschiedenen Dicyclohexylharnstox'f ab. Das oben durch Abspaltung cfer Trt-Sdrufcz-gruppen erhaltene Tricosapeptid wird in 10 ml Dimethylformamid gelöst und zum Filtrat gespült. Nach ^8 Stunden Stehen bei Raumtemperatur wird das Produkt durch Zugabe von Aether ausgefällt und die überstehende Lösung abdekantiert. Der Niederschlag wird in wenig Methanol gelöst und durch erneute Zpgabe von Aether in ei Pulver übergeführt. Nach Absaugen und Trocknen v/erden I80 mg des geschützten rohen Dotriacontapeptids in 4 ml eines Methylenchlorid/Trifluoressigsäure/v.'asser-Gemisches gelöst. Die Lösung wird nach 1 Stunde Stehen bei Raumtemperatur vollständig eingedampft. Der Rückstand wird in 0,2 N Essigsäure aufgenommen und auf eine Biogelsäule-P^-(lx300cm) geschichtet. Die Eluticn wird mit 0,2 N Essigsäure durchgeführt. Die vereinigten reinen Fraktionen v/erden eingedampft und anschliessend lyophilisiert. Man erhält die Titelverbindung, Smp. 210° (Zers.), [aJ^ = -18° in 50 £iger Essigsäure. . .

Aminosäurezusammensetzung nach Säurehydrolyse' (6 ΪΙ, 1β Stunden) Asp 3,2; Thr 3,9; Ser 2,7; GIn 2,0; Pro 2,0; GIy 3,0; AIa 1,0; Cys 1,6; VaI 2,0; Leu 5.0; Phe 1,0; His 1,0; Lys 2,0; Arg 1,0.

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Claims (3)

1. Patentansprüche t

   neuen Polypeptide der allgemeinen Formel H-Cys-Ser-

   Asn-Leu·Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Asp-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-X-Gly-Y-Pro-NHp, worin X für einen VaIyIrest und Y für einen Alanylrest oder X für einen Alanylrest und Y für einen Valylrest steht, sowie ihre therapeutisch wirksamen Säureadditionssalze und Metallkomplexe.
2. 2. Verfahren zur Herstellung der neuen Polypeptide der allgemeinen Formel H-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Asp-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-X-Gly-Y-Pro-IJHg, worin X und Y obige Bedeutung haben, ihre therapeutisch wirksamen Säureadditionssalze und Schwermetallkomplexe, dadurch gekennzeichnet, dass man die Polypeptide der obigen Formel nach aus der Peptidchemie an sich bekannten Methoden darstellt und anschliesser.ä gegebenenfalls auf an sich bekannte Weise in ihre therapeutisch wirksamen Säureadditionssalze mit organischen oder anorganischen Säuren oder in seine Metallkomplexe überführt .

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   BAD ORlOiNAL
3. 3. Arzneimittel, enthaltend die Polypeptide der im Anspruch 1 angegebenen allgemeinen Formel.

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