DE2153780A1 - Verfahren zur Herstellung von Poly peptiden - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von Poly peptidenInfo
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Description
SANDOZ AG
Basel Case 100-3400
Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden
Die vorliegende Erfindung betrifft Polypeptide der allgemeinen
Formel H-Cys-Ser-Asn~Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Gly-Lys--Leu-Ser-Gln-Asp~Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-Arg-Thr-Asn~Thr-Gly-X-Giy-Y-Fro-NH0,
worin X für einen Valylrest und Y für einen Alanylrest oder X für einen Alanylrest und Y für einen
Valylrest steht, sowie therapeutisch v/irksame Säureadditionssalze
und M-etallkomplexe der genannten Verbindungen und
Verfahren zu ihrer Herstellung.
Die Polypeptide der obigen Formel können nach für die Synthese von Verbindungen dieser Art allgemein bekannten
Methoden hergestellt werden, wobei die Aminosäuren in der in der obigen Foi-mel festgelegten Reihenfolge einzeln oder nach
vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten miteinander verknüpft werden und bei einer geeigneten Stufe der Synthese die
DisulfidbrUcke gebildet wird. Die Verknüpfung der Aminosäure
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und / oder Peptideinheiten erfolgt z. B. in der V/eise, dass
man eine Aminosäure mit geschützter a-Aininogruppe und aktivierter
terminaler Carboxylgruppe mit einer- Aminosäure oder
einem Peptid mit freier a-Aminogruppe und freier oder geschützter
terminaler Carboxylgruppe umsetzt oder dass rr.an eine Aminosäure oder ein Peptid mit aktivierter a-Amino^rup^^
und geschützter terminaler Carboxylgruppe mit einer Aminosäure
oder einem Peptid mit freier terminaler Carboxylcrupr--i-
und geschützter a-Aminogruppe umsetzt.
Die Carboxylgruppe kann beispielsweise durch Ue'cerführung
in ein Säureazicl, --anhydrid, -imidazolid, -isoxazolid
oder einen aktivierten Ester oder durch Reaktion mittels eines Carbcdijniids oder N,N'-Carbonyl-diimidazois aktiviert
v/erden. Vorzugsweise wird als Kondensate cr.srnethcde
die Carbodiirr.idrriethcde, die Azidrnethode, die Methode dor
aktivierten Ester, die Anhydridmethode und die Merrifieldmethode
verwendet.
In der letzten Stufe der Kondensation sind jedoch Methoden
zu verwenden, bei denen Racemisierung nicht auftritt oder
gering sehalten werden kann, vorzugsv/eine durch Yev.iir.&cn^.
der A:iide oder der aktivierten Ester, wobei die Aktivier-urv;
vorzugs'.;eise mit M-Iiydroxysuccinirnid vorgenommen wird.
* oder ein Peptid „...,
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100-^400
An der Reaktion nicht beteiligte freie, funktioneile Gruppen können beim Aufbau des erfindungsgemässen Peptids durch die
von der Synthese langkettiger Peptide her bekannten Schutzgruppen geschützt werden.
So verwendet man beispielsweise für die Blockierung der Guanidogruppe des Argininrestes beim Aufbau der nachstehend
beschriebenen Teilsequenzen C,- und Cg die Carbobenzyloxygruppe,
doch können auch andere geeignete Schutzgruppen, wie die Nitrogruppe, die Tosylgruppe, die p-Nitrobenzyloxycarbonylgruppe
oder die 2-(lsopropyloxycarbonyl)-3,4,5j6-tetrachlorobenzoylgruppe
verwendet werden. Man kann auch den Schutzeffekt der Protonisierung der Guanidogruppe bei der Synthese
verwenden.
Für die Blockierung der £-Aminogruppe des Lysinrestes, beispielsweise
in den nachstehend beschriebenen Teilsequenzen D, und Dp kann eine Carbo-tert.-alkyloxygruppe, vorzugsweise die
Carbo-tert.-butyloxygruppe verwendet werden.
Beim Aufbau des neuen Polypeptids hat sich für die Blockierung der /3-Carboxylgruppe, beispielsweise in der nachstehend
beschriebenen Teilsequenz F,, die tert.-Butyloxygruppe bewährt,
doch können auch andere Schutzgruppen, wie die Methyl-
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oxy-, die Aethyloxy-, die tert.-Amyloxy-, die Amid- oder die
Benzyloxygruppe verwendet werden.
Die Umwandlang einer geschützten Aminogruppe in eine freie
Gruppe sowie die Umwandlung einer funktionell abgewandelten Carboxylgruppe in eine freie Carboxylgruppe im Laufe des Verfahrens
zur Herstellung der neuen Polypeptide erfolgt nach an sich bekannten Methoden durch Behandlung mit hydrolysierenden
bzw. reduzierenden Mitteln.
Die Ausgangsprodukte zur Herstellung der neuen Polypeptide können, sofern sie bisher nicht bekannt waren, nach den für
die Peptidchemie bekannten Methoden erhalten werden, wobei
die Aminosäuren einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten miteinander verknüpft werden.
Die neuen Polypeptide lassen sich auch in Form ihrer Salze gewinnen bzw. verwenden. Als Salze kommen solche mit organischen
Säuren, wie beispielsweise Essigsäure, Milchsäure, Bernsteinsäure, Benzoesäure, Salicylsäure, Methansulfonsäure,
Toluolsulfonsäure sowie polymere Säuren, wie Gerbsäure oder Carboxymethylcellulose und Salze mit anorganischen Säuren,
wie Halogenwasserstoffsäuren, z. B. Salzsäure oder Schwefelsäure
und Phosphorsäure in Frage. Unter Komplexen sind z. B.
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anorganische Verbindungen, die sich von Metallen wie Calcium, Magnesium, Aluminium, Cobalt und insbesondere von Zink ableiten
lassen, zu nennen.
Die erfindungsgemäss hergestellten Polypeptide stellen ein wichtiges therapeutisches Prinzip dar. Sie senken den
Calciumplasmaspiegel und bewirken als Antagonisten des
Parathormons eine Hemmung des Knochenabbaus. Die
biologische Wirkung der neuen Verbindungen wurde an Ratten geprüft, wobei sich aufgrund der Senkung des Blut-Calciums ein Wert von 3000 bis 6000 MRC-Einheiten/mg Peptid ergab.
Calciumplasmaspiegel und bewirken als Antagonisten des
Parathormons eine Hemmung des Knochenabbaus. Die
biologische Wirkung der neuen Verbindungen wurde an Ratten geprüft, wobei sich aufgrund der Senkung des Blut-Calciums ein Wert von 3000 bis 6000 MRC-Einheiten/mg Peptid ergab.
Die zu verabreichende Dosis hängt von.der gewünschten V/irkung
sowie vcn der Applikaticnsart ab. Im allgemeinen
werden jedoch mit einer einmal zu verabreichenden Tagesdosis von 1 bis 10 Einheiten pro kg Tiergcv.'icht zufriedenstellende Resultate erzielt. Für grcssere Säugetiere beträgt die Tagesdosis etwa 70 bis 700 Einheiten, die auf einmal cder in mehreren Anteilen verabreicht werden können. Für die intramuskuläre Applikation enthält eine geeignete Verabreichungsform etwa 70 bis 700 Einheiten der V/irksubstanz, vermischt mit einem flüssigen Träger. ;
werden jedoch mit einer einmal zu verabreichenden Tagesdosis von 1 bis 10 Einheiten pro kg Tiergcv.'icht zufriedenstellende Resultate erzielt. Für grcssere Säugetiere beträgt die Tagesdosis etwa 70 bis 700 Einheiten, die auf einmal cder in mehreren Anteilen verabreicht werden können. Für die intramuskuläre Applikation enthält eine geeignete Verabreichungsform etwa 70 bis 700 Einheiten der V/irksubstanz, vermischt mit einem flüssigen Träger. ;
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BAD OfIIGiNAL
Die erfindungsgemäss hergestellten Verbindungen sind somit indiziert bei allen Zuständen, bei welchen eine Senkung des
Plasmacalciumspiegels bzw. Beeinflussung des Knochenstoffwechsels erwünscht ist, z. B. Hyperoalcämien infolge Mangels
des endogenen Thyreocalcitonins durch Ausfall von Schilddrüsengewebe
oder Hyperfunktion der Nebenschilddrüsen. Sie sind ferner indiziert bei allen Knoehenaffektionen, die auf
einem vermehrten Abbau beruhen oder bei welchen eine Calciumfixation
im Knochen erwünscht ist, z. B. Osteoporose,
Frakturen, Osteomalacie, Rachitis und renaJ bedingte
Osteodystrophie, sowie insbesondere zur Kombinationstherapie mit Calcium und / oder Phosphat.
Die erfindungsgemäss hergestellten Verbindungen können als Heilmittel, z. B. in Form pharmazeutischer Präparate, Verwendung
finden. Dieses enthält die genannten Verbindungen in Mischung mit einem für die parenterale Applikation geeigneten
organischen oder anorganischen Trägermaterial. Sie können auch in Form eines Depotpräparates verabreicht werden.
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Es werden folgende Abkürzungen verwendet;:
Z · = Carbobenzyloxy (Benzyloxy-
oarbonyl) BzI = " Benzyl BOC ■ - s . terfc.-Butyloxycarbonyl
Trfc = Trityl ·-- Triphenylmethyl
OTB = tert.-Eutyloxy
OHP = p-Nitrophenyloxy
OC? = 2,^, 5-TrichlorphGnyloxy
OMe =. Methoxy
OEL = Aethoxy
NOp = Nitro
Ser = L-Seryl
Asn = L-Asparaginyl
Asp = - L-Aspartyl
Leu = ' L-Leucyl
Thr = ' . L-Threonyl
VaI = . L-VaIy 1
Arg - - L-Arginyl · ■
GIn = . L-GIutaminyl
His = L-Histidyl '.
Pro = L-Prolyl
GIy = Glycyl
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BAD ORIGINAL
- 8 - 100-5400
Lys = L-Lysyl
Phe = L-Phenylalanyl
Cys = L-Cysteinyl
Ala = L-Alanyl
OSu = N-Oxysuccinimid
t.But = tert.-Butyl
In den folgenden Beispielen, welche die Ausführung des Verfahrens erläutern, den Umfang der Erfindung aber in keiner
Weise einschränken sollen, erfolgen alle Teir.peraturangaben in Celsiusgraden. Der Wert c für die optische Drehung beträgt
Die Aminosäureanalyse in den folgenden Beispielen ergibt, dass die einzelnen Aminosäuren in den erwarteten Verhältnissen
vorliegen.
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-9- 100-32K)O
1. Darstellung des Ausgangsmaterials
Teilsequenz A,: H-Val-Gly-Ala-Pro-NflU
Man suspendiert 27,5 g Z-Val-Gly-Ala-Pro-NEL in 550 ml
Methanol und hydriert nach Zugabe von 3 ml 96 $iger Schwefelsäure
in Gegenwart von 4,1 ml Eisessig und 3,1 g Palladiumkohle (10 %). Nach Filtration und Eindampfen der Lösung zeigt
das Produkt (Sulfat) im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel
=0,2,
Teilsequenz A0: H-Ala-Gly-Val-Pro-NH,
a) Z-VaI-PrO-NH 2
Man löst 75 g H-PrO-NH2 in 85O ml Dirnethylformamid, versetzt
mit 312 g Z-VaI-CCP und lässt anschliessend die
Lösung für ΐβ Stunden bei Raumtemperatur stehen. Nach Eindampfen
im Vakuum wird der Rückstand aus Essigester uinkristallisiert. Man erhält Z-VaI-PrO-NII2. Smp,:
[α]ρ° = -kl° in Dimethylformamid.
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BAD ORiQiNAL
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b) Z-GIy-VaI-PrO-MH 2
***ΛΛ·τ ο. /^
Man löst 190 g Z-Val-Pro-NHp in 2200 ml Methanol, gibt 85 ml
6 N methanolische Salzsäure zu, hydriert in Anwesenheit von
Palladiur;)l:ohle bei 20° und Normaldruck und filtriert darauf
vom Katalysator ab. Das Produkt wird mit Aether ausgefällt, gewaschen und anschliessend getrocknet. 120 g des erhaltenen
H-Val-Pro-NHg.HCl (Zp: 217-218°; [o3^° = -57° in Methanol)
suspendiert man in l800 ml Dimethylformamid., gibt 196 g
Z-GIy-OCP, dann 6j ml Triäthylamin zu urd schüttelt für
17 Stunden bei 20°. Das ausgeschiedene Triäthylaminhydro-Chlorid
wird abfiltriert und das Piltrat im Vakuum eingedampft. Den Rückstand löst man in einem Gemisch Essigester
/ Wasser. Nach Trocknen über Natriumsulfat und Eindampfen erhält man Z-GIy-VaI-PrO-NH3. Smp.: 82° (mit Zers.)
[a]^° = -76° in Methanol.
c) Z-AIa-GIy-VaI-PrO-NH 2
Man löst 92 g Z-Gly-Val-Pro-KH in 2000 ml Methanol, versetzt
mit 27 ml Essigsäure und hydriert bei 20° in Anwesenheit von Palladiumkohle unter Normaldruck. Man filtriert, dampft im
Vakuum zur Trockne ein, löst den Rückstand in 1000 ml Dimethylformamid, gibt 100 g Z-AIa-OCP zu. schüttelt und lässt
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die Lösung 17 Stunden bei 20° stehen. Hierauf dampft man im Vakuum zur Trockne .ein und kristallisiert den Rückstand aus
Essigester/Aether. Man erhält Z-AIa-GIy-VaI-PrO-NH2, Smp.
(mit Zers.), [a]^ = -51° in Dimethylformamid.
d) H-AIa-GIy-VaI-PrO-NH 2
Man suspendiert 27,5 S Z-Ala-Gly-Val-Pro-NHp in 55Ο ml
Methanol und hydriert nach Zugabe von 3 ml 96 ^iger
Schwefelsäure in Gegenwart von 4,1 ml Eisessig und 3,1 g
Palladiumkohle (10 <£). Nach Filtration und Eindampfen der
Lösung zeigt das Produkt (Sulfat) im Dünnschichtehromatogramm
an Silicagel Rf „ = 0,4.
System: Chloroform / Methanol 7 : 5 + 0,5 % Wasser
System: Chloroform / Methanol 7 : 5 + 0,5 % Wasser
: Z-Thr-Asn-Thr-Gly-NHNH^
Man löst 98 g Z-Thr-Asn-Thr-Gly-CEt in 1000 ml Dimethyl
formamid und versetzt mit 100 ml Hydrazinhydrat. Mach
l6-stüiidi5en Stehen bei Raumtemperatur wird abfiltriert
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BAD ORIGINAL
und mit Wasser und Aether nachgewaschen. Man erhält die
20
Titelverbindung, Smp.: 221°, [a]D = -9° in Dimethylformamid,
Titelverbindung, Smp.: 221°, [a]D = -9° in Dimethylformamid,
Teilsequenz C1: H-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH^
Man löst 1^,5 g 30C-Arg-Thrw\sn~Thr-Gly-HHKHp
in 270 ml Dip.ethylfor.T.sjnid/V.rasser (8:2), kühlt auf -15°,
gibt ^O nil einer h IT Lösung von Salzsäure in Dioxan und
2,5 ml tert.-Butylnitrit zu. Man rührt 10 Minuten bei -15°,
gibt 23 ml Triethylamin zu, filtriert ab, gibt 10,5 S
H-Val-31y-Ala-Pro-!jH2 (Teilsequenz Aj zu, rührt Io Stunden
bei 0°. Danach dampft nian zur Trockne ein, v.-äscht den
Rückstand mit Aether und trocknet. Man löst den Rückstand
in Methanol, gibt ein Zehntel Volumen Wasser und die siebenfache
t'lense Chloroform hinzu und lässt die erhaltene Lösung
durch eina Säule voii 500 g Xiesei^el. Nach Eluiorung
mit einer steigenden Kenge an Methanol erhält man nach
Eindampfen EOC-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Val-Oly-Aia-Pro-NH^
Dieses suspendiert man in 200 ml einer 4 N Lösung von
Salzsäure in Dioxan und rührt v.ährend 2 Stunden bei 25°,
Man dampft zur Trockne ein, löst den Rückstand in 0,2 N
Essigsäure, behandelt rr.it Amberlit-IRA-^IO (Acetat-Form)
und lyophilisiert die '/.'assrige Lösung. Hierauf wäccht
man den Rückstand mit Aether, Essigester und v;ieder Aether
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und trocknet über Natriumhydroxid-Späne. Man erhält die
Titelverbindung in Form des Diacetates, Smp.: 195° (mit Zers.), [ajp° = -64° in Dimethylformamid/HCl I N (1 : 1).
Teilsequenz C'. H-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ala-Gly-Val-Pro-NH
Analog der Arbeitsweise bei der Teilsequenz C, enthält man aus BOC-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-NHNHp und H-Ala-Gly-Val-Pro-NH2
(Teilsequenz Ap) die Titelverbindung in
20 Form des Diacetates, Smp.: 155° (mit Zers.), [a]D = -38° in
Dimethylformamid.
Teilsequenz_C^_: Z-Thr-Asn-Thr-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH^
Zu einer auf -15° abgekühlten Lösung von 11 g Z-Thr-Asn-Thr-GIy-NHNHp
(Teilsequenz B.) in 350 ml Dimethylformamid gibt man 47 ml einer 1,85 η Lösung von Salzsäure in Dioxan und
2,2 ml tert.-Butylnitrit. Man rührt 10 Minuten bei -15°, kühlt auf -30° ab, versetzt mit 12 ml Triäthylamin und filtriert
zur kalten Lösung von H-Val-Giy-Ala-Pro-NHp (Teilsequenz A,) in Dimethylformamid. Nach 90 Minuten Rühren bei
0° wird im Vakuum eingeengt, mit Chloroform versetzt und das ausgefallene Material abfiltriert und getrocknet. Eine Lösung
dieses Rohproduktes in Wasser-Methanol wird durch Dowex 50
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f.iltriert, mit Amberlite IRA 410 neutralisiert und darauf im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird in Acetonitril verrieben,
erwärmt, filtriert und getrocknet. Man erhält die Titelverbindung, Smp.: 220° (mit Zers.)
[aJβ = -28° in Dimethylformamid.
Teilsequenz C2,: Z-Thr-Asn-Thr-Gly-Ala-Gly-Val-Fro-NH^
Analog der Arbeitsweise bei der Teilsequenz CL erhält man aus
Z-Thr-Asn-Thr-GIy-NHNH2 (Teilsequenz Βχ) und H-Ala-Gly-Val-Pro-NHp
(Teilsequenz A^) die Titelverbindung, Smp.: 206° (mit
PO
Zers.), [a]^ = -25° in Dimethylformamid,
Teilsequenz C-: Z^-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH^
Man löst 10 g Z-Thr-Asn-Thr-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-MH2 (Teilsequenz
C-J in 800 ml Methanol-Wasser, gibt 0,5 g Palladiumkohle zu und hydriert bei Normaldruck. Es wird vom Katalysator
abfiltriert und im Vakuum eingedampft. Das erhaltene OeI, H-Thr-Asn-Thr-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NHg, wird in 100 ml
Dimethylformamid gelöst, mit 10 g Ζ-,-Arg-OSu
versetzt und 16 Stunden bei 20° stehen gelasse'n. Die Lösung wird dann im Vakuum eingeengt, das Produkt mit Aceton ausgefällt
und abfiltriert. Der Rückstand wird in Aceton fein
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suspendiert, aufgekocht, filtriert und getrocknet. Man erhält die Titelverbindung, Smp.: 201° (mit Zers.), [aJ^0 =
-15° in Dimethylformamid.
Teilsequenz C^: Z^-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ala-Gly-Val-Pro-NH,
— — — — — — — — — — — — — Q— y— ———_—__________ __
Analog der Arbeitsweise bei der Teilsequenz C_. erhält man
aus Z-Thr-Asn-Thr-Gly-Ala-Gly-Val-Pro-NHp (Teilsequenz CJ)
und Z -Arg-OSu die Titelverbindung, Smp.: IS50 (mit Zers.)»
[α]ρ = -14° in Dimethylformamid.
Teilsequenz D.j Z-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-OH
a) H-Thr-Phe-Pro-OH
Man löst 170 g Z-Phe-Pro-OMe in 1000 ml jMethanol/KCl 1 ?ϊ,
hydriert in Anwesenheit von Palladiurnkohle bei 20° und
Atm. und dampft ein. Man löst den Rückstand in h00 ml
Dimethylformamid, gibt bei 0° 100 ml Triäfchylamin zu, filtriert
das auskristallisierto Triäthylaminhydrochlorid ab
und versetzt das Filtrat mit Z-Thr-H (hergestellt aus
87 g Z-Thr-iiHiIHp durch Lösen in 100 ml N Salzsäure und
Versetzen mit 55 mi N Natriumnitrit ).ifen lässt hierauf
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l6 Stunden bei 0° stehen, dampft zur Trockne ein, löst
den Rucksband in Essigester, wäscht nacheinander mit
verdünnter Salzsäure und verdünntem Ammoniak, trocknet und dampft ein. Man pulverisiert den Rückstand in Heptan,
wäscht mit Petroläther und trocknet. Man erhält Z-Thr-Phe-Pro-OMe,
Smp. 92° (Zers.),[α]β = -16° in Dimethylformamid.
Man löst 53 g Z-Thr-Phe-Pro-OMe in 530 ml Methanol, gibt
100 ml 2 H Natronlauge zu, lässt 1 Stunde bei 25° stehen, gibt 50 ml 2 N Salzsäure zu, konzentriert auf ca. 200 ml,
gibt noch 100 ml Wasser zu, stellt das pH auf 10 ein, wäscht die vrässrige Lösung zweimal mit Essigenter, stellt
anschliessend mit 4 N Salzsäure auf pH 1 ein, extrahiert
das ausgeschiedene Tripeptid Z-Thr-Phe-Pro-OH mit Essig-
20 ester, trocknet und dan:pft ein. Sir.p. 105°,[aj_ = -28° in
Dimethylformamid. Man löst den Rückstand in einem Gemisch von 500 ml Dioxan und 100 ml Wasser und hydriert bei 20°
und Normaldruck in Gegenwart eines Pallad iurnkataly sat or s.
Man filtriert, dampft zur Trockne ein, wäscht den Rückstand mit Aether und trocknet. Man erhält H-Thr-?he-Pro-OH, Snip.
PO
I920 (mit Zersetzung), [α]ί~ = -41° in Essigsäure (95 %).
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BAD ORIGINAL
b) Z-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-OH
Man löst 4O g Z-His-Lys (EOC)-LeU-GIn-HK-NHp in 400 ml
Dimethylformamid, kühlt auf -20°, gibt 75 ml Dioxan/HCl
2 M und ariochliessend 6 ml tert. -Butylnitrit zu, rührt
10 Minuten bei -20°, gibt 50 ml Triäthylamin und 20 g
H-Thr-Phe-Pro-OH zu und lässt ΐβ Stunden bei 25° reagieren.
Man dampft hierauf zur Trockne ein, v/äscht den Rückstand
mit Aether, verdünnter Essigsäure, Aether und sohliesslich mit heisoc-m Essigester. Hierauf trocknet man im Hochvakuum
und erhält Z-His-Lys(EOC)-LGu-Gln-rrhr-Phc-Pro-0H, Snip.
20
200° (Zersetzung), [aJD = -47° in Dimethylformamid.
200° (Zersetzung), [aJD = -47° in Dimethylformamid.
Teilsequenz D0: Z-His-Lys(BOC) -Leu-Glri-Thr-Phe-Pro-NHNH^
a) Z-Gln-Thr-Phe-Pro-OMe
84,8 g Z-Thr(t.But.)-OMe werden in I500 ml Methanol gelöst
und mit 125 ml 2 N Salzsäure und 10 g Palladium (10 % auf Kohle) versetzt. Nach 4-stUndiger Hydrierung
wird vom Katalysator abfiltriert und vollständig eingedampft
.
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61,2 g Z-GIn-OH und 25,6 g N-Hydroxysuccinimid werden
in 1000 ml Aeetonitril/bimethylformamid'gelöst und auf
-15° abgekühlt. Zuerst wird eine Lösung von ^5»7 g Dieyclohexylcarbodiimid
in 200 ml Acetonitril dazugespült, dann das oben erhaltene HCl-H-Thr(t.But.)-0Me gelöst
in Dimethylformamid unter Zusatz von 30,4 ml Triäthylamin.
Unter zeitweiligem Umschütteln lässt man ca. 16 Stunden ™ bei Raumtemperatur stehen. Das auskristallisierte
Triäthylaminhydrochlorid bzw. der Dicyclohexylharnstcff werden abfiltriert und das Filtrat vollständig eingedampft.
Der Rückstand wird in Essigester aufgenommen und mit IN Salzsäure und Natriumbikarbonat 5 % gewaschen.
Nach Trocknen über Natriumsulfat wird die organische Phase auf ein Volumen von ca. 200 ml eingeengt
und mit Petroläther versetzt. Das ausgefallene OeI wird
in ein Pulver umgeformt und abfiltriert. Man erhält Z-GIn-Thr(t.But.)-OMe,
Smp. 106°, [a]^ = +11° In Dimethylformamid
.
78,0 g Z-Gln-Thr(t.But.)-OMe werden in 800 ml Methanol gelöst
und mit 65 ml Hydrazinhydrat versetzt. Nach 48 Stunden
Stehen bei Raumtemperatur wird vollständig eingedampft« Der Rückstand wird mit Wasser behandelt und anschliessend
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aus Methanol/Wasser umkristallisiert. Man erhält Z-Gln-Thr
(t.But.)-NHNH2, Smp. 202°, [aJ^0 = -13° in Methanol.
Ί5.5 g Z-Phe-Pro-OMe werden in 750 ml Methanol gelöst und
mit 55 ml 2 N Salzsäure und 12 g Palladium (10 # auf Kohle)
versetzt. Nach 2-stUndiger Hydrierung.ist die berechnete
Viasserstoffmenge fast quantitativ verbraucht. Vom Katalysator
wird abfiltriert und das Filtrat vollständig eingedampft
.
49,5 g Z-Gln-Thr(t.But.)-NHNH2 werden in 500 ml Dimethylformamid
gelöst und auf -20° abgekühlt. Nach Zugabe von 77 ml 5 N Sclzsäure in Aether und 13,4 ml tert.-Butylnitrit
lässt man 10 Min. weiterrühren und neutralisiert mit 54 ml
Triäthylamin. Das oben erhaltene HCl'H-Phe-Pro-OMe wird in
150 ml Dimethylformamid gelöst, mit 15,4 ml Triäthylamin versetzt und zum Dipeptidazid gespült. Nach 4-stÜndigem
Rühren bei Raumtemperatur wird vom auskristallisierten Triäthylaminhydrochlorid abfiltriert und das Piltrat vollständig
eingedampft. Der Rückstand wird mittels Chloroform/ Methanol über eine Kieselgelsäule filtriert. Nach Kristallisation
aus Essigester/Petroläther erhält man Z-Gln-Thr (t.But.)-Phe-Pro-OMe, Smp. 110°, W^ = -41° in Methanol.
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Das Tetrapeptid wird in 250 ml Trifluoressigaäure gelöst.
Nach 20 Min. Stehen bei Raumtemperatur wird die Lösung auf das halbe Volumen eingeengt und das Produkt mit Aether ausgefällt.
Durch Filtration und ausreichendes Waschen mit Aether erhält man nach Trocknung Z-Gln-Thr-Phe-Pro-OMe,
Smp. 154°, [a}^° = -59° in Methanol.
b) Z-His-Lys(BOC)-
g Z-Lys(B0C)-0H, 48 g H-Leu-OMe und 69 g N-Hydroxysuccinimid
werden in 600 ml Essigester gelöst und auf -20° abgekühlt. Eine Lösung von 65 g Dicyclohexylcarbodiimid in
500 ml Essigester wird dazugespUlt. Unter zeitweiligem Umschütteln
lässt man während 16 Stunden bei Raumtemperatur stehen. Auskristallisierter Dicyclohexylharnstoff wird ab-
^ filtriert und das Piltrat vollständig eingedampft. Der feste Rückstand wird mit Wasser behandelt. Nach Umkristallisation
aus Essigester/Petroläther erhält man Z-Lys(BOC)-
20
Leu-OMe, Smp. 113°, faJD = -l8° in Methanol.
Leu-OMe, Smp. 113°, faJD = -l8° in Methanol.
101,5 g Z-Lys(BOC)-Leu-OMe werden in 1000. ml Essigester gelöst
und mit einer vorgekühlten Lösung von 40 ml 5 N Salzsäure
in Aether in 300 ml Essigester versetzt. Nach Zugabe
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von 5 g Palladium (10 # auf Kohle) in 50 ml Dimethylformamid
aufgeschlämmt wird 3 l/2 Stunden hydriert. Die berechnete
Wasserstoffmenge wird dabei fast quantitativ verbraucht.
Anschliessend wird vom Katalysator abfiltriert und das Piltrat eingedampft.
78,7 g Z-His-NHNHp werden in 2I-OO ml Dimethylformamid gelöst,
mit I82 ml 5 N Salzsäure in Aether versetzt und auf -10° abgekühlt. Nach Zugabe von 32,5 ml tert.-Butylnitrit
lässt man noch 10 Min. v/eiterrühren und neutralisiert mit 140 ml Triäthylamin.
Das oben erhaltene HCl«H-Lys(BOC)-Leu-OMe wird in 300 ml
Dimethylformamid gelöst, mit 36,4 ml .Triäthylamin versetzt
und zur Azidlösung gespült. Nach 4 Stunden Rühren bei Raumtemperatur wird das auskristallisierte Triäthylaminhydrochlorid
abfiltriert und das Filtrat vollständig eingedampft. Man erhält ein OeI, das in Essigester gelöst wird.
Nach Waschen mit Wasser wird die organische Phase über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt. An- *
schliessend wird mit Petroläther gefällt und abfiltriert. Das Rohprodukt wird durch Chromatographie· an Kieselgel
und Elution mit Chloroform/Methanol gereinigt. Durch Kristallisation aus Aether/Petroläther erhält man Z-His-Lys(B0C)-Leu-0Me,
Smp. 146°, [a]^0 = -28° in Methanol.
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64,5 g Z-HIs-LyS(BOC)-LeU-OMe werden in 300 ml Methanol
• gelöst und mit 15 ml Hydrazinhydrat versetzt. Nach 3 Tagen
Stehen bei Raumtemperatur wird die Lösung vollständig eingedampft. Der Rückstand wird mit Essigester/n-Butanol versetzt
und mit gesättigter Natriumchloridlösung mehrere Male gewaschen. Die organische Phase wird zur Trockne eingedampft
und der Rückstand über eine Kieselgelsäule mit Chloroform/Methanol filtriert. Man erhält Z-His-Lys(BOC)-LeU-NHNH2,
Smp. l8l°, [a]J = -26° in Methanol.
c) Z-His-Lys(B0C)-Leu-Gln-Thr-Ph9-Pro-Mm-IH 2
38,4 g Z-Gln-Thr-Phe-Pro-OMe werden in I500 ml Methanol/
Dimethylformamid gelöst. 10 g Palladium (10 # auf Kohle) werden in 50 rnl Wasser aufgeschlämmt und dazugespült. Nach
ca. 1/2 Stunde ist die berechnete Wasserstoffmenge praktisch
verbraucht. Der Katalysator wird abfiltriert und das FiI-trat eingedampft.
38,6 g Z-His-Lys(BOC)-LeU-NHNH3 werden in 250 ml Dimethylformamid
gelöst. Nach Abkühlen auf -15° werden 42 ml 5 W Salzsäure in Aether und 7,3 ml tert.-Butylnitrit zugesetzt.
Es wird 10 Min. gerührt und mit 29,5 ml Triäthylamln neu-
tralisiert. Das oben erhaltene H-Gln-Thr-Phe-Pro-OMe wird
in 250 ml Dimethylformamid gelöst und zur Peptidazidlösung
gespült. Nach 4 Stunden Rühren bei Raumtemperatur wird das ausgeschiedene Triäthylaminhydrochlorid abfiltriert und
das Filtrat vollständig eingedampft. Der Rückstand wird in Essigester/n-Butanol aufgenommen und mit 1 N Ammoniak,
1 N Schwefelsäure und mehrere Male mit Wasser gewaschen. Die organische Phase wird vollständig eingedampft und der
Rückstand über eine Kieselgelsäule mit Chloroform/Methanol/
Wasser gereinigt. Man erhält Z-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-OMe,
Smp. I7I0, ία]£ = -54° in Methanol.
45,6 g Z-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-OMe werden in
1000 ml Methanol/DimethyIformamid gelöst und mit 44 ml
Hydrazinhycrat versetzt. Nach 4 Tagen Stehen bei Raumtemperatur wird die Lösung vollständig eingedampft. Der
Rückstand wird in Acetonitril ausgekocht. Nach Abkühlen auf ca. 20° wird abfiltriert. Man erhält Z-His-Lys(EOC)-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-NHNH2,
Smp. 175°, [aj^° = -58° in
Methanol.
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BAD
Teilseqtuenz_E1: H-His-Lys(BOG)-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-ArK-Thr-
Asn-Thr-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH
£
Methode A
Man löst 10 g Heptapeptid (Teilsequenz ϋχ) in 100 ml Dimethyl
formamid, dampft ein, löst den Rückstand in 100 ml
Dimethylformamid, versetzt mit 15 g N-Kydroxysuccinlm-Id;,
kühlt auf O° ab, gibt 5 g Dicyclohexylcarbodiimid zu,
lässt 5 Stunden reagieren, filtriert den ausgeschiedenen Dicyclohexylharnstoff ab, konzentriert auf j>0 ml tind
fällt den entstandenen Heptapepfcidoxysuccinimläester Z-Ki.s-Lys{BOC)-Leu-Gln-Thr-Phe-?ro-OSu
durch Zusatz von Aether aus. Jiach Auswaschen mit Aether löst ir.an den Rückstand in
100 mi Dimethylfortr.amid, versetzt mit 10 g iTonapeptidamid
(Teilsequenz C,) und lässt während 16 Stunden reagieren. Man gibt 5CO ml Essigaster zu und filtriert. Man löst den
Rückstand in Dimethylformamid, gibt 10 ml Essigsäure zu und fällt wiederum mit Essigester. Man filtriert, vfäscht
mit Sssigsster sowie Aether und trocknet. Man erhält Z-His-Lys
(EOCJ-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Val-Gly-AIa-PrO-JIH2
· 2 AcOH, [a]^ = -24° in Dimethylformamid,
das man direkt in 8o #iger Sssigsäuro löst. Anschliessend
werden 5 g Palladiurnkohle hinzugefügt, bei Normaldruck und
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BAD ORIGINAL
Zimmertemperatur hydriert. Man filtriert, dampft bei 20° im Hochvakuum zur Trockne und wäscht den Rückstand mit Aether.
Nach Trocknen über KOH-Spänen erhält man die Teilsequenz i,, :
Triacetat, Smp.: 185° (mit Zers.), [aJp = -^2° in 1 N Essigsäure
.
Methode B
Man löst 12 g Nonapeptid (Teilsequenz C1-) in 1000 ml Dimethylformamid
/ Wasser, gibt 1,8 g Palladiumkohle zu und hydriert bei Normaldruck. Vom Katalysator wird abfiltriert und das
Filtrat im Vakuum auf 60 ml eingeengt. Diese Lösung von H-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NHg
wird bei -20° aufbewahrt .
Zu einer auf -15° vorgekühlten Lösung von 10 g Z-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-NHNH2
(Teilsequenz D3) in 100 ml Dimethylformamid
gibt man 21 ml einer 1,85 η Lösung von Salzsäure in Dioxan und 1,1 ml tert.-Butylnitrit. Man rührt 10 Min. bei -15°,
kühlt auf -30° ab, gibt 6 ml Triäthyiamin zu und filtriert zur kalten Lösung von H-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Val-Gly-Aja-Pro-MxU
in Dimethylformamid. Nach 90 Min. Rühren bei 0° engt man die Lösung im Vakuum ein, versetzt mit Chloroform, filtriert den
Niederschlag ab, wäscht mit Chloroform, dann mit Essigester
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und trocknet. Das Rohprodukt wird in einem Gemisch von Methanol / Chloroform / Wasser gelöst und auf eine Kieselgelsäule
aufgetragen. Man eluiert, vereinigt die reinen Fraktionen und dampft im Vakuum zur Trockne ein. Den Rückstand löst man
in Methanol, fällt das Produkt mit Essigester, filtriert und trocknet. Man erhält Z-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2,
Smp.: I850 (mit Zers.),
[α]ρ = -29° in Dimethylformamid.
3,68 g des so erhaltenen Hexadecapeptid werden in ISO ml Dimethylformamid
/ Wasser gelöst, mit 3 g Palladium (10 % auf Kohle) in 10 ml Wasser aufgeschlämmt versetzt und der katalytischen
Hydrierung unterworfen. Nach ca. 2 Stunden ist die berechnete Wascerstoffmonge praktisch verbraucht. Es wird vom
Katalysator abfiltriert und das Filtrat vollständig eingedampft und die Teilsequenz E, erhalten.
Teilsequenz_Ep: H-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-Arg-Thr-
Asn-Thr-Gly-AIa-GIy-VaI-PrO-NH
2
Methode A
Analog der Arbeitsweise bei Teilsequenz E, (Methode A) wird aus dem Heptapeptid Teilsequenz D, und dem Nonapeptid Teil-
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sequenz C2 die Teilsequenz E erhalten: Triacetat, Smp.: l64c
PO
(mit Zers.), [aj^ = -19° in Dimethylformamid.
Methode B
Man löst 20 g Nonapeptid (Teilsequenz C^) in 450 ml Dimethylformamid
/ Wasser, gibt 5 6 Falladiumkohle zu und hydriert
bei Normaldruck. Vom Katalysator wird abfiltriert und das Piltrat im Vakuum auf 250 ml eingeengt. Diese Lösung von H-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ala-Gly-Val-Pro-NH2
wira bei -20° aufbewahrt .
Zu einer auf -15° vorgekühlten Lösung von 24 g Z-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-NHNH2
(Teilsequenz D9) in 200 ml Dimethylformamid
gibt man 52 ml einer 1,85 η Lösung von Salzsäure in
Dioxan und 2,6 ml tert.-Butylnitrit. Man rührt 10 Minuten bei
-15°, kühlt auf -30° ab, gibt 14 ml Triäthylamin zu und
filtriert zur kalten Lösung von H-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ala-Gly-Val-Prc-NKp
in Dimethylformamid. Nach 90 Minuten Rühren bei 0° engt man die Lösung im Vakuum ein, versetzt mit
Chloroform, filtriert den Niederschlag ab, wäscht mit Chloroform, dann mit Essigester und trocknet. Das Rohprodukt wird
in einem Gemisch von Methanol / Chloroform / Wasser gelöst und auf eine Kieselgelsäule aufgetragen. Man eluiert, ver-
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einigt die reinen Fraktionen und dampft im Vakuum zur Trockne ein. Den Rückstand lö-^t man in Methanol, fällt das Produkt
mit Essigester, filtriert und trocknet. Man erhält Z-His-Lys (BOC)-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ala-Gly-Val-PrO-NH2,
Smp.: l8o° (mit Zers.), [a]^ = -30° in Dimethylformamid.
6,75 g des so erhaltenen Hexadecapeptid werden in 220 ml
Methanol / Wasser gelöst, mit 6 g Palladium (10 ^ auf Kohle) in 20 ml Wasser aufgeschlämmt versetzt und der katalytisehen
Hydrierung unterworfen. Nach ca. 2 Stunden ist die berechnete Wasserstoffmenge praktisch verbraucht. Es wird vom Katalysator
abfiltriert und das Filtrat vollständig eingedampft und die Teilsequenz Ep erhalten.
Teilsequenz F1: Trt-Gly-Lys(BOC)-Leu-Ser-Gln-Asp(OTB)-Leu-
NHNH
2
a) Z-Asp(OTB)-Leu-OMe
Man löst I5I g Z-Asp(OTB)-OH, 54 g N-Hydroxysuccinimid in
700 ml Acetonitril und kühlt auf -20° ab. Anschliessend gibt man 96,5 g Dicyclohexylcarbodiimid, gelöst in 350 ml
Acetonitril hinzu. Nach ca. 30 Minuten Stehenlassen wird
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der entstandene Dicyclohexylharnstoff abfiltriert. Zu dem Piltrat werden 71,2 g H-Leu-OMe gegeben, danach 4 Stunden
stehen gelassen und am Vakuum eingedampft. Den festen Rückstand versetzt man mit Essigester / Wasser. Die organische
Phase wird hierauf mit 5 % Natriumbicarbonatlösung, Wasser und mit verdünnter Schwefelsäure (pH 3) gewaschen,
nach dem Neutralwaschen über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Man löst den Rückstand mit Chloroform, dem
1 $ Methanol zugesetzt wurde, und filtriert über einer
Kieselgelsäule (10-fache Menge). Man erhält Z-Asp(OTB)-Leu-OMe, Smp. 58°, fa]^ = -l6° in Dimethylformamid.
b) Z-Gln-Asp(OTB)-Leu-OMe . ·
Man löst 118 g Z-Asp(OTB)-Leu-OMe in 2000 ml Methanol.
Danach werden 15 g 10 % Palladium auf Aktivkohle in 6} ml
4 N Salzsäure angerührt und in die Lösung gegeben. Das Ganze wird einer zweistündigen Hydrierung bei Raumtemperatur
und Normaldruck unterworfen. Hierbei werden ca. 85 ^ der theoretischen Menge V/asserstoff verbraucht. Der Katalysator
wird abfiltriert und das Filtrat vollständig eingedampft, wobei H-Asp(OTB)-Leu-OMe*HCl in -Form eines
amorphen Schaumes erhalten wird.
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91,7 g Z-Gln-ONP und 93,8 g H-Asp(OTB)-LeU-OMe -HCl werden
in 500 ml Dimethylformamid gelöst und mit 51 ml N-Methylmorpholin
versetzt. Man lässt I5 Stunden bei Zimmertemperatur
stehen und dampft hierauf die Lösung am Vakuum vollständig
ein. Der so erhaltene Rückstand wird mit Wasser " gut verarbeitet und vom V/asser abfiltriert. Anschliessend
wird aus Methanol umkristallisiert. Man erhält Z-Gln-Asp
(OTB)-Leu-OMe, Smp. I890 (Zers.), [aj£u = -30° in Dimethylformamid.
c) Z-Scr-Gln-AspCOTB)-Leu-OMe
Man löst hh,k g Z-Gln-Asp(OTB)-Leu-OMe in 1200 ml Methanol/
Dimethylformamid. Danach werden 15 g 10 £iges Palladium
auf Aktivkohle in 50 ml V/asser versetzt und in die Lösung
gegeben. Nach ca. 2-stündiger Hydrierzelt ist die berechnete Menge an Wasserstoff fast verbraucht. Der Katalysator
wird abfiltriert und das Piltrat am Vakuum eingedampft. -
21,4 g Z-Ser-NHNHp gelöst in 100 ml Dimethylformamid werden
auf -20° abgekühlt und mit 50,6 ml 5.N Salzsäure in Aether und 10,3 ml tert.-Butylnitrit versetzt. Nach 10 Min.
Rühren wird mit 35,6 ml Triethylamin auf pH 7,5 eingestellt
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und J>k,2 g H-GIn-ASp(OTB)-LeU-OMe in 100 ml Dimethylformamid
gelöst zugegeben. Man rührt h Stunden bei 20°, filtriert vom ausgeschiedenen Triäthylaminhydiochlorid
ab und dampft das Filtrat vollständig ein. Nach Behandlung des Rückstandes mit Wasser und anschliessender
Kristallisation aus Wasser/Methanol wird das Rohprodukt
durch Filtration über eine Kieselgelsäule mit
Chloroform/Methanol gereinigt. Man erhält Z-Ser-Gln-Asp
(OTB)-Leu-OKe, Smp. 172°, [a]^ = -24° in Dimethylformamid.
Trt-Gly-Lys(POC)-Leu-NHNH..,
50,8 g Z-Lys(B0C)-Leu-OMe werden in 600 ml Essigester gelöst
und nach Zugabe von 25 ml k N Salzsäure in Aether und
5 g Palladium (10 % auf Kohle) katalytisch hydriert. Nach
ca. 4 Stunden ist die berechnete Wasserstoffmenge fast vollständig
verbraucht. Vom Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat auf das halbe Volumen eingeengt.
53»0 g Trt-Gly-OH und 12,0 g K-Hydroxysuccinimid werden in
150 ml Dimethylformamid gelöst und auf -15° abgekühlt. Eine Lösung von 21,6 g Dicyclohexylcarbodiimid in 100 ml Acetcnitri:
wird dazugespült und das Gemisch unter zeitweiligem Urcschlitteln
während 3 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen.
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Vom auskristallisierten Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert
und das Filtrat unter Zugabe von 25 ml N-Methylmorpholin mit der aus obiger Hydrierung erhaltenen Dipeptidlösung versetzt.
Nach 16 Stunden Stehen wird vollständig eingedampft. Der Rückstand wird in-Essigester aufgenommen und bei 0°
mit 1 N Schwefelsäure und 5 % Natriumbicarbonatlösung behandelt.
Nach Trocknen über Natriumsulfat wird die orga-
W nische Phase vollständig eingedampft. Durch Filtration des
resultierenden Schaumes über eine Kieselgelsäule mit Chloroform/Methanol erhält man Trt-Gly-Lys(BOC)-Leu-QMe
OQ
in Form eines amorphen Schaumes, [α]β = -10° in Methanol.
Man löst den Rückstand in JOO ml Methanol, versetzt mit
17 ml Hydrazinhydrat und lässt 16 Stunden bei Raumtemperatur stehen. Nach vollständigem Eindampfen und Nachtrocknen
am Hochvakuum wird mittels Chloroform/Methanol über eine Kieselgelsäule filtriert. Durch Kristallisation aus Chloroform/Petroläther
erhält man Trt-Gly-Lys(B0C)-Leu-NHNH2>
Smp. 175°, [a]?° = -12° in Methanol.
e) Trt-Gly-Ly5(B0C)-Leu-Ser-Gln-Asp(0TB)-LeU-NHNH 2
26,6 g Z-Ser-Gln-Asp(OTB)-Leu-OMe werden in 1 1 Methanol/
Dimethylformamid gelöst, mit 5 g Palladium (10 % auf Kohle)
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in 100 ml Wasser aufgeschlämmt, versetzt und der katalytischen
Hydrierung unterworfen. Nach 1 Stunde ist die berechnete Wasserstoffmenge verbraucht. Der Katalysator wird
abfiltr^ert und das Piltrat zur Entfernung von Methanol «eingeengt.
29,6 g Trt-Gly-Lys(BOC)-LeU-NHl-IH2 werden in 150 ml Dimethylformamid
gelöst. Es wird auf -20° abgekühlt und mit 26,2 ml 5 N Salzsäure in Aether und mit 5,3 ml tert.-Butylnitrit
versetzt. Nach 10 Min. Rühren werden 18,5 ml Triäthylamin und die oben erhaltene eingeengte Lösung von K-Ser-Gln-Asp(0TB)-Leu-0Me
zugegeben. Man rührt 4 Stunden bei Raumtemperatur, anschliessend wird das ausgeschiedene Triäthylaminhydrochlorid
abfiltriert und das Piltrat vollständig eingedampft. Der Rückstand wird in Aether aufgenommen,
zu einem Pulver verarbeitet und abgenutscht. Dieses Rohprodukt wird durch Filtration Über eine Kieselgelsäule
mit Chloroform/Methanol gereinigt. Man erhält Trt-Gly-Lys (BOC)-Leu-Ser-Gln-Asp(0TB)-Leu-0Me, Sir.p. 217°, [α]^0 =
-30° in Methanol. .
Das Heptapeptid wird in 400 ml Methanol gelöst, mit 1,4 ml
Hydrazinhydrat versetzt und während 48 Stunden bei Raum-
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temperatur gerührt. Das ausgefallene Hydrazid wird abfiltriert, mit Aether gewaschen und bis zur Gewichtskonstanz
20
getrocknet. Smp. 218°, [aJD = -16° in Dimethylformamid.
getrocknet. Smp. 218°, [aJD = -16° in Dimethylformamid.
Teilsequenz G,: Trt-Gly-Lys(BOC)-Leu-Ser-GIn-A sp(OTB)-LeU-
His-Lys(B0C)-Leu-G3n-Thr-Fhe-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH^ · 2CH,C00H·5
2,43 g Heptapeptid (Teilsequenz F) werden in 30 ml Dimethylformamid
gelöst. Nach Abkühlen auf -20° werden 1,45 mi 5 N
Salzsäure in Aether und 0,252 ml tert.-Butylnitrit zugegeben.
Man lässt noch während 10 Minuten weiterrühren und neutralisiert dann mit 1,01 ml Triäthylamin. Das Hexadecapeptid E,
wird in 50 ml Dimethylformamid gelöst und zur Heptapaptidazidlösung
gespült. Nach 4 Stunden Rühren bei Raumtemperatur ^ wird das ausgeschiedene Triäthylaininhydrochlorid abgesaugt
und das Piltrat vollständig eingedampft. Der Rückstand wird in wenig Methanol warm gelöst und durch Zugabe von Aether gefällt.
Das Rohprodukt wird an einer Kieselgelsäule chromatographiert und mit Chloroform / Methanol / Wasser eluiert. Man
erhält die Titelverbindung vom Smp. 225°, OJp0 = -18° in
Dimethylformamid.
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Teilsequenz_Gp: Trt-Gly-Lys(BOC)-Leu-Ser-Gln-Asp(OTB)-LeU-
Asn-Thr-Gly-Ala-Gly-Val-Pro-NHg'2CH^COOH
Analog der Arbeitsweise bei der Teilsequenz G, wird aus dem
Heptapeptid Teilsequens F, und dem Hexadecapeptid Teilsequenz
ΡΩ
E2 die Titelverbindung erhalten. Smp. 216°, [aJ^ = -19° in
Dimethylformamid.
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■ 56 -
2. Darstellung der Endverbindungen
H-Cys-Ser-Asn-Leu-Scr-Thr-Cys-Vp-l-Leu-Gly-Lys-Lcu-Ser-Oln-Asp-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-Arr-Thr~Asn-Thr-G3y-Val-Gly-AIa-PrO-NH 2
650 mg Tricosapeptid (Teilsequenz G1) werden in 30 ml 60 folger
Essigsäure gelöst und während l6 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen. Nach Zugabe von Wasser wird mehrere Male mit
Aether gewaschen. Die Wasserphase eluiert man durch eine Amberlite-IRA 410•Acetat-Säule und dampft darauf die Lösung
vollständig ein.
Man löst 295 mg BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-OH
in IO ml Dimethylsulfoxid / Dimethylformamid, gibt 131 mg N-Hydroxysuccinimid
und 59 mg Dicyclohexylcarbodiirnid zu und filtriert nach 6
Stunden Stehen vom ausgeschiedenen Dicyclohexy!harnstoff ab.
Das. oben durch Abspaltung der Trb-Scbutß&ruppen erhaltene Tricosapeptid
wird in 10 ml Dimethylformamid gelöst und sum Filtrat
gespült. Nach 48 Stunden Stehen bei Raumtemperatur wird das Produkt durch Zugabe von Aether ausgefällt und die überstehende
Lösung abdekantiert. Der Niederschlag wird in wenig Methanol gelöst und durch erneute Zugabe von Aether in ein Pulver übergeführt.
Nach Absaugen und Trocknen werden 220 mg des ge-
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BAD ORIGINAL
schützten rohen Dotriacontapeptids in 4 ml eines Methylenchlorid/Trifluoressigsäure/Wasser-Gemisches
gelöst. Die Lösung wird nach 1 Stunde Stehen bei Raumtemperatur vollständig eingedampft.
Der Rückstand wird in 0,2 N Essigsäure aufgenommen · und auf eine Biogelsäule-P^-(lx300cm) geschichtet. Die Elution
v;ird mit 0,2 N Essigsäure durchgeführt. Die vereinigten reinen Fraktionen werden eingedampft und anschliessend lyophilisiert.
Man erhält die Titelverbindung, Smp. 215° (Zers.), [a]^ =
-75° in 1 N Essigsäure.
Aminosäurezusammensetzung nach Säurehydrolyse (6 N, 16 Stunden) '
Asp 3,1; Thr 3,7; Ser 2,8; GIn 1,9; Pro 2,0; GIy 2,9; AIa 1,0;
Cys 1,6; VaI 2,0; Leu 5,2; Phe 1,0; His 1,0; Lys 2,0; Arg 0,9.
H-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Asp-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ala-Gly-VaI-PrO-NH
2
300 mg Tricosapeptid (Teilsequenz G2) werden in I5 ml 60' #lger
Essigsäure gelöst und während 16 Stunden bei Raumtemperatur
stehen gelassen. Nach Zugabe von Wasser wird mehrere Male mit Aether gewaschen. Die Wasserphase eluiert man durch eine
Amberlite-IRA 410.Acetat-Säule und dampft darauf die Lösung
vollständig ein.
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Qd
- 58 - 215378CP
Man löst I70 mg BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-OH
in 5 ml Dlmethylsulfoxid / Dimethylformamid, gibt 56 mg N-Hydroxysuccinimid
und 26 mg Dicyclohexylcarbodiimid zu und filtriert nach β Stunden Stehen vom ausgeschiedenen Dicyclohexylharnstox'f ab.
Das oben durch Abspaltung cfer Trt-Sdrufcz-gruppen erhaltene Tricosapeptid
wird in 10 ml Dimethylformamid gelöst und zum Filtrat gespült. Nach ^8 Stunden Stehen bei Raumtemperatur wird das
Produkt durch Zugabe von Aether ausgefällt und die überstehende Lösung abdekantiert. Der Niederschlag wird in wenig Methanol
gelöst und durch erneute Zpgabe von Aether in ei Pulver übergeführt. Nach Absaugen und Trocknen v/erden I80 mg des geschützten
rohen Dotriacontapeptids in 4 ml eines Methylenchlorid/Trifluoressigsäure/v.'asser-Gemisches
gelöst. Die Lösung wird nach 1 Stunde Stehen bei Raumtemperatur vollständig eingedampft.
Der Rückstand wird in 0,2 N Essigsäure aufgenommen und auf eine Biogelsäule-P^-(lx300cm) geschichtet. Die Eluticn
wird mit 0,2 N Essigsäure durchgeführt. Die vereinigten reinen
Fraktionen v/erden eingedampft und anschliessend lyophilisiert. Man erhält die Titelverbindung, Smp. 210° (Zers.), [aJ^ =
-18° in 50 £iger Essigsäure. . .
Aminosäurezusammensetzung nach Säurehydrolyse' (6 ΪΙ, 1β Stunden)
Asp 3,2; Thr 3,9; Ser 2,7; GIn 2,0; Pro 2,0; GIy 3,0; AIa 1,0;
Cys 1,6; VaI 2,0; Leu 5.0; Phe 1,0; His 1,0; Lys 2,0; Arg 1,0.
209819/117S
Claims (3)
- Patentansprüche tneuen Polypeptide der allgemeinen Formel H-Cys-Ser-Asn-Leu·Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Asp-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-X-Gly-Y-Pro-NHp, worin X für einen VaIyIrest und Y für einen Alanylrest oder X für einen Alanylrest und Y für einen Valylrest steht, sowie ihre therapeutisch wirksamen Säureadditionssalze und Metallkomplexe.
- 2. Verfahren zur Herstellung der neuen Polypeptide der allgemeinen Formel H-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Asp-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-X-Gly-Y-Pro-IJHg, worin X und Y obige Bedeutung haben, ihre therapeutisch wirksamen Säureadditionssalze und Schwermetallkomplexe, dadurch gekennzeichnet, dass man die Polypeptide der obigen Formel nach aus der Peptidchemie an sich bekannten Methoden darstellt und anschliesser.ä gegebenenfalls auf an sich bekannte Weise in ihre therapeutisch wirksamen Säureadditionssalze mit organischen oder anorganischen Säuren oder in seine Metallkomplexe überführt .209819/1175BAD ORlOiNAL
- 3. Arzneimittel, enthaltend die Polypeptide der im Anspruch 1 angegebenen allgemeinen Formel.209819/1175BAD ORIGINAL
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CH982671 | 1971-07-05 |
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