Verfahren zur Herstellung bisher unbekannter Polypeptidderivate
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung bisher unbekannter Polypeptidderivate der Formel
EMI1.1
worin R für eine Alkyl-, eine gegebenenfalls substituierte Aralkyl- oder eine gegebenenfalls substituierte Arylgruppe steht, seiner therapeutisch wirksamen Säureadditionssalze und Schwermetallkomplexe. Beispielsweise kann R die Methyl.-, Äthyl-, Propyl-, tert.-Butylgruppe oder aber einen gegebenenfalls durch ein Halogenatom, eine niedere Alkoxy- oder die Nitrogruppe substituierten Phenyl- oder Benzylrest bedeuten. Die neuen Polypeptidderivate zeichnen sich durch ihre Beständigkeit gegenüber der abbauenden Wirkung von Aniinopepti.- dasen aus.
Ein weiterer Vorteil ist der bekanntlich oxydationsbeständige Norleucin-Rest in Stellung 25.
Die bisher unbekannten Polypeptidderivate können hergestellt werden, indem man zu ihrem Aufbau nötige Verbindungen unter Bildung von CONH-Bindungen in beliebiger zeitlicher Reihenfolge miteinander kondensiert, wobei nicht an der Reaktion teilnehmende freie funktionelle Gruppen durch geeignete Schutzgruppen geschützt werden, zu einem beliebigen Zeitpunkt der Synthese die Schutzgruppen abspaltet, die Mercaptogruppen nach Bildung der Sequenz 1 bis 7 zum Disulfid oxydiert und die Carboxylgruppe des Prolylrestes in die Amidgruppe überführt. In der letzten Stufe sind jedoch Methoden zu verwenden, bei denen Racemisierung nicht auftritt oder gering gehalten werden kann, vorzugsweise die Azid- oder die aktivierte Ester-Methode, wobei zur Aktivierung vorzugsweise N-Hydroxysuccinimid Verwendung findet.
tSblicherweise werden die bei Cystein-haltigen Peptiden zum Schutz der SH-Gruppen verwendeten Benzylreste am Ende der Synthese durch Behandlung mit Natrium in flüssigem Ammoniak abgespalten. Es wurde nun gefunden, dass die Abspaltung der Benzylschutzgruppen sowie die Herstellung der (Cys)S-S(Cys)-Bindung vor der letzten Stufe zu besonders guten Ausbeuten an Endprodukt führt.
Beim Aufbau der neuen Polypeptide hat sich für die Blockierung der y-Carboxylgruppe, beispielsweise in der nachstehend beschriebenen Teilsequenz A, die tert. Butyloxygruppe bewährt, doch können auch andere Schutzgruppen, wie die Methoxy-* die Athoxy-, die tert.-Amyloxy-, die Amid- oder die Benzyloxygruppe verwendet werden.
Für die Blockierung der Imidazolgruppe des Histidinrestes in der nachstehend beschriebenen Teilsequenz C hat sich die Triphenylmethylgruppe bewährt, doch können auch andere geeignete Schutzgruppen, wie die Carbo-tert.-butoxy-, die Carbo-tert.-amyloxy-, die Carbobenzoxy- oder die Benzylgruppe verwendet werden.
Für die Blockierung der Guanidogruppe des Argininrestes in der nachstehend beschriebenen Teilsequenz E wurde die Nitrogruppe verwendet doch können auch andere geeignete Schutzgruppen, wie die Tosylgruppe, die p-Nitrobenzoxycarbonylgruppe oder die 2-(lsopropyloxycarbonyl)-3 -3,4,5, 6-tetrachlorobenzoy1- gruppe verwendet werden. Man kann auch den Schutzeffekt der Protonisierung der Guanidogruppe bei der Synthese verwenden.
Die neuen Polypeptidderivate lassen sich auch in Form ihrer Salze gewinnen bzw. verwenden. Als Salze kommen solche mit organischen Säuren, wie Essigsäure, Propionsäure, Glykolsäure, Milchsäure, : Brenztrauben- säure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Benzoesäure, Zimtsäure, Salicylsäure, 2-Phenoxy- oder 2-Acetoxy-benzoe säure, Mandelsäure, Methansulfonsäure, Athansulfonsäure, Hydroxyäthansulfonsäure, Eenzol- oder Toluolsulfonsäure, Naphthalinsulfonsäure, Sulfanilsäure sowie polymere Säuren, wie Gerbsäure, Alginsäure, Polygalacturonsäure, Polyphloretinphosphat oder Carboxymethylcellulose und Salze mit anorganischen Säuren, wie Halogenwasserstoffsäure, z. B. Salzsäure oder Bromwasserstoffsäure, Salpetersäure, Thiocyansäure, Schwefelsäure und Phosphorsäure in Frage. Als Schwermetallkomplex kommt z.
B. derjenige vom Zink*- in Frage.
Die Ausgangsprodukte zur Herstellung der neuen Polypeptidderivate können, sofern sie bisher nicht bekannt waren, nach den für die Peptidchemie bekannten Methoden erhalten werden, wobei die Aminosäuren einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten miteinander verknüpft werden.
Die neuen Verbindungen stellen ein wichtiges therapeutisches Prinzip dar, das den Calciumplasmaspieael, insbesondere den erhöhen Caldumplasmaspiegel, senkt und als Antagonist des Parathormons eine positive Calciumbilanz im Knochen bewirkt.
Es ist somit indiziert bei allen Zuständen, bei welchen eine Senkung des Plasmacalciuinspiegels erwünscht ist, z. B. Hypercalcämien verschiedener Genese, Mangel des endogenen Thyreocalcitonins infolge Ausfalls von Schilddrüsengeweben, Hyperfunktion der Nebenschilddrüsen.
Die neuen Verbindungen sind indiziert bei allen Knochenaffektionen, die auf einem vermehrten Abbau beruhen oder bei welchen eine vermehrte Calciumfixation im Knochen erwünscht ist, z. B. Osteoporose verschiedener Genese (z. B. postklimakterisch, posttraumatisch, bedingt durch Corticosteroidtherapie oder Inaktivität usw.), Frakturen, Osteomalacie, Rachitis sowie insbesondere zur Kombinationstherapie mit Calcium bzw. Phosphat. Die biologische Prüfung der neuen Verbindungen ergab eine Wirksamkeit von etwa 100 bis 450 MRC-Einheiten/mg Peptid. Die erforderliche Tagesdosis (i. m. verabreicht) in MRC-Einheiten beträgt 20 mE bis 10 E, vorzugsweise 100 mElkg Tiergewicht.
Beim Menschen beträgt die tägliche Dosis (i. m.
verabreicht) in MRC-Einheiten 1 bis 500 E. Vorzugsweise wird eine tägliche Dosis von 5 E. i. m. verabreicht.
Die neuen Verbindungen können als Heilmittel, z. B.
in Form pharmazeutischer Präparate, Verwendung finden. Diese enthalten die genannten Verbindungen in Mischung mit einem für die parenterale Applikation geeigneten organischen oder anorganischen Trägermaterial. Für dasselbe kommen solche Stoffe in Frage, die mit den neuen Verbindungen nicht reagieren, wie z. B.
Gelatine, Milchzucker, Stärke, Magnesiumstearat, Talk, pflanzliche Öle, Benzylalkohole, Gummi arabicum, Polyalkylenglykole, Vaseline, Cholesterin oder andere bekannte Arzneimittelträger.
Die pharmazeutischen Präparate können z. B. in flüssiger Form als Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen vorliegen. Gegebenenfalls sind sie sterilisiert und bzw. oder enthalten Hilfsstoffe, wie Konservierungs-, Stabilisierungs-, Netzmittel oder Emulgiermittel. Sie können auch noch andere, therapeutisch wertvolle Stoffe enthalten. Die neuen Verbindungen können auch in Form eines Depotpräparates verabreicht werden.
Die neuen Verbindungen und ihre Salze können auch als Zwischenprodukte zur Herstellung von pharmazeutischen Präparaten Verwendung finden.
Es werden folgende Abkürzungen verwendet:
Z = Benzyloxycarbonyl
Bzl = Benzyl
BOC = tert..-Butyloxycarbonyl
Piv = Pivaloyl
Trt = Trityl = Triphenylmethyl
OTB = tert.-Butyloxy
ONP = p-Nitrophenylester
OCP = 2,4,5-Trichlorphenoxy
OSu = Oxysuccinimid
OMe = Methoxy
OEt = Äthoxy = = Nitro
Ser = L-Seryl
Asn = L-Asparaginyl
Leu = L-Leucyl
Thr = L-Threonyl
Val = L-Valyl Ala = L-Alanyl
Tyr = L-Tyrosyl
Trp = L-Tryptophanyl
Arg = L-Arginyl
Phe -- L-Phenylalanyl
Glu = L-Glutamyl
His = L-Histidyl
Pro = L-Prolyl
Gly = Glycyl
Nle = L-Norleucyl
Cys = L-Cysteinyl
In den nachfolgenden Beispielen,
die die Ausführung des Verfahrens erläutern, den Umfang der Erfindung aber in keiner Weise einschränken sollen, erfolgen alle Temperaturangaben in Celsiusgraden.
Teilsequenz A L-Phenylalanyl-glycyl-L-prolyl- γtert.-butyloxy-
L-glutamyl-L-threonyl-L-prolinamid (H-Phc-Gly-Pro-Glu(OTB)¯Thr-Pro-NH2)
Man löst bei-5 134 g Z-Thr-NH-NHS in 2 Liter in Salzsäure und versetzt mit 0,55 Liter in Natriumnitrit. Nach 5 Minuten wird Kaliumcarbonat bis pH 9 zugegeben, das entstandene Azid mit Athylacetat extrahiert und eine Lösung von 80 g H-Pro-NH Hydrochlorid in 100 ml Wasser, 500 ml Dimethylformamid und 77 ml Triäthylamin hinzugefügt. Man verdampft das Athylacetat bei 200 im Vakuum und lässt über Nacht bei 250 stehen.
Die restliche Lösung wird im Vakuum verdampft, der Rückstand in Athylacetat gelöst, die Lösung mit Wasser, verdünnter Salzsäure und einer wässrigen Kaliumcarbonatlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Man verdampft im Vakuum, löst in warmem Äthylacetat und kühlt ab.
Man erhält Z-Thr-Pro-NH; Smp. 1480, [a] 20D = 720 in 95 % Essigsäure. Man löst hierauf 90 g Z-Thr-Pro NH.2 in 2 Liter Dioxan und 260 ml in Salzsäure und hydriert bei 200 und Normaldruck in Gegenwart eines Palladiumkatalysators. Man filtriert, verdampft die Lösung im Vakuum, wäscht den Rückstand mit Äthyl- acetat und erhält H-Thr-Pro-NH HCl; Smp. 2160, [a] 0 = -64 in 95 % Essigsäure. Dieses wird in 500 ml Dimethylformamid, 50 ml Wasser und 32 ml Triäthyl amin gelöst und 118 g Z-Glu(OTB)-OCP und 800 ml Tetrahydrofuran zugegeben.
Man lässt über Nacht bei
200 stehen, verdampft im Vakuum und kristallisiert den Rückstand mit Athyläther. Man erhält Z-Glu(OTB) Thr-Pro-NH2, Smp. 650 (Zers.), [a]0- = -18 in Dimethylformamid.
Man löst 80 g Z-Glu(OTB)-Thr-Pro-NW in 1,5 Liter Dioxan und 200 ml Wasser und hydriert bei 200 und Normaldruck in Gegenwart eines Palladiumkatalysators.
Die Lösung wird filtriert und im Vakuum verdampft und der Rückstand mit Diäthyläther versetzt, wobei H-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2 erhalten wird; Smp. 650 (Zers.), [a]20D - -28 in Dimcthylformamid,
Dieses wird in 700 ml Dimethylformamid bei 0 gelöst, 200 ml Acetonitril, 68 g ZPhe-Gly-Pro-OH und 32 g Dicyclohexylcarbodiimid hinzugefügt, über
Nacht bei 200 stehengelassen, filtriert, im Vakuum ein gedampft und mit Äthylacetat versetzt. Danach wäscht man die Lösung mit Wasser, verdünnter Salzsäure und wässriger Kaliumcarbonatlösung, trocknet über Natriumsulfat, verdampft im Vakuum und kristallisiert den Rückstand aus Äthylacetat/Äthyläther. Man erhält Z - Phe - Gly - Pro - Glu(OTB) - thr-Pro-NH2, Smp. 1200 (Zers.), [a]20d = -66 in Dimethylformamid, das man in 1500 ml Dioxan und 300 ml Wasser löst.
Man gibt
30 g Palladiumkohle (10%) zu und hydriert bis zum
Ende der Wasserstoffaufnahme. Man filtriert, dampft das Filtrat ein und kristallisiert den Rückstand aus Dioxan. Man erhält das H-Phe-Gly-Pro-Glu(OTB)-Thr Pro-NH2; Smp. 153 , [a]20D = -79 in Dimethylform amid.
Teilsequenz B
Benzyloxycarbony1-L-seryl-glycyl-L-norleucyl glycin (Z-Ser-Gly-Nle-Gly-OH) a) Benzyloxycarbonyl-L-norleucyl-glycin (Z-Nle-Gly-OH)
Man löst 31,6 g H-Gly-OH in 420 ml in NaOH, gibt 840 ml Tetrahydrofuran zu, versetzt anschliessend mit 130 g Z-Nle-ONP, schüttelt, bis die Lösung klar wird, lässt eine Nacht bei 250 stehen. Dann wird im Vakuum auf 500 ml konzentriert und die erhaltene wässrige Lösung mit in NaOH auf pH 9 gestellt, zweimal mit Äther extrahiert, dann mit 4n Salzsäure angesäuert, mit Essigester extrahiert. Die Essigesterlösung wäscht man mit Wasser und 30%iger Kochsalzlösung, trocknet über Natriumsulfat, dampft im Vakuum ein.
Den Rückstand verreibt man mit äther, lässt 2 Stunden bei -20 kristallisieren. Man erhält Z-Nle-Gly-OH, Smp. 138 , [a]20D= -4 in Dimethylformamid.
b) Benzyloxycarbonyl-glycyl-L-norleucyl-glycin (Z-Gly-Nle-Gly-OH)
Man löst 100 g Z-Nle-Gly-OH in 1000 ml 4n HBr/ Eis essig, lässt 50 Minuten bei 250, verreibt mit Äther, filtriert Kristalle ab und wäscht gut mit Äther. Man erhält HBr H-Nle-Gly-OH, [a] 20D = + 24,70 in Essigsäure (95 %). Man löst 84 g HBr H-Nle-Gly-OH in 240 ml Wasser, versetzt mit 152 ml 4n NaOH, 800 ml Tetrahydrofuran und 91 g ZGly-ONP. Man schüttelt 1 Stunde bei 250 und lässt dann 2 Tage bei 250 stehen.
Man konzentriert im Vakuum auf 500 ml, stellt mit in NaOH auf pH 9 und extrahiert mit äther. Die wässrige Phase wird mit in Salzsäure angesäuert, dann zweimal mit Essigester extrahiert. Man wäscht mit Wasser, 30%iger Kochsalzlösung, trocknet über Natriumsulfat, dampft im Vakuum ein und verreibt den Rückstand mit Äther. Man erhält Z-Gly-Nle-Gly-OH, Smp.
1550, [a]20D= -5,60 in Dimethylformamid.
c) Benzyloxycarbonyl-L-seryl-glycyl-L-norleucyl glycin (Z-Ser-Gly-Nle-Gly-OH)
Man löst 89,5 g Z-Gly-Nle-Gly-OH in 900 ml 4n HBrjEisessig, lässt 50 Minuten bei 250 stehen, dampft im Vakuum ein, verreibt mit Äther, filtriert, wäscht gut mit Äther, trocknet im Vakuum, löst in 280 ml Wasser, etwa 650 ml Dimethylformamid, gibt 66,5 ml Triäthylamin zu und versetzt mit der Lösung des Azids, die wie folgt erhalten wird:
:
Man kühlt 940 ml in Salzsäure auf 5, gibt 96 g Z-Ser-NH-NH zu und tropft dann bei -5 360 ml in Natriumnitrit ein, rührt noch 6 Minuten bei-5 , überschichtet mit etwa 600 ml Essigester von 00, stellt unter Zugabe von festem Natriumcarbonat auf pH 8,5, trennt die Essigesterphase ab, extrahiert nochmals, trocknet die Lösung über Natriumsulfat und filtriert.
Die Reaktionslösung dampft man im Vakuum ein, versetzt den Rückstand mit 600 ml Wasser, säuert an, extrahiert mit Athylacetat, wäscht mit Wasser und 30%iger Kochsalzlösung, kühlt auf 00, filtriert Kristalle ab. Man erhält Z-Ser-Gly-Nle-Gly-OH, Smp. 2100 (mit Zers.), [ei D'0 = 80 in Dimethylformamid.
Teilsequenz C
Na,Nimid, -Ditrityl-L-histidyl-L-arginyl
L-phenylalaninhydraszid. HCl (Trt-His (Trt)-Arg-Phe-NH-NH2 - HC1) a) Z-Arg(NO.--Phe-OMe
51,8 g H-Phe-OMe HCl werden in 1 Liter Äther und etwa 50 ml Eiswasser gelöst und unter Rühren und Kühlen genügend Natriumcarbonat zugegeben, bis alles Wasser abgebunden ist. Man filtriert und dampft das Filtrat bis zur Gewichtskonstanz ein, wobei ein farbloses Öl erhalten wird.
67,6 g Z-Arg(NO > ,)-OH werden in 300 ml Acetonitril und 150 ml Dimethylformamid gelöst und mit 41,2 g H-Phe-OMe versetzt. Danach wird auf -200 abgekühlt und eine Lösung von 43,4 g Dicyclohexylcarbodiimid in 100 ml Acetonitril zugegeben. Das Ganze lässt man unter zeitweiligem Umschütteln während 4 Stunden im Eiskasten stehen. Der entstandene Niederschlag wird abfiltriert und das Filtrat eingedampft. Der Eindampfrückstand wird in 1 Liter Essigester gelöst und hierauf in der Kälte mit ln Natronlauge, Wasser, in Schwefelsäure, Wasser und gesättigter Kochsalzlösung gewaschen. Die über Natriumsulfat getrocknete Essigsäureäthylester-Phase wird vollständig eingedampft.
Nach Umkristallisieren aus Essigester/Petroläther erhält man Z-Arg(NO)-Phe-OMe; Smp. 131-1330, [a] 2D -70 in Methanol, -4 in Dimethylformamid.
b) H-Arg(NO2)-Phe-OMe 0,5 H.2O 1,2 HBr
20 g Z-Arg(NO2)-Phe-OMe werden in 50 ml Eisessig gelöst und unter leichtem Kühlen 50 ml 40%ige Bromwasserstoffsäure in Eisessig zugesetzt. Danach lässt man das Ganze unter zeitweiligem Umschütteln während 1 Stunde bei 20 stehen. Nach vollständigem Eindampfen wird der Rückstand in 200 ml Wasser gelöst und zweimal mit Äther gewaschen. Die wässrige Phase wird vollständig eingedampft und der Rückstand aus Methanol/Äther umkristallisiert. Smp. 165-167 mit Zers., [cr] 20D = + 180 in Methanol, + 14 in Dimethylformamid.
c) Z-His(Z)-Arg(NO2)-Phe-OMe
46,1 g H-Arg(NO2)-Phe-OMe 0,5 HnO 1,2 HBr werden in 100 ml Wasser gelöst, hierauf erwärmt und anschliessend abgekühlt. Nach Zugabe von Chloroform und Eis wird mit Ammoniak auf pH 9 gestellt. Die Chloroformphase wird noch einmal mit Wasser gewaschen, anschliessend über Natriumcarbonat getrocknet und filtriert. Dem Filtrat wird eine Lösung von 44,5 g Z-His(Z)-OH, 12,1 g Hydroxysuccinimid in 200 ml Acetonitril und 100 ml Pyridin zugesetzt, danach das Ganze auf -200 abgekühlt und mit einer Lösung von 21,1 g Dicyclohexylcarbodiimid in 70 ml Acetonitril versetzt. Anschliessend wird unter zeitweiligem Rühren 4 Stunden im Eiskasten stehengelassen. Der entstandene Niederschlag wird abfiltriert und das Filtrat eingedampft.
Der Rückstand wird in Essigsäureäthylester aufgenommen und anschliessend folgendermassen gewaschen: 10 Die Kaliumcarbonatlösung (pH zur 10), Wasser, gesättigte Kochsalzlösung, Wasser, gesättigte Kochsalzlösung, Schwefelsäure (pH 3), Wasser, Kochsalzlösung. Die über Natriumsulfat getrocknete Essigsäureäthylester-Phase wird vollständig eingedampft, wobei ein hellbeiger Schaum erhalten wird. Dieser Schaum wird je zweimal in wenig Methanol gelöst und mit Äther gefällt. Die Atherphasen werden abdekantiert und der Niederschlag getrocknet; man erhält Z-His(Z) Arg(NO)-Phe-OMe (amorpher Schaum), [e] 0 = -80 in Methanol, -8 in Dimethylformamid.
d) H-His-Arg-Phe-OMe 4 HC1
25 g Z-His(Z)-Arg(ZO2)-Phe-OMe werden in 800 ml Eisessig gelöst. Danach werden 10 g 10% Palladium auf Aktivkohle in 200 ml in Salzsäure angerührt und in die Lösung gegeben. Das Ganze wird einer 2stündigen Hydrierung unterworfen und anschliessend der Katalysator abfiltriert. Das Filtrat wird erneut mit 5 g 10% Palladium auf Aktivkohle in Wasser versetzt und der Hydrierung unterworfen, die nach 51/2 Stunden beendet ist. Hierbei werden etwa 80 sO der theoretischen Menge Wasserstoff verbraucht. Der I(atalysator wird abfiltriert und das Filtrat vollständig eingedampft, wobei H-His Arg-Phe-OMe .4 4 HCl in Form eines amorphen Schaumes erhalten wird.
e) Trt-His(Trt)-Arg-Phe-OMe. HCl 21,5 g H-His-Arg.-Phe-OMe.4HCl zu 4 HCl werden in 100 ml Pyridin und etwa 100 ml Dimethylformamid gelöst. Bei etwa + 50 wird bis pH 9 Triäthylamin zugegeben und anschliessend eine Lösung von 29 g Tritylchlorid in 300 ml Pyridin während 5 Minuten zugetropft. Nach Beendigung der Zugabe wird von Zeit zu Zeit das pH geprüft und nötigenfalls wieder mit Tri äthylamin auf etwa pH 9 gestellt. Das Ganze wird nach ungefähr 4 Stunden eingedampft, der Rückstand in Chloroform und Wasser aufgenommen und unter Zugabe von wenig In Salzsäure auf pH 4 gestellt. Man trennt die Chloroformphase ab, wäscht sie zweimal mit Wasser, trocknet über Natriumsulfat und dampft vollständig ein.
Der Rückstand wird mit Ather versetzt und vom Äther anschliessend abfiltriert, wobei Trt-His(Trt) Arg-Phe-OMe. HC1 erhalten wird.
f) Trt-His(Trt)-Arg-Phe-NH-NH2.HCl
17 g Trt-His(Trt)-Arg-Phe-OMe. HC1 werden in 200 ml Methanol gelöst und mit 40 ml Hydrazinhydrat versetzt. Danach wird 2 Tage bei Zimmertemperatur stehengelassen. Man dampft ein, löst den Rückstand in Chloroform und wäscht zweimal mit Wasser. Die Chloroform-Phase wird über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Hierauf wird der Rückstand mit Äther gewaschen und abfiltriert; er besteht aus Trt-His(Trt) Arg-Phe-NH-NH2. HCl; Smp. 1580, [l] r) = 9 in Dimethylformamid.
Teilsequenz D
1-(H-Asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl
L-asparaginyl-L-phenylalanin)-2-benzyloxy carbonyl-hydrazid Trifluoracetat (H-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z CF:aCOOH) a) 1-(N-tert-Butyloxycarbonyl-L-phenylalanin)
2-benzyloxycarbonyl-hydrazid (BOC-Phe-NH-NH-Z)
Man löst 72 g BOC-Phe-OH und 28 g N-Methylmorpholin in 500 ml Methylenchlorid auf und tropft bei-5 26 ml Chlorameisensäuremethylester zu. Nach 10 Minuten gibt man noch 44 g Z-NHNH. in 100 ml Methylenchlorid zu und rührt 4 Stunden bei Zimmertemperatur weiter. Nach Auswaschen mit verdünnter Phosphorigersäure wird getrocknet und eingedampft.
Nach Kristallisieren aus Petroläther erhält man BOC Phe-NH-NH-Z vom Smp. 117 , [a]20D = - 5 in Dimethylformamid.
b) 1-(N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-asparaginyl
L-phenylalanin)-2-benzyloxycarbonyl-hydrazid (BOC-Asn-Phe-NH-NH-Z)
Man löst 41 g BOC-Phe-NHNH-Z in 400 ml Trifluoressigsäure und lässt eine Stunde bei 200 stehen.
Beim Verdampfen der Trifluoressigsäure erhält man das H-Phe-NHNH-Z als kristallines Trifluoracetat vom Smp. 1910, [a] b'0 = + 26,4 in Dimethylformamid.
Diese Substanz wird zusammen mit 35 g BOC-Asn ONP und 30 g N-Methylmorpholin in 200 ml Dimethylformamid gelöst. Nach 16 Stunden Stehen bei 200 wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand nacheinander mit Essigester und verdünnter Phos phorigersäure gewaschen. Man erhält BOC-Asn-Phe NH-NH-Z vom Smp. 2100, [a]D = -18 in Dimethylformamid.
c) 1-(N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-asparaginyl
L-asparaginyl-L-phenylalanin)-2-benzyloxy carbonyl-hydrazid (BOC-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z)
Man löst 26 g BOC-Asn-Phe-NH-NH-Z in 200 ml Trifluoressigsäure auf und lässt 1 Stunde bei 200 stehen.
Nach Verdampfen des Lösungsmittels versetzt man in 100 ml Dimethylformamid mit 17 g BOC-Asn-ONP und 15 g N-Methylmorpholin. Nach 16 Stunden bei 200 wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand nacheinander mit Essigester und verdünnter Phosphorigersäure gewaschen. Man erhält BOC-Asn Asn-Phe-NH-NH-Z; Smp. 2400, [a]20D = -280 in Dimethylformamid.
d) 1-(N-tert-Butyloxycarbonyl-L-lencyl-L-asparaginyl
L-asparaginyl-L-phenylalanin) -2-benzyloxy carbonyl-hydrazid (BOC-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z)
Man löst 22 g BOC-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z in 150 ml Trifluoressigsäure und lässt 1 Stunde bei 200 stehen. Nach Verdampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand mit 12 g BOC-Leu-ONP und 10 g N-Methylmorpholin in 100 ml Dimethylformamid versetzt. Nach 16 Stunden Stehenlassen bei 200 wird das Dimethylformamid verdampft und der Rückstand nacheinander mit Essigester und verdünnter Phosphorigersäure gewaschen.
Man erhält BOC-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z vom Smp. 210 , [a]22D= -34 in Dimethylformamid, e) 1-(N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-asparaginyl
L-lencyl-L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-Phenhl alanin)-2-benzyloxycarbonyl-hydrazid (BOC-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z)
Man löst 57 g BOC-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z in 300 ml Trifluoressigsäure und lässt eine Stunde bei 200 stehen. Nach Verdampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand in Ather kristallisiert. Man löst das Tetrapeptid-trifluoracetat in 400 ml Dimethylformamid und versetzt die Lösung mit 27 g BOC-Asn-ONP und 25 N-Methylmorpholin.
Nach 16 Stunden Stehenlassen bei 200 wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand nacheinander mit Essigester und verdünnter Phosphorigersäure gewaschen. - Man erhält BOC-Asn Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z vom Smp. 2500 (Zers.), [a' r, = -340 in Dimethylformamid.
f) 1-(l-Asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl
L-asparaginyl-L-phenylalanin)-2-benzyloxy carbonyl-hydrazid Trifluoracetat (H-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z Trifluor acetat
Man löst 43,5 g BOC-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH- NH-Z in 200 ml Trifluoressigsäure und lässt eine Stunde bei 200 stehen. Nach Eindampfen wird der Rückstand mit Hilfe von Äther kristallisiert. Man erhält H-Asn Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z Trifluoracetat; Smp. 2420, [aj -b0 = -220 in Dimethylformamid.
Telsequenz E tert..-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl
L-tryptophanyl-L-arginin-hydrazid Acetat (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-NHNHe CHsCOOH) a) N-tert-Butyloxycarbonyl-L-tryptophanyl (guanido)N-nitro-L-argininmethylester (BOC-Trp-Arg(NOL)-Ol\4c)
Man löst 35 g H-Arg(NO2)-OMe liCl, 63 g BOC Trp-OCP und 14 g N-Methylmorpholin in 300 ml Dimethylformamid auf und lässt 16 Stunden bei 200 stehen. Nach Verdampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand in Essigester aufgenommen und mit verdünnter Schwefelsäure gewaschen. Man engt etwas ein und fällt mit Äther aus. Dabei kristallisiert BOC-Trp Arg(NO2)-OMe vom Smp. 1300, [alLssO = -220 in Dimethylformamid.
b) N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-tyrosyl-L-tryptophanyl (guanido) N-nitro-arginimmethylester (BOC-Tyr-Trp-Arg(NOo)-OMe)
Man löst 15 g BOC-Trp-Arg(NO2)-OMe in 80 ml 5n methanolischer Salzsäurelösung auf und lässt 1 Stunde bei Zimmertemperatur stehen. Nach Verdampfen des Lösungsmittels und Behandeln mit Äther verbleiben 13 g H-Trp-Arg(NO2)-OMe als Hydrochlorid zurück; Smp. 1200, [a]D = -90 in Dimethylformamid. Dieses Dipeptid wird zusammen mit 14 g BOC-Tyr-OCP und 8g N-Methylmorpholin in 200 ml Dimethylformamid gelöst. Nach 16 Stunden Stehen bei 200 wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand in Essigester aufgenommen.
Nach Waschen mit verdünnter Phosphorigersäure und Einengen des Lösungsmittels kann man mit Hilfe von Äther BOC-Tyr-Trp-Arg(NO2)- OMe isolieren; Smp. 1300, [a] = -110 in Dimethylformamid.
c) tert-Butyloxcarbonyl-L-alanyl-L-tyrosyl
L-tryptophanyl-(guanido)N-nitro-L-arginin methylester (BOC-Ala-Tyr-Trp-Arg(NO )-OMe)
Man löst 13,5 g BOC-Tyr-Trp-Arg(NO2)-OMe in 130 ml 5n methanolischer Salzsäurelösung auf, lässt 1 Stunde bei 250 stehen, dampft zur Trockne ein, wäscht den Rückstand mit Dimethyläther, filtriert ab, löst in 100 ml Dimethylformamid auf und versetzt mit 8,0 g BOC-Ala-OCP und 3,0 ml Triäthylamin. Nach 16 Stunden bei 250 gibt man 500 ml Essigester hinzu, wäscht mit verdünnter Schwefelsäure und Kaliumbicarbonatlösung und dampft zur Trockne ein. Nach Waschen des Rückstandes mit Chloroform erhält man lBOC-Ala-Tyr-Trp-Arg(NO..)-OMe; Smp. 1200 (Zers.), [a] 2E) = 120 in Dimethylformamid.
d) tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl
L-tryptophanyl-(guanido)N-nitro-L-arginin methylester (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg(NO2)-OMo)
Man löst 12,3 g BOC-Ala-Tyr-Trp-Arg(NO-)-OMe in 100 ml 5n methanolischer Salzsäure, lässt 1 Stunde bei 250 stehen, dampft zur Trockene ein, wäscht den Rückstand mit Diäthyläther, löst ihn in 100 ml Dimethylformamid, versetzt mit 14 ml Triäthylamin und 8,5 g BOC-Ser-N3, lässt 16 Stunden bei 0 stehen, gibt 500 ml Essigester zu, wäscht nacheinander mit verdünnter Schwefelsäure und Ammoniumhydroxid, trocknet über Natriumsulfat und dampft das Lösungsmittel ab.
Nach Waschen des Rückstandes mit Chloroform löst man ihn in Essigester und fällt durch Zugabe von Di äthyläther. Man erhält 13,5 g BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp Arg(NO2)-OMe; Smp. 135 (Zers.), [a]20D = - 15 in Dimethylformamid.
c) tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl
L-tryptophanyl-L-arginin-hydrazid Acetat (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-NIINIH2 CH3COOH)
Man löst 13.2 g von dem oben erhaltenen Pentapeptidester in 300 ml Essigsäure, gibt 60 ml Wasser und 13,2 g Palladiam-Kohle (10 Eig) zu und hydriert bis zum Ende der Wasscrstoffaufnahme. Man filtriert, dampft ab, löst den Rückstand in Dimethylformamid auf, dampft wiederum ab, um die Spuren von Essigsäure zu beseitigen. Anschliessend löst man den Rückstand in 260 ml Methanol, versetzt mit 26 ml Hydrazinhydrat und lässt 16 Stunden bei 40j stehen. Nach Zugabe von 260 ml Diäthvläther filtriert man die ausgeschiedene kristalline Masse ab, wäscht mit Diäthyl äther und trocknet im Hochvakuum über Schwefelsäure.
Man erhält BOC-S-zr-Ala-Tyr-Trp-Arg-NHNH- CH3COOH; Smp. l82C, [a]D20 = -8 < in Dimethylformamid.
Teilsequenz Fl
L-Threonyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-valyl-L-leucin (H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OH) a) H-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe. HBr
Man löst 21,0 g Z-Cys(Bzl)-OCP und 12,3 g H-Val Leu-OMe HCl in 120 ml Dimethylformamid. Danach gibt man 5,9 ml Triäthylamin hinzu, lässt 16 Stunden bei 250 stehen, fügt Essigester hinzu, wäscht mit ver dünnter Salzsäure, trocknet über Natriumsulfat, dampft zur Trockne ab und kristallisiert den Rückstand aus Essigsäureäthylester/Diäthyläther. Man erhält Z-Cys (Bzl)-Val-Leu-OMe, Smp. 1o0, [C] 2E) = -28 in Di methylformamid, das man in 210 ml einer 40%igen Lösung von Bromwasserstoff in Eisessig löst. Man lässt
1 Stunde bei 250 stehen, dampft zur Trockne ein und kristallisiert den Rückstand aus Isopropanol/Diäthyl äther um.
Man erhält H-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe HBr, Smp. 1680, [a] .-D0= + 14 in Dimethylformamid.
b) H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe .1,3 HBr
Man löst 20 g Z-Thr-NHNH2 in 350 ml Dimethyl formamid, kühlt auf -20 , gibt 100 ml einer Lösung von 2n Salzsäure in Dioxan und anschliessend noch
10 ml tert.-Butylnitrit zu. Nach 10 Minuten bei 200 werden 45 ml Triäthylamin und 25,5 g H-Cys(Bzl)-Val
Leu-OMe HBr hinzugefügt und das erhaltene Gemisch während 16 Stunden bei 0 geschüttelt. Man dampft zur Trockne ein, löst den Rückstand in einem Gemisch von Essigsäureäthylester/Wasser, wäscht die organische
Phase mit verdünnter Salzsäure, trocknet über Natrium sulfat, dampft ein und kristallisiert den Rückstand aus
Essigester um. Man erhält Z-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu
OMe; Smp. 2080, [a]20D = -27 in Dimethylformamid.
Man löst 20 g von dem oben erhaltenen Tetrapeptid in 200 ml eines Gemisches von Trifluoressigsäure/Essig ester (1:1) auf, leitet während 1 Stunde bei 0 einen
Strom gasförmigen Bromwasserstoffs ein, dampft an schliessend ein und kristallisiert den Rückstand aus Methanol/Diäthyläther um. Man erhält H-Thr-Cys(Bzl) Val-Leu-OMe .1,3 HBr; Smp. 2020, [f] 20D = -100 in
Dimethylformamid.
c) H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OH
Man löst 372 g H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe
1,3 HBr in 1800 ml Methanol, fügt 900 ml 2n Natron lauge hinzu, lässt 1 Stunde bei 250 slehen, gibt 240 ml
Eisessig zu und lässt 2 Stunden bei 0 stehen. Man filtriert die ausgeschiedene kristalline Masse ab, wäscht zuerst mit la Essigsäure und anschliessend mit Wasser und trocknet bei 500 im Hochvakuum. Man erhält das H-Tbr-Cys-(Bzl)-Val-Leu-OH, Smp 219 , [a]20D - -53 in In Ammoniak.
Teilsequenz F2 tert-Butyloxycarbenyl-S-benzyl-L-cysteinyl
L-seryl-L-asparaginyl-L-leucyl-L-serin-hydrazid (BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu-ser-NH-NH2) a) H-Asn-Len-Ser-OMe. HCl
Man löst 43 g H-Leu-Ser-OMe HCl und 53 g BOC-Asn-ONP in 400 ml Dimethylformamid auf, gibt 22 ml Triäthylamin zu, lässt 16 Stunden bei 255 stehen, dampft zur Trockne ein und kristallisiert den Rückstand aus Methanol um. Man erhält 51,6 g BOC-Asn-Leu Ser-OMe, Smp 190 , [a]20D- -24 in Dimcthylformamid, das man in 500 ml einer 4n-Lösung von Salzsäure in Methanol löst. Man lässt 1 Stunde bei 250 stehen, dampft zur Trockne ein, löst den Rückstand in Methanol und fällt mit Diäthyläther. Man erhält H-Asn-Leu-Ser-OMe.HCl; Smp. 180 , [a]20D= -23 in Dimethylformamid.
b) H-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe.HCl
Man löst 39,5 g BOC-Ser-NHNHo in 500 ml Dimethylformamid, kühlt auf -200. gibt 200 ml einer 2n-Lösung von Salzsäure in Dioxan und anschliessend 20 ml tert.-Butylnitrit zu. Nach 10 Minuten bei-20 werden 40 ml Triäthylamin und 38,0 g H-Asn-Leu Ser-OMe-HCl hinzugefügt, danach 16 Stunden bei 0 gerührt, zur Trockne eingedampft und der Rückstand aus Chloroform/Diäthyläther umkristallisiert. Man erhält BOC-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe, Smp. 135 , [a]20D = -22 in Dimethylformamid das man in 420 ml einer 4n Salzsäurelösung in Methanol löst. Man lässt 1 Stunde bei 250 stehen, dampft zur Trockne ein und kristallisiert aus Methanol/Essigsäureäthylester um.
Man erhält H-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe. HCI, Smp. 1550 (Zers.), [all D0 = -15 in Dimethylformamid.
c) BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Len-Sen-NHNH2
Man löst 18,5 g H-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe HCl und
18,0 g BOC-Cys(Bzl)-ONP in 100 ml Dimethylformamid auf, gibt 10 ml Wasser, 3,5 ml Essigsäure und
5,6 ml Triäthylamin zu, lässt 16 Stunden bei 250 stehen, dampft zur Trockne ein und kristallisiert aus Methanol um. Man erhält 25,1 g BOC-Cys(Bzl)-Ser
Asn-Leu-Ser-OMe, Smp. 1820, [a]20D = -17 in Di methylformamid, das man unter leichtem Erwärmen in
200 ml Dimethylformamid löst. Man gibt 200 ml
Methanol und 20 ml Hydrazinhydrat zu, lässt 16 Stun den bei 300 stehen, fällt mit Diäthyläther, wäscht den Niederschlag mit Diäthyläther/Methanol (1:1) und trocknet das so erhaltene BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu Ser-NHNH.2, Smp. 2240, [ei = -13 in Dimethylformamid.
Teilsequenz F
Pivaloyl-L-hemicystinyl-L-seryl-L-asparaginyl
L-leucyl-L-seryl-L-threonyl-L-hemicystinyl
L-valyl-L-leucin
EMI6.1
<tb> (piv-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Len-OH)
<tb>
Man löst 18,4 g BOC-Cvs(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser- NHNH2 (Teilsequenz F2) in 150 ml Dimethylformamid, kühlt auf -200, gibt 40 ml einer 2n-Lösung von Salzsäure in Dioxan und 15 ml tert.-Butylnitrit zu. Nach 10 Minuten bei -20 gibt man noch 28 ml Triäthylamin und 16,2 g H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-Oh (Teilsequenz F1) zu und rührt 16 Stunden bei 250. Danach wird filtriert' die Lösung eingedampft und der Rückstand mit in Essigsäure durchgewaschen. Man erhält
BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Seu-Thr-Cys(Bzl)
Val-Leu-OH, Smp. 2170, [a]20D = -27 in Dimethylformamid.
Man löst das erhaltene Produkt in 5000 ml getrocknetem Ammoniak, gibt unter Rühren und Sieden des Ammoniaks Natriummetall bis zur tiefblauen Färbung zu. Zwecks Entfärbung wird Ammoniumchlorid hinzugefügt. Man dampft zur Trockne ein und wäscht den Rückstand mit ln Essigsäure und Aceton durch.
Nach dem Trocknen erhält man BOC-Cys-Ser-Asn-Leu Ser-Thr-Cys-Val-Leu-OH, Smp. 2480 (Zers.), [a]20D - -41 in Dimethylformamid/Wasser (3 :1).
Man löst das so erhaltene Nonapeptid in 5000 ml 0,01n Ammoniak auf, gibt unter Rühren in Wasser stoffperoxyd bis zur negativen Nitroprussiatreaktion zu, dann noch 200 ml Eisessig, filtriert und lyophilisiert.
EMI7.1
<tb>
Man <SEP> erhält <SEP> BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr <SEP> Ser-Thr-Cys-Val Leu-OH, Smp. 2380 (Zers.), [a]20D = -180 in Dimethylformamid/Wasser (7: 3), das man in 300 ml Trifluoressigsäure löst, lässt 30 Minuten bei 250 stehen, dampft ab, wäscht den Rückstand mit Essigester und löst ihn in 300 ml Dimethylformamid auf. Zu dieser Lösung gibt man 30 g Pivalinsäure-p-nitrophenylester - der wie nachstehend beschrieben hergestellt ist - sowie 14 ml Triäthylamin, lässt 16 Stunden bei 250 stehen, dampft ab und wäscht den Rückstand mit Chloroform. Man löst in 300 ml Dimethylformamid, gibt 50 ml Wasser und 50 g DOWEX-50 hinzu, riihrt 15 Minuten, abfiltriert, wäscht das Harz mit Dimethylformamid und dampft das Filtrat zur Trockne ein.
Man wäscht den Rückstand zuerst mit Chloroform, anschliessend mit Essigester und trocknet. Man erhält das
EMI7.2
<tb> Piv-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-OH,
<tb> Smp. 243 ,[a]20D= -17 in Dimethylformamid/Wasse (3:1),
Pivalins äure-p-nitrophenylester
Man löst 95 g Pivalinsäure und 131 g p-Nitro phenyl in 1000 ml Essigester, gibt 197 g Dicyclohexyl carbodiimid zu, rührt 2 Stunden bei 250, filtriert, dampf das Filtrat ein und kristallisiert den Rückstand auq einem Gemisch von Essigester-Petroläther um. Mar erhält Pivalinsäure-p-nitrophenylester, Smp. 1040.
Teilsequenz ABC N'm-Trityl-L-histidyI-l-arginyl-Gphenyl alanyl-
L-seryl-glycyl-L-norleucyl-glycyl-L-phenylalanyl glycyl-L-prolyl-L-glutamyl-L-threonyl
L-prolinamid Triacetat (H-His(Trt)-Arg-Phe-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly Pro-Glu-Thr-Pro-NH2- 3 CHsC02H) a) L-Seryl-glycyl-L-norleucyl-glycyl-L-phenylalanyl glycyl-L-proly-L-glutamyl-L-threonyl-L-prolin amid Tetrahydrochlorid (H-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr
Pro-NH2.4 HCl)
Man löst 6,7 g Z-Ser-Gly-Nle-Gly-OH (Teilsequenz B), 12 g H-Phe-Gly-Pro-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2 (Teilsequenz A) und 2,1 g Hydroxysuccinimid in 50 ml Di methylformamid und 20 ml Acetonitril auf, kühlt auf 0 gibt 4,0 g Dicyclohexylcarbodiimid hinzu und läss 16 Stunden bei 0 stehen. Man dampft das Lösung.
mittel ab, wäscht den Rückstand mit Wasser, Diäthyl äther und Essigester und kristallisiert aus Chloroform um. Man erhält Z-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu- (OTB)-Thr-Pro-NH.-., Smp. 125-138 (Zers.), [ul 20D -44 in Dimethylformamid, das man in 250 ml einer Lösung von 8n Chlorwasserstoff in Dioxan löst und bei Normaldruck in Gegenwart von Palladium-Katalysator bis zum Ende der Wasserstoffaufnahme hydriert. Man filtriert, dampft zur Trockene ein und verarbeitet den Rückstand in Diäthyläther. Man erhält H-Ser-Gly-Nle- Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NHa 4 HC1, Smp. 1300 (Zers.), [aj D0 --- -52 in Dimethylformamid.
b) Nim-Trityl-L-histidyl-L-arginyl-L-phenylalanyl
L-seryl-glycyl-L-norleucyl-glycyl-L-phenylalanyl glycyl-L-prolyl-L-glutamyl-L-threonyl-
L-prolinamid Triacetat (H-His(Trt)-Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly
Pro-Glu-Thr-Pro-NH2.3CH3CO2H)
Man löst 9,9 g Trt-His(Trt)-Arg-Phe-NHNH2. HCl (Teilsequenz C) in 100 ml Dimethylformamid, kühlt auf -200, gibt 15 ml Dioxan/HCl 2n und anschliessend 1,16 ml tert.-Butylnitrit zu, rührt 10 Minuten bei -200, gibt 28 ml Triäthylamin und 10,0 g H-Ser-Gly-Nle-Gly Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2.HCl zu, riührt 4 Stunden bei 00, filtriert und dampft zur Trockne ein.
Man löst den Rückstand in einem Gemisch von Essigester/ Methanol (8 : 2) auf, wäscht mit verdünntem Ammoniak und anschliessend mit Wasser bis zur Neutralität, trocknet über Natriumsulfat, konzentriert auf 100 ml und fällt durch Zugabe von Diäthyläther. Man löst den Niederschlag wiederum in Dimethylformamid auf und fällt durch Zugabe von Diäthyläther. Man erhält
Trt-HIs(Trt)Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly Pro-Glu-Thr-Pro-NHg [Smp. 168 (Zers.),[a]20D= -43 in Dimethylformamid], das man in 500 ml essigsäure/Wasser (8:2) löst Man lässt 3 Stunden bei 400 stehen, dampft ein, wäscht den Rückstand in Diäthyläther und trocknet im Hochvakuum über KOH-Spänen. Man erhält
H-His(Trt)-Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly
Pro-Glu-Thr-Pro-NH2.3CH3COOH, Smp. 1800 (Zers., [all D0 = 610 in Essigsäure.
Teilsequenz DE
N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl
L-tyrosyl-L-tryptophanyl-L-arginyl-L-asparaginyl
L-leucyl-L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenyl alanin. hydrazid. diacetat (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn
Phe-NHNH2.2 CH3COOH) a) l-(N-tert. -Butyloxycarbonyl-L-seryl-Lalanyl-
L-tyrosyl-L-tryptophanyl-L-arginyl-L-asparaginyl L-leucyl-L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenyl- alanin)-2-benzyloxycarbonyl-hydrazid diacetat (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn
Phe-NH-NH-Z 2 CH3COOH)
Man kühlt 320 ml Dimethylformamid auf 200 C, gibt 100 ml 2n Chlorwasserstoff in Dioxan zu und löst darin 68 g BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-NHNH2-Acetat (Teilsequenz E).
Anschliessend versetzt man mit 12 ml tert.-Butylnitrit, lässt 10 Minuten bei 200 rühren und tropft 35 ml Triäthylamin zu. Das so erhaltene Gemisch wird mit einer Lösung, entstanden aus 8,8 g H-Asn Leu-Asn-Asn-Phe-NHNH-Z Trifluoracetat (Teilsequenz D) und 17 ml Triäthylamin in 150 ml Dimethylformamid vereinigt. Nach 16 Stunden Stehenlassen bei 0 wird eingedampft. Man löst den Rückstand in Essig ester/Butanol und wäscht mit verdünnter Essigsäure und Ammoniaklösung. Nach Eindampfen des Lösungsmittels verbleibt das
BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Ain-Leu-Asn-Asn Phe-NHNH-Z .2 2 CH:,COOH vom Smp. 175, [a] 20D = -19,50 in Dimethylformamid.
b) tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L alanyl-L-tyrosyl
L-tryptophanyl-L-arginyl-L-asparaginyl-L-lcucyl
L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenylalanin.
Hydrazid Diacetat (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-asn Phe-NHNHa 2 CHlCOOH)
Man löst 90 g BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu Asn-Asn-Phe-NHNH-Z.2CH3COOH in 500 ml Dimethylformamid und hydriert mit 10 g Pd/C (10%ig) bis zum Ende der Wasserstoffaufnahme. Nach Abfiltrieren des Katalysators wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand aus einem Gemisch von Ather und Äthanol kristallisiert. Man erhält
BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Leu-Asn-Asn Phe-NHNHa 2 CHsCOOH vom Smp. 2650, [a]2rB0 = -57 in Dimethylformamid.
Teilsequenz ABCDE L-Seryl-L-alanyl-L-tyrosyl-L-tryptoph anyl-
L-arginyl-L-asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl
L-asp[araginyl-L-phenylalanyl-L-histidyl
L-arginyl-L-phenylalanyl-L-seryl-glycyl
L-norleucyl-glycyl-L-phenylalanyl-glycyl
L-prolyl-L-glutamyl-L-threonyl-L-prolinamid,
Hexa-trifluoracetat (H-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn
Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly
Pro-Glu-Thr-Pro-NH5 6 CFsCOoH)
Man löst 15,2 g
BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Len-Asn-Asn
Phe-NHNH2.Diactat (Teilsequenzen D, E) in 200 ml Dimethylformamid, kühlt auf -200, gibt 15 ml Dioxan/HCl 2n und anschliessend 1,16 ml tert.-Butylnitrit zu und rührt 10 Minuten bei -200. Man gibt 14 ml Triäthylamin und eine Lösung von 18,6 g des in Teilsequenz A, B, C erhaltenen Tridecapeptidacetats zu,
rührt das erhaltene Gemisch 16 Stunden bei 00, filtriert und dampft zur Trockne ein. Man wäscht den Rückstand mit Diäthyl äther und mit Chloroform, löst in Dioxan/Wasser (8 : 2), behandelt die erhaltene Lösung mit 100 ml Amberlit IRA-410 (Acetat-Form), dampft ein und kristallisiert den Rückstand aus Isopropanol/Wasser um. Man erhält das
BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Ser-Asn-Asn Phe-His (Trt) -Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-
Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH acetat, Smp. 1450 (Zers.), [a} 0 = -670 in Essigsäure, das man unter Stickstoffatmosphäre in 500 ml Trifluoressigsäure löst. Man lässt 1 Stunde bei 250 stehen, konzentriert auf 100 ml und fällt durch Zugabe von 1000 ml Di äthyläther. Man filtriert, löst den Rückstand in Dimethylformamid und fällt mit Diäthyläther.
Nach Trocknen über KOH-Spänen erhält man das H-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-
Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-gly-Phe-Gly Pro-Glu-Thr-Pro-NH2.6CF3CO@H, Smp. 1300 (Zers.), [a] r) = -450 in Essigsäure.
Beispiet Pivaloyl-L-Hemicystinyl-L-seryl-L-asparaginyl L-leucyl-L-seryl-L-threonyl-L-hemicystinyl L-valyl-L-leucyl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl L-tryptophanyl-L-arginyl-L-asparaginyl-L-leucyl L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenyulalanyl L-histidyl-L-arginyl-L-phenylalanyl-Lserylglycyl-L-norleucyl-glycyl-L-phenylalanylglycyl-L-prolyl-L-glutamyl-L-threonyl L-prolinamid Hexaacetat.Octahydrat
EMI8.1
<tb> (Piv-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu
Ser-Ala-Tyr-Trp-Arp-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe
His-Arg-Phc-Ser-Gly-Nle-gly-Phe-Gly-Pro-Glu
Thr-Pro-NH3.Hcxaacctat. Octahydral)
Man löst 1,0 g Nonapeptid (Teilsequenz F) in 10 ml Dimethylformamid, gibt 1,5 g N-Hydroxysuccinimid und 0,52 g Dicyclohexylcarbodiimid zu, rührt 6 Stunden bei 255, filtriert und dampft das Filtrat zur Trockne ein.
Man wäscht den Rückstand mit Essigester und Diäthyl äther und trocknet. Man erhält
EMI8.2
<tb> Piv-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val.-Leu-OSu, <SEP>
<tb> Smp. 2420, das man in 10 ml Dimethylformamid löst.
Zu dieser Lösung gibt man 3,1 g Tricosapeptid-Hexa Trifluoracetat (Teilsequenz A, B, C, D, E), 0,4 ml Tri äthylamin sowie 1,2 g N-Hydroxysuccinimid und rührt 16 Stunden bei 250. Man dampft zur Trockne ein, wäscht den Rückstand mit Diäthyläther, Chloroform und Aceton. So erhält man das rohe, geschützte Dotria contapeptid, das man in 100 ml 0,3n Essigsäure löst, mit 20 ml Amberlit-IRA-410 (Acetat) behandelt und gibt 50 ml 0,6n Ammoniumhydroxid hinzu. Man stellt das pH auf 6,5 ein und schichtet die erhaltene Lösung auf eine Carboxymethylcellulosesäule (10 X 100 cm), die mit einer 0,15n-Ammoniumacetatpufferlösung equilibriert wurde. Die Elution wird mit einem steigenden Konzentrations- und pH-Gradient (0,1 5n auf 0,4n; pH 6,5 auf pH 7,0) eines Ammoniumacetatpuffers durchgeführt.
Die vereinigten Fraktionen die das reine Peptid erhalten, werden dreimal gefriergetrocknet, der Rückstand wird mit Äthanol und anschliessend mit Di äthyläther gewaschen und über Kaliumhydroxid im Hochvakuum getrocknet. Man erhält
EMI8.3
<tb> Piv-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Ser Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-
His-Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro
Glu-Thr-Pro-NII2.6 CH3CO2H.8 H2O.
Smp. 2160 (Zers.), [a]20D = -560 in Essigsäure in.
Aminosäurezusammensetzung nach Säurehydrolyse (6n, 16 Std.) : Ala1,1, Arg2,0, Asn3,9, Cys/21,6, Glu1,2, Gly3,0, His1,1, Leu2,9, Nle1,0, Phe3,0, Pro2,1, Serd,8, Thr1,9, Tyr1,0, Val0,, (Trp 1,0 durch Spektrophotometrie).