Verfahren zur Herstellung bisher unbekannter Polypeptidderivate
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung bisher unbekannter Polypeptidderivate der allgemeinen Formel
EMI1.1
10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg.
22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32
Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH: worin R für eine Alkyl-, Alkenyl-. ggf. substituierte Aralkyl- oder eine gf. substituierte Arylgruppe steht.
ihrer therapeutisch wirksamen Säureadditionssalze und Schwermetallkomplexe. Als R kommen beispielsweise der Äthyl-, Allyl-, Phenyl-, p-Nitrophenyl-, p-Chlorphe nyl-, p-Bromphenyl-. p-Methoxyphenyl-, Azobenzoloder der p-Methoxy-Azobenzolrest in Frage.
Die erfindungsgemässen Polypeptidderivate zeichnen sich durch Beständigkeit gegenüber der abbauenden Wirkung von Aminopeptidasen aus.
Die bisher unbekannten Polypeptidderivate können nach für die Synthese von Verbindungen dieser Art allgemein bekannten Methoden hergestellt werden, wobei die Aminosäuren in der in der obigen Formel festgelegten Reihenfolge einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten miteinander verknüpft werden, indem man entsprechende zu ihrem Aufbau nötige Verbindungen unter Bildung von CONH-Bindungen in beliebiger zeitlicher Reihenfolge miteinander kondensiert.
wobei nicht an der Reaktion teilnehmende freie funktionelle Gruppen intermediär durch geeignete Schutzgruppen geschützt werden, zu einem beliebigen Zeitpunkt
0 der Synthese unter Beibehaltung der R-CH..-O-C-Gmp- pe in Stellung 1. worin R obige Bedeutung hat, die Schutzgruppen abspaltet, die Mercaptogruppen nach Bildung der Teilsequenz 1 bis 7 und vor Einbau der eine Methionylgruppe enthaltenden Teilsequenz zum Disulfid oxydiert und die Carboxylgruppe des terminalen Prolylrestes in die Amidgruppe überführt. Die Einführung der im Endprodukt am endständigen L-Hemicystin-Molekül gewünschten Gruppe der allgemeinen Formel
EMI1.2
worin R obige Bedeutung hat, kann in einer beliebigen Stufe vor der letzten Stufe erfolgen.
In der letzten Stufe sind jedoch Methoden zu verwenden, bei denen Racemisierung nicht auftritt oder gering gehalten werden kann. vorzugsweise die Azidoder die aktivierte Ester-Methode. wobei zur Aktivierung vorzugsweise N-Hyd roxysuccinimid Verwendung findet. Üblicherweise werden die beim Aufbau von Cystein-haltigen Peptiden zum Schutz der SH-Gruppen verwendeten Benzylreste am Ende der Synthese durch Behandlung mit Natrium in flüssigem Ammoniak abgespalten.
Es wurde nun gefunden. dass die Abspaltung der Benzylschutzgruppen und die Herstellung der (Cys)S S(Cys)-Bindung vor der letzten Stufe zu besonders guten Ausbeuten an Endprodukt führt.
Beim Aufbau der neuen Polypeptidderivate hat sich für die Blockierung der #-Carboxygruppe, beispielsweise in der nachstehend beschriebenen Teilsequenz A, die tert.Butyloxy(Truppe bewährt, doch können auch andere Schutzgruppen. wie die Methoxy-. die Äthoxy-, die tert. Amyloxy-, die Amid- oder die Benzylgruppe verwendet werden.
Für die Blockierune der Imidazolgruppe des Histidinrestes in der nachstehend beschriebenen Teilsequenz C hat sich die Triphenylmethylgruppe bewährt, doch können auch andere geeignete Schutzgruppen, wie die Carbo-tert.butoxy-. die Carbo-tert.amyloxy-. die Carbobenzoxy- oder die Benzylgrtippe venvendet werden.
Für die Blockierung der Guanidoamppe des Argininrestes in der nachstehend beschriebenen Teilsequenz E wurde die Nitro-Gruppe verwendet. doch können auch andere geeignete Schutzgruppen. wie die Tosylgruppe, die p-Nitrrbenzoxycaron-lgruppe oder die 2-(Isopro- pyloxycarbonyl)-3.4.5.6-tetrachlorbenzoylgruppe verwendet werden. Man kann auch den Schutzeffekt der Pro tonisierung der Guanidogruppe bei der Synthese verwenden.
Die neuen Polypeptidderivate lassen sich auch in Form ihrer Salze gewinnen bzw. verwenden. Als Salze kommen solche mit organischen Säuren. wie Essigsäure, Propionsäure, Glykolsäure. Milchsäure. Brenztraubensäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure. Fumarsäure, Weinsäure. Zitronensäure, Benzoesäure. Zimtsäure, Salicylsäure, 2-Phenoxv- oder 2-Acetoxybenzoe- säure, Mandelsäure, Methansulfonsäure. Äthansulfonsäure, Hydroxyäthansulfonsäure, Benzol- oder Toluolsulfonsäure, Naphthalinsulfonsäure, Sulfanilsäure sowie polymere Säuren wie Gerbsäure. Alginsäure. Polvgalacturonsäure, Polyphloretinphosphat oder Carbo'cymethyl- cellulose und Salze mit anorganischen Säuren. wie Ha logenwasserstoffsäure. z.B.
Salzsäure oder Bromwasserstoffsäure, Salpetersäure, Thiocyansäure, Schwefelsäure und Phosphorsäure in Frage. Als Schwermetallkomplexe kommen zB. diejenigen vom Zink in Frage.
Die Ausgangsprodukte zur Herstellung der neuen Polypeptidderivate können, sofern sie bisher nicht bekannt waren, nach den für die Peptidchemie bekannten Methoden erhalten werden, wobei die Aminosäuren einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten miteinander verknüpft werden.
Die neuen Verbindungen stellen ein wichtiges therapeutisches Prinzip dar, dass den Calciumplasmaspiegel, insbesondere den erhöhten Calciumplasmaspiegel senkt und als Antagonist des Parathormons eine positive Calciumbilanz im Knochen bewirkt.
Es ist somit indiziert bei allen Zuständen, bei welchen eine Senkung des Plasmacalciumspiegels erwünscht ist, z.B. Hypercalcämien verschiedener Genese. .Mangel des endogenen Thyreocalcitonins infolge Ausfalls von Schildd rüsengewebe, Hyperfunktion der Nebenschilddrüsen.
Die neuen Verbindungen sind indiziert bei allen Knochenaffektionen, die auf einem vermehrten Abbau beruhen oder bei welchen eine vermehrte Calciumfixation im Knochen erwünscht ist, z.B. Osteoporose verschiedener Genese (z.B. postklimakterisch, posttraumatisch, bedingt durch Corticosteroidtherapie oder Inaktivität usw.), Frakturen, Osteomalacie, Rachitis sowie insbesondere zur Kombinationstherapie mit Calcium bzw.
Phosphat.
Die biologische Prüfung der neuen Verbindungen ergab eine Wirksamkeit von ca. 100 bis 450 MRC-Einheiten/mg Peptid. Die erforderliche Tagesdosis (i.m.
verabreicht) in MRC-Einheiten beträgt 20 mE bis 10 E, vorzugsweise 100 mE/kg Tiergewicht.
Beim Menschen beträgt die tägliche Dosis (i.m. verabreicht) in MRC-Einheiten 1 bis 500 E. Vorzugsweise wird eine tägliche Dosis von 5 E i.m. verabreicht.
Die neuen Verbindungen können als Heilmittel. z.B.
in Form pharmazeutischer Präparate, Verwendung finden. Diese enthalten die genannten Verbindungen in Mischung mit einem für die parenterale Applikation geeigneten organischen oder anorganischen Trägermaterial.
Für dasselbe kommen solche Stoffc in Frage. die mit der neuen Verbindung nicht reagieren, wie z.B. Gelatine.
Milchzucker, Stärke, Magnesiumstearat, Talk, pflanzliche Öle, Benzylalkohole, Gummi arabicum, Polyalky- lenglykole, Vaseline, Cholesterin oder andere bekannte Arzneimittelträger.
Die pharmazeutischen Präparate können z.B. in flüssiger Form als Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen vorliegen. Gegebenenfalls sind sie sterilisiert und bzw. oder enthalten Hilfsstoffe, wie Konservierunps-.
Stabilisierungs., Netzmittel oder Emulgiermittel. Sie können auch noch andere, therapeutische wertvolle Stoffe enthalten. Die neuen Verbindungen können auch in Form von Depotpräparaten verabreicht werden,
Die neuen Verbindungen und ihre Salze können auch als Zwischenprodukt zur Herstellung von pharmazeutischen Präparaten Verwendung finden.
Es werden folgende Abkürzungen verwendet:
Z = Carbobenzoxy
Bzl = Benzyl
EOC = Äthoxycarbonyl
BOC = tert.Butyloxycarbonyl
Trt = Trityl = Triphenylmethyl
OTB = tert.Butyloxy
ONP = p-Nitrophenylester
OCP = 2,4,5-Trichlorphenoxy
OSu = Oxysuccinimid
OMe = Methoxy
OEt = Äthoxy NO. = Nitro
Ser = L-Seryl
Asn = L-Asparaginyl
Leu = L-Leucyl
Thr = L-Threonyl
Val = L-Valyl
Ala = L-Alanyl
Tyr = L-Tyrosyl
Trp = L-Tryptophanyl
Arg = L-Arginyl
Phe = L-Phenylalanyl
Glu = L-Glutamyl
His = L-Histidyl
Pro = L-Prolyl
Gly = Glycyl
Met = L-Methionyl
Cys = L-Cysteinyl
In den folgenden Beispielen, die die Ausführung des Verfahrens erläutern, den Umfang der Erfindung aber in keiner Weise einschränken sollen, erfolgen alle Temperaturangaben in Celsiusgraden.
Teilsequenz A L-Phenylalanyl-glycyl-L-prolyl-γ-tert.butyloxy-L- -glutamyl-L-threonyl-L-prolinamid [H-Phe-Gly-Pro-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH.]
Man löst bei -5 134 g Z-Thr-NH-NH. in 2 Liter IN Salzsäure und versetzt mit 0.55 Liter IN Natriumnitrit. Nach 5 Minuten wird Kaliumcarbonat bis pH 9 zugegeben. das entstandene Azid mit Äthylacetat extrahiert und eine Lösung von 80 g H-Pro-NH. . hydrochlo- rid in 100 ml Wasser. 500 ml Dimethylformamid und 77 ml Triäthylamin hinzugefügt. Man verdampft das Äthylacetat bei 20 im Vakuum und lässt über Nacht bei 250 stehen.
Die restliche Lösung wird im Vakuum verdampft. der Rückstand in Äthylacetat gelöst. die Lösung mit Wasser. verdünnter Salzsäure und einer wässrigen Kalciumcarbonatlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet Man verdampft im Vakuum.
löst in warmem Äthylacetat und kühlt ab. Man erhält Z-Thr-Pro-NH2: Smp. 148 [α]D20= - 72 in 95% Essigsäure. Man löst hierauf 90 g Z-Thr-Pro-NH2 in 2 Liter Dioxan und 260ml 1N Salzsäure und hydriert bei 200 und Normaldruck in Gegenwart eines Palladiumkatalysators. Man abfiltriert, verdampft die Lösung im Vakuum. wäscht den Rückstand mit Äthylacetat und erhält H-Thr-Pro-NH: HCI; Smp. 2160, [z]D20= - 640 in 95% Essigsäure. Dieses wird in 500 ml Dimethylformamid. 50 ml Wasser und 32 ml Triäthylamin gelöst und 118g Z-Glu(OTB)-OCP und 800 mol Tetrahydrofuran zugegeben.
Man lässt über Nacht bei 200 stehen, verdampft im Vakuum und kristallisiert den Rückstand mit Ätbyläther. Man erhält Z-Glu(OTB) Thr-Pro-NH2, Smp. 65 (Zers.). [α]D20= - 18 in Dimethylformamid.
Man löst 80 e ZGlu(OTB)-Thr-Pro-N'H. in 1.5 Liter Dioxan und 200 ml Wasser und hydriert bei 20 und Normaldruck in Gegenwart eines Palladiumkatalysators.
Die Lösung wird filtriert und im Vakuum verdampft und der Rückstand mit Diäthyläther versetzt. wobei H Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2 erhalten wird; Smp. 650 (Zers.).
[α]D20= - 28 in Dimethylformamid.
Dieses wird in 700 ml Dimethylformamid bei 0 gelöst. 200 ml Acetonitril. 68 g Z-Phe-Gly-Pro-OH. 18 g N-Hydroxysuccinimid und 32 g Dicyclohexylcarbodiimid hinzugefügt, über Nacht bei 200 stehengelassen. filtriert, im Vakuum eingedampft und mit Äthylacetat versetzt.
Danach wäscht man die Lösung mit Wasser. verdünnter Salzsäure und wässriger Kaliumcarbonatlösung, trocknet über Natriumsulfat. verdampft im Vakuum und kristallisiert den Rückstand aus Äthylacetat/Äthyläther. Man erhält Z-Phe-Gly-Pro-Glu(OTB)-Thr Pro-NH2 Smp. 120 (Zers.), [α]D20 = -66 in Dimethylformamid. das man in 1500 ml Dioxan und 300 ml Wasser löst. Nian gibt 30 g Palladiumkohle (10%) zu und hydriert bis zum Ende der Wasserstoffaufnahme. Man filtriert. dampft das Filtrat ein und kristallisiert den Rückstand aus Dioxan. Man erhält das H-Phe-Gly-Prn-Glu(OTB)-Thr- Pro-NH2; Smp. 1535. [z.]" " = -79 in Dimethylformamid.
Teilsequenz B
N-tert. Butyloxycurbonyl-L-seryl-glycyl-L-methionyl -glycin (BOC-Ser-Gly-Met-Gly-OH) a) L-Methionyl-glycin-äthylester-hydrochlorid (H-Met-Gly-OEt. HCl)
Man löst 65 g BOC-Met-OH in 900 ml Chloroform.
kühlt auf -10 . gibt 30 ml N-Methylmorpholin und 35,6 g Chlorameisensäureisobutylester zu. Nach 10 Minuten fügt man langsam eine Lösung von 30g Glycin äthylester in 200 ml Chloroform hinzu und lässt bei 200 eine Stunde reagieren. Man extrahiert mit 0,5N Ammoniumhydroxid. dann mit 0,2N Schwefelsäure. wäscht mit Wasser neutral, trocknet über Natriumsulfat und engt ein. Nach Umkristallisieren aus Petroläther erhält man BOC-Met-Glv-OEt; Smp. 490, [α]D20 = - 190 in Äthanol. Man löst es in 750 ml 4N HCl/Äthanol, lässt I Std. bei 250 stehen. dampft ein, wäscht den Rückstand mit Diäthyläther und trocknet bis zur Gewichtskonstanz.
Man erhält das H-Met-Gly-OEt HCI in Form eines öles.
b) N-tert.Butyloxycarbonyl-L-seryl-glycin-äthylester (BOC-Ser-Gly-OEt)
Man löst 12,5 g N-tert.Butyloxycarbonyl-serin in 100 ml Chloroform und gibt 6.1 g N-Methylmorpholin dazu: danach tropft man 8,2 g Chlorameisensäureisobutylester hinzu. Nach 10 Minuten wird eine Lösung von 6,6 g Glycin-äthylester in 50ml Chloroform hinzugefügt und 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wird mit verdünntem Ammoniak. dann mit Salzsäurelösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und die organische Phase abgedampft. Man erhält BOC-Ser-Gly-OEt als Öl; [α]D20 = 30 in Dimethylformamid.
C) N-tert.Butyloxycarbonyl-L-seryl-glycin-hydrazid (BOC-Ser-Gly-NHNH2)
Man löst 19,4 g BOC-Ser-Glv-OEt in 270 mol Äthylalkohol, gibt 48.6 ml Hydrazinhydrat hinzu und lässt 2 Tage bei Raumtemperatur stehen. Anschliessend dampft man die Lösung ab und kristallisiert den Rückstand aus einem Methylalkohol/Äthyläther-Gemisch (1: 3). Man erhält BOC-Ser-Gly-NHNH2, Smp. 157 . [α]D20= -5 in Dimethylformamid.
d) N-tert.Butyloxycarbonyl-L-seryl-glycyl-L-methionyl -glycin äthylester (BOC-Ser-Gly-Met-Gly-OEt)
Zu 200 ml Dimethylformamid werden 25 ml einer 4N Chlorwasserstofflösung in Äthvläther gegeben und darin bei - 100 11 g BOC-Ser-Gly-NHNH.. gelöst. Anschliessend tropft man bei - 100 5.4 ml tert.Butylnitrit hinzu, fügt der Lösung zuerst 18 ml Triäthylamin und dann eine Lösung von 12g H-Met-Gly-OEt HCI in 100 ml Dimethylformamid und 6,2 ml Triäthylamin bei.
Es wird 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. nach 12 Stunden filtriert und eingedampft. Den Rückstand löst man in Chloroform, wäscht nacheinander mit verdünnter Ammoniak- und Salzsäurelösung. trocknet über Natriumsulfat und dampft ein. Man erhält BOC-Ser-Gly Met-Gly-OEt. [α]D20 = = 14 in Dimethylformamid.
e) tert.Butyloxycarbonyl-L-seryl-glycyl-L-methionyl -glycin (BOC-Ser-Gly-Met-Gly-OH)
Man löst 24 g BOC-Ser-Gly-Met-Gly-OEt in 250 ml Dioxan, gibt 75 ml IN Natronlauge zu, rührt 1 Stunde bei 250. behandelt mit 150 ml Dowex-50 (H--Form), filtriert, dampft das Filtrat ein und kristallisiert den Rückstand aus Essigester/ Diäthyläther. Man erhält
BOC-Ser-Gly-Met-Gly-OH, Smp. 87 (Zers.). [α]D20 = - 170 in Dimethylformamid.
Teilsequenz C
Na'Nimid. Ditrityl-L-histidyl-L-arginyl-L-phenylalanin hydrazid # HCl[(Trt)-His(Trt)-Arg-Phe-NH-NH2 # HCl] a) Z-Arg(NO2)-Phe-OMe
51,8g H-Phe-OMe HC1 werden in 1 Liter Äther und ca. 50ml Eiswasser gelöst und unter Rühren und Kühlen genügend Natriumcarbonat zugegeben. bis alles Wasser abgebunden ist. Man filtriert und dampft das Filtrat bis zur Gewichtskonstanz ein, wobei ein farbloses Öl erhalten wird.
67,6 g Z-Arg(NO2)-OH werden in 300 ml Acetonitril und 150 ml Dimethylformamid gelöst und mit 41,2 g H-Phe-OMe versetzt. Danach wird auf 200 abgekühlt und eine Lösung von 43,4 g Dicyclohexylcarbodiimid in 100 ml Acetonitril zugegeben. Das Ganze lässt man unter zeitweiligem Umschütteln während 4 Stunden im Eiskasten stehen. Der entstandene Niederschlag wird abfiltriert und das Filtrat eingedampft. Der Eindampfrückstand wird in 1 Liter Essigester gelöst und hierauf in der Kälte mit lN Natronlauge, Wasser, 1N Schwefelsäure, Wasser und gesättigter Kochsalzlösung gewaschen.
Die über Natriumsulfat getrocknete Essigsäureäthvlester- Phase wird vollständig eingedampft. Nach Umkristallisieren aus Essigester/Petroläther erhält man Z-Arg(NO2) Phe-OMe; Smp. 131-133 , [α]D20 = - 7 in Methanol, -4 in Dimethylformamid.
b) H-Arg(NO2)-Phe-OMe # 0.5H2O # HBr
20 g Z-Arg(N & )-Phe-OMe werden in 50 ml Eisessig gelöst und unter leichtem Kühlen 50 ml 40Stciae Bromwasserstoffsäure in Eisessig zugesetzt. Danach lässt man das Ganze unter zeitweiligem Umschütteln während 1 Stunde bei 200 stehen. Nach vollständigem Eindampfen wird der Rückstand in 200 ml Wasser gelöst und zweimal mit Äther gewaschen. Die wässrige Phase wird vollständig eingedampft und der Rückstand aus Methanol/ Äther umkristallisiert. Smp. 165- 1670 mit Zersetzung, [α]D20 = = 180 in Methanol. + 140 in Dimethylform- amid.
c) Z-His(Z)-Arg(NO2)-Phe-OMe
46.1 g H-Arg(NO2)-Phe-OMe # 0.5 H2O # 1.2 HBr werden in 100 ml Wasser gelöst, hierauf erwärmt und anschliessend abgekühlt. Nach Zugabe von Chloroform und Eis wird mit Ammoniak auf pH 9 gestellt. Die Chloroform phase wird noch einmal mit Wasser gewaschen, anschliessend über Natriumcarbonat getrocknet und filtriert. Dem Filtrat wird eine Lösung von 44,5 g Z-His(Z)-OH, 12,1 g Hydroxysuccinimid in 200 ml Acetonitril und 100 ml Pyridin zugesetzt, danach das Ganze auf - 200 abgekühlt und mit einer Lösung von 21,1 g Dicyclohexylcarbodiimid in 70 ml Acetonitril versetzt. Anschliessend wird unter zeitweiligem Rühren 4 Stunden im Eiskasten stehengelassen. Der entstandene Niederschlag wird abfiltriert und das Filtrat eingedampft.
Der Rückstand wird in Essigsäureäthylester aufaenom- men und anschliesend folgendermassen gewaschen: 10%ige Kaliumcarbonatlösung (pH#10), Wasser, gesättigte Kochsalzlösung. Wasser. gesättigte Kochsalzlösung.
Schwefelsäure (pH 3), Wasser, Kochsalzlösung. Die über Natriumsulfat getrocknete Essigsäureäthylester-Phase wird vollständig eingedampft, wobei ein hellbeiger Schaum erhalten wird. Dieser Schaum wird je zweimal in wenig Methanol gelöst und mit Äther gefällt. Die Ätherphasen werden abdekantiert und der Niederschlag getrocknet; man erhält Z-His(Z)-Arg(NO2)-Phe-OMe (amorpher Schaum), [α]D20 = -8 in Methanol, -8 in Dimethylformamid.
d) H-His-Arg-Phe-OMe 4 HCI
25 g Z-His(Z)-Arg(NO2)-Phe-OMe werden in 800 ml Eisessig gelöst. Danach werden 10 g 10% Palladium auf Aktivkohle in 200 ml 1N Salzsäure angerührt und in die Lösung gegeben. Das Ganze wird einer 2stündigen Hydrierung unterworfen und anschliessend der Katalysator abfiltriert. Das Filtrat wird erneut mit 5 g 10% Palladium auf Aktivkohle in Wasser versetzt und der Hydrierung unterworfen, die nach 51/2 Stunden beendet ist. Hierbei werden ca. 80% der theoretischen Menge Wasserstoff verbraucht. Der Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat vollständig eingedampft, wobei H-His Arg-Phe-OMe . 4 4 HCI in Form eines amorphen Schaumes erhalten wird.
e) Trt-His(Trt)-Arg-Plze-OMe . HCI
21,5 g H-His-Arg-Phe-OMe . 4 HCl weredn in 100 ml Pyridin und ca. 100 ml Dimethylformamid gelöst. Bei ca. + 50 wird bis pH 9 Triäthylamin zugegeben und anschliessend eine Lösung von 29 g Tritylchlorid in 300 ml Pyridin während 5 Minuten zugetropft. Nach Beendigung der Zugabe wird von Zeit zu Zeit das pH geprüft und nötigenfalls wieder mit Triäthylamin auf ca pH 9 gestellt. Das Ganze wird nach ungefähr 4 Stunden eingedampft, der Rückstand in Chloroform und Wasser aufgenommen und unter Zugabe von wenig lN Salzsäure auf pH 4 gestellt. Man trennt die Chloroformphase ab, wäscht sie zweimal mit Wasser, trocknet über Natriumsulfat und dampft vollständig ein.
Der Rückstand wird mit Äther versetzt und vom Äther anschliessend abfiltriert, wobei Trt-His(Trt)-Arg-Phe-OMe. HCl erhalten wird.
f) Trt-His(Trt)-Arg-Phe-NH-NH2 # HCl
17 g Trt-His(Trt)-Arg-Phe-OMe # HCl werden in 200 ml Methanol gelöst und mit 40 ml Hydrazinhydrat versetzt. Danach wird 2 Tage bei Zimmertemperatur stehengelassen. Man dampft ein. Iöst den Rückstand in Chloroform und wäscht zweimal mit Wasser. Die Chloroform Phase wird über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Hierauf wird der Rückstand mit Äther gewaschen und abfiltriert; er besteht aus Trt-His(Trt)-Arg Phe-NH-NH. @ HCI, Smp. 1580. [α]D18 = 90 in Di methylformamid.
Teilsequenz D
1-(H-Asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl-L-asparaginyl -L-phenylalanin)-2-benzyloxycarbonyl-hydrazin # Tri fluoracetat (H-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z # CF3COOH) a) I -(N-tert.Bl l tloxl carhonyl-L-/henw .Te(lanyl)-2-benzyl- oxycarbonyl-hydrazid (BOC-Phe-NH-NH-Z)
Man löst 72 g BOC-Phe-OH und 28 g N-Methyl.
morpholin in 500 ml Mithylenchlorid auf und tropft bei -5 26 ml Chlorameisensäuremethylester zu. Nach 10 Minuten gibt man noch 44 g Z-NHNH2 in 100 ml Methylenchlorid zu und rührt 4 Stunden bei Zimmertemperatur weiter. Nach Auswaschen mit verdünnter Phosphorigersäure wird getrocknet und eingedampft. Nach Kristallisieren aus Petroläther erhält man BOC-Phe-NH NH-Z vom Smp. 117 [α]D20 = -5 in Dimethylformamid.
b) I-(N-tert.Butyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phenyl alanin)-2-benzyloxycarbonyl-hydrazid (BOC-Asn-Phe-NH-NH-Z)
Man löst 41 g BOC-Phe-NHNH-Z in 400 ml Trifluoressigsäure und lässt eine Stunde bei 200 stehen.
Beim Verdampfen der Trifluoressigsäure erhält man das H-Phe-NHNH-Z als kristallines Trifluoracetat vom Smp. 1910, [α]D20 = +26,40 in Dimethylformamid.
Diese Substanz wird zusammen mit 35 g BOC-Asn-ONP und 30 g N-Methylmorpholin in 200 mol Dimethylformamid gelöst. Nach 16 Stunden Stehen bei 200 wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand nacheinander mit Essigester und verdünnter Phosphorigersäure gewaschen. Man erhält BOC-Asn-Phe-NH-NH-Z vom Smp. 210 , [ijD20 = - 180 in Dimethylformamid.
c) 1-(N-tert.Butyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L -asparaginyl-L-phenylalanin)-2-binzyloxycarbonyl -hydrazid (BOC-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z)
Man löst 26 g BOC-Asn-Phe-NH-NH-Z in 200 ml Trifluoressigsäure auf und lässt 1 Stunde bei 200 stehen.
Nach Verdampfen des Lösungsmittels versetzt man in 100 ml Dimethylformamid mit 17 g BOC-Asn-ONP und 15 g N-Methvlrnorpholin. Nach 16 Stunden bei 200 wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand nacheinander mit Essigester und verdünnter Phosphoriger- säure gewaschen. Man erhält BOC-Asn-Asn-Phe-NH NH-Z; Smp. 240 . [α]D20 = 280 in Dimethylformamid.
d) 1-(N-tert.Butyloxycarbonyl-L-leucyl-L-asparaginyl -L-asparaginyl-L-phenylalanin)-2-benzyloxycarbonyl -hydrazid (BOC-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z)
Man löst 22 o BOC-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z in 150 ml Trifluoressigsäure und lässt 1 Stunde bei 200 stehen.
Nach Verdampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand mit 12 g BOC-Leu-ONP und 10g N-Methylmorpholin in 100ml Dimethylformamid versetzt. Nach 16 Stunden Stehenlassen bei 200 wird das Dimethvlformamid verdampft und der Rückstand nacheinander mit Essigester und verdünnter Phosphon.gersäu re gewaschen.
Man erhält BOC-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z vom Smp.
210 , [α]D22 = -34 in Dimethylformamid.
e) 1-(N-tert.Butyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-leucyl-L -asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenylalanin)-2-benzyl oxycarbonyl-hydrazin (BOC-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z)
Man löst 57 g BOC-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z in 300 ml Trifluoressiosäure und lässt eine Stunde bei 200 stehen. Nach Verdampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand in Äther kristallisiert. Man löst das Tetra peptid-trifluoracc-tat in 400 ml Dimethylformamid und versetzt die Lösung mit 27 g BOC-Asn-ONP und 25 g N-Methylmorpholin. Nach 16 Stunden Stehenlassen bei 200 wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand nacheinander mit Essigester und verdünnter Phosphorigersäure gewaschen.
Man erhält BOC-Asn-Leu Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z vom Smp. 250 (Zers.), [α]D20 = -34 in Dimethylformamid.
f) 1-(L-Asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl-L -asparaginyl-L-phenylalanin)-2-benzyloxycarbonyl -hydrazid # trifluoracetat (H-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z # Trifluoracetat)
Man löst 43.5 g BOC-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH NH-Z in 200 ml Trifluoressigsäure und lässt eine Stunde bei 200 stehen. Nach Eindampfen wird der Rückstand mit Hilfe von Äther kristallisiert. Man erhält H-Asn Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z Trifluoracetat; Smp. 2420, [α]D20=-22 in Dimethylformamid.
Teilsequenz E tert.Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl -L-tryptophanyl-L-arginin-hydrazid (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-NHNH. cH3COOH) a) N-tert.Butyloxycarbonyl-L-tryptophanyl -(guanido)N-nitro-L-argininmethylester [BOC-Trp-Arg(NO2)-OMe]
Man löst 35 g H-Arg(NO2)-OMe # HCl, 63 g BOC Trp-OCP und 14g N-Methylmorpholin in 300ml Dimethylformamid auf und lässt 16 Stunden bei 200 stehen.
Nach Verdampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand in Essigester aufgenommen und mit verdünnter Schwefelsäure gewaschen. Man engt etwas ein und fällt mit Äther aus. Dabei kristallisiert BOC-Trp-Arg(NO2)- OMe vom Smp. 1300. [alpha;]D20 = -22 in Dimethylformamid.
b) N- tert.Butyloxycarhortvl-L-tyrosyl-L- -tryptophanyl-(guanido)N-nitro-argininmethylester [BOC-Tyr-Trp-Arg(NO2)-OMe]
Man löst 15 g BOC-Trp-Arg(NO2)-OMe in 80 ml 5N methanolischer Salzsäurelösung auf und lässt 1 Stunde bei Zimmertemperatur stehen. Nach Verdampfen des Lösungsmittels und Behandeln mit Äther verbleiben 13 g H-Trp-Arg(NO2)-OMe als Hydrochlorid zurück; Smp. 1200, [D?O = 90 in Dimethylformamid. Dieses Dipeptid wird zusammen mit 14g BOC-Tyr-OCP und 8 g N-Methylmorpholin in 200ml Dimethylformamid gelöst. Nach 16 Stunden Stehen bei 200 wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand in Essigester aufgenommen.
Nach Waschen mit verdünnter Phosphorigersäure und Einengen des Lösungsmittels kann man mit Hilfe von Äther BOC-Tyr-Trp-Arg(NO2)-OMe isolieren; Smp. 130 , [α]D20 = -11 in dimethylformamid.
c) tert.Butyloxycarbonyl-L-alanyl-L-tyrosyl-L -tryptophanyl-(guanido)N-nitro-L-argininmethylester [BOC-Ala-Tyr-Trp-Arg(NO2)-OMe]
Man löst 13,5 g BOC-Tyr-Trp-ArgtNO2)-OMe in 130ml 5N methanolischer Salzsäurelösung auf, lässt 1 Stunde bei 250 stehen, dampft zur Trockne ein, wäscht den Rückstand mit Dimethyläther, filtriert ab, löst in 100 ml Dimethylformamid auf und versetzt mit 8,0 g BOC-Ala-OCP und 3,0 ml Triäthylamin. Nach 16 Stunden bei 250 gibt man 500ml Essigester hinzu. wäscht mit verdünnter Schwefelsäure und Kaliumbicarbonatlösung und dampft zur Trockne ein. Nach Waschen des Rückstandes mit Chloroform erhält man BOC-Ala-Tvr- Trp-Arg(NO2)-OMe; Smp. 120 (Zers.),[α]D20 = -12 in Dimethylformamid.
d) tert.Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-L-tyroxyl-L -tryptophanyl-guanido)N-nitro-L-argininmethylester [BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg(NO2)-OMe]
Man löst 12,3 g BOC-Ala-Tvr-Trp-Arg(NO2)-OMe in 100ml 5N methanolischer Salzsäure, lässt 1 Stunde bei 250 stehen, dampft zur Trockene ein, wäscht den Rückstand mit Diäthyläther, löst ihn in 100ml Dimethylformamid, versetzt mit 14 ml Triäthylamin und 8,5 g BOC-Ser-N2, lässt 16 Stunden bei 0 stehen, gibt 500 ml Essigester zu, wäscht nacheinander mit verdünnter Schwefelsäure und Ammoniumhydroxid, trocknet über Natriumsulfat und dampft das Lösungsmittel ab. Nach Waschen des Rückstandes mit Chloroform löst man ihn in Essigester und fällt durch Zugabe von Diäthyl äther.
Man erhält 13,5 g BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg (NO2)-OMe; Smp. 1350 (Zers.), [α]D20 = - 150 in Dimethylformamid.
e) tert.Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-L -tyrosyl-L-tryptophanyl-L-arginin-hydrazi # diacetat (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-NHNH2 # 2 CH3COOH)
Man löst 13,2 g von dem oben erhaltenen Pentapeptidester in 300 ml Essigsäure, gibt 60 ml Wasser und 13,2 g Palladium-Kohle (10%ig) zu und hydriert bis zum Ende der Wasserstoffaufnahme. Man filtriert, dampft ab, löst den Rückstand in Dimethylformamid auf, dampft wiederum ab, um die Spuren von Essigsäure zu beseitigen. Anschliessend löst man den Rückstand in 260 ml Methanol, versetzt mit 25 ml Hydrazinhydrat und lässt 16 Stunden bei 400 stehen. Nach Zugabe von 260 ml Diäthyläther filtriert man die ausgeschiedene kristalline Masse ab, wäscht mit Diäthyläther und trocknet im Hochvakuum über Schwefelsäure.
Man erhält BOC Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-NHNH3 2 CHFCOOH: Smp.
1820, [α]D20 = -8 in Dimethylformamid.
Teilsequenz F1
L-Threonyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-valyl-L-leucin [H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OHl a) H-Cys(Bz1)-Va1-Leu-OMe. HBr
Man löst 21,0 g Z-Cys(Bzl)-OCP und 12,3 g H-Val Leu-OMe . HCl in 120ml Dimethylformamid. Danach gibt man 5,9 ml Triäthylamin hinzu, lässt 16 Stunden bei 250 stehen, fügt Essigester hinzu, wäscht mit verdünnter Salzsäure, trocknet über Natriumsulfat. dampft zur Trockne ab und kristallisiert den Rückstand aus Essigsäureäthylester!Diäthyläther. Man erhält Z Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe, Smp. 1600, [α]D20 = 280 in Dimethylformamid, das man in 210 ml einer 40%igen Lösung von Bromwasserstoff in Eisessig löst.
Man lässt 1 Stunden bei 250 stehen, dampft zur Trockne ein und kristallisiert den Rückstand aus IsopropanollDiäthyl- äther um. Man erhält H-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe HBr, Smp. 1680, [α]D20 = + 140 in Dimethylformamid.
b) H-T/lr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe 1,3 HBr
Man löst 20 g Z-Thr-NHNH2 in 350 ml Dimethylformamid. kühlt auf 200, gibt 100 ml einer Lösung von 2N Salzsäure in Dioxan und anschliessend noch 10 ml tert.Butylnitrit zu. Nach 10 Minuten bei -20 werden 45 ml Triäthylamin und 25,5 g H-Cys(Bzl)-Val Leu-OMe HBr hinzugefügt und das erhaltene Gemisch während 16 Stunden bei 0 geschüttelt. Man dampft zur Trockne ein. löst den Rückstand in einem Gemisch von Essigsäureäthylester/Wasser, wäscht die organische Phase mit verdünnter Salzsäure, trocknet über Natriumsulfat, dampft ein und kristallisiert den Rückstand aus Essigester um. Man erhält Z-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu OMe: Smp. 2080, [α]D20 = 270 in Dimethylformamid.
Man löst 20 g von dem oben erhaltenen Tetrapeptid in 200 ml eines Gemisches von Trifluoressigsäure/Essigester (1:1) auf, leitet während 1 Stunde bei 0 einen Strom gasförmigen Bromwasserstoffs ein, dampft anschliessend ein und kristallisiert den Rückstand aus Methanol-Diäthyläther um. Man erhält H-Thr-Cys(Bzl) Val-Leu-OMe # 1,3 HBr; Smp. 202 , [α]D20 = -10 in Dimethylformamid.
c) H-TIir-Cys(BzI)- Val-Lew-OH
Man löst 372 g H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe 1,3 HBr in 1800 ml Methanol, gibt 900 ml 2N Natronlauge zu, lässt 1 Stunde bei 250 stehen, gibt 240ml Eisessig zu und lässt 2 Stunden bei 00 stehen. Man filtriert die ausgeschiedene kristalline Masse ab, wäscht diese zuerst mit 1N Essigsäure, anschliessend mit Wasser und trocknet bei 500 im Hochvakuum. Man erhält das H-Thr Cys(Bzl)-Val-Leu-OH. Smp. 2190, [α]D20 = 530 in 1N Ammoniak.
Teilsequenz F2 tert.Butyloxycarbonyl-S-benzyl-L-cysteinyl -L-seryl-L-asparaginyl-L-leucyl-L-serin-hydrazid [BOC-Cys(Szl)-Ser-Asn-Leu-Ser-NH-NH2] a) H-Asn-Leu-Ser-OMe # HCl
Man löst 43 g H-Leu-Ser-OMe HCI und 53 g BOC Asn-ONP in 400ml Dimethylformamid auf, gibt 22 ml Triäthylamin zu lässt 16 Stunden bei 250 stehen, dampft zur Trockne ein und kristallisiert den Rückstand aus Methanol um. Man erhält 51,6 g BOC-Asn-Leu-Ser OMe, Smp. 1900, [α]D20 = 240 in Dimethylformamid, das man in 500ml einer 4N Lösung von Salzsäure in Methanol löst. Man lässt 1 Stunde bei 250 stehen, dampft zur Trockne ein, löst den Rückstand in Methanol und fällt mit Diäthyläther.
Man erhält H Asn-Leu-Ser-OMe HCI: Smp. 1800, [x]D20 = -23n in Dimethylformamid.
b) H-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe # HCl
Man löst 39,5 g BOC-Ser-NHNH2 in 500 ml Dimethylformamid, kühlt auf - 200, gibt 200ml einer 2N Lösung von Salzsäure in Dioxan und anschliessend 20 ml tert.Butylnitrit zu. Nach 10 Minuten bei -20 werden 40 ml Triäthylamin und 38,0 g H-Asn-Leu-Ser-OMe HCl hinzugefügt, danach 16 Stunden bei 0 gerührt, zur Trockne eingedampft und der Rückstand aus Chloroform/Diäthyläther umkristallisiert. Man erhält BOC Ser-Asn-Leu-Ser-OMe, Smp. 1350, [ziD20 = 220 in Dimethylformamid, das man in 420ml einer 4N Salzsäurelösung in Methanol löst.
Man lässt 1 Stunde bei 250 stehen, dampft zur Trockne ein und kristallisiert aus Methanol/Essigsäureäthylester um. Man erhält H Ser-Asn-Leu-Ser-OMe HCl, Smp. 1550 (Zersetzung).
[α]D20 = -15 in Dimethylformamid.
c) BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser-NHNH2
Man löst 18,5 g H-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe HCl und 18.0 g BOC-Cys-Bzl)-ONP in 100 ml Dimethylformamid auf, gibt 10 ml Wasser, 3,5 ml Essigsäure und 5,6 ml Triäthylamin zu, Iässt 16 Stunden bei 250 stehen, dampft zur Trockne ein und kristallisiert aus Methanol um.
Man erhält 25,1 g BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe, Smp. 1820, [α]D20 = -17 in Dimethylformamid. das man unter leichtem Erwärmen in 200 ml Dimethylformamid löst. Man gibt 200ml Methanol und 20ml Hydrazinhydrat zu, lässt 16 Stunden bei 300 stehen, fällt mit Diäthyläther, wäscht den Niederschlag mit Diäthyl äther/Methanol (1:1) und trocknet das so erhaltene BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser-NHNH2, Smp. 224 , [α]D20 - - 130 in Dimethylformamid.
Teilsequenz F Äthoxycarbonyl-L-hemicystinyl-L-seryl-L -asparaginyl-L-leucyl-L-seryl-L-threonyl-L-hemicystinyl -L-valyl-L-leucin
EMI7.1
Man löst 18,4 g BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser NHNH2 (Teilsequenz F2) in 150 ml Dimethylformamid, kühlt auf 200, gibt 40 ml einer 2N Lösung von Salzsäure in Dioxan und 15 ml tert.Butylnitrit zu. Nach 10 Minuten bei - 200 gibt man noch 28 ml Triäthylamin und 16,2 g H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OH (Teilsequenz F1) zu und rühry 16 Stunden bei 25 . Danach wird filtriert, die Lösung eingedampft und der Rückstand mit 1N Essigsäure durchgewaschen. Man erhält BOC-Cys (Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OH. Smp.
217 , [α]D20 = -27 in Dimethylformamid.
Man löst das erhaltene Produkt in 5000 ml getrocknetem Ammoniak, gibt unter Rühren und Sieden des Ammoniaks Natriummetall bis zur tiefblauen Färbung zu. Zwecks Entfärbung wird Ammoniumchlorid hinzugefügt. Man dampft zur Trockne ein und wäscht den Rückstand mit 1N Essigsäure und Aceton durch. Nach Trocknen erhält man BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr Cys-Val-Leu-OH, Smp. 2480 (Zers.), [α]D20 = 410 in DimethylformamidlWasser (3 1).
Man löst das so erhaltene Nonapeptid in 5000ml 0.01N Ammoniak auf, gibt unter Rühren IN Wasserstoffperoxyd bis zur negativen Nitroprussiatreaktion zu.
dann noch 200 ml Eisessig, filtriert und lyophilisiert.
Man erhält
EMI7.2
OH. Smp. 2380 (Zers.), [1D2O = - 180 in Dimethyl formamid/Wasser (3 1), dass man in 300 ml Trifluoressigsäure löst, lässt 30 Minuten bei 250 stehen, dampft ab, wäscht den Rückstand mit Essigester und löst ihn in 300 ml Dimethylformamid auf. Zu dieser Lösung gibt man 30g Kohlensäure-p-nitrophenyl-äthylester der wie nachstehend beschrieben hergestellt ist-. sowie 14 ml Triäthylamin, lässt 16 Stunden bei 250 stehen, dampft ab und wäscht den Rückstand mit Chloroform.
Man löst in 300 ml Dimethylformamid, gibt 50 ml Wasser und 50g DOWEX-50 hinzu, rührt 15 Minuten, filtriert, wäscht den Harz mit Dimethylformamid und dampft das Filtrat zur Trockne ein. Man wäscht den Rückstand zuerst mit Chloroform und anschliessend mit Essigester und trocknet. Man erhält das
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Smp. 2630, [α]D20 = 210 in Dimethylformamid/Wasser (3 1).
Kohlensäure-p-nitrophenyl-äthylester
Man löst 200g p-Nitrophenol und 113 ml Pyridin in 1200 ml Essigester, kühlt auf 00, gibt unter Rühren 156 ml Chlorameisensäureäthylester zu, rührt noch 30 Minuten bei 00, wäscht mit Wasser, trocknet über Na2SO4 und dampft zur Trockne ein. Man löst den Rückstand in Diäthyläther und kristallisiert den Kohlensäuro-p-nitrophenvl-äthvlester durch Zugabe von Petroläther, Smp. 650.
Teilsequenz ABC
Nim-Trityl-L-histidyl-L-arginyl-L-phenylalanyl-L-seryl -glycyl-L-iiietliionyl-glycyl-L-ph enyialanyl-glycyl-L- -prolyl-L-glutamyl-L-threonyl-L-prolinamid # triacetat [H-His(Trt)-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 # 3 CH3CO2H) a) L-Seryl-glycyl-L-methionyl-glycyl-L-phenylalanyl -glycyl-L-prolyl-L-glutamyl-L-threonyl-L-prolin amid # Hydrochlorid (H-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly
Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 # HCl)
Man löst 6,7 g BOC-Ser-Gly-Met-Gly-OH (Teilsequenz B), 12 g H-Phe-Gly-Pro-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2 (Teilsequenz A) und 2,1 g Hydroxysuccinimid in 50ml Dimethylformamid und 20 ml Acetonitril auf.
kühlt auf 00, gibt 4,0g Dicyclohexylcarbodiimid hinzu und lässt 16 Stunden bei 0 stehen. Man dampft das Lösungsmittel ab, wäscht den Rückstand mit Wasser, Diäthyl äther und Essigester und kristallisiert aus Chloroform um. Man erhält BOC-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2, Smp. 121 (Zers.), [α]D20 = 470 in Dimethylformamid, das man in 250ml einer Lösung von 8N Chlorwasserstoff in Dioxan löst. Man rührt während 2 Stunden bei 250. dampft zur Trockne ein und verarbeitet den Rückstand in Diäthyläther.
Man erhält H-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr Pro-NH2 HCI [Smp. 1300 (Zers.). [α]D20 = 480 in Dimethylformamid].
b) Nim-Trityl-L-histidyl-L-arginyl-L-phenylalanyl-L -seryl-glycyl-L-methionyl-glycyl-L-phenylalanyl-gly cyl-L-prolyl-L-glutamyl-L-threonyl-L-prolinamid .
triacetat [H-His(Trt)-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 # 3 CH3COOH]
Man löst 9.9 ° Trt-His(Trt)-Arg-Phe-NHNH2 HCI (Teilsequenz C) in 100 ml Dimethylformamid, kühlt auf 200, gibt 15 ml Dioxan/HCl 2N und anschliessend 1.16 ml tert.Butylnitrit zu, rührt 10 Minuten bei -200, gibt 28 ml Triäthylamin und 10,0 g H-Ser-Gly-Met-Gly Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 # HCl zu, rührt 4 Stunden bei 00, filtriert und dampft zur Trockne ein.
Man löst den Rückstand in einem Gemisch von Essigester/ Methanol (8 : 2) auf, wäscht mit verdünntem Ammoniak und anschliessend mit Wasser bis zur Neutralität. trocknet über Natriumsulfat. konzentriert auf 100 ml und fällt durch Zugabe von Diäthyläther. Man löst den Niederschlag wiederum in Dimethylformamid auf und fällt durch Zugabe von Diäthyläther. Man erhält Trt His(Trt) - Arg - Phe - Ser - Gly - Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu Thr-Pro-NH2 [Smp. 168 (Zers.), [α]D20 = -43 in Dimethylformamidi, das man in 500 ml Essigsäure/Wasser (8 : 2) löst. Man lässt 3 Stunden bei 400 stehen, dampft ein. wäscht den Rückstand in Diäthyläther und trocknet im Hochvakuum über KOH-Spänen.
Man erhält H-His(Trt)-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro Glu-Thr-Pro-NH2 # 3 CH2COOH, Smp. 182 (Zers.), [α]D20 = -56 in Essigsäure.
Teilsequenz DE
N-tert.Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrrosyl -L-tryptophanyl-L-arginyl-L-asparaginyl-L-leucyl-L -asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenylalanin-hydrazid.
diacetat (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn.
Leu-Asn-Asn-Phe-NHNH. 2 CH,COOH) a) 1-(N-tert.Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-L -tyrosinyl-L-tryprophanyl-L-arginyl-L-asparaginyl -L-leucyl-L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenyl alanin)-2-benzyloxycarbonyl-hydrazid # diacetat (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe
NH-NH-Z 2 CH3COOH)
Man kühlt 320 ml Dimethylformamid auf - 200C.
gibt 100 ml 2N Chlorwasserstoff in Dioxan zu und löst darin 68 g BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-NHNH acetat (Teilsequenz E). Anschliessend versetzt man mit 12 mol tert.Butylnitrit, lässt 10 Minuten bei -20 rühren und tropft 35 ml Triäthylamin zu. Das so erhaltene Gemisch wird mit einer Lösung, entstanden aus 8,8 g H-Asn-Leu Asn-Asn-Phe-NHNH-Z Trifluoracetat (Teilsequenz D) und 17 ml Triäthylamin in 150 ml Dimethylformamid vereinigt. Nach 16 Stunden Stehenlassen bei 0 wird eingedampft. Man löst den Rückstand in Essigester/ Butanol und wäscht mit verdünnter Essigsäure und Ammoniaklösung.
Nach Eindampfen des Lösungsmittels verbleibt das BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn- Asn-Phe-NHNH-Z 2 CH3COOH vom Smp. 1750, [α]D20 = -19,5 in Dimethylformamid.
b) tert.Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl -L-tryptophanyl-L-arginyl-L-asparaginyl-L-leucyl-L -asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenylalanin-hydrazid .
diacetat (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn Leu-Asn-Asn-Phe-NHNH- 2 CH3COOH)
Man löst 90 g BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu- Asn-Asn-Phe-NHNH-Z 2 CH3COOH in 500 ml Dimethylformamid und hydriert mit 10 g PdlC (10%ig) bis zum Ende der Wasserstoffaufnahme. Nach Abfiltrieren des Katalysators wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand aus einem Gemisch von Äther und Äthanol kristallisiert. Man erhält BOC-Ser Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NHNH 2 CH3COOH vom Smp. 2650. [α]D20 = = 570 in Dime thylformamid.
Tellseqiienz A BCDE
L-Seryl-L-alanyl-L-tyrosyl-L-tryptophanyl-L-arginyl -L-asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl-L-asparaginyl-L -pllenylatan.yl-L-histidyl-L-arginyl-L-pllenylalanvl- -L-seryl-glycyl-L-methionyl-glycyl-L-phenylalanyl -glycyl-L-prolyl-L-glutamyl-L-threonyl-L-prolinamid .
hexatrifluoracetat (H-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn
Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH@. 6 CF3CO2H)
Man löst 15.2 g BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu Asn-Asn-Phe-NHNH2 diacetat (Teilsequenzen D. E) in 200 ml Dimethylformamid. kühlt auf -20. gibt 15 ml Dioxan/HCl 2N und anschliessend 1,16 ml tert.Butylnitrit zu und rührt 10 Minuten bei 200. Man gibt 14 ml Triäthylamin und eine Lösung von 15,6 g des in Teilsequenz A. B, C erhaltenen Tridecapeptidacetats zu, rührt das erhaltene Gemisch 16 Stunden bei 0t, filtriert und dampft zur Trockne ein.
Man wäscht den Rückstand mit Diäthyläther und mit Chloroform, löst in Dioxan/Wasser (8:2). behandelt die erhaltene Lösung mit 100 ml Amberlit-IRA-410 (Acetat-Form), dampft ein und kristallisiert den Rückstand aus Isopropanol/ Wasser um. Man erhält das BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg Asn - Leu - Asn - Asn-Phe-His(Trt)-Arg-Phe-Ser-Gly-Met- Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 Acetat, Smp. 1450 (Zers.), [α]D20 = -67 in Essigsäure, das man unter Stickstoffatmosphäre in 500 ml Trifluoressigsäure löst.
Man lässt 1 Stunde bei 250 stehen, konzentriert auf 100 ml und fällt durch Zugabe von 1000 ml Diäthyl äther. Man filtriert, löst den Rückstand in Dimethylformamid und fällt mit Diäthyläther. Nach Trocknen über KOH-Spänen erhält man das H-Ser-Ala-Tyr-Trp Arg - Asn - Leu - Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met- Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 # 6 CF3CO2H, Smp.
1300 (Zers.), [α]D20 = -42 in Essigsäure.
Beispiel I Äthoxycarbonyl-L-hemicystinyl-L-seryl-L-asparaginyl -L-leucyl-L-seryl-L-threonyl-L-heniivstinyl-L-valyl-L- -leucyl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl-L-tryptophanyl-L -arginyl-L-asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl-L -asparaginyl-L-phenylalanyl-L-histidyl-L-arginyl-L -phenylalanyl-L-seryl-glycyl-L-methionyl-glycyl-L -phenylalanyl-glycyl-L-prolyl-L-glutamyl-L-threonyl -L-prolinamid # Hexaacetat # Octahydrat
EMI8.1
Ser-Ala-Tyr-Try-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg
Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro NHo Hexaacetat zu Octahydrat
Man löst 1.0 g Nonapeptid (Teilsequenz F) in 10 ml Dimethylformamid. gibt 1,5 g N-Hydroxysuccinimid und 0,52 g Dicyclohexylcarbodiimid zu. rührt 6 Stunden bei 250, filtriert und dampft das Filtrat zur Trockne ein.
Man wäscht den Rückstand mit Essioester und Diäthvl äther und trocknet. Man erhält
EMI8.2
EMI8.3
Smp. 2420 das man in 19 ml Dimethylformamid löst. Zu dieser Lösung gibt man 3,1 g Tricosapeptid-Hexatrifluoracetat (Teilsequenz A, B, C, D, E) 0,4 ml Triäthylamin sowie 1.2 g N-Hydroxysuccin- imid und rührt 16 Stunden bei 250. Man dampft zur Trockne ein, wäscht den Rückstand mit Diäthyläther, Chloroform und Aceton. So erhält man das rohe. geschützte Dotriacontapeptid. das man in 100 ml 0,3 Essigsäure löst, mit 20 ml Amberlit-IRA-410 (Acetat) behandelt und gibt 50 ml 0.6 N Ammoniumhydroxid hinzu.
Man stellt das pH auf 6.5 ein und schichtet die erhaltene Lösung auf eine Carboxymethylcellulosesäule (10
X 100 cm), die mit einer 0,15N Ammoniumacetatpufferlösung equilibiert wurde. Die Elution wird mit einem steigenden Konzentrations- und pH-Gradient (0,15 N auf 0,4 N; pH 6.5 auf pH 7.0) eines Ammoniumacetatpuffers durchgeführt. Die vereinigten Fraktionen. die das reine Peptid enthalten. werden dreimal gefriergetrocknet, der Rückstand wird mit Äthanol und anschliessend mit Diäthyläther gewaschen und über Kaliumhydroxid im Hochvakuum getrocknet. Man erhält EOC
EMI8.4
Arg - Asn - Leu - Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met- Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 # 6CH3CO2H 8 H2O, Smp. 240 (Zers.). [α]D20 = -56 in Essigsäure IN.
Aminosäurezusammensetzung nach Säurehydrolyse (6N, 16 Stunden): Ala1.1, Arg ,., AsP3.@, Cvs/9,..
Gly3.0, His1.1, Leu2.@, Met1,0, Phe3.0, Pro@.@, Ser@.@, Thr1.0, Val0.9 (Trp1.0 durch Spektrophotometrie).