Verfahren zur Herstellung bisher unbekannter Polypeptidderivate
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung bisher unbekannter Polypeptidderivate der allgemeinen Formel
EMI1.1
10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg.
22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32
Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH: worin R für eine Alkyl-, Alkenyl-. ggf. substituierte Aralkyl- oder eine gf. substituierte Arylgruppe steht.
ihrer therapeutisch wirksamen Säureadditionssalze und Schwermetallkomplexe. Als R kommen beispielsweise der Äthyl-, Allyl-, Phenyl-, p-Nitrophenyl-, p-Chlorphe nyl-, p-Bromphenyl-. p-Methoxyphenyl-, Azobenzoloder der p-Methoxy-Azobenzolrest in Frage.
Die erfindungsgemässen Polypeptidderivate zeichnen sich durch Beständigkeit gegenüber der abbauenden Wirkung von Aminopeptidasen aus.
Die bisher unbekannten Polypeptidderivate können nach für die Synthese von Verbindungen dieser Art allgemein bekannten Methoden hergestellt werden, wobei die Aminosäuren in der in der obigen Formel festgelegten Reihenfolge einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten miteinander verknüpft werden, indem man entsprechende zu ihrem Aufbau nötige Verbindungen unter Bildung von CONH-Bindungen in beliebiger zeitlicher Reihenfolge miteinander kondensiert.
wobei nicht an der Reaktion teilnehmende freie funktionelle Gruppen intermediär durch geeignete Schutzgruppen geschützt werden, zu einem beliebigen Zeitpunkt
0 der Synthese unter Beibehaltung der R-CH..-O-C-Gmp- pe in Stellung 1. worin R obige Bedeutung hat, die Schutzgruppen abspaltet, die Mercaptogruppen nach Bildung der Teilsequenz 1 bis 7 und vor Einbau der eine Methionylgruppe enthaltenden Teilsequenz zum Disulfid oxydiert und die Carboxylgruppe des terminalen Prolylrestes in die Amidgruppe überführt. Die Einführung der im Endprodukt am endständigen L-Hemicystin-Molekül gewünschten Gruppe der allgemeinen Formel
EMI1.2
worin R obige Bedeutung hat, kann in einer beliebigen Stufe vor der letzten Stufe erfolgen.
In der letzten Stufe sind jedoch Methoden zu verwenden, bei denen Racemisierung nicht auftritt oder gering gehalten werden kann. vorzugsweise die Azidoder die aktivierte Ester-Methode. wobei zur Aktivierung vorzugsweise N-Hyd roxysuccinimid Verwendung findet. Üblicherweise werden die beim Aufbau von Cystein-haltigen Peptiden zum Schutz der SH-Gruppen verwendeten Benzylreste am Ende der Synthese durch Behandlung mit Natrium in flüssigem Ammoniak abgespalten.
Es wurde nun gefunden. dass die Abspaltung der Benzylschutzgruppen und die Herstellung der (Cys)S S(Cys)-Bindung vor der letzten Stufe zu besonders guten Ausbeuten an Endprodukt führt.
Beim Aufbau der neuen Polypeptidderivate hat sich für die Blockierung der #-Carboxygruppe, beispielsweise in der nachstehend beschriebenen Teilsequenz A, die tert.Butyloxy(Truppe bewährt, doch können auch andere Schutzgruppen. wie die Methoxy-. die Äthoxy-, die tert. Amyloxy-, die Amid- oder die Benzylgruppe verwendet werden.
Für die Blockierune der Imidazolgruppe des Histidinrestes in der nachstehend beschriebenen Teilsequenz C hat sich die Triphenylmethylgruppe bewährt, doch können auch andere geeignete Schutzgruppen, wie die Carbo-tert.butoxy-. die Carbo-tert.amyloxy-. die Carbobenzoxy- oder die Benzylgrtippe venvendet werden.
Für die Blockierung der Guanidoamppe des Argininrestes in der nachstehend beschriebenen Teilsequenz E wurde die Nitro-Gruppe verwendet. doch können auch andere geeignete Schutzgruppen. wie die Tosylgruppe, die p-Nitrrbenzoxycaron-lgruppe oder die 2-(Isopro- pyloxycarbonyl)-3.4.5.6-tetrachlorbenzoylgruppe verwendet werden. Man kann auch den Schutzeffekt der Pro tonisierung der Guanidogruppe bei der Synthese verwenden.
Die neuen Polypeptidderivate lassen sich auch in Form ihrer Salze gewinnen bzw. verwenden. Als Salze kommen solche mit organischen Säuren. wie Essigsäure, Propionsäure, Glykolsäure. Milchsäure. Brenztraubensäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure. Fumarsäure, Weinsäure. Zitronensäure, Benzoesäure. Zimtsäure, Salicylsäure, 2-Phenoxv- oder 2-Acetoxybenzoe- säure, Mandelsäure, Methansulfonsäure. Äthansulfonsäure, Hydroxyäthansulfonsäure, Benzol- oder Toluolsulfonsäure, Naphthalinsulfonsäure, Sulfanilsäure sowie polymere Säuren wie Gerbsäure. Alginsäure. Polvgalacturonsäure, Polyphloretinphosphat oder Carbo'cymethyl- cellulose und Salze mit anorganischen Säuren. wie Ha logenwasserstoffsäure. z.B.
Salzsäure oder Bromwasserstoffsäure, Salpetersäure, Thiocyansäure, Schwefelsäure und Phosphorsäure in Frage. Als Schwermetallkomplexe kommen zB. diejenigen vom Zink in Frage.
Die Ausgangsprodukte zur Herstellung der neuen Polypeptidderivate können, sofern sie bisher nicht bekannt waren, nach den für die Peptidchemie bekannten Methoden erhalten werden, wobei die Aminosäuren einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten miteinander verknüpft werden.
Die neuen Verbindungen stellen ein wichtiges therapeutisches Prinzip dar, dass den Calciumplasmaspiegel, insbesondere den erhöhten Calciumplasmaspiegel senkt und als Antagonist des Parathormons eine positive Calciumbilanz im Knochen bewirkt.
Es ist somit indiziert bei allen Zuständen, bei welchen eine Senkung des Plasmacalciumspiegels erwünscht ist, z.B. Hypercalcämien verschiedener Genese. .Mangel des endogenen Thyreocalcitonins infolge Ausfalls von Schildd rüsengewebe, Hyperfunktion der Nebenschilddrüsen.
Die neuen Verbindungen sind indiziert bei allen Knochenaffektionen, die auf einem vermehrten Abbau beruhen oder bei welchen eine vermehrte Calciumfixation im Knochen erwünscht ist, z.B. Osteoporose verschiedener Genese (z.B. postklimakterisch, posttraumatisch, bedingt durch Corticosteroidtherapie oder Inaktivität usw.), Frakturen, Osteomalacie, Rachitis sowie insbesondere zur Kombinationstherapie mit Calcium bzw.
Phosphat.
Die biologische Prüfung der neuen Verbindungen ergab eine Wirksamkeit von ca. 100 bis 450 MRC-Einheiten/mg Peptid. Die erforderliche Tagesdosis (i.m.
verabreicht) in MRC-Einheiten beträgt 20 mE bis 10 E, vorzugsweise 100 mE/kg Tiergewicht.
Beim Menschen beträgt die tägliche Dosis (i.m. verabreicht) in MRC-Einheiten 1 bis 500 E. Vorzugsweise wird eine tägliche Dosis von 5 E i.m. verabreicht.
Die neuen Verbindungen können als Heilmittel. z.B.
in Form pharmazeutischer Präparate, Verwendung finden. Diese enthalten die genannten Verbindungen in Mischung mit einem für die parenterale Applikation geeigneten organischen oder anorganischen Trägermaterial.
Für dasselbe kommen solche Stoffc in Frage. die mit der neuen Verbindung nicht reagieren, wie z.B. Gelatine.
Milchzucker, Stärke, Magnesiumstearat, Talk, pflanzliche Öle, Benzylalkohole, Gummi arabicum, Polyalky- lenglykole, Vaseline, Cholesterin oder andere bekannte Arzneimittelträger.
Die pharmazeutischen Präparate können z.B. in flüssiger Form als Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen vorliegen. Gegebenenfalls sind sie sterilisiert und bzw. oder enthalten Hilfsstoffe, wie Konservierunps-.
Stabilisierungs., Netzmittel oder Emulgiermittel. Sie können auch noch andere, therapeutische wertvolle Stoffe enthalten. Die neuen Verbindungen können auch in Form von Depotpräparaten verabreicht werden,
Die neuen Verbindungen und ihre Salze können auch als Zwischenprodukt zur Herstellung von pharmazeutischen Präparaten Verwendung finden.
Es werden folgende Abkürzungen verwendet:
Z = Carbobenzoxy
Bzl = Benzyl
EOC = Äthoxycarbonyl
BOC = tert.Butyloxycarbonyl
Trt = Trityl = Triphenylmethyl
OTB = tert.Butyloxy
ONP = p-Nitrophenylester
OCP = 2,4,5-Trichlorphenoxy
OSu = Oxysuccinimid
OMe = Methoxy
OEt = Äthoxy NO. = Nitro
Ser = L-Seryl
Asn = L-Asparaginyl
Leu = L-Leucyl
Thr = L-Threonyl
Val = L-Valyl
Ala = L-Alanyl
Tyr = L-Tyrosyl
Trp = L-Tryptophanyl
Arg = L-Arginyl
Phe = L-Phenylalanyl
Glu = L-Glutamyl
His = L-Histidyl
Pro = L-Prolyl
Gly = Glycyl
Met = L-Methionyl
Cys = L-Cysteinyl
In den folgenden Beispielen, die die Ausführung des Verfahrens erläutern, den Umfang der Erfindung aber in keiner Weise einschränken sollen, erfolgen alle Temperaturangaben in Celsiusgraden.
Teilsequenz A L-Phenylalanyl-glycyl-L-prolyl-γ-tert.butyloxy-L- -glutamyl-L-threonyl-L-prolinamid [H-Phe-Gly-Pro-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH.]
Man löst bei -5 134 g Z-Thr-NH-NH. in 2 Liter IN Salzsäure und versetzt mit 0.55 Liter IN Natriumnitrit. Nach 5 Minuten wird Kaliumcarbonat bis pH 9 zugegeben. das entstandene Azid mit Äthylacetat extrahiert und eine Lösung von 80 g H-Pro-NH. . hydrochlo- rid in 100 ml Wasser. 500 ml Dimethylformamid und 77 ml Triäthylamin hinzugefügt. Man verdampft das Äthylacetat bei 20 im Vakuum und lässt über Nacht bei 250 stehen.
Die restliche Lösung wird im Vakuum verdampft. der Rückstand in Äthylacetat gelöst. die Lösung mit Wasser. verdünnter Salzsäure und einer wässrigen Kalciumcarbonatlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet Man verdampft im Vakuum.
löst in warmem Äthylacetat und kühlt ab. Man erhält Z-Thr-Pro-NH2: Smp. 148 [α]D20= - 72 in 95% Essigsäure. Man löst hierauf 90 g Z-Thr-Pro-NH2 in 2 Liter Dioxan und 260ml 1N Salzsäure und hydriert bei 200 und Normaldruck in Gegenwart eines Palladiumkatalysators. Man abfiltriert, verdampft die Lösung im Vakuum. wäscht den Rückstand mit Äthylacetat und erhält H-Thr-Pro-NH: HCI; Smp. 2160, [z]D20= - 640 in 95% Essigsäure. Dieses wird in 500 ml Dimethylformamid. 50 ml Wasser und 32 ml Triäthylamin gelöst und 118g Z-Glu(OTB)-OCP und 800 mol Tetrahydrofuran zugegeben.
Man lässt über Nacht bei 200 stehen, verdampft im Vakuum und kristallisiert den Rückstand mit Ätbyläther. Man erhält Z-Glu(OTB) Thr-Pro-NH2, Smp. 65 (Zers.). [α]D20= - 18 in Dimethylformamid.
Man löst 80 e ZGlu(OTB)-Thr-Pro-N'H. in 1.5 Liter Dioxan und 200 ml Wasser und hydriert bei 20 und Normaldruck in Gegenwart eines Palladiumkatalysators.
Die Lösung wird filtriert und im Vakuum verdampft und der Rückstand mit Diäthyläther versetzt. wobei H Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2 erhalten wird; Smp. 650 (Zers.).
[α]D20= - 28 in Dimethylformamid.
Dieses wird in 700 ml Dimethylformamid bei 0 gelöst. 200 ml Acetonitril. 68 g Z-Phe-Gly-Pro-OH. 18 g N-Hydroxysuccinimid und 32 g Dicyclohexylcarbodiimid hinzugefügt, über Nacht bei 200 stehengelassen. filtriert, im Vakuum eingedampft und mit Äthylacetat versetzt.
Danach wäscht man die Lösung mit Wasser. verdünnter Salzsäure und wässriger Kaliumcarbonatlösung, trocknet über Natriumsulfat. verdampft im Vakuum und kristallisiert den Rückstand aus Äthylacetat/Äthyläther. Man erhält Z-Phe-Gly-Pro-Glu(OTB)-Thr Pro-NH2 Smp. 120 (Zers.), [α]D20 = -66 in Dimethylformamid. das man in 1500 ml Dioxan und 300 ml Wasser löst. Nian gibt 30 g Palladiumkohle (10%) zu und hydriert bis zum Ende der Wasserstoffaufnahme. Man filtriert. dampft das Filtrat ein und kristallisiert den Rückstand aus Dioxan. Man erhält das H-Phe-Gly-Prn-Glu(OTB)-Thr- Pro-NH2; Smp. 1535. [z.]" " = -79 in Dimethylformamid.
Teilsequenz B
N-tert. Butyloxycurbonyl-L-seryl-glycyl-L-methionyl -glycin (BOC-Ser-Gly-Met-Gly-OH) a) L-Methionyl-glycin-äthylester-hydrochlorid (H-Met-Gly-OEt. HCl)
Man löst 65 g BOC-Met-OH in 900 ml Chloroform.
kühlt auf -10 . gibt 30 ml N-Methylmorpholin und 35,6 g Chlorameisensäureisobutylester zu. Nach 10 Minuten fügt man langsam eine Lösung von 30g Glycin äthylester in 200 ml Chloroform hinzu und lässt bei 200 eine Stunde reagieren. Man extrahiert mit 0,5N Ammoniumhydroxid. dann mit 0,2N Schwefelsäure. wäscht mit Wasser neutral, trocknet über Natriumsulfat und engt ein. Nach Umkristallisieren aus Petroläther erhält man BOC-Met-Glv-OEt; Smp. 490, [α]D20 = - 190 in Äthanol. Man löst es in 750 ml 4N HCl/Äthanol, lässt I Std. bei 250 stehen. dampft ein, wäscht den Rückstand mit Diäthyläther und trocknet bis zur Gewichtskonstanz.
Man erhält das H-Met-Gly-OEt HCI in Form eines öles.
b) N-tert.Butyloxycarbonyl-L-seryl-glycin-äthylester (BOC-Ser-Gly-OEt)
Man löst 12,5 g N-tert.Butyloxycarbonyl-serin in 100 ml Chloroform und gibt 6.1 g N-Methylmorpholin dazu: danach tropft man 8,2 g Chlorameisensäureisobutylester hinzu. Nach 10 Minuten wird eine Lösung von 6,6 g Glycin-äthylester in 50ml Chloroform hinzugefügt und 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wird mit verdünntem Ammoniak. dann mit Salzsäurelösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und die organische Phase abgedampft. Man erhält BOC-Ser-Gly-OEt als Öl; [α]D20 = 30 in Dimethylformamid.
C) N-tert.Butyloxycarbonyl-L-seryl-glycin-hydrazid (BOC-Ser-Gly-NHNH2)
Man löst 19,4 g BOC-Ser-Glv-OEt in 270 mol Äthylalkohol, gibt 48.6 ml Hydrazinhydrat hinzu und lässt 2 Tage bei Raumtemperatur stehen. Anschliessend dampft man die Lösung ab und kristallisiert den Rückstand aus einem Methylalkohol/Äthyläther-Gemisch (1: 3). Man erhält BOC-Ser-Gly-NHNH2, Smp. 157 . [α]D20= -5 in Dimethylformamid.
d) N-tert.Butyloxycarbonyl-L-seryl-glycyl-L-methionyl -glycin äthylester (BOC-Ser-Gly-Met-Gly-OEt)
Zu 200 ml Dimethylformamid werden 25 ml einer 4N Chlorwasserstofflösung in Äthvläther gegeben und darin bei - 100 11 g BOC-Ser-Gly-NHNH.. gelöst. Anschliessend tropft man bei - 100 5.4 ml tert.Butylnitrit hinzu, fügt der Lösung zuerst 18 ml Triäthylamin und dann eine Lösung von 12g H-Met-Gly-OEt HCI in 100 ml Dimethylformamid und 6,2 ml Triäthylamin bei.
Es wird 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. nach 12 Stunden filtriert und eingedampft. Den Rückstand löst man in Chloroform, wäscht nacheinander mit verdünnter Ammoniak- und Salzsäurelösung. trocknet über Natriumsulfat und dampft ein. Man erhält BOC-Ser-Gly Met-Gly-OEt. [α]D20 = = 14 in Dimethylformamid.
e) tert.Butyloxycarbonyl-L-seryl-glycyl-L-methionyl -glycin (BOC-Ser-Gly-Met-Gly-OH)
Man löst 24 g BOC-Ser-Gly-Met-Gly-OEt in 250 ml Dioxan, gibt 75 ml IN Natronlauge zu, rührt 1 Stunde bei 250. behandelt mit 150 ml Dowex-50 (H--Form), filtriert, dampft das Filtrat ein und kristallisiert den Rückstand aus Essigester/ Diäthyläther. Man erhält
BOC-Ser-Gly-Met-Gly-OH, Smp. 87 (Zers.). [α]D20 = - 170 in Dimethylformamid.
Teilsequenz C
Na'Nimid. Ditrityl-L-histidyl-L-arginyl-L-phenylalanin hydrazid # HCl[(Trt)-His(Trt)-Arg-Phe-NH-NH2 # HCl] a) Z-Arg(NO2)-Phe-OMe
51,8g H-Phe-OMe HC1 werden in 1 Liter Äther und ca. 50ml Eiswasser gelöst und unter Rühren und Kühlen genügend Natriumcarbonat zugegeben. bis alles Wasser abgebunden ist. Man filtriert und dampft das Filtrat bis zur Gewichtskonstanz ein, wobei ein farbloses Öl erhalten wird.
67,6 g Z-Arg(NO2)-OH werden in 300 ml Acetonitril und 150 ml Dimethylformamid gelöst und mit 41,2 g H-Phe-OMe versetzt. Danach wird auf 200 abgekühlt und eine Lösung von 43,4 g Dicyclohexylcarbodiimid in 100 ml Acetonitril zugegeben. Das Ganze lässt man unter zeitweiligem Umschütteln während 4 Stunden im Eiskasten stehen. Der entstandene Niederschlag wird abfiltriert und das Filtrat eingedampft. Der Eindampfrückstand wird in 1 Liter Essigester gelöst und hierauf in der Kälte mit lN Natronlauge, Wasser, 1N Schwefelsäure, Wasser und gesättigter Kochsalzlösung gewaschen.
Die über Natriumsulfat getrocknete Essigsäureäthvlester- Phase wird vollständig eingedampft. Nach Umkristallisieren aus Essigester/Petroläther erhält man Z-Arg(NO2) Phe-OMe; Smp. 131-133 , [α]D20 = - 7 in Methanol, -4 in Dimethylformamid.
b) H-Arg(NO2)-Phe-OMe # 0.5H2O # HBr
20 g Z-Arg(N & )-Phe-OMe werden in 50 ml Eisessig gelöst und unter leichtem Kühlen 50 ml 40Stciae Bromwasserstoffsäure in Eisessig zugesetzt. Danach lässt man das Ganze unter zeitweiligem Umschütteln während 1 Stunde bei 200 stehen. Nach vollständigem Eindampfen wird der Rückstand in 200 ml Wasser gelöst und zweimal mit Äther gewaschen. Die wässrige Phase wird vollständig eingedampft und der Rückstand aus Methanol/ Äther umkristallisiert. Smp. 165- 1670 mit Zersetzung, [α]D20 = = 180 in Methanol. + 140 in Dimethylform- amid.
c) Z-His(Z)-Arg(NO2)-Phe-OMe
46.1 g H-Arg(NO2)-Phe-OMe # 0.5 H2O # 1.2 HBr werden in 100 ml Wasser gelöst, hierauf erwärmt und anschliessend abgekühlt. Nach Zugabe von Chloroform und Eis wird mit Ammoniak auf pH 9 gestellt. Die Chloroform phase wird noch einmal mit Wasser gewaschen, anschliessend über Natriumcarbonat getrocknet und filtriert. Dem Filtrat wird eine Lösung von 44,5 g Z-His(Z)-OH, 12,1 g Hydroxysuccinimid in 200 ml Acetonitril und 100 ml Pyridin zugesetzt, danach das Ganze auf - 200 abgekühlt und mit einer Lösung von 21,1 g Dicyclohexylcarbodiimid in 70 ml Acetonitril versetzt. Anschliessend wird unter zeitweiligem Rühren 4 Stunden im Eiskasten stehengelassen. Der entstandene Niederschlag wird abfiltriert und das Filtrat eingedampft.
Der Rückstand wird in Essigsäureäthylester aufaenom- men und anschliesend folgendermassen gewaschen: 10%ige Kaliumcarbonatlösung (pH#10), Wasser, gesättigte Kochsalzlösung. Wasser. gesättigte Kochsalzlösung.
Schwefelsäure (pH 3), Wasser, Kochsalzlösung. Die über Natriumsulfat getrocknete Essigsäureäthylester-Phase wird vollständig eingedampft, wobei ein hellbeiger Schaum erhalten wird. Dieser Schaum wird je zweimal in wenig Methanol gelöst und mit Äther gefällt. Die Ätherphasen werden abdekantiert und der Niederschlag getrocknet; man erhält Z-His(Z)-Arg(NO2)-Phe-OMe (amorpher Schaum), [α]D20 = -8 in Methanol, -8 in Dimethylformamid.
d) H-His-Arg-Phe-OMe 4 HCI
25 g Z-His(Z)-Arg(NO2)-Phe-OMe werden in 800 ml Eisessig gelöst. Danach werden 10 g 10% Palladium auf Aktivkohle in 200 ml 1N Salzsäure angerührt und in die Lösung gegeben. Das Ganze wird einer 2stündigen Hydrierung unterworfen und anschliessend der Katalysator abfiltriert. Das Filtrat wird erneut mit 5 g 10% Palladium auf Aktivkohle in Wasser versetzt und der Hydrierung unterworfen, die nach 51/2 Stunden beendet ist. Hierbei werden ca. 80% der theoretischen Menge Wasserstoff verbraucht. Der Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat vollständig eingedampft, wobei H-His Arg-Phe-OMe . 4 4 HCI in Form eines amorphen Schaumes erhalten wird.
e) Trt-His(Trt)-Arg-Plze-OMe . HCI
21,5 g H-His-Arg-Phe-OMe . 4 HCl weredn in 100 ml Pyridin und ca. 100 ml Dimethylformamid gelöst. Bei ca. + 50 wird bis pH 9 Triäthylamin zugegeben und anschliessend eine Lösung von 29 g Tritylchlorid in 300 ml Pyridin während 5 Minuten zugetropft. Nach Beendigung der Zugabe wird von Zeit zu Zeit das pH geprüft und nötigenfalls wieder mit Triäthylamin auf ca pH 9 gestellt. Das Ganze wird nach ungefähr 4 Stunden eingedampft, der Rückstand in Chloroform und Wasser aufgenommen und unter Zugabe von wenig lN Salzsäure auf pH 4 gestellt. Man trennt die Chloroformphase ab, wäscht sie zweimal mit Wasser, trocknet über Natriumsulfat und dampft vollständig ein.
Der Rückstand wird mit Äther versetzt und vom Äther anschliessend abfiltriert, wobei Trt-His(Trt)-Arg-Phe-OMe. HCl erhalten wird.
f) Trt-His(Trt)-Arg-Phe-NH-NH2 # HCl
17 g Trt-His(Trt)-Arg-Phe-OMe # HCl werden in 200 ml Methanol gelöst und mit 40 ml Hydrazinhydrat versetzt. Danach wird 2 Tage bei Zimmertemperatur stehengelassen. Man dampft ein. Iöst den Rückstand in Chloroform und wäscht zweimal mit Wasser. Die Chloroform Phase wird über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Hierauf wird der Rückstand mit Äther gewaschen und abfiltriert; er besteht aus Trt-His(Trt)-Arg Phe-NH-NH. @ HCI, Smp. 1580. [α]D18 = 90 in Di methylformamid.
Teilsequenz D
1-(H-Asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl-L-asparaginyl -L-phenylalanin)-2-benzyloxycarbonyl-hydrazin # Tri fluoracetat (H-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z # CF3COOH) a) I -(N-tert.Bl l tloxl carhonyl-L-/henw .Te(lanyl)-2-benzyl- oxycarbonyl-hydrazid (BOC-Phe-NH-NH-Z)
Man löst 72 g BOC-Phe-OH und 28 g N-Methyl.
morpholin in 500 ml Mithylenchlorid auf und tropft bei -5 26 ml Chlorameisensäuremethylester zu. Nach 10 Minuten gibt man noch 44 g Z-NHNH2 in 100 ml Methylenchlorid zu und rührt 4 Stunden bei Zimmertemperatur weiter. Nach Auswaschen mit verdünnter Phosphorigersäure wird getrocknet und eingedampft. Nach Kristallisieren aus Petroläther erhält man BOC-Phe-NH NH-Z vom Smp. 117 [α]D20 = -5 in Dimethylformamid.
b) I-(N-tert.Butyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phenyl alanin)-2-benzyloxycarbonyl-hydrazid (BOC-Asn-Phe-NH-NH-Z)
Man löst 41 g BOC-Phe-NHNH-Z in 400 ml Trifluoressigsäure und lässt eine Stunde bei 200 stehen.
Beim Verdampfen der Trifluoressigsäure erhält man das H-Phe-NHNH-Z als kristallines Trifluoracetat vom Smp. 1910, [α]D20 = +26,40 in Dimethylformamid.
Diese Substanz wird zusammen mit 35 g BOC-Asn-ONP und 30 g N-Methylmorpholin in 200 mol Dimethylformamid gelöst. Nach 16 Stunden Stehen bei 200 wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand nacheinander mit Essigester und verdünnter Phosphorigersäure gewaschen. Man erhält BOC-Asn-Phe-NH-NH-Z vom Smp. 210 , [ijD20 = - 180 in Dimethylformamid.
c) 1-(N-tert.Butyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L -asparaginyl-L-phenylalanin)-2-binzyloxycarbonyl -hydrazid (BOC-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z)
Man löst 26 g BOC-Asn-Phe-NH-NH-Z in 200 ml Trifluoressigsäure auf und lässt 1 Stunde bei 200 stehen.
Nach Verdampfen des Lösungsmittels versetzt man in 100 ml Dimethylformamid mit 17 g BOC-Asn-ONP und 15 g N-Methvlrnorpholin. Nach 16 Stunden bei 200 wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand nacheinander mit Essigester und verdünnter Phosphoriger- säure gewaschen. Man erhält BOC-Asn-Asn-Phe-NH NH-Z; Smp. 240 . [α]D20 = 280 in Dimethylformamid.
d) 1-(N-tert.Butyloxycarbonyl-L-leucyl-L-asparaginyl -L-asparaginyl-L-phenylalanin)-2-benzyloxycarbonyl -hydrazid (BOC-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z)
Man löst 22 o BOC-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z in 150 ml Trifluoressigsäure und lässt 1 Stunde bei 200 stehen.
Nach Verdampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand mit 12 g BOC-Leu-ONP und 10g N-Methylmorpholin in 100ml Dimethylformamid versetzt. Nach 16 Stunden Stehenlassen bei 200 wird das Dimethvlformamid verdampft und der Rückstand nacheinander mit Essigester und verdünnter Phosphon.gersäu re gewaschen.
Man erhält BOC-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z vom Smp.
210 , [α]D22 = -34 in Dimethylformamid.
e) 1-(N-tert.Butyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-leucyl-L -asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenylalanin)-2-benzyl oxycarbonyl-hydrazin (BOC-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z)
Man löst 57 g BOC-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z in 300 ml Trifluoressiosäure und lässt eine Stunde bei 200 stehen. Nach Verdampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand in Äther kristallisiert. Man löst das Tetra peptid-trifluoracc-tat in 400 ml Dimethylformamid und versetzt die Lösung mit 27 g BOC-Asn-ONP und 25 g N-Methylmorpholin. Nach 16 Stunden Stehenlassen bei 200 wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand nacheinander mit Essigester und verdünnter Phosphorigersäure gewaschen.
Man erhält BOC-Asn-Leu Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z vom Smp. 250 (Zers.), [α]D20 = -34 in Dimethylformamid.
f) 1-(L-Asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl-L -asparaginyl-L-phenylalanin)-2-benzyloxycarbonyl -hydrazid # trifluoracetat (H-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z # Trifluoracetat)
Man löst 43.5 g BOC-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH NH-Z in 200 ml Trifluoressigsäure und lässt eine Stunde bei 200 stehen. Nach Eindampfen wird der Rückstand mit Hilfe von Äther kristallisiert. Man erhält H-Asn Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z Trifluoracetat; Smp. 2420, [α]D20=-22 in Dimethylformamid.
Teilsequenz E tert.Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl -L-tryptophanyl-L-arginin-hydrazid (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-NHNH. cH3COOH) a) N-tert.Butyloxycarbonyl-L-tryptophanyl -(guanido)N-nitro-L-argininmethylester [BOC-Trp-Arg(NO2)-OMe]
Man löst 35 g H-Arg(NO2)-OMe # HCl, 63 g BOC Trp-OCP und 14g N-Methylmorpholin in 300ml Dimethylformamid auf und lässt 16 Stunden bei 200 stehen.
Nach Verdampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand in Essigester aufgenommen und mit verdünnter Schwefelsäure gewaschen. Man engt etwas ein und fällt mit Äther aus. Dabei kristallisiert BOC-Trp-Arg(NO2)- OMe vom Smp. 1300. [alpha;]D20 = -22 in Dimethylformamid.
b) N- tert.Butyloxycarhortvl-L-tyrosyl-L- -tryptophanyl-(guanido)N-nitro-argininmethylester [BOC-Tyr-Trp-Arg(NO2)-OMe]
Man löst 15 g BOC-Trp-Arg(NO2)-OMe in 80 ml 5N methanolischer Salzsäurelösung auf und lässt 1 Stunde bei Zimmertemperatur stehen. Nach Verdampfen des Lösungsmittels und Behandeln mit Äther verbleiben 13 g H-Trp-Arg(NO2)-OMe als Hydrochlorid zurück; Smp. 1200, [D?O = 90 in Dimethylformamid. Dieses Dipeptid wird zusammen mit 14g BOC-Tyr-OCP und 8 g N-Methylmorpholin in 200ml Dimethylformamid gelöst. Nach 16 Stunden Stehen bei 200 wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand in Essigester aufgenommen.
Nach Waschen mit verdünnter Phosphorigersäure und Einengen des Lösungsmittels kann man mit Hilfe von Äther BOC-Tyr-Trp-Arg(NO2)-OMe isolieren; Smp. 130 , [α]D20 = -11 in dimethylformamid.
c) tert.Butyloxycarbonyl-L-alanyl-L-tyrosyl-L -tryptophanyl-(guanido)N-nitro-L-argininmethylester [BOC-Ala-Tyr-Trp-Arg(NO2)-OMe]
Man löst 13,5 g BOC-Tyr-Trp-ArgtNO2)-OMe in 130ml 5N methanolischer Salzsäurelösung auf, lässt 1 Stunde bei 250 stehen, dampft zur Trockne ein, wäscht den Rückstand mit Dimethyläther, filtriert ab, löst in 100 ml Dimethylformamid auf und versetzt mit 8,0 g BOC-Ala-OCP und 3,0 ml Triäthylamin. Nach 16 Stunden bei 250 gibt man 500ml Essigester hinzu. wäscht mit verdünnter Schwefelsäure und Kaliumbicarbonatlösung und dampft zur Trockne ein. Nach Waschen des Rückstandes mit Chloroform erhält man BOC-Ala-Tvr- Trp-Arg(NO2)-OMe; Smp. 120 (Zers.),[α]D20 = -12 in Dimethylformamid.
d) tert.Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-L-tyroxyl-L -tryptophanyl-guanido)N-nitro-L-argininmethylester [BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg(NO2)-OMe]
Man löst 12,3 g BOC-Ala-Tvr-Trp-Arg(NO2)-OMe in 100ml 5N methanolischer Salzsäure, lässt 1 Stunde bei 250 stehen, dampft zur Trockene ein, wäscht den Rückstand mit Diäthyläther, löst ihn in 100ml Dimethylformamid, versetzt mit 14 ml Triäthylamin und 8,5 g BOC-Ser-N2, lässt 16 Stunden bei 0 stehen, gibt 500 ml Essigester zu, wäscht nacheinander mit verdünnter Schwefelsäure und Ammoniumhydroxid, trocknet über Natriumsulfat und dampft das Lösungsmittel ab. Nach Waschen des Rückstandes mit Chloroform löst man ihn in Essigester und fällt durch Zugabe von Diäthyl äther.
Man erhält 13,5 g BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg (NO2)-OMe; Smp. 1350 (Zers.), [α]D20 = - 150 in Dimethylformamid.
e) tert.Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-L -tyrosyl-L-tryptophanyl-L-arginin-hydrazi # diacetat (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-NHNH2 # 2 CH3COOH)
Man löst 13,2 g von dem oben erhaltenen Pentapeptidester in 300 ml Essigsäure, gibt 60 ml Wasser und 13,2 g Palladium-Kohle (10%ig) zu und hydriert bis zum Ende der Wasserstoffaufnahme. Man filtriert, dampft ab, löst den Rückstand in Dimethylformamid auf, dampft wiederum ab, um die Spuren von Essigsäure zu beseitigen. Anschliessend löst man den Rückstand in 260 ml Methanol, versetzt mit 25 ml Hydrazinhydrat und lässt 16 Stunden bei 400 stehen. Nach Zugabe von 260 ml Diäthyläther filtriert man die ausgeschiedene kristalline Masse ab, wäscht mit Diäthyläther und trocknet im Hochvakuum über Schwefelsäure.
Man erhält BOC Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-NHNH3 2 CHFCOOH: Smp.
1820, [α]D20 = -8 in Dimethylformamid.
Teilsequenz F1
L-Threonyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-valyl-L-leucin [H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OHl a) H-Cys(Bz1)-Va1-Leu-OMe. HBr
Man löst 21,0 g Z-Cys(Bzl)-OCP und 12,3 g H-Val Leu-OMe . HCl in 120ml Dimethylformamid. Danach gibt man 5,9 ml Triäthylamin hinzu, lässt 16 Stunden bei 250 stehen, fügt Essigester hinzu, wäscht mit verdünnter Salzsäure, trocknet über Natriumsulfat. dampft zur Trockne ab und kristallisiert den Rückstand aus Essigsäureäthylester!Diäthyläther. Man erhält Z Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe, Smp. 1600, [α]D20 = 280 in Dimethylformamid, das man in 210 ml einer 40%igen Lösung von Bromwasserstoff in Eisessig löst.
Man lässt 1 Stunden bei 250 stehen, dampft zur Trockne ein und kristallisiert den Rückstand aus IsopropanollDiäthyl- äther um. Man erhält H-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe HBr, Smp. 1680, [α]D20 = + 140 in Dimethylformamid.
b) H-T/lr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe 1,3 HBr
Man löst 20 g Z-Thr-NHNH2 in 350 ml Dimethylformamid. kühlt auf 200, gibt 100 ml einer Lösung von 2N Salzsäure in Dioxan und anschliessend noch 10 ml tert.Butylnitrit zu. Nach 10 Minuten bei -20 werden 45 ml Triäthylamin und 25,5 g H-Cys(Bzl)-Val Leu-OMe HBr hinzugefügt und das erhaltene Gemisch während 16 Stunden bei 0 geschüttelt. Man dampft zur Trockne ein. löst den Rückstand in einem Gemisch von Essigsäureäthylester/Wasser, wäscht die organische Phase mit verdünnter Salzsäure, trocknet über Natriumsulfat, dampft ein und kristallisiert den Rückstand aus Essigester um. Man erhält Z-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu OMe: Smp. 2080, [α]D20 = 270 in Dimethylformamid.
Man löst 20 g von dem oben erhaltenen Tetrapeptid in 200 ml eines Gemisches von Trifluoressigsäure/Essigester (1:1) auf, leitet während 1 Stunde bei 0 einen Strom gasförmigen Bromwasserstoffs ein, dampft anschliessend ein und kristallisiert den Rückstand aus Methanol-Diäthyläther um. Man erhält H-Thr-Cys(Bzl) Val-Leu-OMe # 1,3 HBr; Smp. 202 , [α]D20 = -10 in Dimethylformamid.
c) H-TIir-Cys(BzI)- Val-Lew-OH
Man löst 372 g H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe 1,3 HBr in 1800 ml Methanol, gibt 900 ml 2N Natronlauge zu, lässt 1 Stunde bei 250 stehen, gibt 240ml Eisessig zu und lässt 2 Stunden bei 00 stehen. Man filtriert die ausgeschiedene kristalline Masse ab, wäscht diese zuerst mit 1N Essigsäure, anschliessend mit Wasser und trocknet bei 500 im Hochvakuum. Man erhält das H-Thr Cys(Bzl)-Val-Leu-OH. Smp. 2190, [α]D20 = 530 in 1N Ammoniak.
Teilsequenz F2 tert.Butyloxycarbonyl-S-benzyl-L-cysteinyl -L-seryl-L-asparaginyl-L-leucyl-L-serin-hydrazid [BOC-Cys(Szl)-Ser-Asn-Leu-Ser-NH-NH2] a) H-Asn-Leu-Ser-OMe # HCl
Man löst 43 g H-Leu-Ser-OMe HCI und 53 g BOC Asn-ONP in 400ml Dimethylformamid auf, gibt 22 ml Triäthylamin zu lässt 16 Stunden bei 250 stehen, dampft zur Trockne ein und kristallisiert den Rückstand aus Methanol um. Man erhält 51,6 g BOC-Asn-Leu-Ser OMe, Smp. 1900, [α]D20 = 240 in Dimethylformamid, das man in 500ml einer 4N Lösung von Salzsäure in Methanol löst. Man lässt 1 Stunde bei 250 stehen, dampft zur Trockne ein, löst den Rückstand in Methanol und fällt mit Diäthyläther.
Man erhält H Asn-Leu-Ser-OMe HCI: Smp. 1800, [x]D20 = -23n in Dimethylformamid.
b) H-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe # HCl
Man löst 39,5 g BOC-Ser-NHNH2 in 500 ml Dimethylformamid, kühlt auf - 200, gibt 200ml einer 2N Lösung von Salzsäure in Dioxan und anschliessend 20 ml tert.Butylnitrit zu. Nach 10 Minuten bei -20 werden 40 ml Triäthylamin und 38,0 g H-Asn-Leu-Ser-OMe HCl hinzugefügt, danach 16 Stunden bei 0 gerührt, zur Trockne eingedampft und der Rückstand aus Chloroform/Diäthyläther umkristallisiert. Man erhält BOC Ser-Asn-Leu-Ser-OMe, Smp. 1350, [ziD20 = 220 in Dimethylformamid, das man in 420ml einer 4N Salzsäurelösung in Methanol löst.
Man lässt 1 Stunde bei 250 stehen, dampft zur Trockne ein und kristallisiert aus Methanol/Essigsäureäthylester um. Man erhält H Ser-Asn-Leu-Ser-OMe HCl, Smp. 1550 (Zersetzung).
[α]D20 = -15 in Dimethylformamid.
c) BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser-NHNH2
Man löst 18,5 g H-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe HCl und 18.0 g BOC-Cys-Bzl)-ONP in 100 ml Dimethylformamid auf, gibt 10 ml Wasser, 3,5 ml Essigsäure und 5,6 ml Triäthylamin zu, Iässt 16 Stunden bei 250 stehen, dampft zur Trockne ein und kristallisiert aus Methanol um.
Man erhält 25,1 g BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe, Smp. 1820, [α]D20 = -17 in Dimethylformamid. das man unter leichtem Erwärmen in 200 ml Dimethylformamid löst. Man gibt 200ml Methanol und 20ml Hydrazinhydrat zu, lässt 16 Stunden bei 300 stehen, fällt mit Diäthyläther, wäscht den Niederschlag mit Diäthyl äther/Methanol (1:1) und trocknet das so erhaltene BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser-NHNH2, Smp. 224 , [α]D20 - - 130 in Dimethylformamid.
Teilsequenz F Äthoxycarbonyl-L-hemicystinyl-L-seryl-L -asparaginyl-L-leucyl-L-seryl-L-threonyl-L-hemicystinyl -L-valyl-L-leucin
EMI7.1
Man löst 18,4 g BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser NHNH2 (Teilsequenz F2) in 150 ml Dimethylformamid, kühlt auf 200, gibt 40 ml einer 2N Lösung von Salzsäure in Dioxan und 15 ml tert.Butylnitrit zu. Nach 10 Minuten bei - 200 gibt man noch 28 ml Triäthylamin und 16,2 g H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OH (Teilsequenz F1) zu und rühry 16 Stunden bei 25 . Danach wird filtriert, die Lösung eingedampft und der Rückstand mit 1N Essigsäure durchgewaschen. Man erhält BOC-Cys (Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OH. Smp.
217 , [α]D20 = -27 in Dimethylformamid.
Man löst das erhaltene Produkt in 5000 ml getrocknetem Ammoniak, gibt unter Rühren und Sieden des Ammoniaks Natriummetall bis zur tiefblauen Färbung zu. Zwecks Entfärbung wird Ammoniumchlorid hinzugefügt. Man dampft zur Trockne ein und wäscht den Rückstand mit 1N Essigsäure und Aceton durch. Nach Trocknen erhält man BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr Cys-Val-Leu-OH, Smp. 2480 (Zers.), [α]D20 = 410 in DimethylformamidlWasser (3 1).
Man löst das so erhaltene Nonapeptid in 5000ml 0.01N Ammoniak auf, gibt unter Rühren IN Wasserstoffperoxyd bis zur negativen Nitroprussiatreaktion zu.
dann noch 200 ml Eisessig, filtriert und lyophilisiert.
Man erhält
EMI7.2
OH. Smp. 2380 (Zers.), [1D2O = - 180 in Dimethyl formamid/Wasser (3 1), dass man in 300 ml Trifluoressigsäure löst, lässt 30 Minuten bei 250 stehen, dampft ab, wäscht den Rückstand mit Essigester und löst ihn in 300 ml Dimethylformamid auf. Zu dieser Lösung gibt man 30g Kohlensäure-p-nitrophenyl-äthylester der wie nachstehend beschrieben hergestellt ist-. sowie 14 ml Triäthylamin, lässt 16 Stunden bei 250 stehen, dampft ab und wäscht den Rückstand mit Chloroform.
Man löst in 300 ml Dimethylformamid, gibt 50 ml Wasser und 50g DOWEX-50 hinzu, rührt 15 Minuten, filtriert, wäscht den Harz mit Dimethylformamid und dampft das Filtrat zur Trockne ein. Man wäscht den Rückstand zuerst mit Chloroform und anschliessend mit Essigester und trocknet. Man erhält das
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EMI7.4
Smp. 2630, [α]D20 = 210 in Dimethylformamid/Wasser (3 1).
Kohlensäure-p-nitrophenyl-äthylester
Man löst 200g p-Nitrophenol und 113 ml Pyridin in 1200 ml Essigester, kühlt auf 00, gibt unter Rühren 156 ml Chlorameisensäureäthylester zu, rührt noch 30 Minuten bei 00, wäscht mit Wasser, trocknet über Na2SO4 und dampft zur Trockne ein. Man löst den Rückstand in Diäthyläther und kristallisiert den Kohlensäuro-p-nitrophenvl-äthvlester durch Zugabe von Petroläther, Smp. 650.
Teilsequenz ABC
Nim-Trityl-L-histidyl-L-arginyl-L-phenylalanyl-L-seryl -glycyl-L-iiietliionyl-glycyl-L-ph enyialanyl-glycyl-L- -prolyl-L-glutamyl-L-threonyl-L-prolinamid # triacetat [H-His(Trt)-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 # 3 CH3CO2H) a) L-Seryl-glycyl-L-methionyl-glycyl-L-phenylalanyl -glycyl-L-prolyl-L-glutamyl-L-threonyl-L-prolin amid # Hydrochlorid (H-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly
Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 # HCl)
Man löst 6,7 g BOC-Ser-Gly-Met-Gly-OH (Teilsequenz B), 12 g H-Phe-Gly-Pro-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2 (Teilsequenz A) und 2,1 g Hydroxysuccinimid in 50ml Dimethylformamid und 20 ml Acetonitril auf.
kühlt auf 00, gibt 4,0g Dicyclohexylcarbodiimid hinzu und lässt 16 Stunden bei 0 stehen. Man dampft das Lösungsmittel ab, wäscht den Rückstand mit Wasser, Diäthyl äther und Essigester und kristallisiert aus Chloroform um. Man erhält BOC-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2, Smp. 121 (Zers.), [α]D20 = 470 in Dimethylformamid, das man in 250ml einer Lösung von 8N Chlorwasserstoff in Dioxan löst. Man rührt während 2 Stunden bei 250. dampft zur Trockne ein und verarbeitet den Rückstand in Diäthyläther.
Man erhält H-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr Pro-NH2 HCI [Smp. 1300 (Zers.). [α]D20 = 480 in Dimethylformamid].
b) Nim-Trityl-L-histidyl-L-arginyl-L-phenylalanyl-L -seryl-glycyl-L-methionyl-glycyl-L-phenylalanyl-gly cyl-L-prolyl-L-glutamyl-L-threonyl-L-prolinamid .
triacetat [H-His(Trt)-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 # 3 CH3COOH]
Man löst 9.9 ° Trt-His(Trt)-Arg-Phe-NHNH2 HCI (Teilsequenz C) in 100 ml Dimethylformamid, kühlt auf 200, gibt 15 ml Dioxan/HCl 2N und anschliessend 1.16 ml tert.Butylnitrit zu, rührt 10 Minuten bei -200, gibt 28 ml Triäthylamin und 10,0 g H-Ser-Gly-Met-Gly Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 # HCl zu, rührt 4 Stunden bei 00, filtriert und dampft zur Trockne ein.
Man löst den Rückstand in einem Gemisch von Essigester/ Methanol (8 : 2) auf, wäscht mit verdünntem Ammoniak und anschliessend mit Wasser bis zur Neutralität. trocknet über Natriumsulfat. konzentriert auf 100 ml und fällt durch Zugabe von Diäthyläther. Man löst den Niederschlag wiederum in Dimethylformamid auf und fällt durch Zugabe von Diäthyläther. Man erhält Trt His(Trt) - Arg - Phe - Ser - Gly - Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu Thr-Pro-NH2 [Smp. 168 (Zers.), [α]D20 = -43 in Dimethylformamidi, das man in 500 ml Essigsäure/Wasser (8 : 2) löst. Man lässt 3 Stunden bei 400 stehen, dampft ein. wäscht den Rückstand in Diäthyläther und trocknet im Hochvakuum über KOH-Spänen.
Man erhält H-His(Trt)-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro Glu-Thr-Pro-NH2 # 3 CH2COOH, Smp. 182 (Zers.), [α]D20 = -56 in Essigsäure.
Teilsequenz DE
N-tert.Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrrosyl -L-tryptophanyl-L-arginyl-L-asparaginyl-L-leucyl-L -asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenylalanin-hydrazid.
diacetat (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn.
Leu-Asn-Asn-Phe-NHNH. 2 CH,COOH) a) 1-(N-tert.Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-L -tyrosinyl-L-tryprophanyl-L-arginyl-L-asparaginyl -L-leucyl-L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenyl alanin)-2-benzyloxycarbonyl-hydrazid # diacetat (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe
NH-NH-Z 2 CH3COOH)
Man kühlt 320 ml Dimethylformamid auf - 200C.
gibt 100 ml 2N Chlorwasserstoff in Dioxan zu und löst darin 68 g BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-NHNH acetat (Teilsequenz E). Anschliessend versetzt man mit 12 mol tert.Butylnitrit, lässt 10 Minuten bei -20 rühren und tropft 35 ml Triäthylamin zu. Das so erhaltene Gemisch wird mit einer Lösung, entstanden aus 8,8 g H-Asn-Leu Asn-Asn-Phe-NHNH-Z Trifluoracetat (Teilsequenz D) und 17 ml Triäthylamin in 150 ml Dimethylformamid vereinigt. Nach 16 Stunden Stehenlassen bei 0 wird eingedampft. Man löst den Rückstand in Essigester/ Butanol und wäscht mit verdünnter Essigsäure und Ammoniaklösung.
Nach Eindampfen des Lösungsmittels verbleibt das BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn- Asn-Phe-NHNH-Z 2 CH3COOH vom Smp. 1750, [α]D20 = -19,5 in Dimethylformamid.
b) tert.Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl -L-tryptophanyl-L-arginyl-L-asparaginyl-L-leucyl-L -asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenylalanin-hydrazid .
diacetat (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn Leu-Asn-Asn-Phe-NHNH- 2 CH3COOH)
Man löst 90 g BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu- Asn-Asn-Phe-NHNH-Z 2 CH3COOH in 500 ml Dimethylformamid und hydriert mit 10 g PdlC (10%ig) bis zum Ende der Wasserstoffaufnahme. Nach Abfiltrieren des Katalysators wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand aus einem Gemisch von Äther und Äthanol kristallisiert. Man erhält BOC-Ser Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NHNH 2 CH3COOH vom Smp. 2650. [α]D20 = = 570 in Dime thylformamid.
Tellseqiienz A BCDE
L-Seryl-L-alanyl-L-tyrosyl-L-tryptophanyl-L-arginyl -L-asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl-L-asparaginyl-L -pllenylatan.yl-L-histidyl-L-arginyl-L-pllenylalanvl- -L-seryl-glycyl-L-methionyl-glycyl-L-phenylalanyl -glycyl-L-prolyl-L-glutamyl-L-threonyl-L-prolinamid .
hexatrifluoracetat (H-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn
Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH@. 6 CF3CO2H)
Man löst 15.2 g BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu Asn-Asn-Phe-NHNH2 diacetat (Teilsequenzen D. E) in 200 ml Dimethylformamid. kühlt auf -20. gibt 15 ml Dioxan/HCl 2N und anschliessend 1,16 ml tert.Butylnitrit zu und rührt 10 Minuten bei 200. Man gibt 14 ml Triäthylamin und eine Lösung von 15,6 g des in Teilsequenz A. B, C erhaltenen Tridecapeptidacetats zu, rührt das erhaltene Gemisch 16 Stunden bei 0t, filtriert und dampft zur Trockne ein.
Man wäscht den Rückstand mit Diäthyläther und mit Chloroform, löst in Dioxan/Wasser (8:2). behandelt die erhaltene Lösung mit 100 ml Amberlit-IRA-410 (Acetat-Form), dampft ein und kristallisiert den Rückstand aus Isopropanol/ Wasser um. Man erhält das BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg Asn - Leu - Asn - Asn-Phe-His(Trt)-Arg-Phe-Ser-Gly-Met- Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 Acetat, Smp. 1450 (Zers.), [α]D20 = -67 in Essigsäure, das man unter Stickstoffatmosphäre in 500 ml Trifluoressigsäure löst.
Man lässt 1 Stunde bei 250 stehen, konzentriert auf 100 ml und fällt durch Zugabe von 1000 ml Diäthyl äther. Man filtriert, löst den Rückstand in Dimethylformamid und fällt mit Diäthyläther. Nach Trocknen über KOH-Spänen erhält man das H-Ser-Ala-Tyr-Trp Arg - Asn - Leu - Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met- Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 # 6 CF3CO2H, Smp.
1300 (Zers.), [α]D20 = -42 in Essigsäure.
Beispiel I Äthoxycarbonyl-L-hemicystinyl-L-seryl-L-asparaginyl -L-leucyl-L-seryl-L-threonyl-L-heniivstinyl-L-valyl-L- -leucyl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl-L-tryptophanyl-L -arginyl-L-asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl-L -asparaginyl-L-phenylalanyl-L-histidyl-L-arginyl-L -phenylalanyl-L-seryl-glycyl-L-methionyl-glycyl-L -phenylalanyl-glycyl-L-prolyl-L-glutamyl-L-threonyl -L-prolinamid # Hexaacetat # Octahydrat
EMI8.1
Ser-Ala-Tyr-Try-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg
Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro NHo Hexaacetat zu Octahydrat
Man löst 1.0 g Nonapeptid (Teilsequenz F) in 10 ml Dimethylformamid. gibt 1,5 g N-Hydroxysuccinimid und 0,52 g Dicyclohexylcarbodiimid zu. rührt 6 Stunden bei 250, filtriert und dampft das Filtrat zur Trockne ein.
Man wäscht den Rückstand mit Essioester und Diäthvl äther und trocknet. Man erhält
EMI8.2
EMI8.3
Smp. 2420 das man in 19 ml Dimethylformamid löst. Zu dieser Lösung gibt man 3,1 g Tricosapeptid-Hexatrifluoracetat (Teilsequenz A, B, C, D, E) 0,4 ml Triäthylamin sowie 1.2 g N-Hydroxysuccin- imid und rührt 16 Stunden bei 250. Man dampft zur Trockne ein, wäscht den Rückstand mit Diäthyläther, Chloroform und Aceton. So erhält man das rohe. geschützte Dotriacontapeptid. das man in 100 ml 0,3 Essigsäure löst, mit 20 ml Amberlit-IRA-410 (Acetat) behandelt und gibt 50 ml 0.6 N Ammoniumhydroxid hinzu.
Man stellt das pH auf 6.5 ein und schichtet die erhaltene Lösung auf eine Carboxymethylcellulosesäule (10
X 100 cm), die mit einer 0,15N Ammoniumacetatpufferlösung equilibiert wurde. Die Elution wird mit einem steigenden Konzentrations- und pH-Gradient (0,15 N auf 0,4 N; pH 6.5 auf pH 7.0) eines Ammoniumacetatpuffers durchgeführt. Die vereinigten Fraktionen. die das reine Peptid enthalten. werden dreimal gefriergetrocknet, der Rückstand wird mit Äthanol und anschliessend mit Diäthyläther gewaschen und über Kaliumhydroxid im Hochvakuum getrocknet. Man erhält EOC
EMI8.4
Arg - Asn - Leu - Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met- Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 # 6CH3CO2H 8 H2O, Smp. 240 (Zers.). [α]D20 = -56 in Essigsäure IN.
Aminosäurezusammensetzung nach Säurehydrolyse (6N, 16 Stunden): Ala1.1, Arg ,., AsP3.@, Cvs/9,..
Gly3.0, His1.1, Leu2.@, Met1,0, Phe3.0, Pro@.@, Ser@.@, Thr1.0, Val0.9 (Trp1.0 durch Spektrophotometrie).
Process for the production of previously unknown polypeptide derivatives
The present invention relates to a process for the preparation of previously unknown polypeptide derivatives of the general formula
EMI1.1
10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg.
22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32
Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH: where R is an alkyl, alkenyl. optionally substituted aralkyl or an optionally substituted aryl group.
their therapeutically effective acid addition salts and heavy metal complexes. As R, for example, ethyl, allyl, phenyl, p-nitrophenyl, p-Chlorphe nyl, p-bromophenyl come. p-methoxyphenyl, azobenzene or the p-methoxy-azobenzene radical in question.
The polypeptide derivatives according to the invention are distinguished by their resistance to the degrading action of aminopeptidases.
The previously unknown polypeptide derivatives can be prepared by methods generally known for the synthesis of compounds of this type, the amino acids being linked to one another individually in the order specified in the above formula or after prior formation of smaller peptide units, by adding corresponding compounds necessary for their construction Formation of CONH bonds condensed with one another in any chronological order.
wherein free functional groups not participating in the reaction are intermediately protected by suitable protective groups, at any point in time
0 of the synthesis while maintaining the R-CH ..- OC group in position 1. where R has the above meaning, splits off the protective groups, the mercapto groups after formation of the partial sequence 1 to 7 and before incorporation of the partial sequence containing a methionyl group to the disulfide oxidized and the carboxyl group of the terminal Prolylrestes converted into the amide group. The introduction of the group of the general formula desired in the end product on the terminal L-hemicystine molecule
EMI1.2
in which R has the above meaning, can take place in any stage before the last stage.
In the last stage, however, methods are to be used in which racemization does not occur or can be kept low. preferably the azide or the activated ester method. wherein N-Hydroxysuccinimid is preferably used for activation. The benzyl radicals used to protect the SH groups in the synthesis of cysteine-containing peptides are usually split off at the end of the synthesis by treatment with sodium in liquid ammonia.
It has now been found. that the splitting off of the benzyl protective groups and the production of the (Cys) S S (Cys) bond before the last stage lead to particularly good yields of the end product.
In the construction of the new polypeptide derivatives, the tert-butyloxy group has proven useful for blocking the # -carboxy group, for example in the partial sequence A described below, but other protective groups, such as methoxy, ethoxy, tert. Amyloxy, can also be used -, the amide or the benzyl group can be used.
The triphenylmethyl group has proven useful for blocking the imidazole group of the histidine residue in the partial sequence C described below, but other suitable protective groups, such as the carbo-tert-butoxy-. the carbo-tert-amyloxy-. the carbobenzoxy or benzyl groups can be used.
The nitro group was used to block the guanidoamppe of the arginine residue in the partial sequence E described below. however, other suitable protecting groups can also be used. such as the tosyl group, the p-nitrobenzoxycaronyl group or the 2- (isopropyloxycarbonyl) -3.4.5.6-tetrachlorobenzoyl group can be used. One can also use the protective effect of the protonization of the guanido group in the synthesis.
The new polypeptide derivatives can also be obtained or used in the form of their salts. The salts used are those with organic acids. such as acetic acid, propionic acid, glycolic acid. Lactic acid. Pyruvic acid, malonic acid, succinic acid, maleic acid. Fumaric acid, tartaric acid. Citric acid, benzoic acid. Cinnamic acid, salicylic acid, 2-phenoxy- or 2-acetoxybenzoic acid, mandelic acid, methanesulphonic acid. Ethanesulfonic acid, hydroxyethanesulfonic acid, benzene or toluenesulfonic acid, naphthalenesulfonic acid, sulfanilic acid and polymeric acids such as tannic acid. Alginic acid. Polygalacturonic acid, polyphloretin phosphate or carbocymethyl cellulose and salts with inorganic acids. like hydrohalic acid. e.g.
Hydrochloric acid or hydrobromic acid, nitric acid, thiocyanic acid, sulfuric acid and phosphoric acid in question. The heavy metal complexes include, for example. those from zinc in question.
The starting products for the production of the new polypeptide derivatives can, if they were not previously known, be obtained by the methods known for peptide chemistry, the amino acids being linked to one another individually or after prior formation of smaller peptide units.
The new compounds represent an important therapeutic principle that lowers the calcium plasma level, in particular the increased calcium plasma level and, as an antagonist of the parathyroid hormone, causes a positive calcium balance in the bones.
It is thus indicated in all conditions in which a lowering of the plasma calcium level is desired, e.g. Hypercalcaemia of various origins. Deficiency of endogenous thyroid gland due to the loss of thyroid tissue, hyperfunction of the parathyroid glands.
The new compounds are indicated for all bone affections that are based on increased breakdown or in which increased calcium fixation in the bone is desired, e.g. Osteoporosis of various origins (e.g. post-climacteric, post-traumatic, caused by corticosteroid therapy or inactivity, etc.), fractures, osteomalacia, rickets and especially for combination therapy with calcium or
Phosphate.
The biological testing of the new compounds showed an effectiveness of approx. 100 to 450 MRC units / mg peptide. The required daily dose (i.m.
administered) in MRC units is 20 mU to 10 U, preferably 100 mU / kg animal weight.
In humans, the daily dose (administered IM) in MRC units is 1 to 500 U. A daily dose of 5 U IM is preferably used. administered.
The new compounds can be used as remedies. e.g.
in the form of pharmaceutical preparations, use. These contain the compounds mentioned in a mixture with an organic or inorganic carrier material suitable for parenteral administration.
Such substances come into question for the same. which do not react with the new connection, e.g. Gelatin.
Milk sugar, starch, magnesium stearate, talc, vegetable oils, benzyl alcohol, gum arabic, polyalkylene glycols, petrolatum, cholesterol or other known drug carriers.
The pharmaceutical preparations can e.g. in liquid form as solutions, suspensions or emulsions. If necessary, they are sterilized and / or contain auxiliaries, such as preservatives.
Stabilizers, wetting agents or emulsifying agents. They can also contain other therapeutically valuable substances. The new compounds can also be administered in the form of depot preparations,
The new compounds and their salts can also be used as intermediates for the production of pharmaceutical preparations.
The following abbreviations are used:
Z = carbobenzoxy
Bzl = benzyl
EOC = ethoxycarbonyl
BOC = tert-butyloxycarbonyl
Trt = trityl = triphenylmethyl
OTB = tert-butyloxy
ONP = p-nitrophenyl ester
OCP = 2,4,5-trichlorophenoxy
OSu = oxysuccinimide
OMe = methoxy
OEt = ethoxy NO. = Nitro
Ser = L-seryl
Asn = L-asparaginyl
Leu = L-leucyl
Thr = L-threonyl
Val = L-valyl
Ala = L-alanyl
Tyr = L-tyrosyl
Trp = L-tryptophanyl
Arg = L-arginyl
Phe = L-phenylalanyl
Glu = L-glutamyl
His = L-histidyl
Pro = L-prolyl
Gly = glycyl
Met = L-methionyl
Cys = L-cysteinyl
In the following examples, which illustrate the implementation of the process but are not intended to restrict the scope of the invention in any way, all temperatures are given in degrees Celsius.
Partial sequence A L-phenylalanyl-glycyl-L-prolyl-γ-tert.butyloxy-L-glutamyl-L-threonyl-L-prolinamide [H-Phe-Gly-Pro-Glu (OTB) -Thr-Pro-NH .]
One dissolves at -5 134 g of Z-Thr-NH-NH. in 2 liters of IN hydrochloric acid and mixed with 0.55 liters of IN sodium nitrite. After 5 minutes, potassium carbonate is added to pH 9. the resulting azide extracted with ethyl acetate and a solution of 80 g of H-Pro-NH. . hydrochloride in 100 ml of water. 500 ml of dimethylformamide and 77 ml of triethylamine were added. The ethyl acetate is evaporated at 20 in vacuo and left to stand at 250 overnight.
The remaining solution is evaporated in vacuo. the residue dissolved in ethyl acetate. the solution with water. diluted hydrochloric acid and an aqueous calcium carbonate solution and dried over sodium sulfate. It is evaporated in vacuo.
Dissolves in warm ethyl acetate and cools. Z-Thr-Pro-NH2 is obtained: m.p. 148 [α] D20 = -72 in 95% acetic acid. 90 g of Z-Thr-Pro-NH2 are then dissolved in 2 liters of dioxane and 260 ml of 1N hydrochloric acid and hydrogenated at 200 and normal pressure in the presence of a palladium catalyst. It is filtered off and the solution is evaporated in vacuo. the residue was washed with ethyl acetate and obtained H-Thr-Pro-NH: HCl; M.p. 2160, [z] D20 = -640 in 95% acetic acid. This is in 500 ml of dimethylformamide. Dissolved 50 ml of water and 32 ml of triethylamine and added 118g of Z-Glu (OTB) -OCP and 800 mol of tetrahydrofuran.
The mixture is left to stand at 200 overnight, evaporated in vacuo and the residue is crystallized with ethyl ether. Z-Glu (OTB) Thr-Pro-NH2, melting point 65 (decomp.) Is obtained. [α] 20 D = -18 in dimethylformamide.
80 e ZGlu (OTB) -Thr-Pro-N'H are dissolved. in 1.5 liters of dioxane and 200 ml of water and hydrogenated at 20 and normal pressure in the presence of a palladium catalyst.
The solution is filtered and evaporated in vacuo and diethyl ether is added to the residue. to obtain H Glu (OTB) -Thr-Pro-NH2; M.p. 650 (dec.).
[α] 20 D = -28 in dimethylformamide.
This is dissolved at 0 in 700 ml of dimethylformamide. 200 ml acetonitrile. 68 g of Z-Phe-Gly-Pro-OH. 18 g of N-hydroxysuccinimide and 32 g of dicyclohexylcarbodiimide added, left to stand at 200 overnight. filtered, evaporated in vacuo and treated with ethyl acetate.
The solution is then washed with water. dilute hydrochloric acid and aqueous potassium carbonate solution, dried over sodium sulfate. evaporated in vacuo and the residue crystallized from ethyl acetate / ethyl ether. Z-Phe-Gly-Pro-Glu (OTB) -Thr Pro-NH2 m.p. 120 (dec.), [Α] D20 = -66 in dimethylformamide is obtained. which is dissolved in 1500 ml of dioxane and 300 ml of water. Nian adds 30 g of palladium carbon (10%) and hydrogenates until the hydrogen uptake has ceased. Filter. the filtrate evaporates and the residue crystallizes from dioxane. The H-Phe-Gly-Prn-Glu (OTB) -Thr-Pro-NH2 is obtained; M.p. 1535. [z.] "" = -79 in dimethylformamide.
Partial sequence B
N-tert. Butyloxycurbonyl-L-seryl-glycyl-L-methionyl -glycine (BOC-Ser-Gly-Met-Gly-OH) a) L-methionyl-glycine-ethyl ester hydrochloride (H-Met-Gly-OEt.HCl)
65 g of BOC-Met-OH are dissolved in 900 ml of chloroform.
cools to -10. add 30 ml of N-methylmorpholine and 35.6 g of isobutyl chloroformate. After 10 minutes, a solution of 30 g of glycine ethyl ester in 200 ml of chloroform is slowly added and the reaction is allowed to take place at 200 for one hour. Extract with 0.5N ammonium hydroxide. then with 0.2N sulfuric acid. Washed neutral with water, dried over sodium sulfate and concentrated. After recrystallization from petroleum ether, BOC-Met-Glv-OEt is obtained; M.p. 490, [α] 20 D = -190 in ethanol. It is dissolved in 750 ml of 4N HCl / ethanol and left to stand at 250 for 1 hour. evaporated, the residue was washed with diethyl ether and dried to constant weight.
The H-Met-Gly-OEt HCI is obtained in the form of an oil.
b) N-tert-butyloxycarbonyl-L-seryl-glycine-ethyl ester (BOC-Ser-Gly-OEt)
12.5 g of N-tert-butyloxycarbonyl-serine are dissolved in 100 ml of chloroform and 6.1 g of N-methylmorpholine are added: 8.2 g of isobutyl chloroformate are then added dropwise. After 10 minutes, a solution of 6.6 g of glycine ethyl ester in 50 ml of chloroform is added and the mixture is stirred at room temperature for 1 hour. The reaction mixture is made with dilute ammonia. then washed with hydrochloric acid solution, dried over sodium sulfate and the organic phase evaporated. BOC-Ser-Gly-OEt is obtained as an oil; [α] 20 D = 30 in dimethylformamide.
C) N-tert-butyloxycarbonyl-L-seryl-glycine-hydrazide (BOC-Ser-Gly-NHNH2)
19.4 g of BOC-Ser-Glv-OEt are dissolved in 270 mol of ethyl alcohol, 48.6 ml of hydrazine hydrate are added and the mixture is left to stand for 2 days at room temperature. The solution is then evaporated and the residue is crystallized from a methyl alcohol / ethyl ether mixture (1: 3). BOC-Ser-Gly-NHNH2, melting point 157 is obtained. [α] D20 = -5 in dimethylformamide.
d) N-tert-butyloxycarbonyl-L-seryl-glycyl-L-methionyl -glycine ethyl ester (BOC-Ser-Gly-Met-Gly-OEt)
25 ml of a 4N hydrogen chloride solution in ether are added to 200 ml of dimethylformamide, and 11 g of BOC-Ser-Gly-NHNH .. are dissolved in it at -100. Subsequently, 5.4 ml of tert-butyl nitrite are added dropwise at -100, first 18 ml of triethylamine and then a solution of 12 g of H-Met-Gly-OEt HCl in 100 ml of dimethylformamide and 6.2 ml of triethylamine are added.
It is stirred for 3 hours at room temperature. filtered after 12 hours and evaporated. The residue is dissolved in chloroform and washed successively with dilute ammonia and hydrochloric acid solutions. dries over sodium sulfate and evaporates. BOC-Ser-Gly Met-Gly-OEt is obtained. [α] 20 D = = 14 in dimethylformamide.
e) tert-butyloxycarbonyl-L-seryl-glycyl-L-methionyl -glycine (BOC-Ser-Gly-Met-Gly-OH)
24 g of BOC-Ser-Gly-Met-Gly-OEt are dissolved in 250 ml of dioxane, 75 ml of IN sodium hydroxide solution are added, the mixture is stirred at 250 ml for 1 hour, treated with 150 ml of Dowex-50 (H form), filtered, and evaporated the filtrate and the residue crystallized from ethyl acetate / diethyl ether. You get
BOC-Ser-Gly-Met-Gly-OH, m.p. 87 (dec.). [α] 20 D = -170 in dimethylformamide.
Partial sequence C
Na'Nimid. Ditrityl-L-histidyl-L-arginyl-L-phenylalanine hydrazide # HCl [(Trt) -His (Trt) -Arg-Phe-NH-NH2 # HCl] a) Z-Arg (NO2) -Phe-OMe
51.8 g of H-Phe-OMe HC1 are dissolved in 1 liter of ether and approx. 50 ml of ice water, and sufficient sodium carbonate is added while stirring and cooling. until all the water has set. It is filtered and the filtrate is evaporated to constant weight, a colorless oil being obtained.
67.6 g of Z-Arg (NO2) -OH are dissolved in 300 ml of acetonitrile and 150 ml of dimethylformamide, and 41.2 g of H-Phe-OMe are added. It is then cooled to 200 and a solution of 43.4 g of dicyclohexylcarbodiimide in 100 ml of acetonitrile is added. The whole thing is left in the ice box for 4 hours while shaking from time to time. The resulting precipitate is filtered off and the filtrate is evaporated. The evaporation residue is dissolved in 1 liter of ethyl acetate and then washed in the cold with 1N sodium hydroxide solution, water, 1N sulfuric acid, water and saturated sodium chloride solution.
The ethyl acetate phase, dried over sodium sulfate, is evaporated completely. After recrystallization from ethyl acetate / petroleum ether, Z-Arg (NO2) Phe-OMe is obtained; M.p. 131-133, [α] D20 = - 7 in methanol, -4 in dimethylformamide.
b) H-Arg (NO2) -Phe-OMe # 0.5H2O # HBr
20 g of Z-Arg (N &) -Phe-OMe are dissolved in 50 ml of glacial acetic acid, and 50 ml of 40% hydrobromic acid in glacial acetic acid are added with slight cooling. Then the whole thing is left to stand at 200 for 1 hour with occasional shaking. After complete evaporation, the residue is dissolved in 200 ml of water and washed twice with ether. The aqueous phase is completely evaporated and the residue is recrystallized from methanol / ether. M.p. 165-1670 with decomposition, [α] D20 = = 180 in methanol. + 140 in dimethylformamide.
c) Z-His (Z) -Arg (NO2) -Phe-OMe
46.1 g of H-Arg (NO2) -Phe-OMe # 0.5 H2O # 1.2 HBr are dissolved in 100 ml of water, then heated and then cooled. After adding chloroform and ice, the pH is adjusted to 9 with ammonia. The chloroform phase is washed once more with water, then dried over sodium carbonate and filtered. A solution of 44.5 g of Z-His (Z) -OH, 12.1 g of hydroxysuccinimide in 200 ml of acetonitrile and 100 ml of pyridine is added to the filtrate, then the whole is cooled to -200 and with a solution of 21.1 g Dicyclohexylcarbodiimide in 70 ml of acetonitrile was added. The mixture is then left to stand for 4 hours in the ice chest with occasional stirring. The resulting precipitate is filtered off and the filtrate is evaporated.
The residue is taken up in ethyl acetate and then washed as follows: 10% potassium carbonate solution (pH # 10), water, saturated saline solution. Water. saturated saline solution.
Sulfuric acid (pH 3), water, saline solution. The ethyl acetate phase, dried over sodium sulfate, is evaporated completely, a light beige foam being obtained. This foam is dissolved twice in a little methanol and precipitated with ether. The ether phases are decanted off and the precipitate is dried; one obtains Z-His (Z) -Arg (NO2) -Phe-OMe (amorphous foam), [α] D20 = -8 in methanol, -8 in dimethylformamide.
d) H-His-Arg-Phe-OMe 4 HCI
25 g of Z-His (Z) -Arg (NO2) -Phe-OMe are dissolved in 800 ml of glacial acetic acid. Then 10 g of 10% palladium on activated charcoal are stirred in 200 ml of 1N hydrochloric acid and added to the solution. The whole is subjected to a 2 hour hydrogenation and then the catalyst is filtered off. The filtrate is again mixed with 5 g of 10% palladium on activated charcoal in water and subjected to the hydrogenation, which is complete after 51/2 hours. About 80% of the theoretical amount of hydrogen is consumed here. The catalyst is filtered off and the filtrate is evaporated completely, with H-His Arg-Phe-OMe. 4 4 HCl is obtained in the form of an amorphous foam.
e) Trt-His (Trt) -Arg-Plze-OMe. HCI
21.5 g of H-His-Arg-Phe-OMe. 4 HCl are dissolved in 100 ml of pyridine and approx. 100 ml of dimethylformamide. At about + 50, triethylamine is added to pH 9, and a solution of 29 g of trityl chloride in 300 ml of pyridine is then added dropwise over the course of 5 minutes. After the addition is complete, the pH is checked from time to time and, if necessary, adjusted to approx. PH 9 with triethylamine. The whole is evaporated after about 4 hours, the residue is taken up in chloroform and water and adjusted to pH 4 with the addition of a little 1N hydrochloric acid. The chloroform phase is separated off, washed twice with water, dried over sodium sulfate and completely evaporated.
Ether is added to the residue and the ether is then filtered off, Trt-His (Trt) -Arg-Phe-OMe. HCl is obtained.
f) Trt-His (Trt) -Arg-Phe-NH-NH2 # HCl
17 g of Trt-His (Trt) -Arg-Phe-OMe # HCl are dissolved in 200 ml of methanol, and 40 ml of hydrazine hydrate are added. It is then left to stand for 2 days at room temperature. One evaporates. Dissolve the residue in chloroform and wash twice with water. The chloroform phase is dried over sodium sulfate and evaporated. The residue is then washed with ether and filtered off; it consists of Trt-His (Trt) -Arg Phe-NH-NH. @ HCI, m.p. 1580. [α] D18 = 90 in dimethylformamide.
Partial sequence D
1- (H-asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenylalanine) -2-benzyloxycarbonyl-hydrazine # trifluoroacetate (H-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z # CF3COOH) a) I - (N-tert.Bl l tloxl carhonyl-L- / henw .Te (lanyl) -2-benzyloxycarbonyl-hydrazide (BOC-Phe-NH-NH-Z)
72 g of BOC-Phe-OH and 28 g of N-methyl are dissolved.
morpholine in 500 ml of mithylene chloride and 26 ml of methyl chloroformate are added dropwise at -5. After 10 minutes, 44 g of Z-NHNH2 in 100 ml of methylene chloride are added and the mixture is stirred for a further 4 hours at room temperature. After washing with dilute phosphoric acid, it is dried and evaporated. After crystallization from petroleum ether, BOC-Phe-NH-NH-Z is obtained with a melting point of 117 [α] D20 = -5 in dimethylformamide.
b) I- (N-tert-butyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phenyl alanine) -2-benzyloxycarbonyl-hydrazide (BOC-Asn-Phe-NH-NH-Z)
41 g of BOC-Phe-NHNH-Z are dissolved in 400 ml of trifluoroacetic acid and left to stand at 200 for one hour.
On evaporation of the trifluoroacetic acid, the H-Phe-NHNH-Z is obtained as crystalline trifluoroacetate of m.p. 1910, [α] D20 = +26.40 in dimethylformamide.
This substance is dissolved in 200 mol of dimethylformamide together with 35 g of BOC-Asn-ONP and 30 g of N-methylmorpholine. After 16 hours of standing at 200, the solvent is evaporated and the residue is washed successively with ethyl acetate and dilute phosphoric acid. BOC-Asn-Phe-NH-NH-Z of melting point 210, [ijD20 = -180 in dimethylformamide is obtained.
c) 1- (N-tert-butyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L -asparaginyl-L-phenylalanine) -2-binzyloxycarbonyl-hydrazide (BOC-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z)
26 g of BOC-Asn-Phe-NH-NH-Z are dissolved in 200 ml of trifluoroacetic acid and left to stand at 200 for 1 hour.
After evaporation of the solvent, 17 g of BOC-Asn-ONP and 15 g of N-methylmorpholine are added to 100 ml of dimethylformamide. After 16 hours at 200, the solvent is evaporated and the residue is washed successively with ethyl acetate and dilute phosphorous acid. BOC-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z is obtained; M.p. 240. [α] D20 = 280 in dimethylformamide.
d) 1- (N-tert-butyloxycarbonyl-L-leucyl-L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenylalanine) -2-benzyloxycarbonyl-hydrazide (BOC-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z)
Dissolve 22 o BOC-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z in 150 ml of trifluoroacetic acid and leave to stand at 200 for 1 hour.
After the solvent has evaporated, 12 g of BOC-Leu-ONP and 10 g of N-methylmorpholine in 100 ml of dimethylformamide are added to the residue. After 16 hours of standing at 200, the dimethylformamide is evaporated and the residue is washed successively with ethyl acetate and dilute phosphonic acid.
One obtains BOC-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z with melting point.
210, [α] D22 = -34 in dimethylformamide.
e) 1- (N-tert-butyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-leucyl-L -asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenylalanine) -2-benzyl oxycarbonylhydrazine (BOC-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe -NH-NH-Z)
57 g of BOC-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z are dissolved in 300 ml of trifluoroacetic acid and left to stand at 200 for one hour. After evaporation of the solvent, the residue is crystallized from ether. The tetra peptide trifluoracc-tat is dissolved in 400 ml of dimethylformamide and 27 g of BOC-Asn-ONP and 25 g of N-methylmorpholine are added to the solution. After 16 hours of standing at 200, the solvent is evaporated and the residue is washed successively with ethyl acetate and dilute phosphoric acid.
BOC-Asn-Leu Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z of m.p. 250 (decomp.), [Α] D20 = -34 in dimethylformamide is obtained.
f) 1- (L-asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl-L -asparaginyl-L-phenylalanine) -2-benzyloxycarbonyl-hydrazide # trifluoroacetate (H-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH- Z # trifluoroacetate)
43.5 g of BOC-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z are dissolved in 200 ml of trifluoroacetic acid and left to stand at 200 for one hour. After evaporation, the residue is crystallized with the aid of ether. H-Asn Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z trifluoroacetate is obtained; M.p. 2420, [α] D20 = -22 in dimethylformamide.
Partial sequence E tert-butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl-L-tryptophanyl-L-arginine hydrazide (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-NHNH. CH3COOH) a) N-tert. Butyloxycarbonyl-L-tryptophanyl - (guanido) N-nitro-L-arginine methyl ester [BOC-Trp-Arg (NO2) -OMe]
Dissolve 35 g of H-Arg (NO2) -OMe # HCl, 63 g of BOC Trp-OCP and 14 g of N-methylmorpholine in 300 ml of dimethylformamide and leave to stand at 200 for 16 hours.
After evaporation of the solvent, the residue is taken up in ethyl acetate and washed with dilute sulfuric acid. One constricts a little and falls out with ether. BOC-Trp-Arg (NO2) - OMe of melting point 1300 crystallizes out. [Alpha;] D20 = -22 in dimethylformamide.
b) N-tert.Butyloxycarhortvl-L-tyrosyl-L- -tryptophanyl- (guanido) N-nitro-arginine methyl ester [BOC-Tyr-Trp-Arg (NO2) -OMe]
15 g of BOC-Trp-Arg (NO2) -OMe are dissolved in 80 ml of 5N methanolic hydrochloric acid solution and left to stand for 1 hour at room temperature. After evaporation of the solvent and treatment with ether, 13 g of H-Trp-Arg (NO2) -OMe remain as hydrochloride; 1200, [D? O = 90 in dimethylformamide. This dipeptide is dissolved together with 14 g of BOC-Tyr-OCP and 8 g of N-methylmorpholine in 200 ml of dimethylformamide. After 16 hours of standing at 200, the solvent is evaporated and the residue is taken up in ethyl acetate.
After washing with dilute phosphorous acid and concentration of the solvent, BOC-Tyr-Trp-Arg (NO2) -OMe can be isolated with the aid of ether; M.p. 130, [α] D20 = -11 in dimethylformamide.
c) tert.Butyloxycarbonyl-L-alanyl-L-tyrosyl-L -tryptophanyl- (guanido) N-nitro-L-arginine methyl ester [BOC-Ala-Tyr-Trp-Arg (NO2) -OMe]
13.5 g of BOC-Tyr-Trp-ArgtNO2) -OMe are dissolved in 130 ml of 5N methanolic hydrochloric acid solution, left to stand at 250 for 1 hour, evaporated to dryness, the residue is washed with dimethyl ether, filtered off, and dissolved in 100 ml of dimethylformamide and 8.0 g of BOC-Ala-OCP and 3.0 ml of triethylamine are added. After 16 hours at 250, 500 ml of ethyl acetate are added. washes with dilute sulfuric acid and potassium bicarbonate solution and evaporated to dryness. After washing the residue with chloroform, BOC-Ala-Tvr-Trp-Arg (NO2) -OMe is obtained; M.p. 120 (dec.), [Α] D20 = -12 in dimethylformamide.
d) tert.Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-L-tyroxyl-L -tryptophanyl-guanido) N-nitro-L-arginine methyl ester [BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg (NO2) -OMe]
12.3 g of BOC-Ala-Tvr-Trp-Arg (NO2) -OMe are dissolved in 100 ml of 5N methanolic hydrochloric acid, left to stand at 250 for 1 hour, evaporated to dryness, the residue is washed with diethyl ether, dissolved in 100 ml of dimethylformamide, mixed with 14 ml of triethylamine and 8.5 g of BOC-Ser-N2, left to stand at 0 for 16 hours, added 500 ml of ethyl acetate, washed successively with dilute sulfuric acid and ammonium hydroxide, dried over sodium sulfate and the solvent evaporated. After washing the residue with chloroform, it is dissolved in ethyl acetate and precipitated by adding diethyl ether.
13.5 g of BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg (NO2) -OMe are obtained; M.p. 1350 (dec.), [Α] D20 = -150 in dimethylformamide.
e) tert-butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-L -tyrosyl-L-tryptophanyl-L-arginine-hydrazi # diacetate (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-NHNH2 # 2 CH3COOH)
13.2 g of the pentapeptide ester obtained above are dissolved in 300 ml of acetic acid, 60 ml of water and 13.2 g of palladium-carbon (10%) are added and the mixture is hydrogenated until hydrogen uptake has ceased. It is filtered, evaporated, the residue is dissolved in dimethylformamide, and again evaporated to remove the traces of acetic acid. The residue is then dissolved in 260 ml of methanol, mixed with 25 ml of hydrazine hydrate and left to stand at 400 for 16 hours. After adding 260 ml of diethyl ether, the precipitated crystalline mass is filtered off, washed with diethyl ether and dried over sulfuric acid in a high vacuum.
BOC Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-NHNH3 2 CHFCOOH is obtained: mp.
1820, [α] D20 = -8 in dimethylformamide.
Partial sequence F1
L-threonyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-valyl-L-leucine [H-Thr-Cys (Bzl) -Val-Leu-OHl a) H-Cys (Bz1) -Va1-Leu-OMe. HBr
21.0 g of Z-Cys (Bzl) -OCP and 12.3 g of H-Val Leu-OMe are dissolved. HCl in 120ml dimethylformamide. Then 5.9 ml of triethylamine are added, the mixture is left to stand at 250 for 16 hours, ethyl acetate is added, the mixture is washed with dilute hydrochloric acid and dried over sodium sulfate. evaporated to dryness and the residue crystallized from ethyl acetate / diethyl ether. Z Cys (Bzl) -Val-Leu-OMe, m.p. 1600, [α] D20 = 280 is obtained in dimethylformamide, which is dissolved in 210 ml of a 40% solution of hydrogen bromide in glacial acetic acid.
The mixture is left to stand at 250 for 1 hour, evaporated to dryness and the residue is recrystallized from isopropanol / diethyl ether. H-Cys (Bzl) -Val-Leu-OMe HBr, m.p. 1680, [α] D20 = +140 in dimethylformamide is obtained.
b) H-T / lr-Cys (Bzl) -Val-Leu-OMe 1.3 HBr
20 g of Z-Thr-NHNH2 are dissolved in 350 ml of dimethylformamide. cools to 200, 100 ml of a solution of 2N hydrochloric acid in dioxane and then 10 ml of tert-butyl nitrite are added. After 10 minutes at -20, 45 ml of triethylamine and 25.5 g of H-Cys (Bzl) -Val Leu-OMe HBr are added and the resulting mixture is shaken at 0 for 16 hours. It is evaporated to dryness. dissolves the residue in a mixture of ethyl acetate / water, the organic phase was washed with dilute hydrochloric acid, dried over sodium sulfate, evaporated and the residue was recrystallized from ethyl acetate. Z-Thr-Cys (Bzl) -Val-Leu OMe is obtained: m.p. 2080, [α] D20 = 270 in dimethylformamide.
20 g of the tetrapeptide obtained above are dissolved in 200 ml of a mixture of trifluoroacetic acid / ethyl acetate (1: 1), a stream of gaseous hydrogen bromide is passed in at 0 for 1 hour, then evaporated and the residue is recrystallized from methanol-diethyl ether. H-Thr-Cys (Bzl) Val-Leu-OMe # 1.3 HBr is obtained; 202, [α] 20 D = -10 in dimethylformamide.
c) H-TIir-Cys (BzI) - Val-Lew-OH
372 g of H-Thr-Cys (Bzl) -Val-Leu-OMe 1.3 HBr are dissolved in 1800 ml of methanol, 900 ml of 2N sodium hydroxide solution are added, left to stand at 250 for 1 hour, 240 ml of glacial acetic acid are added and left for 2 hours 00 stand. The precipitated crystalline mass is filtered off, washed first with 1N acetic acid, then with water and dried at 500 in a high vacuum. The H-Thr Cys (Bzl) -Val-Leu-OH is obtained. M.p. 2190, [α] D20 = 530 in 1N ammonia.
Partial sequence F2 tert-butyloxycarbonyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-seryl-L-asparaginyl-L-leucyl-L-serine hydrazide [BOC-Cys (Szl) -Ser-Asn-Leu-Ser-NH-NH2 ] a) H-Asn-Leu-Ser-OMe # HCl
43 g of H-Leu-Ser-OMe HCl and 53 g of BOC Asn-ONP are dissolved in 400 ml of dimethylformamide, 22 ml of triethylamine are allowed to stand for 16 hours at 250, evaporated to dryness and the residue is recrystallized from methanol. 51.6 g of BOC-Asn-Leu-Ser OMe, m.p. 1900, [α] D20 = 240 are obtained in dimethylformamide, which is dissolved in 500 ml of a 4N solution of hydrochloric acid in methanol. The mixture is left to stand at 250 for 1 hour, evaporated to dryness, the residue is dissolved in methanol and precipitated with diethyl ether.
H Asn-Leu-Ser-OMe HCl: Mp. 1800, [x] D20 = -23n in dimethylformamide is obtained.
b) H-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe # HCl
39.5 g of BOC-Ser-NHNH2 are dissolved in 500 ml of dimethylformamide, cooled to -200, 200 ml of a 2N solution of hydrochloric acid in dioxane and then 20 ml of tert-butyl nitrite are added. After 10 minutes at -20, 40 ml of triethylamine and 38.0 g of H-Asn-Leu-Ser-OMe HCl are added, then the mixture is stirred for 16 hours at 0, evaporated to dryness and the residue is recrystallized from chloroform / diethyl ether. BOC Ser-Asn-Leu-Ser-OMe, melting point 1350, [ziD20 = 220 in dimethylformamide, which is dissolved in 420 ml of a 4N hydrochloric acid solution in methanol, is obtained.
The mixture is left to stand at 250 for 1 hour, evaporated to dryness and recrystallized from methanol / ethyl acetate. H Ser-Asn-Leu-Ser-OMe HCl, melting point 1550 (decomposition) is obtained.
[α] D20 = -15 in dimethylformamide.
c) BOC-Cys (Bzl) -Ser-Asn-Leu-Ser-NHNH2
Dissolve 18.5 g of H-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe HCl and 18.0 g of BOC-Cys-Bzl) -ONP in 100 ml of dimethylformamide, add 10 ml of water, 3.5 ml of acetic acid and 5.6 ml Triethylamine added, left to stand at 250 for 16 hours, evaporated to dryness and recrystallized from methanol.
25.1 g of BOC-Cys (Bzl) -Ser-Asn-Leu-Ser-OMe, m.p. 1820, [α] D20 = -17 in dimethylformamide are obtained. which is dissolved in 200 ml of dimethylformamide with gentle heating. 200 ml of methanol and 20 ml of hydrazine hydrate are added, the mixture is left to stand for 16 hours at 300, precipitated with diethyl ether, the precipitate is washed with diethyl ether / methanol (1: 1) and the BOC-Cys (Bzl) -Ser-Asn-Leu thus obtained is dried -Ser-NHNH2, m.p. 224, [α] D20-130 in dimethylformamide.
Partial sequence F ethoxycarbonyl-L-hemicystinyl-L-seryl-L -asparaginyl-L-leucyl-L-seryl-L-threonyl-L-hemicystinyl-L-valyl-L-leucine
EMI7.1
Dissolve 18.4 g of BOC-Cys (Bzl) -Ser-Asn-Leu-Ser NHNH2 (partial sequence F2) in 150 ml of dimethylformamide, cool to 200, add 40 ml of a 2N solution of hydrochloric acid in dioxane and 15 ml of tert-butyl nitrite to. After 10 minutes at -200 are added 28 ml of triethylamine and 16.2 g of H-Thr-Cys (Bzl) -Val-Leu-OH (partial sequence F1) and stir for 16 hours at 25. It is then filtered, the solution is evaporated and the residue is washed through with 1N acetic acid. BOC-Cys (Bzl) -Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys (Bzl) -Val-Leu-OH is obtained. M.p.
217, [α] D20 = -27 in dimethylformamide.
The product obtained is dissolved in 5000 ml of dried ammonia, and sodium metal is added with stirring and boiling of the ammonia until it turns deep blue. Ammonium chloride is added to decolorize. It is evaporated to dryness and the residue is washed through with 1N acetic acid and acetone. After drying, BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr Cys-Val-Leu-OH, m.p. 2480 (dec.), [Α] D20 = 410 in dimethylformamide / water (3 l) is obtained.
The nonapeptide obtained in this way is dissolved in 5000 ml of 0.01N ammonia, 1N hydrogen peroxide is added with stirring until the nitroprussiate reaction is negative.
then another 200 ml of glacial acetic acid, filtered and lyophilized.
You get
EMI7.2
OH. Mp. 2380 (decomp.), [1D2O = -180 in dimethyl formamide / water (3 1) that is dissolved in 300 ml of trifluoroacetic acid, left to stand at 250 for 30 minutes, evaporated, the residue was washed with ethyl acetate and dissolved in 300 ml of dimethylformamide. 30 g of p-nitrophenyl-ethyl carbonate, which is prepared as described below, are added to this solution. and 14 ml of triethylamine, left to stand at 250 for 16 hours, evaporated and the residue was washed with chloroform.
It is dissolved in 300 ml of dimethylformamide, 50 ml of water and 50 g of DOWEX-50 are added, the mixture is stirred for 15 minutes, filtered, the resin is washed with dimethylformamide and the filtrate is evaporated to dryness. The residue is washed first with chloroform and then with ethyl acetate and dried. You get that
EMI7.3
EMI7.4
M.p. 2630, [α] D20 = 210 in dimethylformamide / water (3 liters).
Carbonic acid p-nitrophenyl ethyl ester
200 g of p-nitrophenol and 113 ml of pyridine are dissolved in 1200 ml of ethyl acetate, cooled to 00, 156 ml of ethyl chloroformate are added with stirring, stirred for a further 30 minutes at 00, washed with water, dried over Na2SO4 and evaporated to dryness. The residue is dissolved in diethyl ether and the carbonic acid p-nitrophenyl ethereal ester is crystallized by adding petroleum ether, melting point 650.
Partial sequence ABC
Nim-Trityl-L-histidyl-L-arginyl-L-phenylalanyl-L-seryl -glycyl-L-iiietliionyl-glycyl-L-ph enyialanyl-glycyl-L- -prolyl-L-glutamyl-L-threonyl-L- prolinamide # triacetate [H-His (Trt) -Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 # 3 CH3CO2H) a) L-Seryl-glycyl-L-methionyl -glycyl-L-phenylalanyl -glycyl-L-prolyl-L-glutamyl-L-threonyl-L-proline amide # hydrochloride (H-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly
Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 # HCl)
6.7 g of BOC-Ser-Gly-Met-Gly-OH (partial sequence B), 12 g of H-Phe-Gly-Pro-Glu (OTB) -Thr-Pro-NH2 (partial sequence A) and 2.1 are dissolved g of hydroxysuccinimide in 50 ml of dimethylformamide and 20 ml of acetonitrile.
cool to 00, add 4.0 g of dicyclohexylcarbodiimide and leave to stand at 0 for 16 hours. The solvent is evaporated off, the residue is washed with water, diethyl ether and ethyl acetate and recrystallized from chloroform. BOC-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro Glu (OTB) -Thr-Pro-NH2, m.p. 121 (dec.), [Α] D20 = 470 in dimethylformamide, which is obtained in 250 ml dissolves a solution of 8N hydrogen chloride in dioxane. The mixture is stirred for 2 hours at 250 °, evaporated to dryness and the residue is processed in diethyl ether.
H-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr Pro-NH2 HCl [mp. 1300 (dec.). [α] 20 D = 480 in dimethylformamide].
b) Nim-Trityl-L-histidyl-L-arginyl-L-phenylalanyl-L-seryl-glycyl-L-methionyl-glycyl-L-phenylalanyl-glycyl-L-prolyl-L-glutamyl-L-threonyl-L -prolinamide.
triacetate [H-His (Trt) -Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 # 3 CH3COOH]
Dissolve 9.9 ° Trt-His (Trt) -Arg-Phe-NHNH2 HCI (partial sequence C) in 100 ml dimethylformamide, cool to 200, add 15 ml dioxane / HCl 2N and then 1.16 ml tert-butyl nitrite, stir for 10 minutes -200, add 28 ml of triethylamine and 10.0 g of H-Ser-Gly-Met-Gly Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 # HCl, stir for 4 hours at 00, filtered and evaporated to dryness .
The residue is dissolved in a mixture of ethyl acetate / methanol (8: 2), washed with dilute ammonia and then with water until neutral. dries over sodium sulfate. concentrated to 100 ml and precipitated by adding diethyl ether. The precipitate is again dissolved in dimethylformamide and precipitated by adding diethyl ether. Trt His (Trt) - Arg - Phe - Ser - Gly - Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu Thr-Pro-NH2 [mp. 168 (dec.), [Α] D20 = -43 in dimethylformamidi, which is dissolved in 500 ml of acetic acid / water (8: 2). It is left to stand at 400 for 3 hours and evaporated. washes the residue in diethyl ether and dries in a high vacuum over KOH chips.
H-His (Trt) -Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro Glu-Thr-Pro-NH2 # 3 CH2COOH, m.p. 182 (dec.), [Α] D20 is obtained = -56 in acetic acid.
Partial sequence DE
N-tert-butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrrosyl-L-tryptophanyl-L-arginyl-L-asparaginyl-L-leucyl-L -asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenylalanine hydrazide.
diacetate (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn.
Leu-Asn-Asn-Phe-NHNH. 2 CH, COOH) a) 1- (N-tert-butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-L -tyrosinyl-L-tryprophanyl-L-arginyl-L-asparaginyl -L-leucyl-L-asparaginyl-L- asparaginyl-L-phenyl alanine) -2-benzyloxycarbonyl-hydrazide # diacetate (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe
NH-NH-Z 2 CH3COOH)
320 ml of dimethylformamide are cooled to -200C.
add 100 ml of 2N hydrogen chloride in dioxane and dissolve 68 g of BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-NHNH acetate (partial sequence E). Then 12 mol of tert-butyl nitrite are added, the mixture is stirred for 10 minutes at -20 and 35 ml of triethylamine are added dropwise. The resulting mixture is combined with a solution formed from 8.8 g of H-Asn-Leu Asn-Asn-Phe-NHNH-Z trifluoroacetate (partial sequence D) and 17 ml of triethylamine in 150 ml of dimethylformamide. After 16 hours of standing at 0 it is evaporated. The residue is dissolved in ethyl acetate / butanol and washed with dilute acetic acid and ammonia solution.
After evaporation of the solvent the BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NHNH-Z 2 CH3COOH of m.p. 1750, [α] D20 = -19.5 in dimethylformamide remains .
b) tert-butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl-L-tryptophanyl-L-arginyl-L-asparaginyl-L-leucyl-L -asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenylalanine hydrazide.
diacetate (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn Leu-Asn-Asn-Phe-NHNH- 2 CH3COOH)
90 g of BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NHNH-Z 2 CH3COOH are dissolved in 500 ml of dimethylformamide and hydrogenated with 10 g of PdlC (10%) until the end of the Hydrogen uptake. After filtering off the catalyst, the solvent is evaporated and the residue is crystallized from a mixture of ether and ethanol. BOC-Ser Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NHNH 2 CH3COOH of m.p. 2650 is obtained. [Α] D20 = = 570 in dimethylformamide.
Tell seqiiency A BCDE
L-Seryl-L-alanyl-L-tyrosyl-L-tryptophanyl-L-arginyl -L-asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl-L-asparaginyl-L -pllenylatan.yl-L-histidyl-L-arginyl- L-pllenylalanvl- -L-seryl-glycyl-L-methionyl-glycyl-L-phenylalanyl -glycyl-L-prolyl-L-glutamyl-L-threonyl-L-prolinamide.
hexatrifluoroacetate (H-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn
Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH @. 6 CF3CO2H)
15.2 g of BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu Asn-Asn-Phe-NHNH2 diacetate (partial sequences D.E) are dissolved in 200 ml of dimethylformamide. cools to -20. 15 ml of dioxane / HCl 2N and then 1.16 ml of tert-butyl nitrite are added and the mixture is stirred for 10 minutes at 200. 14 ml of triethylamine and a solution of 15.6 g of the tridecapeptide acetate obtained in partial sequence A. B, C are added, and the mixture is stirred the mixture obtained for 16 hours at 0t, filtered and evaporated to dryness.
The residue is washed with diethyl ether and with chloroform and dissolved in dioxane / water (8: 2). treats the solution obtained with 100 ml of Amberlit-IRA-410 (acetate form), evaporates and recrystallizes the residue from isopropanol / water. The BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His (Trt) -Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr -Pro-NH2 acetate, m.p. 1450 (dec.), [Α] D20 = -67 in acetic acid, which is dissolved in 500 ml of trifluoroacetic acid under a nitrogen atmosphere.
The mixture is left to stand at 250 for 1 hour, concentrated to 100 ml and precipitated by adding 1000 ml of diethyl ether. After drying over KOH chips, the H-Ser-Ala-Tyr-Trp Arg - Asn - Leu - Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met- Gly-Phe-Gly-Pro- Glu-Thr-Pro-NH2 # 6 CF3CO2H, m.p.
1300 (dec.), [Α] D20 = -42 in acetic acid.
Example I Ethoxycarbonyl-L-hemicystinyl-L-seryl-L-asparaginyl-L-leucyl-L-seryl-L-threonyl-L-heniivstinyl-L-valyl-L-leucyl-L-seryl-L-alanyl-L -tyrosyl-L-tryptophanyl-L-arginyl-L-asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl-L -asparaginyl-L-phenylalanyl-L-histidyl-L-arginyl-L-phenylalanyl-L-seryl-glycyl-L -methionyl-glycyl-L -phenylalanyl-glycyl-L-prolyl-L-glutamyl-L-threonyl -L-prolinamide # hexaacetate # octahydrate
EMI8.1
Ser-Ala-Tyr-Try-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg
Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro NHo hexaacetate to octahydrate
1.0 g of nonapeptide (partial sequence F) is dissolved in 10 ml of dimethylformamide. add 1.5 g of N-hydroxysuccinimide and 0.52 g of dicyclohexylcarbodiimide. stir for 6 hours at 250, filtered and evaporated the filtrate to dryness.
The residue is washed with ethyl acetate and dietary ether and dried. You get
EMI8.2
EMI8.3
M.p. 2420 which is dissolved in 19 ml of dimethylformamide. 3.1 g of tricosapeptide hexatrifluoroacetate (partial sequence A, B, C, D, E), 0.4 ml of triethylamine and 1.2 g of N-hydroxysuccinimide are added to this solution and the mixture is stirred at 250 for 16 hours. washes the residue with diethyl ether, chloroform and acetone. This is how you get the raw. protected dotriacontapeptide. which is dissolved in 100 ml of 0.3 acetic acid, treated with 20 ml of Amberlite IRA-410 (acetate) and added 50 ml of 0.6 N ammonium hydroxide.
The pH is adjusted to 6.5 and the resulting solution is layered on a carboxymethyl cellulose column (10
X 100 cm), which was equilibrated with a 0.15N ammonium acetate buffer solution. The elution is carried out with an increasing concentration and pH gradient (0.15 N to 0.4 N; pH 6.5 to pH 7.0) of an ammonium acetate buffer. The united factions. which contain the pure peptide. are freeze-dried three times, the residue is washed with ethanol and then with diethyl ether and dried over potassium hydroxide in a high vacuum. EOC is obtained
EMI8.4
Arg - Asn - Leu - Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 # 6CH3CO2H 8 H2O, m.p. 240 (dec. ). [α] 20 D = -56 in acetic acid IN.
Amino acid composition after acid hydrolysis (6N, 16 hours): Ala1.1, Arg,., AsP3. @, Cvs / 9, ..
Gly3.0, His1.1, Leu2. @, Met1,0, Phe3.0, Pro @. @, Ser @. @, Thr1.0, Val0.9 (Trp1.0 by spectrophotometry).