Verfahren zur Herstellung bisher unbekannter Polypeptidderivate Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung bisher unbekannter Polypeptidderivate der allgemeinen Formel
EMI1.1
10 11 i2 13 1 15 16 17 18 zu 19 20 21 22 23 24 Ser-A1a-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-A sn-Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly-
25 26 27 28 29 70 3). 32 Nle - Gly- Phe -Gly - Pro-Glu-Thr -Pro-Tu?l , worin R für eine Alkyl-, Alkenyl-, gegebenenfalls substituierte Aralkyl- oder eine gegebenenfalls substituierte Arylgruppe steht, ihrer therapeutisch wirksamen Säureadditionssalze und Schwermetallkomplexe. Als R kommen beispielsweise der Äthyl-, Allyl-, Phenyl-, p-Nitrophenyl-, p-Chlorphenyl-, p-Bromphenyl-, p-Methoxyphenyl-, Azobenzol- oder der p-Methoxy-Azobenzolrest in Frage.
Die erfindungsgemässen Polypeptidderivate zeichnen sich durch Beständigkeit gegenüber der abbauenden Wirkung von Aminopeptidasen aus. Ein weiterer Vorteil ist der bekanntlich oxydationsbeständige Norlencin-Rest in Stellung 25.
Die bisher unbekannten Polypeptidderivate können nach für die Synthese von Verbindungen dieser Art allgemein bekannten Methoden hergestellt werden, wobei die Aminosäuren in der in der obigen Formel festgelegten Reihenfolge einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten miteinander verknüpft werden, indem man entsprechende zu ihrem Aufbau nötige Verbindungen unter Bildung von CONH-Bindungen in beliebiger zeitlicher Reihenfolge miteinander kondensiert, wobei nicht an der Reaktion teilnehmende freie funktionelle Gruppen intermediär durch geeignete Schutzgruppen geschützt werden, zu einem beliebigen Zeitpunkt der Synthese unter Beibehaltung der
EMI1.2
in Stellung 1, worin R obige Bedeutung hat, die Schutzgruppen abspaltet,
die Mercaptogruppen nach Bildung der Teilsequenz 1 bis 7 zum Disulfid oxydiert und die Carboxylgruppe des terminalen Prolylrestes in die Amidgruppe überführt. Die Einführung der im Endprodukt am endständigen L-Hemicystin-Molekül gewünschten Gruppe der allgemeinen Formel
EMI1.3
worin R obige Bedeutung hat, kann in einer beliebigen Stufe vor der letzten Stufe erfolgen. In der letzten Stufe sind jedoch Methoden zu verwenden, bei denen Racemisierung nicht auftritt oder gering gehalten werden kann, vorzugsweise die Azid- oder die aktivierte Ester-Methode, wobei zur Aktivierung vorzugsweise N-Hydroxysuccinimid Verwendung findet. Üblicherweise werden die beim Aufbau von cysteinhaltigen Peptiden zum Schutz der SH-Gruppen verwendeten Benzylreste am Ende der Synthese durch Behandlung mit Natrium in flüssigem Ammoniak abgespalten.
Es wurde nun gefunden, dass die Abspaltung der Benzylschutzgruppen und die Herstellung der (Cys)S-S(Cys)-Bindung vor der letzten Stufe zu besonders guten Ausbeuten an Endprodukt führt.
Beim Aufbau der neuen Polypeptidderivate hat sich für die Blockierung der y-Carboxygruppe, beispielsweise in der nachstehend beschriebenen Teilsequenz A, die tert.-Butyloxygruppe bewährt, doch können auch andere Schutzgruppen, wie die Methoxy-, die Äthoxy-, die tert.-Amyloxy-, die Amidoder die Benzylgruppe verwendet werden.
Für die Blockierung der Imidazolgruppe des Histidinrestes in der nachstehend beschriebenen Teilsequenz C hat sich die Triphenylmethylgruppe bewährt, doch können auch andere geeignete Schutzgruppen, wie die Carbo-tert.-butoxy-, die Carbo-tert.-amyloxy-, die Carbobenzoxy- oder die Benzylgruppe verwendet werden.
Für die Blockierung der Guanidogruppe des Argininrestes in der nachstehend beschriebenen Teilsequenz E wurde die Nitrogruppe verwendet, doch können auch andere geeignete Schutzgruppen, wie die Tosylgruppe, die p-Nitrobenzoxycarbonylgruppe oder die 2-(Isopropyloxycarbonyl)-3,4,5,6- tetrachlorobenzoylgruppe verwendet werden. Man kann auch den Schutzeffekt der Protonisierung der Guanidogruppe bei der Synthese verwenden.
Die neuen Polypeptidderivate lassen sich auch in Form ihrer Salze gewinnen bzw. verwenden. Als Salze kommen solche mit organischen Säuren, wie Essigsäure, Propionsäure, Glykolsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Benzoesäure, Zimtsäure, Salicylsäure, 2-Phenoxyoder 2-Acetoxybenzoesäure, Mandelsäure, Methansulfonsäure, Äthansulfonsäure, Hydroxyäthansulfonsäure, Benzoloder Toluolsulfonsäure, Naphthalinsulfonsäure, Sulfanilsäure sowie polymere Säuren, wie Gerbsäure, Alginsäure, Polygalacturonsäure, Polychloretinphosphat oder Carboxymethylcellulose und Salze mit anorganischen Säuren, wie Halogenwasserstoffsäure, z. B. Salzsäure oder Bromwasserstoffsäure, Salpetersäure, Thiocyansäure, Schwefelsäure und Phosphorsäure, in Frage. Als Schwermetallkomplex kommen z.
B. diejenigen vom ZinkO+O+ in Frage.
Die Ausgangsprodukte zur Herstellung der neuen Polypeptidderivate können, sofern sie bisher nicht bekannt waren, nach den für die Peptidchemie bekannten Methoden erhalten werden, wobei die Aminosäuren einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten miteinander verknüpft werden.
Die neuen Verbindungen stellen ein wichtiges therapeutisches Prinzip dar, das den Calciumplasmaspiegel, insbesondere den erhöhten Calciumplasmaspiegel, senkt und als Antagonist des Parathormons eine positive Calciumbilanz im Knochen bewirkt.
Es ist somit indiziert bei allen Zuständen, bei welchen eine Senkung des Plasmacalciumspiegels erwünscht ist, z. B.
Hypercalcämien verschiedener Genese, Mangel des endogenen Thyreocalcitonins infolge Ausfalls von Schilddrüsengewebe, Hyperfunktion der Nebenschilddrüsen.
Die neuen Verbindungen sind indiziert bei allen Knochenaffektionen, die auf einem vermehrten Abbau beruhen oder bei welchen eine vermehrte Calciumfixation im Knochen erwünscht ist, z. B. Osteoporose verschiedener Genese (z. B.
postklimakterisch, posttraumatisch, bedingt durch Corticosteroidtherapie oder Inaktivität usw.), Frakturen, Osteomalacie, Rachitis sowie insbesondere zur Kombinationstherapie mit Calcium bzw. Phosphat.
Die biologische Prüfung der neuen Verbindungen ergab eine Wirksamkeit von etwa 100 bis 450 MRC-Einheiten/mg Peptid. Die erforderliche Tagesdosis (i. m. verabreicht) in MRC-Einheiten beträgt 20 mE bis 10 E, vorzugsweise 100 mE/kg Tiergewicht. Beim Menschen beträgt die tägliche Dosis (i. m. verabreicht) in MRC-Einheiten 1 bis 500 E.
Vorzugsweise wird eine tägliche Dosis von 5 E i. m. verabreicht.
Die neuen Verbindungen können als Heilmittel, z. B. in Form pharmazeutischer Präparate, Verwendung finden. Diese enthalten die genannten Verbindungen in Mischung mit einem für die parenterale Applikation geeigneten organischen oder anorganischen Trägermaterial. Für dasselbe kommen solche Stoffe in Frage, die mit der neuen Verbindung nicht reagieren, wie z. B. Gelatine, Milchzucker, Stärke, Magnesiumstearat, Talk, pflanzliche Öle, Benzylalkohole, Gummi arabicum, Polyalkylenglykole, Vaseline, Cholesterin oder andere bekannte Arzneimittelträger.
Die pharmazeutischen Präparate können z. B. in flüssiger Form als Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen vorliegen.
Gegebenenfalls sind sie sterilisiert und bzw. oder enthalten Hilfsstoffe, wie Konservierungs-, Stabilisierungs-, Netzmittel oder Emulgiermittel. Sie können auch noch andere, therapeutische wertvolle Stoffe enthalten. Die neuen Verbindungen können auch in Form von Depotpräparaten verabreicht werden.
Die neuen Verbindungen und ihre Salze können auch als Zwischenprodukt zur Herstellung von pharmazeutischen Präparaten Verwendung finden.
Es werden folgende Abkürzungen verwendet:
Z = Benzyloxycarbonyl
Bzl = Benzyl
BOC = tert.-Butyloxycarbonyl
Trt = Trityl = Triphenylmethyl
OTB = tert.-Butyloxy
ONP = p-Nitrophenylester
OCP = 2,4,5-Trichlorphenoxy
OMe = Methoxy
OEt = Äthoxy
NO2 = Nitro Ser = L-Seryl
Asn = L-Asparaginyl
Leu = L-Leucyl
Thr = L-Threonyl
Val = L-Valyl
Ala = L-Alanyl
Tyr = L-Tyrosyl
Trp = L-Tryptophanyl
Arg = L-Arginyl
Phe = L-Phenylalanyl
Glu = L-Glutamyl
His = L-Histidyl
Pro = L-Prolyl
Gly = Glycyl
Nle = L-Norleucyl
Cys = L-Cysteinyl
OSu = Oxysuccinimid
EOC = Äthoxycarbonyl
In den nachfolgenden Beispielen, die die Ausführung des Verfahrens erläutern, den Umfang der Erfindung aber in keiner Weise einschränken sollen, erfolgen alle Temperaturangaben in Celsiusgraden.
Teilsequenz A L-Phenylalanyl-glycyl-L-prolyl-y-tert.-butyloxy-L-glutamyl-
L-threonyl-L-prolinamid (H-Phe-Gly-Pro-Glu(OTB)
Thr-Pro-NH2)
Man löst bei -5" 134 g Z-Thr-NH-NH2 in 21 1n Salzsäure und versetzt mit 0,55 1 in Natriumnitrat. Nach 5 Minuten wird Kaliumcarbonat bis pH 9 zugegeben, das entstandene Azid mit Äthylacetat extrahiert und eine Lösung von 80 g H-Pro-NH2 Hydrochlorid in 100 ml Wasser, 500 ml Dimethylformamid und 77 ml Triäthylamin hinzugefügt. Man verdampft das Äthylacetat bei 20 im Vakuum und lässt über Nacht bei 25 stehen.
Die restliche Lösung wird im Vakuum verdampft, der Rückstand in Äthylacetat gelöst, die Lösung mit Wasser, verdünnter Salzsäure und einer wässrigen Calciumcarbonatlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Man verdampft im Vakuum, löst in warmem Äthylacetat und kühlt ab. Man erhält Z-Thr-Pro-NH2; Smp. 148", [a]D20 = -72" in 95% Essigsäure. Man löst hierauf 90 g Z-Thr-Pro-NH2 in 2 1 Dioxan und 260 ml In Salzsäure und hydriert bei 20 und Normaldruck in Gegenwart eines Palladiumkatalysators. Man filtriert, verdampft die Lösung im Vakuum, wäscht den Rückstand mit Äthylacetat und erhält H-Thr-Pro-NH2 HCl; Smp. 216 , [a]D20 = 640 in 95% Essigsäure.
Dieses wird in 500 ml Dimethylformamid, 50 ml Wasser und 32 ml Triäthylamin gelöst und 118 g Z-Glu (OTB)-OCP und 800 ml Tetrahydrofuran zugegeben. Man lässt über Nacht bei 20 stehen, verdampft im Vakuum und kristallisiert den Rückstand mit Äthyläther. Man erhält Z-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2, Smp. 65" (Zers.), [a] = - 18 in Dimethylformamid.
Man löst 80 g Z-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2 in 1,5 1 Dioxan und 200 ml Wasser und hydriert bei 20 und Normaldruck in Gegenwart eines Palladiumkatalysators. Die Lösung wird filtriert und im Vakuum verdampft und der Rückstand mit Diäthyläther versetzt, wobei H-Glu(OTB )-Thr-Pro-NH2 erhalten wird; Smp. 65" (Zers.), [a]D20 = - 280 in Dimethyl- formamid.
Dieses wird in 700 ml Dimethylformamid bei 0 gelöst, 200 ml Acetonitril, 68 g Z-Phe-Gly-Pro-OH, 18 g N-Hydroxysuccinimid und 32 g Dicyclohexylcarbodiimid hinzugefügt, über Nacht bei 20 stehengelassen, filtriert, im Vakuum eingedampft und mit Äthylacetat versetzt. Danach wäscht man die Lösung mit Wasser, verdünnter Salzsäure und wässriger Kaliumcarbonatlösung, trocknet über Natriumsulfat, verdampft im Vakuum und kristallisiert den Rückstand aus Äthylacetat/Äthyläther. Man erhält Z-Phe-Gly-Pro-Glu (OTB)-Thr-Pro-NH2; Smp. 1200 (Zers.), [a]D20 = -66" in Dimethylformamid, das man in 1500 ml Dioxan und 300 ml Wasser löst. Man gibt 30 g Palladiumkohle (10%) zu und hydriert bis zum Ende der Wasserstoffaufnahme.
Man filtriert, dampft das Filtrat ein und kristallisiert den Rückstand aus Dioxan. Man erhält das H-Phe-Gly-Pro-Glu(OTB)-Thr-Pro- NH2; Smp. 153 , [a]D2 =-79 in Dimethylformamid.
Teilsequenz B
Benzyloxycarbonyl-L-seryl-glycyl-L-norleucyl-glycin (Z-Ser-Gly-Nle-Gly-OH) a) Benzyloxycarbonyl-L-norleucyl-glycin (Z-Nle-Gly-OH)
Man löst 31,6 g H-Gly-Oh in 420 ml in NaOH, gibt 840 ml Tetrahydrofuran zu, versetzt anschliessend mit 130 g Z-Nle-ONP, schüttelt, bis die Lösung klar wird, lässt eine Nacht bei 25 stehen. Dann wird im Vakuum auf 500 ml konzentriert und die erhaltene wässrige Lösung mit in NaOH auf pH 9 gestellt, zweimal mit Äther extrahiert, dann mit 4n Salzsäure angesäuert, mit Essigester extrahiert. Die Essigesterlösung wäscht man mit Wasser und 30%iger Kochsalzlösung, trocknet über Natriumsulfat, dampft im Vakuum ein.
Den Rückstand verreibt man mit Äther, lässt 2 Stunden bei -20" kristallisieren. Man erhältZ-Nle-Gly-OH; Smp. 138 , ]D20 = 40 in Dimethylformamid.
b) Benzyloxycarbonyl-glycyl-L-norleucyl-glycin (Z-Gly-Nle-Gly-OH)
Man löst 100 g Z-Nle-Gly-Oh in 1000 ml 4n HBr/Eisessig, lässt 50 Minuten bei 25 , verreibt mit Äther, filtriert Kristalle ab und wäscht gut mit Äther. Man erhält HBr-H-Nle-Gly-OH, [a]D20 = + 24,7 in Essigsäure (95 %).
Man löst 84 g HBr R-Nle-Gly-OR in 240 ml Wasser, versetzt mit 152 ml 4n NaOH, 800 ml Tetrahydrofuran und 91 g Z-Gly-ONP. Man schüttelt 1 Stunde bei 25 und lässt dann 2 Tage bei 25 stehen. Man konzentriert im Vakuum auf 500 ml, stellt mit in NaOH auf pH 9 und extrahiert mit Äther. Die wässrige Phase wird mit in Salzsäure angesäuert, dann zweimal mit Essigester extrahiert. Man wäscht mit Wasser, 30 %iger Kochsalzlösung, trocknet über Natriumsulfat, dampft im Vakuum ein und verreibt den Rückstand mit Äther. Man erhält Z-Gly-Nle-Gly-OH; Smp. 155", [a]D20 = 5,60 in Dimethylformamid.
c) Benzyloxycarbonyl-L-seryl-glycyl-L-norleucyl-glycin (Z-Ser-Gly-Nle-Gly-OH)
Man löst 89,5 g Z-Gly-Nle-Gly-OH in 900 ml 4n HBr/ Eisessig, lässt 50 Minuten bei 25 stehen, dampft im Vakuum ein, verreibt mit Äther, filtriert, wäscht gut mit Äther, trocknet im Vakuum, löst in 280 ml Wasser, etwa 650 ml Dimethylformamid, gibt 66,5 ml Triäthylamin zu und versetzt mit der Lösung des Azids, die wie folgt erhalten wird:
Man kühlt 940 ml 1n Salzsäure auf -5 , gibt 96 g Z-Ser- NH-NH2 zu und tropft dann bei 5 360 ml in Natriumnitrit ein, rührt noch 6 Minuten bei -5", überschichtet mit etwa 600 ml Essigester von 0 , stellt unter Zugabe von festem Natriumcarbonat auf pH 8,5, trennt die Essigesterphase ab, extrahiert nochmals, trocknet die Lösung über Natriumsulfat und filtriert. Die Reaktionslösung dampft man im Vakuum ein, versetzt den Rückstand mit 600 ml Wasser, säuert an, extrahiert mit Äthylacetat, wäscht mit Wasser und 30 %iger Kochsalzlösung, kühlt auf 0 , filtriert Kristalle ab.
Man erhält Z-Ser-Gly-Nle-Gly-OH; Smp. 210 (mit Zers.), [a]D20 = 80 in Dimethylformamid.
Teilsequenz C Na ,amid Ditrityl-L-histidyl-L-arginyl-L-phenylalanin hydrazid RCl [(Trt)-His(Trt)-Arg-Phe-NH-NH2 - HCI] a) Z-Arg(NO2)-Phe-OMe
51,8 g H-Phe-OMe RCl werden in 1 Liter Äther und etwa 50 ml Eiswasser gelöst und unter Rühren und Kühlen genügend Natriumcarbonat zugegeben, bis alles Wasser abgebunden ist. Man filtriert und dampft das Filtrat bis zur Gewichtskonstanz ein, wobei ein farbloses Öl erhalten wird.
67,6 g Z-Arg(NO2)-OH werden in 300 ml Acetonitril und 150 ml Dimethylformamid gelöst und mit 41,2 g H-Phe OMe versetzt. Danach wird auf -20" abgekühlt und eine Lösung von 43,4 g Dicyclohexylcarbodiimid in 100 ml Acetonitril zugegeben. Das Ganze lässt man unter zeitweiligem Umschütteln während 4 Stunden im Eiskasten stehen. Der entstandene Niederschlag wird abfiltriert und das Filtrat eingedampft. Der Eindampfrückstand wird in 1 Liter Eisester gelöst und hierauf in der Kälte mit ln Natronlauge, Wasser, in Schwefelsäure, Wasser und gesättigter Kochsalzlösung gewaschen. Die über Natriumsulfat getrocknete Essigsäure äthylester-Phase wird vollständig eingedampft.
Nach Umkristallisieren aus Essigester/Petroläther erhält man ZArg(NO2)-Phe-OMe; Smp. 131-133", [a120 = 70 in Methanol, -4" in Dimethylformamid.
b) H-Arg(NO2)-Phe-OMe 0,5 H2O 1,2 HBr
20 g Z-Arg(NO2)-Phe-OMe werden in 50 ml Eisessig gelöst und unter leichtem Kühlen 50 ml 40 %ige Bromwasserstoffsäure in Eisessig zugesetzt. Danach lässt man das Ganze unter zeitweiligem Umschütteln während 1 Stunde bei 20 stehen. Nach vollständigem Eindampfen wird der Rückstand in 200 ml Wasser gelöst und zweimal mit Äther gewaschen.
Die wässrige Phase wird vollständig eingedampft und der Rückstand aus Methanol/Äther umkristallisiert. Smp. 165 bis 167 mit Zers., [a]D20 = + 180 in Methanol, + 14" in Dimethylformamid.
c) Z-His(Z)-Arg(NO2)-Phe-OMe
46,1 g H-Arg(NO2)-Phe-OMe 0,5 H2O 1,2 HBr werden in 100 ml Wasser gelöst, hierauf erwärmt und anschliessend abgekühlt. Nach Zugabe von Chloroform und Eisessig wird mit Ammoniak auf pH 9 gestellt. Die Chloroformphase wird noch einmal mit Wasser gewaschen, anschliessend über Natriumcarbonat getrocknet und filtriert. Dem Filtrat wird eine Lösung von 44,5 g Z-His(Z)-OH, 12,1 g Hydroxysuccinimid in 200 ml Acetonitril und 100 ml Pyridin zugesetzt, danach das Ganze auf -20" abgekühlt und mit einer Lösung von 21,1 g Dicyclohexylcarbodiimid in 70 ml Acetonitril versetzt. Anschliessend wird unter zeitweiligem Rühren 4 Stunden im Eiskasten stehengelassen. Der entstandene Niederschlag wird abfiltriert und das Filtrat eingedampft.
Der Rückstand wird in Essigsäureäthylester aufgenommen und anschliessend folgendermassen gewaschen: 10 %ige Kaliumcarbonatlösung (pR X 10), Wasser, gesättigte Kochsalzlösung, Wasser, gesättigte Kochsalzlösung, Schwefelsäure (pH 3), Wasser, Kochsalzlösung. Die über Natriumsulfat getrocknete Essigsäureäthylester-Phase wird vollständig eingedampft, wobei ein hellbeiger Schaum erhalten wird. Dieser Schaum wird je zweimal in wenig Methanol gelöst und mit Äther gefällt. Die Ätherphasen werden abdekantiert und der Niederschlag getrocknet. Man erhält Z-His(Z)-Arg(NO2) Phe-OMe (amorpher Schaum), [a]D20 = -8 in Methanol, 0 in Dimethylformamid.
d) H-His-Arg-Phe-OMe-4 HCI
25 g Z-His(Z)-Arg(NO2)-Phe-OMe werden in 800 ml Eisessig gelöst. Danach werden 10 g 10% Palladium auf Aktiv kohle in 200 ml ln Salzsäure angerührt und in die Lösung gegeben. Das Ganze wird einer 2stündigen Hydrierung unterworfen und anschliessend der Katalysator abfiltriert. Das Filtrat wird erneut mit 5 g 10% Palladium auf Aktivkohle in Wasser versetzt und der Hydrierung unterworfen, die nach 51/2 Stunden beendet ist. Hierbei werden etwa 80% der theoretischen Menge Wasserstoff verbraucht. Der Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat vollständig eingedampft, wobei H-His-Arg-Phe-OMe-4 HCI in Form eines amorphen Schaumes erhalten wird.
e) Trt-His(Trt)-Arg-Phe-OMe RCl
21,5 g H-His-Arg-Phe-OMe-4 HCI werden in 100 ml Pyridin und etwa 100 ml Dimethylformamid gelöst. Bei etwa + 5 wird bis pH 9 Triäthylamin zugegeben und anschliessend eine Lösung von 29 g Tritylchlorid in 300 ml Pyridin während 5 Minuten zugetropft. Nach Beendigung der Zugabe wird von Zeit zu Zeit das pH geprüft und nötigenfalls wieder mit Tri äthylamin auf etwa pH 9 gestellt. Das Ganze wird nach ungefähr 4 Stunden eingedampft, der Rückstand in Chloroform und Wasser aufgenommen und unter Zugabe von wenig ln Salzsäure auf pH 4 gestellt. Man trennt die Chloroformphase ab, wäscht sie zweimal mit Wasser, trocknet über Natriumsulfat und dampft vollständig ein.
Der Rückstand wird mit Äther versetzt und vom Äther anschliessend abfiltriert, wobei Trt-His(Trt)-Arg-Phe-OMe HCl erhalten wird.
f) Trt-His(Trt)-Arg-Phe-NH-NH2 HCl
17 g Trt-His(Trt)-Arg-Phe-OMe HCl werden in 200 ml Methanol gelöst und mit 40 ml Hydrazinhydrat versetzt.
Danach wird 2 Tage bei Zimmertemperatur stehengelassen.
Man dampft ein, löst-den Rückstand in Chloroform und wäscht zweimal mit Wasser. Die Chloroformphase wird über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Hierauf wird der Rückstand mit Äther gewaschen und abfiltriert; er besteht aus Trt-His(Trt)-Arg-Phe-NH-NH2 HCI; Smp. 158 , [a]D18 = in Dimethylformamid.
Teilsequenz D l-(H-Asparaginyl-L4eucyl-L-asparaginyl-L-asparaginyl- L-phenylalanin)-2-benzyloxycarbonyl-hydrazid Trifluoracetat (H-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z CR1COOH) a) 1-(N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-phenylalanyl)-2-benzyl- oxycarbonyl-hydrazid (BOC-Phe-NH-NH-Z)
Man löst 72 g BOC-Phe-OH und 28 g N-Methylmorpholin in 500 ml Methylenchlorid auf und tropft bei -5" 26 ml
Chlorameisensäuremethylester zu. Nach 10 Minuten gibt man noch 44 g Z-NH-NH2 in 100 ml Methylenchlorid zu und rührt 4 Stunden bei Zimmertemperatur weiter. Nach Auswaschen mit verdünnter Phosphorigersäure wird getrocknet und eingedampft.
Nach Kristallisieren aus Petroläther erhält man BOC-Phe-NH-NH-Z vom Smp. 117 [a]D20 = -5" in Dimethylformamid.
b) 1-(N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phenyl- alanin)-2-benzyloxycarbonyl-hydrazid (B OC-Asn-Phe-NH NH
Man löst 41 g BOC-Phe-NH-NH-Z in 400 ml Trifluor essigsäure und lässt 1 Stunde bei 20 stehen. Beim Verdampfen der Trifluoressigsäure erhält man das H-Phe-NH-NH-Z als kristallines Trifluoracetat vom Smp. 191?, [a]D20 = + 26,40 in Dimethylformamid. Diese Substanz wird zusammen mit
35 g BOC-Asn-ONP und 30 g N-Methylmorpholin in 200 ml Dimethylformamid gelöst. Nach 16 Stunden Stehen bei 20 wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand nach einander mit Essigester und verdünnter Phosphorigersäure gewaschen. Man erhält BOC-Asn-Phe-NH-NH-Z vom Smp. 210 , [aj020 = 180 in Dimethylformamid.
c) 1-(N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-asparaginyl L-phenylalanin)-2-benzyloxycarbonyl-hydrazid (BOC-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z)
Man löst 26 g BOC-Asn-Phe-NH-NH-Z in 200 ml Tri fluoressigsäure auf und lässt 1 Stunde bei 20 stehen. Nach Verdampfen des Lösungsmittels versetzt man in 100 ml Dimethylformamid mit 17 g BOC-Asn-ONP und 15 g N-Methylmorpholin. Nach 16 Stunden bei 20 wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand nacheinander mit Essig ester und verdünnter Phosphorigersäure gewaschen. Man erhält BOC-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z; Smp. 240 , [a]D20 = -28" in Dimethylformamid.
d) 1-(N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-leucyl-L-asparaginyl- L-asparaginyl-L-phenylalanin)-2-benzyloxycarbonyl-hydrazid (BOC-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z)
Man löst 22 g BOC-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z in 150 ml
Trifluoressigsäure und lässt 1 Stunde bei 20 stehen. Nach Verdampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand mit 12 g BOC-Leu-ONP und 10 g N-Methylmorpholin in 100 ml
Dimethylformamid versetzt. Nach 16 Stunden Stehenlassen bei 20 wird das Dimethylformamid verdampft und der Rückstand nacheinander mit Essigester und verdünnter Phosphorigersäure gewaschen. Man erhält BOC-Leu-Asn-Asn Phe-NH-NH-Z vom Smp. 210 , [a]D22 = 34" in Dimethylformamid.
e) 1 -(N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-leucyl- L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenylalanin)-2-benzyloxy- carbonyl-hydrazid (BOC-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z)
Man löst 57 g BOC-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z in 300 ml Trifluoressigsäure und lässt 1 Stunde bei 20 stehen.
Nach Verdampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand in Äther kristallisiert. Man löst das Tetrapeptid-trifluoracetat in 400 ml Dimethylformamid und versetzt die Lösung mit 27 g BOC-Asn-ONP und 25 g N-Methylmorpholin. Nach 16 Stunden Stehenlassen bei 20 wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand nacheinander mit Essigester und verdünnter Phosphorigersäure gewaschen. Man erhält BOC Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z vom Smp. 250 (Zers.), [a]DZO = -340 in Dimethylformamid.
f) 1-(1-Asparaginyl-L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenyl- alamin)-2-benzyloxycarbonyl-hydrazid trifluoracetat (H-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z Trifluoracetat)
Man löst 43,5 g BOC-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z in 200 ml Trifluoressigsäure und lässt 1 Stunde bei 20 stehen. Nach Eindampfen wird der Rückstand mit Hilfe von Äther kristallisiert. Man erhält H-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe NH-NH-Z-Trifluoracetat; Smp. 242", [a]D20 = -22" in Dimethylformamid.
Teilsequenz E tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl
L-tryptophanyl-L-arginin-hydrazid (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-NH-NH2 - CH3COOH) a) N-tert. -Butyloxycarbonyl-L-tryptophanyl-(guanido)-N- nitro-L-argininmethylester (BOC-Trp-Arg(NO2)-OMe)
Man löst 35 g H-Arg(NO2)-OMe RCl, 63 g BOC Trp
OCP und 14 g N-Methylmorpholin in 300 ml Dimethylform amid auf und lässt 16 Stunden bei 20 stehen. Nach Ver dampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand in Essig ester aufgenommen und mit verdünnter Schwefelsäure ge waschen. Man engt etwas ein und fällt mit Äther aus. Dabei kristallisiert BOC-Trp-Arg(NO2)-OMe vom Smp. 1300, [a]D20 = -22" in Dimethylformamid.
b) N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-tyrosyl-L-tryptophanyl (guanido)-N-nitro-argininmethylester (BOC-Tyr-Trp
Arg(NO2)-OMe)
Man löst 15 g BOC-Trp-Arg(NO2)-OMe in 80 ml Sn methanolischer Salzsäurelösung auf und lässt 1 Stunde bei
Zimmertemperatur stehen. Nach Verdampfen des Lösungs mittels und Behandeln mit Äther verbleiben 13 g H-Trp
Arg(NO2)-OMe als Hydrochlorid zurück; Smp. 1200, [a]D20 = -90 in Dimethylformamid. Dieses Dipeptid wird zusammen mit 14 g BOC-Tyr-OCP und 8 g N-Methylmor pholin in 200 ml Dimethylformamid gelöst. Nach 16 Stunden
Stehen bei 20 wird das Lösungsmittel verdampft und der
Rückstand in Essigester aufgenommen.
Nach Waschen mit verdünnter Phosphorigersäure und Einengen des Lösungs mittels kann man mit Hilfe von Äther BOC-Tyr-Trp-Arg (NO2)-OMe isolieren; Smp. 1300, [a]D20 = -11" in
Dimethylformamid.
c) tert.-Butyloxycarbonyl-L-alanyl-L-tyrosyl-L-trypto- phanyl-(guanido)-N-nitro-L- argininmethylester (BOC-Ala-Tyr-Trp-Arg(NO2)-OMe)
Man löst 13,5 g BOC-Tyr-Trp-Arg(NO2)-OMe in
130 ml 5n methanolischer Salzsäurelösung auf, lässt 1 Stunde bei 25" stehen, dampft zur Trockne ein, wäscht den Rück stand mit Dimethyläther, filtriert ab, löst in 100 ml Dimethyl formamid auf und versetzt mit 8,0 g BOC-Ala-OCP und
3,0 ml Triäthylamin. Nach 16 Stunden bei 25 gibt man
500 ml Essigester hinzu, wäscht mit verdünnter Schwefelsäure und Kaliumbicarbonatlösung und dampft zur Trockne ein. Nach Waschen des Rückstandes mit Chloroform erhält man BOC-Ala-Tyr-Trp-Arg(NO2)-OMe; Smp. 1200 (Zers.), [a]D20 = -12" in Dimethylformamid.
d) tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl L-tryptophanyl-(guanido)-N-nitro-L-argininmethylester (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg(NO2)-OMe)
Man löst 12,3 g BOC-Ala-Tyr-Trp-Arg(NO2)-OMe in 100 ml Sn methanolischer Salzsäure, lässt 1 Stunde bei 25 stehen, dampft zur Trockne ein, wäscht den Rückstand mit Diäthyläther, löst ihn in 100 ml Dimethylformamid, versetzt mit 14 ml Triäthylamin und 8,5 g BOC-Ser-N3, lässt 16 Stunden bei 0 stehen, gibt 500 ml Essigester zu, wäscht nacheinander mit verdünnter Schwefe Essigester um. Man erhält Z-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe; Smp. 208 , [a]D20 = -27" in Dimethylformamid.
Man löst 20 g von dem oben erhaltenen Tetrapeptid in 200 ml eines Gemisches von Trifluoressigsäure/Essigester (1:1) auf, leitet während 1 Stunde bei 0 einen Strom gasförmigen Bromwasserstoffs ein, dampft anschliessend ein und kristallisiert den Rückstand aus Methanol/Diäthyläther um.
Man erhält H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe 1,3 HBr; Smp. 202", [a]n20 = 100 in Dimethylformamid.
c) H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OH
Man löst 372 g H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe. 1,3 HBr in 1800 ml Methanol, gibt 900 ml 2n Natronlauge zu, lässt
1 Stunde bei 25 stehen, gibt 240 ml Eisessig zu und lässt 2 Stunden bei 0stehen. Man filtriert die ausgeschiedene kristalline Masse ab, wäscht diese zuerst mit ln Essigsäure, anschliessend mit Wasser und trocknet bei 50 im Hochvakuum. Man erhält das H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OH; Smp. 219 , [am20 = 530 in ln Ammoniak.
Teilsequenz F2 tert.-Butyloxycarbonyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-seryl-
L-asparaginyl-L-leucyl-L-serin-hydrazid (BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu-S er-NH-NH2) a) H-Asn-Leu-Ser-OMe RCl
Man löst 43 g H-Leu-Ser-OMe HCI und 53 g BOC-Asn ONP in 400 ml Dimethylformamid auf, gibt 22 ml Triäthylamin zu, lässt 16 Stunden bei 25 stehen, dampft zur Trockne ein und kristallisiert den Rückstand aus Methanol um. Man erhält 51,6 g BOC-Asn-Leu-Ser-OMe; Smp. 1900, [a]D20 = -24" in Dimethylformamid, das man in 500 ml einer 4n Lösung von Salzsäure in Methanol löst. Man lässt 1 Stunde bei 25 stehen, dampft zur Trockne ein, löst den Rückstand in Methanol und fällt mit Diäthyläther.
Man erhält H-Asn Leu-Ser-OMe HCI; Smp. 1800, [a]D20 = -23" in Dimethylformamid.
b) H-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe RCl
Man löst 39,5 g BOC-Ser-NH-NH2 in 500 ml Dimethylformamid, kühlt auf -20 , gibt 200 ml einer 2n Lösung von Salzsäure in Dioxan und anschliessend 20 ml tert.-Butylnitrit zu. Nach 10 Minuten bei 200 werden 40 ml Triäthylamin und 38,0 g H-Asn-Leu-Ser-OMe HCl hinzugefügt, danach 16 Stunden bei 0 gerührt, zur Trockne eingedampft und der Rückstand aus Chloroform/Diäthyläther umkristallisiert.
Man erhält BOC-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe; Smp. 135 , [a]D20 = 220 in Dimethylformamid, das man in 420 ml einer 4n Salzsäurelösung in Methanol löst. Man lässt 1 Stunde bei 25 stehen, dampft zur Trockne ein und kristallisiert aus Methanol/Essigsäureäthylester um. Man erhält H-Ser-Asn Leu-Ser-OMeRCl; Smp. 155 (Zers.), [am20 = 150 in Dimethylformamid.
c) B OC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser-NH-NH2
Man löst 18,5 g H-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe HC1 und 18,0 g BOC-Cys(Bzl)-ONP in 100 ml Dimethylformamid auf, gibt 10 ml Wasser, 3,5 ml Essigsäure und 5,6 ml Triäthylamin zu, lässt 16 Stunden bei 25" stehen, dampft zur Trockne ein und kristallisiert aus Methanol um. Man erhält 25,1 g BOC-Cys (Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe; Smp. 182", [a]D20 = -17" in Dimethylformamid, das man unter leichtem Erwärmen in 200 ml Dimethylformamid löst.
Man gibt 200 ml Methanol und 20 ml Hydrazinhydrat zu, lässt 16 Stunden bei 30 stehen, fällt mit Diäthyläther, wäscht den Niederschlag mit Diäthyläther/Methanol (1:1) und trocknet das so erhaltene BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser-NH-NH2; Smp. 224", [a]D20 = -13" in Dimethylformamid.
Äthoxycarbonyl-L-hemicystinyl-L-seryl-L-asparaginyl L-leucyl-L-seryl-L-threonyl-L-hemicystinyl-L-valyl-L-leucin
EMI6.1
Man löst 18,4 g B OC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser-NH- NH2 (Teilsequenz F2) in 150 ml Dimethylformamid, kühlt auf 200, gibt 40 ml einer 2n Lösung von Salzsäure in Dioxan und 15 ml tert.-Butylnitrit zu. Nach 10 Minuten bei 200 gibt man noch 28 ml Triäthylamin und 16,2 g H-Thr-Cys(Bzl) Val-Leu-OH (Teilsequenz F1) zu und rührt 16 Stunden bei 25". Danach wird filtriert, die Lösung eingedampft und der Rückstand mit 1n Essigsäure durchgewaschen.
Man erhält B OC-eys(Bzl)-S er-Asn-Leu-S er-Thr-Cys (Bzl)-Val- Leu-OH; Smp. 217 , [a]D20 = -270 in Dimethylformamid.
Man löst das erhaltene Produkt in 5000 ml getrocknetem Ammoniak, gibt unter Rühren und Sieden des Ammoniaks Natriummetall bis zur tiefblauen Färbung zu. Zwecks Entfärbung wird Ammoniumchlorid hinzugefügt. Man dampft zur Trockne ein und wäscht den Rückstand mit 1n Essigsäure und Aceton durch. Nach Trocknen erhält man BOC Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-OH; Smp. 248 (Zers.), [a]D20 = M1 0 in Dimethylformamid/Wasser (3 : 1).
Man löst das so erhaltene Nonapeptid in 5000 ml 0,01n Ammoniak auf, gibt unter Rühren 1n Wasserstoffperoxyd bis zur negativen Nitroprussiatreaktion zu, dann noch 200 ml
EMI6.2
<tb> Eisessig, <SEP> filtriert <SEP> und <SEP> lyophilisiert. <SEP> Man <SEP> erhält <SEP> BOC-Cyrs-Ser
<tb> Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-OH; <SEP> Smp. <SEP> 238 <SEP> (Zers),
<tb> [a]n20 = 180 in Dimethylformamid/Wasser (3 1), das man in 300 ml Trifluoressigsäure löst, lässt 30 Minuten bei 25" stehen, dampft ab, wäscht den Rückstand mit Essigester und löst ihn in 300 ml Dimethylformamid auf.
Zu dieser Lösung gibt man 30 g Kohlensäure-p-nitrophenyl-äthylester - der wie nachstehend beschrieben hergestellt ist - sowie 14 ml Triäthylamin zu, lässt 16 Stunden bei 25 stehen, dampft ab und wäscht den Rückstand mit Chloroform. Man löst in 300 ml Dimethylformamid, gibt 50 ml Wasser und 50 g DOWEX-50 hinzu, rührt 15 Minuten, filtriert, wäscht den Harz mit Dimethylformamid und dampft das Filtrat zur Trockne ein. Man wäscht den Rückstand zuerst mit Chloroform und anschliessend mit Essigester und trocknet. Man
EMI6.3
<tb> erhält <SEP> das <SEP> EOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-OH;
<tb> Smp. 263", [a]D20 = 210 in Dimethylformamid/Wasser (3:1).
Kohlensäure-p-nitrophenyl-äthylester
Man löst 200 g p-Nitrophenol und 113 ml Pyridin in 1200 ml Essigester, kühlt auf 0 , gibt unter Rühren 156 ml Chlorameisensäureäthylester zu, rührt noch 30 Minuten bei 0 , wäscht mit Wasser, trocknet über Na2SO4 und dampft zur Trockne ein. Man löst den Rückstand in Diäthyläther und kristallisiert den Kohlensäure-p-nitrophenyl-äthylester durch Zugabe von Petroläther; Smp. 65".
Teilsequenz ABC Nim-Trityl-L-histidyl-L-arginyl-L-phenylalanyl
L-seryl-glycyl-L-norleucyl-glycyl-L-phenylalanyl glycyl-L-prolyl-L-glutamyl-L-threonyl-L-prolin amid Triacetat (H-His(Trt)-Arg-Phe-Ser-Gly-Nle- Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 .3 CH3COOH) a) L-Seryl-glycyl-L-norleucyl-glycyl-L-phenylalanyl- glycyl-L-prolyl-L-glutamyl-L-threonyl-L-prolinamid Tetra- hydrochlorid (H-S er-Gly-Nle-Gly-Ph e-Gly-Pro-Glu- Thr-Pro-NH2 4 HC1)
Man löst 12 g H-Phe-Gly-Pro-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2 in 100 ml Dimethylformamid und 20 ml Acetonitril bei 0 und gibt 2,1 g Hydroxysuccinimid, 8,0 g Z-Ser-Gly-Nle Gly-OH, 4,0 g Dicyclohexylcarbodiimid zu, lässt über Nacht bei 0 stehen,
abfiltriert, verdampft im Vakuum und kristallisiert aus Chloroform. Man erhält Z-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe Gly-Pro-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2; Smp. 125-138 , [a]D20 = -440 in Dimethylformamid.
Man löst in 400 ml Dioxan und 40Q ml HCl/Dioxan und hydriert bei Normaldruck in Gegenwart von Palladiumkatalysator und Säure bis zum Ende der Wasserstoffaufnahme. Man filtriert, dampft im Vakuum ein, löst in Methanol, versetzt mit Äther und erhält H-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu- Thr-Pro-NH2 4 HCI; Smp. 1300 (Zers.), [a]D20 = -520 in Dimethylformamid.
b) Nim-Trityl-L-histidyl-L-arginyl-L-phenylalanyl- L-seryl-glycyl-L-norleucyl-glycyl-L-phenylalanyl-glycyl - L-prolyl-L-glutamyl-L-threonyl-L-prolinamid#triacetat (H-His(Trt) -Arg-Phe-S er-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro Glu-Thr-Pro-NH2 .3 CH3COOH)
Man löst 9,9 g Trt-His(Trt)-Arg-Phe-NH-NH2 RCl (Teilsequenz C) in 100 ml Dimethylformamid, kühlt auf -20 , gibt 15 ml Dioxan/HCl 2n und anschliessend 1,16 ml tert.-Butylnitrit zu, rührt 10 Minuten bei -20 , gibt 28 ml Triäthylamin und 10,0 g H-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe- Gly- Pro Glu-Thr-Pro-NH2 HCl zu, rührt 4 Stunden bei 0 , filtriert und dampft zur Trockne ein.
Man löst den Rückstand in einem Gemisch von Essigester/Methanol (8 2) auf, wäscht mit verdünntem Ammoniak und anschliessend mit Wasser bis zur Neutralität, trocknet über Natriumsulfat, konzentriert auf 100 ml und fällt durch Zugabe von Diäthyläther. Man löst den Niederschlag wiederum in Dimethylformamid auf und fällt durch Zugabe von Diäthyläther. Man erhält Trt His(Trt)-Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr- Pro-NH2 [Smp. 168 (Zers.), iD20 = 430 in Dimethylformamid], das man in 500 ml Essigsäure/Wasser (8 : 2) löst.
Man lässt 3 Stunden bei 40 stehen, dampft ein, wäscht den Rückstand in Diäthyläther und trocknet im Hochvakuum über KOH-Spänen. Man erhält H-His(Trt)-Arg-Phe-Ser Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2!3 CH3COOH; Smp. 182" (Zers.), [a]D20 = -56" in Essigsäure.
Teilsequenz DE N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl-
L-tryptophanyl-L-arginyl-L-asparaginyl-L-leucyl-
L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenylalamin-hydrazid di- acetat (B OC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn- Phe-NH-NH2 - 2 CH3COOH) a) 1-(N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl- L-tyrosyl-L-tryptophanyl-L-arginyl-L-asparaginyl-L-leucyl- L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenylalanin)-2-b enzyl oxycarbonyl-hydrazid-diacetat (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z 2 CH3COOH)
Man kühlt 320 ml Dimethylformamid auf -20 , gibt
100 ml 2n Chlorwasserstoff in Dioxan zu und löst darin 68 g BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-NH-NH2 acetat (Teilsequenz E).
Anschliessend versetzt man mit 12 ml tert.-Butylnitrit, lässt
10 Minuten bei 200 rühren und tropft 35 ml Triäthylamin zu. Das so erhaltene Gemisch wird mit einer Lösung, entstanden aus 8,8 g H-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z Trifluoracetat (Teilsequenz D) und 17 ml Triäthylamin in
150 ml Dimethylformamid vereinigt. Nach 16 Stunden Stehenlassen bei 0 wird eingedampft. Man löst den Rückstand in Essigester/Butanol und wäscht mit verdünnter Essigsäure und Ammoniaklösung. Nach Eindampfen des Lösungsmittels verbleibt das B OC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu- Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z CH3COOH vom Smp. 175o, [a]D20= - 19,50 in Dimethylformamid.
b) tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl- L-tryptophanyl-L-arginyl-L-asparaginyl-L4eucyl L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenylalanin hydrazid di- acetat (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn Phe-NH-NH2 2 CH3COOH)
Man löst 90 g BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn Asn-Phe-NH-NH-Z 2 CH3COOH in 500 ml Dimethylformamid und hydriert mit 10 g Pd/C (10%ig) bis zum Ende der Wasserstoffaufnahme. Nach Abfiltrieren des Katalysators wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand aus einem Gemisch von Äther und Äthanol kristallisiert.
Man erhält BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe- NH-NH2-2 CH3COOH vom Smp. 265 , [or]D20 = -570 in Dimethylformamid.
Teilsequenz ABCDE
L-Seryl-L-alanyl-L-tyrosyl-L-tryptophanyl-L-arginyl
L-asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl-L-asparaginyl
L-phenylalanyl-L-histidyl-L-arginyl-L-phenylalanyl
L-seryl-glycyl-L-norleucyl-glycyl-L-phenylalanyl-glycyl
L-phenylalanyl-glycyl-L-prolyl-L-glutamyl-L-threonyl
L-prolinamid hexatrifluoracetat ( H - S er-Ala-Tyr-Trp-Arg
Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe
Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 6 CF3C02H)
Man löst 15,2 g BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu- Asn-Asn-Phe-NH-NH2 diacetat (Teilsequenzen D, E) in 200 ml Dimethylformamid, kühlt auf -20 , gibt 15 ml Dioxan/HCl 2n und anschliessend 1,16 ml tert.-Butylnitrit zu und rührt 10 Minuten bei -20". Man gibt 14 ml Triäthylamin und eine Lösung von 18,6 g des in Teilsequenz A, B,
C erhaltenen Tridecapeptidacetats zu, rührt das erhaltene Gemisch 16 Stunden bei 0 , filtriert und dampft zur Trockne ein. Man wäscht den Rückstand mit Diäthyläther und mit Chloroform, löst in Dioxan/Wasser (8 : 2), behandelt die erhaltene Lösung mit 100 ml Amberlit-IRA-410 (Acetat Form), dampft ein und kristallisiert den Rückstand aus Isopropanol/Wasser um. Man erhält das Boc-Ser-Ala-Tyr-Trp Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His(Trt)-Arg-Phe-Ser-Gly Nle-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 - Acetat; Smp. 145" (Zers.), [a]D20 = -67" in Essigsäure, das man unter Stickstoffatmosphäre in 500 ml Trifluoressigsäure löst.
Man lässt 1 Stunde bei 25 stehen, konzentriert auf 100 ml und fällt durch Zugabe von 1000 ml Diäthyläther. Man filtriert, löst den Rückstand in Dimethylformamid und fällt mit Diäthyl äther. Nach Trocknen über KOH-Spänen erhält man das H-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 - 6 CF3CO2H; Smp. 1300 (Zers.), [a]D20 = 42" in Essigsäure.
Beispiel 1 Äthoxycarbonyl-L-hemicystinyl-L-seryl-L-asparaginyl L-leucyl-L-seryl-L-threonyl-L-hemicystinyl-L-valyl-L-leucyl-
L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl-L-tryptophanyl-L-arginyl
L-asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl-L-asparaginyl L-phenylalanyl-L-seryl-glycyl-L-norleucyl-glycyl-L-phenyl- alanyl-glycyl-L-prolyl-L-glutamyl-L-threonyl-L-prolin-
EMI7.1
<tb> amid <SEP> Rexaacetat <SEP> Octahydrat <SEP> (EOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser Thr-Cys-Val-Leu-S er-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-
Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-
Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 Rexaacetat Octahydrat)
Man löst 1,0 g Nonapeptid (Teilsequenz F) in 10 ml Dimethylformamid, gibt 1,5 g N-Hydroxysuccinimid und 0,52 g Dicyclohexylcarbodiimid zu, rührt 6 Stunden bei 25 ,
filtriert und dampft das Filtrat zur Trockne ein. Man wäscht den Rückstand mit Essigester und Diäthyläther und trocknet.
EMI7.2
<tb>
Man <SEP> erhält <SEP> EOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu O-Su; Smp. 242", das man in 10 ml Dimethylformamid löst.
Zu dieser Lösung gibt man 3,1 g Tricosapeptid-Hexatrifluoracetat (Teilsequenz A, B, C, D, E), 0,4 ml Triäthylamin sowie 1,2 g N-Hydroxysuccinimid und rührt 16 Stunden bei 250. Man dampft zur Trockne ein, wäscht den Rückstand mit Diäthyläther, Chloroform und Aceton. So erhält man das rohe, geschützte Dotriacontapeptid, das man in 100 ml 0,3 Essigsäure löst, mit 20 ml Amberlit-IRA-410 (Acetat) behandelt und gibt 50 ml 0,6n Ammoniumhydroxid hinzu.
Man stellt das pH auf 6,5 ein und schichtet.die erhaltene Lösung auf eine C'arboxymethylcellulosesäule (10 x 100 cm), die mit einer 0,15n Ammoniumacetatpufferlösung equilibriert wurde. Die Elution wird mit einem steigenden Konzentrations- und pH-Gradient (0,15n auf 0,4n; pH 6,5 auf pH 7,0) eines Ammoniumacetatpuffers durchgeführt.
Die vereinigten Fraktionen, die das reine Peptid enthalten, werden dreimal gefriergetrocknet, der Rückstand wird mit Äthanol und anschliessend mit Diäthyläther gewaschen und über Kalium
EMI8.1
<tb> hydroxid <SEP> im <SEP> Hochvakuum <SEP> getrocknet. <SEP> Man <SEP> erhält <SEP> EOC-Cyr
<tb> Ser-Asn-Leu-S <SEP> er-Thr-Cy's-Val-Leu-S <SEP> er-Ala-Tyr-Trp <SEP> -Arg Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 6 CH1CO2H 8 H2O; Smp.
240 (Zers.), [a]D20 =-56" in Essigsäure ln. Aminosäurezusammensetzung nach Säurehydrolyse (6n, 16 Std.): Ala1,1, Arg2,0, Asp3,9, Cys/21,6, Glu1,2, Gly3,0 Hisl,l, Leu2,9, Nlet,O, Phe3,0, Pro2,1, Ser3,8, Thrs,9, Tyr1,0, ValO,g (Trpl,o durch Spektrophotometrie).
Process for the preparation of previously unknown polypeptide derivatives The present invention relates to a process for the preparation of previously unknown polypeptide derivatives of the general formula
EMI1.1
10 11 i2 13 1 15 16 17 18 to 19 20 21 22 23 24 Ser-A1a-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-A sn-Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly-
25 26 27 28 29 70 3). 32 Nle - Gly - Phe - Gly - Pro - Glu - Thr - Pro - Tu? L, where R stands for an alkyl, alkenyl, optionally substituted aralkyl or an optionally substituted aryl group, their therapeutically effective acid addition salts and heavy metal complexes. As R, for example, the ethyl, allyl, phenyl, p-nitrophenyl, p-chlorophenyl, p-bromophenyl, p-methoxyphenyl, azobenzene or p-methoxy-azobenzene radical come into question.
The polypeptide derivatives according to the invention are distinguished by their resistance to the degrading action of aminopeptidases. Another advantage is the well-known oxidation-resistant norlencin residue in position 25.
The previously unknown polypeptide derivatives can be prepared by methods generally known for the synthesis of compounds of this type, the amino acids being linked to one another individually in the order specified in the above formula or after prior formation of smaller peptide units, by adding corresponding compounds necessary for their construction Formation of CONH bonds condensed with one another in any chronological order, with free functional groups not participating in the reaction being intermediately protected by suitable protective groups, at any point in time during the synthesis while maintaining the
EMI1.2
in position 1, in which R has the above meaning, splits off the protective groups,
the mercapto groups are oxidized to the disulfide after formation of the partial sequence 1 to 7 and the carboxyl group of the terminal prolyl residue is converted into the amide group. The introduction of the group of the general formula desired in the end product on the terminal L-hemicystine molecule
EMI1.3
in which R has the above meaning, can take place in any stage before the last stage. In the last stage, however, methods are to be used in which racemization does not occur or can be kept low, preferably the azide or the activated ester method, with N-hydroxysuccinimide preferably being used for activation. The benzyl residues used to protect the SH groups in the synthesis of cysteine-containing peptides are usually split off at the end of the synthesis by treatment with sodium in liquid ammonia.
It has now been found that the splitting off of the benzyl protective groups and the production of the (Cys) S-S (Cys) bond before the last stage lead to particularly good yields of the end product.
In the construction of the new polypeptide derivatives, the tert-butyloxy group has proven useful for blocking the γ-carboxy group, for example in the partial sequence A described below, but other protective groups such as methoxy, ethoxy, tert-amyloxy can also be used -, the amide or the benzyl group can be used.
The triphenylmethyl group has proven useful for blocking the imidazole group of the histidine residue in the partial sequence C described below, but other suitable protective groups, such as the carbo-tert-butoxy, the carbo-tert-amyloxy, the carbobenzoxy or the Benzyl group can be used.
The nitro group was used to block the guanido group of the arginine residue in the partial sequence E described below, but other suitable protective groups such as the tosyl group, the p-nitrobenzoxycarbonyl group or the 2- (isopropyloxycarbonyl) -3,4,5,6-tetrachlorobenzoyl group can also be used be used. The protective effect of protonation of the guanido group can also be used in the synthesis.
The new polypeptide derivatives can also be obtained or used in the form of their salts. Salts include those with organic acids, such as acetic acid, propionic acid, glycolic acid, lactic acid, pyruvic acid, malonic acid, succinic acid, maleic acid, fumaric acid, tartaric acid, citric acid, benzoic acid, cinnamic acid, salicylic acid, 2-phenoxy or 2-acetoxybenzoic acid, mandelic acid, methanesulfonic acid, methanesulfonic acid Hydroxyethanesulfonic acid, benzene or toluenesulfonic acid, naphthalenesulfonic acid, sulfanilic acid and polymeric acids such as tannic acid, alginic acid, polygalacturonic acid, polychloretine phosphate or carboxymethyl cellulose and salts with inorganic acids such as hydrohalic acid, e.g. B. hydrochloric acid or hydrobromic acid, nitric acid, thiocyanic acid, sulfuric acid and phosphoric acid in question. As a heavy metal complex z.
B. those of zinc O + O + in question.
The starting products for the production of the new polypeptide derivatives can, if they were not previously known, be obtained by the methods known for peptide chemistry, the amino acids being linked to one another individually or after prior formation of smaller peptide units.
The new compounds represent an important therapeutic principle that lowers the calcium plasma level, in particular the increased calcium plasma level, and, as an antagonist of the parathyroid hormone, brings about a positive calcium balance in the bones.
It is therefore indicated for all conditions in which a lowering of the plasma calcium level is desired, e.g. B.
Hypercalcemias of various origins, deficiency of endogenous thyrocalcitonin as a result of loss of thyroid tissue, hyperfunction of the parathyroid glands.
The new compounds are indicated for all bone affections that are based on increased degradation or in which increased calcium fixation in the bone is desired, e.g. B. Osteoporosis of various origins (e.g.
post-climacteric, post-traumatic, caused by corticosteroid therapy or inactivity, etc.), fractures, osteomalacia, rickets and especially for combination therapy with calcium or phosphate.
Biological testing of the new compounds showed an efficacy of about 100 to 450 MRC units / mg peptide. The required daily dose (administered in conjunction with it) in MRC units is 20 mU to 10 U, preferably 100 mU / kg animal weight. In humans, the daily dose (im administered) in MRC units is 1 to 500 U.
Preferably a daily dose of 5 U i. m. administered.
The new compounds can be used as remedies, e.g. B. in the form of pharmaceutical preparations, use. These contain the compounds mentioned in a mixture with an organic or inorganic carrier material suitable for parenteral administration. For the same, those substances come into question that do not react with the new compound, such as. B. gelatin, lactose, starch, magnesium stearate, talc, vegetable oils, benzyl alcohols, gum arabic, polyalkylene glycols, petrolatum, cholesterol or other known excipients.
The pharmaceutical preparations can e.g. B. in liquid form as solutions, suspensions or emulsions.
If necessary, they are sterilized and / or contain auxiliaries such as preservatives, stabilizers, wetting agents or emulsifiers. They can also contain other therapeutically valuable substances. The new compounds can also be administered in the form of depot preparations.
The new compounds and their salts can also be used as intermediates for the production of pharmaceutical preparations.
The following abbreviations are used:
Z = benzyloxycarbonyl
Bzl = benzyl
BOC = tert-butyloxycarbonyl
Trt = trityl = triphenylmethyl
OTB = tert-butyloxy
ONP = p-nitrophenyl ester
OCP = 2,4,5-trichlorophenoxy
OMe = methoxy
OEt = ethoxy
NO2 = Nitro Ser = L-Seryl
Asn = L-asparaginyl
Leu = L-leucyl
Thr = L-threonyl
Val = L-valyl
Ala = L-alanyl
Tyr = L-tyrosyl
Trp = L-tryptophanyl
Arg = L-arginyl
Phe = L-phenylalanyl
Glu = L-glutamyl
His = L-histidyl
Pro = L-prolyl
Gly = glycyl
Nle = L-norleucyl
Cys = L-cysteinyl
OSu = oxysuccinimide
EOC = ethoxycarbonyl
In the following examples, which explain the implementation of the process but are not intended to restrict the scope of the invention in any way, all temperatures are given in degrees Celsius.
Partial sequence A L-phenylalanyl-glycyl-L-prolyl-y-tert.-butyloxy-L-glutamyl-
L-threonyl-L-prolinamide (H-Phe-Gly-Pro-Glu (OTB)
Thr-Pro-NH2)
At -5 "134 g of Z-Thr-NH-NH2 are dissolved in 21 lN hydrochloric acid and 0.55 l in sodium nitrate is added. After 5 minutes, potassium carbonate is added to pH 9, the azide formed is extracted with ethyl acetate and a solution of 80 g of H-Pro-NH2 hydrochloride in 100 ml of water, 500 ml of dimethylformamide and 77 ml of triethylamine are added, the ethyl acetate is evaporated at 20 in a vacuum and left to stand at 25 overnight.
The remaining solution is evaporated in vacuo, the residue is dissolved in ethyl acetate, the solution is washed with water, dilute hydrochloric acid and an aqueous calcium carbonate solution and dried over sodium sulfate. It is evaporated in vacuo, dissolved in warm ethyl acetate and cooled. Z-Thr-Pro-NH2 is obtained; 148 ", [a] D20 = -72" in 95% acetic acid. 90 g of Z-Thr-Pro-NH2 are then dissolved in 2 l of dioxane and 260 ml in hydrochloric acid and hydrogenated at 20 and atmospheric pressure in the presence of a palladium catalyst. It is filtered, the solution evaporated in vacuo, the residue is washed with ethyl acetate and H-Thr-Pro-NH2 HCl is obtained; M.p. 216, [a] D20 = 640 in 95% acetic acid.
This is dissolved in 500 ml of dimethylformamide, 50 ml of water and 32 ml of triethylamine, and 118 g of Z-Glu (OTB) -OCP and 800 ml of tetrahydrofuran are added. The mixture is left to stand at 20 overnight, evaporated in vacuo and the residue is crystallized with ethyl ether. Z-Glu (OTB) -Thr-Pro-NH2, melting point 65 "(decomp.), [A] = -18 in dimethylformamide is obtained.
80 g of Z-Glu (OTB) -Thr-Pro-NH2 are dissolved in 1.5 l of dioxane and 200 ml of water and hydrogenated at 20 and normal pressure in the presence of a palladium catalyst. The solution is filtered and evaporated in vacuo, and diethyl ether is added to the residue, H-Glu (OTB) -Thr-Pro-NH2 being obtained; M.p. 65 "(dec.), [A] D20 = -280 in dimethylformamide.
This is dissolved in 700 ml of dimethylformamide at 0, 200 ml of acetonitrile, 68 g of Z-Phe-Gly-Pro-OH, 18 g of N-hydroxysuccinimide and 32 g of dicyclohexylcarbodiimide are added, left to stand overnight at 20, filtered, evaporated in vacuo and with Ethyl acetate added. The solution is then washed with water, dilute hydrochloric acid and aqueous potassium carbonate solution, dried over sodium sulfate, evaporated in vacuo and the residue is crystallized from ethyl acetate / ethyl ether. Z-Phe-Gly-Pro-Glu (OTB) -Thr-Pro-NH2 is obtained; Melting point 1200 (decomp.), [A] D20 = -66 "in dimethylformamide, which is dissolved in 1500 ml of dioxane and 300 ml of water. 30 g of palladium-carbon (10%) are added and the mixture is hydrogenated until hydrogen uptake is complete.
It is filtered, the filtrate is evaporated and the residue is crystallized from dioxane. The H-Phe-Gly-Pro-Glu (OTB) -Thr-Pro-NH2 is obtained; 153, [a] D2 = -79 in dimethylformamide.
Partial sequence B
Benzyloxycarbonyl-L-seryl-glycyl-L-norleucyl-glycine (Z-Ser-Gly-Nle-Gly-OH) a) Benzyloxycarbonyl-L-norleucyl-glycine (Z-Nle-Gly-OH)
31.6 g of H-Gly-Oh are dissolved in 420 ml of NaOH, 840 ml of tetrahydrofuran are added, 130 g of Z-Nle-ONP are then added, and the mixture is shaken until the solution becomes clear, and left to stand at 25 overnight. It is then concentrated to 500 ml in vacuo and the aqueous solution obtained is adjusted to pH 9 with NaOH, extracted twice with ether, then acidified with 4N hydrochloric acid and extracted with ethyl acetate. The ethyl acetate solution is washed with water and 30% strength sodium chloride solution, dried over sodium sulfate and evaporated in vacuo.
The residue is triturated with ether and allowed to crystallize for 2 hours at -20 ". Z-Nle-Gly-OH; mp 138,] D20 = 40 in dimethylformamide is obtained.
b) Benzyloxycarbonyl-glycyl-L-norleucyl-glycine (Z-Gly-Nle-Gly-OH)
Dissolve 100 g of Z-Nle-Gly-Oh in 1000 ml of 4N HBr / glacial acetic acid, leave for 50 minutes at 25, rub with ether, filter off crystals and wash well with ether. HBr-H-Nle-Gly-OH, [a] D20 = + 24.7 in acetic acid (95%) is obtained.
84 g of HBr R-Nle-Gly-OR are dissolved in 240 ml of water, and 152 ml of 4N NaOH, 800 ml of tetrahydrofuran and 91 g of Z-Gly-ONP are added. Shake at 25 for 1 hour and then let stand at 25 for 2 days. It is concentrated to 500 ml in vacuo, adjusted to pH 9 with NaOH and extracted with ether. The aqueous phase is acidified with hydrochloric acid, then extracted twice with ethyl acetate. It is washed with water, 30% sodium chloride solution, dried over sodium sulfate, evaporated in vacuo and the residue is triturated with ether. Z-Gly-Nle-Gly-OH is obtained; 155 ", [a] 20 D = 5.60 in dimethylformamide.
c) Benzyloxycarbonyl-L-seryl-glycyl-L-norleucyl-glycine (Z-Ser-Gly-Nle-Gly-OH)
89.5 g of Z-Gly-Nle-Gly-OH are dissolved in 900 ml of 4N HBr / glacial acetic acid, left to stand for 50 minutes at 25, evaporated in vacuo, triturated with ether, filtered, washed well with ether, dried in vacuo, Dissolve in 280 ml of water, about 650 ml of dimethylformamide, add 66.5 ml of triethylamine and add the azide solution, which is obtained as follows:
940 ml of 1N hydrochloric acid are cooled to -5, 96 g of Z-Ser-NH-NH2 are added and then at 5360 ml sodium nitrite is added dropwise, stirring is continued for 6 minutes at -5 ", covered with about 600 ml of ethyl acetate of 0, adjusts to pH 8.5 with the addition of solid sodium carbonate, separates the ethyl acetate phase, extracts again, the solution is dried over sodium sulfate and filtered. The reaction solution is evaporated in vacuo, the residue is treated with 600 ml of water, acidified and extracted with ethyl acetate , washed with water and 30% strength sodium chloride solution, cooled to 0, crystals filtered off.
Z-Ser-Gly-Nle-Gly-OH is obtained; M.p. 210 (with decomposition), [a] D20 = 80 in dimethylformamide.
Partial sequence C Na, amide ditrityl-L-histidyl-L-arginyl-L-phenylalanine hydrazide RCl [(Trt) -His (Trt) -Arg-Phe-NH-NH2-HCl] a) Z-Arg (NO2) -Phe -OMe
51.8 g of H-Phe-OMe RCl are dissolved in 1 liter of ether and about 50 ml of ice water and enough sodium carbonate is added with stirring and cooling until all of the water has set. It is filtered and the filtrate is evaporated to constant weight, a colorless oil being obtained.
67.6 g of Z-Arg (NO2) -OH are dissolved in 300 ml of acetonitrile and 150 ml of dimethylformamide, and 41.2 g of H-Phe OMe are added. It is then cooled to -20 "and a solution of 43.4 g of dicyclohexylcarbodiimide in 100 ml of acetonitrile is added. The whole is left to stand in the ice box for 4 hours while shaking from time to time. The precipitate formed is filtered off and the filtrate is evaporated 1 liter of ice ester dissolved and then washed in the cold with 1N sodium hydroxide solution, water, sulfuric acid, water and saturated sodium chloride solution. The ethyl acetate phase, dried over sodium sulfate, is evaporated completely.
After recrystallization from ethyl acetate / petroleum ether, ZArg (NO2) -Phe-OMe is obtained; 131-133 ", [a120 = 70 in methanol, -4" in dimethylformamide.
b) H-Arg (NO2) -Phe-OMe 0.5 H2O 1.2 HBr
20 g of Z-Arg (NO2) -Phe-OMe are dissolved in 50 ml of glacial acetic acid and 50 ml of 40% strength hydrobromic acid in glacial acetic acid are added with slight cooling. Then the whole thing is left to stand at 20 for 1 hour with occasional shaking. After complete evaporation, the residue is dissolved in 200 ml of water and washed twice with ether.
The aqueous phase is completely evaporated and the residue is recrystallized from methanol / ether. M.p. 165 to 167 with dec., [A] D20 = + 180 in methanol, + 14 "in dimethylformamide.
c) Z-His (Z) -Arg (NO2) -Phe-OMe
46.1 g of H-Arg (NO2) -Phe-OMe 0.5 H2O 1.2 HBr are dissolved in 100 ml of water, then heated and then cooled. After addition of chloroform and glacial acetic acid, the pH is adjusted to 9 with ammonia. The chloroform phase is washed once more with water, then dried over sodium carbonate and filtered. A solution of 44.5 g of Z-His (Z) -OH, 12.1 g of hydroxysuccinimide in 200 ml of acetonitrile and 100 ml of pyridine is added to the filtrate, then the whole is cooled to -20 "and mixed with a solution of 21.1 g of dicyclohexylcarbodiimide in 70 ml of acetonitrile are then added to the mixture, and the mixture is then left to stand for 4 hours in an ice box with occasional stirring, the precipitate formed is filtered off and the filtrate is evaporated.
The residue is taken up in ethyl acetate and then washed as follows: 10% potassium carbonate solution (pR X 10), water, saturated saline solution, water, saturated saline solution, sulfuric acid (pH 3), water, saline solution. The ethyl acetate phase, dried over sodium sulfate, is evaporated completely, a light beige foam being obtained. This foam is dissolved twice in a little methanol and precipitated with ether. The ether phases are decanted off and the precipitate is dried. Z-His (Z) -Arg (NO2) Phe-OMe (amorphous foam), [a] D20 = -8 in methanol, 0 in dimethylformamide is obtained.
d) H-His-Arg-Phe-OMe-4 HCI
25 g of Z-His (Z) -Arg (NO2) -Phe-OMe are dissolved in 800 ml of glacial acetic acid. Then 10 g of 10% palladium on activated charcoal are stirred into 200 ml of 1N hydrochloric acid and added to the solution. The whole is subjected to a 2 hour hydrogenation and then the catalyst is filtered off. The filtrate is again mixed with 5 g of 10% palladium on activated charcoal in water and subjected to the hydrogenation, which is complete after 51/2 hours. About 80% of the theoretical amount of hydrogen is consumed here. The catalyst is filtered off and the filtrate is evaporated completely, H-His-Arg-Phe-OMe-4 HCl being obtained in the form of an amorphous foam.
e) Trt-His (Trt) -Arg-Phe-OMe RCl
21.5 g of H-His-Arg-Phe-OMe-4 HCl are dissolved in 100 ml of pyridine and about 100 ml of dimethylformamide. At about + 5, triethylamine is added to pH 9 and a solution of 29 g of trityl chloride in 300 ml of pyridine is then added dropwise over 5 minutes. After the addition is complete, the pH is checked from time to time and, if necessary, adjusted to about pH 9 with triethylamine. The whole is evaporated after about 4 hours, the residue is taken up in chloroform and water and adjusted to pH 4 with the addition of a little 1N hydrochloric acid. The chloroform phase is separated off, washed twice with water, dried over sodium sulfate and completely evaporated.
Ether is added to the residue and the ether is then filtered off, Trt-His (Trt) -Arg-Phe-OMe HCl being obtained.
f) Trt-His (Trt) -Arg-Phe-NH-NH2 HCl
17 g of Trt-His (Trt) -Arg-Phe-OMe HCl are dissolved in 200 ml of methanol, and 40 ml of hydrazine hydrate are added.
It is then left to stand for 2 days at room temperature.
It is evaporated, the residue is dissolved in chloroform and washed twice with water. The chloroform phase is dried over sodium sulfate and evaporated. The residue is then washed with ether and filtered off; it consists of Trt-His (Trt) -Arg-Phe-NH-NH2 HCI; 158, [a] D18 = in dimethylformamide.
Partial sequence D l- (H-asparaginyl-L4eucyl-L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenylalanine) -2-benzyloxycarbonyl-hydrazide trifluoroacetate (H-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z CR1COOH) a) 1- (N-tert-butyloxycarbonyl-L-phenylalanyl) -2-benzyloxycarbonyl-hydrazide (BOC-Phe-NH-NH-Z)
72 g of BOC-Phe-OH and 28 g of N-methylmorpholine are dissolved in 500 ml of methylene chloride and 26 ml are added dropwise at -5 "
Methyl chloroformate to. After 10 minutes, 44 g of Z-NH-NH2 in 100 ml of methylene chloride are added and the mixture is stirred for a further 4 hours at room temperature. After washing with dilute phosphoric acid, it is dried and evaporated.
After crystallization from petroleum ether, BOC-Phe-NH-NH-Z of melting point 117 [a] D20 = -5 "is obtained in dimethylformamide.
b) 1- (N-tert-Butyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phenyl-alanine) -2-benzyloxycarbonyl-hydrazide (B OC-Asn-Phe-NH NH
41 g of BOC-Phe-NH-NH-Z are dissolved in 400 ml of trifluoroacetic acid and left to stand at 20 for 1 hour. When the trifluoroacetic acid is evaporated, H-Phe-NH-NH-Z is obtained as crystalline trifluoroacetate with a melting point of 191 ?, [a] D20 = + 26.40 in dimethylformamide. This substance comes along with
35 g of BOC-Asn-ONP and 30 g of N-methylmorpholine dissolved in 200 ml of dimethylformamide. After 16 hours of standing at 20, the solvent is evaporated and the residue is washed successively with ethyl acetate and dilute phosphoric acid. BOC-Asn-Phe-NH-NH-Z is obtained with a melting point of 210, [aj020 = 180 in dimethylformamide.
c) 1- (N-tert-butyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-asparaginyl L-phenylalanine) -2-benzyloxycarbonyl-hydrazide (BOC-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z)
26 g of BOC-Asn-Phe-NH-NH-Z are dissolved in 200 ml of trifluoroacetic acid and left to stand at 20 for 1 hour. After evaporation of the solvent, 17 g of BOC-Asn-ONP and 15 g of N-methylmorpholine are added to 100 ml of dimethylformamide. After 16 hours at 20, the solvent is evaporated and the residue is washed successively with ethyl acetate and dilute phosphoric acid. BOC-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z is obtained; M.p. 240, [a] D20 = -28 "in dimethylformamide.
d) 1- (N-tert-Butyloxycarbonyl-L-leucyl-L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenylalanine) -2-benzyloxycarbonyl-hydrazide (BOC-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z )
Dissolve 22 g of BOC-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z in 150 ml
Trifluoroacetic acid and let stand at 20 for 1 hour. After evaporation of the solvent, the residue is mixed with 12 g of BOC-Leu-ONP and 10 g of N-methylmorpholine in 100 ml
Dimethylformamide added. After 16 hours of standing at 20, the dimethylformamide is evaporated and the residue is washed successively with ethyl acetate and dilute phosphoric acid. BOC-Leu-Asn-Asn Phe-NH-NH-Z of melting point 210, [a] D22 = 34 "in dimethylformamide is obtained.
e) 1 - (N-tert-butyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenylalanine) -2-benzyloxycarbonyl-hydrazide (BOC-Asn-Leu-Asn-Asn -Phe-NH-NH-Z)
57 g of BOC-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z are dissolved in 300 ml of trifluoroacetic acid and left to stand at 20 for 1 hour.
After evaporation of the solvent, the residue is crystallized from ether. The tetrapeptide trifluoroacetate is dissolved in 400 ml of dimethylformamide and the solution is mixed with 27 g of BOC-Asn-ONP and 25 g of N-methylmorpholine. After 16 hours of standing at 20, the solvent is evaporated and the residue is washed successively with ethyl acetate and dilute phosphoric acid. BOC Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z of melting point 250 (decomp.), [A] DZO = -340 in dimethylformamide is obtained.
f) 1- (1-asparaginyl-L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenyl-alamin) -2-benzyloxycarbonyl-hydrazide trifluoroacetate (H-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z trifluoroacetate)
43.5 g of BOC-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z are dissolved in 200 ml of trifluoroacetic acid and left to stand at 20 for 1 hour. After evaporation, the residue is crystallized with the aid of ether. H-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe NH-NH-Z-trifluoroacetate is obtained; M.p. 242 ", [a] D20 = -22" in dimethylformamide.
Partial sequence E tert-butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl
L-tryptophanyl-L-arginine hydrazide (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-NH-NH2 - CH3COOH) a) N-tert. -Butyloxycarbonyl-L-tryptophanyl- (guanido) -N- nitro-L-arginine methyl ester (BOC-Trp-Arg (NO2) -OMe)
35 g of H-Arg (NO2) -OMe RCl, 63 g of BOC Trp are dissolved
OCP and 14 g of N-methylmorpholine in 300 ml of dimethylform amide and let stand at 20 for 16 hours. After the solvent has evaporated, the residue is taken up in ethyl acetate and washed with dilute sulfuric acid. One constricts a little and falls out with ether. BOC-Trp-Arg (NO2) -OMe of melting point 1300, [a] D20 = -22 "crystallizes in dimethylformamide.
b) N-tert-butyloxycarbonyl-L-tyrosyl-L-tryptophanyl (guanido) -N-nitro-arginine methyl ester (BOC-Tyr-Trp
Arg (NO2) -OMe)
15 g of BOC-Trp-Arg (NO2) -OMe are dissolved in 80 ml of Sn methanolic hydrochloric acid solution and left for 1 hour
Stand at room temperature. After evaporation of the solvent and treatment with ether, 13 g of H-Trp remain
Arg (NO2) -OMe returned as hydrochloride; 1200, [a] D20 = -90 in dimethylformamide. This dipeptide is dissolved in 200 ml of dimethylformamide together with 14 g of BOC-Tyr-OCP and 8 g of N-methylmorpholine. After 16 hours
Standing at 20, the solvent is evaporated and the
The residue was taken up in ethyl acetate.
After washing with dilute phosphorous acid and concentrating the solvent, BOC-Tyr-Trp-Arg (NO2) -OMe can be isolated with the aid of ether; 1300, [a] D20 = -11 "in
Dimethylformamide.
c) tert-Butyloxycarbonyl-L-alanyl-L-tyrosyl-L-tryptophanyl- (guanido) -N-nitro-L-arginine methyl ester (BOC-Ala-Tyr-Trp-Arg (NO2) -OMe)
13.5 g of BOC-Tyr-Trp-Arg (NO2) -OMe are dissolved in
130 ml of 5N methanolic hydrochloric acid solution, left to stand for 1 hour at 25 ", evaporated to dryness, the residue was washed with dimethyl ether, filtered off, dissolved in 100 ml of dimethyl formamide and treated with 8.0 g of BOC-Ala-OCP and
3.0 ml of triethylamine. After 16 hours at 25 you give
Add 500 ml of ethyl acetate, wash with dilute sulfuric acid and potassium bicarbonate solution and evaporate to dryness. After washing the residue with chloroform, BOC-Ala-Tyr-Trp-Arg (NO2) -OMe is obtained; 1200 (dec.), [A] D20 = -12 "in dimethylformamide.
d) tert-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl L-tryptophanyl- (guanido) -N-nitro-L-arginine methyl ester (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg (NO2) -OMe )
12.3 g of BOC-Ala-Tyr-Trp-Arg (NO2) -OMe are dissolved in 100 ml of Sn methanolic hydrochloric acid, left to stand at 25 for 1 hour, evaporated to dryness, the residue is washed with diethyl ether and dissolved in 100 ml Dimethylformamide, mixed with 14 ml of triethylamine and 8.5 g of BOC-Ser-N3, left to stand for 16 hours at 0, added 500 ml of ethyl acetate, washed successively with dilute sulfur and ethyl acetate. Z-Thr-Cys (Bzl) -Val-Leu-OMe is obtained; M.p. 208, [a] D20 = -27 "in dimethylformamide.
20 g of the tetrapeptide obtained above are dissolved in 200 ml of a mixture of trifluoroacetic acid / ethyl acetate (1: 1), a stream of gaseous hydrogen bromide is passed in for 1 hour at 0, then evaporated and the residue is recrystallized from methanol / diethyl ether.
H-Thr-Cys (Bzl) -Val-Leu-OMe 1.3 HBr is obtained; 202 ", [a] n20 = 100 in dimethylformamide.
c) H-Thr-Cys (Bzl) -Val-Leu-OH
372 g of H-Thr-Cys (Bzl) -Val-Leu-OMe are dissolved. 1.3 HBr in 1800 ml of methanol, 900 ml of 2N sodium hydroxide solution are added, leaves
Stand at 25 for 1 hour, add 240 ml of glacial acetic acid and let stand at 0 for 2 hours. The precipitated crystalline mass is filtered off, washed first with 1N acetic acid, then with water and dried at 50 in a high vacuum. The H-Thr-Cys (Bzl) -Val-Leu-OH is obtained; M.p. 219, [am20 = 530 in ammonia.
Partial sequence F2 tert-butyloxycarbonyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-seryl-
L-asparaginyl-L-leucyl-L-serine hydrazide (BOC-Cys (Bzl) -Ser-Asn-Leu-S er-NH-NH2) a) H-Asn-Leu-Ser-OMe RCl
43 g of H-Leu-Ser-OMe HCI and 53 g of BOC-Asn ONP are dissolved in 400 ml of dimethylformamide, 22 ml of triethylamine are added, the mixture is left to stand at 25 for 16 hours, evaporated to dryness and the residue is recrystallized from methanol. 51.6 g of BOC-Asn-Leu-Ser-OMe are obtained; 1900, [a] D20 = -24 "in dimethylformamide, which is dissolved in 500 ml of a 4N solution of hydrochloric acid in methanol. The mixture is left to stand at 25 for 1 hour, evaporated to dryness, the residue is dissolved in methanol and precipitated Diethyl ether.
H-Asn Leu-Ser-OMe HCI is obtained; M.p. 1800, [a] D20 = -23 "in dimethylformamide.
b) H-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe RCl
39.5 g of BOC-Ser-NH-NH2 are dissolved in 500 ml of dimethylformamide, cooled to -20, 200 ml of a 2N solution of hydrochloric acid in dioxane and then 20 ml of tert-butyl nitrite are added. After 10 minutes at 200, 40 ml of triethylamine and 38.0 g of H-Asn-Leu-Ser-OMe HCl are added, then the mixture is stirred for 16 hours at 0, evaporated to dryness and the residue is recrystallized from chloroform / diethyl ether.
BOC-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe is obtained; Melting point 135, [a] D20 = 220 in dimethylformamide, which is dissolved in 420 ml of a 4N hydrochloric acid solution in methanol. The mixture is left to stand at 25 for 1 hour, evaporated to dryness and recrystallized from methanol / ethyl acetate. H-Ser-Asn Leu-Ser-OMeRCl is obtained; M.p. 155 (dec.), [Am20 = 150 in dimethylformamide.
c) B OC-Cys (Bzl) -Ser-Asn-Leu-Ser-NH-NH2
Dissolve 18.5 g of H-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe HC1 and 18.0 g of BOC-Cys (Bzl) -ONP in 100 ml of dimethylformamide, add 10 ml of water, 3.5 ml of acetic acid and 5, 6 ml of triethylamine are added, left to stand for 16 hours at 25 ", evaporated to dryness and recrystallized from methanol. 25.1 g of BOC-Cys (Bzl) -Ser-Asn-Leu-Ser-OMe; mp 182" are obtained. , [a] D20 = -17 "in dimethylformamide, which is dissolved in 200 ml of dimethylformamide with gentle heating.
200 ml of methanol and 20 ml of hydrazine hydrate are added, the mixture is left to stand at 30 for 16 hours, it is precipitated with diethyl ether, the precipitate is washed with diethyl ether / methanol (1: 1) and the BOC-Cys (Bzl) -Ser-Asn- thus obtained is dried Leu-Ser-NH-NH2; M.p. 224 ", [a] D20 = -13" in dimethylformamide.
Ethoxycarbonyl-L-hemicystinyl-L-seryl-L-asparaginyl L-leucyl-L-seryl-L-threonyl-L-hemicystinyl-L-valyl-L-leucine
EMI6.1
Dissolve 18.4 g of B OC-Cys (Bzl) -Ser-Asn-Leu-Ser-NH-NH2 (partial sequence F2) in 150 ml of dimethylformamide, cool to 200, add 40 ml of a 2N solution of hydrochloric acid in dioxane and 15 ml of tert-butyl nitrite. After 10 minutes at 200, 28 ml of triethylamine and 16.2 g of H-Thr-Cys (Bzl) Val-Leu-OH (partial sequence F1) are added and the mixture is stirred for 16 hours at 25 ". It is then filtered, the solution is evaporated and the residue was washed through with 1N acetic acid.
B OC-eys (Bzl) -S er-Asn-Leu-S er-Thr-Cys (Bzl) -Val-Leu-OH; M.p. 217, [a] D20 = -270 in dimethylformamide.
The product obtained is dissolved in 5000 ml of dried ammonia, and sodium metal is added with stirring and boiling of the ammonia until it turns deep blue. Ammonium chloride is added to decolorize. It is evaporated to dryness and the residue is washed through with 1N acetic acid and acetone. After drying, BOC Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-OH is obtained; M.p. 248 (dec.), [A] D20 = M10 in dimethylformamide / water (3: 1).
The nonapeptide obtained in this way is dissolved in 5000 ml of 0.01N ammonia, 1N hydrogen peroxide is added with stirring until the nitroprussiate reaction is negative, then another 200 ml
EMI6.2
<tb> glacial acetic acid, <SEP> filtered <SEP> and <SEP> lyophilized. <SEP> You <SEP> get <SEP> BOC-Cyrs-Ser
<tb> Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-OH; <SEP> Smp. <SEP> 238 <SEP> (dec),
<tb> [a] n20 = 180 in dimethylformamide / water (3 1), which is dissolved in 300 ml of trifluoroacetic acid, left to stand for 30 minutes at 25 ", evaporated, the residue was washed with ethyl acetate and dissolved in 300 ml of dimethylformamide .
To this solution are added 30 g of carbonic acid p-nitrophenyl ethyl ester - which is prepared as described below - and 14 ml of triethylamine, left to stand for 16 hours at 25, evaporated and the residue was washed with chloroform. It is dissolved in 300 ml of dimethylformamide, 50 ml of water and 50 g of DOWEX-50 are added, the mixture is stirred for 15 minutes, filtered, the resin is washed with dimethylformamide and the filtrate is evaporated to dryness. The residue is washed first with chloroform and then with ethyl acetate and dried. Man
EMI6.3
<tb> receives <SEP> the <SEP> EOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-OH;
<tb> m.p. 263 ", [a] D20 = 210 in dimethylformamide / water (3: 1).
Carbonic acid p-nitrophenyl ethyl ester
200 g of p-nitrophenol and 113 ml of pyridine are dissolved in 1200 ml of ethyl acetate, the mixture is cooled to 0, 156 ml of ethyl chloroformate are added with stirring, the mixture is stirred for a further 30 minutes at 0, washed with water, dried over Na2SO4 and evaporated to dryness. The residue is dissolved in diethyl ether and the carbonic acid p-nitrophenyl ethyl ester is crystallized by adding petroleum ether; M.p. 65 ".
Partial sequence ABC Nim-Trityl-L-histidyl-L-arginyl-L-phenylalanyl
L-seryl-glycyl-L-norleucyl-glycyl-L-phenylalanyl glycyl-L-prolyl-L-glutamyl-L-threonyl-L-proline amide triacetate (H-His (Trt) -Arg-Phe-Ser-Gly- Nle- Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 .3 CH3COOH) a) L-Seryl-glycyl-L-norleucyl-glycyl-L-phenylalanyl-glycyl-L-prolyl-L-glutamyl-L -threonyl-L-prolinamide tetra hydrochloride (HS er-Gly-Nle-Gly-Ph e-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 4 HC1)
Dissolve 12 g of H-Phe-Gly-Pro-Glu (OTB) -Thr-Pro-NH2 in 100 ml of dimethylformamide and 20 ml of acetonitrile at 0 and add 2.1 g of hydroxysuccinimide, 8.0 g of Z-Ser-Gly- Nle Gly-OH, 4.0 g of dicyclohexylcarbodiimide, leave to stand overnight at 0,
filtered off, evaporated in vacuo and crystallized from chloroform. Z-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe Gly-Pro-Glu (OTB) -Thr-Pro-NH2 is obtained; 125-138, [a] 20 D = -440 in dimethylformamide.
It is dissolved in 400 ml of dioxane and 40% of HCl / dioxane and hydrogenated at normal pressure in the presence of palladium catalyst and acid until the hydrogen uptake has ended. It is filtered, evaporated in a vacuum, dissolved in methanol, mixed with ether and obtained H-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 4 HCl; M.p. 1300 (dec.), [A] D20 = -520 in dimethylformamide.
b) Nim-Trityl-L-histidyl-L-arginyl-L-phenylalanyl- L-seryl-glycyl-L-norleucyl-glycyl-L-phenylalanyl-glycyl - L-prolyl-L-glutamyl-L-threonyl-L- prolinamid # triacetate (H-His (Trt) -Arg-Phe-S er-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro Glu-Thr-Pro-NH2 .3 CH3COOH)
9.9 g of Trt-His (Trt) -Arg-Phe-NH-NH2 RCl (partial sequence C) are dissolved in 100 ml of dimethylformamide, cooled to -20, 15 ml of dioxane / HCl 2n and then 1.16 ml of tert. -Butyl nitrite, stir for 10 minutes at -20, add 28 ml of triethylamine and 10.0 g of H-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro Glu-Thr-Pro-NH2 HCl, stir for 4 hours at 0 , filtered and evaporated to dryness.
The residue is dissolved in a mixture of ethyl acetate / methanol (8 2), washed with dilute ammonia and then with water until neutral, dried over sodium sulfate, concentrated to 100 ml and precipitated by adding diethyl ether. The precipitate is again dissolved in dimethylformamide and precipitated by adding diethyl ether. Trt His (Trt) -Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 [mp. 168 (decomp.), ID20 = 430 in dimethylformamide], which is dissolved in 500 ml of acetic acid / water (8: 2).
The mixture is left to stand at 40 for 3 hours, evaporated, the residue is washed in diethyl ether and dried in a high vacuum over KOH chips. H-His (Trt) -Arg-Phe-Ser Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2! 3 CH3COOH is obtained; M.p. 182 "(dec.), [A] D20 = -56" in acetic acid.
Partial sequence DE N-tert-butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl-
L-tryptophanyl-L-arginyl-L-asparaginyl-L-leucyl-
L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenylalamin-hydrazide di- acetate (B OC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH2-2 CH3COOH) a) 1 - (N-tert-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl- L-tyrosyl-L-tryptophanyl-L-arginyl-L-asparaginyl-L-leucyl- L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenylalanine) - 2-benzyl oxycarbonyl hydrazide diacetate (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z 2 CH3COOH)
320 ml of dimethylformamide are cooled to -20
100 ml of 2N hydrogen chloride in dioxane are added and 68 g of BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-NH-NH2 acetate (part-sequence E) are dissolved therein.
Then 12 ml of tert-butyl nitrite are added and the mixture is left
Stir for 10 minutes at 200 and 35 ml of triethylamine are added dropwise. The mixture obtained in this way is mixed with a solution formed from 8.8 g of H-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z trifluoroacetate (partial sequence D) and 17 ml of triethylamine in
150 ml of dimethylformamide combined. After 16 hours of standing at 0 it is evaporated. The residue is dissolved in ethyl acetate / butanol and washed with dilute acetic acid and ammonia solution. After evaporation of the solvent, the B OC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z CH3COOH of melting point 175o, [a] D20 = -19.50 in Dimethylformamide.
b) tert-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl- L-tryptophanyl-L-arginyl-L-asparaginyl-L4eucyl L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenylalanine hydrazide di-acetate (BOC- Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn Phe-NH-NH2 2 CH3COOH)
90 g of BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn Asn-Phe-NH-NH-Z 2 CH3COOH are dissolved in 500 ml of dimethylformamide and hydrogenated with 10 g of Pd / C (10%) bis at the end of the hydrogen uptake. After filtering off the catalyst, the solvent is evaporated and the residue is crystallized from a mixture of ether and ethanol.
BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH2-2 CH3COOH of melting point 265, [or] D20 = -570 in dimethylformamide is obtained.
Partial sequence ABCDE
L-Seryl-L-alanyl-L-tyrosyl-L-tryptophanyl-L-arginyl
L-asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl-L-asparaginyl
L-phenylalanyl-L-histidyl-L-arginyl-L-phenylalanyl
L-seryl-glycyl-L-norleucyl-glycyl-L-phenylalanyl-glycyl
L-phenylalanyl-glycyl-L-prolyl-L-glutamyl-L-threonyl
L-prolinamide hexatrifluoroacetate (H - S er-Ala-Tyr-Trp-Arg
Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe
Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 6 CF3C02H)
Dissolve 15.2 g of BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH2 diacetate (partial sequences D, E) in 200 ml of dimethylformamide, cool to -20, add 15 ml of dioxane / HCl 2n and then 1.16 ml of tert-butyl nitrite and stirred for 10 minutes at -20 ". 14 ml of triethylamine and a solution of 18.6 g of the in partial sequence A, B,
C to tridecapeptide acetate obtained, the mixture obtained is stirred for 16 hours at 0, filtered and evaporated to dryness. The residue is washed with diethyl ether and with chloroform, dissolved in dioxane / water (8: 2), the solution obtained is treated with 100 ml of Amberlite IRA-410 (acetate form), evaporated and the residue is recrystallized from isopropanol / water. The Boc-Ser-Ala-Tyr-Trp Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His (Trt) -Arg-Phe-Ser-Gly Nle-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr- Pro-NH2 - acetate; Melting point 145 "(decomp.), [A] D20 = -67" in acetic acid, which is dissolved in 500 ml of trifluoroacetic acid under a nitrogen atmosphere.
The mixture is left to stand at 25 for 1 hour, concentrated to 100 ml and precipitated by adding 1000 ml of diethyl ether. It is filtered, the residue is dissolved in dimethylformamide and precipitated with diethyl ether. After drying over KOH chips, the H-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg Phe- Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2-6 CF3CO2H; M.p. 1300 (dec.), [A] D20 = 42 "in acetic acid.
Example 1 Ethoxycarbonyl-L-hemicystinyl-L-seryl-L-asparaginyl L-leucyl-L-seryl-L-threonyl-L-hemicystinyl-L-valyl-L-leucyl-
L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl-L-tryptophanyl-L-arginyl
L-asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl-L-asparaginyl L-phenylalanyl-L-seryl-glycyl-L-norleucyl-glycyl-L-phenyl-alanyl-glycyl-L-prolyl-L-glutamyl-L-threonyl -L-proline-
EMI7.1
<tb> amide <SEP> rexaacetate <SEP> octahydrate <SEP> (EOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser Thr-Cys-Val-Leu-S er-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-
Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-
Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 rexaacetate octahydrate)
1.0 g of nonapeptide (partial sequence F) is dissolved in 10 ml of dimethylformamide, 1.5 g of N-hydroxysuccinimide and 0.52 g of dicyclohexylcarbodiimide are added, the mixture is stirred for 6 hours at 25,
filtered and the filtrate evaporated to dryness. The residue is washed with ethyl acetate and diethyl ether and dried.
EMI7.2
<tb>
<SEP> is obtained <SEP> EOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu O-Su; M.p. 242 ", which is dissolved in 10 ml of dimethylformamide.
3.1 g of tricosapeptide hexatrifluoroacetate (partial sequence A, B, C, D, E), 0.4 ml of triethylamine and 1.2 g of N-hydroxysuccinimide are added to this solution and the mixture is stirred at 250 for 16 hours. It is evaporated to dryness , washes the residue with diethyl ether, chloroform and acetone. The crude, protected dotriacontapeptide is thus obtained, which is dissolved in 100 ml of 0.3 acetic acid, treated with 20 ml of Amberlite IRA-410 (acetate) and 50 ml of 0.6N ammonium hydroxide are added.
The pH is adjusted to 6.5 and the solution obtained is layered on a C'arboxymethylcellulose column (10 x 100 cm) which has been equilibrated with a 0.15N ammonium acetate buffer solution. The elution is carried out with an increasing concentration and pH gradient (0.15n to 0.4n; pH 6.5 to pH 7.0) of an ammonium acetate buffer.
The combined fractions, which contain the pure peptide, are freeze-dried three times, the residue is washed with ethanol and then with diethyl ether and washed over potassium
EMI8.1
<tb> hydroxide <SEP> dried in a <SEP> high vacuum <SEP>. <SEP> One <SEP> receives <SEP> EOC-Cyr
<tb> Ser-Asn-Leu-S <SEP> er-Thr-Cy's-Val-Leu-S <SEP> er-Ala-Tyr-Trp <SEP> -Arg Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His -Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 6 CH1CO2H 8 H2O; M.p.
240 (dec.), [A] D20 = -56 "in acetic acid ln. Amino acid composition after acid hydrolysis (6n, 16 hours): Ala1.1, Arg2.0, Asp3.9, Cys / 21.6, Glu1.2 , Gly3.0 Hisl, l, Leu2.9, Nlet, O, Phe3.0, Pro2.1, Ser3.8, Thrs, 9, Tyr1.0, ValO, g (Trpl, o by spectrophotometry).