Verfahren zur Herstellung bisher unbekannter Polypeptidderivate
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung bisher unbekannter Polypeptidderivate der Formel
EMI1.1
II 12 1.1 14 15 16 1. 18 19 20 Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-H is-Arg
22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro NH2, worin R für eine Alkyl-, eine gegebenenfal@s substituierte Aralkyl- oder eine gegebenenfalls substituierte Arylgruppe steht, seiner therapeutisch wirksamen Säureadditionssalze und Schwermetallkomplexe.
Beispielsweise kann R die Methyl-, Äthyl-, Propyl-, tert.-Butylgruppe oder aber einen gegebenenfalls durch Halogenatom, eine niedere Alkoxy- oder die Nitrogruppe substituierten Phenyl- oder Benzylrest bedeuten. Die neuen Polypcptidderivatc zeichnen sich durch Beständigkeit gegenüber der abbauenden Wirkung von Aminopeptidasen aus.
Die bisher unbekannten Polypeptidderivatc können nach für die Synthese von Verbindungen dieser Art allgemein bckannten Methoden hergestellt werden, wobei die Aminosäuren in der in der obigen Formel festgelegten Reihenfolge einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten miteinander verknüpft werden, indem man entsprechende zu ihrem Aufbau nötige Verbindungen unter Bildung von CONH-Bin dungn in beliebiger zeitlicher Reihenfolge miteinander kondensiert, wobei nicht an der Reaktion teilnehmende freie funktionelle Gruppen durch geeignete Schutzgruppen geschützt werden, zu einem beliebigen Zeitpunkt der Synthese die Schutzgruppen abspaltet,
die Mercaptogruppen nach Bildung der Teilsequenz 1 bis 7 und vor Einbau der eine Methionylgruppe enthaltenden Teilsequenz zum Disulfid oxydiert, die Carboxylgruppe des terminalen Prolylrestes in die Amidgruppe überführt und gegebenenfalls anschliessend die Säureadditionssalze herstellt, indem man die Polypeptidderivate der obigen Formel durch Umsetzung mit organischen oder anorganischen Säuren in die enlsprechenden Salze überführt. In der letzten Stufe sind jedoch Niethoden zu verwenden, bei denen Racemisierung nicht auftritt oder gering gehalten werden kann, vorzugsweise die Azidoder die aktivierte Ester-Methode, wobei zur Aktivierung vorzugsweise N-Hydroxysuccinimid Verwendung findet.
Üblicherweise werden die bei Cystein-haltigen Peptiden zum Schutz der SH-Gruppen verwendeten Benzylreste am Ende der Synthese durch Behandlung mit Natrium in flüssigem Ammoniak abgespalten. Es wurde nun gefunden, dass die Abspaltung der Benzylschutzgruppen sowie die Herstellung der (Cys)S-S(Cys)-Bindung vor der letzten Stufe zu besonders guten Ausbeuten all Endprodukt führt.
Beim Aufbau der neuen Polypeptide hat sich für die Blockierung der ^-Carboxylgruppe, beispielsweise in der nachstehend beschriebenen Teilsequenz A, die tert.-Butyloxygruppe bewährt, doch können auch andere Schutzgruppen, wie die Methoxy-, die Athoxy-, die tert. Amyloxy-, die Amid- oder die Benzyloxygruppe verwendet werden.
Für die Blockierung der Imidazolgruppe des Histidinrestes in der nachstehend beschriebenen Teilsequenz C hat sich die Triphenylmethylgruppe bewährt, doch können auch andere geeignete Schutzgruppen, wie die Carbo-tert.-butoxy-, die Carbo-tcrt.-amyloxy-. die Gar- bobenzoxy- oder die Benzylgruppe verwendet werden.
Für die Blockierung der Guanidogruppe des Argininrestes in der nachstehend beschriebenen Teilsequenz E wurde die Nitrogruppe vcrwendct. doch können auch andere geeignete Schutzgruppen, wic die Tosylgruppe.
die p-Nitrobenzoxycarbonylgruppe oder die 2-( lso pro- pyloxycarbonyl)-3 .4,5 (i-tetrach lorobenzoylgr;ppe verwendet werden, Man kann auch den Schutzeffekt der Protonisierung der Guanidogruppe bei der Synthese verwenden.
Dic neuen Polypeptiddcrivatc lassen sich auch in Form ihrer Salze gewinnen bzw. verwenden. Als Salze kommen solche mit organischen Säuren. wie Essigsäure.
Propionsäure. Glykolsäure, N-filcl1säure. Brenztrauben- säure, Malonsäure. Bernsteinsäure. Maleinsäure. Fumarsäure, NVeinsätue. Zitronensäure, Benzoesäure, Zimtsäure, Salizylsäure, 2-Phenoxy- oder 2-Acetoxybenzoesäure. Mandelsäure, Methansulfonsäure. Äthan- sulfonsäure, HydroxväthansulfollsäLlre Benzol- oder Toluolsulfonsäure, Naphthalinsulfonsäure, Sulfanilsäurc sowie polymcre Säuren wie Gerbsäure, Alginsäure.
Polygalacturonsäure. f > olyphloretinphosphat oder Carb oxymethyleellulose und Salze mit anorganischen Säuren, wie Halogenwasserstoffsäure. z. B. Salzsäure oder B romwasserstoffsäure. Salpetersäure, Thiocyansäure.
Schwefelsäure und Phosphorsäure in Frage. Als Schwermetallkomplcx kommt z. B. derjenige vom Zink## in Frage.
Die Ausgangsprodukte zur Herstellung der neuen Polypeptidderivate können, sofern sie bisher nicht bekannt waren, nach den für die Peptidchemie bekannten Methoden erhalten werden, wobei die Aminosäuren einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten miteinander verknüpft werden.
Die neuen Verbindungen stellen ein wichtiges therapeutisches Prinzip dar. das den Calciumplasmaspiegel, insbesondere den erhöhten Calciumplasmaspiegel, senkt und als Antagonist des Parathormons eine positive Calciumbilanz im Knochen bewirkt.
Es ist somit indiziert bei allen Zuständen. bei welchen eine Senkung des Plasmacalciumspiegels erwünscht ist, z. B. Hypercalcämien verschiedener Genese, Mangel des endogenen Thyreocalcitonins in Folge Ausfalls von Schilddrüsengeweben. Hyperfunktion der Nebenschilddrüsen.
Die neuen Verbindungen sind indiziert bei allen Knochenaffektionen. die auf einem vermehrten Abbau beruhen oder bei welchen eine vermehrte Calciumfixation im Knochen erwünscht ist, z. B. Osteoporose verschiedener Genese (z. B. postklimakterisch, posttraumatisch, bedingt durch Corticosteroidtherapie oder Inaktivität usw.), Frakturen, Osteomalacie, Rachitis sowie insbesondere zur Kombinationstherapie mit Cal cium bzw. Phosphat.
Die biologische Prüfung der neuen Verbindungen ergab eine Wirksamkeit von etwa 100 bis 450 MRC Einheiten/mg Peptid. Die erforderiiche Tagesdosis (i. m.
verabrcicht) in MRC-Einheiten beträgt 20 mE bis 10 E, vorzugsweise 100 mE kg Tiergewicht.
Beim Mcnschen beträgt die tägliche Dosis (i. m.
verabreicht) in MRC-Einheiten 1 bis 500 E. Vorzugsweise wird eine tägliche Dosis von 5 E i. m. vcrabreicht.
Die neuen Verbindungen können als Heilmittel.
z. B. in Form pharmazeutischer Präparate, Verwendung finden. Diese enthalten die genannten Verbindungen in Mischung mit einem für die parenterale Applikation geeigneten organischen oder anorganischen Träger- material. Für dasselbe kommen solche Stoffe in Frage.
die mit den neuen Verbindungen nicht reagieren wie z. B. Gelatine. Milchzucker, Stärke, Magnesiumstearat.
Talk, pflanzliche Öle, Benzylalkohole, Gummi arabicum, Polyalkylenglykole, Vaseline, Cholesterin oder andere bekannte Arzneim itteltrigr.
Die pharmazeutischen Fräparate können z. B. in flüssiger Form als Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen vorliegen. Gegebenenfalls sind sie sterilisiert und bzw. oder enthalten Hilfsstoffe, wie Konservierunes-, Stabilisierungs-. Netzmittel oder Emulgiermittel. Sie können auch noch andere. therapeutisch wertvolle Stoff enthalten. Die neuen Verbindungen können auch in l:orm eines Depotpräparates verabreicht werden.
Die neuen V erbindungen und ihre Salze können auch als Zwischenprodukte zur Herstellung von pharmazeutischen Präparaten Verwendung finden.
Es werden folgende Abkürzungen verwendet:
Z = Carbobenzoxy
Bzl = Benzyl
BOC = tert.-Butyloxycarbonyl
Piv = Pivaloyl
Trt = Trityl = Triphenylmethyl
OTB = tert.-Butyloxy
ONP = p-Nitrophenylester
OCP = 2,4,5-Trichlorphenoxy
OSu = Oxysuccinimid
OMe = Methoxy
OEt = Äthoxy NO2 = Nitro
Ser = L-Seryl
Asn L-Asparaginyl
Leu -- L-Leucyl
Thr = L-Threonyl
Val = L-Valyl
Ala = L-Alanyl
Tyr L-Tyrosyl
Trp = L-Tryptophanyl
Arg = L-Arginyl Phe - L-Phenylalanyl
Glu L-Glutamyl
His L-Histidyl
Pro L-Prolyl
Gly = Glycyl
Met - L-Methionyl
Cys = L-Cysteinyl
In den nachfolgenden Beispielen, die die Ausfüh rung des Verfahrens erläutern,
den Umfang der Erfindung aber in keiner Weise einschränken sollen. erfolgen alle Temperaturangaben in Celsiusgraden.
Teilsequenz A: L-Phenylalanyl-glycyl-L-Prolyl-γ-tert.- butyloxy-L-glutamyl-L-threohyl-L-prolinamid fH-Phe-G ly-Pro-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2) Man löst bei -5 134 e Z-Thr-NH-NH2 in 2
In Salzsäure und versetzt mit (),55 1 In Natriumnitrit.
Nach 5 Minuten wird Kaliumcarbonat bis pH 9 zuge geben das entstandene Azid mit ALhylacetat extrahiert und eine Lösung von 80 g H-Pro-NH2 hydrochlorid in 100 ml Wasser, 500 ml Dimcthylformamid und 77 ml Triäthylamin hinzugefügt. Man verdampft das Athyl- acetat bei 20 im Vakuum und lässt über Nacht bei 25 stehen. Die restliche Lösung wird im Vakuum vcrdampft, der Rückstand in Äthylacetat gelöst. die Lösung mit Wasser. verdünnter Salzsäure und einer wässrigen Kaliumcarbonatlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Man verdampft im Vakuum. Iöst in warmem Äthylacetat und kühlt ab.
Man erhält Z-Thr Pro-NH.,; Smp. 148-. [a]D20 = -72 in 95,C, Essigsäure. Man löst hierauf 90 g Z-Thr-Pro-NH2 in 2 1 Dioxan und 260 ml In Salzsäure und hydriert bei 20C und Normaldruck in Gegenwart eines Palladiumkatalysators. Man filtriert, verdampft die Lösung im Vakuum, wäscht den Rückstand mit Athylacetat und erhält H-Thr-Pro-NH2#HCl; Smp. 216 , [a] D20 = -64@ in 95% Essigsäure. Dieses wird in 500 ml Dimethylformamid, 50 ml Wasser und 32 ml Triäthylamin gelöst und 118 g Z-Glu(OTB)-OCP und 800 ml Tetrahydrofuran zugegeben. Man lässt über Nacht bei 20 stehen, verdampft im Vakuum und kristaliisiert den Rückstand mit Athyläther.
Man erhält Z-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2, Smp. 65= (Zers.), [a]D20 = - 180 in Dimethylformamid.
Man löst 80 g Z-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2 in 1,5 1 Dioxan und 200 ml Wasser und hydriert bei 20@ und Normaldruck in Gegenwart eines Palladiumkatalysators.
Die Lösung wird filtriert und im Vakuum verdampft und der Rückstand mit Diäthyläther versetzt, wobei H-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH erhalten wird; Smp. 65 (Zers.), [a]D20 = -28@ in Dimethylformamid. Dieses wird in 700 ml Dimethylformamid bei 0 gelöst, 200 ml Acetonitril, 6S g Z-Phe-Gly-Pro-OH und 32 g Dicyclohexylcarbodiimid hinzugefügt, über Nacht bei 20 stehen gelassen, filtri@rt, im Vakuum eingedampft und mit Äthylacetat versetzt.
Danach wäscht man die Lösung mit Wasser, verdünnter Salzsäure und wässriger Kaliumcarbonatlösung, trocknet über Natriumsulfat verdampft im Vakuum und kristallisiert den Rückstand aus Äthylacetat/Äthyläther. Man erhält Z-Phe-Gly-Pro- Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2, Smp. 120 (Zers.), [a]D20 = -66@ in Dimethylformamid, das man in 1500 ml Di oxan und 300 ml Wasser löst. Man gibt 30 g Palladiumkohle (10%) zu und hydriert bis zum Ende der Wasserstoffaufnahme. Man filtriert dampft das Filtrat ein und kristallisiert den Rückstand aus Dioxan. Man erhält das H-Phe-Gly-Pro-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2; Smp. 153@, [a]D20--79 in Dimethylformamid.
Teilsequenz B: N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-glycyl
L-methionyl-glycin (BOC-Ser-Gly-Met-Gly-OH) a) L-Methionyl-glycin-äthylester-hydrochlorid (H-Met-Gly-OEt. HCI)
Man löst 65 g BOG-Met-OH in 900 ml Chloroform, kühlt auf -10 . gibt 30 ml N-Methylmorpholin und 35.6 g Chlorameisensäureisobutylester zu. Nach 10 Minuten fügt man langsam eine Lösung von 30 g Glycin-äthylester in 200 ml Chloroform hinzu und lässt bei 20 eine Stunde reagieren. Man extrahiert mit 0,5n Ammoniumhydroxid. dann mit 0,2n Schwefelsäure, wäscht mit Wasser neutral, trocknet über Natriumsulfat und engt ein. Nach Umkristallisieren aus Petroläther erhält man BOC-Met-Gly-OEt; Smp. 49 . [a] D20= -19 in Äthanol.
Man löst es in 750 ml 4n HCl Äthanol, lässt 1 Std. bei 25- stehen dampft ein. wäscht den Rückstand mit Diäthyläther und trocknet bis zur Ge wichtskonstanz. Man erhält das H-Met-Gly-OEt # HCl in Form eines Öles.
b) N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-glycin-äthylester (BOC-Srr-Gly-OEt)
Man löst 12,5 g N-tert.-Butyloxycarbonyl-serin in
100 ml Chloroform und gibt 6,1 g N-Methylmorpholin dazu; danach tropft man 8,2 g Chlorameisensäureisobutylester hinzu. Nach 10 Minuten wird eine Lösung von 6,6 g Glycin-äthylester in 50 ml Chloroform hinzugefügt und 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt.
Das Reaktionsgemisch wird mit verdünntem Ammoniak, dann mit Salzsäurelösung gewaschen über Natriumsulfat getrocknet und die organische Phase abgedampft. Man erhält BOC-Ser-Gly-OEt als Öl; [a] D20 - - 30 in Dimethylformamid.
c) N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-glycin-hydrazid (BOC-Ser-Gly-NHNH2)
Man löst 19,4 g BOC-Ser-Gly-OEt in 270 ml Äthyl- alkohol, gibt 4S,6 ml Hydrazinhydrat hinzu und lässt 2 Tage bei Raumtemperatur stehen. Anschliessend dampft man die Lösung ab und kristallisiert den Rückstand aus einem ethylalkohol/Athyl äther-Ge misch (1: 3). Man erhält BOC-Ser-Gly-NHNH2. Smp. 157 , [a]D20 = -5 in Dimethylformamid.
d) N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-glycyl-L-methio nyl-glycin-äthylester (BOC-Ser-Gly-Met-Gly-OEt)
Zu 700 ml Dimethylformamid werden 15 ml einer 4n Chlorwasserstofflösung in Äthyläther gegeben und darin bei -10 11 g BOC-Ser-Gly-NHNH2 gelöst.
Anschliessend tropft man bei - 100 5,4 ml tert.-Butylnitrit hinzu. fügt der Lösung zuerst 18 ml Triäthylamin und dann eine Lösung von 12 g H-Met-Giy-OE, HCl in 100 ml Dimethylformamid und 6,2 ml Triäthylamin bei. Es wird 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, nach 12 Stunden filtriert und eingedampft. Den Rückstand löst man in Chloroform, wäscht nacheinander mit verdünnter Ammoniak- und Salzsäurelösung, trocknet über Natriumsulfat und dampft ein. Man erhält BOC Ser-Gly-Met-Gly-OEt. [a]D20 = -14 in Demethylformamid.
e) tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-glycyl-L-methionyl glycin (BOC-Ser-Gly-Met-Gly-OH)
Man löst 24 g BGC-Ser-Gly-Met-Gly-OEt in 250 ml Dioxan. gibt 75 ml In Natronlauge zu. rührt 1 Stunde bei 25 , behandelt mit 150 ml Dowex-50 (H-Form).
filtriert. dampft das Filtrat ein und kristallisiert den Rückstand aus Essigester/Diäthyläther. Man erhält BOC-Ser-Gly-Met-Gly-OH, Smp. 87@ (Zers.) [a]D20 = - 17 ' in Dimethylformamid.
Teilsequenz C: N@, Nimid. Ditrityl-L-histidyl L-phenylalaninhydrazid # HCl (Trt-His(Trt)-Arg Phe-NH-NH2 # HCl) a) Z-Arg(NO2)-Phe-OMe
51,8 g H-Phe-OMe HCl werden in i Liter Ather und etwa 50 ml Eiswasser gelöst und unter Rühren und Kühlen genügend Natriunacabonat zugegeben, bis alles Wasser abgebunden ist. Man filtriert und dampft das Filtrat bis zur Gewichtskonstanz ein. wobei ein farbloses Öl erhalten wird.
67,6 g Z-Arg(NO..)-OH werden in 300 ml Acetonitril und 150 ml Dimerhylformamid gelöst und mit 41,2 g H-Phe-OMe verselzt. Danach wird auf -20@ abgekühlt und eine Lösung von 43.4 g Dicyclohexylcarbodiimid in 100 ml Acetonitril zugegeben. Das Ganze lässt man unter zeitweiligem Umschüttcln während 4 Stunden im Eiskaslen stehen. Der entstandene Niederschlag wird abfiltriert und das Filtrat eingedampft. Der Eindampfrückstand wird in 1 Litcr Essigcster gelöst und hierauf in der Kälte mit 1 n Natronlauge, Wasser, In Schwefelsäure, Wasser und gesättigter Kochsalzlösung gewaschen.
Die über Natriumsulfat ge trocknete Essigsäure äthylester-Phase wird vollständig eingedampfr. Nach Umkristallisieren aus Essizesterj Petroläther erhält man Z-Arg(NO.2)-Phe-OMe; Smp.
131-133 , [a]D20 = -7 in Methanol. -4 in Dimethylformamid.
b) H-Arg(NO2)-Phe-OMe # 0,5 H2O # 1,2 HBr
20 g Z-Arg(NO2)-Phe-OM3 werden in 50 ml Eisessig gelöst und unter leichtem Kühlen 50 ml 40 %ige Bromwasserstoffsäure in Eisessig zugesetzt. Danach lässt man das Ganze unter zeitweiligem Umschütteln während 1 Stunde bei 20- stehen, Nach vollständigem Eindampfen wird der Rückstand in 200 ml Wasser gelöst und zweimal mit Äther gewaschen. Die wässrige Phase wird vollständig eingedampft und der Rückstand aus Methanol/Äther umkristallisiert. Smp. 165-167 mit Zers., [a]D20 = t 18 @ in Methanol, + 14 in Dimethylformamid.
c) Z-His(Z)-Arg(NO2)-Phe-OMe
46,1 g H-Arg(NO2)-Phe-OMe # 0,5 H2O # 1,2 HBr werden in 100 mi Wasser gelöst, hierauf erwärmt und anschliessend abgekühlt. Nach Zugabe von Chloroform und Eis wird mit Ammoniak auf pH 9 gestellt. Die Chloroformphase wird noch einmal mit Wasser gewaschen, anschliessend über Natriumcarbonat getrocknet und filtriert. Dem Filtrat wird eine Lösung von 44,5 g Z-His(Z)-OH, 12,1 g Hydroxysuccinimid in 200 ml Acetonitril und 100 ml Pyridin zugesetzt, danach das Ganze auf -20- abgekühlt und mit einer Lösung von 21,1 g Dicyclohexylcarbodiimid in 70 ml Acetonitril versetzt. Anschliessend wird unter zeitweiligem Rühren 4 Stunden im Eiskasten stehen gelassen.
Der entstandene Niederschlag wird abfiltriert und das Filtrat eingedampft. Dcr Rückstand wird in Essigsäureäthylester aufgenommen und anschliessend folgendermassen gewaschen: 10% ige Kaliumcarbonatlösung (pH # 10).
Wasser, gesättigte Kochsaizlösung, Wasser, gesättigte Kochsalzlösung, Schwefelsäure (pH 3), Wasser. Kochsalzlösung. Die über Natriumsulfat getrocknete Essigsäureäthylester-Phase wird vollständig eingedampft, wobei ein hellbeiger Schaum erhalten wird. Dieser Schaum wird je zweimal in wenig Methanol gelöst und mit Äther gefällt. Die Ätherphasen werden abdekantiert und der Niederschlag getrocknet; man erhält Z-His(Z)-Arg (NO2)-Phe-OMe (amorpher Schaum). [a]D20 = -8 @ in Methanol, -8@ in Dimethylformamid.
d) H-His-Arg-Phe-OMe # 4HCl
25 g Z-His(Z)-Arg(NO2)-Phe-OMe werden in 800 ml Eisessig gelöst. Danach werden 10 g 10% Palladium auf Aktivkohle in 200 ml In Salzsäure angerührt und in die Lösung gegeben. Das Ganze wird einer 2stündigen Hydrierung unterworfen und anschlie Bend der Katalysator abfiltriert. Das Filtrat wird erneut mit 5 g 10% Palladium auf Aktivkohle in Wasser vcrsetzt und der Hydricrung unterworfen. die nach 51 Stunden beendet ist. Hierbei werden etwa 80% der theoretischen Menge Wasserstoff verbraucht. Der Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat vollständig eingedampft. wobei H-His-Arg-Phe-OMe .4 HCl in Form eines amorphen Schaumes erhalten wird.
@) Trt-His(Trt)-drg-Phe-OMe # HCl 21,5 2 H-His-Arg-Phe-OMe # 4 HCI werden in 100 ml Pyridin und etwa 100 ml Dimethylformamid gelöst. Bei etwa - 5 - wird bis pH 9 Triäthylamin zugegeben und anschliessend eine Lösung von 29 g Tritylchlorid in 300 ml Pyridin während 5 Minuten zugetropft. Nach Beendigung der Zueabe wird von Zeit zu Zeit das pH geprüft und nötigenfalls wieder mit Triäthylamin auf etwa pH 9 gestellt. Das Ganze wird nach ungefähr 4 Stunden eingedampft, der Rückstand in Chloroform und Wasser aufgenommen und unter Zugabe von wenig ln Salzsäure auf pH 4 gestellt. Man trennt die Chloroformphase ab, wäscht sie zweimal mit Wasser, trocknet über Natriumsulfat und dampft vollständig ein.
Der Rückstand wird mit Äther versetzt und vom Äther anschliessend abfiltriert. wobei Trt-His(Trt) Arg-Phe-OMe HCI erhalten wird.
f) Trt-His(Trt)-Arg-Phe-NH-NH2 # HCl
17 g Trt-His(Trt)-Arg-Phe-OMe HCI werden in 200 ml Methanol gelöst und mit 40 ml Hydrazinhydrat versetzt. Danach wird 2 Tage bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Man dampft em, löst den Rückstand in Chloroform und wäscht zweimal mit Wasser. Die Chloroform-Phasc wird über Natriumsulfat getrocknet und eingedamp@t. Hierauf wird der Rückstand mit Äther gewaschen und abfiltriert: er besteht aus Trt-His (Trt)-Arg-Phe-NH-NH2 # HCl: [a]D18 = -9@ in Dimethylformamid, Smp. 158 .
Teilsequenz D: l-(H-Asparaginyl-L-ieucyl-L-asparagi nyl-L-phenyl-alanin)-2-benzyloxycarbonyl-hydra zid # Trifluoracetat (H-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe NH-NH-Z # CF@COOH) a) l-(N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-phenylalanin)
2-benzyloxy-carbonyl-hydrazid (BOC-Phe-NH
NH-Z)
Man löst 72 g BOC-Phe-OH und 28 g N-Methylmorpholin in 500 ml Methylenchlorid auf und tropft bei -5 26 ml Chlorameisensäuremethylester zu. Nach
10 Minuten gibt man noch 44 g Z-NHNH2 in 100 ml Methylenchlorid zu und rührt 4 Stunden bei Zimmer- temperatur weiter. Nach Auswaschen mit verdünnter Phosphorigersäure wird getrocknet und eingedampft.
Nach Kristallisieren aus Petroläther erhält man BOC Phe-NH-NH-Z vom Smp. 117@, [a]D20 -5@ in Dimethylformamid.
b) l-(N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-asparaginyl
L-phenylalanin)-2-benzyloxycarbonyl-hydrazid (BOC-Asn-Phe-NH-NH-Z) Man löst 41 g BOC-Phe-NHNH-Z in 400 ml Trifluoressigsäure und lässt eine Stunde bei 20 stehen.
Beim Verdampfen der Trifluoressigsäure erhält man das H-Phe-NHNH-Z als kristallines Trifluoracetat vor Teilsequenz E: tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl
L-tyrosyl-L-tryptophanyl-L-arginin-hydrazid # Ace- lat (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-NHNH2 #
CH3COOH) a) N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-tryptophanyl-(guanido)
N-nitro-L-argininmethylester (BOC-Trp-Arg(NO2)-OMe)
Man löst 35 g H-Arg(NO2)-OMe # HCl. 63 g BOC Trp-OCP und 14 g N-Mcthylmorpholin in 300 ml Dimethylformamid auf und iässt 16 Stunden bei 20 stehen. Nach Verdampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand in Essigester aufgenommen und mit vcrdünnter Schwefelsäure gewaschen. Man engt etwas ein und fällt mit Äther aus.
Dabei kristallisiert BOC-Trp Arg(NO2)-OM3 vom Smp. 130 , [a]D20 = -22 in Di methylformamid.
b) N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-tyrosyl-L-tryptophanyl (guanido)N-nitro-argininmethylester (BOC-Tyr-Trp-Arg(NOo)-OMe)
Man löst 15 g BOC-Trp-Arg(NO2)-OMe in 80 ml 5n methanolischer Salzsäurelösung auf und lässt 1 Stunde bei Zimmertemperatur stehen. Nach Verdampfen des Lösungsmittels und Behandeln mit Äther verbleiben 13 g H-Trp-Arg(NO2)-OMe als Hydrochlorid zurück; Smp. 1200, [a]D = -9 in Dimethylformamid.
Dieses Dipeptid wird zusammen mit 14 g BOC-Tyr OCP und S g N-Methylmorpholin in 200 ml Dimethylformamid gelöst. Nach 16 Stunden Stehen bei 20C wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand in Essigester aufgenommen. Nach Waschen mit verdünnter Phosphorigersäure und Einengen des Lösungsmittels kann man mit Hilfe von Äther BOC-Tyr-Trp-Arg(NO2)- OMe isolieren; Smp. 1305, [a]D20 = -11 in Dimethylformamid.
c) tert.-Butyloxycarbonyl-L-alanyl-L-tyrosyl-L trypto-phanyl-(guanido)N-nitro-L-argininmethyl ester (BOC-Ala-Tyr-Trp-Arg(NO2)-OMe)
Man löst 13,5 g BOC-Tyr-Trp-Arg( NO,)-OMe in 130 ml 5n methanolischer Salzsäurelösung auf, lässt 1 Stunde bei 25 stehen, dampft zur Trockne ein.
wäscht den Rückstand mit Dimethyläther. filtriert ab.
Iöst in 100 ml Dimethylformamid auf und versetzt mit 8,0 g BOC-Ala-OCP und 3,0 ml Triäthylamin. Nach 16 Stunden bei 25 gibt man 500 ml Essigester hinzu.
wäscht mit verdünnter Schwefelsäure und Kaliumbicarbonatlösung und dampft zur Trockene ein. Nach Waschen des Rückstandes mit Chloroform erhält man BOC-Ala-Tyr-Trp-Arg(NO2)-OMe; Smp. 120 (Zers.).
[a]D20 = 12 in Dimethylformamid.
d) tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl L-lrypto phanyl-(guanido )N-nitro-L -arginininethyl- ester (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg(NO2)-OMe)
Man löst 12,3 g BOC-Ala-Tyl-Trp-Arg(NO2)-OME in 100 ml 5n methanolischer Salzsäure, lässt 1 Stunde bei 25 stehen, dampft zur Trockene ein. wäscht den Rückstand mit Diäthyläther. Iöst ihn in 100 ml Dimethylformamid. versetzt mit 14 ml Triäthylamin und S.5 g BOC-Ser-N2, lässt 16 Stunden bei 0 stehen, gibt 500 ml Essigester zu. wäscht nacheinander mit verdünnter Schwefelsäure und Ammoniumhydroxid, trock- net über Natriumsulfat und dampft das Lösungsmittel ab. Nach Waschen des Rückstandes mit Chloroform Smp. 191 , [a]D20 = + 26,4 in Dimethylformamid.
Diese Substanz wird zusammcn mit 35 g BOC-Asn-ONP und 30 g N-Mcthylmorpholin in 200 ml Dimethylformamid gelöst. Nach 16 Stunden Stchen bei 70' wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand nacheinander mit Essigester und verdünnter Phosphorigersäurc gewaschen. Man erhält BOC-Asn-Phe-NH-NH-Z vom Smp. 210@ .[a]D20 = -18 in Dimethylformamid.
c) (N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L asparaginyl-L-phenylalanin)-2-benzyloxycarbonyl hydrazid (BOC-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z)
Man löst 26 g BOC-Asn-Phc-NH-NH-Z in 200 ml Trifluoressigsäure auf und lässt 1 Stunde bei 20' stehen.
Nach Verdampfen des Lösungsmittels versetzt man in 100 ml Dimethylformamid mit 17 g BOC-Asn-ONP und 15 g N-Methylmorpholin. Nach 16 Stunden bei 200 wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand nacheinander mit Essigester und verdünnter Phosphorigersäure gewaschen. Man erhält BOC-Asn Asn-Phe-NH-NH-Z; Smp. 2400, [a] D0 = - 280 in Dimethylformamid.
d) l-(N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-leucyl-L-asparaginyl
L-asparaginyl-L-phenylalanin)-2-benzyloxycarbo nyl-hydrazid (BOC-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z)
Man löst 22 g BOC-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z in 150 ml Trifluoressigsäure und lässt 1 Stunde bei 200 stehen. Nach Verdampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand mit 12 g BOC-Leu-ONP und 10 , N-Methylmorpholin in 100 ml Dimethylformamid versetzt.
Nach 16 Stunden Stehenlassen bei 200 wird das Dimethylformamid verdampft und der Rückstand nacheinander mit Essigester und verdünnter Phosphorigersäure gewaschen. Man erhält BOC-Leu-Asn-Asn-Phe NH-NH-Z vom Smp. 2100, [a]D22 = -34 in Dimethylformamid.
e) l-(N-ter.-Butyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-leucyl
L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenylalanin)
2-benzyloxy-carbonyl-hydrazid (BOC-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z)
Man löst 57 g BOC-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z in 300 ml Trifluoressigsäure und lässt eine Stunde bei 20 stehen. Nach Verdampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand in Ather kristallisiert. Man löst das Tetrapeptid-trifluoracetat in 400 ml Dimethylformamid und versetzt die Lösung mit 27 g BOC-Asn-ONP und 25 g N-Methylmorpholin. Nach 16 Stunden Stehenlassen bei 20- wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand nacheinander mit Essigester und verdünnter Phosphorigersäure gewaschen.
Man erhält BOC-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z vom Smp. 250 (Zers.), [a] D20 @ -34 in Dimethylformamid.
f) l-(L-Asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl-L asparaginyl-L-phenylalanin)-2-benzyloxycarbonyl hydrazid # trifluoracetat (H-Asn-Leu Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z # Trifluoracetat)
Man löst 43.5 g BOC-Asn-Lcu-Asn-Asn-Phc-NH- NH-Z in 200 ml Trifluoressigsäure und lässt eine Stunde bei 20' stehen. Nach EindampEen wird der Rückstand mit Hilfe von Ather kristallisiert. Man erhält H-Asn-Leu Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z Trifluoracetat; Smp. 242, [a] D20=-22 in Dimethylformamid.
c) H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OH
Man löst 372 g H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe # 1,3 HBr in 1800 ml Methanol. fügt 900 ml 2n Natronlauge hinzu. lässt l Stunde bei 25 stehen. gibt 240 ml Eis essig zu und lässt 2 Stunden bei 0 stellen. Man filtrierr die ausgeschiedene kristalline Masse ab. wäscht zuerst mit In Essigsäure und anschliessend mit Wasser und trocknet bei 50 im Hochvakuum. Man erhielt tlas H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OH. Smp. 219 [a]D20 -53 in In Ammoniak.
Teilsequenz F2: tert.-Butyloxycarbonyl-S-benzyl-L cysteinyl-L-seryl-L-asparaginyl-L-leucyl-L-@@@@@- hydrazid (BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser-NH-NH) a) H-Asn-Leu-Ser-OMe # HCl Man löst 43 g H-Leu-Ser-OMe # HCl und 53 g BOC-Asn-ONP in 400 ml Dimethylformamid auf. gibt 27 ml Triäthylamin zu. lässt 16 Stunden bei 25 stehen.
dampft zur Trockne ein und kristallisiert den Rückstand aus Methanol um. Man erhält 51.6 g BOC-Asn-Leu Ser-OMe. Smp. 190@. [a]D20 = - 24 in Dimethylformamid, das man in 500 ml einer 4n Lösung von Salzsäure in Methanol löst. Man lässt 1 Stunde bei 25 stehen.
dampft zur Trockne ein, löst den Rückstand in Metha- nol und fällt mit Diäthyläther. Man erhält H-Asn-Leu Ser-OMe # HCl; Smp. 180 . [a]D20 = -23 in Dimethylformamid.
b) H-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe # HCl
Man löst 39.5 g BOC-Ser@NHNH2 in 500 ml Dimethylformamid, kühlt auf -20 , gibt 200 ml einer 2n Lösung von Salzsäure in Dioxan und anschiiessend 20 ml tert.-Butylnitrit zu. Nach 10 Minuten bei -20 werden 40 ml Triäthylamin und 38,0 g H-Asn-Leu Ser-OMe # HCl hinzugefügt. danach 16 Sumden bei 0 gerührt, zur Trockne eingedampft und der Rückstand aus Chloroform/Diäthyläther umkristallisiert.
Man erhält BOC-Ser-Asn-L@u-Ser-OMe. Smp. 135 .
[a]D20 = -22@ in Dimethylformamid. das man in 420 ml einer 4n Salzsäurelösung in Methanol löst. Man lässt 1 Stunde bei 25 stehen, dampft zur Trockne ein und kristallisiert aus Methanol Essigsäureäthylester um.
Man erhält H-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe # HCl, Smp. 155 (Zers.), [e] 2D =- 15- in Dimethylformamid.
c) BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser-NHNH2
Man löst 18.5 g H-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe HCl und 18,0 g BOC-Cys(Bzl)-ONP in 100 ml Dimethyl- formamid auf. gibt 10 ml Wasser. 3.5 ml Essigsäure und 5,6 ml Triäthylamin zu, lässt 16 Stunden bei 25 stehen.
dampft zur Trockne ein und kristallisiert aus Methanol um. Man erhält 25.1 g BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu Ser-OMe. Smp. 182@, [a]D20 = -17 in Dimethylformamid. das man unter leichtem Erwärmen in 200 ml Dimethylformamid löst. Man gibt 200 ml Methanol und 20 ml Hydrazinhydrat zu, lässt 16 Stunden bei 30 stehen, fällt mit Diäthyläther, wäscht den Niederschiag mit Diäthyläther/Methanol (1 : 1) und trocknet das so erhaltene BOC-Cvs(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser-NHNH .
Smp. 224 , [a]D20 -13@ in Dimethylformamid.
Teilsequen@ F : Pivalovl-L-hemievstinyl-L-servl-L- asparaginyl-L-leucyl-L-seryl-L-threonyl-L hemicystinyl-L-valyl-L-leuein
EMI6.1
Man löst 18,4 g BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu-S@ NHNH2 (Teilsequenz F2) in 150 ml Dimethylformam löst man ihn in Essigester und fällt durch Zugabe von Diäthyläther. Man erhält 13,5 g BOC-Ser-Ala-Tyr Trp-Arg(NO2)-OMe; Smp. 135 (Zers.). [a]D20 = -15 in Dimethylformamid.
e) tert.-Butyloxycarbonyl-L-s@ryl-L-alanyl-L-tyrosyl- L-tryptophanyl-L-arginin-hydrazid # Ace@at (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-NHNH2 # CH@COOH)
Man löst 13.2 g von dem oben erhaltenen Pentapeptidester in 300 ml Essigsäure. gibt 60 ml Wasser und
13,2 g Palladium-Kohle (10 @@ ig) zu und hydriert bis zum Ende der Wass@rs@offaufnahme. Man filtriert.
dampft ab. löst den Rückstand in Dimethylformamid auf, dampft wiederum ab, um die Spuren von Essigsäure zu beseitigen. Anschliessend löst man den Rückstand in 260 ml Methanol. versetzt mit 26 ml Hydrazinhydrat und lässt 16 Stunden bei 40 @ stehen. Nach Zugabe von 260 ml Diäthvläther filtriert man die ausgeschiedene kristalline Masse ab. wäscht mit Diäthyl äther und trocknet im Hochvakuum über Schwefelsäure. Man erhält BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-NHNH2 # CH3COOH; Smp. 182 , [a]D20 = -8 in Dimethylformamid.
Teilsequenz Fl: L-Threonyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L valyl-L-leucin (H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OH) a) H-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe # HBr
Man löst 21,0 g Z-Cys(Bzl)-OCP und 12.3 g H-Val Leu-OMe # HCl in 120 ml Dimethylformamid. Danach gibt man 5,9 ml Triäthylamin hinzu. lässt 16 Stunden bei 25 stehen. führt Essigester hinzu. wäscht mit verdünnter Salzsäure. trocknet über Natriumsulfat, dampft zur Trockne ab und kristallisiert den Rückstand aus Essigsäureäthylester/Diäthyläther. Man erhält Z Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe.
Smp. 160 . [a]D20 = -28 in Dimethylformamid. das man in 210 ml einer 40 % igen Lösung von Bromwasserstoff in Eisessig löst. Man lässt 1 Std. bei 25 stehen, damp@t zur Trockne ein und kristallisiert den Rückstand aus Isopropanol Diäthyl äther um. Man erhält H-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe # HBr, Smp. 168 , [a]D20 = -14 in Dimethylformamid.
b) H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe # 1,3 HBr
Man löst 20 g Z-Thr-NHNH2 in 350 ml Dimethylformamid, kühlt auf -20 . gibt 100 ml einer Lösung von 2n Salzsäure in Dioxan und anschliessend noch 10 ml tert.-Butylnitrit zu. Nach 10 Minuten bei - 20 werden 45 ml Triäthylamin und 25,5 g H-Cys(Bzl)-Val Leu-OMe # HBr hinzugefügt und das erhaltene Gemisch während 16 Stunden bei 0 geschüttelt. Man dampft zur Trockne ein, löst den Rückstand in einem Gemisch von Essigsäureäthylester/Wasser. wäscht die organische Phase mit verdünnter Salzsäure. trocknet über Natriumsulfat, dampft ein und kristallisiert den Rückstand aus Essigester um. Man erhält Z-Thr-Cys (Bzl)-Val-Leu-OMe: Smp. 208 , [a]D20 = -27 in Dimethylformamid.
Man löst 20 g von dem oben erhaltenen Tetrapeptid in 200 ml eines Gemisches von Trifluoressigsäure/ Essigester (1 : 1) auf. leitet während 1 Stunde bei 0 einen Strom gasförmigen Bromwasserstoffs ein. dampft anschliessend ein und kristallisiert den Rückstand aus Methanol/Diäthyläther um. Man erhält H-Thr-Cys(Bzl) Val-Leu-OMe # 1.3 HBr: Smp. 202 , [a]D20 = -10 in Dimethylformamid.
kühlt auf - 20@. gibt 40 ml einer 2n Lösung von Salzsäure in Dioxan und 15 ml tert.-Butylnitrit Zu. Nach 10 Minuten bei -20 eibt man noch 28 ml Triäthyl- amin und 1 6.2 ; H-Thr-Cys(Bzl)-N'al-Leu-OH (Teil- sequenz F1) zu und rührt 16 Stunden bei 25 . danach wird filtriert. die Lösung eingedampft und der Rückstand mit In Essigsäure durchgewaschen. Man erhält
BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu OH, Smp. 217 .[a]D20 -27 in Dimethylformamid.
Man löst das erhaltene Produkt in 5000 ml getrocknetem Ammoniak. gibt unter Rühren und Siedcn des Ammoniaks Natriummetall bis zur tiefblauen Fiirbung zu. Zwecks En@färbung :vird Ammoniumchlorid hinzugefügt. Man dampft zur Trockne ein und wäscht den Rückstand mit ln Essigsäure und Aceton durch.
Nach dem Trocknen erhält man BOC-Cys-Ser-Asn Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-OH. Smp. 248 (Zers.), [a]D20 = -41 in Dimethylformamid Wasser (3 : 1).
Man löst das so erhaltene Nonap@ptid in 5000 ml 0,01n Ammoniak auf, gibt unter Rühren In Wasserstoffperoxyd bis zur negativen Nitroprussiatrenktion zu, dann noch 200 ml Eisessig. filtriert und lyophilisiert.
Man erhält
EMI7.1
Smp. 238 (Zers.). [a]D20 = -18 in Dimethylformamid!Wasser (7 : 3). das man in 300 ml Trifluoressigsäure löst. Iässt 30 Minuten bei 25 stehen. dampft ab, wäscht den Rückstand mit Essigester und löst ihn in 300 nil Dimethylformamid auf. Zu diescr Lösung gibt man 30 g Pivalinsäure-p-nitrophenylester - der wie nachstehend beschrieben hergestellt ist - sowie 14 ml Triäthylamin. lässt 16 Stunden bei 25- stehen. dampft ab und wäscht den Rückstand mit Chloroform. Man löst in 300 ml Dimethylformamid. gibt 50 m! Wasser und 50 a DOWEX-50 hinzu. rührt 15 Minuten. filtriert.
wäscht das Harz mit Dimethylformamid und dampft das Filtrat zur Trockne ein. Man wäscht den Rückstand zuerst mit Chloroform. anschliessend mit Essigester und trocknet. Man erhält das
EMI7.2
@@@-@@@-@@@-@@@-@@@-@@@-@@-@@@-@@@-@@@-@@@.
Smp. 243 [a]D20 = -17 in Dimethylformamid/Was- ser (3 : 1).
Pivalinsäure-p-nitrophenylester
Man löst 95 g Pivalinsäure und 131 g p-Nitrophenyl in 1000 ml Essigester. gibt 197 g Dicyclohexylcarbodiimid zu. rührt 2 Stunden bei 25' filtriert. dampft das Filtrat ein und kristallisiert den Rückstand aus einem Gemisch von Essigester-Petroläther um. Man erhält Pivalinsäure-p-nitrophenylester, Smp. 104 .
Teilsequenz ABC: Nim-Trityl-L-histidyl-L-arginyl-L phenylalanyl-L-seryl-glvcyl-L-methionyl-glycyl-L
L-phenylalanyl-glycyl-L-prolyl-L-glutamyl-L thr@onyl-L-prolinamid # Tri-Acetat (H-His-(Trt)
Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr Pro-NH@ # 3-CH;CO.H) a) L-Seryl-glycyl-L-methionyl-glycyl-L-phenylalanyl glycyl-L-prolyl-L-glutamyl-L-threonyl-L-prolin amid # Hydrochlorid (H-Ser-Gly-Met-Gly-Phe
Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 # HCl)
Man löst 6.7 g BOC-Ser-Gly-Met-Gly-OH (Teilsequenz B), 12 2 g H-Phe-Gly-Pro-Glu(OTB)-Thr-Pro NH. (Teilsequenz A) und 2,1 g Hydroxysuccinimid in 50 ml Dimethylformamid und 20 ml Acetonitril auf.
kühlt auf 0', gibt A.0 g Dicyclohexylcarbodiimid hinzu und lässt 16 Stunden bei 0 stehen. Man dampft das Lösungsmittcl ab, wäscht den Rückstand mit Wasser, Diäthyläther und Essigester und kristallisiert aus Chloroform um. Man erhält BOC-Ser-Gly-Met-Gly-Phe Gly-Pro-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2, Smp. 121 (Zers.), [aj b'0 =-47' in Dimethylformamid, das man in 250 ml einer Lösung von 8n Chlorwasserstoff in Dioxan löst. Man rührt während 2 Stunden bei 25@. dampft zur Trockne ein und verarbeitet den Rückstand in Diäthvl äther. Man erhält H-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro- Glu-Thr-Pro-NH2 # HCl [Smp. 130 (Zers.), [a]D20 = -48 in Dimethylformamid].
b) Nim-Trityl-L-Histidyl-L-arginyl-L-phenylalanyl-L seryl-glycyl-L-methionyl-glycyl-L-phenylalanyl glycyl-L-prolyl-L-glutamyl-L-threonyl-L prolinamid Tri-A cm tat (H-His-(Trt)-Arg-Phe-Ser
Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro NH2 # 3 CH3CO2H)
Man löst 9,9 g Trt-His(Trt)-Arg-Phe-NHNH.2 HCl (Teilsequenz C) in 100 ml Dimethylformamid, kühlt auf - 20 , gibt 15 ml Dioxan/HCl 2n und anschliessend 1,16 ml tert-Butylnitrit zu, rührt 10 Minuten bei 200, gibt 28 ml Triäthylamin und 10,0 g H-Ser-Gly-Met Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 # HCl zu, rührt 4 Stunden bei 0 , filtriert und dampft zur Trockne ein.
Man löst den Rückstand in einem Gemisch von Essit- ester'Methanol (8 : 2) auf, wäscht mit verdünntem Ammoniak und anschliessend mit Wasser bis zur Neutralität. trocknet über Natriumsulfat, konzentriert auf 100 ml und fällt durch Zugabe von Diähyläther. Man löst den Niederschlag wiederum in Dimethylformamid auf und fällt durch Zugabe von Diäthyläther. Man erhält
Trt-His(Trt)-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly Prn-G1u-Thr-Pro-NH.
[Smp. 168 (Zers.), [a]D20 = -43 in Dimethylformamid], das man in 500 ml Essigsäure/Wasser (8 : 2) löst. Man lässt 3 Stunden bei 400 stehen. dampft ein.
wäscht den Rückstand in Diäthyläther und trocknet im Hochvakuum über KOH-Spänen. Man erhält
H-His(Trt)-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly Pro-Glu-Thr-Pro-NH.2 3 CH:.COOH, Smp. 1820 (Zers.), [ll2r) = - 56 in Essigsäure.
Teilsequenz DE: N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L alanyl-L-tyrosyl-L-tryptophanyl-L-arginyl-L asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl-L-asparaginyl L-phenylalanin hydrazid diacetat (BOC-Ser
Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe NHNH2 # 2 CH3COOH) a) 1-(N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-L tyrosyl-L-tryptophanyl-L-arginyl-L-asparaginyl-L leucyl-L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenylalanin) 2-benzyloxycarbonyl-hydrazid # diacetat (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn
Phe-NH-NH-Z # 2 CH3COOH)
Man kühlt 320 ml Dimethylformamid auf -20@ C, gibt 100 ml 2n Chlorwasserstoff in Dioxan zu und löst darin 68 g BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-NHNH2 acetat (Teilsequenz E).
Anschliessend versetzt man mit
12 ml tert.-Butylnitrit, lässt 10 Minuten bei 200 rüh ren und tropft 35 ml Triäthylamin zu. Das so erhaltene Gemisch wird mit einer Lösung. entstanden aus 8,8
H-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NHNH-Z # Trifluoracetat (Teilsequenz D) und 17 ml Triäthylamin in 150 ml Dimethylformamid vereinigt. Nach 1 6 Stunden Stehen- lassen bei 0- wird eingedampft. Man löst den Rück- stand in Essigester Butanol und wäscht mit verdünnter Essigsäure und Ammoniaklösung. Nach Eindampfen des Lösungsmittels verbleibt das BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp- Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NHNH-Z # 2 CH@COOH vom Sp. 175@ . [a]D20 = - 19.5 in Dimethylformamid.
b) tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl
L-tryptophanyl-L-arginyl-L-asparaginyl-L-leucyl
L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenylalanin-hy drazid # diacetat (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn Leu-Asn-Asn-Phe-NHNH2 # 2 CH3COOH)
Man löst 90 Q BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu- Asn-Asn-Phe-NHNH-Z .2 CH:1COOH in 500 ml Dimethylformamid und hydriert mit 10 g Pd.'C (10% ig) bis zum Ende der Wasserstoffaufnahme. Nach Abfiltrieren des Katalysators wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand aus einem Gemisch von Ather und Äthanol kristallisiert.
Man erhält
BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn
Phe-NHNH2 # 2 CH3COOH vom Smp. 265 , [a]D20 = - 57 in Dimethylformamid.
Teilsequenz ABCDE: L-Seryl-L-alanyl-L-tyrosyl-L tryptophanyl-L-arginyl-L-asparaginyl-L-leucyl-L asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenylalanyl-L-histi dyl-L-arginyl-L-phenylalanyl-L-seryl-glycyl-L methionyl-glycyl-L-phenylalanyl-glycyl-L-prolyl-L glutamyl-L-threonyl-L-prolinamid # hexa-trifluor acetat (H-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-
Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro Gly-Thr-Pro-NH2 # 6CF@CO2H)
Man löst 15,2 g BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Ae-Asn- Leu-Asn-Asn-Phe-NHNH2 # diacetat (Teilsequenzen D, E) in 200 ml Dimethylformamid, kühlt auf -20 .
gibt 15 ml Dioxan/HCl 2n und anschliessend 1,16 ml tert. Butylnitrit zu und rührt 10 Minuten bei -203. Man gibt 14 ml Triäthylamin und eine Lösung von 18.6 g des in Teilsequenz A, B. C erhaltenen Tridecapeptidacetats zu, rührt das erhaltene Gemisch 16 Stunden bei 06, filtriert und dampft zur Trockne ein. NIan wäscht den Rückstand mit Diäthyläther und mit Chloroform, löst in DioxaniWasser (8 :2), behandelt die erhaltene Lösung mit 100 ml Amberlit-IRA-410 (Acetat-Form), dampft ein und kristallisiert den Rückstand aus Isopropanol/Wasser um. Man erhält das BOC-Ser-Ala-
Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His(Trt)-Arg-Phe Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 Acetat. Smp. 145 (Zers.).
[a]D20 =-67 in Essigsäure, das man unter Stickstoffatmosphäre in 500 ml Trifluoressigsäure löst. Man lässt 1 Stunde bei 25 stehen, konzentriert auf 100 ml und fällt durch Zugabe von 1000 ml Diäthyläther. Man filtriert, löst den Rückstand in Dimethylformamid und fällt mit Diäthyläther. Nach Trocknen über KOH Spänen erhält man das
H-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe
His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro
Glu-Thr-Pro-NH2 # 6 CF3CO2H, Smp. 130 (Zers.), [a]D20 =-43 in Essigsäure.
Beispiel: Pivaloyl-L-hemicystinyl-L-seryl-L-asparagi nyl-L-leucyl-L-seryl-L-threonyl-L-hemicystinyl-L valyl-L-leucyl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl-L-trypto phanyl-L-arginyl-L-asparaginyl-L-@@@cyl-L-aspara- ginyl-L-asparaginyl-L-phenylalanyl-L-histidyl-L arginyl-L-phenylalanyl-L-seryl-glycyl-L-methionyl glycyl-L-phenylalanyl-glycyl-L-pro@yl-L-glutamyl
L-threonyl-L-prolinamid # Hexa-Aceiat # Octa-
Hydrat
EMI8.1
Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe
His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro Glu-Thr-Pro-Nh2 # Hexa-Acetat # Octahydrat)
Man löst 1.0 g Nonapeptid (Teilsequenz F) in 10 ml Dimethylformamid. gibt 1,5 g N-Hydroxysuccinimid und 0,52 g Dicyclohexylcarbodiimid zu.
rührt 6 Stunden bei 253, filtriert und dampft das Filtrat zur Trockne ein. Man wüscht den Rückstand mit Essigester und Diäthyläther und trocknet. Man erhält
EMI8.2
Smp. 242-, das man in 10 ml Dimethylformamid löst.
Zu dieser Lösung gibt man 3,1 g Tricosapeptid-Hexa Trifluoracetat (Teilsequenz A, B, C. D. E), 0,4 ml Tri äthylamin sowie 1,2 g N-Hydroxysuccinimid und rührt 16 Stunden bei 25. Man dampft zur Trockne ein.
wäscht den Rückstand mit Diäthyläther. Chloroform und Aceton. So erhält man das rohe. geschützte Dotriacontapeptid, das man in 100 ml n.n Essigsäure löst.
mit 20 ml Amberlit-IRA-410 (Acetat) behandelt und gibt 50 ml 0,6n Ammoniumhydroxid hinzu. Man stellt das pH auf 6,5 ein und schichtet die erhaltene Lösung auf eine Carboxymethylcellulosesäule (10 x 100 cm).
die mit einer 0,15n Ammoniumacetatpufferlösung equilibriert wurde. Die Elution wird mit einem steigenden Konzentrations- und pH-Gradient (0.15n auf 0.1n: pH 6,5 auf pH 7.0) eines Ammoniumacetatpuffers durchgeführt. Die vereinigten Fraktionen, die das reine Peptid erhalten, werden dreimal gefriergetrocknet. der Rückstand wird mit Äthanol und ansehliessend mit Diäthyläther gewaschen und über Kaiiumhydroxid im Hochvakuum getrocknet. Man erhält
EMI8.3
Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 # 6 CH3CO2H # 8 H2O, Smp. 216 (Zers.). [a]D20 =-56@ in Essigsäure 1n.
Aminosäurezusammensetzung nach Säurehydrolyse (6n.
16 Std.):
Ala1.1, Arg2.0, Asn@.@, Cys,21.6, Glu@@, Gly6.0, His@@, Leu2.0, Met1.0. Phe3.0, Pro2.1, Ser@.@, Thr@@, Tyr1.0, Val0.1 (Trp 1,0 durch Spektrophotometrie).
PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zur Herstellung bisher unbekannte: Polypeptidderivate der Formel
EMI8.4
II 12 13 14 jr, 16 1. 18 19 20 20 Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg
22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-P@@ -NH2
**WARNUNG** Ende DESC Feld konnte Anfang CLMS uberlappen**.
Process for the production of previously unknown polypeptide derivatives
The present invention relates to a process for the preparation of previously unknown polypeptide derivatives of the formula
EMI1.1
II 12 1.1 14 15 16 1. 18 19 20 Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-H is-Arg
22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro NH2, where R is an alkyl, an optionally substituted aralkyl or a optionally substituted aryl group, its therapeutically effective acid addition salts and heavy metal complexes.
For example, R can represent the methyl, ethyl, propyl, tert-butyl group or a phenyl or benzyl radical which is optionally substituted by halogen, a lower alkoxy or nitro group. The new Polypcptidderivatc are characterized by resistance to the degrading action of aminopeptidases.
The previously unknown polypeptide derivatives can be prepared by methods generally known for the synthesis of compounds of this type, the amino acids being linked to one another individually in the order specified in the above formula or after prior formation of smaller peptide units, by adding corresponding compounds necessary for their construction Formation of CONH bonds condensed with one another in any chronological order, with free functional groups not participating in the reaction being protected by suitable protective groups, the protective groups being split off at any point in the synthesis,
the mercapto groups are oxidized to the disulfide after formation of the partial sequence 1 to 7 and before incorporation of the partial sequence containing a methionyl group, the carboxyl group of the terminal prolyl radical is converted into the amide group and, if necessary, the acid addition salts are then prepared by reacting the polypeptide derivatives of the above formula with organic or inorganic compounds Acids converted into the corresponding salts. In the last stage, however, riveted testicles are to be used in which racemization does not occur or can be kept low, preferably the azide or the activated ester method, with N-hydroxysuccinimide preferably being used for activation.
The benzyl radicals used in cysteine-containing peptides to protect the SH groups are usually split off at the end of the synthesis by treatment with sodium in liquid ammonia. It has now been found that the splitting off of the benzyl protective groups and the production of the (Cys) S-S (Cys) bond before the last stage lead to particularly good yields of all end products.
In the construction of the new polypeptides, the tert-butyloxy group has proven useful for blocking the ^ -carboxyl group, for example in the partial sequence A described below, but other protective groups such as the methoxy, the ethoxy, the tert. Amyloxy, the amide or the benzyloxy group can be used.
The triphenylmethyl group has proven useful for blocking the imidazole group of the histidine residue in the partial sequence C described below, but other suitable protective groups, such as the carbo-tert.-butoxy-, the carbo-tert.-amyloxy-. the garobenzoxy or benzyl group can be used.
The nitro group was used to block the guanido group of the arginine residue in the partial sequence E described below. however, other suitable protecting groups, such as the tosyl group, can also be used.
the p-nitrobenzoxycarbonyl group or the 2- (isopropyloxycarbonyl) -3.4,5 (i-tetrachlorobenzoyl group; ppe can be used. The protective effect of protonation of the guanido group can also be used in the synthesis.
The new polypeptide derivatives can also be obtained or used in the form of their salts. The salts used are those with organic acids. like acetic acid.
Propionic acid. Glycolic acid, N-fillic acid. Pyruvic acid, malonic acid. Succinic acid. Maleic acid. Fumaric acid, NV Citric acid, benzoic acid, cinnamic acid, salicylic acid, 2-phenoxy- or 2-acetoxybenzoic acid. Mandelic acid, methanesulfonic acid. Ethanesulfonic acid, HydroxväthansulfollsäLre benzene or toluene sulfonic acid, naphthalenesulfonic acid, sulfanilic acid and polymeric acids such as tannic acid, alginic acid.
Polygalacturonic acid. f> olyphloretin phosphate or carb oxymethylellulose and salts with inorganic acids, such as hydrohalic acid. z. B. hydrochloric acid or hydrobromic acid. Nitric acid, thiocyanic acid.
Sulfuric acid and phosphoric acid in question. As a heavy metal complex z. B. the one from zinc ## in question.
The starting products for the production of the new polypeptide derivatives can, if they were not previously known, be obtained by the methods known for peptide chemistry, the amino acids being linked to one another individually or after prior formation of smaller peptide units.
The new compounds represent an important therapeutic principle that lowers the calcium plasma level, in particular the increased calcium plasma level, and, as an antagonist of the parathyroid hormone, brings about a positive calcium balance in the bones.
It is therefore indicated for all conditions. in which a lowering of the plasma calcium level is desired, e.g. B. Hypercalcemias of various origins, deficiency of endogenous thyrocalcitonin as a result of loss of thyroid tissue. Hyperfunction of the parathyroid glands.
The new connections are indicated for all bone affections. which are based on increased breakdown or in which increased calcium fixation in the bone is desired, e.g. B. Osteoporosis of various origins (e.g. post-climacteric, post-traumatic, caused by corticosteroid therapy or inactivity, etc.), fractures, osteomalacia, rickets and especially for combination therapy with calcium or phosphate.
Biological testing of the new compounds showed an efficacy of about 100 to 450 MRC units / mg peptide. The required daily dose (in conjunction with
verabrcicht) in MRC units is 20 mE to 10 U, preferably 100 mE kg animal weight.
When eating, the daily dose (i. M.
administered) in MRC units 1 to 500 U. A daily dose of 5 U i. m. delivered.
The new compounds can be used as remedies.
z. B. in the form of pharmaceutical preparations, use. These contain the compounds mentioned in a mixture with an organic or inorganic carrier material suitable for parenteral administration. Such substances come into question for the same.
who do not react with the new connections such as B. gelatin. Lactose, starch, magnesium stearate.
Talc, vegetable oils, benzyl alcohols, gum arabic, polyalkylene glycols, petrolatum, cholesterol or other known medicinal products.
The pharmaceutical preparations can, for. B. in liquid form as solutions, suspensions or emulsions. If necessary, they are sterilized and / or contain auxiliary substances such as preservatives and stabilizers. Wetting agents or emulsifying agents. You can have others too. Contain therapeutically valuable substance. The new compounds can also be administered in the form of a depot preparation.
The new compounds and their salts can also be used as intermediates for the production of pharmaceutical preparations.
The following abbreviations are used:
Z = carbobenzoxy
Bzl = benzyl
BOC = tert-butyloxycarbonyl
Piv = pivaloyl
Trt = trityl = triphenylmethyl
OTB = tert-butyloxy
ONP = p-nitrophenyl ester
OCP = 2,4,5-trichlorophenoxy
OSu = oxysuccinimide
OMe = methoxy
OEt = ethoxy NO2 = nitro
Ser = L-seryl
Asn L-asparaginyl
Leu - L-Leucyl
Thr = L-threonyl
Val = L-valyl
Ala = L-alanyl
Tyr L-tyrosyl
Trp = L-tryptophanyl
Arg = L-arginyl Phe - L-phenylalanyl
Glu L-glutamyl
His L-histidyl
Pro L-prolyl
Gly = glycyl
Met - L-methionyl
Cys = L-cysteinyl
In the following examples, which explain the execution of the process,
but are not intended to limit the scope of the invention in any way. all temperatures are given in degrees Celsius.
Partial sequence A: L-phenylalanyl-glycyl-L-prolyl- γ-tert-butyloxy-L-glutamyl-L-threohyl-L-prolinamide fH-Phe-G ly-Pro-Glu (OTB) -Thr-Pro- NH2) At -5 134 e Z-Thr-NH-NH2 is dissolved in 2
In hydrochloric acid and mixed with (), 55 1 in sodium nitrite.
After 5 minutes, potassium carbonate is added to pH 9, the azide formed is extracted with ALhylacetat and a solution of 80 g of H-Pro-NH2 hydrochloride in 100 ml of water, 500 ml of dimethylformamide and 77 ml of triethylamine are added. The ethyl acetate is evaporated at 20 in vacuo and left to stand at 25 overnight. The remaining solution is evaporated in vacuo and the residue is dissolved in ethyl acetate. the solution with water. diluted hydrochloric acid and an aqueous potassium carbonate solution and dried over sodium sulfate. Evaporate in vacuo. Dissolve in warm ethyl acetate and cool.
Z-Thr Pro-NH.,; M.p. 148-. [a] D20 = -72 in 95, C, acetic acid. 90 g of Z-Thr-Pro-NH2 are then dissolved in 2 l of dioxane and 260 ml in hydrochloric acid and hydrogenated at 20 ° C. and normal pressure in the presence of a palladium catalyst. It is filtered, the solution is evaporated in vacuo, the residue is washed with ethyl acetate and H-Thr-Pro-NH2 # HCl is obtained; M.p. 216, [a] D20 = -64 @ in 95% acetic acid. This is dissolved in 500 ml of dimethylformamide, 50 ml of water and 32 ml of triethylamine, and 118 g of Z-Glu (OTB) -OCP and 800 ml of tetrahydrofuran are added. The mixture is left to stand at 20 overnight, evaporated in vacuo and the residue is crystallized with ethyl ether.
Z-Glu (OTB) -Thr-Pro-NH2, m.p. 65 = (dec.), [A] D20 = -180 in dimethylformamide is obtained.
80 g of Z-Glu (OTB) -Thr-Pro-NH2 are dissolved in 1.5 l of dioxane and 200 ml of water and hydrogenated at 20 ° and normal pressure in the presence of a palladium catalyst.
The solution is filtered and evaporated in vacuo and diethyl ether is added to the residue, H-Glu (OTB) -Thr-Pro-NH being obtained; M.p. 65 (dec.), [A] D20 = -28 @ in dimethylformamide. This is dissolved in 700 ml of dimethylformamide at 0, 200 ml of acetonitrile, 6½ g of Z-Phe-Gly-Pro-OH and 32 g of dicyclohexylcarbodiimide are added, left to stand overnight at 20, filtered, evaporated in vacuo and ethyl acetate is added.
The solution is then washed with water, dilute hydrochloric acid and aqueous potassium carbonate solution, dried over sodium sulfate, evaporated in vacuo and the residue is crystallized from ethyl acetate / ethyl ether. Z-Phe-Gly-Pro-Glu (OTB) -Thr-Pro-NH2, m.p. 120 (decomp.), [A] D20 = -66 @ is obtained in dimethylformamide, which is dissolved in 1500 ml of dioxane and 300 ml Water dissolves. 30 g of palladium-carbon (10%) are added and the mixture is hydrogenated until hydrogen uptake has ceased. The filtrate is filtered off and the residue is crystallized from dioxane. The H-Phe-Gly-Pro-Glu (OTB) -Thr-Pro-NH2 is obtained; Mp. 153 @, [a] D20-79 in dimethylformamide.
Partial sequence B: N-tert-butyloxycarbonyl-L-seryl-glycyl
L-methionyl-glycine (BOC-Ser-Gly-Met-Gly-OH) a) L-methionyl-glycine-ethyl ester hydrochloride (H-Met-Gly-OEt. HCI)
Dissolve 65 g of BOG-Met-OH in 900 ml of chloroform and cool to -10. add 30 ml of N-methylmorpholine and 35.6 g of isobutyl chloroformate. After 10 minutes, a solution of 30 g of glycine ethyl ester in 200 ml of chloroform is slowly added and allowed to react at 20 for one hour. Extract with 0.5N ammonium hydroxide. then with 0.2N sulfuric acid, washed neutral with water, dried over sodium sulfate and concentrated. After recrystallization from petroleum ether, BOC-Met-Gly-OEt is obtained; M.p. 49. [a] D20 = -19 in ethanol.
It is dissolved in 750 ml of 4N HCl ethanol, left to stand at 25 for 1 hour and evaporated. washes the residue with diethyl ether and dries to constant weight. The H-Met-Gly-OEt # HCl is obtained in the form of an oil.
b) N-tert-butyloxycarbonyl-L-seryl-glycine-ethyl ester (BOC-Srr-Gly-OEt)
12.5 g of N-tert-butyloxycarbonyl-serine are dissolved in
100 ml of chloroform and 6.1 g of N-methylmorpholine are added; then 8.2 g of isobutyl chloroformate are added dropwise. After 10 minutes, a solution of 6.6 g of glycine ethyl ester in 50 ml of chloroform is added and the mixture is stirred at room temperature for 1 hour.
The reaction mixture is washed with dilute ammonia and then with hydrochloric acid solution, dried over sodium sulfate and the organic phase is evaporated. BOC-Ser-Gly-OEt is obtained as an oil; [a] D20 - - 30 in dimethylformamide.
c) N-tert-butyloxycarbonyl-L-seryl-glycine-hydrazide (BOC-Ser-Gly-NHNH2)
19.4 g of BOC-Ser-Gly-OEt are dissolved in 270 ml of ethyl alcohol, 4S, 6 ml of hydrazine hydrate are added and the mixture is left to stand for 2 days at room temperature. The solution is then evaporated and the residue is crystallized from an ethyl alcohol / ethyl ether mixture (1: 3). BOC-Ser-Gly-NHNH2 is obtained. M.p. 157, [a] D20 = -5 in dimethylformamide.
d) N-tert-butyloxycarbonyl-L-seryl-glycyl-L-methio nyl-glycine-ethyl ester (BOC-Ser-Gly-Met-Gly-OEt)
15 ml of a 4N hydrogen chloride solution in ethyl ether are added to 700 ml of dimethylformamide and dissolved therein at -10 11 g of BOC-Ser-Gly-NHNH2.
Then 5.4 ml of tert-butyl nitrite are added dropwise at - 100. add 18 ml of triethylamine and then a solution of 12 g of H-Met-Giy-OE, HCl in 100 ml of dimethylformamide and 6.2 ml of triethylamine to the solution. It is stirred for 3 hours at room temperature, filtered after 12 hours and evaporated. The residue is dissolved in chloroform, washed successively with dilute ammonia and hydrochloric acid solution, dried over sodium sulfate and evaporated. BOC Ser-Gly-Met-Gly-OEt is obtained. [a] D20 = -14 in demethylformamide.
e) tert-Butyloxycarbonyl-L-seryl-glycyl-L-methionyl glycine (BOC-Ser-Gly-Met-Gly-OH)
24 g of BGC-Ser-Gly-Met-Gly-OEt are dissolved in 250 ml of dioxane. add 75 ml of sodium hydroxide solution. stir for 1 hour at 25, treated with 150 ml of Dowex-50 (H-form).
filtered. the filtrate evaporates and the residue crystallizes from ethyl acetate / diethyl ether. BOC-Ser-Gly-Met-Gly-OH, melting point 87 @ (decomp.) [A] D20 = - 17 'in dimethylformamide is obtained.
Partial sequence C: N @, Nimid. Ditrityl-L-histidyl L-phenylalanine hydrazide # HCl (Trt-His (Trt) -Arg Phe-NH-NH2 # HCl) a) Z-Arg (NO2) -Phe-OMe
51.8 g of H-Phe-OMe HCl are dissolved in 1 liter of ether and about 50 ml of ice water, and enough sodium carbonate is added with stirring and cooling until all of the water has set. It is filtered and the filtrate is evaporated to constant weight. a colorless oil being obtained.
67.6 g of Z-Arg (NO ..) - OH are dissolved in 300 ml of acetonitrile and 150 ml of dimerhylformamide and gelatinized with 41.2 g of H-Phe-OMe. It is then cooled to -20 @ and a solution of 43.4 g of dicyclohexylcarbodiimide in 100 ml of acetonitrile is added. The whole thing is left to stand in the ice cave for 4 hours while being shaken from time to time. The resulting precipitate is filtered off and the filtrate is evaporated. The evaporation residue is dissolved in 1 liter of vinegar and then washed in the cold with 1N sodium hydroxide solution, water, sulfuric acid, water and saturated sodium chloride solution.
The ethyl acetate phase, dried over sodium sulfate, is completely evaporated. After recrystallization from Essizesterj petroleum ether, Z-Arg (NO.2) -Phe-OMe is obtained; M.p.
131-133, [a] 20 D = -7 in methanol. -4 in dimethylformamide.
b) H-Arg (NO2) -Phe-OMe # 0.5 H2O # 1.2 HBr
20 g of Z-Arg (NO2) -Phe-OM3 are dissolved in 50 ml of glacial acetic acid, and 50 ml of 40% strength hydrobromic acid in glacial acetic acid are added with gentle cooling. The whole is then left to stand for 1 hour at 20 ° with occasional shaking. After complete evaporation, the residue is dissolved in 200 ml of water and washed twice with ether. The aqueous phase is completely evaporated and the residue is recrystallized from methanol / ether. M.p. 165-167 with dec., [A] D20 = t 18 @ in methanol, + 14 in dimethylformamide.
c) Z-His (Z) -Arg (NO2) -Phe-OMe
46.1 g of H-Arg (NO2) -Phe-OMe # 0.5 H2O # 1.2 HBr are dissolved in 100 ml of water, then heated and then cooled. After adding chloroform and ice, the pH is adjusted to 9 with ammonia. The chloroform phase is washed once more with water, then dried over sodium carbonate and filtered. A solution of 44.5 g of Z-His (Z) -OH, 12.1 g of hydroxysuccinimide in 200 ml of acetonitrile and 100 ml of pyridine is added to the filtrate, then the whole is cooled to -20- and treated with a solution of 21.1 g of dicyclohexylcarbodiimide in 70 ml of acetonitrile are added. The mixture is then left to stand for 4 hours in the ice box with occasional stirring.
The resulting precipitate is filtered off and the filtrate is evaporated. The residue is taken up in ethyl acetate and then washed as follows: 10% potassium carbonate solution (pH # 10).
Water, saturated saline solution, water, saturated saline solution, sulfuric acid (pH 3), water. Saline solution. The ethyl acetate phase, dried over sodium sulfate, is evaporated completely, a light beige foam being obtained. This foam is dissolved twice in a little methanol and precipitated with ether. The ether phases are decanted off and the precipitate is dried; Z-His (Z) -Arg (NO2) -Phe-OMe (amorphous foam) is obtained. [a] D20 = -8 @ in methanol, -8 @ in dimethylformamide.
d) H-His-Arg-Phe-OMe # 4HCl
25 g of Z-His (Z) -Arg (NO2) -Phe-OMe are dissolved in 800 ml of glacial acetic acid. Then 10 g of 10% palladium on activated charcoal are stirred in 200 ml of 1N hydrochloric acid and added to the solution. The whole thing is subjected to a 2 hour hydrogenation and then the catalyst is filtered off. The filtrate is reacted again with 5 g of 10% palladium on activated carbon in water and subjected to hydrogenation. which ends after 51 hours. About 80% of the theoretical amount of hydrogen is consumed here. The catalyst is filtered off and the filtrate is completely evaporated. whereby H-His-Arg-Phe-OMe .4 HCl is obtained in the form of an amorphous foam.
@) Trt-His (Trt) -drg-Phe-OMe # HCl 21.5 2 H-His-Arg-Phe-OMe # 4 HCl are dissolved in 100 ml of pyridine and about 100 ml of dimethylformamide. At about -5, triethylamine is added to pH 9 and a solution of 29 g of trityl chloride in 300 ml of pyridine is then added dropwise over the course of 5 minutes. After completion of the addition, the pH is checked from time to time and, if necessary, adjusted to about pH 9 with triethylamine. The whole is evaporated after about 4 hours, the residue is taken up in chloroform and water and adjusted to pH 4 with the addition of a little 1N hydrochloric acid. The chloroform phase is separated off, washed twice with water, dried over sodium sulfate and completely evaporated.
Ether is added to the residue and the ether is then filtered off. whereby Trt-His (Trt) Arg-Phe-OMe HCI is obtained.
f) Trt-His (Trt) -Arg-Phe-NH-NH2 # HCl
17 g of Trt-His (Trt) -Arg-Phe-OMe HCl are dissolved in 200 ml of methanol, and 40 ml of hydrazine hydrate are added. It is then left to stand for 2 days at room temperature. It is evaporated, the residue is dissolved in chloroform and washed twice with water. The chloroform phase is dried over sodium sulfate and evaporated. The residue is then washed with ether and filtered off: it consists of Trt-His (Trt) -Arg-Phe-NH-NH2 # HCl: [a] D18 = -9 @ in dimethylformamide, melting point 158.
Partial sequence D: l- (H-asparaginyl-L-ieucyl-L-asparaginyl-L-phenyl-alanine) -2-benzyloxycarbonyl-hydrazide # trifluoroacetate (H-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe NH-NH- Z # CF @ COOH) a) l- (N-tert-butyloxycarbonyl-L-phenylalanine)
2-benzyloxy-carbonyl-hydrazide (BOC-Phe-NH
NH-Z)
72 g of BOC-Phe-OH and 28 g of N-methylmorpholine are dissolved in 500 ml of methylene chloride and 26 ml of methyl chloroformate are added dropwise at -5. To
Another 10 minutes are added 44 g of Z-NHNH2 in 100 ml of methylene chloride and the mixture is stirred for a further 4 hours at room temperature. After washing with dilute phosphoric acid, it is dried and evaporated.
Crystallization from petroleum ether gives BOC Phe-NH-NH-Z with a melting point of 117 @, [a] D20 -5 @ in dimethylformamide.
b) 1- (N-tert-butyloxycarbonyl-L-asparaginyl
L-phenylalanine) -2-benzyloxycarbonylhydrazide (BOC-Asn-Phe-NH-NH-Z) Dissolve 41 g of BOC-Phe-NHNH-Z in 400 ml of trifluoroacetic acid and leave to stand at 20 for one hour.
When the trifluoroacetic acid is evaporated, the H-Phe-NHNH-Z is obtained as a crystalline trifluoroacetate before partial sequence E: tert-butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl
L-tyrosyl-L-tryptophanyl-L-arginine-hydrazide # Acetate (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-NHNH2 #
CH3COOH) a) N-tert-butyloxycarbonyl-L-tryptophanyl- (guanido)
N-nitro-L-arginine methyl ester (BOC-Trp-Arg (NO2) -OMe)
35 g of H-Arg (NO2) -OMe # HCl are dissolved. 63 g of BOC Trp-OCP and 14 g of N-methylmorpholine are dissolved in 300 ml of dimethylformamide and left to stand at 20 for 16 hours. After evaporation of the solvent, the residue is taken up in ethyl acetate and washed with dilute sulfuric acid. One constricts a little and falls out with ether.
BOC-Trp Arg (NO2) -OM3 with a melting point of 130, [a] D20 = -22, crystallizes in dimethylformamide.
b) N-tert-butyloxycarbonyl-L-tyrosyl-L-tryptophanyl (guanido) N-nitro-arginine methyl ester (BOC-Tyr-Trp-Arg (NOo) -OMe)
15 g of BOC-Trp-Arg (NO2) -OMe are dissolved in 80 ml of 5N methanolic hydrochloric acid solution and left to stand for 1 hour at room temperature. After evaporation of the solvent and treatment with ether, 13 g of H-Trp-Arg (NO2) -OMe remain as hydrochloride; 1200, [a] D = -9 in dimethylformamide.
This dipeptide is dissolved in 200 ml of dimethylformamide together with 14 g of BOC-Tyr OCP and S g of N-methylmorpholine. After 16 hours of standing at 20 ° C., the solvent is evaporated and the residue is taken up in ethyl acetate. After washing with dilute phosphorous acid and concentration of the solvent, BOC-Tyr-Trp-Arg (NO2) - OMe can be isolated with the aid of ether; M.p. 1305, [a] D20 = -11 in dimethylformamide.
c) tert-Butyloxycarbonyl-L-alanyl-L-tyrosyl-L tryptophanyl- (guanido) N-nitro-L-arginine methyl ester (BOC-Ala-Tyr-Trp-Arg (NO2) -OMe)
13.5 g of BOC-Tyr-Trp-Arg (NO,) - OMe are dissolved in 130 ml of 5N methanolic hydrochloric acid solution, left to stand for 1 hour at 25 and evaporated to dryness.
washes the residue with dimethyl ether. filtered off.
Dissolves in 100 ml of dimethylformamide and mixed with 8.0 g of BOC-Ala-OCP and 3.0 ml of triethylamine. After 16 hours at 25, 500 ml of ethyl acetate are added.
washes with dilute sulfuric acid and potassium bicarbonate solution and evaporated to dryness. After washing the residue with chloroform, BOC-Ala-Tyr-Trp-Arg (NO2) -OMe is obtained; M.p. 120 (dec.).
[a] D20 = 12 in dimethylformamide.
d) tert-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl L-lryptophanyl- (guanido) N-nitro-L -argininine ethyl ester (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg (NO2) -OMe)
12.3 g of BOC-Ala-Tyl-Trp-Arg (NO2) -OME are dissolved in 100 ml of 5N methanolic hydrochloric acid, left to stand for 1 hour at 25 and evaporated to dryness. washes the residue with diethyl ether. Dissolve it in 100 ml of dimethylformamide. mixed with 14 ml of triethylamine and 5 g of BOC-Ser-N2, left to stand at 0 for 16 hours, added 500 ml of ethyl acetate. washes successively with dilute sulfuric acid and ammonium hydroxide, dries over sodium sulfate and evaporates the solvent. After washing the residue with chloroform, mp 191, [a] D20 = + 26.4 in dimethylformamide.
This substance is dissolved together with 35 g of BOC-Asn-ONP and 30 g of N-methylmorpholine in 200 ml of dimethylformamide. After 16 hours at 70 ', the solvent is evaporated and the residue is washed successively with ethyl acetate and dilute phosphoric acid. BOC-Asn-Phe-NH-NH-Z is obtained with a melting point of 210 @. [A] D20 = -18 in dimethylformamide.
c) (N-tert-butyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L asparaginyl-L-phenylalanine) -2-benzyloxycarbonyl hydrazide (BOC-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z)
26 g of BOC-Asn-Phc-NH-NH-Z are dissolved in 200 ml of trifluoroacetic acid and left to stand for 1 hour at 20 '.
After evaporation of the solvent, 17 g of BOC-Asn-ONP and 15 g of N-methylmorpholine are added to 100 ml of dimethylformamide. After 16 hours at 200, the solvent is evaporated and the residue is washed successively with ethyl acetate and dilute phosphoric acid. BOC-Asn Asn-Phe-NH-NH-Z is obtained; M.p. 2400, [a] D0 = -280 in dimethylformamide.
d) 1- (N-tert-butyloxycarbonyl-L-leucyl-L-asparaginyl
L-asparaginyl-L-phenylalanine) -2-benzyloxycarbo nyl hydrazide (BOC-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z)
22 g of BOC-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z are dissolved in 150 ml of trifluoroacetic acid and left to stand at 200 for 1 hour. After evaporation of the solvent, 12 g of BOC-Leu-ONP and 10, N-methylmorpholine in 100 ml of dimethylformamide are added to the residue.
After 16 hours of standing at 200, the dimethylformamide is evaporated and the residue is washed in succession with ethyl acetate and dilute phosphoric acid. BOC-Leu-Asn-Asn-Phe NH-NH-Z of melting point 2100, [a] D22 = -34 in dimethylformamide is obtained.
e) 1- (N-ter.-butyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-leucyl
L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenylalanine)
2-benzyloxy-carbonyl-hydrazide (BOC-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z)
57 g of BOC-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z are dissolved in 300 ml of trifluoroacetic acid and left to stand at 20 for one hour. After evaporation of the solvent, the residue is crystallized from ether. The tetrapeptide trifluoroacetate is dissolved in 400 ml of dimethylformamide and the solution is mixed with 27 g of BOC-Asn-ONP and 25 g of N-methylmorpholine. After 16 hours of standing at 20 °, the solvent is evaporated and the residue is washed successively with ethyl acetate and dilute phosphoric acid.
BOC-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z of melting point 250 (decomp.), [A] D20 @ -34 in dimethylformamide is obtained.
f) 1- (L-asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl-L asparaginyl-L-phenylalanine) -2-benzyloxycarbonyl hydrazide # trifluoroacetate (H-Asn-Leu Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z # trifluoroacetate )
43.5 g of BOC-Asn-Lcu-Asn-Asn-Phc-NH-NH-Z are dissolved in 200 ml of trifluoroacetic acid and left to stand for one hour at 20 '. After evaporation, the residue is crystallized with the aid of ether. H-Asn-Leu Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z trifluoroacetate is obtained; M.p. 242, [a] D20 = -22 in dimethylformamide.
c) H-Thr-Cys (Bzl) -Val-Leu-OH
372 g of H-Thr-Cys (Bzl) -Val-Leu-OMe # 1.3 HBr are dissolved in 1800 ml of methanol. add 900 ml of 2N sodium hydroxide solution. lets stand at 25 for 1 hour. add 240 ml ice vinegar and let it set at 0 for 2 hours. The precipitated crystalline mass is filtered off. Washed first with 1N acetic acid and then with water and dried at 50 in a high vacuum. Tlas H-Thr-Cys (Bzl) -Val-Leu-OH was obtained. M.p. 219 [a] D20-53 in In ammonia.
Partial sequence F2: tert-butyloxycarbonyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-seryl-L-asparaginyl-L-leucyl-L - @@@@@ - hydrazide (BOC-Cys (Bzl) -Ser-Asn-Leu- Ser-NH-NH) a) H-Asn-Leu-Ser-OMe # HCl Dissolve 43 g of H-Leu-Ser-OMe # HCl and 53 g of BOC-Asn-ONP in 400 ml of dimethylformamide. add 27 ml of triethylamine. leaves 16 hours at 25.
evaporated to dryness and the residue was recrystallized from methanol. 51.6 g of BOC-Asn-Leu Ser-OMe are obtained. M.p. 190 @. [a] D20 = - 24 in dimethylformamide, which is dissolved in 500 ml of a 4N solution of hydrochloric acid in methanol. It is left at 25 for 1 hour.
evaporates to dryness, the residue is dissolved in methanol and precipitated with diethyl ether. H-Asn-Leu Ser-OMe # HCl is obtained; M.p. 180. [a] D20 = -23 in dimethylformamide.
b) H-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe # HCl
39.5 g of BOC-Ser® NHNH2 are dissolved in 500 ml of dimethylformamide, cooled to -20, 200 ml of a 2N solution of hydrochloric acid in dioxane and then 20 ml of tert-butyl nitrite are added. After 10 minutes at -20, 40 ml of triethylamine and 38.0 g of H-Asn-Leu Ser-OMe # HCl are added. then 16 Sumden stirred at 0, evaporated to dryness and the residue recrystallized from chloroform / diethyl ether.
BOC-Ser-Asn-L @ u-Ser-OMe is obtained. M.p. 135.
[a] D20 = -22 @ in dimethylformamide. which is dissolved in 420 ml of a 4N hydrochloric acid solution in methanol. The mixture is left to stand at 25 for 1 hour, evaporated to dryness and ethyl acetate is recrystallized from methanol.
H-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe # HCl, m.p. 155 (decomp.), [E] 2D = -15- in dimethylformamide is obtained.
c) BOC-Cys (Bzl) -Ser-Asn-Leu-Ser-NHNH2
18.5 g of H-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe HCl and 18.0 g of BOC-Cys (Bzl) -ONP are dissolved in 100 ml of dimethylformamide. gives 10 ml of water. 3.5 ml of acetic acid and 5.6 ml of triethylamine are allowed to stand at 25 for 16 hours.
evaporated to dryness and recrystallized from methanol. 25.1 g of BOC-Cys (Bzl) -Ser-Asn-Leu Ser-OMe are obtained. M.p. 182 @, [a] D20 = -17 in dimethylformamide. which is dissolved in 200 ml of dimethylformamide with gentle heating. 200 ml of methanol and 20 ml of hydrazine hydrate are added, left to stand for 16 hours at 30, precipitated with diethyl ether, the precipitate is washed with diethyl ether / methanol (1: 1) and the BOC-Cvs (Bzl) -Ser-Asn- thus obtained is dried Leu-Ser-NHNH.
M.p. 224, [a] D20-13 @ in dimethylformamide.
Partial sequences @ F: Pivalovl-L-hemievstinyl-L-servl-L-asparaginyl-L-leucyl-L-seryl-L-threonyl-L hemicystinyl-L-valyl-L-leuein
EMI6.1
18.4 g of BOC-Cys (Bzl) -Ser-Asn-Leu-S @ NHNH2 (partial sequence F2) are dissolved in 150 ml of dimethylformam, it is dissolved in ethyl acetate and precipitated by adding diethyl ether. 13.5 g of BOC-Ser-Ala-Tyr Trp-Arg (NO2) -OMe are obtained; M.p. 135 (dec.). [a] D20 = -15 in dimethylformamide.
e) tert.-Butyloxycarbonyl-Ls@ryl-L-alanyl-L-tyrosyl- L-tryptophanyl-L-arginine-hydrazide # Ace @ at (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-NHNH2 # CH @ COOH )
13.2 g of the pentapeptide ester obtained above are dissolved in 300 ml of acetic acid. gives 60 ml of water and
13.2 g of palladium-carbon (10%) are added and hydrogenated until the water uptake has ended. Filter.
evaporates. dissolves the residue in dimethylformamide, evaporates again to remove the traces of acetic acid. The residue is then dissolved in 260 ml of methanol. mixed with 26 ml of hydrazine hydrate and left to stand for 16 hours at 40 @. After adding 260 ml of dietary ether, the precipitated crystalline mass is filtered off. Washed with diethyl ether and dried in a high vacuum over sulfuric acid. BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-NHNH2 # CH3COOH is obtained; M.p. 182, [a] D20 = -8 in dimethylformamide.
Partial sequence Fl: L-Threonyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L valyl-L-leucine (H-Thr-Cys (Bzl) -Val-Leu-OH) a) H-Cys (Bzl) -Val-Leu- OMe # HBr
21.0 g of Z-Cys (Bzl) -OCP and 12.3 g of H-Val Leu-OMe # HCl are dissolved in 120 ml of dimethylformamide. Then 5.9 ml of triethylamine are added. leaves 16 hours at 25. adds ethyl acetate. washes with dilute hydrochloric acid. dried over sodium sulfate, evaporated to dryness and the residue crystallized from ethyl acetate / diethyl ether. Z Cys (Bzl) -Val-Leu-OMe is obtained.
M.p. 160. [a] D20 = -28 in dimethylformamide. which is dissolved in 210 ml of a 40% solution of hydrogen bromide in glacial acetic acid. The mixture is left to stand at 25 for 1 hour, evaporated to dryness and the residue is recrystallized from isopropanol diethyl ether. H-Cys (Bzl) -Val-Leu-OMe # HBr, melting point 168, [a] D20 = -14 in dimethylformamide is obtained.
b) H-Thr-Cys (Bzl) -Val-Leu-OMe # 1.3 HBr
20 g of Z-Thr-NHNH2 are dissolved in 350 ml of dimethylformamide, and the mixture is cooled to -20. add 100 ml of a solution of 2N hydrochloric acid in dioxane and then 10 ml of tert-butyl nitrite. After 10 minutes at -20, 45 ml of triethylamine and 25.5 g of H-Cys (Bzl) -Val Leu-OMe # HBr are added and the resulting mixture is shaken at 0 for 16 hours. It is evaporated to dryness and the residue is dissolved in a mixture of ethyl acetate / water. the organic phase washes with dilute hydrochloric acid. dried over sodium sulfate, evaporated and the residue crystallized from ethyl acetate. Z-Thr-Cys (Bzl) -Val-Leu-OMe is obtained: mp 208, [a] D20 = -27 in dimethylformamide.
20 g of the tetrapeptide obtained above are dissolved in 200 ml of a mixture of trifluoroacetic acid / ethyl acetate (1: 1). passes in a stream of gaseous hydrogen bromide at 0 for 1 hour. then evaporates and the residue recrystallizes from methanol / diethyl ether. H-Thr-Cys (Bzl) Val-Leu-OMe # 1.3 HBr: mp 202, [a] D20 = -10 in dimethylformamide is obtained.
cools down - 20 @. add 40 ml of a 2N solution of hydrochloric acid in dioxane and 15 ml of tert-butyl nitrite. After 10 minutes at -20, 28 ml of triethylamine and 1 6.2; H-Thr-Cys (Bzl) -N'al-Leu-OH (partial sequence F1) and stirred for 16 hours at 25. then it is filtered. the solution evaporated and the residue washed through with 1N acetic acid. You get
BOC-Cys (Bzl) -Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys (Bzl) -Val-Leu OH, m.p. 217. [A] D20-27 in dimethylformamide.
The product obtained is dissolved in 5000 ml of dried ammonia. adds sodium metal to a deep blue color while stirring and boiling the ammonia. For the purpose of coloring: ammonium chloride is added. It is evaporated to dryness and the residue is washed through with 1N acetic acid and acetone.
After drying, BOC-Cys-Ser-Asn Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-OH is obtained. M.p. 248 (dec.), [A] D20 = -41 in dimethylformamide water (3: 1).
The so obtained Nonap @ ptid is dissolved in 5000 ml of 0.01N ammonia, in hydrogen peroxide is added with stirring until the nitroprussiatrenktion is negative, then another 200 ml of glacial acetic acid. filtered and lyophilized.
You get
EMI7.1
M.p. 238 (dec.). [a] D20 = -18 in dimethylformamide! water (7: 3). which is dissolved in 300 ml of trifluoroacetic acid. Let stand at 25 for 30 minutes. evaporated, the residue was washed with ethyl acetate and dissolved in 300 nil dimethylformamide. To this solution are added 30 g of pivalic acid p-nitrophenyl ester - which is prepared as described below - and 14 ml of triethylamine. leaves 16 hours at 25-. evaporated and the residue was washed with chloroform. It is dissolved in 300 ml of dimethylformamide. gives 50 m! Add water and 50 a DOWEX-50. stir for 15 minutes. filtered.
the resin was washed with dimethylformamide and the filtrate was evaporated to dryness. The residue is first washed with chloroform. then with ethyl acetate and dry. You get that
EMI7.2
@@@ - @@@ - @@@ - @@@ - @@@ - @@@ - @@ - @@@ - @@@ - @@@ - @@@.
M.p. 243 [a] D20 = -17 in dimethylformamide / water (3: 1).
Pivalic acid p-nitrophenyl ester
95 g of pivalic acid and 131 g of p-nitrophenyl are dissolved in 1000 ml of ethyl acetate. adds 197 g of dicyclohexylcarbodiimide. stirred for 2 hours at 25 'filtered. the filtrate evaporates and the residue crystallizes from a mixture of ethyl acetate-petroleum ether. Pivalic acid p-nitrophenyl ester is obtained, mp 104.
Partial sequence ABC: Nim-Trityl-L-histidyl-L-arginyl-L phenylalanyl-L-seryl-glvcyl-L-methionyl-glycyl-L
L-phenylalanyl-glycyl-L-prolyl-L-glutamyl-L thr @ onyl-L-prolinamide # tri-acetate (H-His- (Trt)
Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr Pro-NH @ # 3-CH; CO.H) a) L-Seryl-glycyl-L-methionyl-glycyl-L- phenylalanyl glycyl-L-prolyl-L-glutamyl-L-threonyl-L-proline amide # hydrochloride (H-Ser-Gly-Met-Gly-Phe
Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 # HCl)
Dissolve 6.7 g of BOC-Ser-Gly-Met-Gly-OH (partial sequence B), 12 2 g of H-Phe-Gly-Pro-Glu (OTB) -Thr-Pro NH. (Partial sequence A) and 2.1 g of hydroxysuccinimide in 50 ml of dimethylformamide and 20 ml of acetonitrile.
cools to 0 ', A.0 g of dicyclohexylcarbodiimide is added and the mixture is left to stand at 0 for 16 hours. The solvent is evaporated off, the residue is washed with water, diethyl ether and ethyl acetate and recrystallized from chloroform. BOC-Ser-Gly-Met-Gly-Phe Gly-Pro-Glu (OTB) -Thr-Pro-NH2, m.p. 121 (decomp.), [Aj b'0 = -47 'in dimethylformamide, which is obtained dissolves in 250 ml of a solution of 8N hydrogen chloride in dioxane. The mixture is stirred at 25 ° for 2 hours. evaporated to dryness and processed the residue in dietary ether, giving H-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 # HCl [mp. 130 (dec.), [A] D20 = -48 in dimethylformamide].
b) Nim-Trityl-L-Histidyl-L-arginyl-L-phenylalanyl-L-seryl-glycyl-L-methionyl-glycyl-L-phenylalanyl glycyl-L-prolyl-L-glutamyl-L-threonyl-L-prolinamide Tri- A cm tat (H-His- (Trt) -Arg-Phe-Ser
Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro NH2 # 3 CH3CO2H)
Dissolve 9.9 g of Trt-His (Trt) -Arg-Phe-NHNH.2 HCl (partial sequence C) in 100 ml of dimethylformamide, cool to - 20, add 15 ml of dioxane / HCl 2n and then 1.16 ml of tert- Butyl nitrite, stir for 10 minutes at 200, add 28 ml of triethylamine and 10.0 g of H-Ser-Gly-Met Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 # HCl, stir for 4 hours at 0, filtered and evaporated to dryness.
The residue is dissolved in a mixture of ethyl ester'methanol (8: 2), washed with dilute ammonia and then with water until neutral. dried over sodium sulfate, concentrated to 100 ml and precipitated by adding dietary ether. The precipitate is again dissolved in dimethylformamide and precipitated by adding diethyl ether. You get
Trt-His (Trt) -Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly Prn-G1u-Thr-Pro-NH.
[M.p. 168 (decomp.), [A] D20 = -43 in dimethylformamide], which is dissolved in 500 ml of acetic acid / water (8: 2). It is left at 400 for 3 hours. evaporates.
washes the residue in diethyl ether and dries in a high vacuum over KOH chips. You get
H-His (Trt) -Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly Pro-Glu-Thr-Pro-NH.2 3 CH: .COOH, m.p. 1820 (dec.), [Ll2r) = - 56 in acetic acid.
Partial sequence DE: N-tert-butyloxycarbonyl-L-seryl-L alanyl-L-tyrosyl-L-tryptophanyl-L-arginyl-L-asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl-L-asparaginyl L-phenylalanine hydrazide diacetate (BOC -Ser
Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe NHNH2 # 2 CH3COOH) a) 1- (N-tert-butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-L tyrosyl-L-tryptophanyl-L -arginyl-L-asparaginyl-L leucyl-L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenylalanine) 2-benzyloxycarbonyl-hydrazide diacetate (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn
Phe-NH-NH-Z # 2 CH3COOH)
320 ml of dimethylformamide are cooled to -20 ° C., 100 ml of 2N hydrogen chloride in dioxane are added and 68 g of BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-NHNH2 acetate (part-sequence E) are dissolved therein.
Then add
12 ml of tert-butyl nitrite, can stir for 10 minutes at 200 and 35 ml of triethylamine are added dropwise. The mixture thus obtained is mixed with a solution. emerged from 8.8
H-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NHNH-Z # trifluoroacetate (partial sequence D) and 17 ml of triethylamine combined in 150 ml of dimethylformamide. After 16 hours of standing at 0, it is evaporated. The residue is dissolved in ethyl acetate butanol and washed with dilute acetic acid and ammonia solution. After evaporation of the solvent, the BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NHNH-Z # 2 CH @ COOH from Sp. 175 @ remains. [a] D20 = - 19.5 in dimethylformamide.
b) tert-butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl
L-tryptophanyl-L-arginyl-L-asparaginyl-L-leucyl
L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenylalanine-hy drazid # diacetate (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn Leu-Asn-Asn-Phe-NHNH2 # 2 CH3COOH)
Dissolve 90 Q BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu- Asn-Asn-Phe-NHNH-Z.2 CH: 1COOH in 500 ml dimethylformamide and hydrogenate with 10 g Pd.'C (10% ig) until the end of hydrogen uptake. After filtering off the catalyst, the solvent is evaporated and the residue is crystallized from a mixture of ether and ethanol.
You get
BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn
Phe-NHNH2 # 2 CH3COOH of m.p. 265, [a] D20 = - 57 in dimethylformamide.
Partial sequence ABCDE: L-Seryl-L-alanyl-L-tyrosyl-L tryptophanyl-L-arginyl-L-asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenylalanyl-L-histidyl-L-arginyl- L-phenylalanyl-L-seryl-glycyl-L methionyl-glycyl-L-phenylalanyl-glycyl-L-prolyl-L glutamyl-L-threonyl-L-prolinamide # hexa-trifluoroacetate (H-Ser-Ala-Tyr-Trp -Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-
Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro Gly-Thr-Pro-NH2 # 6CF @ CO2H)
15.2 g of BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Ae-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NHNH2 # diacetate (partial sequences D, E) are dissolved in 200 ml of dimethylformamide, and the mixture is cooled to -20.
gives 15 ml of dioxane / HCl 2n and then 1.16 ml of tert. Butyl nitrite and stirred for 10 minutes at -203. 14 ml of triethylamine and a solution of 18.6 g of the tridecapeptide acetate obtained in partial sequence A, B. C are added, the resulting mixture is stirred for 16 hours at 06, filtered and evaporated to dryness. The residue is washed with diethyl ether and with chloroform, dissolved in DioxaniWasser (8: 2), treated the resulting solution with 100 ml of Amberlite IRA-410 (acetate form), evaporated and the residue crystallized from isopropanol / water. The BOC-Ser-Ala-
Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His (Trt) -Arg-Phe Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 acetate. M.p. 145 (dec.).
[a] D20 = -67 in acetic acid, which is dissolved in 500 ml of trifluoroacetic acid under a nitrogen atmosphere. The mixture is left to stand at 25 for 1 hour, concentrated to 100 ml and precipitated by adding 1000 ml of diethyl ether. It is filtered, the residue is dissolved in dimethylformamide and precipitated with diethyl ether. This is obtained after drying over KOH chips
H-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe
His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro
Glu-Thr-Pro-NH2 # 6 CF3CO2H, m.p. 130 (dec.), [A] D20 = -43 in acetic acid.
Example: Pivaloyl-L-hemicystinyl-L-seryl-L-asparaginyl-L-leucyl-L-seryl-L-threonyl-L-hemicystinyl-L valyl-L-leucyl-L-seryl-L-alanyl-L- tyrosyl-L-tryptophanyl-L-arginyl-L-asparaginyl-L - @@@ cyl-L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenylalanyl-L-histidyl-L-arginyl-L-phenylalanyl-L-seryl -glycyl-L-methionyl glycyl-L-phenylalanyl-glycyl-L-pro @ yl-L-glutamyl
L-threonyl-L-prolinamide # Hexa-Aceiat # Octa-
hydrate
EMI8.1
Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe
His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro Glu-Thr-Pro-Nh2 # hexa-acetate # octahydrate)
1.0 g of nonapeptide (partial sequence F) is dissolved in 10 ml of dimethylformamide. add 1.5 g of N-hydroxysuccinimide and 0.52 g of dicyclohexylcarbodiimide.
stir for 6 hours at 253, filtered and the filtrate evaporated to dryness. The residue is washed with ethyl acetate and diethyl ether and dried. You get
EMI8.2
M.p. 242, which is dissolved in 10 ml of dimethylformamide.
3.1 g of tricosapeptide hexa trifluoroacetate (partial sequence A, B, C.D.E), 0.4 ml of triethylamine and 1.2 g of N-hydroxysuccinimide are added to this solution and the mixture is stirred at 25 for 16 hours. It is evaporated to dryness.
washes the residue with diethyl ether. Chloroform and acetone. This is how you get the raw. Protected Dotriacontapeptide, which is dissolved in 100 ml of acetic acid.
treated with 20 ml of Amberlite IRA-410 (acetate) and added 50 ml of 0.6N ammonium hydroxide. The pH is adjusted to 6.5 and the resulting solution is layered on a carboxymethyl cellulose column (10 × 100 cm).
which was equilibrated with a 0.15N ammonium acetate buffer solution. The elution is carried out with an increasing concentration and pH gradient (0.15n to 0.1n: pH 6.5 to pH 7.0) of an ammonium acetate buffer. The pooled fractions containing the pure peptide are freeze-dried three times. the residue is washed with ethanol and then with diethyl ether and dried over potassium hydroxide in a high vacuum. You get
EMI8.3
Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 # 6 CH3CO2H # 8 H2O, m.p. 216 (dec.). [a] D20 = -56 @ in acetic acid 1n.
Amino acid composition after acid hydrolysis (6n.
16 hours):
Ala1.1, Arg2.0, Asn @. @, Cys, 21.6, Glu @@, Gly6.0, His @@, Leu2.0, Met1.0. Phe3.0, Pro2.1, Ser @. @, Thr @@, Tyr1.0, Val0.1 (Trp 1.0 by spectrophotometry).
PATENT CLAIMS
1. Process for the preparation of hitherto unknown: polypeptide derivatives of the formula
EMI8.4
II 12 13 14 jr, 16 1. 18 19 20 20 Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg
22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-P @@ -NH2
** WARNING ** End of DESC field could overlap beginning of CLMS **.