Verfahren zur Herstellung eines bisher unbekannten Polypeptidderivates
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines bisher unbekannten Polypeptidderivates der Formel
EMI1.1
seiner therapeutisch wirksamen Säureadditionssalze und Schwermetallkomplexe.
Das bisher unbekannte Polypeptidderivat kann nach für die Synthese von Verbindungen dieser Art allgemein bekannten Methoden hergestellt werden, indem man entsprechende zu seinem Aufbau nötige Aminosäuren und Mercaptopropionsäure unter Bildung von
CONH-Bindungen in beliebiger zeitlicher Reihenfolge miteinander kondensiert, wobei nicht an der Reaktion teilnehmende freie funktionelle Gruppen intermediär durch geeignete Schutzgruppen geschützt werden, zu einem beliebigen Zeitpunkt der Synthese die Mercaptogruppen nach Bildung der Teilsequenz 1 bis 6 und vor Einbau der eine Methionylgruppe enthaltenden Teilsequenz zum Disulfid oxydiert, die Carboxylgruppe des terminalen Prolylrestes zu einem beliebigen Zeitpunkt der Synthese in die Amidgruppe überführt und gege benenfalls die Säureadditionssalze herstellt,
indem man das Polypeptidderivat der obigen Formel durch Um setzung mit organischen oder anorganischen Säuren in die entsprechenden Salze überführt.
Beim Aufbau des neuen Polypeptidderivates hat sich für die Blockierung der r-Carboxylgruppe, beispiels weise in der nachstehend beschriebenen Teilsequenz A, die tert.-Butyl-oxygruppe bewährt, doch können auch andere Schutzgruppen. wie die Methoxy-, die Athoxy- die tert.-Amyloxy-, die Amid- oder die Benzyloxygruppe verwendet werden.
Für die Blockierung der Imidazolgruppe des Histidinrestes in der nachstehend beschriebenen Teilsequenz C hat sich die Triphenylmethylgruppe bewährt, doch können auch andere geeignete Schutzgruppen, wie die Carbo-tert.-butoxy, die Carbo-tert.-amyloxy-, die Carbobenzoxy- oder die Benzylgruppe verwendet werden.
Für die Blockierung der Guanidogruppe des Argininrestes in der nachstehend beschriebenen Teilsequenz E wurde die Nitrogruppe verwendet, doch können auch andere geeignete Schutzgruppen, wie die Tosylgrnppe, die p-Nitrocarbobenzoxygruppe oder die 2-(Isopropyl oxycarbonyl)3,4,5, 6-tetrachlorobenzoylgruppe verwendet werden. Man kann auch den Schutzeffekt der Protonisierung der Guanidogruppe bei der Synthese verwenden.
Das neue Polypeptidderivat lässt sich auch in Form seiner Salze gewinnen bzw. verwenden. Als Salze kommen solche mit organischen Säuren, wie Essigsäure, Propionsäure, Glykolsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Benzoesäure, Zimtsäure, Salicylsäure, 2-Phenoxy- oder 2-Acetoxy-benzoesäure, Mandelsäure, Methansulfonsäure, Athansulfon- säure, Hydroxyäthansulfonsäure. Benzol- oder Toluolsulfonsäure, Naphthalinsulfonsäure, Sulfanilsäure sowie polymere Säuren wie Gerbsäure, Alginsäure, Polygalacturonsäure, Polyphloretinphosphat oder Carboxymethylcellulose und Salze mit organischen Säuren, wie Halogenwasserstoffsäure, z. B. Salzsäure oder Bromwasserstoffsäure, Salpetersäure, Thiocyansäure, Schwefelsäure und Phosphorsäure in Frage. Als Schwermetallkomplex kommt z.
B. derjenige vom Zink in Frage.
Die Ausgangsprodukte zur Herstellung des neuen Polypeptidderivates können, sofern sie nicht bekannt waren, nach den für die Peptidchemie bekannten Methoden erhalten werden, wobei die Aminosäuren einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten miteinander verknüpft werden.
Die neue Verbindung stellt ein wichtiges therapeutisches Prinzip dar, das den Calciumplasmaspiegel, insbesondere den erhöhten Galciumplasmaspiegel senkt und als Antagonist des Parathormons eine positive Cal ciumbilanz im Knochen bewirkt.
Es ist somit indiziert bei allen Zuständen, bei welchen eine Senkung des Plasmacalciumspiegels envünscht ist, z. B. Hypercalcämien verschiedener Genese, Mangel des endogenen Thyrealcalcitonins infolge Ausfalls von Schilddrüsengewebe, Hyperfunktion der Nebenschilddrüsen.
Die neue Verbindung ist indiziert bei allen Knochenaffektionen, die auf einem vermehrten Abbau beruhen oder bei welchen eine vermehrte Calciumfixation im Knochen erwünscht ist, z. B. Osteoporose verschiedener Genese (z. B. postklimakterisch, posttraumatisch, bedingt durch Corticosteroidtherapie oder Inaktivität usw.), Frakturen, Osteomalacie, Rachitis sowie insbesonders zur Kombinationstherapie mit Calcium bzw. Phosphat.
Die biologische Prüfung der neuen Verbindung ergab eine Wirksamkeit von etwa 100 bis 450 MRC-Einhei tenmg Peptid. Die erforderliche Tagesdosis (i. m. verabreicht) in MRC-Einheiten beträgt 20 mE bis 10 E, vorzugsweise 100 mE/kg Tiergewicht.
Beim Menschen beträgt die tägliche Dosis (i. m. verabreicht) in MRC-Einheiten 1 bis 500 E. Vorzugsweise wird eine tägliche Dosis von 5 E i. m. verabreicht.
Die neue Verbindung kann als Heilmittel, z. B. in Form pharmazeutischer Präparate, Venvendung finden.
Diese enthalten die genannte Verbindung in Mischung mit einem für die parenterale Applikation geeigneten organischen oder anorganischen Trägermaterial. Für dasselbe kommen solche Stoffe in Frage, die mit der neuen Verbindung nicht reagieren, wie z. B. Gelatine, Milchzucker, Stärke, Magnesiumstearat, Talk, pflanzliche Öle, Benzylalkohole, Gummi arabicum, Polyalkylenglykole, Vaseline, Cholesterin oder andere bekannte Arzneimittelträger. Die pharmazeutischen Präparate können z. B. in flüssiger Form als Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen vorliegen. Gegebenenfalls sind sie sterilisiert und bzw. oder enthalten Hilfsstoffe wie Konservierungs-, Stabilisierungs-, Netzmittel oder Emulgiermittel. Sie können auch noch andere, therapeutisch wertvolle Stoffe enthalten. Die neue Verbindung kann auch in Form eines Depotpräparates verabreicht werden.
Die neue Verbindung und ihre Salze kann auch als Zwischenprodukt zur Herstellung von pharmazeutischen Präparaten Verwendung finden.
Es werden folgende Abkürzungen verwendet:
Z = Carbobenzoxy
Bzl = Benzyl
BOC = tert.-Butyloxycarbonyl
Trit = Trityl-Triphenylmethyl
OTB = tert.-Butyloxy
ONP = p-Nitrophenylester
OCP = 2,4,5-Trichlorphenoxv
OMe = Methoxy
OEt = Äthoxy
NO2 = Nitro
Ser = L-Seryl
Asn = L-Asparaginyl
Leu = L-Leucyl
Thr = L-Threonyl
Val = L-Valyl
Ala = L-Alanyl
Tyr = L-Tyrosyl
Trp = L-Tryptophanyl
Arg = L-Arginyl
Phe = L-Phenylalanyl
Glu = L-Glutamyl
His = L-Histidyl
Pro = L-Prolyl
Gly = Glycyl
Met = L-Methionyl
MCP = ss-Mercaptopropionyl
Cys = L-Cysteinyl
In den folgenden Beispielen, die die Ausführung des Verfahrens erläutern, den Umfang der Erfindung aber in keiner Weise einschränken sollen, erfolgen alle Temperaturangaben in Celsiusgraden.
Teilsequenz A: L-Phenylalanyl-glycyl-L-prolyl-v-tert.-butyloxy
L-glutamyl-L-threonyl-L-prolinamid (H-Phe-Gly-Pro-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2)
Man löst bei -50 134 g Z-Thr-NH-NH2 in 2 Liter in Salzsäure und versetzt mit 0,55 Liter in Natriumnitrit. Nach 5 Minuten wird Kaliumcarbonat bis pH 9 zugegeben, das entstandene Azid mit Athylacetat extrahiert und eine Lösung von 80 g H-Pro-NH2-hydro- chlorid in 100 ml Wasser, 500 ml Dimethylformamid und 77 ml Triäthylamin hinzugefügt. Man verdampft das Äthylacetat bei 200 im Vakuum und lässt über Nacht bei 25 stehen.
Die restliche Lösung wird im Vakuum verdampft, der Rückstand in Äthylacetat gelöst, mit Wasser, verdünnter Salzsäure und einer wässrigen Kaliumcarbonatlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Man verdampft im Vakuum, löst in warmem Äthylacetat und kühlt ab. Man erhält Z-Thr-Pro-NH2; Smp. 1480, [a] 2D = -720 in 95 % Essigsäure. Man löst hierauf 90 g Z-Thr-Pro-NH2 in 2 Liter Dioxan und 260 ml In Salzsäure und hydriert bei 200 und Normaldruck in Gegenwart eines Palladiumkatalysators.
Man filtriert, verdampft die Lösung im Vakuum, wäscht den Rückstand mit Äthylacetat und erhält H-Thr-Pro-NH2 - HC1; Smp. 2160, [a] = -640 in 95 % Essigsäure. Dieses wird in 500 ml Dimethylformamid, 50 ml Wasser und 32 ml Triäthylamin gelöst und 118 g ZGlu(OTB)-OCP und 800 ml Tetrahydrofuran zugegeben. Man lässt über Nacht bei 200 stehen, verdampft im Vakuum und kristallisiert den Rückstand mit Äthyläther. Man erhält Z-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2, Smp. 650 (Zers.); [a] 2E)0 = -180 in Dimethylformamid.
Man löst 80 g ZGlu(OTB)-Thr-Pro-NH2 in 1,5 Liter Dioxan und 200 ml Wasser und hydriert bei 200 und Normaldruck in Gegenwart eines Palladiumkatalysators.
Die Lösung wird filtriert und im Vakuum verdampft und der Rückstand mit Diäthyläther versetzt, wobei H-Glu (OTB)-Thr-Pro-NH2 erhalten wird; Smp. 650 (Zers.), [a] 2D = -280 in Dimethylformamid. Dieses wird in 700 ml Dimethylformamid bei 0 gelöst, 200 ml Acetonitril, 68 g Z-Phe-Gly-Pro-OH, 18 g N-Hydroxysuccinimid und 32 g Dicyclohexylcarbodiimid hinzugefügt, über Nacht bei 200 stehengelassen, abfiltriert, im Vakuum eingedampft und mit Athylacetat versetzt.
Danach wäscht man die Lösung mit Wasser, verdünnter Salzsäure und wässriger Kaliumcarbonatlösung, trocknet über Natriumsulfat, verdampft im Vakuum und kristallisiert den Rückstand aus i6Lthylacetat/Sithyläther. Man erhält Z-Phe-Gly-Pro-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH,.
Smp. 1200 (Zers.). [a] 2D = - 660 in Dimethylformamid, das man in 1500 ml Dioxan und 300 ml Wasser löst.
Man gibt 30 g Palladiumkohle (10,0g) zu und hydriert bis zum Ende der Wasserstoffaufnahme. Man filtriert, dampft das Filtrat ein und kristallisiert den Rückstand aus Dioxan. Man erhält das H-Phe-Gly-Pro-Glu(OTB) Thr-Pro-NH,; Smp. 1530 [o]20 = - 790 in Dimethylformamid.
Teilsequenz B: N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-glycyl-L-methionyl- glycin (BOC-Ser-Gly-Met-Gly-OH) a) L-Methionyl-glycin-äthylester-hydrochlorid (H-Met-Gly-OEt HC1)
Man löst 65 g BOC-Met-OH in 900 ml Chloroform, kühlt auf - 10, gibt 30 ml N-Methylmorpholin und 35,6 g Chlorameisensäureisobutylester zu. Nach
10 Minuten fügt man langsam eine Lösung von 30 g Glycin-äthylester in 200 ml Chloroform hinzu und lässt bei 200 eine Stunde reagieren. Man extrahiert mit 0,5n Ammoniumhydroxid, dann mit 0,2n Schwefelsäure, wäscht mit Wasser neutral, trocknet über Natriumsulfat und engt ein. Nach Umkristallisieren aus Petroläther erhält man BOC-Met-Gly-OEt; Smp. 490, {o] 2D = 190 in Äthanol.
Man löst es in 750 ml 4n HCl/Athanol, lässt 1 Std. bei 250 stehen, dampft ein, wäscht den Rückstand mit Diäthyläther und trocknet bis zur Gewichtskonstanz. Man erhält das H-Met-Gly-OEt HCl in Form eines Öls.
b) tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-glycin-äthylester (BOC-Ser-Gly-OEt)
Man löst 12,5 g N-tert.-Butyloxycarbonyl-serin in 100 ml Chloroform und gibt 6,1 g N-Methylmorpholin dazu; danach tropft man 8,2 g Chlorameisensäureisobutylester hinzu. Nach 10 Minuten wird eine Lösung von 6,6 g Glycin-äthylester in 50 ml Chloroform hinzugefügt und 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wird mit verdünntem Ammoniak, dann mit Salzsäurelösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und die organische Phase abgedampft.
Man erhält BOC-Ser-Gly-OEt als Öl; [a]2D = - 30 in Dimethylformamid.
c) tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-glycin-hydrazid (BOC-Ser-Gly-NHNH2)
Man löst 19,4 g BOC-Ser-Gly-OEt in 270 ml Äthyl- alkohol, gibt 48,6 ml Hydrazinhydrat hinzu und lässt 2 Tage bei Raumtemperatur stehen. Anschliessend dampft man die Lösung ab und kristallisiert den Rückstand aus einem Methylalkohol/Athyläther-Gemisch (1: 3). Man erhält BOC-Ser-Gly-NHNH2, Smp. 1570, [a] r > = - = 50 in Dimethylformamid.
d) tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-glycyl-L-methionyl glycin-äthylester (BOC-Ser-Gly-Met-Gly-OEt)
Zu 200 ml Dimethylformamid werden 25 ml einer 4n Chlorwasserstofflösung in Äthyläther gegeben und darin 11 g BOC-Ser-Gly-NHNH2 gelöst. Anschliessend tropft man bei -10 5,4 ml tert.-Butylnitrit hinzu, fügt der Lösung zuerst 18 ml Triäthylamin und dann eine Lösung von 12 g H-Met-Gly-OEt HC1 in 100 ml Dimethylformamid und 6,2 ml Triäthylamin bei. Es wird 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, nach 12 Stunden filtriert und eingedampft. Den Rückstand löst man in Chloroform, wäscht nacheinander mit verdünnter Ammoniak- und Salzsäurelösung, trocknet über Natriumsulfat und dampft ein. Man erhält BOC-Ser-Gly-Met Gly-OEt, [a] D = - 140 in Dimethylformamid.
e) tert.-Butyloxyvarbonyl-L-seryl-glycyl-L-methionyl- glycin (B OC-Ser-Gly-Met-Gly-OH)
Man löst 24 g BOC-Ser-Gly-Met-Gly-OEt in 250 ml Dioxan, gibt 75 ml in Natronlauge zu, rührt 1 Stunde bei 250, behandelt mit 150 ml Dowex-50 (H+-Form), filtriert, dampft das Filtrat ein und kristallisiert den Rückstand aus Essigester/Diäthyläther. Man erhält BOC Ser-Gly-Met-Gly-OH, Smp. 870 (Zers.), [a]4D0 = - 170 in Dimethylformamid.
Teilsequenz C: Na,Nimjd. Ditrityl-L-histidyl-L-arginyl-L-phenyl alaninhydrazid HCl) [(Trt)-His(Trt)-Ärg-Ph
NHNH2 HCl] a) ZArg(NO2)-Phe-OMe
51,8 g H-Phe-OMe HCl werden in 1 Liter Äther und etwa 50 ml Eiswasser gelöst und unter Rühren und Kühlen genügend Natriumcarbonat zugegeben, bis alles Wasser abgebunden ist. Man filtriert und dampft das Filtrat bis zur Gewichtskonstanz ein, wobei ein farbloses Öl erhalten wird.
67,6 g Z-Arg(NO2)-OH werden in 300 ml Acetonitril und 150 ml Dimethylformamid gelöst und mit 41,2 g H-Phe-OMe versetzt. Danach wird auf 200 abgekühlt und eine Lösung von 43,4 g Dicyclohexylcarbodiimid in 100 ml Acetonitril zugegeben. Das Ganze lässt man unter zeitweiligem Umschütteln während 4 Stunden im Eiskasten stehen. Der entstandene Niederschlag wird abfiltriert und das Filtrat eingedampft. Der Eindampfrückstand wird in 1 Liter Essigester gelöst und hierauf in der Kälte mit 1n Natronlauge, Wasser, ln Schwefelsäure, Wasser und gesättigter Kochsalzlösung gewaschen. Die über Natriumsulfat getrocknete Essigsäureäthylester-Phase wird vollständig eingedampft.
Nach Umkristallisieren aus Essigester/Petroläther erhält man ZArg(NOo)-Phe-OMe; Smp. 131 bis 1330, [a] r) = - 70 in Methanol, -40 in Dimethylformamid.
b) H-Arg(NO2)-Phe-OMe 0,5 H-O 1,2 HBr
20 g ZArg(NOO)-Phe-OMe werden in 50 ml Eisessig gelöst und unter leichtem Kühlen 50 ml 40%ige Bromwasserstoffsäure in Eisessig zugesetzt. Danach lässt man das Ganze unter zeitweiligem Umschütteln während 1 Stunde bei 200 stehen. Nach vollständigem Eindampfen wird der Rückstand in 200 ml Wasser gelöst und zweimal mit Äther gewaschen. Die wässrige Phase wird vollständig eingedampft und der Rückstand aus Methanol/Äther umkristallisiert. Smp. 165-1670 mit Zers., cfl 20 - + D [a] D = + 18 in Methanol, l 14 in Dimethyl- formamid.
c) Z-His(Z) -Arg(NOr)-Phe-OMe
46,1 g H-Arg(NO2)-Phe-OMe 0,5 HG 1,2 HBr werden in 100 ml Wasser gelöst, hierauf erwärmt und anschliessend abgekühlt. Nach Zugabe von Chloroform und Eis wird mit Ammoniak auf pH 9 gestellt. Die Chloroformphase wird noch einmal mit Wasser gewaschen, anschliessend über Natriumcarbonat getrocknet und filtriert.
Dem Filtrat wird eine Lösung von 44,5 g Z-His(Z)-OH, 12,1 g Hydroxysuccinimid in 200 ml Acetonitril und 100 mi Pyridin zugesetzt. danach das Ganze auf -200 abgekühlt und mit einer Lösung von 21,1 g Dicyclohexylcarbodiimid in 70 ml Acetonitril versetzt. Anschliessend wird unter zeitweiligem Rühren 4 Stunden im Eiskasten stehengelassen. Der entstandene Niederschlag wird abfiltriert und das Filtrat eingedampft. Der Rückstand wird in Essigsäureäthylester aufgenommen und anschliessend folgendermassen gewaschen: l0 Oige Kaliumcarbonatlösung (pH zur 10), Wasser. gesättigte Kochsalzlösung, Wasser, gesättigte Kochsalzlösung, Schwefelsäure (pH 3), Wasser, Kochsalzlösung.
Die über Natriumsulfat getrocknete Essigsäureäthylester- Phase wird vollständig eingedampft, wobei ein hellbeiger Schaum erhalten wird. Dieser Schaum wird je zweimal in wenig Methanol gelöst und mit Äther gefällt. Die Atherphasen werden abdekantiert und der Niederschlag getrocknet; man erhält Z-His(Z)-Arg(NOe)-Phe-OMe (amorpher Schaum) [a] 2E0 = - 80 in Methanol, - 80 in Dimethylformamid.
d) H-His-Arg-Phe-OMe 4 HCl
25 g Z-His(Z)-Arg(NO )-Phe-OMe werden in 800 ml Eisessig gelöst. Danach werden 10 g 10W Palladium auf Aktivkohle in 200 ml 1n Salzsäure angerührt und in die Lösung gegeben. Das Ganze wird einer 2stündigen Hydrierung unterworfen und anschliessend der Katalysator abfiltriert. Das Filtrat wird erneut mit 5 g 10 Palladium auf Aktivkohle in Wasser versetzt und der Hydrierung unterworfen, die nach 51/2 Stunden beendet ist.
Hierbei werden etwa 80% der theoretischen Menge Wasserstoff verbraucht. Der Ka.alysator wird abfiltriert und das Filtrat vollständig eingedampft, wobei H-His Arg-Phe-OMe .4 4 HCl in Form eines amorphen Schau- mes erhalten wird.
e) Trt-His(Trt)-Arg-Phe-OMe HCl
21,5 g H-His-Arg-Phe-OMe.4 HCl werden in 100 ml Pyridin und etwa 100 ml Dimethylformamid gelöst. Bei etwa +50 wird bis pH 9 Triäthylamin zugegeben und anschliessend eine Lösung von 29 g Tritylchlorid in 300 ml Pyridin während 5 Minuten zugetropft. Nach Beendigung der Zugabe wird von Zeit zu Zeit das pH geprüft und nötigenfalls wieder mit Triäthylamin auf etwa pH 9 gestellt. Das Ganze wird nach ungefähr 4 Stunden eingedampft, der Rückstand in Chloroform und Wasser aufgenommen und unter Zugabe von wenig 1n Salzsäure auf pH 4 gestellt. Man trennt die Chloroformphase ab, wäscht sie zweimal mit Wasser, trocknet über Natriumsulfat und dampft vollständig ein.
Der Rückstand wird mit Äther versetzt und vom Äther anschliessend abfiltriert, wobei Trt-His(Trt)-Arg-Phe OMe HCl erhalten wird.
f) Trt-His(Trt) -Arg-Phe-NH-NH.2 HCl
17 g Trt-His(Trt)-Arg-Phe-OMe HCl werden in 200 ml Methanol gelöst und mit 40 ml Hydrazinhydrat versetzt. Danach wird 2 Tage bei Zimmertemperatur stehengelassen. Man dampft ein, löst den Rückstand in Chloroform und wäscht zweimal mit Wasser. Die Chloroform-Phase wird über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Hierauf wird der Rückstand mit Äther gewaschen und abfiltriert; er besteht aus Trt-His(Trt) Arg-Phe-NH-NH HCl; Smp 1580, [a] r) = -90 in Dimethylformamid.
Teilsequenz D:
1-(L-Asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl- L-asparaginyl-L-phenylalanin)-2-benzyloxycarbonyl- hydrazid Trifluoracetat (H-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z. CF:sCOOH) a) l-(N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-phenylalanin)-
2-benzyloxycarbonyl-hydrazid (BOC-Phe-NH-NH-Z)
Man löst 72 g BOC-Phe-OH und 28 g N-Methylmorpholin in 500 ml Methylenchlorid auf und tropft bei -5 26 ml Chlorameisensäuremethylester zu. Nach 10 Minuten gibt man noch 44 g Z-NHNH3 in 100 ml Methylenchlorid zu und rührt 4 Stunden bei Zimmertemperatur weiter. Nach Auswaschen mit verdünnter Phosphorigersäure wird getrocknet und eingedampft.
Nach Kristallisieren aus Petroläther erhält man BOC-Phe-NH NH-Z vom Smp. 1170, [a] 2r0 = -5 in Dimethylformamid.
b) l-(N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L- phenylalanin)-2-benzyloxycarbonyl-hydrazid (BOC-Asn-Phe-NH-NH-Z)
Man löst 41 g BOC-Phe-NHNH-Z in 400 ml Trifluoressigsäure und lässt eine Stunde bei 200 stehen.
Beim Verdampfen der Trifluoressigsäure erhält man das H-Phe-NHNH-Z als kristallines Trifluoracetat vom Smp. 1910 [a] 20 = + 26,40 in Dimethylformamid.
Diese Substanz wird zusammen mit 35 g BOC-Asn-ONP und 30 g N-Methylmorpholin in 200 ml Dimethylformamid gelöst. Nach 16 Stunden Stehen bei 200 wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand nacheinander mit Essigester und verdünnter Phosphorigersäure gewaschen. Man erhält BOC-Asn-Phe-NH-NH-Z vom Smp. 2100, [a]D = - 180 in Dimethylformamid.
c) l-(N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-asparaginyl-
L-asparaginyl-L-phenylalanin) -2-benzyloxycarbonyl hydrazid (BOC-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z)
Man löst 26 g BOC-Asn-Phe-NH-NH-Z in 200 ml Trifluoressigsäure auf und lässt 1 Stunde bei 200 stehen.
Nach Verdampfen des Lösungsmittels versetzt man in 100 ml Dimethylformamid mit 17 g BOC-Asn-ONP und 15 g N-Methylmorpholin. Nach 16 Stunden bei 200 wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand nacheinander mit Essigester und verdünnter Phosphorigersäure gewaschen. Man erhält BOC-Asn-Asn-Phe NH-NH-Z; Smp. 2400, [a] D0 = - 280 in Dimethylform- amid.
d) l-(N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-leucyl-L-asparaginyl L-asparaginyl-L-phenylalanin)-2-benzyloxyvarbonyl - hydrazid (BOC-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z)
Man löst 22 g BOC-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z in 150 ml Trifluoressigsäure und lässt 1 Stunde bei 200 stehen. Nach Verdampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand mit 12 g BOC-Leu-ONP und 10 g N-Methylmorpholin in 100 ml Dimethylformamid versetzt. Nach 16 Stunden Stehenlassen bei 200 wird das Dimethylformamid verdampft und der Rückstand nacheinander mit Essigester und verdünnter Phosphorigersäure gewaschen. Man erhält BOC-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z vom Smp. 2100, [u] 2D = - 340 in Dimethylformamid.
e) 1 -(N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-asparaginyl-
L-leucyl-L-asp araginyl-L-asparaginyl-L-phenyl alanin)-2-benzyloxycarbonyl-hydrazid (BOC-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z)
Man löst 57 g BOC-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z in 300 ml Trifluoressigsäure und lässt eine Stunde bei 200 stehen. Nach Verdampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand in Ather kristallisiert. Man löst das Tetrapeptid-trifluoracetat in 400 ml Dimethylformamid und versetzt die Lösung mit 27 g BOC-Asn-ONP und 25 g N-Methylmorpholin. Nach 16 Stunden Stehenlassen bei 200 wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand nacheinander mit Essigester und verdünnter Phosphorigersäure gewaschen. Man erhält BOC-Asn Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z vom Smp. 2500 (Zers.), [o] eD = - 340 in Dimethylformamid.
f) l-(L-Asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl-
L-asparaginyl-L-phenylalanin)-2-benzyloxycarbonyl hydrazid trifluoracetat (H-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z . Trifluor acetat)
Man löst 43,5 g BOC-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH NH-Z in 200 ml Trifluoressigsäure und lässt eine Stunde bei 200 stehen. Nach Eindampfen wird der Rückstand mit Hilfe von Äther kristallisiert. Man erhält H-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z. Trifluoracetat; Smp. 2420, [a] 2D = - 220 in Dimethylformamid.
Teilsequenz E: tert. -Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl- L-tryptophanyl-L-arginyl--hydrazid. acetat (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-NHNH2 CH3COOH) a) N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-tryptophanyl (guanido)N-nitro-L-argininmethylester (BOC-Trp-Arg(NOs)-OMe)
Man löst 35 g H-Arg(NO2)-OMe HCl, 63 g BOC Trp-OCP und 14 g N-Methylmorpholin in 3100 ml Dimethylformamid auf und lässt 16 Stunden bei 200 stehen. Nach Verdampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand in Essigester aufgenommen und mit verdünnter Schwefelsäure gewaschen. Man engt etwas ein und fällt mit Äther aus.
Dabei kristallisiert BOC-Trp Arg(NO2)-OMe vom Smp. 1300, [o] 2D0 = -220 in Dimethylformamid.
b) N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-tyrosyl-L-tryptophanyl- (guanido)N-nitro-argininmethylester (BOC-Tyr-Trp-Arg(NOw)-OMe)
Man löst 15 g BOC-Trp-Arg(N02)-OMe in 80 ml 5n methanolischer Salzsäurelösung auf und lässt 1 Stunde bei Zimmertemperatur stehen. Nach Verdampfen des Lösungsmittels und Behandeln mit Äther verbleiben 13 g H-Trp-Arg(NO)-OMe als Hydrochlorid zurück; Smp. 1200, [cc]u = -90 in Dimethylformamid. Dieses Dipeptid wird zusammen mit 14 g BOC-Tyr-OCP und 8g N-Methylmorpholin in 200 ml Dimethylformamid gelöst. Nach 16 Stunden Stehen bei 200 wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand in Essigester aufgenommen.
Nach Waschen mit verdünnter Phosphorigersäure und Einengen des Lösungsmittels kann man mit Hilfe von Äther BOC-Tyr-Trp-Arg(NOO)-OMe iso
20 lieren; Smp. 130 , [a] 20D = - 110 in Dimethylformamid.
c) tert.-Butyloxycarbonyl-L-alanyl-L-tyrosyl-L-trypto phanyl-(guanido)N-nitro-L-argininmethylester (B OC-Ala-Tyr-Trp-Arg(NO2) -OMe)
Man löst 13,5 g BOC-Tyr-Trp-Arg(NO,)-OMe in 130 ml 5n methanolischer Salzsäurelösung auf, lässt 1 Stunde bei 250 stehen dampft zur Trockne ein, wäscht den Rückstand mit Diäthyläther, filtriert ab, löst in l00 ml Dimethylformamid auf und versetzt mit 8,0 g BOC-Ala-OCP und 30 ml Triäthylamin. Nach 16 Stunden bei 250 gibt man 500 ml Essigester hinzu, wäscht mit verdünnter Schwefelsäure und Kaliumbicarbonatlösung und dampft zur Trockne ein. Nach Waschen des Rückstandes mit Chloroform erhält man BOC-Ala-Tyr Trp-Arg(NO-)-OMe; Smp. 120 (Zcrs.), [o] - 120 in Dimethylformamid.
d) tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl L-tryptophanyl-(guanido)N-nitro-L-arginin- methylester (E OC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg(NO -)-OM e)
Man löst 12,3 g BOC-Ala-Tyr-Trp-Arg(NO2)-OMe in 100 ml 5n methanolischer Salzsäure, lässt 1 Stunde bei 250 stehen, dampft zur Trockene ein, wäscht den Rück stand mit Diäthyläther, löst ihn in 100 ml Dimethylformamid, versetzt mit 14 ml Triäthylamin und 8,5 g BOC-Ser-N3, lässt 16 Stunden bei 0 stehen, gibt 500 ml Essigester zu, wäscht nacheinander mit verdünnter Schwefelsäure und Ammoniumhydroxid, trocknet über Natriumsulfat und dampft das Lösungsmittel ab. Nach Waschen des Rückstandes mit Chloroform löst man ihn in Essigester und fällt durch Zugabe von Diäthyläther.
Man erhält 13,5 g BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg(NOs)- OMe; Smp. 135 (Zers.), [a] 2E0 = - 150 in Dimethylformamid.
e) tert. -Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl-
L-tryptophanyl-L-arginin hydrazidacetat (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-NHNH3 CH3COOH)
Man löst 13,2 g von dem oben erhaltenen Pentapeptidester in 300 ml Essigsäure, gibt 60 ml Wasser und 13,2 g Palladium-Kohle (10%ig) zu und hydriert bis zum Ende der Wasserstoffaufnahme. Man filtriert, dampft ab, löst den Rückstand in Dimethylformamid auf, dampft wiederum ab, um die Spuren von Essigsäure zu beseitigen. Anschliessend löst man den Rückstand in 260 ml Methanol, versetzt mit 26 ml Hydrazinhydrat und lässt 16 Stunden bei 400 stehen. Nach Zugabe von 260 ml Diäthyläther filtriert man die ausgeschiedene kristalline Masse ab, wäscht mit Diäthyläther und trocknet im Hochvakuum über Schwefelsäure. Man erhält BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-NHNH2.
CH0COOH; Smp. 1820, [e]E = - 80 im Dimethylformamid.
Teilsequenz Fl
L-Threonyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-valyl-L-leucin- methylester hydrobromid (H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe HBr) a) H-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe HBr
Man löst 21,0 g Z-Cys(Bzl)-OCP und 12,3 g H-Val Leu-OMe-HCl in 120 ml Dimethylformamid. Danach gibt man 5,9 ml Triäthylamin hinzu. lässt 16 Stunden bei 250 stehen, fügt Essigester hinzu, wäscht mit verdünnter Salzsäure, trocknet über Natriumsulfat, dampft zur Trockne ab und kristallisiert den Rückstand aus Essigsäureäthylester/Diäthyläther. Man erhält Z-Cys (Bzl)-Val-Leu-OMe, Smp. 1600, [ol D0 = -280 in Di- methylformamid, das man in 210 ml einer 40 ;; igen Lösung von Bromwasserstoff in Eisessig löst.
Man lässt 1 Std. bei 250 stehen, dampft zur Trockne ein und kristallisiert den Rückstand aus Isopropanol/Diäthyläther um. Man erhält H-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe. HBr, Smc i68 * [¯] -D = + 140 in Dimethylformamid.
b) H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe HBr
Man löst 20 g Z-Thr-NHNH2 in 350 ml Dimethylformamid, kühlt auf - 203. gibt 100 ml einer Lösung von 2n Salzsäure in Dioxan und anschliessend noch 10 ml tert.-Butylnitrit zu. Nach 10 Minuten bei - 200 werden 45 ml Triäthylamin und 25,5 g H-Cys(Bzl)-Val Leu-OMe HBr hinzugefügt und das erhaltene Gemisch während 16 Stunden bei 0- geschüttelt. Man dampft zur Trockne ein, löst den Rückstand in einem Gemisch von EssigsäureäthylesteriWasser, wäscht die organische Phase mit verdünnter Salzsäure, trocknet über Natriumsulfat, dampft ein und kristallisiert den Rückstand aus Essigester um. Man erhält Z-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu OMe; Smp. 2080, [r] 2D = - 270 in Dimethylformamid.
Man löst 20 g von dem oben erhaltenen Tetrapeptid in 200 ml eines Gemisches von Trifluoressigsäure-Essigester (1:1) auf, leitet während 1 Stunde bei 0 einen Strom gasförmigen Bromwasserstoffs ein, dampft anschliessend ein und kristallisiert den Rückstand aus Methanol/Diäthyläther um. Man erhält H-Thr-Cys(Bzl) Val-Leu-OMe . 1,3 HBr; Smp. 2020, [a] D0 = - 100 in Dimethylformamid.
Teilsequenz F2: tert.-Butyloxycarbonyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-seryl-
L-asparaginyl-L-leucyl-L-serin-hydrazid (BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser-NHNH) a) H-Asn-Leu-Ser-OMe HCl
Man löst 43 g H-Leu-Ser-OMe HCl und 53 g BOC-Asn-ONP in 400 ml Dimethylformamid auf, gibt 22 ml Triäthylamin zu, lässt 16 Stunden bei 250 stehen, dampft zur Trockne ein und kristallisiert den Rückstand aus Methanol um. Man erhält 51,6 g BOC-Asn-Leu Ser-OMe, Smp. 1900, [o] 2D = - 240 in Dimethylformamid, das man in 500 ml einer 4n Lösung von Salzsäure in Methanol löst. Man lässt 1 Stunde bei 250 stehen, dampft zur Trockne ein, löst den Rückstand in Methanol und fällt mit Diäthyläther.
Man erhält H-Asn-Leu Ser-OMe HC1; Smp. 1800, [a] D20 = - 230 in Dimethylformamid.
b) H-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe HCl
Man löst 39,5 g BOC-Ser-NHNH2 in 500 ml Dimethylformamid, kühlt auf - 200, gibt 200 ml einer 2n Lösung von Salzsäure in Dioxan und anschliessend 20 ml tert. Butylnitrit zu. Nach 10 Minuten bei - 200 werden 40 ml Triäthylamin und 38,0 g H-Asn-Leu-Ser-OMe HCl hinzugefügt, danach 16 Stunden bei 0 gerührt, zur Trockne eingedampft und der Rückstand aus Chloroform/Diäthyläther umkristallisiert. Man erhält BOC-Ser Asn-Leu-Ser-OMe, Smp. 1350, [a] 2E0)= -220 in Dimethylformamid, das man in 420 ml einer 4n Salzsäurelösung in Methanol löst. Man lässt 1 Stunde bei 25 stehen, dampft zur Trockne ein und kristallisiert aus Methanol/Essigsäureäthylester um.
Man erhält H-Ser Asn-Leu-Ser-OMe HCl, Smp. 1550 (Zers.), [α] r) = - 150 in Dimethylformamid.
c) Bzl-MCP-Ser-Asn-Leu-Ser-NHNH2
Man löst 18,5 g H-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe HC1 und 13,5 g Bzl-MCP-ONP in 100 ml Dimethylformamid auf, gibt 10 ml Wasser, 3,5 ml Essigsäure und 5,6 ml Tri äthylamin zu, lässt 16 Stunden bei 250 stehen, dampft zur Trockne ein und kristallisiert aus Äthanol um. Man erhält 21,3 g Bzl-MCP-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe, Smp.
193 ; [a]D = - 170 in Dimethylformamid, das man unter leichtem Erwärmen in 200 ml Dimethylformamid löst. Man gibt 200 ml Methanol und 20 ml Hydrazinhydrat zu, lässt 16 Stunden bei 300 stehen, fällt mit Diäthyläther, wäscht den Niederschlag mit Diäthyläther/ Methanol (1:1) und trocknet das so erhaltene Bzl MCP-Ser-Asn-Leu-Ser-NHNH-, Smp. 2510, [a] D'0 = - 16 in Dimethylformamid.
Teilsequen F: ss-Mercaptopropionyl-L-seryl-L-asparaginyl-L- leucyl-L-seryl-L-threonyl-L-hemicystinyl-L-valyl-
L-leucin-hydrazid
EMI6.1
Man löst 16,2 g Bzl-MCP-Ser-Asn-Leu-Ser-NHNH (Teilsequenz F7) in 150 ml Dimethylformamid, kühlt auf -200, gibt 40 ml einer 2n Lösung von Salzsäure in Dioxan und 15 ml tert.-Butyinitrit zu. Nach 10 Minuten bei - 200 gibt man noch 28 ml Triäthylamin und 24,8 g H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe. 1,3 HBr zu und rührt 16 Stunden bei 250. Danach wird filtriert, die Lösung abgedampft und der Rückstand mit heissem Methanol durchgewaschen.
Man erhält 24,1 g Bzl-MCP-Ser-Asn Leu-Ser-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe, Smp. 2440, [a] 20 = - 220 in Dimethylformamid, das man bei 600 in 100 ml Dimethylformamid löst, gibt 10 ml Hydrazinhydrat zu und lässt 2 Stunden bei 600 stehen. Das entstandene Octapeptidhydrazid kristallisiert aus. Man wäscht mit Diäthyläther, Wasser und Methanol und trocknet im Hochvakuum über Phosphorpentoxid.
Man erhält 15,1 g Octapeptidhydrazid, Smp. 2650, [a] 2rg = - -350 in Dimethylformamid/Wasser (3 1).
Man löst das erhaltene Produkt in 5000 ml getrocknetem Ammoniak, gibt unter Rühren und Sieden des Ammoniaks Natriummetall bis zur tiefblauen Färbung zu.
Zwecks Entfärbung wird Ammoniumchlorid hinzugefügt und danach ein Luftstrom bis zur negativen Nitroprussiatreaktion durch die Lösung geleitet. Man dampft zur Trockne ab und wäscht den Rückstand mit Wasser und Aceton durch. Nach Trocknen erhält man
EMI7.1
Smp. 278U, [e] vD - - 19U in Dimethylformamid/Wasser (3 1).
Teilsequenz ABC:
Nim-Trityl-L-histidyl-L-arginyl-L-phenylalanyl-
L-seryl-glycyl-L-methionyl-glycyl-L-phenylalanyl-
L-glycyl-L-prolyl-L-glutamyl-L-threonyl-
L-prolinamid Triacetat (H-His(Trt)-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly- Pro Glu-Thr-Pro-NH2- 3 CH3CO2H) a) L-Seryl-glycyl-L-methionyl-glycyl-Lphenylalanyl- glycyl-L-prolyl-L-glutamyl-L-threonyl-L-prolinamid (H-Ser-Gly-Met-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NHe HC1)
Man löst 6,7 g BOC-Ser-Gly-Met-Gly-OH (Teilsequenz B), 12 g H-Phe-Gly-Pro-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2 (Teilsequenz A) und 2,1 g Hydroxysuccinimid in 50 ml Dimethylformamid und 20 ml Acetonitril auf, kühlt auf 00, gibt 4,0 g Dicyclohexylcarbodiimid hinzu und lässt
16 Stunden bei 0 stehen.
Man dampft das Lösungsmittel ab, wäscht den Rückstand mit Wasser, Diäthyl äther und Essigester und kristallisiert aus Chloroform um. Man erhält BOC-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2, Smp. 1210 (Zers.), [a] D = - 470 in Dimethylformamid, das man in 250 ml einer Lösung von 8n Chlorwasserstoff in Dioxan löst. Man rührt während 2 Stunden bei 250, dampft zur Trockne ein und verarbeitet den Rückstand in Diäthyläther. Man erhält H-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu - Thr - Pro NH.2 HCl, Smp. 1300 (Zers.), [a]2D = -480 in Di- methylformamid.
b) Nim-Trityl-L-histidyl-L-arginyl-L-phenylalanyl-
L-seryl-glycyl-L-methionyl-glycyl-L-phenylalanyl glycyl-L-prolyl-L-glutamyl-L-threonyl-L-prolin amid (H-His(Trt)-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly- Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 - 3 CH:3COOH)
Man löst 9,9 g Trt-His(Trt)-Arg-Phe-NHNH; HCl (Teilsequenz C) in 100 ml Dimethylformamid, kühlt auf 200, gibt 15 ml Dioxan/HCl 2n und anschliessend
1,6 ml tert.-Butylnitrit zu, rührt 10 Minuten bei - 200, gibt 28 ml Triäthylamin und 10,0 g H-Ser-Gly-Met Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2- HCl zu, rührt 4 Stunden bei 00, filtriert und dampft zur Trockne ein.
Man löst den Rückstand in einem Gemisch von Essigester/Methanol (8 : 2) auf, wäscht mit verdünntem Ammoniak und anschliessend mit Wasser bis zur Neutralität, trocknet über Natriumsulfat, konzentriert auf
100 ml und fällt durch Zugabe von Diäthyläther. Man löst den Niederschlag wiederum in Dimethylformamid auf und fällt durch Zugabe von Diäthyläther. Man erhält Trt-His (Trt)-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly
Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 [Smp. 1680 (Zers.), [o] D = -430 in Dimethylform- amid], das man in 500 ml Essigsäure/Wasser (8 : 2) löst.
Man lässt 3 Stunden bei 400 stehen, dampft ein, wäscht den Rückstand in Diäthyläther und trocknet im Hochvakuum über KOH-Späne. Man erhält H-His (Trt)-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro- Glu-Thr-Pro-NH2- 3 CH3COOH, Smp. 1820 (Zers.), [o]20 - 560 in Essigsäure.
Teilsequenz DE:
N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl-
L-tryptophanyl-L-arginyl-L-asparaginyl-L-leucyl-
L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenylalanin- hydrazid diacetat (B OC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-
Phe-NHNH2 2 CH3COOH) a) l-(N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-L- tyrosinyl-L-tryptophanyl-L-arginyl-L-asparaginyl L-leucyl-L-asparaginyl-L-asparagmyl-L-phenyl- alanyl)-2-benzyloxycarbonyl-hydrazid diacetat (B OC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-
Phe-NH-NH-Z 2 CHBCOOH)
Man kühlt 320 ml Dimethylformamid auf - 200 C, gibt 100 ml 2n Chlorwasserstoff in Dioxan zu und löst darin 68 g <RTI
ID=7.52> BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-NHNH2- acetat (Teilsequenz E). Anschliessend versetzt man mit 12 ml tert.-Butylnitrit, lässt 10 Minuten bei -200 rühren und tropft 35 ml Triäthylamin zu. Das so erhaltene Gemisch wird mit einer Lösung, entstanden aus 8,8 g H-Asn-Leu Asn-Asn-Phe-NHNH-Z Trifluoracetat (Teilsequenz D) und 17 ml Triäthylamin in 150 ml Dimethylformamid vereinigt. Nach 16 Stunden bei 0 wird eingedampft. Man löst den Rückstand in Essigester und wäscht mit verdünnter Phosphorsäure und Ammoniaklösung. Nach Eindampfen des Lösungsmittels verbleibt das
B OC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn
Phe-NHNH-Z 2 CH3COOH vom Smp. 1750, [a] D0 = - 19,50 in Dimethylformamid.
b) tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl L-tryptophanyl-L-arginyl-L-asparaginyl-L-leucyl-
L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenyl- alanin hydrazid diacetat (B OC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn
Asn-Phe-NHNH2 2 CH3COOH)
Man löst 90 g BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu Asn-Asn-Phe-NHNH-Z 2 CH:3COOH in 500 ml Dimethylformamid und hydriert mit 10 g Pd/C (10Sig) bis zum Ende der Wasserstoffaufnahme. Nach Abfiltrieren des Katalysators wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand aus einem Gemisch von Äther und Athanol kristallisiert.
Man erhält BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NHNHa 2 CH3COOH vom Smp. 2650 [a] 2E0 - 570 in Dimethylformamid.
Teilsequenz ABCDE: L-Seryl-L-alanyl-L-tyrosyl-L-tryptophanyl-
L-arginyl-L-asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl-
L-asparaginyl-L-phenylalanyl-L-histidyl-L-arginyl
L-phenylalanyl-L-seryl-glycyl-L-methionyl-giycyl-
L-phenylalanyl-glycyL-glutamyl-L-threonyl-
L-prolinamid hexatrifluoracetat (H-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg,-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-
His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-
Thr-Pro-NH2 6 CFUCOiH).
Man löst 15,2 g BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn Leu-Asn-Asn-PheNHNH; Diacetat (Teilsequenz DE) in 200 ml Dimethylformamid, kühlt auf - 200 gibt 15 ml Dioxan/HCl 2n und anschliessend 1,16 ml tert.-Butylnitrit zu und rührt 10 Minuten bei - 200. Man gibt
14 ml Triäthylamin und eine Lösung von 18,6 g des in Teilsequenz ABC erhaltenen Tridecapeptidacetat zu, rührt das erhaltene Gemisch 16 Stunden bei 00, filtriert und dampft zur Trockne ein. Man wäscht den Rückstand mit Diäthyläther und mit Chloroform, löst in Dioxan/Wasser (8 : 2), behandelt die erhaltene Lösung mit 100 ml Amberiit-IRA-41 0 (Acetat-Form), dampft ein und kristallisiert den Rückstand aus Isopropanol/ Wasser um.
Man erhält das BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His (Trt)-Arg -Phe-Ser - Gly - Met Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NHO - acetat, Smp. 1450 (Zers.), [a] r, - - 670 in Essigsäure, das man unter Stickstoffatmosphäre in 500 ml Trifluoressigsäure löst.
Man lässt 1 Stunde bei 250 stehen, konzentriert auf 100 ml und fällt durch Zugabe von 1000 ml Diäthyl äther. Man abfiltriert, löst den Rückstand in Dimethylformamid und fällt mit Diäthyläther. Nach Trocknen über KOH-Späne erhält man das H-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-
His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu- Thr-Pro-NHo - 6 CFbCOaH,
Smp. 1300 (Zers.), [a] 2i} = - 420 in Essigsäure.
Beispiel ss-Mercaptopropionyl-L-seryl-L-asparaginyl-L-leucyl- L-seryl-L-threonyl-L-hemicystinyl-L-valyl-L-leucyl-L- seryl-L-al anyt-L-tyrosyl-L-tryptoph anyl-L-arginyl-L- asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl-L-asparaginyl-L- phenylalanyl-L-histidyl-L-arginyl-L-phenylalanyl-L seryl-fycyl-L-methionyl-glycyl-L-phenylalanyl-glycyl- L-prolyl-L-glutamyl-L-threonyl-L-prolinamid Hexaacetat Octahvdrat.
EMI8.1
NHo Hexaacetat Octahydrat)
Man löst 1,05 g Octapeptid-Hydrazid (Teilsequenz
F) in einem Gemisch von 50 ml Dimethylformamid und
1,2 ml DioxanlHCl 2n bei -20 . Man gibt 0,116 ml tert.-Butylnitrit zu, rührt 10 Minuten bei -20 , gibt
1,4 ml Triäthylamin und 3,1 g Tricosapeptid-Hexatri fluoracetat (Teilsequenz ABCDE) und 5 ml Wasser zu und rührt 16 Stunden bei O'. Man dampft zur Trockne ein, wäscht den Rückstand mit Diäthyläther, Chloroform und Aceton. So erhält man das rohe Peptidderivat, das man in 100 ml 0,3n Essigsäure löst, mit 20 ml Am berlit-IRA-4 10 (Acetat) behandelt und gibt 50 ml 0,6n
Ammoniumhydroxyd hinzu.
Man stellt das pH auf 6,5 ein und schichtet die erhaltene Lösung auf eine Carboxymethylcellulosesäule (10 X 100 cm), die mit einer 0,1 5n Ammoniumacetatpuffer-Lösung equilibriert wurde.
Die Elution wird mit einem steigenden Konzentrationsund pH-Gradient (0,15n auf 0,4n; pH 6,5 auf pH 7,0) eines Ammoniumacetatpuffers durchgeführt. Die vereinigten Fraktionen, die das reine Peptid erhalten, werden 3mal lyophilisiert, der Rückstand wird mit Äthanol und anschliessend mit Diäthyläther gewaschen und über Kaliumhydroxyd im Hochvakuum getrocknet. Man erhält
EMI8.2
Smp. 2200 (Zers.). [o] = 560 in Essigsäure ln.
Aminosäurezusammensetzung nach Säurehydrolyse (6n, 16 Stunden): Alar. Arg.'0, Ans5,9, Cys/21.0, Gluto, Gly30, His1.1,
Leu2,9, Met0, Phe3,0, Pro2., Sers.s, Thrlu, Tyrso, Val09 (Trp 1,0 durch Spektrophotometrie).
Process for the production of a previously unknown polypeptide derivative
The present invention relates to a process for the preparation of a previously unknown polypeptide derivative of the formula
EMI1.1
its therapeutically effective acid addition salts and heavy metal complexes.
The previously unknown polypeptide derivative can be prepared by methods generally known for the synthesis of compounds of this type, by adding amino acids and mercaptopropionic acid necessary for its structure to form
CONH bonds condensed with one another in any chronological order, with free functional groups not participating in the reaction being intermediately protected by suitable protective groups, at any point in the synthesis the mercapto groups after formation of partial sequence 1 to 6 and before incorporation of the partial sequence containing a methionyl group for The disulfide is oxidized, the carboxyl group of the terminal prolyl residue is converted into the amide group at any point in the synthesis and, if necessary, the acid addition salts are produced,
by converting the polypeptide derivative of the above formula into the corresponding salts by reaction with organic or inorganic acids.
In the construction of the new polypeptide derivative, the tert-butyloxy group has proven useful for blocking the r-carboxyl group, for example in the partial sequence A described below, but other protective groups can also be used. such as the methoxy, the ethoxy, the tert-amyloxy, the amide or the benzyloxy group are used.
The triphenylmethyl group has proven useful for blocking the imidazole group of the histidine residue in the partial sequence C described below, but other suitable protecting groups such as the carbo-tert-butoxy, the carbo-tert-amyloxy, the carbobenzoxy or the benzyl group can also be used be used.
The nitro group was used to block the guanido group of the arginine residue in the partial sequence E described below, but other suitable protecting groups such as the tosyl group, the p-nitrocarbobenzoxy group or the 2- (isopropyl oxycarbonyl) 3,4,5,6-tetrachlorobenzoyl group can also be used be used. The protective effect of protonation of the guanido group can also be used in the synthesis.
The new polypeptide derivative can also be obtained or used in the form of its salts. The salts are those with organic acids, such as acetic acid, propionic acid, glycolic acid, lactic acid, pyruvic acid, malonic acid, succinic acid, maleic acid, fumaric acid, tartaric acid, citric acid, benzoic acid, cinnamic acid, salicylic acid, 2-phenoxy- or 2-acetoxy-benzoic acid, mandelic acid, Methanesulfonic acid, athanesulfonic acid, hydroxyethanesulfonic acid. Benzene or toluenesulfonic acid, naphthalenesulfonic acid, sulfanilic acid and polymeric acids such as tannic acid, alginic acid, polygalacturonic acid, polyphloretin phosphate or carboxymethyl cellulose and salts with organic acids such as hydrohalic acid, e.g. B. hydrochloric acid or hydrobromic acid, nitric acid, thiocyanic acid, sulfuric acid and phosphoric acid in question. As a heavy metal complex z.
B. the one from zinc in question.
The starting products for the production of the new polypeptide derivative can, if they were not known, be obtained by the methods known for peptide chemistry, the amino acids being linked to one another individually or after prior formation of smaller peptide units.
The new compound represents an important therapeutic principle which lowers the calcium plasma level, in particular the increased calcium plasma level and, as an antagonist of the parathyroid hormone, causes a positive calcium balance in the bones.
It is therefore indicated for all conditions in which a lowering of the plasma calcium level is desired, e.g. B. Hypercalcemia of various origins, deficiency of endogenous thyreal calcitonin as a result of the loss of thyroid tissue, hyperfunction of the parathyroid glands.
The new compound is indicated for all bone affections that are based on increased breakdown or in which increased calcium fixation in the bone is desired, e.g. B. Osteoporosis of various origins (e.g. post-climacteric, post-traumatic, caused by corticosteroid therapy or inactivity, etc.), fractures, osteomalacia, rickets and especially for combination therapy with calcium or phosphate.
Biological testing of the new compound showed an efficacy of about 100 to 450 MRC units of peptide. The required daily dose (administered in conjunction with it) in MRC units is 20 mU to 10 U, preferably 100 mU / kg animal weight.
In humans, the daily dose (administered intramuscularly) in MRC units is 1 to 500 U. A daily dose of 5 U i.v. m. administered.
The new compound can be used as a remedy, e.g. B. in the form of pharmaceutical preparations, use.
These contain the compound mentioned in a mixture with an organic or inorganic carrier material suitable for parenteral administration. For the same, those substances come into question that do not react with the new compound, such as. B. gelatin, lactose, starch, magnesium stearate, talc, vegetable oils, benzyl alcohols, gum arabic, polyalkylene glycols, petrolatum, cholesterol or other known excipients. The pharmaceutical preparations can e.g. B. in liquid form as solutions, suspensions or emulsions. If necessary, they are sterilized and / or contain auxiliaries such as preservatives, stabilizers, wetting agents or emulsifiers. They can also contain other therapeutically valuable substances. The new compound can also be administered in the form of a depot preparation.
The new compound and its salts can also be used as an intermediate for the production of pharmaceutical preparations.
The following abbreviations are used:
Z = carbobenzoxy
Bzl = benzyl
BOC = tert-butyloxycarbonyl
Tritol = trityl triphenylmethyl
OTB = tert-butyloxy
ONP = p-nitrophenyl ester
OCP = 2,4,5-trichlorophenoxv
OMe = methoxy
OEt = ethoxy
NO2 = nitro
Ser = L-seryl
Asn = L-asparaginyl
Leu = L-leucyl
Thr = L-threonyl
Val = L-valyl
Ala = L-alanyl
Tyr = L-tyrosyl
Trp = L-tryptophanyl
Arg = L-arginyl
Phe = L-phenylalanyl
Glu = L-glutamyl
His = L-histidyl
Pro = L-prolyl
Gly = glycyl
Met = L-methionyl
MCP = ss-mercaptopropionyl
Cys = L-cysteinyl
In the following examples, which illustrate the implementation of the process but are not intended to restrict the scope of the invention in any way, all temperatures are given in degrees Celsius.
Partial sequence A: L-phenylalanyl-glycyl-L-prolyl-v-tert.-butyloxy
L-glutamyl-L-threonyl-L-prolinamide (H-Phe-Gly-Pro-Glu (OTB) -Thr-Pro-NH2)
At -50, 134 g of Z-Thr-NH-NH2 are dissolved in 2 liters in hydrochloric acid, and 0.55 liters in sodium nitrite are added. After 5 minutes, potassium carbonate is added to pH 9, the azide formed is extracted with ethyl acetate and a solution of 80 g of H-Pro-NH2 hydrochloride in 100 ml of water, 500 ml of dimethylformamide and 77 ml of triethylamine is added. The ethyl acetate is evaporated at 200 in vacuo and left to stand at 25 overnight.
The remaining solution is evaporated in vacuo, the residue is dissolved in ethyl acetate, washed with water, dilute hydrochloric acid and an aqueous potassium carbonate solution and dried over sodium sulfate. It is evaporated in vacuo, dissolved in warm ethyl acetate and cooled. Z-Thr-Pro-NH2 is obtained; M.p. 1480, [a] 2D = -720 in 95% acetic acid. 90 g of Z-Thr-Pro-NH2 are then dissolved in 2 liters of dioxane and 260 ml in hydrochloric acid and hydrogenated at 200 and normal pressure in the presence of a palladium catalyst.
It is filtered, the solution is evaporated in vacuo, the residue is washed with ethyl acetate and H-Thr-Pro-NH2 - HC1 is obtained; M.p. 2160, [a] = -640 in 95% acetic acid. This is dissolved in 500 ml of dimethylformamide, 50 ml of water and 32 ml of triethylamine and 118 g of ZGlu (OTB) -OCP and 800 ml of tetrahydrofuran are added. The mixture is left to stand at 200 overnight, evaporated in vacuo and the residue is crystallized with ethyl ether. Z-Glu (OTB) -Thr-Pro-NH2, m.p. 650 (decomp.); [a] 2E) 0 = -180 in dimethylformamide.
80 g of ZGlu (OTB) -Thr-Pro-NH2 are dissolved in 1.5 liters of dioxane and 200 ml of water and hydrogenated at 200 and normal pressure in the presence of a palladium catalyst.
The solution is filtered and evaporated in vacuo, and diethyl ether is added to the residue, H-Glu (OTB) -Thr-Pro-NH2 being obtained; M.p. 650 (dec.), [A] 2D = -280 in dimethylformamide. This is dissolved in 700 ml of dimethylformamide at 0, 200 ml of acetonitrile, 68 g of Z-Phe-Gly-Pro-OH, 18 g of N-hydroxysuccinimide and 32 g of dicyclohexylcarbodiimide are added, left to stand overnight at 200, filtered off, evaporated in vacuo and with Ethyl acetate added.
The solution is then washed with water, dilute hydrochloric acid and aqueous potassium carbonate solution, dried over sodium sulphate, evaporated in vacuo and the residue is crystallized from ethyl acetate / sithyl ether. Z-Phe-Gly-Pro-Glu (OTB) -Thr-Pro-NH, is obtained.
1200 (dec.). [a] 2D = - 660 in dimethylformamide, which is dissolved in 1500 ml of dioxane and 300 ml of water.
30 g of palladium-on-carbon (10.0 g) are added and the mixture is hydrogenated until hydrogen uptake has ceased. It is filtered, the filtrate is evaporated and the residue is crystallized from dioxane. The H-Phe-Gly-Pro-Glu (OTB) Thr-Pro-NH, is obtained; M.p. 1530 [o] 20 = -790 in dimethylformamide.
Partial sequence B: N-tert-butyloxycarbonyl-L-seryl-glycyl-L-methionyl-glycine (BOC-Ser-Gly-Met-Gly-OH) a) L-methionyl-glycine-ethyl ester hydrochloride (H-Met- Gly-OEt HC1)
65 g of BOC-Met-OH are dissolved in 900 ml of chloroform, cooled to -10, 30 ml of N-methylmorpholine and 35.6 g of isobutyl chloroformate are added. To
A solution of 30 g of glycine ethyl ester in 200 ml of chloroform is slowly added for 10 minutes and the mixture is left to react at 200 for one hour. It is extracted with 0.5N ammonium hydroxide, then with 0.2N sulfuric acid, washed neutral with water, dried over sodium sulfate and concentrated. After recrystallization from petroleum ether, BOC-Met-Gly-OEt is obtained; M.p. 490, {o] 2D = 190 in ethanol.
It is dissolved in 750 ml of 4N HCl / ethanol, left to stand at 250 for 1 hour, evaporated, the residue is washed with diethyl ether and dried to constant weight. The H-Met-Gly-OEt HCl is obtained in the form of an oil.
b) tert-butyloxycarbonyl-L-seryl-glycine-ethyl ester (BOC-Ser-Gly-OEt)
12.5 g of N-tert-butyloxycarbonyl-serine are dissolved in 100 ml of chloroform and 6.1 g of N-methylmorpholine are added; then 8.2 g of isobutyl chloroformate are added dropwise. After 10 minutes, a solution of 6.6 g of glycine ethyl ester in 50 ml of chloroform is added and the mixture is stirred at room temperature for 1 hour. The reaction mixture is washed with dilute ammonia and then with hydrochloric acid solution, dried over sodium sulfate and the organic phase is evaporated.
BOC-Ser-Gly-OEt is obtained as an oil; [a] 2D = - 30 in dimethylformamide.
c) tert-butyloxycarbonyl-L-seryl-glycine-hydrazide (BOC-Ser-Gly-NHNH2)
19.4 g of BOC-Ser-Gly-OEt are dissolved in 270 ml of ethyl alcohol, 48.6 ml of hydrazine hydrate are added and the mixture is left to stand for 2 days at room temperature. The solution is then evaporated off and the residue is crystallized from a methyl alcohol / ethyl ether mixture (1: 3). BOC-Ser-Gly-NHNH2, m.p. 1570, [a] r> = - = 50 is obtained in dimethylformamide.
d) tert-Butyloxycarbonyl-L-seryl-glycyl-L-methionyl glycine-ethyl ester (BOC-Ser-Gly-Met-Gly-OEt)
25 ml of a 4N hydrogen chloride solution in ethyl ether are added to 200 ml of dimethylformamide and 11 g of BOC-Ser-Gly-NHNH2 are dissolved in it. 5.4 ml of tert-butyl nitrite are then added dropwise at -10, and first 18 ml of triethylamine and then a solution of 12 g of H-Met-Gly-OEt HC1 in 100 ml of dimethylformamide and 6.2 ml of triethylamine are added. It is stirred for 3 hours at room temperature, filtered after 12 hours and evaporated. The residue is dissolved in chloroform, washed successively with dilute ammonia and hydrochloric acid solution, dried over sodium sulfate and evaporated. BOC-Ser-Gly-Met Gly-OEt, [a] D = -140 in dimethylformamide is obtained.
e) tert-Butyloxyvarbonyl-L-seryl-glycyl-L-methionyl-glycine (B OC-Ser-Gly-Met-Gly-OH)
24 g of BOC-Ser-Gly-Met-Gly-OEt are dissolved in 250 ml of dioxane, 75 ml of sodium hydroxide solution are added, the mixture is stirred at 250 ml for 1 hour, treated with 150 ml of Dowex-50 (H + form), filtered, and then evaporated Filtrate and the residue crystallized from ethyl acetate / diethyl ether. BOC Ser-Gly-Met-Gly-OH, m.p. 870 (decomp.), [A] 4D0 = -170 in dimethylformamide is obtained.
Partial sequence C: Na, Nimjd. Ditrityl-L-histidyl-L-arginyl-L-phenyl alanine hydrazide HCl) [(Trt) -His (Trt) -Arg-Ph
NHNH2 HCl] a) ZArg (NO2) -Phe-OMe
51.8 g of H-Phe-OMe HCl are dissolved in 1 liter of ether and about 50 ml of ice water and enough sodium carbonate is added with stirring and cooling until all of the water has set. It is filtered and the filtrate is evaporated to constant weight, a colorless oil being obtained.
67.6 g of Z-Arg (NO2) -OH are dissolved in 300 ml of acetonitrile and 150 ml of dimethylformamide, and 41.2 g of H-Phe-OMe are added. It is then cooled to 200 and a solution of 43.4 g of dicyclohexylcarbodiimide in 100 ml of acetonitrile is added. The whole thing is left in the ice box for 4 hours while shaking from time to time. The resulting precipitate is filtered off and the filtrate is evaporated. The evaporation residue is dissolved in 1 liter of ethyl acetate and then washed in the cold with 1N sodium hydroxide solution, water, 1N sulfuric acid, water and saturated sodium chloride solution. The ethyl acetate phase, dried over sodium sulfate, is completely evaporated.
After recrystallization from ethyl acetate / petroleum ether, ZArg (NOo) -Phe-OMe is obtained; Mp. 131 to 1330, [a] r) = -70 in methanol, -40 in dimethylformamide.
b) H-Arg (NO2) -Phe-OMe 0.5 H-O 1.2 HBr
20 g of ZArg (NOO) -Phe-OMe are dissolved in 50 ml of glacial acetic acid, and 50 ml of 40% strength hydrobromic acid in glacial acetic acid are added with slight cooling. Then the whole thing is left to stand at 200 for 1 hour with occasional shaking. After complete evaporation, the residue is dissolved in 200 ml of water and washed twice with ether. The aqueous phase is completely evaporated and the residue is recrystallized from methanol / ether. M.p. 165-1670 with decomposition, cfl 20 - + D [a] D = + 18 in methanol, 14 in dimethylformamide.
c) Z-His (Z) -Arg (NOr) -Phe-OMe
46.1 g of H-Arg (NO2) -Phe-OMe 0.5 HG 1.2 HBr are dissolved in 100 ml of water, then heated and then cooled. After adding chloroform and ice, the pH is adjusted to 9 with ammonia. The chloroform phase is washed once more with water, then dried over sodium carbonate and filtered.
A solution of 44.5 g of Z-His (Z) -OH, 12.1 g of hydroxysuccinimide in 200 ml of acetonitrile and 100 ml of pyridine is added to the filtrate. then the whole thing is cooled to -200 and mixed with a solution of 21.1 g of dicyclohexylcarbodiimide in 70 ml of acetonitrile. The mixture is then left to stand for 4 hours in the ice chest with occasional stirring. The resulting precipitate is filtered off and the filtrate is evaporated. The residue is taken up in ethyl acetate and then washed as follows: 10% potassium carbonate solution (pH to 10), water. saturated saline, water, saturated saline, sulfuric acid (pH 3), water, saline.
The ethyl acetate phase, dried over sodium sulfate, is evaporated completely, a light beige foam being obtained. This foam is dissolved twice in a little methanol and precipitated with ether. The ether phases are decanted off and the precipitate is dried; one obtains Z-His (Z) -Arg (NOe) -Phe-OMe (amorphous foam) [a] 2E0 = - 80 in methanol, - 80 in dimethylformamide.
d) H-His-Arg-Phe-OMe 4 HCl
25 g of Z-His (Z) -Arg (NO) -Phe-OMe are dissolved in 800 ml of glacial acetic acid. Then 10 g of 10W palladium on activated charcoal are stirred in 200 ml of 1N hydrochloric acid and added to the solution. The whole is subjected to a 2 hour hydrogenation and then the catalyst is filtered off. The filtrate is mixed again with 5 g of 10% palladium on activated charcoal in water and subjected to hydrogenation, which is complete after 51/2 hours.
About 80% of the theoretical amount of hydrogen is consumed here. The catalyst is filtered off and the filtrate is evaporated completely, H-His Arg-Phe-OMe.44 HCl being obtained in the form of an amorphous foam.
e) Trt-His (Trt) -Arg-Phe-OMe HCl
21.5 g of H-His-Arg-Phe-OMe.4 HCl are dissolved in 100 ml of pyridine and about 100 ml of dimethylformamide. At about +50 triethylamine is added to pH 9, and a solution of 29 g of trityl chloride in 300 ml of pyridine is then added dropwise over 5 minutes. After the addition is complete, the pH is checked from time to time and, if necessary, adjusted to about pH 9 with triethylamine. The whole is evaporated after about 4 hours, the residue is taken up in chloroform and water and adjusted to pH 4 with the addition of a little 1N hydrochloric acid. The chloroform phase is separated off, washed twice with water, dried over sodium sulfate and completely evaporated.
Ether is added to the residue and the ether is then filtered off, Trt-His (Trt) -Arg-Phe OMe HCl being obtained.
f) Trt-His (Trt) -Arg-Phe-NH-NH.2 HCl
17 g of Trt-His (Trt) -Arg-Phe-OMe HCl are dissolved in 200 ml of methanol, and 40 ml of hydrazine hydrate are added. It is then left to stand for 2 days at room temperature. It is evaporated, the residue is dissolved in chloroform and washed twice with water. The chloroform phase is dried over sodium sulfate and evaporated. The residue is then washed with ether and filtered off; it consists of Trt-His (Trt) Arg-Phe-NH-NH-HCl; M.p. 1580, [a] r) = -90 in dimethylformamide.
Partial sequence D:
1- (L-asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenylalanine) -2-benzyloxycarbonylhydrazide trifluoroacetate (H-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z. CF : sCOOH) a) l- (N-tert-butyloxycarbonyl-L-phenylalanine) -
2-benzyloxycarbonyl hydrazide (BOC-Phe-NH-NH-Z)
72 g of BOC-Phe-OH and 28 g of N-methylmorpholine are dissolved in 500 ml of methylene chloride and 26 ml of methyl chloroformate are added dropwise at -5. After 10 minutes, 44 g of Z-NHNH3 in 100 ml of methylene chloride are added and the mixture is stirred for a further 4 hours at room temperature. After washing with dilute phosphoric acid, it is dried and evaporated.
Crystallization from petroleum ether gives BOC-Phe-NH-NH-Z with a melting point of 1170, [a] 2r0 = -5 in dimethylformamide.
b) l- (N-tert-butyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phenylalanine) -2-benzyloxycarbonyl-hydrazide (BOC-Asn-Phe-NH-NH-Z)
41 g of BOC-Phe-NHNH-Z are dissolved in 400 ml of trifluoroacetic acid and left to stand at 200 for one hour.
When the trifluoroacetic acid is evaporated, the H-Phe-NHNH-Z is obtained as a crystalline trifluoroacetate with a melting point of 1910 [a] 20 = + 26.40 in dimethylformamide.
This substance is dissolved in 200 ml of dimethylformamide together with 35 g of BOC-Asn-ONP and 30 g of N-methylmorpholine. After 16 hours of standing at 200, the solvent is evaporated and the residue is washed successively with ethyl acetate and dilute phosphoric acid. BOC-Asn-Phe-NH-NH-Z of melting point 2100, [a] D = -180 in dimethylformamide is obtained.
c) l- (N-tert-butyloxycarbonyl-L-asparaginyl-
L-asparaginyl-L-phenylalanine) -2-benzyloxycarbonyl hydrazide (BOC-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z)
26 g of BOC-Asn-Phe-NH-NH-Z are dissolved in 200 ml of trifluoroacetic acid and left to stand at 200 for 1 hour.
After evaporation of the solvent, 17 g of BOC-Asn-ONP and 15 g of N-methylmorpholine are added to 100 ml of dimethylformamide. After 16 hours at 200, the solvent is evaporated and the residue is washed successively with ethyl acetate and dilute phosphoric acid. BOC-Asn-Asn-Phe NH-NH-Z is obtained; M.p. 2400, [a] D0 = -280 in dimethylformamide.
d) l- (N-tert-butyloxycarbonyl-L-leucyl-L-asparaginyl L-asparaginyl-L-phenylalanine) -2-benzyloxyvarbonyl - hydrazide (BOC-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z)
22 g of BOC-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z are dissolved in 150 ml of trifluoroacetic acid and left to stand at 200 for 1 hour. After evaporation of the solvent, 12 g of BOC-Leu-ONP and 10 g of N-methylmorpholine in 100 ml of dimethylformamide are added to the residue. After 16 hours of standing at 200, the dimethylformamide is evaporated and the residue is washed in succession with ethyl acetate and dilute phosphoric acid. BOC-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z of melting point 2100, [u] 2D = -340 in dimethylformamide is obtained.
e) 1 - (N-tert-butyloxycarbonyl-L-asparaginyl-
L-leucyl-L-asp araginyl-L-asparaginyl-L-phenyl alanine) -2-benzyloxycarbonyl-hydrazide (BOC-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z)
57 g of BOC-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z are dissolved in 300 ml of trifluoroacetic acid and left to stand at 200 for one hour. After evaporation of the solvent, the residue is crystallized from ether. The tetrapeptide trifluoroacetate is dissolved in 400 ml of dimethylformamide and the solution is mixed with 27 g of BOC-Asn-ONP and 25 g of N-methylmorpholine. After 16 hours of standing at 200, the solvent is evaporated and the residue is washed successively with ethyl acetate and dilute phosphoric acid. BOC-Asn Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z of melting point 2500 (decomp.), [O] eD = -340 in dimethylformamide is obtained.
f) l- (L-asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl-
L-asparaginyl-L-phenylalanine) -2-benzyloxycarbonyl hydrazide trifluoroacetate (H-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z. Trifluoroacetate)
43.5 g of BOC-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z are dissolved in 200 ml of trifluoroacetic acid and left to stand at 200 for one hour. After evaporation, the residue is crystallized with the aid of ether. H-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z is obtained. Trifluoroacetate; M.p. 2420, [a] 2D = -220 in dimethylformamide.
Partial sequence E: tert. -Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl-L-tryptophanyl-L-arginyl - hydrazide. acetate (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-NHNH2 CH3COOH) a) N-tert-butyloxycarbonyl-L-tryptophanyl (guanido) N-nitro-L-arginine methyl ester (BOC-Trp-Arg (NOs) -OMe )
35 g of H-Arg (NO2) -OMe HCl, 63 g of BOC Trp-OCP and 14 g of N-methylmorpholine are dissolved in 3100 ml of dimethylformamide and left to stand at 200 for 16 hours. After evaporation of the solvent, the residue is taken up in ethyl acetate and washed with dilute sulfuric acid. One constricts a little and falls out with ether.
BOC-Trp Arg (NO2) -OMe with a melting point of 1300, [o] 2D0 = -220, crystallizes in dimethylformamide.
b) N-tert-butyloxycarbonyl-L-tyrosyl-L-tryptophanyl- (guanido) N-nitro-arginine methyl ester (BOC-Tyr-Trp-Arg (NOw) -OMe)
15 g of BOC-Trp-Arg (NO2) -OMe are dissolved in 80 ml of 5N methanolic hydrochloric acid solution and left to stand for 1 hour at room temperature. After evaporation of the solvent and treatment with ether, 13 g of H-Trp-Arg (NO) -OMe remain as hydrochloride; M.p. 1200, [cc] u = -90 in dimethylformamide. This dipeptide is dissolved together with 14 g of BOC-Tyr-OCP and 8 g of N-methylmorpholine in 200 ml of dimethylformamide. After 16 hours of standing at 200, the solvent is evaporated and the residue is taken up in ethyl acetate.
After washing with dilute phosphoric acid and concentration of the solvent, BOC-Tyr-Trp-Arg (NOO) -OMe iso
20 lungs; M.p. 130, [a] 20D = -110 in dimethylformamide.
c) tert-Butyloxycarbonyl-L-alanyl-L-tyrosyl-L-tryptophanyl- (guanido) N-nitro-L-arginine methyl ester (B OC-Ala-Tyr-Trp-Arg (NO2) -OMe)
13.5 g of BOC-Tyr-Trp-Arg (NO,) - OMe are dissolved in 130 ml of 5N methanolic hydrochloric acid solution, left to stand at 250 for 1 hour, evaporated to dryness, the residue is washed with diethyl ether, filtered off, dissolved in 100 ml of dimethylformamide and treated with 8.0 g of BOC-Ala-OCP and 30 ml of triethylamine. After 16 hours at 250, 500 ml of ethyl acetate are added, washed with dilute sulfuric acid and potassium bicarbonate solution and evaporated to dryness. After washing the residue with chloroform, BOC-Ala-Tyr Trp-Arg (NO -) - OMe is obtained; M.p. 120 (Zcrs.), [O] - 120 in dimethylformamide.
d) tert-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl L-tryptophanyl- (guanido) N-nitro-L-arginine methyl ester (E OC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg (NO - ) -OM e)
12.3 g of BOC-Ala-Tyr-Trp-Arg (NO2) -OMe are dissolved in 100 ml of 5N methanolic hydrochloric acid, left to stand at 250 for 1 hour, evaporated to dryness, the residue was washed with diethyl ether, dissolved in 100 ml of dimethylformamide, mixed with 14 ml of triethylamine and 8.5 g of BOC-Ser-N3, left to stand for 16 hours at 0, added 500 ml of ethyl acetate, washed successively with dilute sulfuric acid and ammonium hydroxide, dried over sodium sulfate and the solvent evaporated. After washing the residue with chloroform, it is dissolved in ethyl acetate and precipitated by adding diethyl ether.
13.5 g of BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg (NOs) - OMe are obtained; M.p. 135 (dec.), [A] 2E0 = -150 in dimethylformamide.
e) tert. -Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl-
L-tryptophanyl-L-arginine hydrazide acetate (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-NHNH3 CH3COOH)
13.2 g of the pentapeptide ester obtained above are dissolved in 300 ml of acetic acid, 60 ml of water and 13.2 g of palladium-carbon (10%) are added and the mixture is hydrogenated until hydrogen uptake has ceased. It is filtered, evaporated, the residue is dissolved in dimethylformamide, and again evaporated to remove the traces of acetic acid. The residue is then dissolved in 260 ml of methanol, treated with 26 ml of hydrazine hydrate and left to stand at 400 for 16 hours. After adding 260 ml of diethyl ether, the precipitated crystalline mass is filtered off, washed with diethyl ether and dried over sulfuric acid in a high vacuum. BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-NHNH2 is obtained.
CH0COOH; M.p. 1820, [e] E = -80 in the dimethylformamide.
Partial sequence Fl
L-Threonyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-valyl-L-leucine methyl ester hydrobromide (H-Thr-Cys (Bzl) -Val-Leu-OMe HBr) a) H-Cys (Bzl) -Val- Leu-OMe HBr
21.0 g of Z-Cys (Bzl) -OCP and 12.3 g of H-Val Leu-OMe-HCl are dissolved in 120 ml of dimethylformamide. Then 5.9 ml of triethylamine are added. left to stand at 250 for 16 hours, added ethyl acetate, washed with dilute hydrochloric acid, dried over sodium sulfate, evaporated to dryness and the residue crystallized from ethyl acetate / diethyl ether. Z-Cys (Bzl) -Val-Leu-OMe, m.p. 1600, [ol D0 = -280 in dimethylformamide, which is in 210 ml of a 40 ;; solution of hydrogen bromide in glacial acetic acid.
The mixture is left to stand at 250 for 1 hour, evaporated to dryness and the residue is recrystallized from isopropanol / diethyl ether. H-Cys (Bzl) -Val-Leu-OMe is obtained. HBr, Smc i68 * [¯] -D = +140 in dimethylformamide.
b) H-Thr-Cys (Bzl) -Val-Leu-OMe HBr
20 g of Z-Thr-NHNH2 are dissolved in 350 ml of dimethylformamide and the mixture is cooled to - 203. 100 ml of a solution of 2N hydrochloric acid in dioxane and then 10 ml of tert-butyl nitrite are added. After 10 minutes at -200, 45 ml of triethylamine and 25.5 g of H-Cys (Bzl) -Val Leu-OMe HBr are added and the resulting mixture is shaken at 0- for 16 hours. It is evaporated to dryness, the residue is dissolved in a mixture of ethyl acetate and water, the organic phase is washed with dilute hydrochloric acid, dried over sodium sulfate, evaporated and the residue is recrystallized from ethyl acetate. Z-Thr-Cys (Bzl) -Val-Leu OMe is obtained; M.p. 2080, [r] 2D = -270 in dimethylformamide.
20 g of the tetrapeptide obtained above are dissolved in 200 ml of a mixture of trifluoroacetic acid / ethyl acetate (1: 1), a stream of gaseous hydrogen bromide is passed in for 1 hour at 0, then evaporated and the residue is recrystallized from methanol / diethyl ether. H-Thr-Cys (Bzl) Val-Leu-OMe is obtained. 1.3 HBr; M.p. 2020, [a] D0 = - 100 in dimethylformamide.
Partial sequence F2: tert-butyloxycarbonyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-seryl-
L-asparaginyl-L-leucyl-L-serine hydrazide (BOC-Cys (Bzl) -Ser-Asn-Leu-Ser-NHNH) a) H-Asn-Leu-Ser-OMe HCl
43 g of H-Leu-Ser-OMe HCl and 53 g of BOC-Asn-ONP are dissolved in 400 ml of dimethylformamide, 22 ml of triethylamine are added, the mixture is left to stand at 250 for 16 hours, evaporated to dryness and the residue is recrystallized from methanol . 51.6 g of BOC-Asn-Leu Ser-OMe, melting point 1900, [o] 2D = - 240 are obtained in dimethylformamide, which is dissolved in 500 ml of a 4N solution of hydrochloric acid in methanol. The mixture is left to stand at 250 for 1 hour, evaporated to dryness, the residue is dissolved in methanol and precipitated with diethyl ether.
H-Asn-Leu Ser-OMe HC1 is obtained; M.p. 1800, [a] D20 = -230 in dimethylformamide.
b) H-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe HCl
39.5 g of BOC-Ser-NHNH2 are dissolved in 500 ml of dimethylformamide, cooled to - 200, 200 ml of a 2N solution of hydrochloric acid in dioxane and then 20 ml of tert. Butyl nitrite too. After 10 minutes at -200, 40 ml of triethylamine and 38.0 g of H-Asn-Leu-Ser-OMe HCl are added, the mixture is then stirred for 16 hours at 0, evaporated to dryness and the residue is recrystallized from chloroform / diethyl ether. BOC-Ser Asn-Leu-Ser-OMe, melting point 1350, [a] 2E0) = -220 is obtained in dimethylformamide, which is dissolved in 420 ml of a 4N hydrochloric acid solution in methanol. The mixture is left to stand at 25 for 1 hour, evaporated to dryness and recrystallized from methanol / ethyl acetate.
H-Ser Asn-Leu-Ser-OMe HCl, m.p. 1550 (dec.), [Α] r) = -150 in dimethylformamide is obtained.
c) Bzl-MCP-Ser-Asn-Leu-Ser-NHNH2
Dissolve 18.5 g of H-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe HC1 and 13.5 g of Bzl-MCP-ONP in 100 ml of dimethylformamide, add 10 ml of water, 3.5 ml of acetic acid and 5.6 ml of Tri ethylamine, left to stand at 250 for 16 hours, evaporated to dryness and recrystallized from ethanol. 21.3 g of Bzl-MCP-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe, mp.
193; [a] D = - 170 in dimethylformamide, which is dissolved in 200 ml of dimethylformamide with gentle heating. 200 ml of methanol and 20 ml of hydrazine hydrate are added, the mixture is left to stand at 300 for 16 hours, it is precipitated with diethyl ether, the precipitate is washed with diethyl ether / methanol (1: 1) and the resulting Bzl MCP-Ser-Asn-Leu-Ser- NHNH-, m.p. 2510, [a] D'0 = -16 in dimethylformamide.
Partial sequences F: ss-mercaptopropionyl-L-seryl-L-asparaginyl-L- leucyl-L-seryl-L-threonyl-L-hemicystinyl-L-valyl-
L-leucine hydrazide
EMI6.1
16.2 g of Bzl-MCP-Ser-Asn-Leu-Ser-NHNH (partial sequence F7) are dissolved in 150 ml of dimethylformamide, the mixture is cooled to -200, and 40 ml of a 2N solution of hydrochloric acid in dioxane and 15 ml of tert-butynitrite are added to. After 10 minutes at -200 are added 28 ml of triethylamine and 24.8 g of H-Thr-Cys (Bzl) -Val-Leu-OMe. 1.3 HBr is added and the mixture is stirred for 16 hours at 250. It is then filtered, the solution is evaporated and the residue is washed through with hot methanol.
24.1 g of Bzl-MCP-Ser-Asn Leu-Ser-Thr-Cys (Bzl) -Val-Leu-OMe, m.p. 2440, [a] 20 = -220 in dimethylformamide, which is obtained at 600 in 100 ml of dimethylformamide is dissolved, 10 ml of hydrazine hydrate are added and the mixture is left to stand at 600 for 2 hours. The resulting octapeptide hydrazide crystallizes out. It is washed with diethyl ether, water and methanol and dried in a high vacuum over phosphorus pentoxide.
15.1 g of octapeptide hydrazide, melting point 2650, [a] 2rg = - -350 in dimethylformamide / water (3 l) are obtained.
The product obtained is dissolved in 5000 ml of dried ammonia, and sodium metal is added with stirring and boiling of the ammonia until it turns deep blue.
To decolorize, ammonium chloride is added and a stream of air is then passed through the solution until the nitroprussiate reaction is negative. It is evaporated to dryness and the residue is washed through with water and acetone. After drying, one obtains
EMI7.1
M.p. 278U, [e] vD - - 19U in dimethylformamide / water (3 1).
Partial sequence ABC:
Nim-Trityl-L-histidyl-L-arginyl-L-phenylalanyl-
L-seryl-glycyl-L-methionyl-glycyl-L-phenylalanyl-
L-glycyl-L-prolyl-L-glutamyl-L-threonyl-
L-prolinamide triacetate (H-His (Trt) -Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly- Pro Glu-Thr-Pro-NH2- 3 CH3CO2H) a) L-Seryl-glycyl-L- methionyl-glycyl-Lphenylalanyl- glycyl-L-prolyl-L-glutamyl-L-threonyl-L-prolinamide (H-Ser-Gly-Met-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NHe HC1)
6.7 g of BOC-Ser-Gly-Met-Gly-OH (partial sequence B), 12 g of H-Phe-Gly-Pro-Glu (OTB) -Thr-Pro-NH2 (partial sequence A) and 2.1 are dissolved g of hydroxysuccinimide in 50 ml of dimethylformamide and 20 ml of acetonitrile, cool to 00, add 4.0 g of dicyclohexylcarbodiimide and leave
Stand at 0 for 16 hours.
The solvent is evaporated off, the residue is washed with water, diethyl ether and ethyl acetate and recrystallized from chloroform. BOC-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro Glu (OTB) -Thr-Pro-NH2, m.p. 1210 (decomp.), [A] D = -470 in dimethylformamide, which is converted into 250 ml of a solution of 8N hydrogen chloride in dioxane dissolves. The mixture is stirred for 2 hours at 250, evaporated to dryness and the residue is processed in diethyl ether. H-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro NH.2 HCl, melting point 1300 (dec.), [A] 2D = -480 in dimethylformamide is obtained.
b) Nim-trityl-L-histidyl-L-arginyl-L-phenylalanyl-
L-seryl-glycyl-L-methionyl-glycyl-L-phenylalanyl glycyl-L-prolyl-L-glutamyl-L-threonyl-L-proline amide (H-His (Trt) -Arg-Phe-Ser-Gly-Met -Gly-Phe-Gly- Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 - 3 CH: 3COOH)
9.9 g of Trt-His (Trt) -Arg-Phe-NHNH are dissolved; HCl (partial sequence C) in 100 ml of dimethylformamide, cools to 200, gives 15 ml of dioxane / HCl 2n and then
1.6 ml of tert-butyl nitrite are added, the mixture is stirred at -200 for 10 minutes, there are 28 ml of triethylamine and 10.0 g of H-Ser-Gly-Met Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2-HCl to, stir for 4 hours at 00, filtered and evaporated to dryness.
The residue is dissolved in a mixture of ethyl acetate / methanol (8: 2), washed with dilute ammonia and then with water until neutral, dried over sodium sulfate, concentrated
100 ml and falls by adding diethyl ether. The precipitate is again dissolved in dimethylformamide and precipitated by adding diethyl ether. Trt-His (Trt) -Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly is obtained
Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 [m.p. 1680 (decomp.), [O] D = -430 in dimethylformamide], which is dissolved in 500 ml of acetic acid / water (8: 2).
The mixture is left to stand at 400 for 3 hours, evaporated, the residue is washed in diethyl ether and dried in a high vacuum over KOH chips. H-His (Trt) -Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2-3 CH3COOH, mp. 1820 (dec.), [O] 20 is obtained - 560 in acetic acid.
Partial sequence DE:
N-tert-butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl-
L-tryptophanyl-L-arginyl-L-asparaginyl-L-leucyl-
L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenylalanine hydrazide diacetate (B OC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-
Phe-NHNH2 2 CH3COOH) a) l- (N-tert-butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosinyl-L-tryptophanyl-L-arginyl-L-asparaginyl L-leucyl-L-asparaginyl-L -asparagmyl-L-phenyl- alanyl) -2-benzyloxycarbonyl-hydrazide diacetate (B OC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-
Phe-NH-NH-Z 2 CHBCOOH)
320 ml of dimethylformamide are cooled to -200 ° C., 100 ml of 2N hydrogen chloride in dioxane are added and 68 g <RTI
ID = 7.52> BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-NHNH2-acetate (partial sequence E). Then 12 ml of tert-butyl nitrite are added, the mixture is stirred for 10 minutes at -200 and 35 ml of triethylamine are added dropwise. The resulting mixture is combined with a solution formed from 8.8 g of H-Asn-Leu Asn-Asn-Phe-NHNH-Z trifluoroacetate (partial sequence D) and 17 ml of triethylamine in 150 ml of dimethylformamide. After 16 hours at 0 it is evaporated. The residue is dissolved in ethyl acetate and washed with dilute phosphoric acid and ammonia solution. The remains after evaporation of the solvent
B OC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn
Phe-NHNH-Z 2 CH3COOH of m.p. 1750, [a] D0 = -19.50 in dimethylformamide.
b) tert-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl L-tryptophanyl-L-arginyl-L-asparaginyl-L-leucyl-
L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenyl-alanine hydrazid diacetate (B OC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn
Asn-Phe-NHNH2 2 CH3COOH)
90 g of BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu Asn-Asn-Phe-NHNH-Z 2 CH: 3COOH are dissolved in 500 ml of dimethylformamide and hydrogenated with 10 g of Pd / C (10Sig) to the end the hydrogen uptake. After filtering off the catalyst, the solvent is evaporated and the residue is crystallized from a mixture of ether and ethanol.
BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NHNHa 2 CH3COOH of melting point 2650 [a] 2E0-570 in dimethylformamide is obtained.
Partial sequence ABCDE: L-Seryl-L-alanyl-L-tyrosyl-L-tryptophanyl-
L-arginyl-L-asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl-
L-asparaginyl-L-phenylalanyl-L-histidyl-L-arginyl
L-phenylalanyl-L-seryl-glycyl-L-methionyl-giycyl-
L-phenylalanyl-glycyL-glutamyl-L-threonyl-
L-prolinamide hexatrifluoroacetate (H-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg, -Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-
His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-
Thr-Pro-NH2 6 CFUCOiH).
15.2 g of BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn Leu-Asn-Asn-PheNHNH are dissolved; Diacetate (partial sequence DE) in 200 ml of dimethylformamide, cools down to -200, 15 ml of dioxane / HCl 2N and then 1.16 ml of tert-butyl nitrite are added and the mixture is stirred at -200 for 10 minutes
14 ml of triethylamine and a solution of 18.6 g of the tridecapeptide acetate obtained in partial sequence ABC are added, the resulting mixture is stirred at 00 for 16 hours, filtered and evaporated to dryness. The residue is washed with diethyl ether and with chloroform, dissolved in dioxane / water (8: 2), the solution obtained is treated with 100 ml of Amberiit-IRA-410 (acetate form), evaporated and the residue is crystallized from isopropanol / water around.
The BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His (Trt) -Arg -Phe-Ser-Gly-Met Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr- Pro-NHO - acetate, m.p. 1450 (decomp.), [A] r, - - 670 in acetic acid, which is dissolved in 500 ml of trifluoroacetic acid under a nitrogen atmosphere.
The mixture is left to stand at 250 for 1 hour, concentrated to 100 ml and precipitated by adding 1000 ml of diethyl ether. It is filtered off, the residue is dissolved in dimethylformamide and precipitated with diethyl ether. After drying over KOH chips, the H-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-
His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu- Thr-Pro-NHo - 6 CFbCOaH,
M.p. 1300 (dec.), [A] 2i} = -420 in acetic acid.
Example ss-mercaptopropionyl-L-seryl-L-asparaginyl-L-leucyl-L-seryl-L-threonyl-L-hemicystinyl-L-valyl-L-leucyl-L-seryl-L-al anyt-L-tyrosyl- L-tryptoph anyl-L-arginyl-L-asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenylalanyl-L-histidyl-L-arginyl-L-phenylalanyl-L-seryl-fycyl-L-methionyl- glycyl-L-phenylalanyl-glycyl-L-prolyl-L-glutamyl-L-threonyl-L-prolinamide hexaacetate octahydrate.
EMI8.1
NHo hexaacetate octahydrate)
1.05 g of octapeptide hydrazide (partial sequence
F) in a mixture of 50 ml and dimethylformamide
1.2 ml of dioxane / HCl 2n at -20. 0.116 ml of tert-butyl nitrite are added and the mixture is stirred at -20 for 10 minutes
1.4 ml of triethylamine and 3.1 g of tricosapeptide hexatri fluoroacetate (partial sequence ABCDE) and 5 ml of water and stirred for 16 hours at O '. It is evaporated to dryness and the residue is washed with diethyl ether, chloroform and acetone. This gives the crude peptide derivative, which is dissolved in 100 ml of 0.3N acetic acid, treated with 20 ml of Amberlit-IRA-4 10 (acetate) and added 50 ml of 0.6N
Add ammonium hydroxide.
The pH is adjusted to 6.5 and the solution obtained is layered on a carboxymethyl cellulose column (10 × 100 cm) which has been equilibrated with a 0.1 5N ammonium acetate buffer solution.
The elution is carried out with an increasing concentration and pH gradient (0.15n to 0.4n; pH 6.5 to pH 7.0) of an ammonium acetate buffer. The combined fractions which contain the pure peptide are lyophilized 3 times, the residue is washed with ethanol and then with diethyl ether and dried over potassium hydroxide in a high vacuum. You get
EMI8.2
M.p. 2200 (dec.). [o] = 560 in acetic acid ln.
Amino acid composition after acid hydrolysis (6n, 16 hours): Alar. Arg.'0, Ans5,9, Cys / 21.0, Gluto, Gly30, His1.1,
Leu2.9, Met0, Phe3.0, Pro2., Sers.s, Thrlu, Tyrso, Val09 (Trp 1.0 by spectrophotometry).