Verfahren zur Herstellung eines bisher unbekannten Polypeptidderivates
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines bisher unbekannten Polypeptidderivates der Formel
EMI1.1
11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Ala-Tyr-TrpArg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-A rg- 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 Phe-Ser-Gly- Nle -Gly-Phe -Gly-Pro-Glu-Thr-Pro- NHg, seiner therapeutisch wirksamen Säureadditions salze und Schwermetallkomplexe.
Das erfindungsgemässe Polypeptidderivat zeichnet sich durch Beständigkeit gegenüber der abbauenden
Wirkung von Aminopeptidasen aus. Ein weiterer Vor teil ist der bekanntlich oxydationsbeständige Norleucin
Rest in Stellung 25.
Das bisher unbekannte Polypeptidderivat kann nach für die Synthese von Verbindungen dieser Art allgemein bekannten Methoden hergestellt werden, wobei die
Aminosäuren in der, in der obigen Formel festgelegten Reihenfolge einzeln oder nach vorheriger Bildung klei nerer Peptideinheiten miteinander verknüpft werden, indem man entsprechende zu seinem Aufbau nötige
Verbindungen unter Bildung von CONH-Bindungen in beliebiger zeitlicher Reihenfolge miteinander konden siert, wobei nicht an der Reaktion teilnehmende freie funktionelle Gruppen durch geeignete Schutzgruppen geschützt werden, zu einem beliebigen Zeitpunkt der
Synthese die Schutzgruppen mit Ausnahme der BOC
Gruppe in Stellung 1 abspaltet, die Mercaptogruppen nach Bildung der Sequenz 1 bis 7 zum Disulfid oxy diert und die Carboxylgruppe des terminalen Prolyl restes in die Amidgruppe überführt.
In der letzten Stufe sind jedoch Methoden zu verwenden, bei denen Race misierung nicht auftritt oder gering gehalten werden kann, vorzugsweise die Azid- oder die aktivierte Ester
Methode, wobei zur Aktivierung, vorzugsweise N-Hydr oxysuccinimid, Verwendung findet. Üblicherweise werden die bei Cystein-haltigen Peptiden zum Schutz der SH-Gruppen verwendeten Benzylreste am Ende der Synthese durch Behandlung mit Natrium in flüssigem Ammoniak abgespalten.
Es wurde nun gefunden, dass die Abspaltung der Benzylschutzgruppen und die Herstellung der (Cys)S S-(Cys)-Bindung vor der letzten Stufe zu besondern guten Ausbeuten an Endprodukt führt.
Beim Aufbau des neuen Polypeptidderivates haben sich für die Blockierung der y-Carboxylgruppe, beispielsweise in der nachstehend beschriebenen Teilsequenz A, die tert.-Butyloxygruppe bewährt, doch können auch andere Schutzgruppen, wie die Methoxy-, die Athoxy-, die tert.-Amyloxy-, die Amid- oder die Benzyloxygruppe verwendet werden.
Für die Blockierung der Imidazolgruppe des Histidinrestes in der nachstehend beschriebenen Teilsequenz C hat sich die Triphenylmethylgruppe bewährt, doch können auch andere geeignete Schutzgruppen, wie die Carbo - tert. - butoxy-, die Carbo - tert. - amyloxy-, die Carbobenzoxy- oder die Benzylgruppe verwendet werden.
Für die Blockierung der Guanidogruppe des Argininrestes in der nachstehend beschriebenen Teilsequenz E wurde die Nitrogruppe verwendet, doch können auch andere geeignete Schutzgruppen, wie die Tosylgruppe, die p-Nitrobenzoxycarbonylgruppe oder die 9-(lsopropyloxycarbonyl)-3,4,5 ,6-tetrachloro- benzoylgruppe verwendet werden. Man kann auch den Schutzeffekt der Protonisierung der Guanidogruppe bei der Synthese verwenden.
Das neue Polypeptidderivat lässt sich auch in Form seiner Salze gewinnen bzw. verwenden. Als Salze kommen solche mit organischen Säuren, wie Essigsäure, Propionsäure, Glykolsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Benzoesäure, Zimtsäure, Salicylsäure, 2-Phenoxy- oder 2-Acetoxy-benzoe säure, Mandelsäure, Methansulfonsäure, Athansulfon- säure, Hydroxyäthansulfonsäure, Benzol- oder Toluolsulfonsäure, Naphthalinsulfonsäure, Sulfanilsäure sowie polymere Säuren, wie Gerbsäure, Alginsäure, Polygalacturonsäure, Polyphloretinphosphat, oder Carboxymethylcellulose und Salze mit anorganischen Säuren, wie Halogenwasserstoffsäure, z. B. Salzsäure oder Bromwasserstoffsäure, Salpetersäure, Thiocyansäure, Schwefelsäure und Phosphorsäure in Frage.
Als Schwermetallkomplex kommt z. B. derjenige vom ZinkE3 in Frage.
Die Ausgangsprodukte zur Herstellung des neuen Polypeptidderivates können, sofern sie bisher nicht bekannt waren, nach den für die Peptidchemie bekannten Methoden erhalten werden, wobei die Aminosäuren einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten miteinander verknüpft werden.
Die neue Verbindung stellt ein wichtiges therapeutisches Prinzip dar, das den Calciumplasmaspiegel, insbesondere den erhöhten Calciumplasmaspiegel senkt und als Antagonist des Parathormons eine positive Calciumbilanz im Knochen bewirkt.
Es ist somit indiziert bei allen Zuständen, bei welchen eine Senkung des Plasmacalciumspiegels erwünscht ist, z. B. Hypercalcämien verschiedener Genese, Mangel des endogenen Thyreocalcitonins infolge Ausfalls von Schilddrüsengewebe, Hyperfunktion der Nebenschilddrüsen.
Die neue Verbindung ist indiziert bei allen Knochenaffektionen, die auf einem vermehrten Abbau beruhen oder bei welchen eine vermehrte Calciumfixation im Knochen erwünscht ist, z. B. Osteoporose verschiedener Genese (z. B. postklimakterisch, posttraumatisch, bedingt durch Corticosteroidtherapie oder Inaktivität usw.), Frakturen, Osteomalacie, Rachitis sowie insbesondere zur Kombinationstherapie mit Calcium bzw.
Phosphat. Die biologische Prüfung der neuen Verbindungen ergab eine Wirksamkeit von etwa 100 bis 450 MRC-Einheiten/mg Peptid. Die erforderliche Tagesdosis (i. m. verabreicht) in MRC-Einheiten beträgt 20 mE bis 10E, vorzugsweise 100 mEjkg Tiergewicht.
Beim Menschen beträgt die tägliche Dosis (i. m.
verabreicht) in MRC-Einheiten 1 bis 500 E. Vorzugsweise wird eine tägliche Dosis von 5 E i. m. verabreicht.
Die neue Verbindung kann als Heilmittel, z. B.
in Form pharmazeutischer Präparate, Verwendung finden. Diese enthalten die genannte Verbindung in Mischung mit einem für die parenterale Applikation geeigneten organischen oder anorganischen Trägermaterial. Für dasselbe kommen solche Stoffe in Frage, die mit der neuen Verbindung nicht reagieren, wie z. B. Gelatine, Milchzucker, Stärke, Magnesiumstearat, Talk, pflanzliche Öle, Benzylalkohole, Gummi arabicum, Polyaikylenglykole, Vaseline, Cholesterin oder andere bekannte Arzneimitte lträger.
Die pharmazeutischen Präparate können z. B. in flüssiger Form als Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen vorliegen. Gegebenenfalls sind sie sterilisiert und bzw. oder enthalten Hilfsstoffe, wie Konservierungs-, S*abilisierungs-, Netzmittel oder Emulgiermittel. Sie können auch noch andere, therapeutisch wertvolle Stoffe enthalten. Die neue Verbindung kann auch in Form eines Depotpräparates verabreicht werden.
Die neue Verbindung und ihre Salze können auch als Zwischenprodukte zur Herstellung von pharmazeutischen Präparaten Verwendung finden.
Es werden folgende Abkürzungen verwendet:
Z = Benzyloxycarbonyl
Bzl = Benzyl
BOC = tert.-Butyloxycarbonyl
Trit = Trityl = Triphenylmethyl
OTB = tert.-Butyloxy
ONP = p-Nitrophenylester
OCP = 2,4,5-Trichlorphenoxy
OMe = Methoxy
OEt = Äthoxy NO2 = Nitro
Ser = L-Seryl
Asn = L-Asparaginyl
Leu = L-Leucyl
Thr = L-Threonyl
Val = L-Valyl
Ala = L-Alanyl
Tyr = L-Tyrosyl
Trp = L-Tryptophanyl
Arg = L-Arginyl
Phe - L-Phenylalanyl
Glu = L-Glutamyl
His = L-Histidyl
Pro = L-Prolyl
Gly = Glycyl
Nle = L-Norleucyl
Cys = L-Cysteinyl
OSu = Oxvsuccinimid
In den folgenden Beispielen, die die Ausführung des Verfahrens erläutern, den Umfang der Erfindung aber in keiner Weise einschränken sollen, erfolgen alle Temperaturangaben in Celsiusgraden.
Teilsequenz A L-Phenylalanyl-glycyl-L-prolyl-γ-tert.-butyloxy-
L-glutamyl-L-threonyl-L-prolinamid (H-Phe-Gly-Pro-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2)
Man löst bei-5 134 g Z-Thr-NH-NH2 in 2 Liter In Salzsäure und versetzt mit 0,55 Liter in Natrium nitrit. Nach 5 Minuten wird Kaliumcarbonat bis pH 9 zugegeben, das entstandene Azid mit Athylacetat extrahiert und eine Lösung von 80 g H-Pro-NH2 Hydrochlorid in 100 ml Wasser, 500 ml Dimethylformamid und 77 ml Triäthylamin hinzugefügt. Man verdampft das Äthylacetat bei 200 im Vakuum und lässt über Nacht bei 250 stehen.
Die restliche Lösung wird im Vakuum verdampft, der Rückstand in Äthylacetat gelöst, die Lösung mit Wasser, verdünnter Salzsäure und einer wässrigen Kaliumcarbonatlösung gewaschen, und über Natriumsulfat getrocknet. Man verdampft im Vakuum, löst in warmem Äthylacetat und kühlt ab.
Man erhält Z-Thr-Pro-NH2.; Smp. 1480, [α]D20 = -72 in 95 S Essigsäure.
Man löst hierauf 90 g Z-Thr-Pro-NHe in 2 Liter Dioxan und 260 ml In Salzsäure und hydriert bei 200 und Normaldruck in Gegenwart eines Palladiumkatalysators. Man filtriert, verdampft die Lösung im Vakuum, wäscht den Rückstand mit Äthylacetat und erhält H-Thr-Pro-NH2 HCl; Smp. 2160, [ct] 2rg= -640 in 95 % Essigsäure. Dieses wird in 500 ml Dimethylformamid, 50 ml Wasser und 32 ml Triäthylamin gelöst und 118 g Z-Glu(OTB)-OCP und 800 ml Tetrahydrofuran zugegeben. Man lässt über Nacht bei 200 stehen, verdampft im Vakuum und kristallisiert den Rückstand mit Athyläther.
Man erhält Z-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2, Smp. 650 (Zers.), [a] 2E0) = -180 in Dimethylformamid.
Man löst 80 g Z-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH; in 1,5 Litcr Dioxan und 200 ml Wasser und hydriert bei 200 und Normaldruck in Gegenwart eines Palladiumkatalysators. Die Lösung wird filtriert und im Vakuum verdampft und der Rückstand mit Diäthyläther versetzt, wobei H-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH3 erhalten wird; Smp.
650 (Zers.), {o 2rg = -280 in Dimethylformamid.
Dieses wird in 700 ml Dimethylformamid bei 0 gelöst, 200 ml Acetonitril, 68 g Z-Phe-Gly-Pro-OH und 32 g Dicyclohexylcarbodiimid hinzugefügt, über Nacht bei 200 stehengelassen, filtriert, im Vakuum eingedampft und mit Äthylacetat versetzt. Danach wäscht man die Lösung mit Wasser, verdünnter Salzsäure und wässriger Kaliumcarbonatlösung, trocknet über Natriumsulfat, verdampft im Vakuum und kristallisiert den Rückstand aus Athylacetat/Bthyläther. Man erhält Z- Phe - Gly - Pro - Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2; Smp. 1200 (Zers.), tc] D0 = -660 in Dimethylformamid, das man in 1500 ml Dioxan und 300 ml Wasser löst. Man gibt 30 g Palladiumkohle (10 %) zu und hydriert bis zum Ende der Wasserstoffaufnahme.
Man filtriert, dampft das Filtrat ein und kristallisiert den Rückstand aus Dioxan. Man erhält das H-Phe-Gly-Pro-Glu(OTB)-Thr- Pro-NH2; Smp. 1530, [a] D0 = 790 in Dimethylformamid.
Teilsequenz B
Benzyloxycarbonyl-L-seryl-glycyl-L-norleucyl glycin (Z-Ser-Gly-Nle-Gly-OH) a) Benzyloxycarbonyl-L-norleucyl-glycin (Z-Nle-Gly-OH)
Man löst 31,6 g H-Gly-OH in 420 ml in NaOH, gibt 840 ml Tetrahydrofuran zu, versetzt anschliessend mit 130 g Z-Nle-ONP, schüttelt, bis die Lösung klar wird, lässt eine Nacht bei 250 stehen. Dann wird im Vakuum auf 500 ml konzentriert und die erhaltene wässrige Lösung mit in NaOH auf pH 9 gesteEt, zwei- mal mit Ather exirahiert, dann mit 4n Salzsäure angesäuert, mit Essigester extrahiert. Die Essigesterlösung wäscht man mit Wasser und 30Siger KochsaElösung, trocknet über Natriumsulfat, dampft im Vakuum ein.
Den Rückstand verreibt man mit Äther, lässt 2 Stunden bei -200 kristallisieren. Man erhält Z-Nle-Gly-OH, Smp. 1380, [a]D20 = M0 in Dimethylformamid¯ b) Benzyloxycarbonyl-glycyl-L-norleucyl-glycin (Z-Gly-Nle-Gly-OH)
Man löst 100 g Z-Nle-Gly-OH in 1000 ml 4n HBr/Eisessig, lässt 50 Minuten bei 250, verreibt mit Äther, filtriert Kristalle ab und wäscht gut mit Äther.
Man erhält HBr-H-Nle-Gly-OH, [a] 2D = +24,70 in Essigsäure (95 %).
Man löst 84 g Br- H-Nle-Gly-OH in 240 ml Wasser, versetzt mit 152 ml 4n NaOH, 800 ml Tetrahydrofuran und 91 g Z-Gly-ONP. Man schüttelt 1 Stunde bei 250 und lässt dann 2 Tage bei 250 stehen.
Man konzentriert im Vakuum auf 500 ml, stellt mit in NaOH auf pH 9 und extrahiert mit Äther. Die wäl3rige Phase wird mit in Salzsäure angesäuert, dann zweimal mit Essigester extrahiert. Man wäscht mit Wasser, 30 %iger Kochsalzlösung, trocknet über Natriumsulfat, dampft im Vakuum ein und verreibt den Rückstand mit Äther. Man erhält Z-Gly-Nle-Gly-OH, Smp. 1550, [0]2D0 = -5,60 in Dimethylformamid.
c) Benzyloxycarbonyl-L-seryl-glycyl-L-norleucyl- glycin (Z-Ser-Gly-Nle-Gly-OH) Man löst 89,5 g Z-Gly-Nle-Gly-OH in 900 ml 4n H!3r,Eisessig, lässt 50 Minuten bei 250 stehen, dampft im Vakuum ein, verreibt mit Äther, filtnert, wäscht gut mit Äther, trocknet im Vakuum, löst in 280 ml Wasser, etwa 650 ml Dimethylformamid, glit 66,5 ml Triäthylamin zu und versetzt mit der Lösung des Azids, die wie folgt erhalten wird:
:
Man kühlt 940 ml in Salzsäure auf -5 , gibt 96 g Z-Ser-NH-NHs zu und tropft dann bei-5 360 ml ln Natriurnnitrit ein, rührt noch 6 Minuten bei -5 , überschichtet mit etwa 600 ml Essigester von 00, stellt unter Zugabe von festem Natriumcarbonat auf pH 8,5, trennt die Essigesterphase ab, extrahiert nochmals, trocknet die Lösung über Natriumsulfat und filtriert.
Die Reaktionslösung dampft man im Vakuum ein, versetzt den Rückstand mit 600 ml Wasser, säuert an, extrahiert mit Athylacetat, wäscht mit Wasser und 30 %iger Kochsalzlösung, kühlt auf 00, filtriert Kristalle ab. Man erhält Z-Ser-Gly-Nle-Gly-OH, Smp 2100 (mit Zers.), [a] 2D = 80 in Dimethylformamid.
Teilsequenz C
Na,Nimid.-Ditrityl-L-histidyl-L-arginyl- L-phenylalaninhydrazid. HCl (Trt-His(Trt)-Arg-Phe-NH-NH2 HCl) a) Z-Arg(NO2)-Phe-OMe
51,8 g H-Phe-OMe HCl werden in 1 Liter Äther und etwa 50 ml Eiswasser gelöst und unter Rühren und Kühlen genügend Natriumcarbonat zugegeben, bis alles Wasser abgebunden ist. Man filtriert und dampft das Filtrat bis zur Gewichtskonstanz ein, wobei ein farbloses Öl erhalten wird.
67,6 g Z-ArgNO. -OH werden in 300 ml Acetonitril und 150 ml Dimethylformamid gelöst und mit 41,2 g H-Phe-OMe versetzt. Danach wird auf -200 abgekühlt und eine Lösung von 43,4 g Dicyclohexylcarbodiimid in 100 ml Acetonitril zugegeben. Das Ganze lässt man unter zeitweiligem Umschütteln während 4 Stunden im Eiskasten stehen. Der entstandene Niederschlag wird abfiltriert und das Filtrat eingedampft. Der Eindampfrückstand wird in 1 Liter Essigester gelöst und hierauf in der Kälte mit in Natronlauge, Wasser, in Schwefelsäure, Wasser und gesättigter Kochsalzlösung gewaschen. Die über Natriumsulfat getrocknete Essigsäureäthylester-Phase wird vollständig eingedampft. Nach Umkristallisieren aus Essigesterj Petroläther erhält man Z-Arg(NO2)-Phe-OMe; Smp.
131-1330, [aJD- = -70 in Methanol, 40 in Dimethylformamid.
b) H-Arg(NO)-Phe-OMe 0,5 H2O # 1,2 HBr
20 g Z-Arg(NO2)-Phe-OMe werden in 50 ml Eisessig gelöst und unter leichtem Kühlen 50 ml 40 %ige Bromwasserstoffsäure in Eisessig zugesetzt. Danach lässt man das Ganze unter zeitweiligem Umsehüttein während 1 Stunde bei 200 stehen. Nach vollständigem Eindampfen wird der Rückstand in 200 ml Wasser gelöst und zweimal mit Äther gewaschen. Die wässrige Phase wird vollständig eingedampft und der Rückstand aus Methanol/Äther umkristallisiert. Smp. 165-1670 mit Zers., kl D = + 180 in Methanol, + 140 in Dimethylformamid.
c) Z-His(Z)-Arg(NO)-Phe-OMe
46,1 g H-Arg(NtOe)-Phe-OMe 0,5 H2O # 1,2 HBr werden in 100 ml Wasser gelöst, hierauf erwärmt und anschliessend abgekühlt. Nach Zugabe von Chloroform und Eis wird mit Ammoniak auf pH 9 gestellt. Die Chloroformphase wird noch einmal mit Wasser gewaschen, anschliessend über Natriumcarbonat getrocknet und abfiltriert. Dem Filtrat wird eine Lösung von 44,5 g Z-His(Z)-OH, 12,1 g Hydroxysuccinimid in 200 ml Acetonitril und 100 ml Pyridin zugesetzt, danach das Ganze auf -200 abgekühlt und mit einer Lösung von 21,1 g Dicyclohexylcarbodiimid in 70 ml Acetonitril versetzt. Anschliessend wird unter zeitweiligem Rühren 4 Stunden im Eiskasten stehengelassen.
Der entstandene Niederschlag wird abfiltriert und das Filtrat eingedampft. Der Rückstand wird in Essigsäureäthylester aufgenommen und anschliessend folgendermassen gewaschen: 10 Geige Kaliumcarbonatlösung (pH 10), Wasser, gesättigte Kochsalzlösung, Wasser, gesättigte Kochsalzlösung, Schwefelsäure (pH 3), Wasser, Kochsalzlösung. Die über Natriumsulfat getrocknete Essigsäure äthylester-Phase wird vollständig eingedampft, wobei ein hellbeiger Schaum erhalten wird. Dieser Schaum wird je zweimal in wenig Methanol gelöst und mit Ather gefällt. Die Ätherphasen werden abdekantiert und der Niederschlag getrocknet; man erhält Z-His(Z) Arg(NO. > )-Phe-OMe (amorpher Schaum), [a] 2rg= -8 in Methanol, -8 in Dimethylformamid.
d) H-His-Arg-Phe-OMe. 4 HCl
25 g Z-His(Z) -Arg(NO)-Phe-OMe werden in 800 ml Eisessig gelöst. Danach werden 10 g 10 S Palladium auf Aktivkohle in 200 ml in Salzsäure angerührt und in die Lösung gegeben. Das Ganze wird einer 2stündigen Hydrierung unterworfen und anschliessend der Katalysator abfiltriert. Das Filtrat wird erneut mit 5 g 10% Palladium auf Aktivkohle in Wasser versetzt und der Hydrierung unterworfen, die nach 51A Stunden beendet ist. Hierbei werden etwa 80 der theoretischen Menge Wasserstoff verbraucht. Der Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat vollständig eingedampft, wobei H-His-Arg-Phe-OMe # 4 HCI in Form eines amorphen Schaumes erhalten wird.
e) Trt-His(Trt)-Arg-Phe-OMe HCI
21,5 g H-His-Arg-Phe-OMe4 HCI werden in 100 ml Pyridin und etwa 100 ml Dimethylformamid gelöst. Bei etwa; 50 wird bis pH 9 Triäthylamin zugegeben und anschliessend eine Lösung von 29 g Tritylchlorid in 300 ml Pyridin während 5 Minuten zugetropft. Nach Beendigung der Zugabe wird von Zeit zu Zeit das pH geprüft und nötigenfalls wieder mit Triäthylamin auf etwa pH 9 gestellt. Das Ganze wird nach ungefähr 4 Stunden eingedampft, der Rückstand in Chloroform und Wasser aufgenommen und unter Zugabe von wenig in Salzsäure auf pH 4 gestellt. Man trennt die Chloroformphase ab, wäscht sie zweimal mit Wasser, trocknet über Natriumsulfat und dampft vollständig ein.
Der Rückstand wird mit Äther versetzt und vom Ather anschliessend abfiltriert, wobei Trt-His(Trt) Arg-Phe-OMe HCI erhalten wird.
f) Trt-His(Trt)-Arg-Phe-NH-NH3 - HCl
17 g Trt-His(Trt)-Arg-Phe-OMe. HC1 werden in 200 ml Methanol gelöst und mit 40 ml Hydrazinhydrat versetzt. Danach wird 2 Tage bei Zimmertemperatur stehengelassen. Man dampft ein, löst den Rückstand in Chloroform und wäscht zweimal mit Wasser. Die Chloroformphase wird über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Hierauf wird der Rückstand mit Äther gewaschen und abfiltriert; er besteht aus Trt His(Trt)-Arg-Phe-NH-NH.2 HCl; [α]D18 = 90 in Dimethylformamid, Smp. 1580.
Teilsequenz D
1-(L-Asparaninyl-L-leucyl-L-asparaginyl-
L-asparaginyl-L-phenylalanin)-2-benzyloxy- carbonyl-hydrazid. Trifluoracetat (H-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z CF3COOH) a) 1-(N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-phenylalanin)-
2-benzyloxycarbonyl-hydrazid (BOC-Phe-NH-NH-Z)
Man löst 72 g BOC-Phe-OH und 28 g N-Methylmorpholin in 500 ml Methylenchlorid auf und tropft bei -5 26 ml Chlorameisensäuremethylester zu. Nach 10 Minuten gibt man noch 44 g Z-NHNHe in 100 ml Methylenchlorid zu und rührt 4 Stunden bei Zimmertemperatur weiter. Nach Auswaschen mit verdünnter Phosphorigersäure wird getrocknet und eingedampft.
Nach Kristallisieren aus Petroläther erhält man BOC Phe-NH-NH-Z vom Smp. 117 , [α] D20 - -5 in Dimethylformamid.
b) l-(N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-asparaginyl-
L-phenylalanin)-2-benzyloxycarbonyl-hydrazid (BOC-Asn-Phe-NH-NH-Z)
Man löst 41 g BOC-Phe-NHNH-Z in 400 ml Tri fluoressigsäure und lässt eine Stunde bei 200 stehen.
Beim Verdampfen der Trifluoressigsäure erhält man das H-PheNHNH-Z als kristallines Trifluoracetat vom Smp. 191s, [a] 2ss0 = t 26,40 in Dimethylformamid.
Diese Substanz wird zusammen mit 35 g BOC-Asn ONP und 30 g N-Methylmorpholin in 200 ml Dimethylformamid gelöst. Nach 16 Stunden Stehen bei 200 wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand nacheinander mit Essigester und verdünnter Phosphorigersäure gewaschen. Man erhält BOC-Asn-Phe-NH NH-Z vom Smp. 2100 [a]4D = -180 in Dimethylformamid.
c) 1 -(N-tert.-Butyloxycarbonyl-l-aspara ginyl- L-asparaginyl-L-phenylalanin)-2-benzyloxy- carbonyl-hydrazid (B OC-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z)
Man löst 26 g BOC-Asn-Phe-NH-NH-Z in 200 ml Trifluoressigsäure auf und lässt 1 Stunde bei 200 stehen.
Nach Verdampfen des Lösungsmittels versetzt man in 100 ml Dimethylformamid mit 17 g BOC-Asn-ONP' und 15 g N-Methylmorpholin. Nach 16 Stunden bei 200 wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand nacheinander mit Essigester und verdünnter Phos phorigersäure gewaschen. Man erhält BOC-Asn-Asn Phe-NH-NH-Z; Smp. 2400, [u]2,0= -280 in Dimethylformamid.
d) 1-(N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-leucyl-
L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenylalanin)
2-benzyloxycarbonyl-hydrazid (B OC-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z)
Man löst 22 g BOC-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z in 150 ml Trifluoressigsäure und lässt 1 Stunde bei 200 stehen. Nach Verdampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand mit 12 g BOC-Leu-ONP und 10 g N-Methylmorpholin in 100 ml Dimethylformamid versetzt. Nach 16 Stunden Stehenlassen bei 200 wird das Dimethylformamid verdampft und der Rückstand nacheinander mit Essigester und verdünnter Phosphorigersäure gewaschen. Man erhält BOC-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z vom Smp. 2100, [ril 2i;' = -340 in Dimethylformamid.
e) 1 -(N-tert.-B utyloxycarbonyl-L-asparaginyl-
L-leucyl-L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenyl alanin)-2-benzyloxycarbonyl-hydrazid (B OC-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z)
Man löst 57 g BOC-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z in 300 ml Trifluoressigsäure und lässt eine Stunde bei 200 stehen. Nach Verdampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand in Ather kristallisiert. Man löst das Tetrapeptid-trifluoracetat in 400 ml Dimethylformamid und versetzt die Lösung mit 27 g BOC-Asn-ONP und 25 g N-Methylmorpholin. Nach 16 Stunden Stehenlassen bei 200 wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand nacheinander mit Essigester und verdünnter Phosphorigersäure gewaschen. Man erhält BOC Asn- Leu-Asn-Asn- Phe-NH-NH-Z vom Smp. 2500 (Zers.), [aj 0 - 340 in Dimethylformamid.
f) 1 -(L-Asparaglnyl-L-leucyl-L-asparaginyl-
L-asparaginyl-L-phenylalanin)-2-benzyloxy carbonyl-hydrazid Trifluoracetat (H-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z Trifluor- acetat)
Man löst 43,5 g BOC-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH NH-Z in 200 ml Trifluoressigsäure und lässt eine Stunde bei 200 stehen. Nach Eindampfen wird der Rückstand mit Hilfe von Ather kristallisiert. Man erhält H-Asn Leu - Asn - Asn - Phe - NH - NH - Z. Trifluoracetat; Smp.
2420, [a]2DO= -220 in Dimethylformamid.
Teilsequenz E tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-aIanyl-L-tyrosyl-
L-tryptophanyl-L-arginin-hydrazid Acetat (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-NHNH.,- CHa(::OOH) a) N-tert.-Butyioxycarbonyl-L-tryptophanyl (guanido) N-nitro-L-argininmethylester (BOC-Trp-Arg(NO)-OMe)
Man löst 35 g H-Arg(NO,)-OMe- HCI, 63 g BOC Trp-OCP und 14 g N-Methylmorpholin in 300 ml Dimethylformamid auf und lässt 16 Stunden bei 200 stehen. Nach Verdampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand in Essigester aufgenommen und mit verdünnter Schwefelsäure gewaschen. Man engt etwas ein und fällt mit Ather aus.
Dabei kristallisiert BOC-Trp Arg(NOU)-OMe vom Smp. 1300, [(Z]2D= -22 in Dimethylformamid.
b) N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-tyrosyl-L-trypto phanyl-(guanido)N-nitro-argininmethylester (BOC-Tyr-Trp-Arg(NO2)-OMe)
Man löst 15 g BOC-Trp-Arg(NO2)-OMe in 80 ml Sn methanolischer Salzsäurelösung auf und lässt 1 Stunde bei Zimmertemperatur stehen. Nach Verdampfen des Lösungsmittels und Behandeln mit Äther verbleiben 13 g H-Trp-Arg(NO.)-OMe als Hydrochlorid zurück; Smp. 1200, [a]D = -90 in Dimethylformamid. Dieses Dipeptid wird zusammen mit 14 g BOC-Tyr-OCP und 8 g N-Methylmorpholin in 200 ml Dimethylformamid gelöst. Nach 16 Stunden Stehen bei 200 wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand in Essigester aufgenommen.
Nach Waschen mit verdünnter Phosphorigersäure und Einengen des Lösungsmittels kann man mit Hilfe von Äther BOC-Tyr Trp-Arg(NO2)-OMe isolieren; Smp. 1300, [a]D ,= -110 in Dimethylformamid.
c) tert.-Butyloxycarbonyl-L-alanyl-L-tyrosyl
L-tryptophanyl-(guanido)N-nitro-L-arginin methylester (B OC-Ala-Tyr-Trp-Arg(NO2)-OMe)
Man löst 13,5 g BOC-Tyr-Trp-Arg(NO2)-OMe in 130 ml Sn methanolischer Salzsäurelösung auf, lässt 1 Stunde bei 250 stehen, dampft zur Trockne ein, wäscht den Rückstand mit Dimethyläther, filtriert ab, löst in 100 ml Dimethylformamid auf und versetzt mit 8,0 g BOC-Ala-OCP und 3,0 ml Triäthylamin. Nach 16 Stunden bei 25 gibt man 500 ml Essigester hinzu, wäscht mit verdünnter Schwefelsäure und Kaliumbicarbonatlösung und dampft zur Trockne ein. Nach Waschen des Rückstandes mit Chloroform erhält man BOC-Ala-Tyr-Trp-Arg(NO2)-OMe; Smp. 1200 (Zers.), [a]2d = -12 in Dimethylformamid.
d) tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl
L-tyrosyl-L-tryptophanyl-(guanido)N-nitro
L-argininmethylester (B OC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg(NO2)-OMe)
Man löst 12,3 g BOC-Ala-Tyr-Trp-Arg(NO-)-OMe in 100 ml Sn methanolischer Salzsäure, lässt 1 Stunde bei 250 stehen, dampft zur Trockne ein, wäscht den Rückstand mit Diäthyläther, löst ihn in 100 ml Dimethylformamid, versetzt mit 14 ml Triäthylamin und 8,5 g BOC-Ser-.N:3, lässt 16 Stunden bei 0 stehen, gibt 500 ml Essigester zu, wäscht nacheinander mit verdünnter Schwefelsäure und Ammoniumhydroxid, trocknet über Natriumsulfat und dampft das Lösungsmittel ab. Nach Waschen des Rückstandes mit Chloroform löst man ihn in Essigester und fällt durch Zugabe von Di äthyläther.
Man erhält 13,5 g BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp Arg(NO.))-OMe; Smp. 135s (Zers.), [a] D= -150 in Dimethylformamid.
e) tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyi- L-tyrosyl-L-tryptophanyl-L-arginin # Hydrazid
Acetat (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Agr-NHNH- # CH3COOH)
Man löst 13,2 g von dem oben erhaltenen Pentapeptidester in 300 ml Essigsäure, gibt 60 ml Wasser und 13,2 g Palladium-Kohle (10 %ig) zu und hydriert bis zum Ende der Wasserstoffaufnahme. Man filtriert, dampft ab, löst den Rückstand in Dimethylformamid auf, dampft wiederum ab, um die Spuren von Essigsäure zu beseitigen. Anschliessend löst man den Rückstand in 260 ml Methanol, versetzt mit 26 ml Hydrazinhydrat und lässt 16 Stunden bei 400 stehen. Nach Zugabe von 260 ml Diäthyläther filtriert man die ausgeschiedene kristalline Masse ab, wäscht mit Diäthyläther und trocknet im Hochvakuum über Schwefelsäure.
Man erhält BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-NHNH2 CH3COOH; Smp. 1820, [aX2D = -80 in Dimethylformamid.
Teilsequenz Fl
L-Threonyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-valyl L-leucinmethylester Hydrobromid (H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe HBr) a) H-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe HBr
Man löst 21,0 g Z-Cys(Bzl)-OCP und 12,3 g H-Val Leu-OMe HC1 in 120 ml Dimethylformamid.
Danach gibt man 5,9 ml Triäthylamin hinzu, lässt 16 Stunden tei 25 stehen, fügt Essigester hinzu, wäscht mit verdünnter Salzsäure, trocknet über Natriumsulfat, dampft zur Trockne ab und kristallisiert den Rückstand aus Essigsäureäthylester/Diäthyläther. Man erhält Z-Cys (Bzl)-Val-Leu-OMe, Smp. 1600, tau D0 = -280 in Dimethylformamid, das man in 210 ml einer 405Sigen Lösung von Bromwasserstoff in Eisessig löst. Man lässt
1 Stunde bei 250 stehen, dampft zur Trockne ein und kristallisiert den Rückstand aus Isopropanol/Diäthyl äther um.
Man erhält H-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe HBr, Smp. 168 , [a]2d = r 140 in Dimethylformamid.
b) H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe HBr
Man löst 20 g Z-Thr-NHNH.2 in 350 ml Dimethylformamid, kühlt auf -200, gibt 100 ml einer Lösung von 2n Salzsäure in Dioxan und anschliessend noch
10 ml tert.-Butylnitrit zu. Nach 10 Minuten bei -200 werden 45 ml Triäthylamin und 25,5 g H-Cys(Bzl)-Val Leu-OMe HBr hinzugefügt und das erhaltene Gemisch während 16 Stunden bei 0 geschüttelt. Man dampft zur Trockne ein, löst den Rückstand in einem Gemisch von Essigsäureäthylester/Wasser, wäscht die organische Phase mit verdünnter Salzsäure, trocknet über Natriumsulfat, dampft ein und kristallisiert den Rückstand aus Essigester um. Man erhält Z-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu OMe; Smp. 2085, [rr]s -270 in Dimethylformamid.
Man löst 20 g von dem oben erhaltenen Tetrapeptid in 200 ml eines Gemisches von Trifluoressigsäure/Essigester (1:1) auf, leitet während 1 Stunde bei 0 einen Strom gasförmigen Bromwasserstoffs ein, dampft anschliessend ein und kristallisiert den Rückstand aus MethanollDiäthyläther um. Man erhält H-Thr Cys(Bzi)-Val-Leu-OMe. 1,3 HBr; Smp. 2020, [aJ 2D0 = 100 in Dimethylformamid.
Tellsequenz F3
L-Threonyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-valyl-L-leucin (H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OH)
Man löst 372 g H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe HBr (Teilsequenz Fl) in 1800 ml Methanol, fügt 900 ml 2n Natronlauge hinzu, lässt 1 Stunde bei 250 stehen, gibt 240 ml Eisessig zu und lässt 2 Stunden bei 0 stehen. Danach filtriert man die ausgeschiedene kristalline Masse ab, wäscht diese zuerst mit ln Essigsäure, anschliessend mit Wasser und trocknet bei 500 im Hochvakuum. Man erhält das H-Thr-Cys(Bzl)-Val Leu-OH; Smp. 2190, [a]2D= -530 in 1n Ammoniak.
Teilsequenz F2 tert.-Butyloxycarbonyl-S-benzyl-L-cysteinyl
L-seryl-L-asparaginyl-L-leucyl-L-serin-hydrazid (BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser-NH-NH2) a) H-Asn-Leu-Ser-OMe HCl
Man löst 43 g H-Leu-Ser-OMe HCl und 53 g BOC-Asn-ONP in 400 ml Dimethylformamid auf, gibt 22 ml Triäthylamin zu, lässt 16 Stunden bei 250 stehen, dampft zur Trockne ein und kristallisiert den Rückstand aus Methanol um. Man erhält 51,6 g BOC-Asn-Leu Ser-OMe, Smp. 1900, [a] D20 = 240 in Dimethylformamid, das man in 500 ml einer 4n-Lösung von Salzsäure in Methanol löst. Man lässt 1 Stunde bei 250 stehen, dampft zur Trockne ein, löst den Rückstand in Methanol und fällt mit Diäthyläther.
Man erhält H-Asn-Leu-Ser-OMe HCl; Smp. 1800, [a] nEj = -230 in Dimethylformamid.
b) H-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe HCl
Man löst 39,5 g BOC-Ser-NHNH.2 in 500 ml Dimethylformamid, kühlt auf -200, gibt 200 ml einer 2n-Lösung von Salzsäure in Dioxan und anschliessend 20 ml tert.-Butylnitrit zu. Nach 10 Minuten bei -200 werden 40 ml Triäthylamin und 38,0 g H-Asn-Leu-Ser OMe HCl hinzugefügt, danach 16 Stunden bei 0 gerührt, zur Trockne eingedampft und der Rückstand aus ChloroformíDiäthyläther umkristallisiert. Man erhält BOC-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe, Smp. 1350 [a] 20 = -220 in Dimethylformamid, das man in 420 ml einer 4n Salzsäurelösung in Methanol löst.
Man lässt 1 Stunde bei 250 stehen, dampft zur Trockne ein und kristallisiert aus Methanol/Essigsäureäthylester um. Man erhält H-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe HCl, Smp. 1550 (Zers.), [a20 -150 in Dimethylformamid.
c) BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser-NHNH2
Man löst 18,5 g H-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe HCl und 18,0 g BOC-Cys(Bzl)-ONP in 100 ml Dimethylformamid auf, gibt 10 ml Wasser, 3,5 ml Essigsäure und 5,6 ml Triäthylamin zu, lässt 16 Stunden bei 250 stehen, dampft zur Trockne ein und kristallisiert aus Methanol um. Man erhält 25,1 g BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu Ser-OMe, Smp. 1820, [a] 20) = -170 in Dimethylformamid, das man unter leichtem Erwärmen in 200 ml Dimethylformamid löst. Man gibt 200 ml Methanol und 20 ml Hydrazinhydrat zu, lässt 16 Stunden bei 300 stehen, fällt mit Diäthyläther, wäscht den Niederschlag mit Diäthyläther/Methanol (1:1) und trocknet das so erhaltene BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser-NHNH2, Smp.
2240, [a] D0= 130 in Dimethylformamid.
Teilsequenz F tert.-Butyloxycarbonyl-L-hemicystinyl-L-seryl L-asparaginyl-L-leucyl-L-seryl-L-threonyl L-hemicystinyl-L-valyl-L-leucin-hydrazid
EMI7.1
Man löst 18,4 g BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser- NHNHo (Teilsequenz F2) in 150 ml Dimethylformamid, kühlt auf 200, gibt 40 ml einer 2n-Lösung von Salzsäure in Dioxan und 15 ml tert.-Butylnitrit zu.
Nach 10 Minuten bei 200 gibt man noch 28 ml Tri äthylamin und 24,8 g H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe.
1,3 HBr (Teilsequenz F1) zu und rührt 16 Stunden bei 250. Danach wird filtriert, die Lösung eingedampft und der Rückstand mit heissem Methanol durchgewaschen.
Man erhält BOC - Cys(Bzl) - Ser - Asn - Leu-Ser-Thr-Cys (Bzl)-Val-Leu-OMe, Smp. 242-2440, [a]D = -250 in Dimethylformamid, das man bei 600 in 100 ml Dimethylformamid löst. Man gibt 10 ml Hydrazinhydrat zu und lässt 2 Stunden bei 600 stehen; das entstandene Nonapeptidhydrazid kristallisiert aus. Man wäscht mit Diäthyläther, Wasser und Methanol und trocknet im Hochvakuum über Phosphorpentoxid. Man erhält Nonapeptidhydrazid vom Smp. 2600 (Zers.), [a] 2E) = -33 in Dimethylformamid/Wasser (3 1). Man löst das erhaltene Produkt in 5000 ml getrocknetem Ammoniak, gibt unter Rühren und Sieden des Ammoniaks Natriummetall bis zur tiefblauen Färbung zu. Zwecks Entfärbung wird Ammoniumchlorid hinzugefügt und danach ein Luftstrom bis zur negativen Nitroprussiatreaktion durch die Lösung geleitet.
Man dampft zur Trockne ein und wäscht den Rückstand mit Wasser durch. Nach Trocknen erhält man
EMI7.2
EMI7.3
Smp. 298 (Zers.), [a]2D= -- 200 in Dimethylformamid/Wasser (3 :1).
Teilsequenz F4 tert.-Butyloxycarbonyl-L-hemicystinyl-L-seryl
L-asparaginyl-L-leucyl-L-seryl-L-threonyl- L-hemicvstinvl-L-valvl-L4eucin
EMI7.4
Man löst 18,4 g BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser- NHNH2 (Teilsequenz F2) in 150 ml Dimethylformamid, kühlt auf -200, gibt 40 ml einer 2n-Lösung von Salzsäure in Dioxan und 15 ml tert.-Butylnitrit zu. Nach 10 Minuten bei -200 gibt man noch 28 ml Triäthylamin und 16,2 g H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OH (Teilsequenz F3) zu und rührt 16 Stunden bei 250. Danach wird filtriert, die Lösung eingedampft und der Rückstand mit in Essigsäure durchgewaschen.
Man erhält
BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr
Cys(Bzl)-Val-Leu-OH, Smp. 2170, [a] 2D = -27 in Dimethylformamid.
Man löst das erhaltene Produkt in 5000 ml getrocknetem Ammoniak, gibt unter Rühren und Sieden des Ammoniaks Natriummetall bis zur tiefblauen Färbung zu. Zwecks Entfärbung wird Ammoniumchlorid hinzugefügt. Man dampft zur Trockne ein und wäscht den Rückstand mit in Essigsäure und Aceton durch.
Nach Trocknen erhält man BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser Thr-Cys-Val-Leu-OH, Smp. 2480 (Zers.), [a] 2D0= -41 0 in Dimethylformamid/Wasser (7: 3).
Man löst das erhaltene Nonapeptid in 5000 ml 0,01n Ammoniak auf, gibt unter Rühren in Wasserstoffperoxyd bis zur negativen Nitroprussiatreaktion hinzu, dann noch 200 ml Eisessig, filtriert und lvophi- lisiert. Man erhält
EMI7.5
Val-Leu-OH, Smp. 238 (Zers.), [a];B = -18 in Dimethylformamid/Wasser (3 1).
Teilsequenz ABC
Nim-Trityl-L-histidyl-L-arginyl-L-phenylalanyl-
L-seryl-glycyl-L-norleucyl-glycyl-L-phenyl- alanyl-glycyl-L-prolyl-L-glutamyl-L-threonyl-
L-prolinamid Triacetat (H-His(Trt)-Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly Pro-Glu-Thr-Pro-NH2- 3 CH3COOH) a) L-Seryl-glycyl-L-norleucyl-glycyl-L-phenyl- alanyl-glycyl-L-prolyl-L-glutamyl-L-threonyl- L-prolinamid. Tetrahydrochlorid (H-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr
Pro-NH2 - 4 HCl)
Man löst 12 g H-Phe-Gly-Pro-Glu(OTB)-Thr-Pro NH in 100 ml Dimethylformamid und 20 ml Acetonitril bei 0 und gibt 2,1 g Hydroxysuccinimid, 8,0 g Z-Ser-Gly-Nle-Gly-OH, 4,0 g Dicyclohexylcarbodiimid zu,
lässt über Nacht bei 0 stehen, abfiltriert, verdampft im Vakuum und kristallisiert aus Chloroform. Man erhält Z-Ser- Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu(OTB)-Thr- Pro-NHe, Smp. 125-1380, [oj 2D = 440 in Dimethylformamid.
Man löst in 400 ml Dioxan und 400 ml HCl/Dioxan und hydriert bei Normaldruck in Gegenwart von Palladiumkatalysator und Säure bis zum Ende der Wasserstoffaufnahme. Man filtriert, dampft im Vakuum ein, löst in Methanol, versetzt mit Äther und erhält
H-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr
Pro-NH2 # 4 HCI, Smp. 1300 (Zers.), tal D = -52 in Dimethylformamid.
b) Nim-Trityl-L-histidyl-L-arginyl-L-phenylalanyl-
L-seryl-glycyl-L-norleucyl-glycyl-L-phenyl alanyl-glycyl-L-propyl-L-glutamyl-L-threonyl-
L-prolinamid Triacetat (H-His(Trt)-Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly Pro-Glu-Thr-Pro-NH2- 3 CH3CO2H)
Man löst 9,9 g N-Trt-Ni'-Trt-His-Arg-Phe-NHNHe HC1 in 100 ml Dimethylformamid, kühlt auf -200, gibt 30 ml Dioxan/HCl 2n und anschliessend 1,16 ml tert. Butylnitrit zu, rührt 10 Minuten bei -200, gibt 28 ml Triäthylamin und 9,7 g H-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 HCl zu, rührt 4 Stunden bei 00, filtriert und dampft zur Trockne ein.
Man löst den Rückstand in einem Gemisch von Essigester/Methanol (8 : 2) auf, wäscht mit verdünntem Ammoniak und anschliessend mit Wasser bis Neutralität, trocknet über Natriumsulfat, konzentriert auf 100 ml und fällt durch Zugabe von Diäthyläther. Man löst den Niederschlag wiederum in Dimethylformamid auf und fällt durch Zugabe von Diäthyläther. Man erhält Trt-His (Trt)-Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-
Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NHO [Smp. 1680 (Zers.), [aJ 2D0 - -430 in Dimethylformamid], das man in 500 ml Essigsäure/Wasser (8 : 2) löst. Man lässt 3 Stunden bei 400 stehen, dampft ein, wäscht den Rückstand in Diäthyläther und trocknet im Hochvakuum über KOH-Spänen.
Man erhält
H-His (Trt)-Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe- Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2- 3 CH3COOH, Smp. 1800 (Zers.), [a]20 = 610 in Essigsäure.
Teilsequenz DE N-tert.-B utyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-
L-tyrosyl-L-tryptophanyl-L-arginyl
L-asparaginyl-L-leucyl-L- asparaginyl
L-asparaginyl-L-phenylalanin-hydrazid Diacetat (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn Phe-NHNH2- 2 CH3COOH) a) 1 -(N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl
L-tyrosyl-L-tryptophanyl-L-arginyl L-asparaginyl-L4eucyl-L-asparaginyl
L-asparaginyl-L-phenylalanin)-2-benzyloxy carbonyl-hydrazid Diacetat (B O C-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-
Phe-NH-NH-Z 2 CH3COOH)
Man kühlt 320 ml Dimethylformamid auf -200 C,
gibt 100 ml 2n Chlorwasserstoff in Dioxan zu und löst darin 68 g BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-NHNH2 Acetat (Teilsequenz E). Anschliessend versetzt man mit 12 ml tert.-Butylnitrit, lässt 10 Minuten bei -200 rühren und tropft 35 ml Triäthylamin zu. Das so erhaltene Gemisch wird mit einer Lösung, entstanden aus 8,8 g H-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NHNH-Z Tri- fluoracetat (Teilsequenz D) und 17 ml Triäthylamin in 150 ml Dimethylformamid vereinigt. Nach 16 Stunden Stehenlassen bei 0 wird eingedampft. Man löst den Rückstand in Essigester/Butanol und wäscht mit verdünnter Essigsäure und Ammoniaklösung.
Nach Eindampfen des Lösungsmittels verbleibt das
BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn
Phe-NHNH-Z 2 CH3COOH vom Smp. 1750, [a]D = -19,50 in Dimethylformamid.
b) tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl
L-tyrosyl-L-tryptophanyl-L-arginyl
L-asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl
L-asparaginyl-L-phenylalanin Hydrazid Diacetat (B OC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn- Phe-NHNH2 2 CH3COOH)
Man löst 90 g BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu Asn-Asn-Phe-NHNH-Z- 2 CH3COOH in 500 ml Dimethylformamid und hydriert mit 10 g Pd/C (10%ig) bis zum Ende der Wasserstoffaufnahme. Nach Abfiltrieren des Katalysators wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand aus einem Gemisch von Äther und Äthanol kristallisiert.
Man erhält B OC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn- Phe-NHNH2 2 CH3COOH vom Smp. 2650, [a] r) = -570 in Dimethylformamid.
Teilsequenz ABCDE L-Seryl-L-alanyl-L-tyrosyl-L-tryptophanyl-
L-arginyl-L-asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl
L-asparaginyl-L-phenylalanyl-L-histidyl L-arginyl-L-phenylalanyl-L-seryl-glycyl-
L-norleucyl-glycyl-L-phenylalanyl-glycyl
L-prolyl-L-glutamyl-L-threonyl- L-prolinamid. Hexa-trifluoracetat (H-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn
Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly Pro-Glu-Thr-Pro-NH2- 6 CF3CO2H)
Man löst 15,2 g BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn Leu-Asn-Asn-Phe-NHNH2 - Diacetat (Teilsequenz DE) in 200 ml Dimethylformamid,
kühlt auf -200, gibt 15 ml Dioxan/HCl 2n und anschliessend 1,16 ml tert. Butylnitrit zu und rührt 10 Minuten bei -200. Man gibt 14 ml Triäthylamin und eine Lösung von 18,6 g des in Teilsequenz ABC erhaltenen Tridecapeptidazetats zu, rührt das erhaltene Gemisch 16 Stunden bei 00, filtriert und dampft zur Trockene ein. Man wäscht den Rückstand mit Diäthyläther und mit Chloroform, löst in Dioxan/Wasser (8 2), behandelt die erhaltene Lösung mit 100 ml Amberlit-IRA-4l0 (Acetat-Form), dampft ein und kristallisiert den Rückstand aus Isopropanol/Wasser um.
Man erhält das
B OC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn
Phe-His(Trt)-Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe
Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 . Acetat, Smp. 1450 (Zers.), [a]2,0 = -710 in Essigsäure, das man unter Stickstoffatmosphäre in 500 ml Trifluoressigsäure löst. Man lässt 1 Stunde bei 250 stehen, konzentriert auf 100 ml und fällt durch Zugabe von 1000 ml Di äthyläther. Man filtriert, löst den Rückstand in Dimethylformamid und fällt mit Diäthyläther. Nach.
Trocknen über KOH-Späne erhält man das
H-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn
Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly Pro-Glu-Thr-Pro-NHz 6 CF3CO2H, Smp. 1300 (Zers.), [a]2,0 = -450 in Essigsäure.
Beispiel tert.-Butyloxycarbonyl-L-hemicystinyl-L-seryl L-asparaginyl-L-leucyl-L-seryl-L-threonyl-
L-hemicystinyl-L-valyl-L-leucyl-L-seryl-
L-alanyl-L-tyrosyl-L-tryptophanyl-L-arginyl L-asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl-
L-asparaginyl-L-phenylalanyl-L-histidyl
L-arginyl-L-phenylalanyl-L-seryl-glycyl
L-norleucyl-glycyl-L-phenylalanyl-glycyl
L-prolyl-L-glutamyl-L-threonyl
L-prolinamid Hexaacetat Octahydrat
EMI8.1
Leu-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn
Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly Pro-Glu-Thr-Pro-NH2. Hexaacetat Octahydrat)
1.
Methode
Man löst 1,05 g Nonapeptid-Hydrazid (Teilsequenz F) in einem Gemisch von 50 ml Dimethylformamid und 1,2 ml Dioxan/HCl 2n bei -200. Man gibt 0,116 ml tert.-Butylnitrit zu, rührt 10 Minuten bei -200, gibt
1,4 ml Triäthylamin und 3,1 g Tricosapeptid-Hexa-Tri fluoracetat (Teilsequenz A, B, C, D, E) und 5 ml Was ser zu und rührt 16 Stunden bei 00. Man dampft zur
Trockne ein, wäscht den Rückstand mit Diäthyläther,
Chloroform und Aceton. So erhält man das rohe, ge schützte Dotriacontapeptid, das man in 100 ml 0,3n Essigsäure löst, mit 20 ml Amberlit-IRA-410 (Acetat) behandelt und gibt 50 ml 0,6n Ammoniumhydroxid hinzu. Man stellt das pH auf 6,5 ein und schichtet die erhaltene Lösung auf eine Carboxymethylcellulosesäule (10 X 100 cm), die mit einer 0,15n Ammoniumacetatpufferlösung equilibriert wurde.
Die Elution wird mit einem steigenden Konzentrations- und pH-Gradient (0,lSn auf 0,4n; pH 6,5 auf pH 7,0) eines Ammonium acetatpuffers durchgeführt. Die vereinigten Fraktionen, die das reine Peptid enthalten, werden dreimal gefrier getrocknet, der Rückstand mit Äthanol und anschlie ssend mit Diäthyläther gewaschen und über Kalium hydroxid im Hochvakuum getrocknet. Man erhält
EMI8.2
SeÀla-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-
Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly Pro-Glu-Thr-Pro-NHz 6 CH8COH 8 H20, Smp. 2200 (Zers.), [a]2,0 = -580 in Essigsäure ln.
Aminosäurezusammensetzung nach Säurehydrolyse (6n, 16 Std.): Ala1,1, Args.o, Asn0,9, Cys/21,6, Glu1,2, Gly8.0, His11, Leu2,g, Nlel,o, Phe3,0, Pro.1, Ser.s, Thr1,9, Tyr1,0, Valor (Trp 1,0 durch Spektrophotometrie).
2. Methode
Man löst 1,0 g Nonapeptid (Teilsequenz F4) in
10 ml Dimethylformamid, gibt 1,5 g N-Hydroxysuccinimid und 0,52 g Dicyclohexylcarbodiimid hinzu, rührt
6 Stunden bei 250, filtriert und dampft das Filtrat zur Trockne ein. Man wäscht den Rückstand mit Essigester und Diäthyläther und trocknet. Man erhält 1,2 g
EMI9.1
Smp. 2420, das man in 10 ml Dimethylformamid löst, gibt
3,1 g Tricosapeptid-Trifluoracetat (Teilsequenz A, B,
C, D, E), 0,4 ml Triäthylamin und 1,2 g N-Hydroxysuccinimid zu und rührt 16 Stunden bei 250. Man dampft zur Trockne ein, wäscht den Rückstand mit Diäthyläther, Chloroform und Aceton. So erhält man das rohe, geschützte Dotriacosapeptid, das man in
100 ml 0,3n Essigsäure löst, mit 20 ml Amberlit-IRA410 (Acetat) behandelt und gibt 50 ml 0,6n Ammo niumhydroxid hinzu.
Man stellt das pH auf 6,5 ein und schichtet die erhaltene Lösung auf eine Carboxymethylcellulosesäule (10 X 100 cm), die mit einer 0,15n-Ammoniumacetatpufferlösung equilibriert wurde.
Die Elution wird mit einem steigenden Konzentrationsund pH-Gradient (0,15n auf 0,4n; pH 6,5 auf pH 7,0) eines Ammoniumacetatpuffers durchgeführt. Die vereinigten Fraktionen, die das reine Peptid enthalten, werden dreimal gefriergetrocknet, der Rückstand mit Äthanol und anschliessend mit Diäthyläther gewaschen und über Kaliumhydroxid im Hochvakuum getrocknet.
Man erhält
EMI9.2
Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-
Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly Pro-Glu-Thr-Pro-NH2- 6 CH3CO2H- 8 H2O, Smp. 2260 (Zers.), [a] 2D0 = -58 in Essigsäure in.
Aminosäurezusammensetzung nach Säurehydrolyse (6n, 16 Std.): Ala1,1, Arg2,0, Asn3,9, Cys/21.6, Glu1,2, Gly8.0, His1,1, Leu2,9, Nlel,o, Phea.o, Pro2,l, Ser3,8, Thrl,s, Tyr1,0, ValOg (Trp 1,0 durch Spektrophotometrie).
Process for the production of a previously unknown polypeptide derivative
The present invention relates to a process for the preparation of a previously unknown polypeptide derivative of the formula
EMI1.1
11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Ala-Tyr-TrpArg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-A rg- 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 Phe-Ser-Gly- Nle - Gly-Phe -Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NHg, its therapeutically effective acid addition salts and heavy metal complexes.
The polypeptide derivative according to the invention is characterized by resistance to the degrading
Effect of aminopeptidases. Another advantage is the well-known oxidation-resistant norleucine
Rest in position 25.
The previously unknown polypeptide derivative can be prepared by methods generally known for the synthesis of compounds of this type, the
Amino acids are linked to one another in the order specified in the above formula, individually or after prior formation of smaller peptide units, by using the appropriate components for its structure
Compounds condensed with one another to form CONH bonds in any order in time, with free functional groups not participating in the reaction being protected by suitable protective groups at any point in time
Synthesis of the protecting groups with the exception of the BOC
The group in position 1 is split off, the mercapto groups are oxidized to the disulfide after formation of the sequence 1 to 7 and the carboxyl group of the terminal Prolyl radical is converted into the amide group.
In the last stage, however, methods are to be used in which race mization does not occur or can be kept low, preferably the azide or the activated ester
Method whereby N-Hydro oxysuccinimide is preferably used for activation. The benzyl radicals used in cysteine-containing peptides to protect the SH groups are usually split off at the end of the synthesis by treatment with sodium in liquid ammonia.
It has now been found that the splitting off of the benzyl protective groups and the production of the (Cys) S S (Cys) bond before the last stage lead to particularly good yields of the end product.
In the construction of the new polypeptide derivative, the tert-butyloxy group have proven useful for blocking the γ-carboxyl group, for example in the partial sequence A described below, but other protective groups such as methoxy, ethoxy, tert-amyloxy can also be used -, the amide or the benzyloxy group can be used.
The triphenylmethyl group has proven useful for blocking the imidazole group of the histidine residue in the partial sequence C described below, but other suitable protective groups, such as the carbo-tert. - butoxy, the carbo - tert. - amyloxy, the carbobenzoxy or the benzyl group can be used.
The nitro group was used to block the guanido group of the arginine residue in the partial sequence E described below, but other suitable protective groups, such as the tosyl group, the p-nitrobenzoxycarbonyl group or the 9- (isopropyloxycarbonyl) -3,4,5,6-tetrachloro - benzoyl group can be used. The protective effect of protonation of the guanido group can also be used in the synthesis.
The new polypeptide derivative can also be obtained or used in the form of its salts. Salts include those with organic acids, such as acetic acid, propionic acid, glycolic acid, lactic acid, pyruvic acid, malonic acid, succinic acid, maleic acid, fumaric acid, tartaric acid, citric acid, benzoic acid, cinnamic acid, salicylic acid, 2-phenoxy- or 2-acetoxy-benzoic acid, mandelic acid , Methanesulphonic acid, ethanesulphonic acid, hydroxyethanesulphonic acid, benzene or toluenesulphonic acid, naphthalenesulphonic acid, sulphanilic acid and polymeric acids such as tannic acid, alginic acid, polygalacturonic acid, polyphloretin phosphate, or carboxymethyl cellulose and salts with inorganic acids, such as hydrohalic acids. B. hydrochloric acid or hydrobromic acid, nitric acid, thiocyanic acid, sulfuric acid and phosphoric acid in question.
As a heavy metal complex z. B. the one from ZinkE3 in question.
The starting products for the production of the new polypeptide derivative can, if they were not previously known, be obtained by the methods known for peptide chemistry, the amino acids being linked to one another individually or after prior formation of smaller peptide units.
The new compound represents an important therapeutic principle that lowers the calcium plasma level, in particular the increased calcium plasma level, and, as an antagonist of the parathyroid hormone, causes a positive calcium balance in the bones.
It is therefore indicated for all conditions in which a lowering of the plasma calcium level is desired, e.g. B. Hypercalcemias of various origins, deficiency of endogenous thyreocalcitonins as a result of loss of thyroid tissue, hyperfunction of the parathyroid glands.
The new compound is indicated for all bone affections that are based on increased breakdown or in which increased calcium fixation in the bone is desired, e.g. B. Osteoporosis of various origins (e.g. post-climacteric, post-traumatic, caused by corticosteroid therapy or inactivity, etc.), fractures, osteomalacia, rickets and especially for combination therapy with calcium or
Phosphate. Biological testing of the new compounds showed an efficacy of about 100 to 450 MRC units / mg peptide. The required daily dose (administered in the same way) in MRC units is 20 mE to 10E, preferably 100 mEjkg animal weight.
In humans, the daily dose (i.m.
administered) in MRC units 1 to 500 U. A daily dose of 5 U i. m. administered.
The new compound can be used as a remedy, e.g. B.
in the form of pharmaceutical preparations, use. These contain the compound mentioned in a mixture with an organic or inorganic carrier material suitable for parenteral administration. For the same, those substances come into question that do not react with the new compound, such as. B. gelatin, lactose, starch, magnesium stearate, talc, vegetable oils, benzyl alcohols, gum arabic, polyalkylene glycols, petroleum jelly, cholesterol or other known pharmaceutical carriers.
The pharmaceutical preparations can e.g. B. in liquid form as solutions, suspensions or emulsions. If necessary, they are sterilized and / or contain auxiliaries such as preservatives, abilizers, wetting agents or emulsifiers. They can also contain other therapeutically valuable substances. The new compound can also be administered in the form of a depot preparation.
The new compound and its salts can also be used as intermediates for the production of pharmaceutical preparations.
The following abbreviations are used:
Z = benzyloxycarbonyl
Bzl = benzyl
BOC = tert-butyloxycarbonyl
Tritol = trityl = triphenylmethyl
OTB = tert-butyloxy
ONP = p-nitrophenyl ester
OCP = 2,4,5-trichlorophenoxy
OMe = methoxy
OEt = ethoxy NO2 = nitro
Ser = L-seryl
Asn = L-asparaginyl
Leu = L-leucyl
Thr = L-threonyl
Val = L-valyl
Ala = L-alanyl
Tyr = L-tyrosyl
Trp = L-tryptophanyl
Arg = L-arginyl
Phe - L-phenylalanyl
Glu = L-glutamyl
His = L-histidyl
Pro = L-prolyl
Gly = glycyl
Nle = L-norleucyl
Cys = L-cysteinyl
OSu = oxysuccinimide
In the following examples, which illustrate the implementation of the process but are not intended to restrict the scope of the invention in any way, all temperatures are given in degrees Celsius.
Partial sequence A L-phenylalanyl-glycyl-L-prolyl- γ-tert-butyloxy-
L-glutamyl-L-threonyl-L-prolinamide (H-Phe-Gly-Pro-Glu (OTB) -Thr-Pro-NH2)
Dissolve 134 g of Z-Thr-NH-NH2 in 2 liters of hydrochloric acid at -5.55 liters of sodium nitrite. After 5 minutes, potassium carbonate is added to pH 9, the azide formed is extracted with ethyl acetate and a solution of 80 g of H-Pro-NH2 hydrochloride in 100 ml of water, 500 ml of dimethylformamide and 77 ml of triethylamine is added. The ethyl acetate is evaporated at 200 in vacuo and left to stand at 250 overnight.
The remaining solution is evaporated in vacuo, the residue dissolved in ethyl acetate, the solution washed with water, dilute hydrochloric acid and an aqueous potassium carbonate solution and dried over sodium sulfate. It is evaporated in vacuo, dissolved in warm ethyl acetate and cooled.
Z-Thr-Pro-NH2 is obtained .; M.p. 1480, [α] D20 = -72 in 95 S acetic acid.
90 g of Z-Thr-Pro-NHe are then dissolved in 2 liters of dioxane and 260 ml of In hydrochloric acid and hydrogenated at 200 and normal pressure in the presence of a palladium catalyst. It is filtered, the solution evaporated in vacuo, the residue is washed with ethyl acetate and H-Thr-Pro-NH2 HCl is obtained; M.p. 2160, [ct] 2rg = -640 in 95% acetic acid. This is dissolved in 500 ml of dimethylformamide, 50 ml of water and 32 ml of triethylamine, and 118 g of Z-Glu (OTB) -OCP and 800 ml of tetrahydrofuran are added. The mixture is left to stand at 200 overnight, evaporated in vacuo and the residue is crystallized with ethyl ether.
Z-Glu (OTB) -Thr-Pro-NH2, melting point 650 (decomp.), [A] 2E0) = -180 in dimethylformamide is obtained.
80 g of Z-Glu (OTB) -Thr-Pro-NH are dissolved; in 1.5 liters of dioxane and 200 ml of water and hydrogenated at 200 and normal pressure in the presence of a palladium catalyst. The solution is filtered and evaporated in vacuo and diethyl ether is added to the residue, H-Glu (OTB) -Thr-Pro-NH3 being obtained; M.p.
650 (dec.), {O 2rg = -280 in dimethylformamide.
This is dissolved in 700 ml of dimethylformamide at 0, 200 ml of acetonitrile, 68 g of Z-Phe-Gly-Pro-OH and 32 g of dicyclohexylcarbodiimide are added, left to stand overnight at 200, filtered, evaporated in vacuo and ethyl acetate is added. The solution is then washed with water, dilute hydrochloric acid and aqueous potassium carbonate solution, dried over sodium sulfate, evaporated in vacuo and the residue is crystallized from ethyl acetate / ethyl ether. Z-Phe-Gly-Pro-Glu (OTB) -Thr-Pro-NH2 is obtained; Mp. 1200 (decomp.), Tc] D0 = -660 in dimethylformamide, which is dissolved in 1500 ml of dioxane and 300 ml of water. 30 g of palladium-carbon (10%) are added and the mixture is hydrogenated until hydrogen uptake has ceased.
It is filtered, the filtrate is evaporated and the residue is crystallized from dioxane. The H-Phe-Gly-Pro-Glu (OTB) -Thr-Pro-NH2 is obtained; M.p. 1530, [a] D0 = 790 in dimethylformamide.
Partial sequence B
Benzyloxycarbonyl-L-seryl-glycyl-L-norleucyl glycine (Z-Ser-Gly-Nle-Gly-OH) a) Benzyloxycarbonyl-L-norleucyl-glycine (Z-Nle-Gly-OH)
31.6 g of H-Gly-OH are dissolved in 420 ml of NaOH, 840 ml of tetrahydrofuran are added, 130 g of Z-Nle-ONP are then added, and the mixture is shaken until the solution becomes clear, and left to stand at 250 for one night. It is then concentrated to 500 ml in vacuo and the aqueous solution obtained is adjusted to pH 9 with NaOH, extracted twice with ether, then acidified with 4N hydrochloric acid and extracted with ethyl acetate. The ethyl acetate solution is washed with water and 30% sodium chloride solution, dried over sodium sulphate and evaporated in vacuo.
The residue is triturated with ether and allowed to crystallize for 2 hours at -200. One obtains Z-Nle-Gly-OH, m.p. 1380, [a] D20 = M0 in Dimethylformamid¯ b) Benzyloxycarbonyl-glycyl-L-norleucyl-glycine (Z-Gly-Nle-Gly-OH)
100 g of Z-Nle-Gly-OH are dissolved in 1000 ml of 4N HBr / glacial acetic acid, left at 250 for 50 minutes, rubbed with ether, crystals filtered off and washed well with ether.
HBr-H-Nle-Gly-OH, [a] 2D = +24.70 in acetic acid (95%) is obtained.
84 g of Br-H-Nle-Gly-OH are dissolved in 240 ml of water, and 152 ml of 4N NaOH, 800 ml of tetrahydrofuran and 91 g of Z-Gly-ONP are added. Shake at 250 for 1 hour and then let stand at 250 for 2 days.
It is concentrated to 500 ml in vacuo, adjusted to pH 9 with NaOH and extracted with ether. The aqueous phase is acidified with hydrochloric acid, then extracted twice with ethyl acetate. It is washed with water, 30% sodium chloride solution, dried over sodium sulfate, evaporated in vacuo and the residue is triturated with ether. Z-Gly-Nle-Gly-OH, m.p. 1550, [0] 2D0 = -5.60 in dimethylformamide is obtained.
c) Benzyloxycarbonyl-L-seryl-glycyl-L-norleucyl-glycine (Z-Ser-Gly-Nle-Gly-OH) Dissolve 89.5 g of Z-Gly-Nle-Gly-OH in 900 ml of 4n H! 3r Glacial acetic acid, left to stand for 50 minutes at 250, evaporated in vacuo, rubbed with ether, filtered, washed well with ether, dried in vacuum, dissolved in 280 ml of water, about 650 ml of dimethylformamide, added 66.5 ml of triethylamine and added with the solution of the azide, which is obtained as follows:
:
940 ml of hydrochloric acid are cooled to -5, 96 g of Z-Ser-NH-NHs are added and 360 ml of sodium nitrite are then added dropwise at -5, stirred for a further 6 minutes at -5, covered with about 600 ml of 00 ethyl acetate, adjusts to pH 8.5 with the addition of solid sodium carbonate, separates the ethyl acetate phase, extracts again, the solution is dried over sodium sulfate and filtered.
The reaction solution is evaporated in vacuo, the residue is treated with 600 ml of water, acidified, extracted with ethyl acetate, washed with water and 30% sodium chloride solution, cooled to 00, and crystals are filtered off. Z-Ser-Gly-Nle-Gly-OH, m.p. 2100 (with decomp.), [A] 2D = 80 in dimethylformamide is obtained.
Partial sequence C
Na, Nimid-Ditrityl-L-histidyl-L-arginyl-L-phenylalanine hydrazide. HCl (Trt-His (Trt) -Arg-Phe-NH-NH2 HCl) a) Z-Arg (NO2) -Phe-OMe
51.8 g of H-Phe-OMe HCl are dissolved in 1 liter of ether and about 50 ml of ice water and enough sodium carbonate is added with stirring and cooling until all of the water has set. It is filtered and the filtrate is evaporated to constant weight, a colorless oil being obtained.
67.6 g of Z-ArgNO. -OH are dissolved in 300 ml of acetonitrile and 150 ml of dimethylformamide, and 41.2 g of H-Phe-OMe are added. It is then cooled to -200 and a solution of 43.4 g of dicyclohexylcarbodiimide in 100 ml of acetonitrile is added. The whole thing is left in the ice box for 4 hours while shaking from time to time. The resulting precipitate is filtered off and the filtrate is evaporated. The evaporation residue is dissolved in 1 liter of ethyl acetate and then washed in the cold with sodium hydroxide solution, water, sulfuric acid, water and saturated sodium chloride solution. The ethyl acetate phase, dried over sodium sulfate, is completely evaporated. After recrystallization from ethyl acetate petroleum ether, Z-Arg (NO2) -Phe-OMe is obtained; M.p.
131-1330, [aJD- = -70 in methanol, 40 in dimethylformamide.
b) H-Arg (NO) -Phe-OMe 0.5 H2O # 1.2 HBr
20 g of Z-Arg (NO2) -Phe-OMe are dissolved in 50 ml of glacial acetic acid and 50 ml of 40% strength hydrobromic acid in glacial acetic acid are added with slight cooling. Then the whole thing is left to stand at 200 for 1 hour while being shaken from time to time. After complete evaporation, the residue is dissolved in 200 ml of water and washed twice with ether. The aqueous phase is completely evaporated and the residue is recrystallized from methanol / ether. M.p. 165-1670 with decomposition, kl D = + 180 in methanol, + 140 in dimethylformamide.
c) Z-His (Z) -Arg (NO) -Phe-OMe
46.1 g of H-Arg (NtOe) -Phe-OMe 0.5 H2O # 1.2 HBr are dissolved in 100 ml of water, then heated and then cooled. After adding chloroform and ice, the pH is adjusted to 9 with ammonia. The chloroform phase is washed once more with water, then dried over sodium carbonate and filtered off. A solution of 44.5 g of Z-His (Z) -OH, 12.1 g of hydroxysuccinimide in 200 ml of acetonitrile and 100 ml of pyridine is added to the filtrate, then the whole is cooled to -200 and treated with a solution of 21.1 g Dicyclohexylcarbodiimide in 70 ml of acetonitrile was added. The mixture is then left to stand for 4 hours in the ice chest with occasional stirring.
The resulting precipitate is filtered off and the filtrate is evaporated. The residue is taken up in ethyl acetate and then washed as follows: 10 violet potassium carbonate solution (pH 10), water, saturated saline solution, water, saturated saline solution, sulfuric acid (pH 3), water, saline solution. The ethyl acetate phase, dried over sodium sulfate, is evaporated completely, a light beige foam being obtained. This foam is dissolved twice in a little methanol and precipitated with ether. The ether phases are decanted off and the precipitate is dried; one obtains Z-His (Z) Arg (NO.>) -Phe-OMe (amorphous foam), [a] 2rg = -8 in methanol, -8 in dimethylformamide.
d) H-His-Arg-Phe-OMe. 4 HCl
25 g of Z-His (Z) -Arg (NO) -Phe-OMe are dissolved in 800 ml of glacial acetic acid. Then 10 g of 10 S palladium on activated charcoal are stirred in 200 ml of hydrochloric acid and added to the solution. The whole is subjected to a 2 hour hydrogenation and then the catalyst is filtered off. The filtrate is again admixed with 5 g of 10% palladium on activated carbon in water and subjected to hydrogenation, which is complete after 51A hours. About 80 of the theoretical amount of hydrogen is consumed here. The catalyst is filtered off and the filtrate is evaporated completely, H-His-Arg-Phe-OMe # 4 HCl being obtained in the form of an amorphous foam.
e) Trt-His (Trt) -Arg-Phe-OMe HCI
21.5 g of H-His-Arg-Phe-OMe4 HCl are dissolved in 100 ml of pyridine and about 100 ml of dimethylformamide. At about; 50 is added to pH 9 triethylamine and then a solution of 29 g of trityl chloride in 300 ml of pyridine is added dropwise over 5 minutes. After the addition is complete, the pH is checked from time to time and, if necessary, adjusted to about pH 9 with triethylamine. The whole is evaporated after about 4 hours, the residue is taken up in chloroform and water and adjusted to pH 4 with the addition of a little hydrochloric acid. The chloroform phase is separated off, washed twice with water, dried over sodium sulfate and completely evaporated.
Ether is added to the residue and the ether is then filtered off, Trt-His (Trt) Arg-Phe-OMe HCl being obtained.
f) Trt-His (Trt) -Arg-Phe-NH-NH3-HCl
17 g of Trt-His (Trt) -Arg-Phe-OMe. HC1 are dissolved in 200 ml of methanol and mixed with 40 ml of hydrazine hydrate. It is then left to stand for 2 days at room temperature. It is evaporated, the residue is dissolved in chloroform and washed twice with water. The chloroform phase is dried over sodium sulfate and evaporated. The residue is then washed with ether and filtered off; it consists of Trt His (Trt) -Arg-Phe-NH-NH.2 HCl; [α] D18 = 90 in dimethylformamide, m.p.1580.
Partial sequence D
1- (L-asparaninyl-L-leucyl-L-asparaginyl-
L-asparaginyl-L-phenylalanine) -2-benzyloxycarbonyl-hydrazide. Trifluoroacetate (H-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z CF3COOH) a) 1- (N-tert-butyloxycarbonyl-L-phenylalanine) -
2-benzyloxycarbonyl hydrazide (BOC-Phe-NH-NH-Z)
72 g of BOC-Phe-OH and 28 g of N-methylmorpholine are dissolved in 500 ml of methylene chloride and 26 ml of methyl chloroformate are added dropwise at -5. After 10 minutes, 44 g of Z-NHNHe in 100 ml of methylene chloride are added and the mixture is stirred for a further 4 hours at room temperature. After washing with dilute phosphoric acid, it is dried and evaporated.
Crystallization from petroleum ether gives BOC Phe-NH-NH-Z of mp 117, [α] D20-5 in dimethylformamide.
b) l- (N-tert-butyloxycarbonyl-L-asparaginyl-
L-phenylalanine) -2-benzyloxycarbonyl-hydrazide (BOC-Asn-Phe-NH-NH-Z)
41 g of BOC-Phe-NHNH-Z are dissolved in 400 ml of trifluoroacetic acid and left to stand at 200 for one hour.
When the trifluoroacetic acid is evaporated, the H-PheNHNH-Z is obtained as crystalline trifluoroacetate with a melting point of 191s, [a] 2ss0 = t 26.40 in dimethylformamide.
This substance is dissolved in 200 ml of dimethylformamide together with 35 g of BOC-Asn ONP and 30 g of N-methylmorpholine. After 16 hours of standing at 200, the solvent is evaporated and the residue is washed successively with ethyl acetate and dilute phosphoric acid. BOC-Asn-Phe-NH-NH-Z of melting point 2100 [a] 4D = -180 is obtained in dimethylformamide.
c) 1 - (N-tert-butyloxycarbonyl-l-asparaginyl- L-asparaginyl-L-phenylalanine) -2-benzyloxycarbonyl-hydrazide (B OC-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z)
26 g of BOC-Asn-Phe-NH-NH-Z are dissolved in 200 ml of trifluoroacetic acid and left to stand at 200 for 1 hour.
After evaporation of the solvent, 17 g of BOC-Asn-ONP 'and 15 g of N-methylmorpholine are added to 100 ml of dimethylformamide. After 16 hours at 200, the solvent is evaporated and the residue is washed successively with ethyl acetate and dilute phosphoric acid. BOC-Asn-Asn Phe-NH-NH-Z is obtained; M.p. 2400, [u] 2.0 = -280 in dimethylformamide.
d) 1- (N-tert-butyloxycarbonyl-L-leucyl-
L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenylalanine)
2-benzyloxycarbonyl hydrazide (B OC-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z)
22 g of BOC-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z are dissolved in 150 ml of trifluoroacetic acid and left to stand at 200 for 1 hour. After evaporation of the solvent, 12 g of BOC-Leu-ONP and 10 g of N-methylmorpholine in 100 ml of dimethylformamide are added to the residue. After 16 hours of standing at 200, the dimethylformamide is evaporated and the residue is washed in succession with ethyl acetate and dilute phosphoric acid. BOC-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z of melting point 2100 is obtained, [ril 2i; ' = -340 in dimethylformamide.
e) 1 - (N-tert-butyloxycarbonyl-L-asparaginyl-
L-leucyl-L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenyl alanine) -2-benzyloxycarbonyl-hydrazide (B OC-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z)
57 g of BOC-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z are dissolved in 300 ml of trifluoroacetic acid and left to stand at 200 for one hour. After evaporation of the solvent, the residue is crystallized from ether. The tetrapeptide trifluoroacetate is dissolved in 400 ml of dimethylformamide and the solution is mixed with 27 g of BOC-Asn-ONP and 25 g of N-methylmorpholine. After 16 hours of standing at 200, the solvent is evaporated and the residue is washed successively with ethyl acetate and dilute phosphoric acid. BOC Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z of melting point 2500 (decomp.), [Aj 0-340 in dimethylformamide is obtained.
f) 1 - (L-asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl-
L-asparaginyl-L-phenylalanine) -2-benzyloxy carbonyl-hydrazide Trifluoroacetate (H-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z trifluoroacetate)
43.5 g of BOC-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z are dissolved in 200 ml of trifluoroacetic acid and left to stand at 200 for one hour. After evaporation, the residue is crystallized with the aid of ether. H-Asn Leu - Asn - Asn - Phe - NH - NH - Z. Trifluoroacetate are obtained; M.p.
2420, [a] 2DO = -220 in dimethylformamide.
Partial sequence E tert-butyloxycarbonyl-L-seryl-L-aIanyl-L-tyrosyl-
L-tryptophanyl-L-arginine hydrazide acetate (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-NHNH., - CHa (:: OOH) a) N-tert-butyioxycarbonyl-L-tryptophanyl (guanido) N- nitro-L-arginine methyl ester (BOC-Trp-Arg (NO) -OMe)
Dissolve 35 g of H-Arg (NO,) - OMe-HCl, 63 g of BOC Trp-OCP and 14 g of N-methylmorpholine in 300 ml of dimethylformamide and leave to stand at 200 for 16 hours. After evaporation of the solvent, the residue is taken up in ethyl acetate and washed with dilute sulfuric acid. You narrow in a little and fall out with ether.
BOC-Trp Arg (NOU) -OMe with a melting point of 1300, [(Z] 2D = -22, crystallizes in dimethylformamide.
b) N-tert-butyloxycarbonyl-L-tyrosyl-L-tryptophanyl- (guanido) N-nitro-arginine methyl ester (BOC-Tyr-Trp-Arg (NO2) -OMe)
15 g of BOC-Trp-Arg (NO2) -OMe are dissolved in 80 ml of Sn methanolic hydrochloric acid solution and left to stand for 1 hour at room temperature. After evaporation of the solvent and treatment with ether, 13 g of H-Trp-Arg (NO.) - OMe remain as hydrochloride; 1200, [a] D = -90 in dimethylformamide. This dipeptide is dissolved together with 14 g of BOC-Tyr-OCP and 8 g of N-methylmorpholine in 200 ml of dimethylformamide. After 16 hours of standing at 200, the solvent is evaporated and the residue is taken up in ethyl acetate.
After washing with dilute phosphorous acid and concentration of the solvent, BOC-Tyr Trp-Arg (NO2) -OMe can be isolated with the aid of ether; M.p. 1300, [a] D, = -110 in dimethylformamide.
c) tert-butyloxycarbonyl-L-alanyl-L-tyrosyl
L-tryptophanyl- (guanido) N-nitro-L-arginine methyl ester (B OC-Ala-Tyr-Trp-Arg (NO2) -OMe)
13.5 g of BOC-Tyr-Trp-Arg (NO2) -OMe are dissolved in 130 ml of Sn methanolic hydrochloric acid solution, left to stand at 250 for 1 hour, evaporated to dryness, the residue is washed with dimethyl ether, filtered off, dissolved in 100 ml of dimethylformamide and treated with 8.0 g of BOC-Ala-OCP and 3.0 ml of triethylamine. After 16 hours at 25, 500 ml of ethyl acetate are added, washed with dilute sulfuric acid and potassium bicarbonate solution and evaporated to dryness. After washing the residue with chloroform, BOC-Ala-Tyr-Trp-Arg (NO2) -OMe is obtained; 1200 (dec.), [A] 2d = -12 in dimethylformamide.
d) tert-butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl
L-tyrosyl-L-tryptophanyl- (guanido) N-nitro
L-arginine methyl ester (B OC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg (NO2) -OMe)
12.3 g of BOC-Ala-Tyr-Trp-Arg (NO -) - OMe are dissolved in 100 ml of Sn methanolic hydrochloric acid, left to stand at 250 for 1 hour, evaporated to dryness, the residue is washed with diethyl ether and dissolved in 100 ml of dimethylformamide, mixed with 14 ml of triethylamine and 8.5 g of BOC-Ser-.N: 3, left to stand for 16 hours at 0, 500 ml of ethyl acetate are added, washed successively with dilute sulfuric acid and ammonium hydroxide, dried over sodium sulfate and the solvent evaporated from. After washing the residue with chloroform, it is dissolved in ethyl acetate and precipitated by adding diethyl ether.
13.5 g of BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp Arg (NO.)) - OMe are obtained; M.p. 135s (dec.), [A] D = -150 in dimethylformamide.
e) tert-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyi-L-tyrosyl-L-tryptophanyl-L-arginine # hydrazide
Acetate (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Agr-NHNH- # CH3COOH)
13.2 g of the pentapeptide ester obtained above are dissolved in 300 ml of acetic acid, 60 ml of water and 13.2 g of palladium-carbon (10%) are added and the mixture is hydrogenated until hydrogen uptake has ceased. It is filtered, evaporated, the residue is dissolved in dimethylformamide, and again evaporated to remove the traces of acetic acid. The residue is then dissolved in 260 ml of methanol, treated with 26 ml of hydrazine hydrate and left to stand at 400 for 16 hours. After adding 260 ml of diethyl ether, the precipitated crystalline mass is filtered off, washed with diethyl ether and dried over sulfuric acid in a high vacuum.
BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-NHNH2 CH3COOH is obtained; M.p. 1820, [aX2D = -80 in dimethylformamide.
Partial sequence Fl
L-threonyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-valyl L-leucine methyl ester hydrobromide (H-Thr-Cys (Bzl) -Val-Leu-OMe HBr) a) H-Cys (Bzl) -Val-Leu-OMe HBr
21.0 g of Z-Cys (Bzl) -OCP and 12.3 g of H-Val Leu-OMe HC1 are dissolved in 120 ml of dimethylformamide.
Then 5.9 ml of triethylamine are added, left to stand for 16 hours, ethyl acetate is added, washed with dilute hydrochloric acid, dried over sodium sulfate, evaporated to dryness and the residue is crystallized from ethyl acetate / diethyl ether. Z-Cys (Bzl) -Val-Leu-OMe, melting point 1600, tau D0 = -280 is obtained in dimethylformamide, which is dissolved in 210 ml of a 405S solution of hydrogen bromide in glacial acetic acid. One lets
Stand at 250 for 1 hour, evaporate to dryness and recrystallize the residue from isopropanol / diethyl ether.
H-Cys (Bzl) -Val-Leu-OMe HBr, melting point 168, [a] 2d = r 140 in dimethylformamide is obtained.
b) H-Thr-Cys (Bzl) -Val-Leu-OMe HBr
20 g of Z-Thr-NHNH.2 are dissolved in 350 ml of dimethylformamide, the mixture is cooled to -200, and 100 ml of a solution of 2N hydrochloric acid in dioxane are then added
10 ml of tert-butyl nitrite. After 10 minutes at -200, 45 ml of triethylamine and 25.5 g of H-Cys (Bzl) -Val Leu-OMe HBr are added and the resulting mixture is shaken at 0 for 16 hours. It is evaporated to dryness, the residue is dissolved in a mixture of ethyl acetate / water, the organic phase is washed with dilute hydrochloric acid, dried over sodium sulfate, evaporated and the residue is recrystallized from ethyl acetate. Z-Thr-Cys (Bzl) -Val-Leu OMe is obtained; M.p. 2085, [rr] s -270 in dimethylformamide.
20 g of the tetrapeptide obtained above are dissolved in 200 ml of a mixture of trifluoroacetic acid / ethyl acetate (1: 1), a stream of gaseous hydrogen bromide is passed in for 1 hour at 0, then evaporated and the residue is recrystallized from methanol / diethyl ether. H-Thr Cys (Bzi) -Val-Leu-OMe is obtained. 1.3 HBr; M.p. 2020, [aJ 2D0 = 100 in dimethylformamide.
Tell sequence F3
L-Threonyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-valyl-L-leucine (H-Thr-Cys (Bzl) -Val-Leu-OH)
372 g of H-Thr-Cys (Bzl) -Val-Leu-OMe HBr (partial sequence Fl) are dissolved in 1800 ml of methanol, 900 ml of 2N sodium hydroxide solution are added, left to stand at 250 for 1 hour, 240 ml of glacial acetic acid are added and 2 Hours are at 0. The precipitated crystalline mass is then filtered off, washed first with 1N acetic acid, then with water and dried at 500 ° in a high vacuum. The H-Thr-Cys (Bzl) -Val Leu-OH is obtained; M.p. 2190, [a] 2D = -530 in 1N ammonia.
Partial sequence F2 tert-butyloxycarbonyl-S-benzyl-L-cysteinyl
L-seryl-L-asparaginyl-L-leucyl-L-serine hydrazide (BOC-Cys (Bzl) -Ser-Asn-Leu-Ser-NH-NH2) a) H-Asn-Leu-Ser-OMe HCl
43 g of H-Leu-Ser-OMe HCl and 53 g of BOC-Asn-ONP are dissolved in 400 ml of dimethylformamide, 22 ml of triethylamine are added, the mixture is left to stand at 250 for 16 hours, evaporated to dryness and the residue is recrystallized from methanol . 51.6 g of BOC-Asn-Leu Ser-OMe, melting point 1900, [a] D20 = 240 are obtained in dimethylformamide, which is dissolved in 500 ml of a 4N solution of hydrochloric acid in methanol. The mixture is left to stand at 250 for 1 hour, evaporated to dryness, the residue is dissolved in methanol and precipitated with diethyl ether.
H-Asn-Leu-Ser-OMe HCl is obtained; M.p. 1800, [a] nEj = -230 in dimethylformamide.
b) H-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe HCl
39.5 g of BOC-Ser-NHNH.2 are dissolved in 500 ml of dimethylformamide, cooled to -200, 200 ml of a 2N solution of hydrochloric acid in dioxane and then 20 ml of tert-butyl nitrite are added. After 10 minutes at -200, 40 ml of triethylamine and 38.0 g of H-Asn-Leu-Ser OMe HCl are added, then the mixture is stirred at 0 for 16 hours, evaporated to dryness and the residue is recrystallized from chloroform / diethyl ether. BOC-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe, m.p. 1350 [a] 20 = -220, is obtained in dimethylformamide, which is dissolved in 420 ml of a 4N hydrochloric acid solution in methanol.
The mixture is left to stand at 250 for 1 hour, evaporated to dryness and recrystallized from methanol / ethyl acetate. H-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe HCl, melting point 1550 (dec.), [A20-150 in dimethylformamide is obtained.
c) BOC-Cys (Bzl) -Ser-Asn-Leu-Ser-NHNH2
Dissolve 18.5 g of H-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe HCl and 18.0 g of BOC-Cys (Bzl) -ONP in 100 ml of dimethylformamide, add 10 ml of water, 3.5 ml of acetic acid and 5, 6 ml of triethylamine, left to stand for 16 hours at 250, evaporated to dryness and crystallized from methanol. 25.1 g of BOC-Cys (Bzl) -Ser-Asn-Leu Ser-OMe, melting point 1820, [a] 20) = -170 are obtained in dimethylformamide, which is dissolved in 200 ml of dimethylformamide with gentle heating. 200 ml of methanol and 20 ml of hydrazine hydrate are added, the mixture is left to stand at 300 for 16 hours, it is precipitated with diethyl ether, the precipitate is washed with diethyl ether / methanol (1: 1) and the BOC-Cys (Bzl) -Ser-Asn- thus obtained is dried Leu-Ser-NHNH2, m.p.
2240, [a] D0 = 130 in dimethylformamide.
Partial sequence F tert-butyloxycarbonyl-L-hemicystinyl-L-seryl L-asparaginyl-L-leucyl-L-seryl-L-threonyl L-hemicystinyl-L-valyl-L-leucine hydrazide
EMI7.1
Dissolve 18.4 g of BOC-Cys (Bzl) -Ser-Asn-Leu-Ser-NHNHo (partial sequence F2) in 150 ml of dimethylformamide, cool to 200, are 40 ml of a 2N solution of hydrochloric acid in dioxane and 15 ml of tert .-Butyl nitrite too.
After 10 minutes at 200, 28 ml of triethylamine and 24.8 g of H-Thr-Cys (Bzl) -Val-Leu-OMe are added.
1.3 HBr (partial sequence F1) is added and the mixture is stirred for 16 hours at 250. It is then filtered, the solution is evaporated and the residue is washed through with hot methanol.
BOC - Cys (Bzl) - Ser - Asn - Leu-Ser-Thr-Cys (Bzl) -Val-Leu-OMe, m.p. 242-2440, [a] D = -250 in dimethylformamide, which is obtained at 600 dissolves in 100 ml of dimethylformamide. 10 ml of hydrazine hydrate are added and the mixture is left to stand at 600 for 2 hours; the resulting nonapeptide hydrazide crystallizes out. It is washed with diethyl ether, water and methanol and dried in a high vacuum over phosphorus pentoxide. Nonapeptide hydrazide with a melting point of 2600 (decomp.), [A] 2E) = -33 in dimethylformamide / water (3 1) is obtained. The product obtained is dissolved in 5000 ml of dried ammonia, and sodium metal is added with stirring and boiling of the ammonia until it turns deep blue. To decolorize, ammonium chloride is added and a stream of air is then passed through the solution until the nitroprussiate reaction is negative.
It is evaporated to dryness and the residue is washed through with water. After drying, one obtains
EMI7.2
EMI7.3
M.p. 298 (dec.), [A] 2D = - 200 in dimethylformamide / water (3: 1).
Partial sequence F4 tert-butyloxycarbonyl-L-hemicystinyl-L-seryl
L-asparaginyl-L-leucyl-L-seryl-L-threonyl-L-hemicvstinvl-L-valvl-L4eucine
EMI7.4
Dissolve 18.4 g of BOC-Cys (Bzl) -Ser-Asn-Leu-Ser-NHNH2 (partial sequence F2) in 150 ml of dimethylformamide, cool to -200, add 40 ml of a 2N solution of hydrochloric acid in dioxane and 15 ml tert-butyl nitrite too. After 10 minutes at -200, 28 ml of triethylamine and 16.2 g of H-Thr-Cys (Bzl) -Val-Leu-OH (partial sequence F3) are added and the mixture is stirred at 250 for 16 hours. It is then filtered and the solution is evaporated and the residue washed through in acetic acid.
You get
BOC-Cys (Bzl) -Ser-Asn-Leu-Ser-Thr
Cys (Bzl) -Val-Leu-OH, m.p. 2170, [a] 2D = -27 in dimethylformamide.
The product obtained is dissolved in 5000 ml of dried ammonia, and sodium metal is added with stirring and boiling of the ammonia until it turns deep blue. Ammonium chloride is added to decolorize. It is evaporated to dryness and the residue is washed through in acetic acid and acetone.
After drying, BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser Thr-Cys-Val-Leu-OH, m.p. 2480 (decomp.), [A] 2D0 = -41 0 in dimethylformamide / water (7: 3) .
The nonapeptide obtained is dissolved in 5000 ml of 0.01N ammonia, hydrogen peroxide is added with stirring until the nitroprussiate reaction is negative, then another 200 ml of glacial acetic acid, filtered and volatilized. You get
EMI7.5
Val-Leu-OH, m.p. 238 (dec.), [A]; B = -18 in dimethylformamide / water (3 l).
Partial sequence ABC
Nim-Trityl-L-histidyl-L-arginyl-L-phenylalanyl-
L-seryl-glycyl-L-norleucyl-glycyl-L-phenyl- alanyl-glycyl-L-prolyl-L-glutamyl-L-threonyl-
L-prolinamide triacetate (H-His (Trt) -Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly Pro-Glu-Thr-Pro-NH2- 3 CH3COOH) a) L-Seryl-glycyl-L- norleucyl-glycyl-L-phenyl-alanyl-glycyl-L-prolyl-L-glutamyl-L-threonyl-L-prolinamide. Tetrahydrochloride (H-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr
Pro-NH2 - 4 HCl)
12 g of H-Phe-Gly-Pro-Glu (OTB) -Thr-Pro NH are dissolved in 100 ml of dimethylformamide and 20 ml of acetonitrile at 0, and 2.1 g of hydroxysuccinimide and 8.0 g of Z-Ser-Gly-Nle are added -Gly-OH, 4.0 g of dicyclohexylcarbodiimide to
left to stand overnight at 0, filtered off, evaporated in vacuo and crystallized from chloroform. Z-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu (OTB) -Thr-Pro-NHe, melting point 125-1380, [oj 2D = 440 in dimethylformamide.
It is dissolved in 400 ml of dioxane and 400 ml of HCl / dioxane and hydrogenated at normal pressure in the presence of palladium catalyst and acid until the hydrogen uptake has ended. It is filtered, evaporated in vacuo, dissolved in methanol, treated with ether and obtained
H-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr
Pro-NH2 # 4 HCl, m.p. 1300 (decomp.), Tal D = -52 in dimethylformamide.
b) Nim-trityl-L-histidyl-L-arginyl-L-phenylalanyl-
L-seryl-glycyl-L-norleucyl-glycyl-L-phenyl-alanyl-glycyl-L-propyl-L-glutamyl-L-threonyl-
L-prolinamide triacetate (H-His (Trt) -Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly Pro-Glu-Thr-Pro-NH2- 3 CH3CO2H)
9.9 g of N-Trt-Ni'-Trt-His-Arg-Phe-NHNHe HC1 are dissolved in 100 ml of dimethylformamide, cooled to -200, 30 ml of dioxane / HCl 2n and then 1.16 ml of tert. Butyl nitrite, stir for 10 minutes at -200, add 28 ml of triethylamine and 9.7 g of H-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 HCl, stir for 4 hours at 00, filtered and evaporated to dryness.
The residue is dissolved in a mixture of ethyl acetate / methanol (8: 2), washed with dilute ammonia and then with water until neutral, dried over sodium sulfate, concentrated to 100 ml and precipitated by adding diethyl ether. The precipitate is again dissolved in dimethylformamide and precipitated by adding diethyl ether. Trt-His (Trt) -Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-
Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NHO [m.p. 1680 (decomp.), [AJ 2D0-430 in dimethylformamide], which is dissolved in 500 ml of acetic acid / water (8: 2). The mixture is left to stand at 400 for 3 hours, evaporated, the residue is washed in diethyl ether and dried in a high vacuum over KOH chips.
You get
H-His (Trt) -Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2-3 CH3COOH, m.p. 1800 (dec.), [A] 20 = 610 in acetic acid.
Partial sequence DE N-tert-butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-
L-tyrosyl-L-tryptophanyl-L-arginyl
L-asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl
L-asparaginyl-L-phenylalanine hydrazide diacetate (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn Phe-NHNH2-2 CH3COOH) a) 1 - (N-tert-butyloxycarbonyl-L -seryl-L-alanyl
L-tyrosyl-L-tryptophanyl-L-arginyl L-asparaginyl-L4eucyl-L-asparaginyl
L-asparaginyl-L-phenylalanine) -2-benzyloxy carbonyl-hydrazide diacetate (B O C-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-
Phe-NH-NH-Z 2 CH3COOH)
320 ml of dimethylformamide are cooled to -200 C,
add 100 ml of 2N hydrogen chloride in dioxane and dissolve 68 g of BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-NHNH2 acetate (partial sequence E). Then 12 ml of tert-butyl nitrite are added, the mixture is stirred for 10 minutes at -200 and 35 ml of triethylamine are added dropwise. The mixture thus obtained is combined with a solution formed from 8.8 g of H-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NHNH-Z trifluoroacetate (partial sequence D) and 17 ml of triethylamine in 150 ml of dimethylformamide. After 16 hours of standing at 0 it is evaporated. The residue is dissolved in ethyl acetate / butanol and washed with dilute acetic acid and ammonia solution.
The remains after evaporation of the solvent
BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn
Phe-NHNH-Z 2 CH3COOH of m.p. 1750, [a] D = -19.50 in dimethylformamide.
b) tert-butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl
L-tyrosyl-L-tryptophanyl-L-arginyl
L-asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl
L-asparaginyl-L-phenylalanine hydrazide diacetate (B OC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NHNH2 2 CH3COOH)
90 g of BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu Asn-Asn-Phe-NHNH-Z- 2 CH3COOH are dissolved in 500 ml of dimethylformamide and hydrogenated with 10 g of Pd / C (10%) until End of hydrogen uptake. After filtering off the catalyst, the solvent is evaporated and the residue is crystallized from a mixture of ether and ethanol.
B OC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NHNH2 2 CH3COOH of melting point 2650, [a] r) = -570 in dimethylformamide is obtained.
Partial sequence ABCDE L-Seryl-L-alanyl-L-tyrosyl-L-tryptophanyl-
L-arginyl-L-asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl
L-asparaginyl-L-phenylalanyl-L-histidyl L-arginyl-L-phenylalanyl-L-seryl-glycyl-
L-norleucyl-glycyl-L-phenylalanyl-glycyl
L-prolyl-L-glutamyl-L-threonyl-L-prolinamide. Hexa-trifluoroacetate (H-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn
Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly Pro-Glu-Thr-Pro-NH2- 6 CF3CO2H)
Dissolve 15.2 g of BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn Leu-Asn-Asn-Phe-NHNH2 - diacetate (partial sequence DE) in 200 ml of dimethylformamide,
cools to -200, gives 15 ml of dioxane / HCl 2n and then 1.16 ml of tert. Butyl nitrite and stir for 10 minutes at -200. 14 ml of triethylamine and a solution of 18.6 g of the tridecapeptide acetate obtained in partial sequence ABC are added, the mixture obtained is stirred at 00 for 16 hours, filtered and evaporated to dryness. The residue is washed with diethyl ether and with chloroform, dissolved in dioxane / water (8 2), the solution obtained is treated with 100 ml of Amberlite IRA-4l0 (acetate form), evaporated and the residue is recrystallized from isopropanol / water.
You get that
B OC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn
Phe-His (Trt) -Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe
Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2. Acetate, melting point 1450 (decomp.), [A] 2.0 = -710 in acetic acid, which is dissolved in 500 ml of trifluoroacetic acid under a nitrogen atmosphere. The mixture is left to stand at 250 for 1 hour, concentrated to 100 ml and precipitated by adding 1000 ml of diethyl ether. It is filtered, the residue is dissolved in dimethylformamide and precipitated with diethyl ether. To.
Drying over KOH chips gives this
H-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn
Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly Pro-Glu-Thr-Pro-NHz 6 CF3CO2H, m.p. 1300 (dec.), [A] 2.0 = -450 in acetic acid .
Example tert-butyloxycarbonyl-L-hemicystinyl-L-seryl L-asparaginyl-L-leucyl-L-seryl-L-threonyl-
L-hemicystinyl-L-valyl-L-leucyl-L-seryl-
L-alanyl-L-tyrosyl-L-tryptophanyl-L-arginyl L-asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl-
L-asparaginyl-L-phenylalanyl-L-histidyl
L-arginyl-L-phenylalanyl-L-seryl-glycyl
L-norleucyl-glycyl-L-phenylalanyl-glycyl
L-prolyl-L-glutamyl-L-threonyl
L-prolinamide hexaacetate octahydrate
EMI8.1
Leu-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn
Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2. Hexaacetate octahydrate)
1.
method
1.05 g of nonapeptide hydrazide (partial sequence F) are dissolved in a mixture of 50 ml of dimethylformamide and 1.2 ml of dioxane / HCl 2n at -200. 0.116 ml of tert-butyl nitrite are added and the mixture is stirred at -200 for 10 minutes
1.4 ml of triethylamine and 3.1 g of tricosapeptide hexa-tri fluoroacetate (partial sequence A, B, C, D, E) and 5 ml of water and stirred for 16 hours at 00. It is evaporated
Dry up, wash the residue with diethyl ether,
Chloroform and acetone. This gives the crude, protected Dotriacontapeptide, which is dissolved in 100 ml of 0.3N acetic acid, treated with 20 ml of Amberlite IRA-410 (acetate) and 50 ml of 0.6N ammonium hydroxide are added. The pH is adjusted to 6.5 and the solution obtained is layered on a carboxymethylcellulose column (10 × 100 cm) which has been equilibrated with a 0.15N ammonium acetate buffer solution.
The elution is carried out with an increasing concentration and pH gradient (0.1 Sn to 0.4 n; pH 6.5 to pH 7.0) of an ammonium acetate buffer. The combined fractions, which contain the pure peptide, are freeze-dried three times, the residue is washed with ethanol and then with diethyl ether and dried over potassium hydroxide in a high vacuum. You get
EMI8.2
SeÀla-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-
Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly Pro-Glu-Thr-Pro-NHz 6 CH8COH 8 H20, m.p. 2200 (dec.), [A] 2.0 = -580 in acetic acid ln.
Amino acid composition after acid hydrolysis (6n, 16h): Ala1.1, Args.o, Asn0.9, Cys / 21.6, Glu1.2, Gly8.0, His11, Leu2, g, Nlel, o, Phe3.0 , Pro.1, Ser.s, Thr1.9, Tyr1.0, Valor (Trp 1.0 by spectrophotometry).
2nd method
1.0 g of nonapeptide (partial sequence F4) is dissolved in
10 ml of dimethylformamide, add 1.5 g of N-hydroxysuccinimide and 0.52 g of dicyclohexylcarbodiimide, stir
6 hours at 250, filtered and the filtrate evaporated to dryness. The residue is washed with ethyl acetate and diethyl ether and dried. 1.2 g are obtained
EMI9.1
M.p. 2420, which is dissolved in 10 ml of dimethylformamide
3.1 g tricosapeptide trifluoroacetate (partial sequence A, B,
C, D, E), 0.4 ml of triethylamine and 1.2 g of N-hydroxysuccinimide are added and the mixture is stirred at 250 for 16 hours. It is evaporated to dryness, the residue is washed with diethyl ether, chloroform and acetone. This is how one obtains the raw, proprietary Dotriacosapeptide that is found in
Dissolve 100 ml of 0.3N acetic acid, treat with 20 ml of Amberlit-IRA410 (acetate) and add 50 ml of 0.6N ammonium hydroxide.
The pH is adjusted to 6.5 and the solution obtained is layered on a carboxymethylcellulose column (10 × 100 cm) which has been equilibrated with a 0.15N ammonium acetate buffer solution.
The elution is carried out with an increasing concentration and pH gradient (0.15n to 0.4n; pH 6.5 to pH 7.0) of an ammonium acetate buffer. The combined fractions, which contain the pure peptide, are freeze-dried three times, the residue is washed with ethanol and then with diethyl ether and dried over potassium hydroxide in a high vacuum.
You get
EMI9.2
Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-
Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly Pro-Glu-Thr-Pro-NH2- 6 CH3CO2H-8 H2O, m.p. 2260 (dec.), [A] 2D0 = -58 in acetic acid in.
Amino acid composition after acid hydrolysis (6n, 16 hrs.): Ala1,1, Arg2,0, Asn3,9, Cys / 21.6, Glu1,2, Gly8.0, His1,1, Leu2,9, Nlel, o, Phea.o , Pro2, l, Ser3.8, Thrl, s, Tyr1.0, ValOg (Trp 1.0 by spectrophotometry).