Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung des neuen Polypeptidamids der Formel
EMI1.1
und seiner therapeutisch wirksamen Säureadditionssalze.
Das Polypeptidamid der obigen Formel kann nach für die Synthese von Verbindungen dieser Art allge- mein bekannten Methoden hergestellt werden, wobei die Aminosäuren in der in der obigen Formel festgelegten Reihenfolge einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten miteinander verknüpft werden und bei einer geeigneten Stufe der Synthese nach Bildung der Aminosäuresequenz 1 bis 7 die Disulfidbrücke gebildet und die Carboxylgruppe des terminalen Prolylrestes in die Amidgruppe übergeführt wird.
Die Verknüpfung der Aminosäure und/oder Peptideinheiten erfolgt z.B. in der Weise, dass man eine Aminosäure mit geschützter a-Aminogruppe und aktivierter terminaler Carboxylgruppe mit einer Aminosäure oder einem Peptid mit freier a-Aminogruppe und freier oder geschützter terminaler Carboxylgruppe umsetzt oder dass man eine Aminosäure oder ein Peptid mit aktivierter oc-Ami- nogruppe und geschützter terminaler Carboxylgruppe mit einer Aminosäure oder einem Peptid mit freier terminaler Carboxylgruppe und geschützter a-Aminogruppe umsetzt.
Die Carboxylgruppe kann beispielsweise durch Über- führung in ein Säureazid, -anhydrid, -imidazolid, -isoxazolid oder einen aktivierten Ester oder durch Reaktion mittels eines Carbodiimids oder N,N'-Carbonyl-diimidazols aktiviert werden. Vorzugsweise wird als Kondensationsmethode die Carbodiimidmethode, die Azidmethode, die Methode der aktivierten Ester, die Anhydridmethode und die Merrifieldmethode verwendet.
In der letzten Stufe der Kondensation sind jedoch Methoden zu verwenden, bei denen Racemisierung nicht auftritt oder gering gehalten werden kann, vorzugsweise durch Verwendung der Azide oder der aktivierten Ester, wobei die Aktivierung vorzugsweise mit N-Hydroxysuccinimid vorgenommen wird.
An der Reaktion nicht beteiligte freie, funktionelle Gruppen können beim Aufbau des erfindungsgemässen Peptids durch die von der Synthese langkettiger Peptide her bekannten Schutzgruppen geschützt werden.
So verwendet man beispielsweise für die Blockierung der Guanidogruppe des Argininrestes in der nachstehend beschriebenen Teilsequenz C5 die Nitrogruppe, doch können auch andere geeignete Schutzgruppen, wie die Tosylgruppe, die p-Nitrocarbobenzoxygruppe oder die 2-(Isopropyloxycarhonyl)-3,4,5,6-tetrachlorobenzoyl- gruppe verwendet werden. Man kann auch den Schutzeffekt der Protonisierung der Guanidogruppe bei der Synthese verwenden.
Beim Aufbau des neuen Polypeptids hat sich für die Blockierung der r-Carboxylgruppe, beispielsweise in der nachstehend beschriebenen Teilsequenz F1, die tert. Butyloxygruppe bewährt, doch können auch andere Schutzgruppen, wie die Methoxy-, die Äthoxy-, die tert. Amyloxy-, die Amid- oder die Benzyloxygruppe verwendet werden.
Für die Blockierung der -Aminogruppe des Lysinrestes, beispielsweise in den nachstehend beschriebenen Teilsequenzen Dl und D2, kann eine Carbo-tert.aIkoxygruppe, vorzugsweise die Carbo-tert.butoxygruppe verwendet werden.
Als Mercaptoschutzgruppe in der nachstehend beschriebenen Teilsequenz F1 verwendet man vorzugsweise die Berzyl- oder die Tritylgruppe. üblicherweise werden die zum Schutz der SH-Gruppen verwendeten Benzyl- bzw. Tritylreste am Ende der Synthese durch Behandlung mit Natrium in flüssigem Ammoniak abgespalten. Es wurde nun gefunden, dass die Abspaltung der Benzyl- bzw. Tritylschutzgruppen sowie die Herstellung der SsJBindung vor der letzten Stufe zu besonders guten Ausbeuten an Endprodukt führt.
Die Umwandlung einer geschützten Mercapto- oder Aminogruppe in eine freie Gruppe sowie die Umwandlung einer funktionell abgewandelten Carboxylgruppe in eine freie Carboxylgruppe im Laufe des Verfahrens zur Herstellung des neuen Polypeptids erfolgt nach an sich bekannten Methoden durch Behandlung mit hydrolysierenden bzw. reduzierenden Mitteln.
Die Ausgangsprodukte zur Herstellung des neuen Polypeptids können, sofern sie bisher nicht bekannt waren, nach den für die Peptidchemie bekannten Methoden erhalten werden, wobei die Aminosäuren einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten miteinander verknüpft werden.
Das neue Polypeptid lässt sich auch in Form seiner Salze gewinnen bzw. verwenden. Als Salze kommen solche mit organischen Säuren, wie beispielsweise Essigsäure, Milchsäure, Bernsteinsäure, Benzoesäure, Salicylsäure, Methansulfonsäure, Toluolsulfonsäure sowie polymere Säuren, wie Gerbsäure oder Carboxymethyl- cellulose und Salze mit anorganischen Säuren, wie Halogenwasserstoffsäuren, z.B. Salzsäure oder Schwefelsäure und Phosphorsäure in Frage.
Als Schwermetallkomplex kommt z.B. derjenige vom 00+ Zink in Frage.
Das erfindungsgemäss hergestellte neue Polypeptid stellt ein wichtiges therapeutisches Prinzip dar. Es senkt den Calciumplasmaspiegel und bewirkt als Antagonist des Parathormons eine positive Calciumbilanz im Knochen. Die biologische Wirkung der neuen Verbindung wurde an Ratten geprüft.
Die zu verabreichende Dosis hängt von der gewürrschten Wirkung sowie von der Applikationsart ab.
im allgemeinen werden jedoch mit einer einmal zu verabreichenden Tagesdosis von 1 bis 10 Einheiten pro kg Tiergewicht zufriedenstellende Resultate erzielt. Für grössere Säugetiere beträgt die Tagesdosis etwa 70 bis 700 Einheiten, die auf einmal oder in mehreren Anteilen verabreicht werden können. Für die intramuskuläre Applikation enthält eine geeignete Verabreichungsform etwa 70 bis 700 Einheiten der Wirksubstanz, vermischt mit einem flüssigen Träger.
Die erfindungsgemäss hergestellte Verbindung ist somit indiziert bei allen Zuständen. bei welchen eine Senkung des Plasmacalciumspiegels bzw. Beeinflussung des Knochenstoffwechsels erwünscht ist, z.B. Hypercalcämien infolge Mangels des endogenen Thyreocalcitonins durch Ausfall von Schilddrüsenaewebe oder Hyperfunktion der Nebenschilddrüsen. Sie ist ferner indiziert bei allen Knochenaffektionen, die auf einem vermehrten Abbau beruhen oder bei welchen eine Calciumfixation im Knochen erwünscht ist, z.B. Osteoporose verschiedener Genese (z.B. postklimakterisch, posttraumatisch, bedingt durch Corticosteroidtherapie oder Inaktivität usw.), Frakturen, Osteomalacie, Rachitis und renal be dingte Osteodystrophie, sowie insbesondere zur Kombinationstherapie mit Calcium bzw. Phosphat.
Die erfindungsgemäss hergestellte Verbindung kann als Heilmittel, z.B. in Form pharmazeutischer Präparate, Verwendung finden. (Dieses enthält die genannte Verbindung in Mischung mit einem für die parenterale Applikation geeigneten organischen oder anorganischen Trägermaterial. Sie kann auch in Form eines Depotpräparates verabreicht werden.
Es werden folgende Abkürzungen verwendet: Z = Carbobenzoxy (Benzyloxycarbonyl) Bzl = Benzyl BOC = tert.Butyioxycarbonyl Trt = Trityl = Triphenylmethyl OTB = tert.Butyloxy ONP = p-Nitrophenylester OCP = 2,4,5-Trichlorphenoxy OMe = Methoxy OEt = Äthoxy NO2 = Nitro Ser = L-Seryl Asn = L-Asparaginyl Asp = L-Aspartyl Leu = L-Leucyl Thr = L-Threonyl Val = tL-Valyl Arg = L-Arginyl Gln = L-Glutaminyl His = L-Histidyl Pro = L-Prolyl Gly = Giycyi Lys = L-Lysyl Phe = L-Phenylalanin Cys = L-Cysteinyl Ala = L-Alanyl OSu = N-Oxysuccinimid
In den folgenden Beispielen, welche die Ausführung des Verfahrens erläutern, den Umfang der Erfindung aber in keiner Weise einschränken sollen,
erfolgen alle Temperaturangaben in Celsiusgraden. Der Wert c für die optische Drehung beträgt 1. Die Aminosäureanalyse in den folgenden Beispielen ergibt, dass die einzelnen Aminosäuren in den erwarteten Verhältnissen vorliegen.
1. Darstellung des Ausgangsmaterials
Teilsequenz A1: H-Val-Gly-Ala-Pro-NH2
Man suspendiert 27,5 g Z-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 in 550 ml Methanol und hydriert nach Zugabe von 3 mi 96%iger Schwefelsäure in Gegenwart von 4,1 ml Eisessig und 3,1 g Palladiumkohle (10%). Nach Filtration und Eindampfen der Lösung zeigt das Produkt (Sulfat) im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel Rfs = 0,2.
Teilsequenz B1: Z-Thr-Asn- Thr-Gly-NHNH2
Man löst 98 g Z-Thr-Asn-ir-G1y-OEt in. 1000 ml Dimethylformamid und versetzt mit 100 ml Hydrazin hydrat. Nach 16stündigem Stehen bei Raumtemperatur wird abfiltriert und mit Wasser und Äther nachgewaschen. Man erhält die Titelverbindung, Smp.: 2210, [α]D20 = -90 in Dimethylformamid.
Teilsequenz C1:
H-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Val-Gly-Ala-Prn-NH2
Man löst 13,5 g BOC-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-NHNH2 in 270 ml Dimethylformamid/Wasser (8 : 2), kühlt auf -150, gibt 40 ml einer 4N Lösung von Salzsäure in Dioxan und 2,5 mi tert.Butylnitrit zu. Man rührt 10 Minuten bei -150, gibt 28 ml Triäthylamin zu, filtriert ab, gibt 10,5 g H-Val-Gly-AlaWPro-NH2 (Teilsequenz A1) zu, rührt 16 Stunden bei 00. Danach dampft man zur Trockne ein, wäscht den Rückstand mit Äther und trocknet. Man löst den 'Rückstand in Methanol, gibt ein Zehntel Volumen Wasser und die siebenfache Menge Chloroform hinzu und lässt die erhaltene Lösung durch eine Säule von 500 g Kieselgel.
Nach Eluierung mit einer steigenden Menge an Methanol erhält man nach Eindampfen BOC-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Vai-Gly- Ala-Pro-NH2. Dieses suspendiert man in 200 ml einer 4N Lösung von Salzsäure in Dioxan und rührt während 2 Stunden bei 250. Man dampft zur Trockne ein, löst den Rückstand in 0,2N Essigsäure, behandelt mit Am berlit-IRA-410 (Acetat-Form) und lyophilisiert die wässrige Lösung. Hierauf wäscht man den Rückstand mit Äther, Essigester und wieder Äther und trocknet über Natriumhydroxid-Späne. Man erhält die Titelver- bindung in Form des Diacetates, Smp.: 195 (mit Zers.), IIalo20 = - 640 in Dimethylformamid/XCl 1N (1:1).
Teilsequenz C2:
Z-Thr-Asn-Thr-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2
Zu einer auf 150 abgekühlten Lösung von 11 g Z-Thr-Asn-Thr-Gly-NHN'H2 (Teilsequenz B1) in 350 mm Dimethylformamid gibt man 47 ml einer 1,85n Lösung von Salzsäure in Dioxan und 2,2 ml tert.Butylnitrit. Man rührt 10 Minuten bei - 150, kühlt auf -300 ab, versetzt mit 12 ml Triäthylamin und filtriert zur kalten Lösung von H-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 (Teilsequenz A1) in Dimethylformamid. Nach 90 Minuten Rühren bei 00 wird im Vakuum eingeengt, mit Chloroform versetzt und das ausgefallene Material abfiltriert und getrocknet.
Eine Lösung dieses Rohproduktes in Wasser-Methanol wird durch Dowex 50 filtriert, mit Amberlite IRA 410 neutralisiert und darauf im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird in Acetonitril verrieben, erwärmt, filtriert und getrocknet. Man erhält die Titelverbindung, Smp.: 2200 (mit Zers.) [α]D20 = - 280 in Dimethylformamid.
Teilsequenz C3:
Z3-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2
Man löst 10 g Z-Thr-Asn-Thr-Gly-Val-Gly-Ala-Pro- NH2 (Teilsequenz C3) in 800 ml Methanol-Wasser, gibt 0,5 g Palladiumkohle zu und hydriert bei Normaldruck.
Es wird vom Katalysator abfiltriert und im Vakuum eingedampft. Das erhaltene Öl, H-Thr-Asn-Thr-Gly Val-Gly-Ala-Pro-NH2, wird in 100 ml Dimethylform- amid gelöst, mit 10 g Z3-Arg-OSu versetzt und 16 Stunden bei 200 stehengelassen. Die Lösung wird dann im Vakuum eingeengt, das Produkt mit Aceton ausgefällt und abfiltriert. Der Rückstand wird in Aceton fein suspendiert, aufgekocht, filtriert und getrocknet. Man erhält die Titelverbindung, Smp.: 2010 (mit Zers.), [aio20 = - 150 in Dimethylformamid.
Teilsequenz D1:
Z-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-OH a) H-Thr-Phe-Pro-OH
Man löst 176 g Z-Phe*Pro-OMe in 1000 ml Metha nol/HCl 1 N, hydriert in Anwesenheit von IPamadium- kohle bei 200 und 1 Atm. und dampft ein. Man löst den Rückstand in 400 ml Dimethylformamid, gibt bei 0 100 ml Triäthylamin zu, filtriert das auskristallisierte Triäthylaminhydrochlorid ab und versetzt das Filtrat mit Z-Thr;N3 (hergestellt aus 87 g Z-Thr-NHNH2 durch Lösen in 100 ml N Salzsäure und Versetzen mit 35 ml N Natriumnitrit). Man lässt hierauf 16 Stunden bei 00 stehen, dampft zur Trockne ein, löst den Rückstand in Essigester, wäscht nacheinander mit verdünnter Salzsäure und verdünntem Ammoniak, trocknet und dampft ein.
Man pulverisiert den Rückstand in Heptan, wäscht mit Petroläther und trocknet. Man erhält Z-Thr-Phe Pro-OMe, Smp. 920 (Zers.), IX]D2O = - 160 in Dime- thylformamid.
Man löst 53 g Z-Thr-Phe-Pro-OMe in 530 ml Methanol, gibt 100 ml 2N Natronlauge zu, lässt 1 Stunde bei 250 stehen, gibt 50 ml 2N Salzsäure zu, konzentriert auf ca. 200 ml, gibt noch 100 ml Wasser zu, stellt das pH auf 10 ein, wäscht die wässrige Lösung zweimal mit Essigester, stellt anschliessend mit 4N Salzsäure auf pH 1 ein, extrahiert das ausgeschiedene Tripeptid Z Thr-Phe;Pro-C)H mit Essigester, trocknet und dampft ein. Smp. 1050, IM]D20 = 280 in Dimethylformamid.
Man löst den Rückstand in einem Gemisch von 500 ml Dioxan und 100 ml Wasser und hydriert bei 200 und Normaldruck in Gegenwart eines Palladiumkatalysators.
Man filtriert, dampft zur Trockne ein, wäscht den Rückstand mit Äther und trocknet. Man erhält H-Thr-Phe Pro-OH, Smp. 1920 (mit Zersetzung), [a]D20 = 410 in Essigsäure (95 5C).
b) Z-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-OH
Man löst 40 g Z-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-NH-NH2 in 400 ml Dimethylformamid, kühlt auf 200, gibt 75 ml Dioxan/HCI 2N und anschliessend 6 ml tert.Butylnitrit zu, rührt 10 Minuten bei 200, gibt 30 ml Triäthylamin und 20 g H-Thr-3?he-Pro-OH zu und lässt 16 Stunden bei 250 reagieren. Man dampft hierauf zur Trockne ein. wäscht den Rückstand mit Äther, verdünnter Essigsäure, Äther und schliesslich mit heissem Essigester. Hierauf trocknet man im Hochvakuum und erhält Z-His-Lys(BOC)-Leu -Gln-Thr-Phe-Pro- OH, Smp.
2000 (Zersetzung), ]o2O = - 470 in Dimethylform- amid.
Teilsequenz D2: Z-His-Lys(BOC)-Leu-GIn- Thr-Phe-Pro-NHNH2 a) Z Gin-Thr-Phe4 > roOMe
84,8 g Z-Thr(tBut.)-OMe werden in 1500 mi Me,- thanol gelöst und mit 125 ml 2N Salzsäure und 10 g Palladium (10% auf Kohle) versetzt. Nach 4stündiger Hydrierung wird vom Katalysator abfiltriert und vollständig eingedampft.
61,2 g ZGln-OH und 25,6 g N'Hydroxysuccinimid werden in 1000 ml Acetonitril/'Dimethylformamid gelöst und auf - 150 abgekühlt. Zuerst wird eine Lösung von 45,7 g Dicyclohexylcarbodiimid in 200 ml Aceto nitril dazugespült, dann das oben erhaltene HCl . H- Thr(t.But.)-OMe gelöst in Dimethylformamid unter Zusatz von 30,4 mi Triäthylamin. Unter zeitweiligem Umschütteln lässt man ca. 16 Stunden bei Raumtemperatur stehen. Das auskristallisierte Triäthylaminhydrochlorid bzw. der Dicyclohexylharnstoff werden abfiltriert und das Filtrat vollständig eingedampft. Der Rückstand wird in Essigester aufgenommen und mit 1 N Salzsäure und Natriumbicarbonat 5% gewaschen.
Nach Trocknen über Natriumsulfat wird die organische Phase auf ein Volumen von ca. 200 ml eingeengt und mit Petrol äther versetzt. Das ausgefallene Öl wird in ein Pulver umgeformt und abfiltriert. Man erhält Z-Gln-Thr(t.But.)- Orte, Smp. 1060, [α]D20 = + 110 in Dimethylformamid.
78,0 g Z-Gln-Thr(t.But.)-OMe werden in 800 ml Methanol gelöst und mit 65 ml Hydrazinhydrat versetzt. Nach 48 Stunden Stehen bei Raumtemperatur wird vollständig eingedampft. Der Rückstand wird mit wasser behandelt und anschliessend aus Methanol Wasser umkristallisiert. Man erhält Z-Gln-Thr(t.But.)- NHNH2, Smp. 2020, la1n20 = - 130 in Methanol.
45,3 g Z-Phe-Pro-OMe werden in 750 ml Methanol gelöst und mit 55 ml 2N Salzsäure und 12 g Palladium (10% auf Kohle) versetzt. Nach 2stündiger Hydrierung ist die berechnete Wasserstoffmenge fast quantitativ verbraucht. Vom Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat vollständig eingedampft.
49,5 g Z-Gln-Thr(t.But.)-NHNH2 werden in 500,ml Dimethylformamid gelöst und auf - 200 abgekühlt.
Nach Zugabe von 77 mi 5 N Salzsäure in Äther und 13,4 ml tert'Butylnitrit lässt man 10 Min. weiterrühren und neutralisiert mit 54 ml Triäthylamin. Das oben erhaltene HCI . H-Phe-Pro-OMe wird in 150 ml Di methylformamid gelöst, mit 15,4 ml Triäthylamin versetzt und zum Dipeptidazid gespült. Nach 4stündigem Rühren bei Raumtemperatur wird vom auskristallisierten Triäthylaminhydrochlorid abfiltriert und das Filtrat vollständig eingedampft. Der Rückstand wird mittels Chloroform/Methanol über eine Kieselgelsäule filtriert.
Wach Kristallisation aus Essigester/Petroläther erhält man Z-Gln-Thr(t.But.)-Phe-Pro-OMe. Smp. 1100, [a]n20 = 410 in Methanol.
Das Tetrapeptid wird in 250 ml Trifluoressigsäure gelöst. Nach 20 Min. Stehen bei Raumtemperatur wird die Lösung auf dlas halbe Volumen ein(Teent und das Produkt mit Äther ausgefällt. Durch Filtration und ausreichendes Waschen mit Äther erhält man nach Trock nuna Z-Gln-Thr-Phe-Pro-OMe. Smp. 1540. [α]D20 = 590 in Methanol.
b) Z-His-Lys(BOC) -Leu-NHNH,
114 g Z-Lys(BOC)-OH, 48 g H-Leu-OMe und 69 g N-Hydroxysuccinimid werden in 600ml Essigester ge löst und auf - 200 abgekühlt. Eine Lösung von 65 g Dicyclohexylcarbodiimid in 300 ml Essigester wird da zugespfflt. Unter zeitweiligem Umsehütteln lässt man während 16 Stunden bei Raumtemperatur stehen. Aus kristallisierter Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert und das Filtrat vollständig eingedampft. Der feste Rückstand wird mit Wasser behandelt. Nach Umkristallisation aus Essigester/Petroläther erhält man Z-Lys(BOC)- Leu-OMe, Smp. 1130, ia]20 = - 180 in Methanol.
101,5 g Z-Lys(BOC)-Leu-OMe werden in 1000 ml Essigester gelöst und mit einer vorgekühlten Lösung von 40 ml 5 N Salzsäure in Äther in 300 mi Essigester versetzt. Nach Zugabe von 5 g Palladium (10% auf Kohle) in 50 ml Dimethylformamid aufgeschlämmt wird 31/2 Stunden hydriert. Die berechnete Wasserstoffmenge wird dabei fast quantitativ verbraucht. Anschliessend wird vom Katalysator abfiltriert und das Filtrat ein 'geçlasmpft.
78,7 g Z-His-NHNH2 werden in 400 ml Dimethylformamid gelöst, mit 182 ml 5N Salzsäure in Äther versetzt und auf -IpO abgekühlt. Nach Zugabe von 32,5 mi tert.Butylnitrit lässt man noch 10 Min. weiterrühren und neutralisiert mit 140 ml Triäthylamin.
Das oben erhaltene HC1 H-Lys(BOC)-Leu-OMe wird in 300 ml Dimethylformamid gelöst, mit 36,4 ml Triäthylamin versetzt und zur Azidlösung gespült. Nach 4 Stunden Rühren bei Raumtemperatur wird das auskristallisierte Triäthylaminhydrochlorid abfiltriert und das Filtrat vollständig eingedampft. Man erhält ein Öl, das in Essigester gelöst wird. Nach Waschen mit Wasser wird die organische Phase über Natriumsulfat ge 'trockner. filtriert und eingeengt. Anschliessend wird mit Petroläther gefällt und abfiltriert. Das Rohprodukt wird durch Chromatographie an Kieselgel und Elution mit Chloroform/Methanol gereinigt.
Durch Kristallisation aus Äther/Petroläther erhält man Z-His-Lys(BOC)-Leu OMe, Smp. 1460, t02o = - 280 in Methanol.
64,5 g Z-His-Lys(l3OC)-Leu-OMe werden in 300 ml Methanol gelöst und mit 15 ml Hydrazinhydrat versetzt. Nach 3 Tagen Stehen bei Raumtemperatur wird die Lösung vollständig eingedampft. Der Rückstand wird mit Essigester/n-Butanol versetzt und mit gesättigter Natriumchloridlösung mehrere Male gewaschen. Die or organische Phase wird zur Trockne eingedampft und der Rückstand über eine Kieselgelsäule mit Chloroform/ Methanol filtriert. Man erhält Z-His-Lys(BOC)-Leu- !NHNH2, Smp. 1810 fr]¯20 = 260 in Methanol.
c) Z-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-NHNH2
38,4 g Z-Gln-Thr-Phe-Pro-OiMe werden in 1500 ml Methanol/Dimethylformamid gelöst. 10 g Palladium (10% auf Kohle) werden in 50 ml Wasser aufge- schlämmt und dazugespült. Nach ca. · Stunde ist die berechnete Wasserstoffmenge praktisch verbraucht. Der Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat eingedampft.
38.6 g Z-EIis-;Lys(BoO-Leu-NHNHo werden in 250 ml Dimethyiformamid gelöst. Nach Abkühlen auf 15 werden 42 ml 5N Salzsäure in Äther und 7,3 ml tert. Butylnitrit zugesetzt. Es wird 10 Min. gerührt und mit 29,5 ml Triäthylamin neutralisiert. Das oben erhaltene H-Gln-Thr-PheEro-OIMe wird in 250 ml Dimethylformamid gelöst und zur Peptidazidlösung gespült. Nach 4 Stunden Rühren bei Raumtemperatur wird das ausge- schiedene Triäthvlaminhydrochlorid abfiltriert und das Filtrat vollständig eingedampft. Der Rückstand wird in Essigester/n-Butanol aufgenommen und mit 1N Ammoniak, 1 N Schwefelsäure und mehrere Male mit Wasser gewaschen.
Die organische Phase wird vollständig eingedampft und der Rückstand über eine Kieselgelsäule mit Chloroform/Methanol/Wasser gereinigt. Man erhält Z-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-OMe, Smp.
171 ,[α]D20 = 540 in Methanol.
43,6 g Z-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-OMe werden in 1000 ml Methanol/Dimethylformamid gelöst und mit 44 ml Hydrazinhydrat versetzt. Nach 4 Tagen Stehen bei Raumtemperatur wird die Lösung vollständig eingedampft. Der Rückstand wird in Acetonitril ausgekocht. Nach Abkühlen auf ca. 200 wird abfiltriert.
Man erhält Z-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro- NHNH2, Smp. 1750, fo]n20 = - 580 in Methanol.
Teilsequenz E1:
H-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-Arg-Thr- Asn-Thr- Gly-Val-Gly-A la-Pro-NH2 Methode A
Man löst 10 g Heptapeptid (Teilsequenz D1) in 100 mi Dimethylformamid, dampft ein, löst den Rückstand in 100 ml Dimethylformamid, versetzt mit 15 g N-Hydroxysuccinimid, kühlt auf 0 ab, gibt 5 g Dicyclohexylcarbodiimid zu, lässt 3 Stunden reagieren, filtriert den ausgeschiedenen Dicyclohexylharnstoff ab, konzentriert auf 30 ml und fällt den entstandenen Heptapeptidoxysuccinimidester Z-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Phe- Pro-OSu durch Zusatz von Äther aus. Nach Auswaschen mit Äther löst man den Rückstand in 100 ml Dimethylformamid, versetzt mit 10 g Nonapeptidamid (Teilsequenz C1) und lässt während 16 Stunden reagieren.
Man gibt 500 ml Essigester zu und filtriert. Man löst den Rückstand in Dimethylformamid. gibt 10 ml Essigsäure zu und fällt wiederum mit Essigester. Man filtriert, wäscht mit Essigester sowie Äther und trocknet.
Man erhält Z-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-Arg- Thr-Asn-Thr-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 2 AcOH, [o2O = - 240 in Dimethylformamid, das man direkt in 80%iger Essigsäure löst. Anschliessend werden 5 g Palladiumkohle hinzugefügt, bei Normaldruck und Zimmertemperatur hydriert. Man filtriert, dampft bei 200 im Hochvakuum zur Trockne und wäscht den Rückstand mit Äther. Nach Trocknen über KOTI-Spänen erhält man die Teilsequenz E1: Triacetat, Smp. 1850 (mit Zers.), [α]D20 - 42 in 1N Essigsäure.
Methode B
Man löst 12 g Nonapeptid (Teilsequenz C5) in 1000 ml Dimethylformamid/Wasser, gibt 1,8 g Palladiumkohle zu und hydriert bei Normaldruck. Vom Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat im Vakuum auf 60 ml eingeengt. Diese Lösung von H-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly Val-Gly-Ala-Pro-WH2 wird bei - 200 aufbewahrt.
Zu einer auf - 150 vorgekühlten Lösung von 10 g Z-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-NHNH2 (Teilsequenz D2) in 100 ml Dimethylformamid gibt man 21 ml einer 1,85 n Lösung von Salzsäure in Dioxan und 1,1 mi tert.Butylnitrit. Man rührt 10 Min. bei -150, kühlt auf - 300 ab, gibt 6 ml Triäthylamin zu und filtriert zur kalten Lösung von H-ArEs-Thr Asn-Thr-Gly-Val-Gly- Ala-Pro-NHO in Dimethylformamid. Nach 90 Min. Rühren bei 00 engt man die Lösung im Vakuum ein, versetzt mit Chloroform, filtriert den Niederschlag ab, wäscht mit Chloroform, dann mit Essigester und trocknet.
Das Rohprodukt wird in einem Gemisch von Me thanol/Chloroform/Wasser gelöst und auf eine Kiesel gelsäule aufgetragen. Man eluiert, vereinigt die reinen Fraktionen und dampft im Vakuum zur Trockne ein.
Den Rückstand löst man in Methanol, fällt das Produkt mit Essigester, filtriert und trocknet. Man erhält Z-His Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro -Arg-Thr-Asn-Thr-Gly Val-Gly-Ala-Pro-NH2, Smp. 1850 (mit Zers.), ralDZO = - 290 in Dimethylformamid.
3,68 g des so erhaltenen Hexadecapeptids werden in 120 ml Dimethylformamid/Wasser gelöst, mit 3 g Palladium (10% auf Kohle) in 10 ml Wasser aufgeschlämmt versetzt und der katalytischen Hydrierung unterworfen.
Nach ca. 2 Stunden ist die berechnete Wasserstoffmenge praktisch verbraucht. Es wird vom Katalysator abfiltriert und das Filtrat vollständig eingedampft und die Teilsequenz E1 erhalten.
Teilsequenz F1:
Trt-Gly-Lys(BOC)-Leu-Ser-Gln-Asp(OTB)-Leu-
NHNH2 a) Z-Asp(OTB)-Leu-OMe
Man löst 151 g Z-Asp(OTB)-OH, 54 g N-Hydroxysuccinimid in 700 ml Acetonitril und kühlt auf 200 ab. Anschliessend gibt man 96,5 g Dicyclohexylcarbodiimid, gelöst in 350 ml Acetonitril hinzu. Nach ca. 30 Minuten Stehenlassen wird der entstandene Dicyclohexylharnstoff abfiltriert. Zu dem Filtrat werden 71,2 g H-Leu-OMe gegeben, danach 4 Stunden stehengelassen und am Vakuum eingedampft. Den festen Rückstand versetzt man mit Essigester/Wasser. Die organische Phase wird hierauf mit 5% Natriumbicarbonatlösung, Wasser und mit verdünnter Schwefelsäure (pH 3) gewaschen, nach dem Neutraiwaschen über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft.
Man löst den Rückstand mit Chloroform, dem 1% Methanol zugesetzt wurde, und filtriert über einer Kieselgelsäule (lOfache Menge).
Man erhält Z-Asp(OTB)-Leu-OMe, Smp. 580, IaJ20 = 160 in Dimethylformamid.
b) Z-Gln-Asp(OTB)-Leu-OMe
Man löst 118 g ZkAsp(OTB)-Leu-OMe in 2000 ml Methanol. Danach werden 15 g 10% Palladium auf Aktivkohle in 63 ml 4N Salzsäure angerührt und in die Lösung gegeben. Das Ganze wird einer zweistündigen Hydrierung bei Raumtemperatur und Normaldruck unterworfen. Hierbei werden ca. 85% der theoretischen Menge Wasserstoff verbraucht. Der Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat vollständig eingedampft, wobei H-Asp(OTB)-Leu-OMe HCl in Form eines amorphen Schaumes erhalten wird.
91,7 g Z-Gln-ONP und 93,8 g H-Asp(OTB)-Leu OMe HCI werden in 500 ml Dimethylformamid gelöst und mit 51 ml N-Methylmorpholin versetzt. Man lässt 15 Stunden bei Zimmertemperatur stehen und dampft hierauf die Lösung am Vakuum vollständig ein. Der so erhaltene Rückstand wird mit Wasser gut verarbeitet und vom Wasser abfiltriert. Anschliessend wird aus Methanol umkristallisiert. Man erhält Z-Gln-Asp(OTB)- Leu-OMe, Smp. 1890 (Zers.), rilD20 = - 300 in Dimethylformamid.
c) Z-Ser-Gln-A sp(OTB)-Leu- OMe
Man löst 44.4 g Z-Gln-Asp(OTB)-Leu-OMe in 1200 ml Methanol/lDimethylformamid. Danach werden 15 g 107,ges Palladium auf Aktivkohle in 50 ml Wasser versetzt und in die Lösung gegeben. Nach ca. 2stündiger Hydrierzeit ist die berechnete Menge an Wasserstoff fast verbraucht. Der Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat am Vakuum eingedampft.
21,4 g Z-Ser-NHNH2 gelöst in 100 ml Dimethylformamid werden auf -200 abgekühlt und mit 50,6 ml 5N Salzsäure in Ather und 10,3 ml tert.Butylnitrit versetzt. Nach 10 Min. Rühren wird mit 35,6 ml Triäthylamin auf pH 7,5 eingestellt und 34,2 g H-Gln-Asp(OT'B)- Leu-OMe in 100 ml Dimethylformamid gelöst zugegeben. Man rührt 4 Stunden bei 200, filtriert vom ausgeschiedenen Triäthylaminhydrochlorid ab und dampft das Filtrat vollständig ein. Nach Behandlung des Rückstandes mit Wasser und anschliessender Kristallisation aus Wasser/Methanol wird das Rohprodukt durch Filtration über eine Kieselgelsäule mit Chloroform/Me- thanol gereinigt. Man erhält Z-Ser-Gln-Asp(OTB)-Leu OMe, Smp. 172 , [CC]D20 = 240 in Dimethylformamid.
d) Trt-Gly-Lys(BOC)-Leu-NHNH,
50,8 g ZLys(BOC)-Leu-OMe werden in 600 ml Essigester gelöst und nach Zugabe von 25 ml 4 N Salzsäure in Äther und 3 g Palladium (10% auf Kohle) katalytisch hydriert. Nach ca. 4 Stunden ist die berechnete Wasserstoffmenge fast vollständig verbraucht. Vom Sa- talysator wird abfiltriert und das Filtrat auf das halbe Volumen eingeengt.
33,0 g Trt-Gly-OH und 12,0 g N-Hydroxysuccinimid werden in 150ml Dimethylformamid gelöst und auf -150 abgekühlt. Eine Lösung von 21,6 g Dicyclohexylcarbodiimid in 100 ml Acetonitril wird dazugespült und das Gemisch unter zeitweiligem Umschütteln während 3 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen.
Vom auskristallisierten Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert und das Filtrat unter Zugabe von 25 ml N Methylmorpholin mit der aus obiger Hydrierung erhaltenen Dipeptidlösung versetzt. Nach 16 Stunden Stehen wird vollständig eingedampft. Der Rückstand wird in Essigester aufgenommen und bei 00 mit 1N Schwefelsäure und 5% Natriumbicarbonatlösung behandelt. Nach Trocknen über Natriumsulfat wird die organische Phase vollständig eingedampft. Durch Filtration des resultierenden Schaumes über eine Kieselgelsäule mit Chloroform/Methanol erhält man Trt-Gly-Lys(BOC)-Leu-OMe in Form eines amorphen Schaumes, ICC]D2O = 100 in Methanol.
Man löst den Rückstand in 300 ml Methanol, versetzt mit 17 ml Hydrazinhydrat und lässt 16 Stunden bei Raumtemperatur stehen. Nach vollständigem Eindampfen und Nachtrocknen am Hochvakuum wird mittels Chloroform/lMethanol über eine Kieselgelsäule filtriert. Durch Kristallisation aus Ghloroform/Petroläther erhält man Trt-Gly-Lys(B0e3-Leu-NIFNH?, Smp. 1750, [aJ25 = - 120 in Methanol.
e) Trt-Gly-Lys(BOC)-Leu-Ser-Gln-Asp(OTB)-Leu-
NHNH2
26,6 g ZSerGln-Asp(OTB)-Leu-OMe werden in 1 Liter Methanol/'Dimethylformamid gelöst, mit 5 g Palladium (10 ,Zo auf Kohle) in 100 ml Wasser aufgeschlämmt, versetzt und der katalytischen Hydrierung unterworfen. Nach 1 Stunde ist die berechnete Wasserstoffmenge verbraucht. Der Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat zur Entfernung von Methanol eingeengt.
29,6 g Trt-Gly-Lys(BOC)JLeu-NHNH2 werden in 150 ml Dimethylformamid gelöst. Es wird auf 200 abgekühlt und mit 26.2 ml 5N Salzsäure in Äther und mit 5,3 ml tert.Butylnitrit versetzt. Nach 10 Min. Rüh ren werden 18,5 ml Triäthylamin und die oben erhaltene eingeengte Lösung von H-Ser-Gln-Asp(OTB)-Leu- OMe zugegeben. Man rührt 4 Stunden bei Raumtemperatur, anschliessend wird das ausgeschiedene Triäthylaminhydrochlorid abfiltriert und das Filtrat vollständig eingedampft. Der Rückstand wird in Äther aufgenommen, zu einem Pulver verarbeitet und abgenutscht.
Dieses Rohprodukt wird durch Filtration über eine Kieselgelsäule mit Chloroform/Methanol gereinigt. Man erhält Trt-Gly-Lys(BOC)-Leu-Ser-Gln-Asp(OTB)-Leu OMe, Smp. 2170, [iD20 = 300 in Methanol.
Das Heptapeptid wird in 400 ml Methanol gelöst, mit 1,4 ml Hydrazinhydrat versetzt und während 48 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das ausgefallene Hydrazid wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und bis zur Gewichtskonstanz getrocknet. Smp. 218 , [α]D20 = 160 in Dimethylformamid.
Teilsequenz G1 Trt-Gly-Lys(BOC)-Leu-Ser-Gln-Asp(OTB)-Leu -His-
Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-A rg-Thr-A sn-Thr Gly-VaI-Gly-AI-Pro-NHfl 2CH2COOH 3H2O
2,43 g Heptapeptid (Teilsequenz F1) werden in 30 ml Dimethylformamid gelöst. Nach Ablkühlen auf - 200 werden 1,45 ml 5 N Salzsäure in Äther und 0,252 ml tert.Butylnitrit zugegeben. Man lässt noch während 10 Minuten weiterrühren und neutralisiert dann mit 1,01 ml Triäthylamin. ;Das Hexadecapeptid E1 wird in 50 ml Dimethylformamid gelöst und zur Heptapeptidazidlösung gespült. Nach 4 Stunden Rühren bei Raumtem .peratur wird das ausgeschiedene Triäthylaminhydrochlo- rid abgesaugt und das Filtrat vollständig eingedampft.
Der Rückstand wird in wenig Methanol warm gelöst und durch Zugabe von Äther gefällt. Das Rohprodukt wird an einer Kieselgelsäule chromatographiert und mit Chloroform/Methanol/Wasser eluiert. Man erhält die Titelverbindung vom Smp. 2250, 10C]D2 = - 180 in Dimethylformamid.
Beispiel
EMI6.1
650 mg Tricosapeptid (Teilsequenz G1) werden in 30 ml 60'50iger Essigsäure gelöst und während 16 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Nach Zugabe von Wasser wird mehrere Male mit Äther gewaschen.
Die Wasserphase eluiert man durch eine Amberlite-IRA 410 Acetat-Säule und dampft darauf die Lösung vollständig ein.
Man löst 295 mg
EMI6.2
Val-Len-OH in 10 ml Diirethyisulfoxid/'Dimethylform- amid, gibt 131 mg N > Hydroxysuccinimid und 59 mg Dicyclohexylcarbodiimid zu und filtriert nach 6 Stunden Stehen vom ausgeschiedenen Dicyclohexylharnstoff ab. Das oben durch Abspaltung der Schutzgruppen erhaltene Tricosapeptid wird in 10 ml Dimethylformamid gelöst und zum Filtrat gespült. Nach 48 Stunden Stehen bei Raumtemperatur wird das Produkt durch Zugabe von Äther ausgefällt und die überstehende Lö- sung abdekantiert. Der Niederschlag wird in wenig Methanol gelöst und durch erneute Zugabe von Äther in ein Pulver übergeführt.
Nach Absaugen und Trocknen werden 220 mg des geschützten rohen Dotriacontapeptids in 4 ml eines Methylenchlorid/Trifluoressigsäure/ Wasser-Gemisches gelöst. Die Lösung wird nach 1 Stunde Stehen bei Raumtemperatur vollständig eingedampft.
Der Rückstand wird in 0,2N Essigsäure aufgenommen und auf eine BiogelsäuleJP-(1 X 300cm) geschichtet.
Die Elution wird mit 0,2N Essigsäure durchgeführt. Die vereinigten reinen Fraktionen werden eingedampft und anschliessend lyophilisiert. Man erhält die Titelverbindung, Smp. 2150 (Zers.), !aiID20 = -750 in 1N Essirg- säure.
Aminosäurezusammensetzung nach Säurehydrolyse (6N, 16 Stunden) Asp 3,1; Thr 3,7; Ser 2,8; Gln 1,9; Pro 2,0; Gly 2,9; Ala 1,0; Cys 1,6; Val 2,0; Leu 5,2; Phe 1,0; His 1,0; Lys 2,0; Arg 0,9.
PATENTANSPRÜCHE
I. Verfahren zur Herstellung des neuen Polypeptidamids der Formel
EMI6.3
und seiner therapeutisch wirksamen Säureadditionssalze, dadurch gekennzeichnet, dass man entsprechende zu seinem Aufbau nötige Aminosäuren unter Bildung von CONH-Bindungen in beliebiger zeitlicher Reihenfolge miteinander kondensiert. wobei nicht an der Reaktion teilnehmende freie funktionelle Gruppen intermediär durch geeignete Schutzgruppen geschützt werden, und dass man zu einem beliebigen Zeitpunkt der Synthese, nach Bildung der Aminosäuresequenz 1 bis 7 die Mercaptogruppen zum Disulfid oxydiert, die Carboxylgruppe des terminalen Prolylrestes in die Amidgruppe überführt und das Reaktionsproduikt schliesslich in Form der freien Base oder eines therapeutisch wirksamen Säu readdition ssalzes gewinnt.
II. Verwendung des nach Patentanspruch I hergestellten Polypeptidamids der Formel
EMI6.4
zur Herstellung von Schwermetallkomplexen, dadurch gekennzeichnet, dass man das Polypeptidamid der obi- gen Formel durch Umsetzung mit lSchwermetallsalzen in die entsprechenden Schwermetallkomplexe überführt.
Anmerkung des Eidg. Amtes für geistiges Eigentum:
Sollten Teile der Beschreibung mit der im Patentanspruch gegebenen Definition der Erfindung nicht in Einklang stehen, so sei daran erinnert, dass gemäss Art. 51 des Patentgesetzes der.Patentanspruch für den sachlichen Geltungsbereich des Patentes massgebend ist.
**WARNUNG** Ende DESC Feld konnte Anfang CLMS uberlappen**.
The present invention relates to a process for the preparation of the novel polypeptide amide of the formula
EMI1.1
and its therapeutically effective acid addition salts.
The polypeptide amide of the above formula can be prepared by methods generally known for the synthesis of compounds of this type, the amino acids being linked to one another individually in the order specified in the above formula or after prior formation of smaller peptide units and at a suitable stage of the synthesis after formation of the amino acid sequence 1 to 7, the disulfide bridge is formed and the carboxyl group of the terminal prolyl residue is converted into the amide group.
The amino acid and / or peptide units are linked e.g. in such a way that an amino acid with a protected a-amino group and activated terminal carboxyl group is reacted with an amino acid or a peptide with a free a-amino group and a free or protected terminal carboxyl group, or an amino acid or a peptide with an activated oc-amino group and a protected terminal carboxyl group is reacted with an amino acid or a peptide having a free terminal carboxyl group and a protected α-amino group.
The carboxyl group can be activated, for example, by conversion into an acid azide, anhydride, imidazolide, isoxazolide or an activated ester or by reaction using a carbodiimide or N, N'-carbonyl diimidazole. The carbodiimide method, the azide method, the activated ester method, the anhydride method and the Merrifield method are preferably used as the condensation method.
In the last stage of the condensation, however, methods are to be used in which racemization does not occur or can be kept low, preferably by using the azides or the activated esters, the activation preferably being carried out with N-hydroxysuccinimide.
Free functional groups that are not involved in the reaction can be protected during the synthesis of the peptide according to the invention by the protective groups known from the synthesis of long-chain peptides.
For example, the nitro group is used to block the guanido group of the arginine residue in the partial sequence C5 described below, but other suitable protective groups such as the tosyl group, the p-nitrocarbobenzoxy group or the 2- (isopropyloxycarhonyl) -3,4,5,6 -tetrachlorobenzoyl group can be used. The protective effect of protonation of the guanido group can also be used in the synthesis.
In the construction of the new polypeptide has been used for blocking the r-carboxyl group, for example in the partial sequence F1 described below, the tert. Butyloxy group proven, but other protecting groups, such as methoxy, ethoxy, tert. Amyloxy, the amide or the benzyloxy group can be used.
A carbo-tert-alkoxy group, preferably the carbo-tert-butoxy group, can be used for blocking the amino group of the lysine residue, for example in the partial sequences D1 and D2 described below.
The berzyl or trityl group is preferably used as the mercapto protecting group in the partial sequence F1 described below. Usually, the benzyl or trityl radicals used to protect the SH groups are split off at the end of the synthesis by treatment with sodium in liquid ammonia. It has now been found that the splitting off of the benzyl or trityl protective groups and the production of the SsJ bond before the last stage lead to particularly good yields of the end product.
The conversion of a protected mercapto or amino group into a free group and the conversion of a functionally modified carboxyl group into a free carboxyl group in the course of the process for the preparation of the new polypeptide is carried out according to methods known per se by treatment with hydrolyzing or reducing agents.
The starting products for the production of the new polypeptide can, if they were not previously known, be obtained by the methods known for peptide chemistry, the amino acids being linked to one another individually or after prior formation of smaller peptide units.
The new polypeptide can also be obtained or used in the form of its salts. Salts include those with organic acids, such as acetic acid, lactic acid, succinic acid, benzoic acid, salicylic acid, methanesulfonic acid, toluenesulfonic acid, and polymeric acids, such as tannic acid or carboxymethyl cellulose, and salts with inorganic acids, such as hydrohalic acids, e.g. Hydrochloric acid or sulfuric acid and phosphoric acid in question.
The heavy metal complex used e.g. the one from 00+ zinc in question.
The new polypeptide produced according to the invention represents an important therapeutic principle. It lowers the calcium plasma level and, as an antagonist of the parathyroid hormone, brings about a positive calcium balance in the bone. The biological activity of the new compound was tested on rats.
The dose to be administered depends on the desired effect and the type of application.
in general, however, satisfactory results are achieved with a once daily dose of 1 to 10 units per kg of animal weight. For larger mammals, the daily dose is about 70 to 700 units, which can be administered all at once or in several portions. For intramuscular administration, a suitable form of administration contains about 70 to 700 units of the active substance mixed with a liquid carrier.
The connection established according to the invention is thus indicated in all states. in which a lowering of the plasma calcium level or an influence on the bone metabolism is desired, e.g. Hypercalcaemia as a result of a lack of endogenous thyrocalcitonin due to the failure of thyroid tissue or hyperfunction of the parathyroid glands. It is also indicated for all bone affections that are based on increased degradation or in which calcium fixation in the bone is desired, e.g. Osteoporosis of various origins (e.g. post-climacteric, post-traumatic, caused by corticosteroid therapy or inactivity, etc.), fractures, osteomalacia, rickets and renal-related osteodystrophy, and especially for combination therapy with calcium or phosphate.
The compound prepared according to the invention can be used as a medicine, e.g. in the form of pharmaceutical preparations, use. (This contains the compound mentioned as a mixture with an organic or inorganic carrier material suitable for parenteral administration. It can also be administered in the form of a depot preparation.
The following abbreviations are used: Z = carbobenzoxy (benzyloxycarbonyl) Bzl = benzyl BOC = tert-butyioxycarbonyl Trt = trityl = triphenylmethyl OTB = tert-butyloxy ONP = p-nitrophenyl ester OCP = 2,4,5-trichlorophenoxy OMe = methoxy OEt = ethoxy NO2 = Nitro Ser = L-Seryl Asn = L-Asparaginyl Asp = L-Aspartyl Leu = L-Leucyl Thr = L-Threonyl Val = tL-Valyl Arg = L-Arginyl Gln = L-Glutaminyl His = L-Histidyl Pro = L-Prolyl Gly = Giycyi Lys = L-Lysyl Phe = L-Phenylalanine Cys = L-Cysteinyl Ala = L-Alanyl OSu = N-Oxysuccinimide
In the following examples, which illustrate the implementation of the method but are not intended to restrict the scope of the invention in any way,
all temperatures are given in degrees Celsius. The value c for the optical rotation is 1. The amino acid analysis in the following examples shows that the individual amino acids are present in the expected ratios.
1. Representation of the source material
Partial sequence A1: H-Val-Gly-Ala-Pro-NH2
27.5 g of Z-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 are suspended in 550 ml of methanol and, after addition of 3 ml of 96% sulfuric acid, hydrogenated in the presence of 4.1 ml of glacial acetic acid and 3.1 g of palladium carbon (10%) . After filtration and evaporation of the solution, the product (sulfate) shows Rfs = 0.2 in a thin-layer chromatogram on silica gel.
Partial sequence B1: Z-Thr-Asn-Thr-Gly-NHNH2
98 g of Z-Thr-Asn-ir-G1y-OEt are dissolved in 1000 ml of dimethylformamide, and 100 ml of hydrazine hydrate are added. After 16 hours of standing at room temperature, it is filtered off and washed with water and ether. The title compound is obtained, m.p .: 2210, [α] D20 = -90 in dimethylformamide.
Partial sequence C1:
H-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Val-Gly-Ala-Prn-NH2
13.5 g of BOC-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-NHNH2 are dissolved in 270 ml of dimethylformamide / water (8: 2), cooled to -150, and 40 ml of a 4N solution of hydrochloric acid in dioxane and 2.5 with tert-butyl nitrite. The mixture is stirred for 10 minutes at -150, 28 ml of triethylamine are added, filtered off, 10.5 g of H-Val-Gly-AlaWPro-NH2 (partial sequence A1) are added, the mixture is stirred for 16 hours at 00. Then it is evaporated to dryness, washes the residue with ether and dries. The 'residue is dissolved in methanol, a tenth volume of water and seven times the amount of chloroform are added and the resulting solution is passed through a column of 500 g of silica gel.
After elution with an increasing amount of methanol, after evaporation, BOC-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Vai-Gly-Ala-Pro-NH2 is obtained. This is suspended in 200 ml of a 4N solution of hydrochloric acid in dioxane and stirred for 2 hours at 250. It is evaporated to dryness, the residue is dissolved in 0.2N acetic acid, treated with Amberlit-IRA-410 (acetate form) and lyophilizes the aqueous solution. The residue is then washed with ether, ethyl acetate and again with ether and dried over sodium hydroxide shavings. The title compound is obtained in the form of the diacetate, m.p .: 195 (with decomposition), IIalo20 = -640 in dimethylformamide / XCl 1N (1: 1).
Partial sequence C2:
Z-Thr-Asn-Thr-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2
47 ml of a 1.85N solution of hydrochloric acid in dioxane and 2.2 ml of tert. Are added to a solution, cooled to 150, of 11 g of Z-Thr-Asn-Thr-Gly-NHN'H2 (partial sequence B1) in 350 mm of dimethylformamide. Butyl nitrite. The mixture is stirred for 10 minutes at -150, cooled to -300, mixed with 12 ml of triethylamine and filtered to obtain a cold solution of H-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 (partial sequence A1) in dimethylformamide. After 90 minutes of stirring at 00, the mixture is concentrated in vacuo, chloroform is added and the precipitated material is filtered off and dried.
A solution of this crude product in water-methanol is filtered through Dowex 50, neutralized with Amberlite IRA 410 and then evaporated in vacuo. The residue is triturated in acetonitrile, heated, filtered and dried. The title compound is obtained, m.p .: 2200 (with decomposition) [α] D20 = -280 in dimethylformamide.
Partial sequence C3:
Z3-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2
10 g of Z-Thr-Asn-Thr-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 (partial sequence C3) are dissolved in 800 ml of methanol-water, 0.5 g of palladium-carbon is added and the mixture is hydrogenated at normal pressure.
The catalyst is filtered off and evaporated in vacuo. The oil obtained, H-Thr-Asn-Thr-Gly Val-Gly-Ala-Pro-NH2, is dissolved in 100 ml of dimethylformamide, mixed with 10 g of Z3-Arg-OSu and left to stand at 200 for 16 hours. The solution is then concentrated in vacuo, and the product is precipitated with acetone and filtered off. The residue is finely suspended in acetone, boiled, filtered and dried. The title compound is obtained, m.p .: 2010 (with decomposition), [aio20 = - 150 in dimethylformamide.
Partial sequence D1:
Z-His-Lys (BOC) -Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-OH a) H-Thr-Phe-Pro-OH
176 g of Z-Phe * Pro-OMe are dissolved in 1000 ml of methanol / HCl 1 N, hydrogenated in the presence of IPamadium carbon at 200 and 1 atm. and evaporates. The residue is dissolved in 400 ml of dimethylformamide, 100 ml of triethylamine are added at 0, the crystallized triethylamine hydrochloride is filtered off and the filtrate is treated with Z-Thr; N3 (prepared from 87 g of Z-Thr-NHNH2 by dissolving in 100 ml of N hydrochloric acid and Add 35 ml of N sodium nitrite). The mixture is then left to stand at 00 for 16 hours, evaporated to dryness, the residue is dissolved in ethyl acetate, washed successively with dilute hydrochloric acid and dilute ammonia, dried and evaporated.
The residue is pulverized in heptane, washed with petroleum ether and dried. Z-Thr-Phe Pro-OMe, melting point 920 (decomp.), IX] D2O = -160 in dimethylformamide is obtained.
53 g of Z-Thr-Phe-Pro-OMe are dissolved in 530 ml of methanol, 100 ml of 2N sodium hydroxide solution are added, the mixture is left to stand at 250 for 1 hour, 50 ml of 2N hydrochloric acid are added, concentrated to approx. 200 ml, another 100 ml are added Add water, adjust the pH to 10, wash the aqueous solution twice with ethyl acetate, then adjust to pH 1 with 4N hydrochloric acid, extract the precipitated tripeptide Z Thr-Phe; Pro-C) H with ethyl acetate, dry and evaporate. M.p. 1050, IM] D20 = 280 in dimethylformamide.
The residue is dissolved in a mixture of 500 ml of dioxane and 100 ml of water and hydrogenated at 200 and normal pressure in the presence of a palladium catalyst.
It is filtered, evaporated to dryness, the residue is washed with ether and dried. H-Thr-Phe Pro-OH, m.p. 1920 (with decomposition), [a] D20 = 410 in acetic acid (95 5C) is obtained.
b) Z-His-Lys (BOC) -Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-OH
40 g of Z-His-Lys (BOC) -Leu-Gln-NH-NH2 are dissolved in 400 ml of dimethylformamide, cooled to 200, 75 ml of dioxane / HCl 2N and then 6 ml of tert-butyl nitrite are added, and the mixture is stirred at 200 for 10 minutes , add 30 ml of triethylamine and 20 g of H-Thr-3? he-Pro-OH and allow to react at 250 for 16 hours. It is then evaporated to dryness. washes the residue with ether, dilute acetic acid, ether and finally with hot ethyl acetate. It is then dried in a high vacuum and Z-His-Lys (BOC) -Leu -Gln-Thr-Phe-Pro-OH, m.p.
2000 (decomposition),] o2O = - 470 in dimethylformamide.
Partial sequence D2: Z-His-Lys (BOC) -Leu-GIn-Thr-Phe-Pro-NHNH2 a) Z Gin-Thr-Phe4> roOMe
84.8 g of Z-Thr (tBut.) - OMe are dissolved in 1500 ml of methanol, and 125 ml of 2N hydrochloric acid and 10 g of palladium (10% on carbon) are added. After 4 hours of hydrogenation, the catalyst is filtered off and completely evaporated.
61.2 g of ZGln-OH and 25.6 g of N'-hydroxysuccinimide are dissolved in 1000 ml of acetonitrile / 'dimethylformamide and cooled to -150. First a solution of 45.7 g of dicyclohexylcarbodiimide in 200 ml of aceto nitrile is rinsed in, then the HCl obtained above. H-Thr (t.But.) - OMe dissolved in dimethylformamide with the addition of 30.4 ml of triethylamine. The mixture is left to stand at room temperature for about 16 hours with occasional shaking. The crystallized triethylamine hydrochloride or the dicyclohexylurea are filtered off and the filtrate is completely evaporated. The residue is taken up in ethyl acetate and washed with 1 N hydrochloric acid and sodium bicarbonate 5%.
After drying over sodium sulfate, the organic phase is concentrated to a volume of approx. 200 ml and petroleum ether is added. The precipitated oil is converted into a powder and filtered off. Z-Gln-Thr (t.But.) - Orte, m.p. 1060, [α] D20 = +110 in dimethylformamide are obtained.
78.0 g of Z-Gln-Thr (t.But.) - OMe are dissolved in 800 ml of methanol, and 65 ml of hydrazine hydrate are added. After 48 hours of standing at room temperature, it is completely evaporated. The residue is treated with water and then recrystallized from methanol water. One obtains Z-Gln-Thr (t.But.) - NHNH2, m.p. 2020, la1n20 = - 130 in methanol.
45.3 g of Z-Phe-Pro-OMe are dissolved in 750 ml of methanol, and 55 ml of 2N hydrochloric acid and 12 g of palladium (10% on carbon) are added. After hydrogenation for 2 hours, the calculated amount of hydrogen has been consumed almost quantitatively. The catalyst is filtered off and the filtrate is completely evaporated.
49.5 g of Z-Gln-Thr (t.But.) - NHNH2 are dissolved in 500 ml of dimethylformamide and cooled to -200.
After adding 77 ml of 5N hydrochloric acid in ether and 13.4 ml of tert-butyl nitrite, stirring is continued for 10 minutes and the mixture is neutralized with 54 ml of triethylamine. The HCI obtained above. H-Phe-Pro-OMe is dissolved in 150 ml of dimethylformamide, mixed with 15.4 ml of triethylamine and rinsed to the dipeptide azide. After stirring for 4 hours at room temperature, the triethylamine hydrochloride which has crystallized out is filtered off and the filtrate is completely evaporated. The residue is filtered through a silica gel column using chloroform / methanol.
Awake crystallization from ethyl acetate / petroleum ether gives Z-Gln-Thr (t.But.) - Phe-Pro-OMe. M.p. 1100, [a] n20 = 410 in methanol.
The tetrapeptide is dissolved in 250 ml of trifluoroacetic acid. After standing for 20 minutes at room temperature, the solution is reduced to half its volume (Teent and the product is precipitated with ether. Filtration and sufficient washing with ether give, according to Trock, Z-Gln-Thr-Phe-Pro-OMe. Mp. 1540. [α] 20 D = 590 in methanol.
b) Z-His-Lys (BOC) -Leu-NHNH,
114 g of Z-Lys (BOC) -OH, 48 g of H-Leu-OMe and 69 g of N-hydroxysuccinimide are dissolved in 600 ml of ethyl acetate and cooled to -200. A solution of 65 g of dicyclohexylcarbodiimide in 300 ml of ethyl acetate is added there. The mixture is left to stand at room temperature for 16 hours with occasional shaking. The crystallized dicyclohexylurea is filtered off and the filtrate is completely evaporated. The solid residue is treated with water. After recrystallization from ethyl acetate / petroleum ether, Z-Lys (BOC) - Leu-OMe, melting point 1130, generally speaking] 20 = -180 in methanol is obtained.
101.5 g of Z-Lys (BOC) -Leu-OMe are dissolved in 1000 ml of ethyl acetate and a precooled solution of 40 ml of 5N hydrochloric acid in ether in 300 ml of ethyl acetate is added. After adding 5 g of palladium (10% on carbon) slurried in 50 ml of dimethylformamide, the mixture is hydrogenated for 31/2 hours. The calculated amount of hydrogen is used almost quantitatively. The catalyst is then filtered off and the filtrate is blown in.
78.7 g of Z-His-NHNH2 are dissolved in 400 ml of dimethylformamide, 182 ml of 5N hydrochloric acid in ether are added and the mixture is cooled to -IpO. After adding 32.5 ml of tert-butyl nitrite, the mixture is stirred for a further 10 minutes and neutralized with 140 ml of triethylamine.
The HC1 H-Lys (BOC) -Leu-OMe obtained above is dissolved in 300 ml of dimethylformamide, mixed with 36.4 ml of triethylamine and rinsed to the azide solution. After stirring for 4 hours at room temperature, the triethylamine hydrochloride which has crystallized out is filtered off and the filtrate is completely evaporated. An oil is obtained which is dissolved in ethyl acetate. After washing with water, the organic phase is dried over sodium sulfate. filtered and concentrated. It is then precipitated with petroleum ether and filtered off. The crude product is purified by chromatography on silica gel and elution with chloroform / methanol.
Crystallization from ether / petroleum ether gives Z-His-Lys (BOC) -Leu OMe, m.p. 1460, t02o = -280 in methanol.
64.5 g of Z-His-Lys (13OC) -Leu-OMe are dissolved in 300 ml of methanol, and 15 ml of hydrazine hydrate are added. After standing for 3 days at room temperature, the solution is completely evaporated. The residue is mixed with ethyl acetate / n-butanol and washed several times with saturated sodium chloride solution. The organic phase is evaporated to dryness and the residue is filtered through a silica gel column with chloroform / methanol. Z-His-Lys (BOC) -Leu-! NHNH2, melting point 1810 fr] ¯20 = 260 in methanol is obtained.
c) Z-His-Lys (BOC) -Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-NHNH2
38.4 g of Z-Gln-Thr-Phe-Pro-OiMe are dissolved in 1500 ml of methanol / dimethylformamide. 10 g of palladium (10% on charcoal) are suspended in 50 ml of water and rinsed in. After about an hour, the calculated amount of hydrogen is practically consumed. The catalyst is filtered off and the filtrate is evaporated.
38.6 g of Z-EIis-; Lys (BoO-Leu-NHNHo are dissolved in 250 ml of dimethylformamide. After cooling to 15, 42 ml of 5N hydrochloric acid in ether and 7.3 ml of tert-butyl nitrite are added. The mixture is stirred for 10 minutes and with 29.5 ml of triethylamine are neutralized.The H-Gln-Thr-PheEro-OIMe obtained above is dissolved in 250 ml of dimethylformamide and rinsed with the peptide azide solution.After 4 hours of stirring at room temperature, the precipitated triethylamine hydrochloride is filtered off and the filtrate is completely evaporated The residue is taken up in ethyl acetate / n-butanol and washed with 1N ammonia, 1N sulfuric acid and several times with water.
The organic phase is completely evaporated and the residue is purified on a silica gel column with chloroform / methanol / water. Z-His-Lys (BOC) -Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-OMe, m.p.
171, [α] 20 D = 540 in methanol.
43.6 g of Z-His-Lys (BOC) -Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-OMe are dissolved in 1000 ml of methanol / dimethylformamide, and 44 ml of hydrazine hydrate are added. After standing for 4 days at room temperature, the solution is completely evaporated. The residue is boiled in acetonitrile. After cooling to approx. 200, it is filtered off.
Z-His-Lys (BOC) -Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-NHNH2, mp 1750, fo] n20 = -580 in methanol is obtained.
Partial sequence E1:
H-His-Lys (BOC) -Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-Arg-Thr- Asn-Thr- Gly-Val-Gly-A la-Pro-NH2 Method A
10 g of heptapeptide (partial sequence D1) are dissolved in 100 ml of dimethylformamide, evaporated, the residue is dissolved in 100 ml of dimethylformamide, 15 g of N-hydroxysuccinimide are added, the mixture is cooled to 0, 5 g of dicyclohexylcarbodiimide are added, allowed to react for 3 hours, filtered the excreted dicyclohexylurea is concentrated to 30 ml and the resulting heptapeptide oxysuccinimide ester Z-His-Lys (BOC) -Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-OSu is precipitated by adding ether. After washing with ether, the residue is dissolved in 100 ml of dimethylformamide, mixed with 10 g of nonapeptide amide (partial sequence C1) and left to react for 16 hours.
500 ml of ethyl acetate are added and the mixture is filtered. The residue is dissolved in dimethylformamide. add 10 ml of acetic acid and fall again with ethyl acetate. It is filtered, washed with ethyl acetate and ether and dried.
Z-His-Lys (BOC) -Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 2 AcOH, [O2O = - 240 in dimethylformamide is obtained , which is dissolved directly in 80% acetic acid. Then 5 g of palladium carbon are added and the mixture is hydrogenated at normal pressure and room temperature. It is filtered, evaporated to dryness at 200 in a high vacuum and the residue is washed with ether. After drying over KOTI chips, the partial sequence E1 is obtained: triacetate, melting point 1850 (with decomposition), [α] D20-42 in 1N acetic acid.
Method B.
12 g of nonapeptide (partial sequence C5) are dissolved in 1000 ml of dimethylformamide / water, 1.8 g of palladium-carbon are added and the mixture is hydrogenated at normal pressure. The catalyst is filtered off and the filtrate is concentrated to 60 ml in vacuo. This solution of H-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly Val-Gly-Ala-Pro-WH2 is kept at -200.
21 ml of a 1.85 N solution of hydrochloric acid are added to a solution, precooled to -150, of 10 g of Z-His-Lys (BOC) -Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-NHNH2 (partial sequence D2) in 100 ml of dimethylformamide in dioxane and 1.1 ml of tert-butyl nitrite. The mixture is stirred for 10 minutes at -150, cooled to -300, 6 ml of triethylamine are added and the mixture is filtered to obtain a cold solution of H-ArEs-Thr Asn-Thr-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NHO in dimethylformamide. After 90 minutes of stirring at 00, the solution is concentrated in vacuo, chloroform is added, the precipitate is filtered off, washed with chloroform and then with ethyl acetate and dried.
The crude product is dissolved in a mixture of methanol / chloroform / water and applied to a silica gel column. It is eluted, the pure fractions are combined and evaporated to dryness in vacuo.
The residue is dissolved in methanol, the product is precipitated with ethyl acetate, filtered and dried. Z-His Lys (BOC) -Leu-Gln-Thr-Phe-Pro -Arg-Thr-Asn-Thr-Gly Val-Gly-Ala-Pro-NH2, m.p. 1850 (with decomposition), ralDZO = - 290 in dimethylformamide.
3.68 g of the hexadecapeptide obtained in this way are dissolved in 120 ml of dimethylformamide / water, mixed with 3 g of palladium (10% on carbon) suspended in 10 ml of water and subjected to catalytic hydrogenation.
After about 2 hours, the calculated amount of hydrogen is practically consumed. The catalyst is filtered off and the filtrate is completely evaporated and the partial sequence E1 is obtained.
Partial sequence F1:
Trt-Gly-Lys (BOC) -Leu-Ser-Gln-Asp (OTB) -Leu-
NHNH2 a) Z-Asp (OTB) -Leu-OMe
151 g of Z-Asp (OTB) -OH and 54 g of N-hydroxysuccinimide are dissolved in 700 ml of acetonitrile and cooled to 200. 96.5 g of dicyclohexylcarbodiimide, dissolved in 350 ml of acetonitrile, are then added. After about 30 minutes of standing, the dicyclohexylurea formed is filtered off. 71.2 g of H-Leu-OMe are added to the filtrate, then left to stand for 4 hours and evaporated in vacuo. The solid residue is mixed with ethyl acetate / water. The organic phase is then washed with 5% sodium bicarbonate solution, water and with dilute sulfuric acid (pH 3), dried over sodium sulphate and evaporated after being washed neutral.
The residue is dissolved with chloroform, to which 1% methanol has been added, and filtered through a silica gel column (10-fold amount).
Z-Asp (OTB) -Leu-OMe, melting point 580, IaJ20 = 160 in dimethylformamide is obtained.
b) Z-Gln-Asp (OTB) -Leu-OMe
118 g of ZkAsp (OTB) -Leu-OMe are dissolved in 2000 ml of methanol. Then 15 g of 10% palladium on activated charcoal are stirred in 63 ml of 4N hydrochloric acid and added to the solution. The whole is subjected to hydrogenation for two hours at room temperature and normal pressure. Approx. 85% of the theoretical amount of hydrogen is consumed here. The catalyst is filtered off and the filtrate is evaporated completely, H-Asp (OTB) -Leu-OMe HCl being obtained in the form of an amorphous foam.
91.7 g of Z-Gln-ONP and 93.8 g of H-Asp (OTB) -Leu OMe HCI are dissolved in 500 ml of dimethylformamide and mixed with 51 ml of N-methylmorpholine. The mixture is left to stand for 15 hours at room temperature and the solution is then completely evaporated in vacuo. The residue obtained in this way is processed well with water and the water is filtered off. It is then recrystallized from methanol. Z-Gln-Asp (OTB) - Leu-OMe, melting point 1890 (decomp.), RilD20 = - 300 in dimethylformamide is obtained.
c) Z-Ser-Gln-A sp (OTB) -Leu- OMe
44.4 g of Z-Gln-Asp (OTB) -Leu-OMe are dissolved in 1200 ml of methanol / dimethylformamide. Then 15 g of 107 total palladium on activated charcoal are added to 50 ml of water and added to the solution. After a hydrogenation time of about 2 hours, the calculated amount of hydrogen is almost consumed. The catalyst is filtered off and the filtrate is evaporated in vacuo.
21.4 g of Z-Ser-NHNH2 dissolved in 100 ml of dimethylformamide are cooled to -200 and mixed with 50.6 ml of 5N hydrochloric acid in ether and 10.3 ml of tert-butyl nitrite. After stirring for 10 minutes, the pH is adjusted to 7.5 with 35.6 ml of triethylamine and 34.2 g of H-Gln-Asp (OT'B) -Leu-OMe, dissolved in 100 ml of dimethylformamide, are added. The mixture is stirred for 4 hours at 200, the precipitated triethylamine hydrochloride is filtered off and the filtrate is completely evaporated. After treatment of the residue with water and subsequent crystallization from water / methanol, the crude product is purified by filtration through a silica gel column with chloroform / methanol. Z-Ser-Gln-Asp (OTB) -Leu OMe, melting point 172, [CC] D20 = 240 in dimethylformamide is obtained.
d) Trt-Gly-Lys (BOC) -Leu-NHNH,
50.8 g of ZLys (BOC) -Leu-OMe are dissolved in 600 ml of ethyl acetate and, after addition of 25 ml of 4N hydrochloric acid in ether and 3 g of palladium (10% on carbon), are catalytically hydrogenated. After approx. 4 hours the calculated amount of hydrogen is almost completely consumed. The catalyst is filtered off and the filtrate is concentrated to half its volume.
33.0 g of Trt-Gly-OH and 12.0 g of N-hydroxysuccinimide are dissolved in 150 ml of dimethylformamide and cooled to -150. A solution of 21.6 g of dicyclohexylcarbodiimide in 100 ml of acetonitrile is rinsed in and the mixture is left to stand for 3 hours at room temperature with occasional shaking.
The dicyclohexylurea which has crystallized out is filtered off and the dipeptide solution obtained from the above hydrogenation is added to the filtrate with the addition of 25 ml of N-methylmorpholine. After 16 hours of standing, it is completely evaporated. The residue is taken up in ethyl acetate and treated at 00 with 1N sulfuric acid and 5% sodium bicarbonate solution. After drying over sodium sulfate, the organic phase is completely evaporated. Filtration of the resulting foam through a silica gel column with chloroform / methanol gives Trt-Gly-Lys (BOC) -Leu-OMe in the form of an amorphous foam, ICC] D2O = 100 in methanol.
The residue is dissolved in 300 ml of methanol, 17 ml of hydrazine hydrate are added and the mixture is left to stand at room temperature for 16 hours. After complete evaporation and subsequent drying in a high vacuum, it is filtered through a silica gel column using chloroform / methanol. Crystallization from chloroform / petroleum ether gives Trt-Gly-Lys (B0e3-Leu-NIFNH ?, m.p. 1750, [aJ25 = - 120 in methanol.
e) Trt-Gly-Lys (BOC) -Leu-Ser-Gln-Asp (OTB) -Leu-
NHNH2
26.6 g of ZSerGln-Asp (OTB) -Leu-OMe are dissolved in 1 liter of methanol / dimethylformamide, suspended in 100 ml of water with 5 g of palladium (10% on carbon), added and subjected to catalytic hydrogenation. The calculated amount of hydrogen is consumed after 1 hour. The catalyst is filtered off and the filtrate is concentrated to remove methanol.
29.6 g of Trt-Gly-Lys (BOC) JLeu-NHNH2 are dissolved in 150 ml of dimethylformamide. It is cooled to 200 and mixed with 26.2 ml of 5N hydrochloric acid in ether and with 5.3 ml of tert-butyl nitrite. After stirring for 10 minutes, 18.5 ml of triethylamine and the concentrated solution of H-Ser-Gln-Asp (OTB) -Leu-OMe obtained above are added. The mixture is stirred for 4 hours at room temperature, then the precipitated triethylamine hydrochloride is filtered off and the filtrate is completely evaporated. The residue is taken up in ether, processed into a powder and suction filtered.
This crude product is purified by filtration through a silica gel column with chloroform / methanol. One receives Trt-Gly-Lys (BOC) -Leu-Ser-Gln-Asp (OTB) -Leu OMe, mp 2170, [iD20 = 300 in methanol.
The heptapeptide is dissolved in 400 ml of methanol, 1.4 ml of hydrazine hydrate are added and the mixture is stirred at room temperature for 48 hours. The precipitated hydrazide is filtered off, washed with ether and dried to constant weight. M.p. 218, [α] D20 = 160 in dimethylformamide.
Partial sequence G1 Trt-Gly-Lys (BOC) -Leu-Ser-Gln-Asp (OTB) -Leu -His-
Lys (BOC) -Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-A rg-Thr-A sn-Thr Gly-VaI-Gly-AI-Pro-NHfl 2CH2COOH 3H2O
2.43 g of heptapeptide (partial sequence F1) are dissolved in 30 ml of dimethylformamide. After cooling to -200, 1.45 ml of 5N hydrochloric acid in ether and 0.252 ml of tert-butyl nitrite are added. The mixture is left to stir for a further 10 minutes and then neutralized with 1.01 ml of triethylamine. ; The hexadecapeptide E1 is dissolved in 50 ml of dimethylformamide and rinsed to the heptapeptide azide solution. After 4 hours of stirring at room temperature, the precipitated triethylamine hydrochloride is filtered off with suction and the filtrate is completely evaporated.
The residue is dissolved warm in a little methanol and precipitated by adding ether. The crude product is chromatographed on a silica gel column and eluted with chloroform / methanol / water. The title compound is obtained with a melting point of 2250, 10C] D2 = -180 in dimethylformamide.
example
EMI6.1
650 mg of tricosapeptide (partial sequence G1) are dissolved in 30 ml of 60% acetic acid and left to stand for 16 hours at room temperature. After adding water, it is washed several times with ether.
The water phase is eluted through an Amberlite IRA 410 acetate column and the solution is then completely evaporated.
295 mg are dissolved
EMI6.2
Val-Len-OH in 10 ml of diirethyisulfoxide / dimethylformamide, adds 131 mg of N> hydroxysuccinimide and 59 mg of dicyclohexylcarbodiimide and, after standing for 6 hours, filters off the dicyclohexylurea which has separated out. The tricosapeptide obtained above by splitting off the protective groups is dissolved in 10 ml of dimethylformamide and rinsed to the filtrate. After 48 hours of standing at room temperature, the product is precipitated by adding ether and the supernatant solution is decanted off. The precipitate is dissolved in a little methanol and converted into a powder by adding more ether.
After filtering off with suction and drying, 220 mg of the protected, crude Dotriacontapeptide are dissolved in 4 ml of a methylene chloride / trifluoroacetic acid / water mixture. The solution is completely evaporated after standing for 1 hour at room temperature.
The residue is taken up in 0.2N acetic acid and layered on a biogel column JP- (1 X 300 cm).
Elution is carried out with 0.2N acetic acid. The combined pure fractions are evaporated and then lyophilized. The title compound is obtained, m.p. 2150 (decomp.),! AiID20 = -750 in 1N acetic acid.
Amino acid composition after acid hydrolysis (6N, 16 hours) Asp 3.1; Thr 3.7; Ser 2.8; Gln 1.9; Pro 2.0; Gly 2.9; Ala 1.0; Cys 1.6; Val 2.0; Leu 5.2; Phe 1.0; His 1.0; Lys 2.0; Arg 0.9.
PATENT CLAIMS
I. Process for the preparation of the new polypeptide amide of the formula
EMI6.3
and its therapeutically effective acid addition salts, characterized in that corresponding amino acids necessary for its structure are condensed with one another in any chronological order to form CONH bonds. where free functional groups not participating in the reaction are intermediately protected by suitable protective groups, and that at any point in the synthesis, after formation of the amino acid sequence 1 to 7, the mercapto groups are oxidized to the disulfide, the carboxyl group of the terminal prolyl radical is converted into the amide group and that Reaction product finally wins in the form of the free base or a therapeutically effective acidic salt.
II. Use of the polypeptide amide of the formula prepared according to claim I
EMI6.4
for the production of heavy metal complexes, characterized in that the polypeptide amide of the above formula is converted into the corresponding heavy metal complexes by reaction with heavy metal salts.
Note from the Federal Office for Intellectual Property:
If parts of the description are not in accordance with the definition of the invention given in the patent claim, it should be remembered that according to Art. 51 of the Patent Act, the patent claim is decisive for the material scope of the patent.
** WARNING ** End of DESC field could overlap beginning of CLMS **.