Die vorliegende Erfindung betrifft das neue Polypeptidamid der Formel
EMI1.1
seine therapeutisch wirksamen Säureadditionssalze und Schwermetallkomplexe sowie Verfahren zu seiner Herstellung.
Das Polypeptidamid der obigen Formel kann nach für die Synthese von Verbindungen dieser Art allgemein bekannten Methoden hergestellt werden. wobei die Aminosäuren in der in der obigen Formel festgelegten Reihenfolge einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten miteinander verknüpft werden und bei einer geeigneten Stufe der Synthese die Disulfidbrücke gebildet wird. Die Verknüpfung derAminosäure und oder Peptideinheiten erfolgt z.
B. in der Weise dass man eine Aminosäure mit geschützter a-Aminogruppe und aktivierter terminaler Carboxylgruppe mit einer Aminosäure oder einem Peptid mit freier a-Aminogruppe und freier oder geschützter terminaler Carboxylgruppe umsetzt oder dass man eine Aminosäure oder ein Peptid mit aktivierter a-Ami- nogruppe und geschützter terminaler Carboxylgruppe mit einer Aminosäure oder einem Peptid mit freier terminaler Carboxylgruppe und geschützter a-Aminogruppe umsetzt.
Die Carboxylgruppe kann beispielsweise durch Überführung in ein Säureazid-. anhvdrid. -imidazolid. -isoxazolid oder einen aktivierten Ester oder durch Reaktion mittels eines Carbodiimids oder N.N-Carbonyl-diimidazolo aktiviert werden. Vorzugsweise wird als Kondensationsmethode die Carbodiimidmethode. die Azidmethode. die Methode der aktivierten Ester, die Anhydridmethode oder die Merrifieldmethode verwendet.
In der letzten Stufe der Kondensation sind jedoch Methoden zu verwenden, bei denen Racemisierung nicht auftritt oder gering gehalten werden kann, vorzugsweise durch Verwendung der Azide oder der aktivierten Ester. wobei die Aktivierung vorzugsweise mit N-Hydroxysuccinimid vorgenommen wird.
An der Reaktion nicht beteiligte freie, funktionelle Gruppen können beim Aufbau des erfindungsgemässen Peptids durch die von der Synthese langkettiger Peptide her bekannten Schutzgruppen geschützt werden.
So verwendet man beispielsweise für die Blockierung der Guanidogruppe des Argininrestes in der nachstehend beschriebenen Teilsequenz B die Nitrogruppe, doch können auch andere geeignete Schutzgruppen. wie die Tosylgruppe, die p Nitrocarbobenzoxygruppe oder die 2-(Isopropyloxycarbonyl)- 3,4.5.6-tetrachlorobenzoylgruppe verwendet werden. Man kann auch den Schutzeffekt der Protonisierung der Guanidogruppe bei der Synthese verwenden.
Beim Aufbau des neuen Polypeptids hat sich für die Blokkierung der ,-Carboxylgruppe, beispielsweise in der nachstehend beschriebenen Teilsequenz D, die tert.-Butyloxygruppe bewährt, doch können auch andere Schutzgruppen. wie die Methoxv. die Äthoxy-. die tert.-Amyloxy-, die Amid- oder die Benzyloxygruppe verwendet werden.
Für die Blockierung der eI)-Aminogruppe des Lysinrestes.
beispielsweise in der nachstehend beschriebenen Teilsequenz C, kann eine Carbo-tert.-alkoxygruppe. vorzugsweise die Carbo-tert.-butoxygruppe verwendet werden.
Als Mercaptoschutzgruppe in den nachstehend beschriebenen Teilsequenzen EF verwendet man vorzugsweise die Ben zyl- oder die Tritylgruppe. Üblicherweise werden die zum Schutz der SH-Gruppen verwendeten Benzyl- bzw. Tritylreste am Ende der Synthese durch Behandlung mit Natrium in flüssigem Ammoniak abgespalten. Es wurde nun gefunden, dass die Abspaltung der Benzyl- bzw. Tritylschutzgruppen sowie die Herstellung der S-S-Bindung vor der letzten Stufe zu besonders guten Ausbeuten an Endprodukt führt.
Die Umwandlung einer geschützten Mercapto- oder Aminogruppe in eine freie Gruppe sowie die Umwandlung einer funktionell abgewandelten Carboxylgruppe in eine freie Carboxylgruppe im Laufe des Verfahrens zur Herstellung des neuen Polypeptids erfolgt nach an sich bekannten Methoden durch Behandlung mit hydrolysierenden bzw. reduzierenden Mitteln.
Die Ausgangsprodukte zur Herstellung des neuen Polypeptids können, sofern sie bisher nicht bekannt waren, nach den für die Peptidchemie bekannten Methoden erhalten werden, wobei die Aminosäuren einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten miteinander verknüpft werden.
Das neue Polypeptid lässt sich auch in Form seiner Salze gewinnen bzw. verwenden. Als Salze kommen solche mit organischen Säuren, wie beispielsweise Essigsäure, Milchsäure, Bernsteinsäure, Benzoesäure, Salicylsäure, Methansulfonsäure, Toluolsulfonsäure sowie polymere Säuren, wie Gerbsäure oder Carboxymethylcellulose und Salze mit anorganischen Säuren, wie Halogenwasserstoffsäuren, z. B. Salzsäure oder Schwefelsäure und Phosphorsäure in Frage. Als Schwermetallkomplex kommt z. B. derjenige vom Zinks in Frage.
Das erfindungsgemäss hergestellte neue Polypeptid stellt ein wichtiges therapeutisches Prinzip dar. Es senkt den Calciumplasmaspiegel und bewirkt als Antagonist des Parathormons eine positive Calciumbilanz im Knochen. Die biologische Wirkung der neuen Verbindung wurde an Ratten geprüft.
Die zu verabreichende Dosis hängt von der gewünschten Wirkung sowie von der Applikationsart ab. Im allgemeinen werden jedoch mit einer einmal zu verabreichenden Tagesdosis von 1 bis 10 Einheiten pro kg Tiergewicht zufriedenstellende Resultate erzielt. Für grössere Säugetiere beträgt die Tagesdosis etwa 70 bis 700 Einheiten, die auf einmal oder in mehreren Anteilen verabreicht werden können. Für die intramuskuläre Applikation enthält eine geeignete Verabreichungsform etwa 70 bis 700 Einheiten der Wirksubstanz, vermischt mit einem flüssigen Träger.
Die erfindungsgemäss hergestellte Verbindung ist somit indiziert bei allen Zuständen, bei welchen eine Senkung des Plasmacalciumspiegels bzw. Beeinflussung des Knochenstoffwechsels erwünscht ist, z. B. Hypercalcämien infolge Mangels des endogenen Thyreocalcitonins durch Ausfall von Schilddrüsengewebe oder Hyperfunktion der Nebenschilddrüsen. Sie ist ferner indiziert bei allen Knochenaffektionen, die auf einem vermehrten Abbau beruhen oder bei welchen eine Calciumfixation im Knochen erwünscht ist. z. B. Osteoporose verschiedener Genese (z. B. postklimakterisch, posttraumatisch, bedingt durch Corticosteroidtherapie oder Inaktivität usw.), Frakturen, Osteomalacie, Rachitis und renal bedingte Osteodystrophie, sowie insbesondere zur Kombinationstherapie mit Calcium bzw. Phosphat.
Die erfindungsgemäss hergestellte Verbindung kann als Heilmittel, z. B. in Form pharmazeutischer Präparate, Verwendung finden. Dieses enthält die genannte Verbindung in Mischung mit einem für die parenterale Applikation geeigneten organischen oder anorganischen Trägermaterial. Sie kann auch in Form eines Depotpräparates verabreicht werden.
Es werden folgende Abkürzungen verwendet: Z = Carbobenzoxy (Benzyloxycarbonyl) Bzl = Benzyl BOC = tert.-Butyloxycarbonyl Trt = Trityl = Triphenylmethyl OTB = tert.-Butyloxy ONP = p-Nitrophenylester OCP = 2,4,5-Trichlorphenoxy OMe = Methoxy OEt = Athoxy NO = Nitro Ser = L-Seryl Asn = L-Asparaginyl Asp = L-Aspartyl Lèu = L-Leucyl Thr = L-Threonyl Val = L-Valyl Arg = L-Arginyl Gln = L-Glutaminyl His = L-Histidyl Pro = L-Prolyl Gly = Glycyl Lys = L-Lysyl Phe = L-Phenylalanin Cys = L-Cysteinyl Ala = L-Alanyl
OSu = N-Oxysuccinimid
In den folgenden Beispielen, welche die Ausführung des Verfahrens erläutern, den Umfang der Erfindung aber in keiner Weise einschränken sollen, erfolgen alle Temperaturan .gaben in Celsiusgraden. Der Wert c für die optische Drehung beträgt 1.
Die Aminosäureanalyse in den folgenden Beispielen ergibt, dass die einzelnen Aminosäuren in den erwarteten Verhältnissen vorliegen.
Teilsequenz A: H-Ala-Gly-Val-Pro-NH a) Z-Val-Pro-NH2
Man löst 75 g H-Pro-NH2 in 850 ml Dimethylformamid, versetzt mit 312 g Z-Val-OCP und lässt anschliessend die Lösung für 16 Stunden bei Raumtemperatur stehen. Nach Eindampfen im Vakuum wird der Rückstand aus Essigester umkristallisiert. Man erhält Z-Val-Pro-NH2. Smp.: 1301310, [a]D' = 410G in Dimethylformamid.
b) Z-Gly-Val-Pro-NH2
Man löst Z-Val-Pro-NH2 in 2200 ml Methanol, gibt 85 ml 6N methanolische Salzsäure zu. hydriert in Anwesenheit von Palladiumkohle bei 200 und Normaldruck und filtriert darauf vom Katalysator ab. Das Produkt wird mit Äther ausgefällt, gewaschen und anschliessend getrocknet. 120 g des erhaltenen H-Val-Pro-NH2.HCl (Zp: 217-2180; [2]DO = - 57o in Methanol) suspendiert man in 1800 ml Dimethylformamid, gibt 196 g Z-Gly-OCP, dann 67 ml Triäthylamin zu und schüttelt für 17 Stunden bei 200. Das ausgeschiedene Triäthylaminhydrochlorid wird abfiltriert und das Filtrat im Vakuum eingedampft. Den Rückstand löst man in einem Gemisch Essigester/Wasser.
Nach Trocknen über Na2SO4 und Eindampfen erhält man Z-Gly-Val-Pro-NH2. Smp.: 820 (mit Zers.) [alD = -760C in Methanol.
c) Z-Ala-Gly-Val-Pro-NH2
Man löst 101 g Z-Gly-Val-Pro-NH2 in 800 ml Methanol und hydriert bei Normaldruck und 200 in Anwesenheit von Palladiumkohle. Man filtriert, dampft im Vakuum zur Trockne ein, löst den Rückstand in 1000 ml Dimethylformamid, gibt
111 g Z-Ala-OCP zu, schüttelt und lässt 17 Stunden bei 200 stehen. Hierauf dampft man die Lösung im Vakuum zur Trockne ein, löst den Rückstand in Essigester und wäscht mit
1 N Salzsäure und 1 N NH40H. Man trocknet über Na2SO4, dampft zur Trockne ein, wäscht den Rückstand mit Äther, trocknet und erhält Z-Ala-Gly-Val-Pro-NH2. Smp.: 1650, [ctl2DO = - 490C in Dimethylformamid.
d) H-Ala-Gly-Val-Pro-NH2, Sulfat
Man suspendiert 27,5 g Z-Ala-Gly-Val-Pro-NH2 in 550 ml Methanol und hydriert nach Zugabe von 3 ml 96 %Der Schwefelsäure in Gegenwart von 4,1 ml Eisessig und 3,1 g Palladiumkohle (10%). Nach Filtration und Eindampfen der Lösung zeigt das Produkt im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel Rfs = 0,4.
System: Chloroform/Methanol 7:3 + 0,5% Wasser.
Teilsequenz B: BOC-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-NHNH2 a) Z-Asn-Thr-Gly-OEt
Man löst 43 g H-Thr-Gly-OEt in 500 ml Dimethylformamid und hydriert bei Normaldruck und Zimmertemperatur in Anwesenheit von Palladiumkohle. Man filtriert, gibt 60 g Z Asn-OCP zu, lässt 16 Stunden bei 250 stehen, konzentriert auf ca. 250 ml, gibt Essigester zu, wäscht mit verdünnter Salzsäure, trocknet über Natriumsulfat und dampft zur Trockne ein. Der Rückstand wird mit Essigester gewaschen und getrocknet. Man erhält Z-Asn-Thr-Glv-OEt. Smp.: 2250, [a]D = - 40C in Dimethylformamid.
b) Z-Thr-Asn-Thr-Gly-OEt
Man löst 29 g Z-Asn-Thr-Gly-OEt in 700 ml Dimethylformamid, hydriert bei Normaldruck und Zimmertemperatur in Anwesenheit von Palladiumkohle, filtriert und versetzt das Filtrat mit Z-Thr-N3, das aus 30 g Z-Thr-NHNH2 hergestellt wurde. Nach 12 Stunden bei 00 dampft man zur Trockne ein, wäscht den Rückstand mit Wasser, Ather und Äthanol. Man erhält Z-Thr-Asn-Thr-Gly-OEt, Smp. 2300, [a]D = - 80C in Dimethylformamid.
c) BOC-Arg.Thr-Asn-Thr-Gly-NHNH2
Man löst 22 g Z-Thr-Asn-Thr-Gly-OEt in 700 ml Dimethylformamid, hydriert bei Normaldruck und Zimmertemperatur in Anwesenheit von Palladiumkohle und filtriert. Man löst 23 g BOC-Arg(NO2)-OH in 500 ml Dimethylacetamid, gibt 12 ml Triäthylamin zu, kühlt auf - 100, gibt 9,4 ml Chlorameisensäureisobutylester hinzu, lässt 10 Minuten reagieren und gibt die oben erhaltene Tetrapeptidlösung zu. Näch 30 Min.
bei 250 fügt man 100 ml Wasser hinzu, behandelt die erhaltene Lösung mit Amberlit-IRA-410 (OH-Form) bis zur negativen Chlorreaktion, filtriert und dampft zur Trockne ab. Man wäscht den Rückstand mit Chloroform, Essigester und Äther und trocknet. Man erhält BOC-Arg(NO2)-Thr-Asn-Thr-Gly- OEt. Smp. 1000, [zeo = 4o in Dimethylformamid. Man löst 12 g BOC-Arg(NO2)-Thr-Asn-Thr-Gly-OEt in einem Gemisch von 200 ml Essigsäure und 40 ml Wasser, hydriert in Anwesenheit von Palladiumkohle bei 200 und Normaldruck, filtriert und dampft im Vakuum bei 200 zur Trockne ein. Man löst den Rückstand in Dimethylformamid und dampft ab.
Diese Behandlung wird wiederholt, bis keine Essigsäure mehr nachweisbar ist. Man löst den Rückstand in 120 ml Dimethylformamid, gibt 6 ml Hydrazinhydrat zu, lässt 16 Stunden bei 250 stehen, dampft ab, wäscht den Rückstand mit Äther, Methanol/Äther (1:1) und danach wiederum mit Äther und trocknet. Man erhält BOC-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-NHNH2, Smp. 1750 (mit Zersetzung), [abo = 420C in Dimethylformamid/HCl 1 N (1:1).
Teilsequenz AB: H-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ala-Gly-Val Pro-NH 2 CH3COOH Maro löst 13,5 g BOC-Arg.Thr-Asn-Thr-Gly-NHNH2 (Teilsequenz B) in 270 ml Dimethylformamid/Wasser (8:2), kühlt auf - 150, gibt 40 ml einer 4 N Lösung von Salzsäure in Dioxan und 2,5 ml tert.-Butylnitrit zu. Man rührt 10 Minuten bei - 150, gibt 28 ml Triäthylamin zu, filtriert ab, gibt 10,5 g H Ala-Gly-Val-Pro-NH (Teilsequenz A) zu, rührt 16 Stunden bei 00. Danach dampft man zur Trockne ein, wäscht den Rückstand mit Äther und trocknet. Man lässt den Rückstand in Methanol, gibt einen Zehntel Volumen Wasser und die siebenfache Menge Chloroform hinzu und lässt die erhaltene Lösung durch eine Säule von 500 g Kieselgel.
Nach Eluierung mit einer steigenden Menge an Methanol erhält man nach Eindampfen BOC-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ala-Gly-Val-Pro-NH2.
Dieses suspendiert man in 200 ml einer 4 N Lösung von Salzsäure in Dioxan und rührt während 2 Stunden bei 250. Man dampft zur Trockne ein, löst den Rückstand in 0,2 N Essigsäure, behandelt mit Amberlit-IRA-410 (Acetat-Form) und lyophylisiert die wässrige Lösung. Hierauf wäscht man den Rückstand mit Äther, Essigester und wieder Äther und trocknet über Natriumhydroxid-Späne. Man erhält H-Arg-Thr Asn-Thr-Gly-Ala-GlyWal-Pro-NH -2 2 CH3COOH. Smp.
155 (mit Zers.) [a]Db = -38C in Dimethylformamid.
Teilsequenz C: Z-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-OH a) H-Thr-Phe-Pro-OH
Man löst 176 g Z-Phe-Pro-OMe in 1000 ml Methanol/HCl
1 N, hydriert in Anwesenheit von Palladiumkohle bei 20 und
1 Atm. und dampft ein. Man löst den Rückstand in 400 ml Dimethylformamid, gibt bei 00 100 ml Triäthylamin zu, filtriert das auskristallisierte Triäthylaminhydrochlorid ab und versetzt das Filtrat mit Z-Thr-N3 (hergestellt aus 87 g Z-Thr-NHNH2 durch Lösen in 100 ml N Salzsäure und Versetzen mit 35 ml N Natriumnitrit). Man lässt hierauf 16 Stunden bei 00 stehen, dampft zur Trockne ein, löst den Rückstand in Essigester, wäscht nacheinander mit verdünnter Salzsäure und verdünntem Ammoniak, trocknet und dampft ein. Man pulverisiert den Rückstand in Heptan, wäscht mit Petroläther und trocknet.
Man erhält Z-Thr-Phe-Pro-OMe, Smp. 920 (Zers.), [a]D) = - 16C in Dimethylformamid.
Man löst 53 g Z-Thr-Phe-Pro-OMe in 530 ml Methanol, gibt 100 ml 2 N Natronlauge zu lässt 1 Stunde bei 250 stehen, gibt 50 ml 2 N Salzsäure zu, konzentriert auf ca. 200 ml, gibt noch 100 ml Wasser zu, stellt das pH auf 10 ein, wäscht die wässrige Lösung zweimal mit Essigester, stellt anschliessend mit 4 N Salzsäure auf pH 1 ein, extrahiert das ausgeschiedene Tripeptid Z-Thr-Phe-Pro-OH mit Essigester, trocknet und dampft ein. Smp. 105 [a]20 = - 280 in Dimethylformamid.
Man löst den Rückstand in einem Gemisch von 500 ml Dioxan und 100 ml Wasser und hydriert bei 200 und Normaldruck in
Gegenwart eines Palladiumkatalysators. Man filtriert, dampft zur Trockne ein, wäscht den Rückstand mit Äther und trock net. Man erhält H-Thr-Phe-Pro-OH, Smp. 1920 (mit Zersetzung), [a]20 = -4lin Essigsäure (956X), b) Z-Leu-Gln-OMe
Man löst 70 g Z-Gln-OH in 1,5 1 Dioxan und lässt soviel ätherische Diazomethanlösung zufliessen, bis die Lösung gelb gefärbt bleibt. Anschliessend wird die Lösung eingedampft und der weisse Rückstand mit Äther verarbeitet. Man erhält Z
Gln-OMe, Smp. 1360, [a]D = 210 in Dimethylformamid.
Man löst 71 g Ester in 1,7 1 Methanol. Danach werden 5 g lO c Palladium auf Aktivkohle mit 59 ml einer 4 N Salzsäure angerührt und in die Lösung gegeben. Das Ganze wird einer 3stündigen Hydrierung bei Raumtemperatur und Normaldruck unterworfen. Hierbei wird ca. 83 % der theoretischen Menge an Wasserstoff verbraucht. Der Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat vollständig eingedampft, wobei H-Gln-OMe HCl in Form eines zähen Öls erhalten wird.
Man löst 64 g Z-Leu-OH in 200 ml Acetonitril, versetzt mit
27,7 g N-Hydroxysuccinimid und kühlt auf - 10o ab. Dazu giesst man eine Lösung von 50 g Dicyclohexylcarbodiimid in
100 ml Acetonitril. In ca. 30 Minuten wird vom Dicyclohexylharnstoff abfiltriert. Das Filtrat versetzt man mit 47,3 g H Gln-OMe - HCl, gelöst in Dimethylformamid, unter gleichzeitiger Zugabe von einem äquivalenten N-Methylmorpholin.
Man lässt 4 Stunden stehen und dampft ein. Der Rückstand wird in Essigester gelöst und mit 5% Natriumbicarbonatlösung, 1 N Salzsäure und Wasser gewaschen. Die organische Phase trocknet man über Natriumsulfat und dampft im Vakuum ein. Nach Umkristallisation aus Methanol und Äther erhält man Z-Leu-Gln-OMe, Smp. 1790, [a]2" = - 16C in Dimethylformamid.
c) Z-Lys(BOC)-Leu-Gln-OMe
42 g Z-Leu-OMe werden in 1500 ml Methanol gelöst.
Danach werden 16 g 10% Palladium auf Aktivkohle mit 25,8 ml einer 4 N Salzsäure angerührt und in die Lösung gegeben. Das Ganze wird einer 8-stündigen Hydrierung bei Raumtemperatur und Normaldruck unterworfen. Hierbei werden 95% der theoretischen Menge Wasserstoff verbraucht. Der Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat eingedampft. Man erhält H-Leu-Gln-OMe - HCl in Form eines Schaumes. Man löst hierauf H-Leu-GLn-OMe . HCI in 300 ml Dimethylformamid, gibt 34 g Z-Lys(BOC)-OCP und 8,4 ml Triäthylamin zu.
Nach Umschütteln lässt man während 16Stunden¯stehen.
Hierauf wird das Reaktionsgemisch am Vakuum eingedampft.
Der Rückstand wird mit Wasser behandelt und vom Wasser abfiltriert. Anschliessend löst man in wenig Methanol und fällt mit Äther. Nach Filtration und Trocknen erhält man Z-Lys (BOC)-Leu-Gln-OMe, [a]0 = -21oC in Dimethylformamid.
d) Z-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-NH-NH2
Man löst 38 g Z-Lys(BOC)-Leu-Gln-OMe in 300 ml Dimethylformamid, gibt 15 g 10%ige Palladiumkohle zu, hydriert bei Normaldruck und Zimmertemperatur und filtriert vom Katalysator ab. Hierauf versetzt man mit aus 52,2 g Z-His NHNH2 hergestelltem Z-His-N3, lässt 5 Stunden bei 200 stehen, dampft ab, löst den Rückstand in Essigester, wäscht mit Wasser, trocknet über Natriumsulfat, dampft ab, und wäscht den Rückstand mit Äther. Man erhält Z-His-Lys(BOC)-Leu Gln-OMe, Smp.1200 (mit Zersetzung), [a]D =- 190 in Dimethylformamid. Man löst 33 g Z-His-Lys-(BOC)-Leu-Gln-OMe in 330 ml Methanol, versetzt mit 7,5 ml Hydrazinhydrat, lässt zwei Tage bei 250 stehen und dampft anschliessend zur Trockne ein.
Man löst hierauf in Dimethylformamid, dampft ein und wiederholt diese Behandlung, bis keine Spuren von Hydrazin mehr nachweisbar sind. Man wäscht den Rückstand mit Äther, Wasser und Äther, trocknet und erhält Z-His Lys(BOC)-Leu-Gln-NH-NH2, Smp. 1 99o, [a]D = - 22oC in Methanol.
e) Z-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-CH
Man löst 40 g Z-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-NH-NH2 in 400 ml Dimethylformamid, kühlt auf 200, gibt 75 ml Dioxan/HCl 2 N und anschliessend 6 ml. tert.-Butylnitril zu, rührt 10 Minuten bei - 200, gibt 30 ml Triäthylamin und 20 g H Thr-Phe-Pro-OH zu und lässt 16 Stunden bei 250 reagieren.
Man dampft hierauf zur Trockne ein, wäscht den Rückstand mit Äther, verdünnter Essigsäure, Äther und schliesslich mit heissem Essigester. Hierauf trocknet man im Hochvakuum und erhält Z-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-OH, Smp.
2000 (Zersetzung), [a]Do = - 470C in Dimethylformamid.
Teilsequenz ABC: H-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr Gly-Ala-Gly-Val-Pro-NH2 3 CH3CO2H
Man löst 10 g Heptapeptid (Teilsequenz C) in 100 ml Dimethylformamid, dampft ein, löst den Rückstand in 100 ml Dimethylformamid, versetzt mit 15 g N-Hydroxysuccinimid, kühlt auf 00 ab, gibt 5 g Dicyclohexylcarbodiimid zu, lässt 3 Stunden reagieren, filtriert den ausgeschiedenen Dicyclohexylharnstoff ab, konzentriert auf 30 ml und fällt den entstandenen Heptapeptidoxysuccinimidester H-His-Lys(BOC)-Leu-Gln Thr-Phe-Pro-OSu durch Zusatz von Äther aus. Nach Auswaschen mit Äther löst man den Rückstand in 100 ml Dimethylformamid, versetzt mit 10 g Nonapeptidamid (Teilsequenz AB) und lässt während 16 Std. reagieren. Man gibt 500 ml Essigester zu und filtriert.
Man löst den Rückstand in Dime thylformamid, gibt 10 ml Essigsäure zu und fällt wiederum mit Essigester. Man filtriert, wäscht mit Essigester sowie Äther und trocknet. Man erhält Z-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Phe- Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ala-Gly-Val-Pro-NH2 2 AcOH, [a]D = - 310 in Dimethylformamid, das man direkt in 80 %iger Essigsäure löst. Anschliessend werden 5 g Palladiumkohle hinzugefügt, bei Normaldruck und Zimmertemperatur hydriert. Man filrteirt, dampft bei 200 im Hochvakuum zur Trockne und wäscht den Rückstand mit Äther. Nach Trocknen über KOH-Spänen erhält man die Teilsequenz ABC, Smp.
1640 (mit Zers.), [a]D = - 190C in Dimethylformamid.
Teilsequenz D Trt-Gly-Lys(B OC)-Leu-Ser-Gln-Asp (OTB)-Leu-NHNH2 a) Z-Asp(OTB)-Leu-OMe
Man löst 151 g Z-Asp(OTB)-OH, 54 g N-Hydroxysuccinim id in 700 ml Acetonitril und kühlt auf - 200C ab. Anschliessend gibt man 96,5 g Dicyclohexylcarbodiimid, gelöst in 350 ml Acetonitril hinzu. Nach ca. 30 Minuten Stehenlassen wird der entstandene Dicyclohexylharnstoff abfiltriert. Zu dem Filtrat werden 71,2 g H-Leu-OMe gegeben, danach 4 Stunden stehen gelassen und am Vakuum eingedampft. Den festen Rückstand versetzt man mit Essigester/Wasser (2:1). Die organische Phase wird hierauf mit 5 % Natriumbicarbonatlösung, Wasser und mit verdünnter Schwefelsäure (pH 3) gewaschen, nach dem Neutralwaschen über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft.
Man löst den Rückstand mit Chloroform, dem 1% Methanol zugesetzt wurde, und filtriert über einer Kieselgelsäure (10-fache Menge). Man erhält Z Asp(OTB)-Leu-OMe, Smp. 1310, [a]Dn = 230 in Dimethylformamid.
b) H-Gln-Asp(OTB)-Leu-OMe
Man löst 118 g Z-Asp(OTB)-Leu-OMe in 2000 ml Methanol. Danach werden 15 g 10% Palladium auf Aktivkohle in 63 ml 4 N Salzsäure angerührt und in die Lösung gegeben. Das Ganze wird einer zweistündigen Hydrierung bei Raumtemperatur und Normaldruck unterworfen. Hierbei werden ca. 85% der theoretischen Menge Wasserstoff verbraucht. Der Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat vollständig eingedampft, wobei H-Asp(OTB)-Leu-OMe . HCl in Form eines amorphen Schaumes erhalten wird.
91,7 g Z-Gln-ONP und 93,8 h H-Asp(OTB)-Leu-OMe HCI werden in 500 ml Dimethylformamid gelöst und mit 5 ml N-Methylmorpholin versetzt. Man lässt 15 Stunden bei Zimmertemperatur stehen und dampft hierauf die Lösung am Vakuum vollständig ein. Der so erhaltene Rückstand wird mit Wasser gut verarbeitet und vom Wasser abfiltriert. Anschliessend wird aus Methanol umkristallisiert. Man erhält Z-Gln Asp(OTB)-Leu-OMe, Smp. 1900 (Zers.), [a]D0 - 280 in Dimethylformamid. Man löst 44,4 g Z-Gln-Asp(OTB)-Leu OMe in 1200 ml Methanol/Dimethylformamid (1:1). Danach werden 15 g 10%ges Palladium auf Aktivkohle in 50 ml Wasser versetzt und in die Lösung gegeben. Nach ca. 2-stündiger Hydrierzeit ist fast die quantitative Menge an Wasserstoff verbraucht. Der Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat am Vakuum eingedampft.
Der Rückstand wird in Essigester gelöst und dreimal mit gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen.
Die organische Phase trocknet man über Natriumsulfat und dampft das Filtrat auf ca. 1/3 des ursprünglichen Volumens ein.
Nach Zugabe von Petroläther lässt sich das feste Tripeptid abfiltrieren. Man erhält H-Gln-Asp(OTB)-Leu-OMe, Smp.
1750, [a]20 = - 180in Dimethylformamid.
c) Z-Lys(BOC)-Leu-Ser-OMe
Man löst 43 g H-Leu-Ser-OMe HCI und 80 g Z-Lys(BOC) OCP in 400 ml Dimethylformamid, gibt 22 ml Triäthylamin zu, lässt 25 Stunden bei 250 stehen, filtriert das ausgeschiedene Triäthylamin ab und dampft das Filtrat zur Trockne ein. Man löst den Rückstand in Essigester, wäscht mit verdünnter Salzsäure sowie verdünnter Kaliumbicarbonatlösung, trocknet über Natriumsulfat, filtriert und dampft ein. Man kristallisiert den Rückstand aus Essigester/Äther um und erhält Z-Lys(BOC)-Leu-Ser-OMe, Smp. 1100, [a]D = - 140in Dimethylformamid.
d)Trt-Gly-Lys(BOC)-Leu-Ser-NHNH
Man löst 158 g Trt Gly-OH in 2000 ml Dichloromethan und 72 ,1 Triäthylamin, kühlt auf - 5o, versetzt mit 50 ml Chlorameisensäureäthylester und rührt 10 Minuten bei - 5o, Gleichzeitig löst man 300 g Z-Lys(BOC)-Leu-Ser-OMe in 3000 ml Dioxan/Wasser (8:2), hydriert in Anwesenheit von Palladiumkohle bei Zimmertemperatur und Normaldruck, filtriert und dampft ab. Man löst den Rückstand in Chloroform und versetzt mit dem oben erhaltenen gemischten Anhydrid. Man lässt 1 Stunde bei 00 stehen, wäscht die Chloroformlösung mit verdünnter Essigsäure und anschliessend mit verdünnter Kaliumbicarbonatlösung, trocknet und dampft zur Trockne ein.
Man löst den Rückstand in 1250 ml Methanol, versetzt mit 175 ml Hydrazinhydrat und lässt 16 Stunden bei 25o stehen.
Man konzentriert auf 500 ml, versetzt mit Wasser, filtriert, wäscht den Rückstand mit Wasser und trocknet über Phosphorpentoxid. Man erhält Trt-Gly-Lys(BOC)-Leu-Ser NHNH2, Smp. 2040, [ol]D = - 60 in Dimethylformamid.
e) Trt-Gly-Lys(BOC)-Leu-Ser-Gln-Asp(OTB)-Leu-NHNH2
Man lässt 76 g Trt-Gly-Lys(BOC)-Leu-Ser-NHNH2 in 300 ml Dimethylformamid, kühlt auf - 200, gibt 75 ml Dioxan/HCl 4 N und anschliessend 11,6 ml tert.-Butylnitrit zu, rührt 10 Minuten bei - 15 , versetzt mit 70 ml Triäthylamin und mit 49,5 g H-Gln-Asp(OTB)-Leu-OMe. Hierauf rührt man während 16 Stunden bei 00. Man filtriert das ausgeschiedene Triäthylaminhydrochlorid ab, konzentriert das Filtrat auf ca. 100 ml und versetzt den Rückstand mit Wasser. Man filtriert den ausgeschiedenen Rückstand ab, der anschliessend mit Wasser durchgewaschen wird und trocknet schliesslich im Hochvakuum bei 500. Der Rückstand wird mit Essigester ausgekocht, mit Äther gewaschen und getrocknet.
Der erhaltene Heptapeptidester Trt-Gly-Lys(B OC)-Leu-Ser-Gln- Asp(OTB-Leu-OMe (Smp. 2110), [G]D0 = - 380C in Dimethylformamid) wird in 200 ml Dimethylformamid gelöst, mit 4 ml Hydrazin versetzt und 24 Stunden bei 25o stehen gelassen.
Nach Konzentrieren auf ca. 100 ml gibt man 500 ml Wasser zu, filtriert vom ausgeschiedenen Material ab, wäscht mit Wasser bis zur Neutralreaktion und trocknet über Phosphorpentoxid bei 500. Man erhält Trt-Gly-Lys(BOC)-Leu-Ser-Gln Asp(OTB)-Leu-NHNH2, Smp. 2200, [J]D0 = 290 in Dimethylformamid/Wasser (8:2).
Teilsequenz ABCD: H-Gly-Lys(BOC)-Leu-Ser-Gln-Asp(OTB)-Leu-His-Lys(BOC).
Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ala-Gly Val-Pro-NH2 3 AcCH 3 H20
Man löst 3 g Heptapeptidhydrazid (Teilsequenz D) in 30 ml Dimethylformamid, kühlt auf - 200, gibt 2 ml Dioxan/HCl 4 N und anschliessend 0,3 ml tert.-Butylnitrit zu. Man rührt während 10 Minuten bei 200, gibt 2 ml Triäthylamin und 3 g Hexadecapeptidamid (Teilsequenz ABC) zu, rührt 16 Stunden bei 00 dampft zur Trockne ab. Man wäscht den Rückstand bei 00 mit verdünnter Essigsäure und anschliessend mit Wasser, filtriert, löst den Rückstand in Methanol/Wasser (9:1), filtriert über Kieselgel, dampft dem Rückstand ab, wäscht mit Essigester, löst in 200 ml 80% Essigsäure auf, lässt 4 Stunden bei 25o stehen, dampft bei 200 zur Trockne, wäscht den Rückstand mit Äther, Essigester und Äther, filtriert und trocknet.
Man erhält die Teilsequenz ABCD. Smp. 188 (mit Zers.), [u]2' = - 7C in Dimethylformamid,
Teilsequenz E:
H-Thr-Cy(Bzl)-Val-Leu-OH a) H-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe HBr
Man löst 21.0 g Z-Cys(Bzl)-OCP und 12,3 g H-Val-Leu OMe HCI in 120 ml Dimethylformamid. Danach gibt man 5,9 ml Triäthylamin hinzu, lässt 16 Stunden bei 250 stehen, fügt Essigester hinzu, wäscht mit verdünnter Salzsäure, trocknet über Natriumsulfat. dampft zur Trockne ab und kristallisiert den Rückstand aus Essigsäureäthylester/Diäthyläther.
Man erhält Z-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe, Smp. 1600, [z]D2O = - 28 in Dimethylformamid. das man in 210 ml einer 40%igen Lösung von Bromwasserstoff in Eisessig löst. Man lässt 1 Stunde bei 25 stehen, dampft zur Trockne ein und kristallisiert den Rückstand aus Isopropanol/Diäthyläther um. Man erhält H-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe HBr, Smp. 1680, [α]D20= = + 14C in Dimethylformamid.
b) H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe 1,3 HBr
Man löst 20 g Z-Thr-NHNH2 in 350 ml Dimethylformamid, kühlt auf -20 gibt 100 ml einer Lösung von 2 N Salzsäure in Dioxan und anschliessend noch 10 ml tert.-Butylnitrit zu. Nach 10 Minuten bei - 20 werden 45 ml Triäthylamin und 25,5 g H-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe HBr hinzugefügt und das erhaltene Gemisch während 16 Stunden bei 0 geschüttelt. Man dampft zur Trockne ein. Iöst den Rückstand in einem Gemisch von Essigsäure äthylester/ Wasser, wäscht die organische Phase mit verdünnter Salzsäure. trocknet über Natriumsulfat. dampft ein und kristallisiert den Rückstand aus Essigester um.
Man erhält Z-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe; Smp. 2080, {]D2O = -27 in Dimethylformamid. Man löst 20 g von dem oben erhaltenen Tetrapeptid in 200 ml eines Gemisches von Trifluor essigsäure1Essigester (1:1) auf. leitet während 1 Stunde bei 0 einen Strom gasförmigen Bromwasserstoffs ein, dampft anschliessend ein und kristallisiert den Rückstand aus MethanoliDiäthyläther um. Man erhält H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu
OMe 1 ,3HBr. Smp. 202 [a]2E' = - lots in Dimethylformamid.
c) H-Thr-Cvs(Bzl)-Val-Leu-OMe 1,3 HBr in 1800 ml Methanol. gibt 900 ml 7 N Natronlauge zu, lässt 1 Stunde bei 25o stehen. gibt 240 ml Eisessig zu und lässt 2 Stunden bei 0 stehen. Man filtriert die ausgeschiedene kristalline Masse ab, wäscht diese zuerst mit 1 N Essigsäure, anschliessend mit Wasser und trocknet bei 500 im Hochvakuum. Man erhält H Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OH, Smp. 2190, [a]D) = -53C in 1 N Ammoniak.
Teilsequenz F1
BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser-NHNH2 a) H-Asn-Leu-Ser-OMe HCI
Man löst g H-Leu-Ser-OMe HCl und 53 g BOC-Asn
ONP in 400 ml Dimethylformamid auf. gibt 22 ml Triäthyl amin zu, lässt 16 Stunden bei 250 stehen, dampft zur Trockne ein und kristallisiert den Rückstand aus Methanol um,Man erhält BOC-Asn-Leu-Ser-OMe. Smp. 1900, [α]D20 = -24O in Dimethylformamid. das man in 500 ml einer 4 N Lösung von Salzsäure in Methanol löst. Man lässt 1 Stunde bei 250 stehen, dampft zur Trockne ein. Iöst den Rückstand in Methanol und fällt mit Diäthyläther.
Man erhält H-Asn-Leu-Ser-OMe HCI, Smp. 1800, [a]D' = - 23 C in Dimethylformamid.
b) H-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe HCI
Man löst 39.5 g BOC-Ser-NHNH in 500 ml Dimethylformamid, kühlt auf-20 . gibt 200 ml einer 2 N Lösung von Salzsäure und Dioxan und anschliessend 20 ml tert.Butylnitrit zu. Nach 10 Minuten bei - 200 werden 90 ml Triäthylamin und 38,0 g H-Asn-Leu-Ser-OMe HCl hinzugefügt, danach 16 Stunden bei 0 gerührt, zur Trockne eingedampft und der Rückstand aus Chloroform/Diäthyläther umkristallisiert. Man erhält BOC-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe, Smp. 1350 [i2o - - 220 in Dimethylformamid, das man in 420 ml einer 4 N Salzsäurelösung in Methanol löst. Man lässt 1 Stunde bei 25o stehen, dampft zur Trockne ein und kristallisiert aus Methanol/Essigsäureäthylester um. Man erhält H-Ser-Asn-Leu-Ser- OMe HCI.
Smp. 155o (Zers.), [a]D = - 150C in Dimethylformamid.
c) BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser-NHNH2
Man löst 18,5 g H-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe . HCI und 18 g BOC-Cys(Bzl)-ONP in 100 ml Dimethylformamid auf, gibt 10 ml Wasser, 3,5 ml Essigsäure und 5,6 ml Triäthylamin zu, lässt 16 Stunden bei 250 stehen, dampft zur Trockne ein und kristallisiert aus Methanol um. Man erhält BOC-Cys(Bzl)-Ser Asn-Leu-Ser-OMe, Smp. 1820, [rc]D - - 170 in Dimethylformamid, das man unter leichtem Erwärmen in 200 ml Dimethylformamid löst. Man gibt 200 ml Methanol und 20 ml Hydrazinhydrat zu, lässt 16 Stunden bei 300 stehen, fällt mit Diäthyläther, wäscht den Niederschlag mit Diäthyläther/ Methanol (1:1) und trocknet das so erhaltene BOC-Cys(Bzl) Ser-Asn-Leu-Ser-NHNH2, Smp. 2240, [a]D = - 130C in Dimethylformamid.
EMI5.1
Man löst 18,4 g BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser-NHNH2 (Teilsequenz F) in 150 ml Dimethylformamid, kühlt auf - 200, gibt 40 ml einer 2 N Lösung von Salzsäure in Dioxan und 15 ml tert.-Butylnitrit zu. Nach 10 Minuten bei 200 gibt man noch 28 ml Triäthylamin und 16,2 g H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu OH (Teilsequenz E) zu und rührt 16 Stunden bei 25 . Danach wird filtriert, die Lösung eingedampft und der Rückstand mit
1N Essigsäure durchgewaschen. Man erhält BOC-Cys(Bzl) Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OH, Smp. 217 , [α]D20 = -17 in Dimethylformamid. Man löst das erhaltene Produkt in 5000 ml getrocknetem Ammoniak, gibt unter rühren und Sieden des Ammoniaks Natriummetall bis zur tiefblauen Färbung zu.
Zwecks Entfärbung wird Ammoniumchlorid hinzuge Saugt. Man dampft zur Trockne ein und wäscht den Rückstand mit 1 N Essigsäure und Aceton durch. Nach Trocknen erhält man BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-OH, Smp.
2480 (Zers.), [a]2OD = 410 in Dimethylformamid/Wasser (3:1). Man löst das so erhaltene Nonapeptid in 5000 ml 0,01 N Ammoniak auf, gibt unter Rühren 1 N Wasserstoffperoxid bis zur negativen Nitroprussiatreaktion zu, dann noch 200 ml Eisessig, filtriert und lyophilisiert. Man erhält
EMI5.2
[(lIDO = - 180C in Dimethylformamid/Wasser (3:1).
EMI5.3
Man löst 1,0 g Nonapeptid (Teilsequenz EF) in 10 ml Dimethylformamid, gibt 1,5 g N-Hydroxysuccinimid und 0,52 g Dicyclohexylcarbodiimid zu, rührt 6 Stunden bei 25 , filtriert und dampft das Filtrat zur Trockne ein. Man wäscht den Rückstand mit Essigester und Diäthyläther und trocknet.
Man erhält
EMI6.1
Smp. 2420, das man in 10 ml Dimethylformamid löst. Zu dieser Lösung gibt man 3,1 g Tricosapeptid-Diacetat (Teilsequenz ABCD) und 1,2 g N-Hydroxysuccinimid und rührt 16 Stunden bei 25 . Man dampft zur Trockne ein, wäscht den Rückstand mit Diäthyläther, Chloroform und Aceton. So erhält man das rohe, geschützte Dotriaconapeptid, das man in 50 ml eines Gemisches von Chloroform/Methanol/Wasser (70:30:5) löst: Man schichtet die erhaltene Lösung auf eine Kieselgelsäule (5 x 100 cm), die mit dem obengenannten Gemisch äquilibriert wurde. Die Elution wird mit einer steigenden Konzentration von Methanol durchgeführt. Die vereinigten Fraktionen, die das reine Peptid enthalten, werden abgedampft, anschliessend mit Diäthyläther gewaschen und über Kaliumhydroxid im Hochvakuum getrocknet.
Man erhält die Titelverbindung, Smp. 1980 (mit Zers.), [cl]D = - 46" in Dimethylformamid.
EMI6.2
Hexaacetat Decahydrat
Man löst 3,3 g geschütztes Dotriacontapeptid diacetat tri hydrat (Beispiel 1) unter Stickstoffatmosphäre in 100 ml Trifluoressigsäure, lässt 15 Minuten bei 200 stehen und dampft zur Trockne ein. Man löst in 300 ml 0,2 N Essigsäure, behandelt mit 20 ml Amberlit-IRA-410 (Acetat), lyophilisiert, wäscht mit Diäthyläther und trocknet über Kaliumhydroxyd im Hochvakuum. Man erhält die Titelverbindung, Smp. 172 (Zers.), [(liDO = - 680 in 50%iger Essigsäure.
The present invention relates to the new polypeptide amide of the formula
EMI1.1
its therapeutically effective acid addition salts and heavy metal complexes and processes for its production.
The polypeptide amide of the above formula can be prepared by methods well known for the synthesis of compounds of this type. wherein the amino acids are linked to one another in the order specified in the above formula, individually or after prior formation of smaller peptide units, and the disulfide bridge is formed at a suitable stage of the synthesis. The amino acid and / or peptide units are linked e.g.
B. in such a way that one reacts an amino acid with a protected a-amino group and activated terminal carboxyl group with an amino acid or a peptide with a free a-amino group and free or protected terminal carboxyl group, or that an amino acid or a peptide with activated a-ami- nogruppe and protected terminal carboxyl group with an amino acid or a peptide with free terminal carboxyl group and protected α-amino group.
The carboxyl group can, for example, be converted into an acid azide. anhvdrid. -imidazolid. -isoxazolide or an activated ester or activated by reaction using a carbodiimide or N.N-carbonyl-diimidazolo. The preferred condensation method is the carbodiimide method. the azide method. the activated ester method, the anhydride method or the Merrifield method are used.
In the last stage of the condensation, however, methods are to be used in which racemization does not occur or can be kept low, preferably by using the azides or the activated esters. the activation preferably being carried out with N-hydroxysuccinimide.
Free functional groups that are not involved in the reaction can be protected during the synthesis of the peptide according to the invention by the protective groups known from the synthesis of long-chain peptides.
For example, the nitro group is used to block the guanido group of the arginine residue in the partial sequence B described below, but other suitable protective groups can also be used. such as the tosyl group, the p-nitrocarbobenzoxy group or the 2- (isopropyloxycarbonyl) - 3,4,5,6-tetrachlorobenzoyl group can be used. The protective effect of protonation of the guanido group can also be used in the synthesis.
In the construction of the new polypeptide, the tert-butyloxy group has proven useful for blocking the -carboxyl group, for example in the partial sequence D described below, but other protective groups can also be used. like the Methoxv. the ethoxy. the tert-amyloxy, the amide or the benzyloxy group can be used.
For blocking the eI) amino group of the lysine residue.
For example, in the partial sequence C described below, a carbo-tert-alkoxy group can be used. preferably the carbo-tert-butoxy group can be used.
The benzyl or trityl group is preferably used as the mercapto protecting group in the partial sequences EF described below. The benzyl or trityl radicals used to protect the SH groups are usually split off at the end of the synthesis by treatment with sodium in liquid ammonia. It has now been found that the splitting off of the benzyl or trityl protective groups and the production of the S-S bond before the last stage lead to particularly good yields of the end product.
The conversion of a protected mercapto or amino group into a free group and the conversion of a functionally modified carboxyl group into a free carboxyl group in the course of the process for the preparation of the new polypeptide is carried out according to methods known per se by treatment with hydrolyzing or reducing agents.
The starting products for the production of the new polypeptide can, if they were not previously known, be obtained by the methods known for peptide chemistry, the amino acids being linked to one another individually or after prior formation of smaller peptide units.
The new polypeptide can also be obtained or used in the form of its salts. The salts are those with organic acids such as acetic acid, lactic acid, succinic acid, benzoic acid, salicylic acid, methanesulfonic acid, toluenesulfonic acid and polymeric acids such as tannic acid or carboxymethyl cellulose and salts with inorganic acids such as hydrohalic acids, e.g. B. hydrochloric acid or sulfuric acid and phosphoric acid in question. As a heavy metal complex z. B. the one from zinc in question.
The new polypeptide produced according to the invention represents an important therapeutic principle. It lowers the calcium plasma level and, as an antagonist of the parathyroid hormone, brings about a positive calcium balance in the bone. The biological activity of the new compound was tested on rats.
The dose to be administered depends on the desired effect and the type of application. In general, however, satisfactory results are achieved with a once daily dose of 1 to 10 units per kg of animal weight. For larger mammals, the daily dose is about 70 to 700 units, which can be administered all at once or in several portions. For intramuscular administration, a suitable form of administration contains about 70 to 700 units of the active substance mixed with a liquid carrier.
The compound produced according to the invention is thus indicated in all conditions in which a reduction in the plasma calcium level or an influence on the bone metabolism is desired, e.g. B. Hypercalcemia as a result of a lack of endogenous thyreocalcitonins due to the failure of thyroid tissue or hyperfunction of the parathyroid glands. It is also indicated for all bone affections that are based on increased degradation or for which calcium fixation in the bone is desired. z. B. Osteoporosis of various origins (e.g. post-climacteric, post-traumatic, caused by corticosteroid therapy or inactivity, etc.), fractures, osteomalacia, rickets and renal osteodystrophy, and especially for combination therapy with calcium or phosphate.
The compound prepared according to the invention can be used as a remedy, e.g. B. in the form of pharmaceutical preparations, use. This contains the compound mentioned in a mixture with an organic or inorganic carrier material suitable for parenteral administration. It can also be administered in the form of a depot preparation.
The following abbreviations are used: Z = carbobenzoxy (benzyloxycarbonyl) Bzl = benzyl BOC = tert-butyloxycarbonyl Trt = trityl = triphenylmethyl OTB = tert-butyloxy ONP = p-nitrophenyl ester OCP = 2,4,5-trichlorophenoxy OMe = methoxy OEt = Athoxy NO = Nitro Ser = L-Seryl Asn = L-Asparaginyl Asp = L-Aspartyl Lèu = L-Leucyl Thr = L-Threonyl Val = L-Valyl Arg = L-Arginyl Gln = L-Glutaminyl His = L-Histidyl Pro = L-Prolyl Gly = Glycyl Lys = L-Lysyl Phe = L-Phenylalanine Cys = L-Cysteinyl Ala = L-Alanyl
OSu = N-oxysuccinimide
In the following examples, which illustrate the implementation of the process but are not intended to restrict the scope of the invention in any way, all temperatures are given in degrees Celsius. The value c for the optical rotation is 1.
The amino acid analysis in the following examples shows that the individual amino acids are present in the expected proportions.
Partial sequence A: H-Ala-Gly-Val-Pro-NH a) Z-Val-Pro-NH2
75 g of H-Pro-NH2 are dissolved in 850 ml of dimethylformamide, 312 g of Z-Val-OCP are added and the solution is then left to stand for 16 hours at room temperature. After evaporation in vacuo, the residue is recrystallized from ethyl acetate. Z-Val-Pro-NH2 is obtained. M.p .: 1301310, [a] D '= 410G in dimethylformamide.
b) Z-Gly-Val-Pro-NH2
Z-Val-Pro-NH2 is dissolved in 2200 ml of methanol, and 85 ml of 6N methanolic hydrochloric acid are added. hydrogenated in the presence of palladium carbon at 200 and normal pressure and then filtered off from the catalyst. The product is precipitated with ether, washed and then dried. 120 g of the H-Val-Pro-NH2.HCl obtained (zp: 217-2180; [2] DO = - 57o in methanol) are suspended in 1800 ml of dimethylformamide, 196 g of Z-Gly-OCP, then 67 ml of triethylamine and shakes at 200 for 17 hours. The precipitated triethylamine hydrochloride is filtered off and the filtrate is evaporated in vacuo. The residue is dissolved in a mixture of ethyl acetate / water.
After drying over Na2SO4 and evaporation, Z-Gly-Val-Pro-NH2 is obtained. M.p .: 820 (with dec.) [AlD = -760C in methanol.
c) Z-Ala-Gly-Val-Pro-NH2
101 g of Z-Gly-Val-Pro-NH2 are dissolved in 800 ml of methanol and hydrogenated at normal pressure and 200 in the presence of palladium carbon. It is filtered, evaporated to dryness in a vacuum, the residue is dissolved in 1000 ml of dimethylformamide
Add 111 g of Z-Ala-OCP, shake and let stand at 200 for 17 hours. The solution is then evaporated to dryness in vacuo, the residue is dissolved in ethyl acetate and washed with
1 N hydrochloric acid and 1 N NH40H. It is dried over Na2SO4, evaporated to dryness, the residue is washed with ether, dried and obtained Z-Ala-Gly-Val-Pro-NH2. M.p .: 1650, [ctl2DO = - 490C in dimethylformamide.
d) H-Ala-Gly-Val-Pro-NH2, sulfate
27.5 g of Z-Ala-Gly-Val-Pro-NH2 are suspended in 550 ml of methanol and, after addition of 3 ml of 96% sulfuric acid, hydrogenated in the presence of 4.1 ml of glacial acetic acid and 3.1 g of palladium carbon (10%) . After filtration and evaporation of the solution, the product shows Rfs = 0.4 in a thin-layer chromatogram on silica gel.
System: chloroform / methanol 7: 3 + 0.5% water.
Partial sequence B: BOC-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-NHNH2 a) Z-Asn-Thr-Gly-OEt
43 g of H-Thr-Gly-OEt are dissolved in 500 ml of dimethylformamide and hydrogenated at normal pressure and room temperature in the presence of palladium carbon. It is filtered, 60 g of Z Asn-OCP are added, left to stand for 16 hours at 250, concentrated to approx. 250 ml, ethyl acetate is added, washed with dilute hydrochloric acid, dried over sodium sulfate and evaporated to dryness. The residue is washed with ethyl acetate and dried. Z-Asn-Thr-Glv-OEt is obtained. M.p .: 2250, [a] D = -40C in dimethylformamide.
b) Z-Thr-Asn-Thr-Gly-OEt
29 g of Z-Asn-Thr-Gly-OEt are dissolved in 700 ml of dimethylformamide, hydrogenated at normal pressure and room temperature in the presence of palladium carbon, filtered and the filtrate is treated with Z-Thr-N3, which is produced from 30 g of Z-Thr-NHNH2 has been. After 12 hours at 00, the mixture is evaporated to dryness and the residue is washed with water, ether and ethanol. Z-Thr-Asn-Thr-Gly-OEt, m.p. 2300, [a] D = -80C in dimethylformamide is obtained.
c) BOC-Arg.Thr-Asn-Thr-Gly-NHNH2
22 g of Z-Thr-Asn-Thr-Gly-OEt are dissolved in 700 ml of dimethylformamide, hydrogenated at normal pressure and room temperature in the presence of palladium-carbon and filtered. 23 g of BOC-Arg (NO2) -OH are dissolved in 500 ml of dimethylacetamide, 12 ml of triethylamine are added, the mixture is cooled to -100, 9.4 ml of isobutyl chloroformate is added, left to react for 10 minutes and the tetrapeptide solution obtained above is added. Next 30 min.
at 250, 100 ml of water are added, the resulting solution is treated with Amberlite-IRA-410 (OH form) until a negative chlorine reaction occurs, filtered and evaporated to dryness. The residue is washed with chloroform, ethyl acetate and ether and dried. BOC-Arg (NO2) -Thr-Asn-Thr-Gly-OEt is obtained. M.p. 1000, [zeo = 40 in dimethylformamide. 12 g of BOC-Arg (NO2) -Thr-Asn-Thr-Gly-OEt are dissolved in a mixture of 200 ml of acetic acid and 40 ml of water, hydrogenated in the presence of palladium carbon at 200 and normal pressure, filtered and evaporated in vacuo at 200 Dry up. The residue is dissolved in dimethylformamide and evaporated.
This treatment is repeated until acetic acid is no longer detectable. The residue is dissolved in 120 ml of dimethylformamide, 6 ml of hydrazine hydrate are added, the mixture is left to stand at 250 for 16 hours, evaporated, the residue is washed with ether, methanol / ether (1: 1) and then again with ether and dried. BOC-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-NHNH2, mp 1750 (with decomposition), [abo = 420C in dimethylformamide / HCl 1 N (1: 1) is obtained.
Partial sequence AB: H-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ala-Gly-Val Pro-NH 2 CH3COOH Maro dissolves 13.5 g of BOC-Arg.Thr-Asn-Thr-Gly-NHNH2 (partial sequence B) in 270 ml of dimethylformamide / water (8: 2), cools to - 150, gives 40 ml of a 4N solution of hydrochloric acid in dioxane and 2.5 ml of tert-butyl nitrite. The mixture is stirred for 10 minutes at −150, 28 ml of triethylamine are added, the mixture is filtered off, 10.5 g of H Ala-Gly-Val-Pro-NH (partial sequence A) are added, and the mixture is stirred at 00 for 16 hours. It is then evaporated to dryness , washes the residue with ether and dries. The residue is left in methanol, a tenth volume of water and seven times the amount of chloroform are added and the resulting solution is passed through a column of 500 g of silica gel.
After elution with an increasing amount of methanol, after evaporation BOC-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ala-Gly-Val-Pro-NH2 is obtained.
This is suspended in 200 ml of a 4 N solution of hydrochloric acid in dioxane and stirred for 2 hours at 250 ° C. It is evaporated to dryness, the residue is dissolved in 0.2 N acetic acid, treated with Amberlit-IRA-410 (acetate form) and lyophilizes the aqueous solution. The residue is then washed with ether, ethyl acetate and again with ether and dried over sodium hydroxide shavings. H-Arg-Thr Asn-Thr-Gly-Ala-GlyWal-Pro-NH -2 2 CH3COOH is obtained. M.p.
155 (with dec.) [A] Db = -38C in dimethylformamide.
Partial sequence C: Z-His-Lys (BOC) -Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-OH a) H-Thr-Phe-Pro-OH
176 g of Z-Phe-Pro-OMe are dissolved in 1000 ml of methanol / HCl
1 N, hydrogenated in the presence of palladium-carbon at 20 and
1 atm. and evaporates. The residue is dissolved in 400 ml of dimethylformamide, 100 ml of triethylamine are added at 00:00, the crystallized triethylamine hydrochloride is filtered off and the filtrate is treated with Z-Thr-N3 (prepared from 87 g of Z-Thr-NHNH2 by dissolving in 100 ml of N hydrochloric acid and Add 35 ml of N sodium nitrite). The mixture is then left to stand at 00 for 16 hours, evaporated to dryness, the residue is dissolved in ethyl acetate, washed successively with dilute hydrochloric acid and dilute ammonia, dried and evaporated. The residue is pulverized in heptane, washed with petroleum ether and dried.
Z-Thr-Phe-Pro-OMe, m.p. 920 (dec.), [A] D) = - 16C in dimethylformamide is obtained.
53 g of Z-Thr-Phe-Pro-OMe are dissolved in 530 ml of methanol, 100 ml of 2N sodium hydroxide solution are added, the mixture is allowed to stand at 250 for 1 hour, 50 ml of 2N hydrochloric acid are added, concentrated to approx. 200 ml, another 100 is added ml of water is added, the pH is adjusted to 10, the aqueous solution is washed twice with ethyl acetate, then adjusted to pH 1 with 4 N hydrochloric acid, the precipitated tripeptide Z-Thr-Phe-Pro-OH is extracted with ethyl acetate, dried and evaporated . M.p. 105 [a] 20 = -280 in dimethylformamide.
The residue is dissolved in a mixture of 500 ml of dioxane and 100 ml of water and hydrogenated at 200 and normal pressure in
Presence of a palladium catalyst. It is filtered, evaporated to dryness, the residue is washed with ether and dried. H-Thr-Phe-Pro-OH, m.p. 1920 (with decomposition), [a] 20 = -4lin acetic acid (956X), b) Z-Leu-Gln-OMe is obtained
70 g of Z-Gln-OH are dissolved in 1.5 l of dioxane and sufficient ethereal diazomethane solution is allowed to flow in until the solution remains yellow in color. The solution is then evaporated and the white residue is processed with ether. One obtains Z
Gln-OMe, m.p. 1360, [a] D = 210 in dimethylformamide.
71 g of ester are dissolved in 1.7 l of methanol. Then 5 g of 10 c palladium on activated charcoal are stirred with 59 ml of 4 N hydrochloric acid and added to the solution. The whole is subjected to hydrogenation for 3 hours at room temperature and normal pressure. Approx. 83% of the theoretical amount of hydrogen is used here. The catalyst is filtered off and the filtrate is evaporated completely to give H-Gln-OMe HCl in the form of a viscous oil.
64 g of Z-Leu-OH are dissolved in 200 ml of acetonitrile, mixed with
27.7 g of N-hydroxysuccinimide and cool down to -10o. For this purpose, a solution of 50 g of dicyclohexylcarbodiimide is poured into
100 ml acetonitrile. The dicyclohexylurea is filtered off in about 30 minutes. The filtrate is mixed with 47.3 g of H Gln-OMe-HCl, dissolved in dimethylformamide, with the simultaneous addition of an equivalent N-methylmorpholine.
It is left to stand for 4 hours and evaporated. The residue is dissolved in ethyl acetate and washed with 5% sodium bicarbonate solution, 1 N hydrochloric acid and water. The organic phase is dried over sodium sulfate and evaporated in vacuo. After recrystallization from methanol and ether, Z-Leu-Gln-OMe, melting point 1790, [a] 2 "= - 16C in dimethylformamide is obtained.
c) Z-Lys (BOC) -Leu-Gln-OMe
42 g of Z-Leu-OMe are dissolved in 1500 ml of methanol.
Then 16 g of 10% palladium on activated carbon are mixed with 25.8 ml of 4 N hydrochloric acid and added to the solution. The whole is subjected to hydrogenation for 8 hours at room temperature and normal pressure. Here, 95% of the theoretical amount of hydrogen is consumed. The catalyst is filtered off and the filtrate is evaporated. H-Leu-Gln-OMe - HCl is obtained in the form of a foam. One then solves H-Leu-GLn-OMe. HCl in 300 ml of dimethylformamide, 34 g of Z-Lys (BOC) -OCP and 8.4 ml of triethylamine are added.
After shaking, it is left to stand for 16 hours.
The reaction mixture is then evaporated in vacuo.
The residue is treated with water and the water is filtered off. It is then dissolved in a little methanol and precipitated with ether. After filtration and drying, Z-Lys (BOC) -Leu-Gln-OMe, [a] 0 = -21oC in dimethylformamide is obtained.
d) Z-His-Lys (BOC) -Leu-Gln-NH-NH2
38 g of Z-Lys (BOC) -Leu-Gln-OMe are dissolved in 300 ml of dimethylformamide, 15 g of 10% palladium carbon are added, the mixture is hydrogenated at normal pressure and room temperature and the catalyst is filtered off. Z-His-N3, prepared from 52.2 g of Z-His NHNH2, is then added, the mixture is left to stand at 200 for 5 hours and evaporated, the residue is dissolved in ethyl acetate, washed with water, dried over sodium sulfate, evaporated and washed Residue with ether. Z-His-Lys (BOC) -Leu Gln-OMe, melting point 1200 (with decomposition), [a] D = -190 in dimethylformamide is obtained. 33 g of Z-His-Lys- (BOC) -Leu-Gln-OMe are dissolved in 330 ml of methanol, 7.5 ml of hydrazine hydrate are added, the mixture is left to stand for two days at 250 and then evaporated to dryness.
It is then dissolved in dimethylformamide, evaporated and this treatment is repeated until no traces of hydrazine can be detected. The residue is washed with ether, water and ether and dried, and Z-His Lys (BOC) -Leu-Gln-NH-NH2, melting point 1 99o, [a] D = - 22oC in methanol is obtained.
e) Z-His-Lys (BOC) -Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-CH
40 g of Z-His-Lys (BOC) -Leu-Gln-NH-NH2 are dissolved in 400 ml of dimethylformamide, cooled to 200, 75 ml of dioxane / HCl 2 N and then 6 ml of tert-butyl nitrile are added, and 10 is stirred Minutes at - 200, is 30 ml of triethylamine and 20 g of H Thr-Phe-Pro-OH and allowed to react at 250 for 16 hours.
It is then evaporated to dryness, the residue is washed with ether, dilute acetic acid, ether and finally with hot ethyl acetate. It is then dried in a high vacuum and Z-His-Lys (BOC) -Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-OH, mp.
2000 (decomposition), [a] Do = -470C in dimethylformamide.
Partial sequence ABC: H-His-Lys (BOC) -Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr Gly-Ala-Gly-Val-Pro-NH2 3 CH3CO2H
10 g of heptapeptide (partial sequence C) are dissolved in 100 ml of dimethylformamide, evaporated, the residue is dissolved in 100 ml of dimethylformamide, 15 g of N-hydroxysuccinimide are added, the mixture is cooled to 00, 5 g of dicyclohexylcarbodiimide are added, left to react for 3 hours, filtered the excreted dicyclohexylurea, concentrated to 30 ml and precipitates the resulting heptapeptide oxysuccinimide ester H-His-Lys (BOC) -Leu-Gln Thr-Phe-Pro-OSu by adding ether. After washing with ether, the residue is dissolved in 100 ml of dimethylformamide, mixed with 10 g of nonapeptide amide (partial sequence AB) and left to react for 16 hours. 500 ml of ethyl acetate are added and the mixture is filtered.
The residue is dissolved in dimethylformamide, 10 ml of acetic acid are added and it is again precipitated with ethyl acetate. It is filtered, washed with ethyl acetate and ether and dried. Z-His-Lys (BOC) -Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ala-Gly-Val-Pro-NH2 2 AcOH, [a] D = -310 in dimethylformamide, which is dissolved directly in 80% acetic acid. Then 5 g of palladium carbon are added and the mixture is hydrogenated at normal pressure and room temperature. It is filtered, evaporated to dryness at 200 in a high vacuum and the residue is washed with ether. After drying over KOH chips, the partial sequence ABC, mp.
1640 (with dec.), [A] D = -190C in dimethylformamide.
Partial sequence D Trt-Gly-Lys (B OC) -Leu-Ser-Gln-Asp (OTB) -Leu-NHNH2 a) Z-Asp (OTB) -Leu-OMe
151 g of Z-Asp (OTB) -OH, 54 g of N-hydroxysuccinimide are dissolved in 700 ml of acetonitrile and the mixture is cooled to -200C. 96.5 g of dicyclohexylcarbodiimide, dissolved in 350 ml of acetonitrile, are then added. After about 30 minutes of standing, the dicyclohexylurea formed is filtered off. 71.2 g of H-Leu-OMe are added to the filtrate, then left to stand for 4 hours and evaporated in vacuo. The solid residue is mixed with ethyl acetate / water (2: 1). The organic phase is then washed with 5% sodium bicarbonate solution, water and with dilute sulfuric acid (pH 3), dried over sodium sulfate and evaporated after washing until neutral.
The residue is dissolved with chloroform to which 1% methanol has been added and filtered through silica gel (10-fold amount). Z Asp (OTB) -Leu-OMe, melting point 1310, [a] Dn = 230 in dimethylformamide is obtained.
b) H-Gln-Asp (OTB) -Leu-OMe
118 g of Z-Asp (OTB) -Leu-OMe are dissolved in 2000 ml of methanol. Then 15 g of 10% palladium on activated charcoal are stirred in 63 ml of 4N hydrochloric acid and added to the solution. The whole is subjected to hydrogenation for two hours at room temperature and normal pressure. Approx. 85% of the theoretical amount of hydrogen is consumed here. The catalyst is filtered off and the filtrate is evaporated completely, whereby H-Asp (OTB) -Leu-OMe. HCl is obtained in the form of an amorphous foam.
91.7 g of Z-Gln-ONP and 93.8 h of H-Asp (OTB) -Leu-OMe HCI are dissolved in 500 ml of dimethylformamide and mixed with 5 ml of N-methylmorpholine. The mixture is left to stand for 15 hours at room temperature and the solution is then completely evaporated in vacuo. The residue obtained in this way is processed well with water and the water is filtered off. It is then recrystallized from methanol. Z-Gln Asp (OTB) -Leu-OMe, melting point 1900 (decomp.), [A] D0-280 in dimethylformamide is obtained. 44.4 g of Z-Gln-Asp (OTB) -Leu OMe are dissolved in 1200 ml of methanol / dimethylformamide (1: 1). Then 15 g of 10% total palladium on activated charcoal are added to 50 ml of water and added to the solution. After a hydrogenation time of about 2 hours, almost the quantitative amount of hydrogen has been consumed. The catalyst is filtered off and the filtrate is evaporated in vacuo.
The residue is dissolved in ethyl acetate and washed three times with saturated sodium chloride solution.
The organic phase is dried over sodium sulfate and the filtrate is evaporated to about 1/3 of the original volume.
After adding petroleum ether, the solid tripeptide can be filtered off. H-Gln-Asp (OTB) -Leu-OMe, m.p.
1750, [a] 20 = -180 in dimethylformamide.
c) Z-Lys (BOC) -Leu-Ser-OMe
43 g of H-Leu-Ser-OMe HCl and 80 g of Z-Lys (BOC) OCP are dissolved in 400 ml of dimethylformamide, 22 ml of triethylamine are added, the mixture is left to stand at 250 for 25 hours, the triethylamine which has separated out is filtered off and the filtrate is evaporated Dry up. The residue is dissolved in ethyl acetate, washed with dilute hydrochloric acid and dilute potassium bicarbonate solution, dried over sodium sulfate, filtered and evaporated. The residue is recrystallized from ethyl acetate / ether and Z-Lys (BOC) -Leu-Ser-OMe, melting point 1100, [a] D = -140 in dimethylformamide is obtained.
d) Trt-Gly-Lys (BOC) -Leu-Ser-NHNH
Dissolve 158 g of Trt Gly-OH in 2000 ml of dichloromethane and 72.1 triethylamine, cool to -5o, add 50 ml of ethyl chloroformate and stir for 10 minutes at -5o, at the same time dissolve 300 g of Z-Lys (BOC) -Leu- Ser-OMe in 3000 ml of dioxane / water (8: 2), hydrogenated in the presence of palladium carbon at room temperature and normal pressure, filtered and evaporated. The residue is dissolved in chloroform, and the mixed anhydride obtained above is added. The mixture is left to stand at 00 for 1 hour, the chloroform solution is washed with dilute acetic acid and then with dilute potassium bicarbonate solution, dried and evaporated to dryness.
The residue is dissolved in 1250 ml of methanol, 175 ml of hydrazine hydrate are added and the mixture is left to stand at 25o for 16 hours.
It is concentrated to 500 ml, water is added and the mixture is filtered, the residue is washed with water and dried over phosphorus pentoxide. Trt-Gly-Lys (BOC) -Leu-Ser NHNH2, m.p. 2040, [ol] D = -60 in dimethylformamide is obtained.
e) Trt-Gly-Lys (BOC) -Leu-Ser-Gln-Asp (OTB) -Leu-NHNH2
76 g of Trt-Gly-Lys (BOC) -Leu-Ser-NHNH2 are left in 300 ml of dimethylformamide, cooled to -200, 75 ml of dioxane / HCl 4 N and then 11.6 ml of tert-butyl nitrite are added, and the mixture is stirred Minutes at - 15, treated with 70 ml of triethylamine and with 49.5 g of H-Gln-Asp (OTB) -Leu-OMe. The mixture is then stirred at 00 for 16 hours. The precipitated triethylamine hydrochloride is filtered off, the filtrate is concentrated to about 100 ml and the residue is treated with water. The precipitated residue is filtered off, which is then washed through with water and finally dried in a high vacuum at 500 °. The residue is boiled with ethyl acetate, washed with ether and dried.
The obtained heptapeptide ester Trt-Gly-Lys (BOC) -Leu-Ser-Gln-Asp (OTB-Leu-OMe (melting point 2110), [G] D0 = -380C in dimethylformamide) is dissolved in 200 ml of dimethylformamide, with 4 ml of hydrazine are added and the mixture is left to stand at 25o for 24 hours.
After concentrating to about 100 ml, 500 ml of water are added, the precipitated material is filtered off, washed with water until the reaction is neutral and dried over phosphorus pentoxide at 500 ml. Trt-Gly-Lys (BOC) -Leu-Ser-Gln Asp is obtained (OTB) -Leu-NHNH2, m.p. 2200, [J] D0 = 290 in dimethylformamide / water (8: 2).
Partial sequence ABCD: H-Gly-Lys (BOC) -Leu-Ser-Gln-Asp (OTB) -Leu-His-Lys (BOC).
Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ala-Gly Val-Pro-NH2 3 AcCH 3 H20
3 g of heptapeptide hydrazide (partial sequence D) are dissolved in 30 ml of dimethylformamide, cooled to -200, 2 ml of dioxane / HCl 4 N and then 0.3 ml of tert-butyl nitrite are added. The mixture is stirred at 200 for 10 minutes, 2 ml of triethylamine and 3 g of hexadecapeptide amide (partial sequence ABC) are added, and the mixture is stirred at 00 for 16 hours and evaporated to dryness. The residue is washed at 00 with dilute acetic acid and then with water, filtered, the residue is dissolved in methanol / water (9: 1), filtered through silica gel, the residue is evaporated, washed with ethyl acetate, dissolved in 200 ml of 80% acetic acid , lets stand for 4 hours at 25o, evaporates to dryness at 200, washes the residue with ether, ethyl acetate and ether, filtered and dried.
The partial sequence ABCD is obtained. M.p. 188 (with decomposition), [u] 2 '= - 7C in dimethylformamide,
Partial sequence E:
H-Thr-Cy (Bzl) -Val-Leu-OH a) H-Cys (Bzl) -Val-Leu-OMe HBr
21.0 g of Z-Cys (Bzl) -OCP and 12.3 g of H-Val-Leu OMe HCI are dissolved in 120 ml of dimethylformamide. Then 5.9 ml of triethylamine are added, the mixture is left to stand at 250 for 16 hours, ethyl acetate is added, the mixture is washed with dilute hydrochloric acid and dried over sodium sulfate. evaporated to dryness and the residue crystallized from ethyl acetate / diethyl ether.
Z-Cys (Bzl) -Val-Leu-OMe, mp. 1600, [z] D2O = - 28 in dimethylformamide is obtained. which is dissolved in 210 ml of a 40% solution of hydrogen bromide in glacial acetic acid. The mixture is left to stand at 25 for 1 hour, evaporated to dryness and the residue is recrystallized from isopropanol / diethyl ether. H-Cys (Bzl) -Val-Leu-OMe HBr, m.p. 1680, [α] D20 = = + 14C in dimethylformamide is obtained.
b) H-Thr-Cys (Bzl) -Val-Leu-OMe 1.3 HBr
20 g of Z-Thr-NHNH2 are dissolved in 350 ml of dimethylformamide, cooled to -20, 100 ml of a solution of 2N hydrochloric acid in dioxane and then 10 ml of tert-butyl nitrite are added. After 10 minutes at -20, 45 ml of triethylamine and 25.5 g of H-Cys (Bzl) -Val-Leu-OMe HBr are added and the resulting mixture is shaken at 0 for 16 hours. It is evaporated to dryness. Dissolves the residue in a mixture of ethyl acetate / water, and the organic phase is washed with dilute hydrochloric acid. dries over sodium sulfate. evaporated and the residue crystallized from ethyl acetate.
Z-Thr-Cys (Bzl) -Val-Leu-OMe is obtained; M.p. 2080, {] D2O = -27 in dimethylformamide. 20 g of the tetrapeptide obtained above are dissolved in 200 ml of a mixture of trifluoroacetic acid / vinegar ester (1: 1). passes in a stream of gaseous hydrogen bromide for 1 hour at 0, then evaporates and the residue recrystallizes from methanol / diethyl ether. H-Thr-Cys (Bzl) -Val-Leu is obtained
OMe 1, 3HBr. 202 [a] 2E '= lots in dimethylformamide.
c) H-Thr-Cvs (Bzl) -Val-Leu-OMe 1.3 HBr in 1800 ml of methanol. add 900 ml of 7 N sodium hydroxide solution, leave to stand at 25o for 1 hour. add 240 ml of glacial acetic acid and let stand at 0 for 2 hours. The precipitated crystalline mass is filtered off, washed first with 1N acetic acid, then with water and dried at 500 in a high vacuum. H Thr-Cys (Bzl) -Val-Leu-OH, melting point 2190, [a] D) = -53C in 1N ammonia is obtained.
Partial sequence F1
BOC-Cys (Bzl) -Ser-Asn-Leu-Ser-NHNH2 a) H-Asn-Leu-Ser-OMe HCI
Dissolve g of H-Leu-Ser-OMe HCl and 53 g of BOC-Asn
ONP in 400 ml of dimethylformamide. 22 ml of triethylamine are added, the mixture is left to stand at 250 for 16 hours, evaporated to dryness and the residue is recrystallized from methanol. BOC-Asn-Leu-Ser-OMe is obtained. 1900, [α] D20 = -24O in dimethylformamide. which is dissolved in 500 ml of a 4N solution of hydrochloric acid in methanol. It is left to stand at 250 for 1 hour and evaporated to dryness. Dissolves the residue in methanol and precipitates with diethyl ether.
H-Asn-Leu-Ser-OMe HCI, melting point 1800, [a] D '= - 23 C in dimethylformamide is obtained.
b) H-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe HCI
39.5 g of BOC-Ser-NHNH are dissolved in 500 ml of dimethylformamide, and the mixture is cooled to -20. add 200 ml of a 2 N solution of hydrochloric acid and dioxane and then 20 ml of tert-butyl nitrite. After 10 minutes at -200, 90 ml of triethylamine and 38.0 g of H-Asn-Leu-Ser-OMe HCl are added, the mixture is then stirred for 16 hours at 0, evaporated to dryness and the residue is recrystallized from chloroform / diethyl ether. BOC-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe, m.p. 1350 [i2o - - 220 in dimethylformamide, which is dissolved in 420 ml of a 4N hydrochloric acid solution in methanol, is obtained. The mixture is left to stand at 25o for 1 hour, evaporated to dryness and recrystallized from methanol / ethyl acetate. H-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe HCI is obtained.
M.p. 155o (dec.), [A] D = -150C in dimethylformamide.
c) BOC-Cys (Bzl) -Ser-Asn-Leu-Ser-NHNH2
18.5 g of H-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe are dissolved. HCl and 18 g of BOC-Cys (Bzl) -ONP in 100 ml of dimethylformamide, 10 ml of water, 3.5 ml of acetic acid and 5.6 ml of triethylamine are added, left to stand for 16 hours at 250, evaporated to dryness and crystallized out Methanol around. BOC-Cys (Bzl) -Ser Asn-Leu-Ser-OMe, m.p. 1820, [rc] D - - 170 in dimethylformamide, which is dissolved in 200 ml of dimethylformamide with gentle heating. 200 ml of methanol and 20 ml of hydrazine hydrate are added, the mixture is left to stand at 300 for 16 hours, it is precipitated with diethyl ether, the precipitate is washed with diethyl ether / methanol (1: 1) and the BOC-Cys (Bzl) Ser-Asn-Leu thus obtained is dried -Ser-NHNH2, m.p. 2240, [a] D = -130C in dimethylformamide.
EMI5.1
Dissolve 18.4 g of BOC-Cys (Bzl) -Ser-Asn-Leu-Ser-NHNH2 (partial sequence F) in 150 ml of dimethylformamide, cool to -200, add 40 ml of a 2N solution of hydrochloric acid in dioxane and 15 ml tert-butyl nitrite too. After 10 minutes at 200, 28 ml of triethylamine and 16.2 g of H-Thr-Cys (Bzl) -Val-Leu OH (partial sequence E) are added and the mixture is stirred at 25 for 16 hours. It is then filtered, the solution evaporated and the residue with
1N acetic acid washed through. BOC-Cys (Bzl) Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys (Bzl) -Val-Leu-OH, m.p. 217, [α] D20 = -17 in dimethylformamide is obtained. The product obtained is dissolved in 5000 ml of dried ammonia, and sodium metal is added with stirring and boiling of the ammonia until it turns deep blue.
Ammonium chloride is added for the purpose of discoloration. It is evaporated to dryness and the residue is washed through with 1N acetic acid and acetone. After drying, BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-OH, mp.
2480 (dec.), [A] 2OD = 410 in dimethylformamide / water (3: 1). The nonapeptide obtained in this way is dissolved in 5000 ml of 0.01 N ammonia, 1 N hydrogen peroxide is added with stirring until the nitroprussiate reaction is negative, then another 200 ml of glacial acetic acid, filtered and lyophilized. You get
EMI5.2
[(IIDO = -180C in dimethylformamide / water (3: 1).
EMI5.3
1.0 g of nonapeptide (partial sequence EF) is dissolved in 10 ml of dimethylformamide, 1.5 g of N-hydroxysuccinimide and 0.52 g of dicyclohexylcarbodiimide are added, the mixture is stirred at 25 for 6 hours, filtered and the filtrate is evaporated to dryness. The residue is washed with ethyl acetate and diethyl ether and dried.
You get
EMI6.1
M.p. 2420, which is dissolved in 10 ml of dimethylformamide. 3.1 g of tricosapeptide diacetate (partial sequence ABCD) and 1.2 g of N-hydroxysuccinimide are added to this solution and the mixture is stirred at 25 for 16 hours. It is evaporated to dryness and the residue is washed with diethyl ether, chloroform and acetone. The crude, protected Dotriaconapeptide is thus obtained, which is dissolved in 50 ml of a mixture of chloroform / methanol / water (70: 30: 5): the resulting solution is layered on a silica gel column (5 x 100 cm) with the above Mixture has been equilibrated. The elution is carried out with an increasing concentration of methanol. The combined fractions, which contain the pure peptide, are evaporated, then washed with diethyl ether and dried over potassium hydroxide in a high vacuum.
The title compound is obtained, m.p. 1980 (with decomposition), [cl] D = -46 "in dimethylformamide.
EMI6.2
Hexaacetate decahydrate
3.3 g of protected Dotriacontapeptide diacetate trihydrate (Example 1) are dissolved in 100 ml of trifluoroacetic acid under a nitrogen atmosphere, left to stand for 15 minutes at 200 and evaporated to dryness. It is dissolved in 300 ml of 0.2 N acetic acid, treated with 20 ml of Amberlite IRA-410 (acetate), lyophilized, washed with diethyl ether and dried over potassium hydroxide in a high vacuum. The title compound is obtained, m.p. 172 (decomp.), [(LiDO = -680 in 50% acetic acid.