Verfahren zur Herstellung eines bisher unbekannten Polypeptidderivates
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines bisher unbekannten Polypeptids der Formel
EMI1.1
<tb> <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> 9 <SEP> 10
<tb> H-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Ser
11 12 13 14 13 16 17 18 19 20 21 Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg
22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 Phe-Ser-Gly- Nle -Gly-Phe-Gly- Pro-Glu-Thr-Pro- NR2, seiner therapeutisch wirksamen Säureadditionssalze und Schwermetallkomplexe.
Das bisher unbekannte Polypeptid kann nach für die Synthese von Verbindungen dieser Art allgemein bekannten Methoden hergestellt werden, wobei die Aminosäuren in der in der obigen Formel festgelegten Reihenfolge einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten miteinander verknüpft werden und bei einer geeigneten Stufe der Synthese die Disulfidbrücke gebildet wird.
Beim A bau des neuen Polypeptids haben sich für die Blockier-:'ne der -Carboxylgruppe, beispielsweise in der nachstenc:nu beschriebenen Teilsequenz A, die tert. Butyloxy-Gruppe bewährt, doch können auch andere Schutzgruppen, wie die Methoxy-, die Athoxy-, die tert. Amyloxy-. die Amid- oder die Benzyloxygruppe verwendet werden.
Für die Blockierung der lmidazolgruppe des Histidinrestes in der nachstehend beschriebenen Teilsequenz C hat sich die Triphenylmethylgruppe bewährt, doch können auch andere geeignete Schutzgruppen, wie die Carbo-tert.-butoxy-. die Carbo-tert.-amyloxy-, die Carbobenzoxy- oder die Benzylgruppe verwendet werden.
Für die Blockierung der Guanidogruppe des Argininrestes in der nachstehend beschriebenen Teilsequenz E wurde die Nitrogruppe verwendet, doch können auch andere geeignete Schutzgruppen, wie die Tosylgruppe, die p-Nitrocarbobenzoxygruppe oder die 2-(lsopropyloxycarbonyl)-3,4,5,6-tetrachlorbenzoylgruppe $verwendet werden. Man kann auch den Schutzeffekt der Protonisierung der Guanidogruppe bei der Synthese verwenden.
Das neue Polypeptid lässt sich auch in Form seiner Salze gewinnen bzw. verwenden. Als Salze kommen solche mit organischen Säuren. wie Essigsäure, Propionsäure, Glykolsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Benzoesäure, Zimtsäure, Salicylsäure, 2-Phenoxy- oder 2-Acetoxybenzoesäure, Mandelsäure, Methansulfonsäure, Äthansulfonsäure, Hydroxyäthansulfonsäure, Benzol- oder Toluolsulfonsäure, Naphthalinsulfonsäure. Sulfanilsäure sowie polymere Säuren wie Gerbsäure. Alginsäure, Polygalacturonsäure, Polyphloretinphosphat oder Carboxymethylcellulose und Salze mit anorganischen Säuren, wie Halogenwasserstoffsäure, z. B. Salzsäure oder Bromwasserstoft- säure, Salpetersäure, Thiocyansäure, Schwefelsäure und Phosphorsäure in Frage.
Als Schwermetallkomplex kommt z. B. derjenige von Zink## in Frage.
Die Ausgangsprodukte zur Herstellung des neuen Polypeptids können, sofern sie bisher nicht bekannt waren. nach den für die Peptidchemie bekannten Methoden erhalten werden, wobei die Aminosäuren einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten miteinander verknüpft werden.
Die neue Verbindung stellt ein wichtiges therapeutisches Prinzip dar. das den Calciumpiasmaspiegel. insbesondere den erhöhten Calciurnplasmaspiegel senkt und als Antagonist des Parathormons eine positive Calciumbilanz im Knochen bewirkt. Es ist somit indiziert bei allen Zuständen, bei welchen eine Senkung des Plasma calciumspiegcls erwünscht ist. z.
B. Flypercalcämien verschiedener Genese. Alanael des endogenen Thyreocalcitonins infolge Ausfalls von Schilddrüsengewebe, Hyperfunktion der Nebenschilddräsen. Die neue Verbindung ist indiziert bei allen Knochenaffektionen, die auf einem vermehrten Abbau beruhen oder bei welchen eine vermehrte Calciumfixation im Knochen erwünscht ist, z. B. Osteoporose verschiedener Genese (z. B. postklimakterisch, posttraumatisch. bedingt durch Corticosteroidtherapie oder Inaktivität usw.), Frakturen, Osteomalacie, Rachitis sowie insbesondere zur Kombinationstherapie mit Calcium bzw. Phosphat.
Die biologische Prüfung der neuen Verbindung ergab eine Wirksamkeit von etwa 100 bis 450 MRC-Einheiten/mg Peptid. Die erforderliche Tages dosis (i. m. verabreicht) in MRC-Einheiten beträgt 20 mE bis 10 E, vorzugsweise 100 mEíkg Tiergewicht. Beim Menschen beträgt die tägliche Dosis (i. m. verabreicht) in MRC Einheiten 1 bis 500 E. Vorzugsweise wird eine tägliche Dosis von 5 E i. m. verabreicht.
Die neue Verbindung kann als Heilmittel, z.B. in Form pharmazeutischer Präparate. Verwendung finden.
Diese enthalten die genannte Verbindung in Mischung mit einem für die parenterale Applikation geeigneten organischen oder anorganischen Trägermaterial. Für dasselbe kommen solche Stoffe in Frage, die mit der neuen Verbindung nicht reagieren, wie z. B. Gelatine, Milchzucker, Stärke, Magnesiumstearat. Talk, pflanzliche Öle, Benzylalkohole, Gummi arabicum, Polyalkylenglykole, Vaseline, Cholesterin oder andere bekannte Arzneimittelträger. Die pharmazeutischen Präparate können z.B. in flüssiger Form als Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen vorliegen. Gegebenenfalls sind sie sterilisiert und bzw. oder enthalten Hilfsstoffe, wie Konservierungs-, Stabilisierungs-, Netzmittel oder Emulgiermittel. Sie können auch noch andere, therapeutisch wertvolle Stoffe enthalten. Die neue Verbindung kann auch in Form eines Depotpräparates verabreicht werden.
Die neue Verbindung und ihre Salze können auch als Zwischenprodukt zur Herstellung von pharmazeutischen Präparaten Verwendung finden.
Es werden folgende Abkürzungen verwendet:
Z = Carbobenzoxy
Bzl = Benzyl
BOC = tert.-Butyloxycarbonyl
Trit = Trityl-Triphenylmethyl
OTB = tert.-Butyloxy
ONP = p-Nitrophenylester
OCP = 2,4,5-Trichlorphenoxv
OMe = Methoxy
OEt = Äthoxy NO2 = Nitro Ser = L-Seryl
Asn = L-Asparaginyl
Leu = L-Leucyl
Thr = L-Threonyl
Val = L-Valyl
Ala = L-Alanyl
Tyr = L-Tyrosyl
Trp = L-Tryptophanyl
Arg = L-Arginyl
Phe = L-Phenylalanyl
Glu = L-Glutamyl
His = L-Histidyl
Pro = L-Prolyl
Gly = Glycyl
Nle = L-Norleucyl
Cys = L-Cysteinyl
In den folgenden Beispielen, die die Ausführung des Verfahrens erläutern, den Umfang der Erfindung aber in keiner Weise einschränken sollen, erfolgen alle Temperaturangaben in Celsiusgraden.
Teilsequenz A: L-Phenylalanyl-glycyl-L-prolyl-y-tert.-butyloxy-
L-glutamyl-L-threonyl-L-prolinamid (H-Phe-Gly-Pro-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2)
Man löst bei -5 134 g Z-Thr-NH-NH2 in 2 Liter in Salzsäure und versetzt mit 0,55 Liter in Natriumnitrit. Nach 5 Minuten wird Kaliumcarbonat bis pH 9 zugegeben, das entstandene Azid mit Äthylacetat extrahiert und eine Lösung von 80 g H-Pro-NH2 hydro- chlorid in 100 ml Wasser, 500 ml Dimethylformamid und 77 ml Triäthylamin hinzugefügt. Man verdampft das Äthylacetat bei 200 im Vakuum und lässt über Nacht bei 250 stehen. Die restliche Lösung wird im Vakuum verdampft, der Rückstand in Äthylacetat gelöst, mit Wasser, verdünnter Salzsäure und einer wässrigen Kaliumcarbonatlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet.
Man verdampft im Vakuum, löst in warmem Äthylacetat und kühlt ab. Man erhält Z-Thr-Pro-NH2; Smp. 1480, [e] 2D = -720 in 95 % Essigsäure. Man löst hierauf 90 g Z-Thr-Pro-NH2 in 2 Liter Dioxan und 260 ml in Salzsäure und hydriert bei 200 und Normaldruck in Gegenwart eines Palladiumkatalysators. Man filtriert, verdampft die Lösung im Vakuum, wäscht den Rückstand mit Äthylacetat und erhält
H-Thr-Pro-NH2.HCl; Smp. 2160, [a]2D0 - -64 in 95% Essigsäure. Dieses wird in 500 ml Dimethylformamid, 50 ml Wasser und 32 ml Triäthylamin gelöst und 118 g Z-Glu(OTB)-OCP und 800 ml Tetrahydrofuran zugegeben. Man lässt über Nacht bei 200 stehen, verdampft im Vakuum und kristallisiert den Rückstand mit Äthyläther.
Man erhält Z-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2, Smp. 650 (Zers.); [a] # = -180 in Dimethylformamid.
Man löst 80 g ZGlu(OTB)-Thr-Pro-NH2 in 1,5 Liter Dioxan und 200 ml Wasser und hydriert bei 200 und Normaldruck in Gegenwart eines Palladiumkatalysators.
Die Lösung wird filtriert und im Vakuum verdampft und der Rückstand mit Diäthyläther versetzt, wobei H-Glu (OTB)-Thr-Pro-NH2 erhalten wird; Smp. 650 (Zers.), [a] # = - 280 in Dimethylformamid. Dieses wird in 700 ml Dimethylformamid bei 0 gelöst, 200 ml Acetonitril, 68 g Z-Phe-Gly-Pro-OH, 18 g N-Hydroxysuccinimid und 32 g Dicyclohexylcarbodiimid hinzugefügt, über Nacht bei 200 stehengelassen, filtriert, im Vakuum eingedampft und mit Athylacetat versetzt. Danach wäscht man die Lösung mit Wasser, verdünnter Salzsäure und wässriger Kaliumcarbonatlösung, trocknet über Natriumsulfat, verdampft im Vakuum und kristallisiert den Rückstand aus ÄthylacetatlÄthyläther. Man erhält .
Z-Phe-Gly-Pro-Glu(OTB) -Thr-Pro-NH2 Smp. 1200 (Zers.). {a] 2E)0 = - 66 in Dimethylformamid, das man in 1500 ml Dioxan und 300 ml Wasser löst.
Man gibt 30 g Palladiumkohle )10 %) zu und hydriert bis zum Ende der Wasserstoffaufnahme. Man filtriert, dampft das Filtrat ein und kristallisiert den Rückstand aus Dioxan. Man erhält das H-Phe-Gly-Pro-Glu(OTB) Thr-Pro-NH2; Smp. 1530 [e] 20 = - 790 in Dimethylformamid.
Teilsequenz B: Benzyloxycarbonyl-L-seryl-glycyl-L-norleucyl-glycin (Z-Ser-Gly-Nle-Gly-OH) a) Benzyloxycarbonyl-L-norleucyl-glycin (ZNle-Gly-OH)
Man löst 31,6 g H-Gly-OH in 420 ml ln NaOH, gibt 840 ml Tetrahydrofuran zu, versetzt anschliessend mit 130 g Z-Nle-ONP, schüttelt, bis die Lösung klar wird, lässt eine Nacht bei 250 stehen. Dann wird im Vakuum auf 500 ml konzentriert und die erhaltene wässige Lösung mit in NaOH auf pH 9 gestellt, zweimal mit Äther extrahiert, dann mit 4n Salzsäure angesäuert, mit Essigester extrahiert. Die Essigesterlösung wäscht man mit Wasser und 30%iger Kochsalzlösung, trocknet über Natriumsulfat, dampft im Vakuum ein. Den Rückstand verreibt man mit Äther, lässt 2 Stunden bei -200 kristallisieren.
Man erhält Z-Nle-Gly-OH, Smp. 1380, [α]# = -4 in Dimethylformamid.
b) Benzyloxycarbonyl-glycyl-L-norleucyl-glycin (Z-Gly-Nle-Gly-OH)
Man löst 100 g Z-Nle-Gly-OH in 1000 ml 4n HBr/ Eisessig, lässt 50 Minuten bei 250, verreibt mit Äther, filtriert Kristalle ab und wäscht gut mit Äther. Man erhält HBr H-Nle-Gly-OH, [a] 1D0 = +24,70 in Essigsäure (95 %).
Man löst 84 g HBr H-Nle-Gly-OH in 240 ml Wasser, versetzt mit 152 ml 4n NaOH, 800 ml Tetrahydrofuran und 91 g Z-Gly-ONP. Man schüttelt 1 Stunde bei 250 und lässt dann 2 Tage bei 250 stehen. Man konzentriert im Vakuum auf 500 ml, stellt mit in NaOH auf pH 9 und extrahiert mit Äther. Die wässrige Phase wird mit in Salzsäure angesäuert, dann zweimal mit Essigester extrahiert. Man wäscht mit Wasser, 30 %iger Kochsalzlösung, trocknet über Natriumsulfat, dampft im Vakuum ein und verreibt den Rückstand mit Äther.
Man erhält Z-Gly-Nle-Gly-OH, Smp. 1550, [α]# = -5,6 in Dimethylformamid.
c) Benzyloxycarbonyl-L-seryl-glycyl-L-norleucyl glycin (Z-Ser-Gly-Nle-Gly-OH)
Man löst 89,5 g Z-Gly-Nle-Gly-OH in 900 ml 4n HBr/Eisessig, lässt 50 Minuten bei 250 stehen, dampft am Vakuum ein, verreibt mit Äther, abfiltriert, wäscht gut mit Äther, trocknet im Vakuum, löst in 280 ml Wasser, etwa 650 ml Dimethylformamid, gibt 66,5 ml Triäthylamin zu und versetzt mit dem Azid, das wie folgt erhalten wird:
:
Man kühlt 940 ml in Salzsäure auf -5 , gibt 96 g Z-Ser-NH-NH2 zu und tropft dann bei -50 360 ml in Natriumnitrit ein, rührt noch 6 Minuten bei überschichtet mit etwa 600 ml Essigester von 00, stellt unter Zugabe von festem Natriumcarbonat auf pH 8,5, trennt die Essigesterphase ab, extrahiert nochmals, trocknet die Lösung über Natriumsulfat und filtriert. Die Reaktionslösung dampft man im Vakuum ein, versetzt den Rückstand mit 600 ml Wasser, säuert an, extrahiert mit Äthylacetat, wäscht mit Wasser und 30%iger Kochsalzlösung, kühlt auf 00, filtriert Kristalle ab. Man erhält Z-Ser-Gly-Nle-Gly-OH, Smp. 2100 (mit Zers.), [α]# = -8 in Dimethylformamid.
Teilsequenz C: N#Nimid. Ditrityl-L-histidyl-L-arginyl-L-phenyl alaninhydrazid HCl) [(Trt)-His(Trt)-Arg-Phe
NH-NH2 HCl a) Z-Arg(NO2)-Phe-OMe
51,8 g H-Phe-OMe HCl werden in 1 Liter Ather und etwa 50 ml Eiswasser gelöst und unter Rühren und Kühlen genügend Natriumcarbonat zugegeben, bis alles Wasser abgebunden ist. Man filtriert und dampft das Filtrat bis zur Gewichtskonstanz ein, wobei ein farbloses Öl erhalten wird.
67,6 g Z-Arg(NOa)-OH werden in 300 ml Acetonitril und 150 ml Dimethylformamid gelöst und mit 41,2 g H-Phe-OMe versetzt. Danach wird auf - 200 abgekühlt und eine Lösung von 43,4 g Dicyclohexylcarbodiimid in 100 ml Acetonitril zugegeben. Das Ganze lässt man unter zeitweiligem Umschütteln während 4 Stunden im Eiskasten stehen. Der entstandene Niederschlag wird abfiltriert und das Filtrat eingedampft. Der Eindampfrückstand wird in 1 Liter Essigester gelöst und hierauf in der Kälte mit 1n Natronlauge, Wasser, 1n Schwefelsäure, Wasser und gesättigter Kochsalzlösung gewaschen. Die über Natriumsulfat getrocknete Essigsäureäthylester-Phase wird vollständig eingedampft.
Nach Umkristallisieren aus Essigester/Petroläther erhält man ZArg(NO2)-Phe-OMe; Smp. 131 bis 1330, [a] 2D8 = - -7 in Methanol, -40 in Dimethylformamid.
b) H-Arg(NO2)-Phe-OMe 0,5 HeO- 1,2 HBr
20 g Z-Arg(NO2)-Phe-OMe werden in 50 ml Eisessig gelöst und unter leichtem Kühlen 50 ml 40%ige Bromwasserstoffsäure in Eisessig zugesetzt. Danach lässt man das Ganze unter zeitweiligem Umschütteln während 1 Stunde bei 200 stehen. Nach vollständigem Eindampfen wird der Rückstand in 200 ml Wasser gelöst und zweimal mit Äther gewaschen. Die wässrige Phase wird vollständig eingedampft und der Rückstand aus Methanol/Äther umkristallisiert. Smp. 165-167 mit Zers., [α# = +18 in Methanol, + 14 in Dimethylformamid.
c) Z-His(Z)-Arg(NOs)-Phe-OMe
46,1 g H-Arg(NOo)-Phe-OMe 0,5 H.O 1,2 HBr werden in 100 ml Wasser gelöst, hierauf erwärmt und anschliessend abgekühlt. NachZugabe von Chloroform und Eis wird mit Ammoniak auf pH 9 gestellt. Die Chloroformphase wird noch einmal mit Wasser gewaschen, anschliessend über Natriumcarbonat getrocknet und filtriert.
Dem Filtrat wird eine Lösung von 44,5 g Z-His(Z)-OH, 12,1 g Hydroxysuccinimid in 200 ml Acetonitril und 100 ml Pyridin zugesetzt, danach das Ganze auf - -20 abgekühlt und mit einer Lösung von 21,1 g Dicyclohexylcarbodiimid in 70 ml Acetonitril versetzt. Anschliessend wird unter zeitweiligem Rühren 4 Stunden im Eiskasten stehengelassen. Der entstandene Niederschlag wird abfiltriert und das Filtrat eingedampft. Der Rückstand wird in Essigsäureäthylester aufgenommen und anschliessend folgendermassen gewaschen: 1OXige Kaliumcarbonatlösung (pH zur 10), Wasser, gesättigte Kochsalzlösung, Wasser, gesättigte Kochsalzlösung, Schwefelsäure (pH 3), Wasser, Kochsalzlösung. Die über Natriumsulfat getrocknete Essigsäureäthylester Phase wird vollständig eingedampft, wobei ein hellbeiger Schaum erhalten wird.
Dieser Schaum wird je zweimal in wenig Methanol gelöst und mit Äther gefällt. Die Ätherphasen werden abdekantiert und der Niederschlag getrocknet; man erhält Z-His(Z)-Arg(NO9)-Phe-OMe (amorpher Schaum) [ri] # = - 80 in Methanol, - 80 in Dimethylformamid.
d) H-His-Arg-Phe-Ome. 4HCl
25 g Z-His(Z)-Arg(NOa)-Phe-OMe werden in 800 ml Eisessig gelöst. Danach werden 10 g 10 % Palladium auf Aktivkohle in 200 ml ln Salzsäure angerührt und in die Lösung gegeben. Das Ganze wird einer 2stündigen Hydrierung unterworfen und anschliessend der Katalysator abfiltriert. Das Filtrat wird erneut mit 5 g lOaó Palladium auf Aktivkohle in Wasser versetzt und der Hydrierung unterworfen, die nach 51,' Stunden beendet ist.
Hierbei werden etwa 80 % der theoretischen Menge Wasserstoff verbraucht. Der Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat vollständig eingedampft, wobei H-His Arg-Phe-OMe .4 4HC1 in Form eines amorphen Schaumes erhalten wird.
e) Trt-His(Trt)-Arg-Phe-OMe. HCl
21,5 g H-His-Arg-Phe-OMe. 4HCL werden in 100 ml Pyridin und etwa 100 ml Dimethylformamid gelöst. Bei etwa +50 wird bis pH 9 Triäthylamin zugegeben und anschliessend eine Lösung von 29 g Tritylchlorid in 300 ml Pyridin während 5 Minuten zugetropft. Nach Beendigung der Zugabe wird von Zeit zu Zeit das pH geprüft und nötigenfalls wieder mit Triäthylamin auf etwa pH 9 gestellt. Das Ganze wird nach ungefähr 4 Stunden eingedampft, der Rückstand in Chloroform und Wasser aufgenommen und unter Zugabe von wenig ln Salzsäure auf pH 4 gestellt. Man trennt die Chloroformphase ab, wäscht sie zweimal mit Wasser, trocknet über Natriumsulfat und dampft vollständig ein. Der Rückstand wird mit Äther versetzt und vom Äther anschliessend abfiltriert, wobei Trt-His(Trt)-Arg-Phe OMe HC1 erhalten wird.
f) Trt-His(Trt)-Arg-Phe-NH-NHo HC1
17 g Trt-His(Trt)-Arg-Phe-OMe HCl werden in 200 ml Methanol gelöst und mit 40 ml Hydrazinhydrat versetzt. Danach wird 2 Tage bei Zimmertemperatur stehengelassen. Man dampft ein, löst den Rückstand in Chloroform und wäscht zweimal mit Wasser. Die Chloroform-Phase wird über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Hierauf wird der Rückstand mit Äther gewaschen und abfiltriert; er besteht aus Trt-His(Trt) Arg-Phe-NH-NH.2 HCl; Smp 1580, [a] D18 = - 90 in Dimethylformamid.
Teilsequenz D:
1-(L-Asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl
L-asparaginyl-L-phenylalanin)-2-benzyloxycarbonyl hydrazid Trifluoracetat (H-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z CFSCOOH) a) 1-(N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-phenylalanin)
2-benzyloxycarbonyl-hydrazid (BOC-Phe-NH-NH-Z)
Man löst 72 g BOC-Phe-OH und 28 g N-Methylmorpholin in 500 ml Methylenchlorid auf und tropft bei -5 26 ml Chlorameisensäuremethylester zu. Nach 10 Minuten gibt man noch 44 g Z-NHNH3 in 100 ml Methylenchlorid zu und rührt 4 Stunden bei Zimmertemperatur weiter. Nach Auswaschen mit verdünnter Phosphorigersäure wird getrocknet und eingedampft.
Nach Kristallisieren aus Petroläther erhält man BOC-Phe-NH NH-Z vom Smp. 1170, [a] "DO = -5 in Dimethylformamid.
b) 1 (N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L- phenylalanin) -2-benzyloxycarbonyl-hydrazid (BOC-Asn-Phe-NH-NH-Z)
Man löst 41 g BOC-Phe-NHNH-Z in 400 ml Trifluoressigsäure und lässt eine Stunde bei 200 stehen.
Beim Verdampfen der Trifluoressigsäure erhält man das H-Phe-NHNH-Z als kristallines Trifluoracetat vom Smp. 1910, [ce] # = + 26,4 in Dimethylformamid.
Diese Substanz wimzusammen mit 35 g BOC-Asn-ONP und 30 g N-Methylmorpholin in 200 ml Dimethylformamid gelöst. Nach 16 Stunden Stehen bei 200 wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand nacheinander mit Essigester und verdünnter Phosphorigersäure gewaschen. Man erhält BOC-Asn-Phe-NH-NH-Z vom Smp. 210 , [a]2D = - 180 in Dimethylformamid.
c) 1-(N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-asparaginyl L-asparaginyl-L-phenylalanin)-2-benzyloxyvarbonyl - hydrazid (BOC-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z)
Man löst 26 g BOC-Asn-Phe-NH-NH-Z in 200 ml Trifluoressigsäure auf und lässt 1 Stunde bei 200 stehen.
Nach Verdampfen des Lösungsmittels versetzt man in 100 ml Dimethylformamid mit 17 g BOC-Asn-ONP und
15 g N-Methylmorpholin. Nach 16 Stunden bei 200 wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand nacheinander mit Essigester und verdünnter Phosphorigersäure gewaschen. Man erhält BOC-Asn-Asn-Phe NH-NH-Z; Smp. 2400, [o] D = - 280 in Dimethylformamid.
d) l-(N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-leucyl-L-asparaginyl- L-asparato,inyl-L-phenylalanin)-2-benzyloxyvarbonyl hydrazid (BOC-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z)
Man löst 22 g BOC-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z in
150 ml Trifluoressigsäure und lässt 1 Stunde bei 200 stehen. Nach Verdampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand mit 12 g BOC-Leu-ONP und 10 g N-Methylmorpholin in 100 ml Dimethylformamid versetzt. Nach
16 Stunden Stehenlassen bei 200 wird das Dimethylformamid verdampft und der Rückstand nacheinander mit Essigester und verdünnter Phosphorigersäure gewaschen. Man erhält BO C-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z vom Smp. 2100, [a] 2D = - 340 in Dimethylformamid.
e) l-(N-tert. -Butyloxycarbonyl-L-asparaginyl-
L-leucyl-L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenyl alanin)-2-benzyloxycarbonyl-hydrazid (BOC-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z)
Man löst 57 g BOC-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z in 300 ml Trifluoressigsäure und lässt eine Stunde bei 200 stehen. Nach Verdampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand in Äther kristallisiert. Man löst das Tetrapeptid-trifluoracetat in 400 ml Dimethylformamid und versetzt die Lösung mit 27 g BOC-Asn-ONP und
25 g N-Methylmorpholin. Nach 16 Stunden Stehenlassen bei 200 wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand nacheinander mit Essigester und verdünnter Phosphorigersäure gewaschen. Man erhält BOC-Asn Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z vom Smp. 2500 (Zers.), [a] 2D0 = - 340 in Dimethylformamid.
f) 1-(L-Asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl
L-asparaginyl-L-phenylalanin)-2-benzyloxycarbonyl hydrazid trifluoracetat (H-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-z.Trifluor acetat)
Man löst-43,5 .g BOC-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH- NH-Z in 200 ml Trifluoressigsäure und lässt eine Stunde bei 20 stehen. Nach Eindampfen wird der Rückstand mit Hilfe von Äther kristallisiert. Man erhält H-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z. Trifluoracetat;
Smp. 242 , [α# = -22 in Dimethylformamid.
Teilsequenz E: tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl
L-tryptophanyl-L-arginyl-hydrazid. acetat (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-NHNH2. CH2COOH) a) N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-tryptophanyl (guanido)N-nitro-L-argininmethylester (BOC-Trp-Arg(NO)-OMe)
Man löst 35 g H-Arg'NOo)-OMe HC1, 63 g BOC Trp-OCP und 14 g N-Methylmorpholin in 300 ml Dimethylformamid auf und lässt 16 Stunden bei 200 stehen. Nach Verdampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand in Essigester aufgenommen und mit verdünnter Schwefelsäure gewaschen. Man engt etwas ein und fällt mit Äther aus. Dabei kristallisiert BOC-Trp Arg(NO2)-OMe vom Smp. 1300, kil # = -220 in Dimethylformamid.
b) N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-tyrosyl-L-tryptophanyl (guanido)N-nitro-argininmethylester (BOC-Tyr-Trp-Arg(NO2) -OMe)
Man löst 15 g BOC-Trp-Arg(NO2)-OMe in 80 ml 5n methanolischer Salzsäurelösung auf und lässt 1 Stunde bei Zimmertemperatur stehen. Nach Verdampfen des Lösungsmittels und Behandeln mit Äther verbleiben 13 g H-Trp-Arg(NO2)-OMe als Hydrochlorid zurück; Smp. 1200, [a]D = -90 in Dimethylformamid. Dieses Dipeptid wird zusammen mit 14 g BOC-Tyr-OCP und 8 g N-Methylmorpholin in 200 ml Dimethylformamid gelöst. Nach 16 Stunden Stehen bei 200 wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand in Essigester aufgenommen.
Nach Waschen mit verdünnter Phosphorigersäure und Einengen des Lösungsmittels kann man mit Hilfe von Äther BOC-Tyr-Trp-Arg(NO2)-OMe isolieren; Smp. 1300, [o] #= - 110 in Dimethylformamid.
c) tert.-Butyloxycarbonyl-L-alanyl-L-tyrosyl-L-trypto phanyl-(guanido)N-nitro-L-argininmethylester (BOC-Ala-Tyr-Trp-Arg(NO-)-OMe)
Man löst 13,5 g BOC-Tyr-Trp-Arg(NO2)-OMe in 130 ml 5n methanolischer Salzsäurelösung auf, lässt 1 Stunde bei 250 stehen, dampft zur Trockne ein, wäscht den Rückstand mit Diäthyläther, filtriert ab, löst in 100 ml Dimethylformamid auf und versetzt mit 8,0 g BOC-Ala-OCP und 3,0 ml Triäthylamin. Nach 16 Stunden bei 250 gibt man 500 ml Essigester hinzu, wäscht mit verdünnter Schwefelsäure und Kaliumbicarbonatlösung und dampft zur Trockne ein. Nach Waschen des Rückstandes mit Chloroform erhält man BOC-Ala-Tyr Trp-Arg(NO2.)-OMe; Smp. 1200 (Zers.), [a]D = 120 in Dimethylformamid.
d) tert.-Butyloxycarbonyl-L-s eryl-L-alanyl-L-tyrosyl
L-tryptophanyl-(guanido)N-nitro-L-arginin methylester (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg(NO2)-OMe)
Man löst 12,3 g BOC-Ala-Tyr-Trp-Arg(NOO)-OMe in 100 ml 5n methanolischer Salzsäure, lässt 1 Stunde bei 250 stehen, dampft zur Trockene ein, wäscht den Rückstand mit Diäthyläther, löst ihn in 100 ml Dimethylformamid, versetzt mit 14 ml Triäthylamin und 8,5 g BOC-Ser-N?;, lässt 16 Stunden bei 0 stehen, gibt 500 ml Essigester zu, wäscht nacheinander mit verdünnter Schwefelsäure und Ammoniumhydroxid, trocknet über Natriumsulfat und dampft das Lösungsmittel ab. Nach Waschen des Rückstandes mit Chloroform löst man ihn in Essigester und fällt durch Zugabe von Diäthyläther.
Man erhält 13,5 g BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg(NO2)- OMe; Smp. 135e (Zers.), [Ex] oD = - 150 in Dimethylformamid.
e) tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl L-tryptophanyl-L-arginin hydrazid hydrazidacetat (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-NHNH- OH)
Man löst 13,2 g von dem oben erhaltenen Pentapeptidester in 300 ml Essigsäure. gibt 60 ml Wasser und 13,2 g Palladium-Kohle (10%ig) zu und hydriert bis zum Ende der Wasserstoffaufnahme. Man filtriert.
dampft ab, löst den Rückstand in Dimethylformamid auf, dampft wiederum ab, um die Spuren von Essigsäure zu beseitigen. Anschliessend löst man den Rückstand in 260 ml Methanol, versetzt mit 26 ml Hydrazin hydrat und lässt 16 Stunden bei 400 stehen. Nach Zugabe von 260 ml Diäthyläther filtriert man die ausgeschiedene kristalline Masse ab, wäscht mit Diäthyläther und trocknet im Hochvakuum über Schwefelsäure. Man erbält BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-NHNH2.CH3COOH; Smp. 1820, [α# # = - 80 im Dimethylformamid.
Teilsequenz Fl
L-Threonyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-valyl-L-leucin methylester hydrobromid (H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe HBr) a) H-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe HBr
Man löst 21,0 g Z-Cys(Bzl)-OCP und 12,3 g H-Val Leu-OMe-HCl in 120 ml Dimethylformamid. Danach gibt man 5,9 ml Triäthylamin hinzu, lässt 16 Stunden bei 250 stehen, fügt Essigester hinzu, wäscht mit verdünnter Salzsäure, trocknet über Natriumsulfat, dampft zur Trockne ab und kristallisiert den Rückstand aus Essigsäureäthylester/Diäthyläther. Man erhält Z-Cys (Bzl)-Val-Leu-OMe, Smp. 1600, [u]D = = 280 in Dimethylformamid, das man in 210 ml einer 40%igen Lösung von Bromwasserstoff in Eisessig löst.
Man lässt 1 Std. bei 250 stehen. dampft zur Trockne ein und kristallisiert den Rückstand aus Isopropanol/Diäthyläther um. Man erhält H-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe HBr,
Smp. 1680, [a] D0 = + 140 in Dimethylformamid.
b) H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe HBr
Man löst 20 g ZThr-NHNH in 350 ml Dimethylformamid, kühlt auf -200, gibt 100 ml einer Lösung von 2n Salzsäure in Dioxan und anschliessend noch
10 ml tert.-Butylnitrit zu. Nach 10 Minuten bei - 200 werden 45 ml Triäthylamin und 25,5 g H-Cys(Bzl)-Val Leu-OMe HBr hinzugefügt und das erhaltene Gemisch während 16 Stunden bei 0 geschüttelt. Man dampft zur Trockne ein, löst den Rückstand in einem Gemisch von Essigsäureäthylester/Wasser, wäscht die organische Phase mit verdünnter Salzsäure, trocknet über Natriumsulfat, dampft ein und kristallisiert den Rückstand aus Essigester um.
Man erhält Z-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu OMe; Smp. 2080, [a] # = - 270 in Dimethylformamid.
Man löst 20 g von dem oben erhaltenen Tetrapeptid in 200 ml eines Gemisches von Trifluoressigsäure-Essigester (1:1) auf, leitet während 1 Stunde bei 0 einen Strom gasförmigen Bromwasserstoffs ein, dampft anschliessend ein und kristallisiert den Rückstand aus Methanol/Diäthyläther um. Man erhält H-Thr-Cys(Bzl) Val-Leu-OMe .1,3 HBr; Smp. 2020, [α]# = - 10 in Dimethp@formamid.
Teilseq@@nz F2 : tert.-Butyloxycarbonyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-seryl
L-asparaginyl-L-leucyl-L-serin-hydrazid (BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser-NH-NH2) a) H-Asn-Leu-Ser-OMe. HCl
Man löst 43 g H-Leu-Ser-OMe HCl und 53 g BOC-Asn-ONP in 400 ml Dimethylformamid auf, gibt 22 ml Triäthylamin zu. Iässt 16 Stunden bei 250 stehen, dampft zur Trockne ein und kristallisiert den Rückstand aus Methanol um. Man erhält 51.6 g BOC-Asn-Leu Ser-OMe, Smp. 190 , [α]# = -24 in Dimethylformamid, das man in 500 ml einer 4n Lösung von Salzsäure in Methanol löst. Man lässt 1 Stunde bei 250 stehen, dampft zur Trockne ein, löst den Rückstand in Methanol und fällt mit Diäthyläther. Man erhält H-Asn-Leu Ser-OMe. HCl; Smp. 180 , [α]# = -23 in Dimethylformamid.
b) H-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe HC1
Man löst 39,5 g BOC-Ser-NHNH in 500 ml Dimethylformamid, kühlt auf - 200, gibt 200 ml einer 2n Lösung von Salzsäure in Dioxan und anschliessend 20 ml tert. Butylnitrit zu. Nach 10 Minuten bei - 200 werden 40 ml Triäthylamin und 38,0 g H-Asn-Leu-Ser-OMe. HCl hinzugefügt, danach 16 Stunden bei 0 gerührt, zur Trockne eingedampft und der Rückstand aus Chloroform/Diäthyläther umkristallisiert. Man erhält BOC-Ser Asn-Leu-Ser-OMe, Smp. 1350, [a] 20 - 220 in Dimethylformamid, das man in 420 ml einer 4n Salzsäurelösung in Methanol löst. Man lässt 1 Stunde bei 250 stehen, dampft zur Trockne ein und kristallisiert aus Methanol/Essigsäureäthylester um.
Man erhält H-Ser Asn-Leu-Ser-OMe HC1, Smp. 1550 (Zers.), [u] rz - - 150 in Dimethylformamid.
c) BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser-NHNH2
Man löst 18,5 g H-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe HCl und 18,0 g BOC-Cys(Bzl)-ONP in 100 ml Dimethylformamid auf, gibt 10 ml Wasser, 3,5 ml Essigsäure und 5,6 ml Triäthylamin zu, lässt 16 Stunden bei 250 stehen, dampft zur Trockne ein und kristallisiert aus Methanol um. Man erhält 25,1 g BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser OMe, Smp. 1820, [o] 2r) = - 170 in Dimethylformamid, das man unter leichtem Erwärmen in 200 ml Dimethylformamid löst.
Man gibt 200 ml Methanol und 20 ml Hydrazinhydrat zu, lässt 16 Stunden bei 300 stehen, fällt mit Diäthyläther, wäscht den Niederschlag mit Di äthyläther/Methanol (1:1) und trocknet das so erhaltene BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser-NHNH2,
Smp. 2240 [ri] # = - 130 in Dimethylformamid.
Teilsequenz F: tert.-Butyloxycarbonyl-L-hemicystinyl-L-seryl
L-asparaginyl-L-leucyl-L-seryl-L-threonyl-L-hemi cystinyl-L-valyl-L-leucin-hydrazid
EMI6.1
<tb> (BOC-Cys=Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu
<tb> NHNH2)
<tb>
Man löst 18,4 g BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser NHNH2 (Teilsequenz F2) in 150 ml Dimethylformamid, kühlt auf - 200, gibt 40 ml einer 2n Lösung von Salzsäure in Dioxan und 15 ml tert.-Butylnitrit zu. Nach
10 Minuten bei -200 gibt man noch 28 ml Triäthylamin und 24,8 g H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe 1,3 HBr (Teilsequenz F1) zu und rührt 16 Stunden bei 25 . Danach wird filtriert, die Lösung eingedampft und der Rückstand mit heissem Methanol durchgewaschen.
Man erhält BOC-Cys(Bzl0-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys(Bzl)-Val Leu-OMe, Smp. 242-244 , [α]# = -25 in Dimethylformamid, das man bei 60C in 100 ml Dimethylformamid löst. Man gibt 10 ml Hydrazinhydrat zu und lässt 2 Stunden bei 600 stehen; das entstandene Nonapeptidhydrazid kristallisiert aus. Man wäscht mit Diäthyläther, Wasser und Methanol und trocknet im Hochvakuum über Phosphorpentoxid. Man erhält Nonapeptidhydrazid vom Smp. 260 (Zers.), [α]# = - 330 in DimethylformamidlWasser (3 : 1). Man löst das erhaltene Produkt in 5000 ml getrocknetem Ammoniak, gibt unter Rühren und Sieden des Ammoniaks Natriummetall bis zur tiefblauen Färbung zu.
Zwecks Entfärbung wird Ammoniumchlorid hinzugefügt und danach ein Luftstrom bis zur negativen Nitroprussiatreaktion durch die Lösung geleitet. Man dampft zur Trockne ein und wäscht den Rückstand mit Wasser und Aceton durch. Nach Trocknen erhält man
EMI7.1
<tb> BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu
<tb> NHNH2,
<tb> Smp. 2980 (Zers.), [a] r, = -200 in Dimethylformamid/Wasser (3 1).
Teilsequenz ABC:
Nim-Trityl-L-histidyl-L-arginyl-L-phenylalanyl
L-seryl-glycyl-L-norleucyl-glycyl-L-phenylalanyl
L-glycyl-L-prolyl-L-glutamyl-L-threonyl
L-prolinamid Triacetat (H-His(Trt) -Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly
Pro-Glu-Thr-Pro-NH2.3 ch3cooh) a) L-Seryl-glycyl-L-norleucyl-glycyl-L-phenylalanyl glycyl-L-prolyl-L-glutamyl-L-threonyl-L-prolin amid Tetrahydrochlorid (H-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu(OTB)-Thr
Pro-NH2.4HCl)
Man löst 12 g H-Phe-Gly-Pro-Glu(OTB)-Thr-Pro NH2 in 1+00 ml Dimethylformamid und 20 ml Acetonitril bei 0 und gibt 2,1 g Hydroxysuccinimid, 8,0 g Z-Ser-Gly-Nle-Gly-OH, 4,0 g Dicyclohexylcarbodiimid zu, lässt Nacht bei 0 stehen, filtriert, verdampft im Vakuum und kristallisiert aus Chloroform.
Man erhält
ZSer-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu(OTB) Thr-Pro-NH2, Smp. 125-138 , [a] 20 - 44 in Dimethylformamid.
Man löst in 400 ml Dioxan und 400 ml HCl/Dioxan und hydriert bei Normaldruck in Gegenwart von Palladiumkatalysator und Säure bis zum Ende der Wasserstoffaufnahme. Man filtriert, dampft im Vakuum ein, löst in Methanol, versetzt mit Äther und erhält
H-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro
NH2 4 HCl, Smp. 130 Zers., [α]d20 = -52 in Dimethylformamid.
b) Nim-Trityl-L-histioyl-L-arginyl-L-phenylalanyl-L seryl-glycyl-L-norleucyl-glycyl-L-phenylalanyl-L glycyl-L-prolyl-L-glutamyl-L-theronyl-L-prolin amid. Azetat (H-His(Trt)-Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly
Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 , 3 CHsCO2H)
Man löst 9,9 g N-Trt-Nim-Trt-His-Arg-Phe- NHNHg , HCl in 100 Dimethylformamid, kühlt auf - 200, gibt 30 ml Dioxan/HCl 2n und anschliessend 1 16 ml tert-Butylnitrit zu, rührt 10 Minuten bei -200, gibt 28 ml Triäthylamin und 9,7 g H-Ser-Gly-Nle-Gly- Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NHa 4 HC1 zu, rührt 4 Stunden bei 00, filtriert und dampft zur Trockne ein.
Man löst den Rückstand in einem Gemisch von Essigester/ Methanol (8 : 2) auf, wäscht mit verdünntem Ammoniak und anschliessend mit Wasser bis Neutralität, trocknet über Natriumsulfat, konzentriert auf 100 ml und fällt durch Zugabe von Diäthyläther. Man löst den Niederschlag wiederum in Dimethylformamid auf und fällt durch Zugabe von Diäthyläther. Man erhält
Trt-His(Trt)-Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly Pro-Glu-Thr-Pro-NHo (Smp. 168 Zers.). [α]# = -43 in Dimethylformamid, das man in 500 ml Essigsäure/Wasser (8 : 2) löst. Man lässt 3 Stunden bei 400 stehen, dampft ein, wäscht den Rückstand in Diäthyläther und trocknet im Hochvakuum über KOH-Späne.
Man erhält
H-His(Trt)-Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro Glu-Thr-Pro-NH, 3 CH,COOH Smp. 180 (Zers.). [α] D = 610 in Essigsäure.
Teilsequenz DE:
N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl
L-tryptophanyl-L-arginyl-L-asparaginyl-L-leucyl
L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenylalanin hydrazid. diacetat (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn Phe-NHNH2- CH3COOH) a) 1-(N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-L tyrosinyl-L-tryptophanyl-L-arginyl-L-asparaginyl
L-leucyl-L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenyl alanyl)-2-benzyloxycarbonyl-hydrazid. diacetat (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn
Phe-NH-NH-Z 2 CH3COOH)
Man kühlt 320 ml Dimethylformamid auf - 200 C, gibt 100 ml 2n Chlorwasserstoff in Dioxan zu und löst darin 68 g BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-NHNH2 acetat (Teilsequenz E).
Anschliessend versetzt man mit 12 ml tert.-Butylnitrit, lässt 10 Minuten bei -20 rühren und tropft 35 ml Triäthylamin zu. Das so erhaltene Gemisch wird mit einer Lösung, entstanden aus 8,8 g H-Asn-Leu Asn-Asn-Phe-NHNH-Z Trifluoracetat (Teilsequenz D) und 17 ml Triäthylamin in 150 ml Dimethylformamid vereinigt. Nach 16 Stunden Stehenlassen bei 0 wird eingedampft. Man löst den Rückstand in Essigester und wäscht mit verdünnter Phosphorsäure und Ammoniaklösung.
Nach Eindampfen des Lösungsmittels verbleibt das
B OC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn
Phe-NHNH-Z 2 CH3COOH vom Smp. 1750, [o] 20 #= - 19,50 in Dimethylformamid.
b) tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl
L-tryptophanyl-L-arginyl-L-asparaginyl-L-leucyl L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenyl- alanin. hydrazid. diacetat (B OC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn Asn-Phe-NHNH2- 2CHsCOOH)
Man löst 90 g BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu Asn-Asn-Phe-NHNH-Z 2 CH3COOH in 500 ml Dimethylformamid und hydriert mit 10 g Pd/C (10 % ig) bis zum Ende der Wasserstoffaufnahme. Nach Abfiltrieren des Katalysators wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand aus einem Gemisch von Äther und Äthanol kristallisiert. Man erhält BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NHNH2 2 CH3COOH vom Smp. 2650 [o] # = - 570 in Dimethylformamid.
Teilsequenz ABCDE:
L-Seryl-L-alanyl-L-tyrosyl-L-tryptophanyl
L-arginyl-L-asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl
L-asparaginyl-L-phenylalanyl-L-histidyl-L-arginyl
L-phenylalanyl-L-s eryl-glycyl-L-norleucyl-glycyl
L-phenylalanyl-glycyl-L-prolyl-L-glutamyl-L threonyl-L-prolinamid. hexatrifluoracetat (H-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe
His-Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu Thr-Pro-NHo 6 CFaCOoH).
Man löst 15,2 g BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn Leu-Asn-Asn-Phe-NHNH2 Diacetat (Teilsequenz DE) in 200 ml Dimethylformamid, kühlt auf - 200, gibt 15 ml Dioxan/HCl 2n und anschliessend 1,16 ml tert.-Butyl nitrit zu und rührt 10 Minuten bei -200. Man gibt
14 ml Triäthylamin und eine Lösung von 18,6 g des in Teilsequenz ABC erhaltenen Tridecapeptidacetats in
Dimethylformamid zu, rührt das erhaltene Gemisch
16 Stunden bei 00, filtriert und dampft zur Trockne ein.
Man wäscht den Rückstand mit Diäthyläther und mit
Chloroform, Iöst in Dioxan/Wasser (8 : 2), behandelt die erhaltene Lösung mit 100 ml Amberlit-IRA-410 (Acetat-Form), dampft ein und kristallisiert den Rückstand aus Isopropanol/Wasser um. Man erhält das
BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn
Phe-His(Trt)-Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly
Pro-Glu-Thr-Pro-NH2. acetat, Smp.145 (Zers.), [α]# zu = =-71 in Essigsäure, das man unter Stickstoffatmosphäre in 50() ml Trifluoressigsäure löst. Man lässt 1 Stunde bei 25 stehen, konzentriert auf 100 ml und fällt durch Zugabe von 1000 ml Diäthyl äther.
Man filtriert, löst den Rückstand in Dimethylformamid und fällt mit Diäthyläther. Nach Trocknen über KOH-Späne erhält man das
H-Ser-Ala-Try-Trp-Arg-Ans-Leu-Asn-Asn-Ph
His-Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro-Gl Thr-Pro-NH2- zu 6 CFe,CO,H,
Smp. 130 (Zers.), [α]# = -45 in Essigsäure.
Beispiel 1 tert.-Butyloxycarbonyl-L-hemicystinyl-L-seryl L-asparaginyl-L-leucyl-L-seryl-L-threonyl-L-hemicystinyl-L-valyl-L-leucyl-L-seryl-L-alanyl-L-tyoxyl L-tryptophanyl-L-arginyl-L-asparaginyl-L-leucyl L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenylalanyl-L-histidyl L-arginyl-L-phenylalanyl-L-seryl-glycyl-L-norleucylglycyl-L-phenylalanyl-glycyl-L-prolyl-L-glutamyl L-threonyl-L-prolinamid. Hexaacetat. Octahydrat
EMI8.1
<SEP> I
<tb> (BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Len
<tb>
Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg
Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro
NH2. Hexaacetat. Octahydrat).
Man löst 1,05 g Nonapeptid-Hydrazid (Teilsequenz F) in einem Gemisch von 50 ml Dimethylformamid und 1,2 ml DioxanlHCl 2n bei -20 . Man gibt 0,116 ml tert.-Butylnitrit zu, rührt 10 Minuten bei -20 , gibt 1,4 ml Triä > :hylamin und 3,1 g Tricosapeptid-Hexatri- fluoracetat (Teilsequenz ABCDE) und 5 ml Wasser zu und rührt 16 Stunden bei 0 . Man dampft zur Trockne ein, wäscht den Rückstand mit Mäthyläther, Chloroform und Aceton.
So erhält man das rohe, geschützte Dotriacontapeptid, das man in 100 ml 0.3n Essigsäure löst, mit 20 ml Amberlit-IRA-410 (Acetat) behandelt und gibt 50 ml 0,6n Ammoniumhydroxid hinzu. Man stellt das pH auf 6,5 ein und schichtet die erhaltene Lösung auf eine Carboxymethylcellulosesäule (lOXlOOcm), die mit einer 0,15n Ammoniumacetatpufferlösung equilibriert wurde. Die Elution wird mit einem steigenden Konzentrations- und pH-Gradient (0,15n auf 0,4n; pH 6,5 auf 7,0) eines Ammoniumacetatpuffers durchgeführt. Die vereinigten Fraktionen, die das reine Peptid erhalten, werden dreimal gefriergetrocknet, der Rückstand wird mit Methanol und anschliessend mit Diäthyl äther gewaschen und über Kaliumhydroxid im Hochvakuum getrocknet.
Man erhält
EMI8.2
<tb> BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Ser
Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-A
Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro
NH2. 6 CH3CO2H. 8H2O, Smp. 220- (Zers.) [α] #= -58 in Essigsäure ln.
Aminosäurezusammensetzung nach Säurehydrolyse (6n, 16 Stunden):
Ala1.1, Arg2,0, Asn3.0, Cys/21.6, Glu1.2, Gly3.0,
His1.1, Leu2.0, Nle1.0, Phe3.0, Pro2.1, Ser3.8,
Thr1.9, Try1.0, Val0.9 (Trp 1,0 durch Spektrophotometrie).
Beispiel 2 L-Hemicystinyl-L-seryl-L-asparaginyl-L-leucyl-L-seryl L-threonyl-L-hemicystinyl-L-valyl-L-leucyl-L-seryl-Lalanyl-L-tyrosyl-L-tryptophanyl-L-arginyl-L-asparaginyl L-leucyl-L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenylalanyl L-histidyl-L-arginyl-L-phenylalanyl-L-seryl-glycyl-Lnormeucyl-glycyl-L-phenylalanyl-glycyl-L-prolyl-Lglutamyl-L-threonyl-L-prolylamid. Octaacetat. Decahydrat
EMI8.3
<tb> (H-Cys-Ser-Asn-leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Ser Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Phe-His-Arg Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro NH3. Octaacetat. Decahydrat).
EMI8.4
<SEP> I
<tb> Man <SEP> löst <SEP> 3,3 <SEP> g <SEP> BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys Val-Leu-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe His-Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro NH3. Acetat unter Stickstoffatmosphäre in 100 ml Trifluoressigsäure, lässt 15 Minuten bei 20 stehen und dampft zur Trockne ein. WIan löst in 300 ml 0,2n Essigsäure, behandelt mit 20 ml Amberlit-IRA-410 (Acetat), lyophilisiert, wäscht mit Diäthyläther und trocknet über Kaliumhydroxid im Hochvakuum. Man erhält
EMI8.5
<tb> H-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Ser-A
<tb>
Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phen-His-Arg-Phe
Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro
NH2. 8 CH3CO2H. 10 H2O, Smp. 220 (Zers.), [α]# # = ¯54 in EssilJsäure ln.
Aminosäurezusammensetzung nach Säurehydrolyse (6n, 16 Stunden): Alar,x, Arg2.0, Asp3,s, Cys/2l,6, Glut,o, Gly30,
His1.1, Leu2.9, Nle1.0, Phe3.0, Pro2.1, ser8.8, Thrl,o, Tyrl.o ValO,s (Trp 1,0 durch Spektrophotometrie).
Process for the production of a previously unknown polypeptide derivative
The present invention relates to a process for the preparation of a previously unknown polypeptide of the formula
EMI1.1
<tb> <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> 9 <SEP> 10
<tb> H-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Ser
11 12 13 14 13 16 17 18 19 20 21 Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg
22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 Phe-Ser-Gly-Nle -Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NR2, its therapeutically effective acid addition salts and heavy metal complexes.
The previously unknown polypeptide can be prepared by methods generally known for the synthesis of compounds of this type, the amino acids being linked individually in the order specified in the above formula or after prior formation of smaller peptide units and the disulfide bridge being formed at a suitable stage of the synthesis becomes.
During the construction of the new polypeptide, the blocking -: 'ne of the carboxyl group, for example in the part-sequence A described below, the tert. Butyloxy group proven, but other protective groups such as methoxy, ethoxy, tert. Amyloxy-. the amide or the benzyloxy group can be used.
The triphenylmethyl group has proven useful for blocking the imidazole group of the histidine residue in the partial sequence C described below, but other suitable protective groups, such as the carbo-tert.-butoxy-. the carbo-tert-amyloxy, the carbobenzoxy or the benzyl group can be used.
The nitro group was used to block the guanido group of the arginine residue in the partial sequence E described below, but other suitable protective groups such as the tosyl group, the p-nitrocarbobenzoxy group or the 2- (isopropyloxycarbonyl) -3,4,5,6-tetrachlorobenzoyl group can also be used $ can be used. The protective effect of protonation of the guanido group can also be used in the synthesis.
The new polypeptide can also be obtained or used in the form of its salts. The salts used are those with organic acids. such as acetic acid, propionic acid, glycolic acid, lactic acid, pyruvic acid, malonic acid, succinic acid, maleic acid, fumaric acid, tartaric acid, citric acid, benzoic acid, cinnamic acid, salicylic acid, 2-phenoxy- or 2-acetoxybenzoic acid, mandelic acid, methanesulphonic acid, ethanesulphonic acid or , Naphthalenesulfonic acid. Sulfanilic acid as well as polymeric acids such as tannic acid. Alginic acid, polygalacturonic acid, polyphloretin phosphate or carboxymethyl cellulose and salts with inorganic acids such as hydrohalic acid, e.g. B. hydrochloric acid or hydrobromic acid, nitric acid, thiocyanic acid, sulfuric acid and phosphoric acid in question.
As a heavy metal complex z. B. that of zinc ## in question.
The starting products for the production of the new polypeptide can, if they were not previously known. can be obtained by the methods known for peptide chemistry, the amino acids being linked to one another individually or after prior formation of smaller peptide units.
The new compound represents an important therapeutic principle: the calcium plasma level. in particular lowers the increased calcium plasma level and, as an antagonist of parathyroid hormone, causes a positive calcium balance in the bones. It is therefore indicated for all conditions in which a reduction in the plasma calcium level is desired. z.
B. Flypercalcemia of various origins. Alanael of the endogenous thyreocalcitonin as a result of the failure of thyroid tissue, hyperfunction of the parathyroid glands. The new compound is indicated for all bone affections that are based on increased breakdown or in which increased calcium fixation in the bone is desired, e.g. B. Osteoporosis of various origins (e.g. post-climacteric, post-traumatic. Caused by corticosteroid therapy or inactivity, etc.), fractures, osteomalacia, rickets and especially for combination therapy with calcium or phosphate.
Biological testing of the new compound showed a potency of about 100 to 450 MRC units / mg peptide. The required daily dose (administered as a rule) in MRC units is 20 mU to 10 U, preferably 100 mEíkg animal weight. In humans, the daily dose (administered intramuscularly) in MRC units is 1 to 500 U. A daily dose of 5 U i.v. m. administered.
The new compound can be used as a remedy, e.g. in the form of pharmaceutical preparations. Find use.
These contain the compound mentioned in a mixture with an organic or inorganic carrier material suitable for parenteral administration. For the same, those substances come into question that do not react with the new compound, such as. B. gelatin, milk sugar, starch, magnesium stearate. Talc, vegetable oils, benzyl alcohol, gum arabic, polyalkylene glycols, petrolatum, cholesterol or other known excipients. The pharmaceutical preparations can e.g. in liquid form as solutions, suspensions or emulsions. If necessary, they are sterilized and / or contain auxiliaries such as preservatives, stabilizers, wetting agents or emulsifiers. They can also contain other therapeutically valuable substances. The new compound can also be administered in the form of a depot preparation.
The new compound and its salts can also be used as an intermediate for the production of pharmaceutical preparations.
The following abbreviations are used:
Z = carbobenzoxy
Bzl = benzyl
BOC = tert-butyloxycarbonyl
Tritol = trityl triphenylmethyl
OTB = tert-butyloxy
ONP = p-nitrophenyl ester
OCP = 2,4,5-trichlorophenoxv
OMe = methoxy
OEt = ethoxy NO2 = nitro Ser = L-Seryl
Asn = L-asparaginyl
Leu = L-leucyl
Thr = L-threonyl
Val = L-valyl
Ala = L-alanyl
Tyr = L-tyrosyl
Trp = L-tryptophanyl
Arg = L-arginyl
Phe = L-phenylalanyl
Glu = L-glutamyl
His = L-histidyl
Pro = L-prolyl
Gly = glycyl
Nle = L-norleucyl
Cys = L-cysteinyl
In the following examples, which illustrate the implementation of the process but are not intended to restrict the scope of the invention in any way, all temperatures are given in degrees Celsius.
Partial sequence A: L-phenylalanyl-glycyl-L-prolyl-y-tert-butyloxy-
L-glutamyl-L-threonyl-L-prolinamide (H-Phe-Gly-Pro-Glu (OTB) -Thr-Pro-NH2)
Dissolve at -5134 g of Z-Thr-NH-NH2 in 2 liters in hydrochloric acid and add 0.55 liters in sodium nitrite. After 5 minutes, potassium carbonate is added to pH 9, the azide formed is extracted with ethyl acetate and a solution of 80 g of H-Pro-NH2 hydrochloride in 100 ml of water, 500 ml of dimethylformamide and 77 ml of triethylamine is added. The ethyl acetate is evaporated at 200 in vacuo and left to stand at 250 overnight. The remaining solution is evaporated in vacuo, the residue is dissolved in ethyl acetate, washed with water, dilute hydrochloric acid and an aqueous potassium carbonate solution and dried over sodium sulfate.
It is evaporated in vacuo, dissolved in warm ethyl acetate and cooled. Z-Thr-Pro-NH2 is obtained; M.p. 1480, [e] 2D = -720 in 95% acetic acid. 90 g of Z-Thr-Pro-NH2 are then dissolved in 2 liters of dioxane and 260 ml in hydrochloric acid and hydrogenated at 200 and normal pressure in the presence of a palladium catalyst. It is filtered, the solution evaporated in vacuo, the residue is washed with ethyl acetate and obtained
H-Thr-Pro-NH2.HCl; M.p. 2160, [a] 2D0 - -64 in 95% acetic acid. This is dissolved in 500 ml of dimethylformamide, 50 ml of water and 32 ml of triethylamine, and 118 g of Z-Glu (OTB) -OCP and 800 ml of tetrahydrofuran are added. The mixture is left to stand at 200 overnight, evaporated in vacuo and the residue is crystallized with ethyl ether.
Z-Glu (OTB) -Thr-Pro-NH2, m.p. 650 (decomp.); [a] # = -180 in dimethylformamide.
80 g of ZGlu (OTB) -Thr-Pro-NH2 are dissolved in 1.5 liters of dioxane and 200 ml of water and hydrogenated at 200 and normal pressure in the presence of a palladium catalyst.
The solution is filtered and evaporated in vacuo, and diethyl ether is added to the residue, H-Glu (OTB) -Thr-Pro-NH2 being obtained; M.p. 650 (dec.), [A] # = -280 in dimethylformamide. This is dissolved in 700 ml of dimethylformamide at 0, 200 ml of acetonitrile, 68 g of Z-Phe-Gly-Pro-OH, 18 g of N-hydroxysuccinimide and 32 g of dicyclohexylcarbodiimide are added, left to stand overnight at 200, filtered, evaporated in vacuo and with Ethyl acetate added. The solution is then washed with water, dilute hydrochloric acid and aqueous potassium carbonate solution, dried over sodium sulfate, evaporated in vacuo and the residue is crystallized from ethyl acetate / ethyl ether. You get .
Z-Phe-Gly-Pro-Glu (OTB) -Thr-Pro-NH2 m.p. 1200 (dec.). {a] 2E) 0 = - 66 in dimethylformamide, which is dissolved in 1500 ml of dioxane and 300 ml of water.
30 g of palladium carbon (10%) are added and the mixture is hydrogenated until the uptake of hydrogen has ended. It is filtered, the filtrate is evaporated and the residue is crystallized from dioxane. The H-Phe-Gly-Pro-Glu (OTB) Thr-Pro-NH2 is obtained; 1530 [e] 20 = -790 in dimethylformamide.
Partial sequence B: Benzyloxycarbonyl-L-seryl-glycyl-L-norleucyl-glycine (Z-Ser-Gly-Nle-Gly-OH) a) Benzyloxycarbonyl-L-norleucyl-glycine (ZNle-Gly-OH)
31.6 g of H-Gly-OH are dissolved in 420 ml of lN NaOH, 840 ml of tetrahydrofuran are added, then 130 g of Z-Nle-ONP are added, shaken until the solution becomes clear, and left to stand at 250 for one night. It is then concentrated to 500 ml in vacuo and the aqueous solution obtained is adjusted to pH 9 with NaOH, extracted twice with ether, then acidified with 4N hydrochloric acid and extracted with ethyl acetate. The ethyl acetate solution is washed with water and 30% strength sodium chloride solution, dried over sodium sulfate and evaporated in vacuo. The residue is triturated with ether and allowed to crystallize for 2 hours at -200.
Z-Nle-Gly-OH, m.p. 1380, [α] # = -4 is obtained in dimethylformamide.
b) Benzyloxycarbonyl-glycyl-L-norleucyl-glycine (Z-Gly-Nle-Gly-OH)
100 g of Z-Nle-Gly-OH are dissolved in 1000 ml of 4N HBr / glacial acetic acid, left at 250 for 50 minutes, rubbed with ether, crystals filtered off and washed well with ether. HBr H-Nle-Gly-OH, [a] 1D0 = +24.70 in acetic acid (95%) is obtained.
84 g of HBr H-Nle-Gly-OH are dissolved in 240 ml of water, and 152 ml of 4N NaOH, 800 ml of tetrahydrofuran and 91 g of Z-Gly-ONP are added. Shake at 250 for 1 hour and then let stand at 250 for 2 days. It is concentrated to 500 ml in vacuo, adjusted to pH 9 with NaOH and extracted with ether. The aqueous phase is acidified with hydrochloric acid, then extracted twice with ethyl acetate. It is washed with water, 30% sodium chloride solution, dried over sodium sulfate, evaporated in vacuo and the residue is triturated with ether.
Z-Gly-Nle-Gly-OH, m.p. 1550, [α] # = -5.6 in dimethylformamide is obtained.
c) Benzyloxycarbonyl-L-seryl-glycyl-L-norleucyl glycine (Z-Ser-Gly-Nle-Gly-OH)
89.5 g of Z-Gly-Nle-Gly-OH are dissolved in 900 ml of 4N HBr / glacial acetic acid, left to stand at 250 for 50 minutes, evaporated in a vacuum, rubbed with ether, filtered off, washed well with ether, dried in vacuo, Dissolve in 280 ml of water, about 650 ml of dimethylformamide, add 66.5 ml of triethylamine and add the azide, which is obtained as follows:
:
940 ml are cooled to -5 in hydrochloric acid, 96 g of Z-Ser-NH-NH2 are added and 360 ml of sodium nitrite are then instilled in drops at -50, stirred for a further 6 minutes while being covered with about 600 ml of 00 ethyl acetate, and the mixture is added of solid sodium carbonate to pH 8.5, the ethyl acetate phase is separated off, extracted again, the solution is dried over sodium sulfate and filtered. The reaction solution is evaporated in vacuo, the residue is mixed with 600 ml of water, acidified, extracted with ethyl acetate, washed with water and 30% sodium chloride solution, cooled to 00, and crystals are filtered off. Z-Ser-Gly-Nle-Gly-OH, m.p. 2100 (with dec.), [Α] # = -8 in dimethylformamide is obtained.
Partial sequence C: N # Nimid. Ditrityl-L-histidyl-L-arginyl-L-phenyl alanine hydrazide HCl) [(Trt) -His (Trt) -Arg-Phe
NH-NH2 HCl a) Z-Arg (NO2) -Phe-OMe
51.8 g of H-Phe-OMe HCl are dissolved in 1 liter of ether and about 50 ml of ice water, and sufficient sodium carbonate is added with stirring and cooling until all of the water has set. It is filtered and the filtrate is evaporated to constant weight, a colorless oil being obtained.
67.6 g of Z-Arg (NOa) -OH are dissolved in 300 ml of acetonitrile and 150 ml of dimethylformamide, and 41.2 g of H-Phe-OMe are added. It is then cooled to -200 and a solution of 43.4 g of dicyclohexylcarbodiimide in 100 ml of acetonitrile is added. The whole thing is left in the ice box for 4 hours while shaking from time to time. The resulting precipitate is filtered off and the filtrate is evaporated. The evaporation residue is dissolved in 1 liter of ethyl acetate and then washed in the cold with 1N sodium hydroxide solution, water, 1N sulfuric acid, water and saturated sodium chloride solution. The ethyl acetate phase, dried over sodium sulfate, is completely evaporated.
After recrystallization from ethyl acetate / petroleum ether, ZArg (NO2) -Phe-OMe is obtained; Mp. 131 to 1330, [a] 2D8 = - -7 in methanol, -40 in dimethylformamide.
b) H-Arg (NO2) -Phe-OMe 0.5 HeO-1.2 HBr
20 g of Z-Arg (NO2) -Phe-OMe are dissolved in 50 ml of glacial acetic acid and 50 ml of 40% strength hydrobromic acid in glacial acetic acid are added with slight cooling. Then the whole thing is left to stand at 200 for 1 hour with occasional shaking. After complete evaporation, the residue is dissolved in 200 ml of water and washed twice with ether. The aqueous phase is completely evaporated and the residue is recrystallized from methanol / ether. 165-167 with dec, [α # = +18 in methanol, +14 in dimethylformamide.
c) Z-His (Z) -Arg (NOs) -Phe-OMe
46.1 g of H-Arg (NOo) -Phe-OMe 0.5 H.O 1.2 HBr are dissolved in 100 ml of water, then heated and then cooled. After addition of chloroform and ice, the pH is adjusted to 9 with ammonia. The chloroform phase is washed once more with water, then dried over sodium carbonate and filtered.
A solution of 44.5 g of Z-His (Z) -OH, 12.1 g of hydroxysuccinimide in 200 ml of acetonitrile and 100 ml of pyridine is added to the filtrate, then the whole is cooled to -20 and with a solution of 21.1 g of dicyclohexylcarbodiimide in 70 ml of acetonitrile are added. The mixture is then left to stand for 4 hours in the ice chest with occasional stirring. The resulting precipitate is filtered off and the filtrate is evaporated. The residue is taken up in ethyl acetate and then washed as follows: 1OX potassium carbonate solution (pH 10), water, saturated sodium chloride solution, water, saturated sodium chloride solution, sulfuric acid (pH 3), water, sodium chloride solution. The ethyl acetate phase, dried over sodium sulfate, is evaporated completely, a light beige foam being obtained.
This foam is dissolved twice in a little methanol and precipitated with ether. The ether phases are decanted off and the precipitate is dried; Z-His (Z) -Arg (NO9) -Phe-OMe (amorphous foam) [ri] # = - 80 in methanol, - 80 in dimethylformamide.
d) H-His-Arg-Phe-Ome. 4HCl
25 g of Z-His (Z) -Arg (NOa) -Phe-OMe are dissolved in 800 ml of glacial acetic acid. Then 10 g of 10% palladium on activated charcoal are stirred in 200 ml of 1N hydrochloric acid and added to the solution. The whole is subjected to a 2 hour hydrogenation and then the catalyst is filtered off. The filtrate is again mixed with 5 g of lOaó palladium on activated charcoal in water and subjected to hydrogenation, which is complete after 51 hours.
About 80% of the theoretical amount of hydrogen is consumed here. The catalyst is filtered off and the filtrate is evaporated completely, H-His Arg-Phe-OMe.44HC1 being obtained in the form of an amorphous foam.
e) Trt-His (Trt) -Arg-Phe-OMe. HCl
21.5 g of H-His-Arg-Phe-OMe. 4HCL are dissolved in 100 ml of pyridine and about 100 ml of dimethylformamide. At about +50 triethylamine is added to pH 9, and a solution of 29 g of trityl chloride in 300 ml of pyridine is then added dropwise over 5 minutes. After the addition is complete, the pH is checked from time to time and, if necessary, adjusted to about pH 9 with triethylamine. The whole is evaporated after about 4 hours, the residue is taken up in chloroform and water and adjusted to pH 4 with the addition of a little 1N hydrochloric acid. The chloroform phase is separated off, washed twice with water, dried over sodium sulfate and completely evaporated. Ether is added to the residue and the ether is then filtered off, Trt-His (Trt) -Arg-Phe OMe HC1 being obtained.
f) Trt-His (Trt) -Arg-Phe-NH-NHo HC1
17 g of Trt-His (Trt) -Arg-Phe-OMe HCl are dissolved in 200 ml of methanol, and 40 ml of hydrazine hydrate are added. It is then left to stand for 2 days at room temperature. It is evaporated, the residue is dissolved in chloroform and washed twice with water. The chloroform phase is dried over sodium sulfate and evaporated. The residue is then washed with ether and filtered off; it consists of Trt-His (Trt) Arg-Phe-NH-NH.2 HCl; M.p. 1580, [a] D18 = -90 in dimethylformamide.
Partial sequence D:
1- (L-asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl
L-asparaginyl-L-phenylalanine) -2-benzyloxycarbonyl hydrazide trifluoroacetate (H-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z CFSCOOH) a) 1- (N-tert.-butyloxycarbonyl-L-phenylalanine)
2-benzyloxycarbonyl hydrazide (BOC-Phe-NH-NH-Z)
72 g of BOC-Phe-OH and 28 g of N-methylmorpholine are dissolved in 500 ml of methylene chloride and 26 ml of methyl chloroformate are added dropwise at -5. After 10 minutes, 44 g of Z-NHNH3 in 100 ml of methylene chloride are added and the mixture is stirred for a further 4 hours at room temperature. After washing with dilute phosphoric acid, it is dried and evaporated.
Crystallization from petroleum ether gives BOC-Phe-NH-NH-Z of melting point 1170, [a] "DO = -5 in dimethylformamide.
b) 1 (N-tert-butyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phenylalanine) -2-benzyloxycarbonyl-hydrazide (BOC-Asn-Phe-NH-NH-Z)
41 g of BOC-Phe-NHNH-Z are dissolved in 400 ml of trifluoroacetic acid and left to stand at 200 for one hour.
When the trifluoroacetic acid is evaporated, the H-Phe-NHNH-Z is obtained as crystalline trifluoroacetate with a melting point of 1910, [ce] # = + 26.4 in dimethylformamide.
This substance was dissolved in 200 ml of dimethylformamide together with 35 g of BOC-Asn-ONP and 30 g of N-methylmorpholine. After 16 hours of standing at 200, the solvent is evaporated and the residue is washed successively with ethyl acetate and dilute phosphoric acid. BOC-Asn-Phe-NH-NH-Z of melting point 210, [a] 2D = -180 in dimethylformamide is obtained.
c) 1- (N-tert-butyloxycarbonyl-L-asparaginyl L-asparaginyl-L-phenylalanine) -2-benzyloxyvarbonyl - hydrazide (BOC-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z)
26 g of BOC-Asn-Phe-NH-NH-Z are dissolved in 200 ml of trifluoroacetic acid and left to stand at 200 for 1 hour.
After evaporation of the solvent, 17 g of BOC-Asn-ONP and 100 ml of dimethylformamide are added
15 g of N-methylmorpholine. After 16 hours at 200, the solvent is evaporated and the residue is washed successively with ethyl acetate and dilute phosphoric acid. BOC-Asn-Asn-Phe NH-NH-Z is obtained; M.p. 2400, [o] D = -280 in dimethylformamide.
d) l- (N-tert-butyloxycarbonyl-L-leucyl-L-asparaginyl- L-asparato, ynyl-L-phenylalanine) -2-benzyloxyvarbonyl hydrazide (BOC-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH- Z)
22 g of BOC-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z are dissolved in
150 ml of trifluoroacetic acid and let stand at 200 for 1 hour. After evaporation of the solvent, 12 g of BOC-Leu-ONP and 10 g of N-methylmorpholine in 100 ml of dimethylformamide are added to the residue. To
Left to stand at 200 for 16 hours, the dimethylformamide is evaporated and the residue is washed successively with ethyl acetate and dilute phosphoric acid. BO C-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z of melting point 2100, [a] 2D = -340 in dimethylformamide is obtained.
e) l- (N-tert-butyloxycarbonyl-L-asparaginyl-
L-leucyl-L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenyl alanine) -2-benzyloxycarbonyl-hydrazide (BOC-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z)
57 g of BOC-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z are dissolved in 300 ml of trifluoroacetic acid and left to stand at 200 for one hour. After evaporation of the solvent, the residue is crystallized from ether. The tetrapeptide trifluoroacetate is dissolved in 400 ml of dimethylformamide and 27 g of BOC-Asn-ONP and are added to the solution
25 g of N-methylmorpholine. After 16 hours of standing at 200, the solvent is evaporated and the residue is washed successively with ethyl acetate and dilute phosphoric acid. BOC-Asn Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z of melting point 2500 (decomp.), [A] 2D0 = -340 in dimethylformamide is obtained.
f) 1- (L-asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl
L-asparaginyl-L-phenylalanine) -2-benzyloxycarbonyl hydrazide trifluoroacetate (H-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-z.Trifluoroacetate)
Dissolve 43.5 g of BOC-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z in 200 ml of trifluoroacetic acid and leave to stand at 20 for one hour. After evaporation, the residue is crystallized with the aid of ether. H-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z is obtained. Trifluoroacetate;
M.p. 242, [α # = -22 in dimethylformamide.
Partial sequence E: tert-butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl
L-tryptophanyl-L-arginyl hydrazide. acetate (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-NHNH2. CH2COOH) a) N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-tryptophanyl (guanido) N-nitro-L-arginine methyl ester (BOC-Trp-Arg (NO) - OMe)
35 g of H-Arg'NOo) -OMe HC1, 63 g of BOC Trp-OCP and 14 g of N-methylmorpholine are dissolved in 300 ml of dimethylformamide and left to stand at 200 for 16 hours. After evaporation of the solvent, the residue is taken up in ethyl acetate and washed with dilute sulfuric acid. One constricts a little and falls out with ether. BOC-Trp Arg (NO2) -OMe with a melting point of 1300, kil # = -220, crystallizes in dimethylformamide.
b) N-tert-butyloxycarbonyl-L-tyrosyl-L-tryptophanyl (guanido) N-nitro-arginine methyl ester (BOC-Tyr-Trp-Arg (NO2) -OMe)
15 g of BOC-Trp-Arg (NO2) -OMe are dissolved in 80 ml of 5N methanolic hydrochloric acid solution and left to stand for 1 hour at room temperature. After evaporation of the solvent and treatment with ether, 13 g of H-Trp-Arg (NO2) -OMe remain as hydrochloride; 1200, [a] D = -90 in dimethylformamide. This dipeptide is dissolved together with 14 g of BOC-Tyr-OCP and 8 g of N-methylmorpholine in 200 ml of dimethylformamide. After 16 hours of standing at 200, the solvent is evaporated and the residue is taken up in ethyl acetate.
After washing with dilute phosphorous acid and concentration of the solvent, BOC-Tyr-Trp-Arg (NO2) -OMe can be isolated with the aid of ether; M.p. 1300, [o] # = -110 in dimethylformamide.
c) tert-Butyloxycarbonyl-L-alanyl-L-tyrosyl-L-tryptophanyl- (guanido) N-nitro-L-arginine methyl ester (BOC-Ala-Tyr-Trp-Arg (NO -) - OMe)
13.5 g of BOC-Tyr-Trp-Arg (NO2) -OMe are dissolved in 130 ml of 5N methanolic hydrochloric acid solution, left to stand at 250 for 1 hour, evaporated to dryness, the residue is washed with diethyl ether, filtered off, dissolved in 100 ml of dimethylformamide and treated with 8.0 g of BOC-Ala-OCP and 3.0 ml of triethylamine. After 16 hours at 250, 500 ml of ethyl acetate are added, washed with dilute sulfuric acid and potassium bicarbonate solution and evaporated to dryness. After washing the residue with chloroform, BOC-Ala-Tyr Trp-Arg (NO2.) - OMe is obtained; 1200 (dec.), [A] D = 120 in dimethylformamide.
d) tert-Butyloxycarbonyl-L-s eryl-L-alanyl-L-tyrosyl
L-tryptophanyl- (guanido) N-nitro-L-arginine methyl ester (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg (NO2) -OMe)
12.3 g of BOC-Ala-Tyr-Trp-Arg (NOO) -OMe are dissolved in 100 ml of 5N methanolic hydrochloric acid, left to stand at 250 for 1 hour, evaporated to dryness, the residue is washed with diethyl ether and dissolved in 100 ml Dimethylformamide, mixed with 14 ml of triethylamine and 8.5 g of BOC-Ser-N?;, Left to stand at 0 for 16 hours, added 500 ml of ethyl acetate, washed successively with dilute sulfuric acid and ammonium hydroxide, dried over sodium sulfate and the solvent evaporated. After washing the residue with chloroform, it is dissolved in ethyl acetate and precipitated by adding diethyl ether.
13.5 g of BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg (NO2) - OMe are obtained; M.p. 135e (decomp.), [Ex] OD = -150 in dimethylformamide.
e) tert-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl L-tryptophanyl-L-arginine hydrazide hydrazide acetate (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-NHNH-OH)
13.2 g of the pentapeptide ester obtained above are dissolved in 300 ml of acetic acid. are 60 ml of water and 13.2 g of palladium-carbon (10%) and hydrogenated until the hydrogen uptake has ceased. Filter.
evaporates, dissolves the residue in dimethylformamide, evaporates again to remove the traces of acetic acid. The residue is then dissolved in 260 ml of methanol, treated with 26 ml of hydrazine hydrate and left to stand at 400 for 16 hours. After adding 260 ml of diethyl ether, the precipitated crystalline mass is filtered off, washed with diethyl ether and dried over sulfuric acid in a high vacuum. One gets BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-NHNH2.CH3COOH; M.p. 1820, [α # # = -80 in dimethylformamide.
Partial sequence Fl
L-Threonyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-valyl-L-leucine methyl ester hydrobromide (H-Thr-Cys (Bzl) -Val-Leu-OMe HBr) a) H-Cys (Bzl) -Val-Leu -OMe HBr
21.0 g of Z-Cys (Bzl) -OCP and 12.3 g of H-Val Leu-OMe-HCl are dissolved in 120 ml of dimethylformamide. Then 5.9 ml of triethylamine are added, the mixture is left to stand at 250 for 16 hours, ethyl acetate is added, washed with dilute hydrochloric acid, dried over sodium sulfate, evaporated to dryness and the residue crystallized from ethyl acetate / diethyl ether. Z-Cys (Bzl) -Val-Leu-OMe, melting point 1600, [u] D = 280 is obtained in dimethylformamide, which is dissolved in 210 ml of a 40% strength solution of hydrogen bromide in glacial acetic acid.
It is left to stand at 250 for 1 hour. evaporated to dryness and the residue crystallized from isopropanol / diethyl ether. H-Cys (Bzl) -Val-Leu-OMe HBr is obtained,
M.p. 1680, [a] D0 = +140 in dimethylformamide.
b) H-Thr-Cys (Bzl) -Val-Leu-OMe HBr
20 g of ZThr-NHNH are dissolved in 350 ml of dimethylformamide, cooled to -200, 100 ml of a solution of 2N hydrochloric acid in dioxane are added, followed by another
10 ml of tert-butyl nitrite. After 10 minutes at -200, 45 ml of triethylamine and 25.5 g of H-Cys (Bzl) -Val Leu-OMe HBr are added and the resulting mixture is shaken at 0 for 16 hours. It is evaporated to dryness, the residue is dissolved in a mixture of ethyl acetate / water, the organic phase is washed with dilute hydrochloric acid, dried over sodium sulfate, evaporated and the residue is recrystallized from ethyl acetate.
Z-Thr-Cys (Bzl) -Val-Leu OMe is obtained; M.p. 2080, [a] # = -270 in dimethylformamide.
20 g of the tetrapeptide obtained above are dissolved in 200 ml of a mixture of trifluoroacetic acid / ethyl acetate (1: 1), a stream of gaseous hydrogen bromide is passed in for 1 hour at 0, then evaporated and the residue is recrystallized from methanol / diethyl ether. H-Thr-Cys (Bzl) Val-Leu-OMe .1,3 HBr is obtained; M.p. 2020, [α] # = -10 in Dimethp @formamid.
Teilseq @@ nz F2: tert-butyloxycarbonyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-seryl
L-asparaginyl-L-leucyl-L-serine hydrazide (BOC-Cys (Bzl) -Ser-Asn-Leu-Ser-NH-NH2) a) H-Asn-Leu-Ser-OMe. HCl
43 g of H-Leu-Ser-OMe HCl and 53 g of BOC-Asn-ONP are dissolved in 400 ml of dimethylformamide, and 22 ml of triethylamine are added. Left to stand at 250 for 16 hours, evaporated to dryness and the residue recrystallized from methanol. 51.6 g of BOC-Asn-Leu Ser-OMe, melting point 190, [α] # = -24 are obtained in dimethylformamide, which is dissolved in 500 ml of a 4N solution of hydrochloric acid in methanol. The mixture is left to stand at 250 for 1 hour, evaporated to dryness, the residue is dissolved in methanol and precipitated with diethyl ether. H-Asn-Leu Ser-OMe is obtained. HCl; M.p. 180, [α] # = -23 in dimethylformamide.
b) H-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe HC1
39.5 g of BOC-Ser-NHNH are dissolved in 500 ml of dimethylformamide, cooled to - 200, 200 ml of a 2N solution of hydrochloric acid in dioxane and then 20 ml of tert. Butyl nitrite too. After 10 minutes at -200, 40 ml of triethylamine and 38.0 g of H-Asn-Leu-Ser-OMe are added. HCl added, then stirred for 16 hours at 0, evaporated to dryness and the residue recrystallized from chloroform / diethyl ether. BOC-Ser Asn-Leu-Ser-OMe, melting point 1350, [a] 20-220 in dimethylformamide, which is dissolved in 420 ml of a 4N hydrochloric acid solution in methanol, is obtained. The mixture is left to stand at 250 for 1 hour, evaporated to dryness and recrystallized from methanol / ethyl acetate.
H-Ser Asn-Leu-Ser-OMe HC1, melting point 1550 (decomp.), [U] rz - - 150 in dimethylformamide is obtained.
c) BOC-Cys (Bzl) -Ser-Asn-Leu-Ser-NHNH2
Dissolve 18.5 g of H-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe HCl and 18.0 g of BOC-Cys (Bzl) -ONP in 100 ml of dimethylformamide, add 10 ml of water, 3.5 ml of acetic acid and 5, 6 ml of triethylamine, left to stand for 16 hours at 250, evaporated to dryness and crystallized from methanol. 25.1 g of BOC-Cys (Bzl) -Ser-Asn-Leu-Ser OMe, m.p. 1820, [o] 2r) = - 170 are obtained in dimethylformamide, which is dissolved in 200 ml of dimethylformamide with gentle heating.
200 ml of methanol and 20 ml of hydrazine hydrate are added, the mixture is left to stand at 300 for 16 hours, it is precipitated with diethyl ether, the precipitate is washed with diethyl ether / methanol (1: 1) and the BOC-Cys (Bzl) -Ser-Asn thus obtained is dried -Leu-Ser-NHNH2,
M.p. 2240 [ri] # = -130 in dimethylformamide.
Partial sequence F: tert-butyloxycarbonyl-L-hemicystinyl-L-seryl
L-asparaginyl-L-leucyl-L-seryl-L-threonyl-L-hemi-cystinyl-L-valyl-L-leucine hydrazide
EMI6.1
<tb> (BOC-Cys = Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu
<tb> NHNH2)
<tb>
Dissolve 18.4 g of BOC-Cys (Bzl) -Ser-Asn-Leu-Ser NHNH2 (partial sequence F2) in 150 ml of dimethylformamide, cool to -200, give 40 ml of a 2N solution of hydrochloric acid in dioxane and 15 ml of tert. -Butyl nitrite too. To
10 minutes at -200 are added 28 ml of triethylamine and 24.8 g of H-Thr-Cys (Bzl) -Val-Leu-OMe 1.3 HBr (partial sequence F1) and stirred for 16 hours at 25. It is then filtered, the solution is evaporated and the residue is washed through with hot methanol.
BOC-Cys (Bzl0-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys (Bzl) -Val Leu-OMe, m.p. 242-244, [α] # = -25 in dimethylformamide, which is obtained at 60C in 100 ml of dimethylformamide are dissolved. 10 ml of hydrazine hydrate are added and the mixture is left to stand for 2 hours at 600; the resulting nonapeptide hydrazide crystallizes out. It is washed with diethyl ether, water and methanol and dried in a high vacuum over phosphorus pentoxide. Nonapeptide hydrazide of melting point 260 (decomp. ), [α] # = - 330 in dimethylformamide / water (3: 1) The product obtained is dissolved in 5000 ml of dried ammonia, sodium metal is added with stirring and boiling of the ammonia until it turns deep blue.
To decolorize, ammonium chloride is added and a stream of air is then passed through the solution until the nitroprussiate reaction is negative. It is evaporated to dryness and the residue is washed through with water and acetone. After drying, one obtains
EMI7.1
<tb> BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu
<tb> NHNH2,
<tb> m.p. 2980 (dec.), [a] r, = -200 in dimethylformamide / water (3 1).
Partial sequence ABC:
Nim-Trityl-L-histidyl-L-arginyl-L-phenylalanyl
L-seryl-glycyl-L-norleucyl-glycyl-L-phenylalanyl
L-glycyl-L-prolyl-L-glutamyl-L-threonyl
L-prolinamide triacetate (H-His (Trt) -Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly
Pro-Glu-Thr-Pro-NH2.3 ch3cooh) a) L-Seryl-glycyl-L-norleucyl-glycyl-L-phenylalanyl glycyl-L-prolyl-L-glutamyl-L-threonyl-L-proline amide tetrahydrochloride ( H-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu (OTB) -Thr
Pro-NH2.4HCl)
12 g of H-Phe-Gly-Pro-Glu (OTB) -Thr-Pro NH2 are dissolved in 1 + 00 ml of dimethylformamide and 20 ml of acetonitrile at 0 and 2.1 g of hydroxysuccinimide and 8.0 g of Z-Ser-Gly are added -Nle-Gly-OH, 4.0 g of dicyclohexylcarbodiimide, allowed to stand overnight at 0, filtered, evaporated in vacuo and crystallized from chloroform.
You get
ZSer-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu (OTB) Thr-Pro-NH2, m.p. 125-138, [a] 20-44 in dimethylformamide.
It is dissolved in 400 ml of dioxane and 400 ml of HCl / dioxane and hydrogenated at normal pressure in the presence of palladium catalyst and acid until the hydrogen uptake has ended. It is filtered, evaporated in vacuo, dissolved in methanol, treated with ether and obtained
H-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro
NH2 4 HCl, m.p. 130 dec., [Α] d20 = -52 in dimethylformamide.
b) Nim-Trityl-L-histioyl-L-arginyl-L-phenylalanyl-L-seryl-glycyl-L-norleucyl-glycyl-L-phenylalanyl-L glycyl-L-prolyl-L-glutamyl-L-theronyl-L- proline amide. Acetate (H-His (Trt) -Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly
Pro-Glu-Thr-Pro-NH2, 3 CHsCO2H)
9.9 g of N-Trt-Nim-Trt-His-Arg-Phe-NHNHg, HCl are dissolved in 100% dimethylformamide, cooled to -200, 30 ml of dioxane / HCl 2N and then 116 ml of tert-butyl nitrite are added, and the mixture is stirred 10 minutes at -200, 28 ml of triethylamine and 9.7 g of H-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NHa 4 HC1 are added, the mixture is stirred at 00 for 4 hours, filtered and evaporates to dryness.
The residue is dissolved in a mixture of ethyl acetate / methanol (8: 2), washed with dilute ammonia and then with water until neutral, dried over sodium sulfate, concentrated to 100 ml and precipitated by adding diethyl ether. The precipitate is again dissolved in dimethylformamide and precipitated by adding diethyl ether. You get
Trt-His (Trt) -Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NHo (m.p. 168 dec.). [α] # = -43 in dimethylformamide, which is dissolved in 500 ml of acetic acid / water (8: 2). The mixture is left to stand at 400 for 3 hours, evaporated, the residue is washed in diethyl ether and dried in a high vacuum over KOH chips.
You get
H-His (Trt) -Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro Glu-Thr-Pro-NH, 3 CH, COOH m.p. 180 (dec.). [α] D = 610 in acetic acid.
Partial sequence DE:
N-tert-butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl
L-tryptophanyl-L-arginyl-L-asparaginyl-L-leucyl
L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenylalanine hydrazide. diacetate (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn Phe-NHNH2- CH3COOH) a) 1- (N-tert-butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-L tyrosinyl- L-tryptophanyl-L-arginyl-L-asparaginyl
L-leucyl-L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenyl alanyl) -2-benzyloxycarbonyl-hydrazide. diacetate (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn
Phe-NH-NH-Z 2 CH3COOH)
320 ml of dimethylformamide are cooled to -200 ° C., 100 ml of 2N hydrogen chloride in dioxane are added and 68 g of BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-NHNH2 acetate (partial sequence E) are dissolved therein.
Then 12 ml of tert-butyl nitrite are added, the mixture is stirred for 10 minutes at -20 and 35 ml of triethylamine are added dropwise. The resulting mixture is combined with a solution formed from 8.8 g of H-Asn-Leu Asn-Asn-Phe-NHNH-Z trifluoroacetate (partial sequence D) and 17 ml of triethylamine in 150 ml of dimethylformamide. After 16 hours of standing at 0 it is evaporated. The residue is dissolved in ethyl acetate and washed with dilute phosphoric acid and ammonia solution.
The remains after evaporation of the solvent
B OC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn
Phe-NHNH-Z 2 CH3COOH of m.p. 1750, [o] 20 # = - 19.50 in dimethylformamide.
b) tert-butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl
L-tryptophanyl-L-arginyl-L-asparaginyl-L-leucyl L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenyl-alanine. hydrazide. diacetate (B OC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn Asn-Phe-NHNH2-2CHsCOOH)
90 g of BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu Asn-Asn-Phe-NHNH-Z 2 CH3COOH are dissolved in 500 ml of dimethylformamide and hydrogenated with 10 g of Pd / C (10%) to the end the hydrogen uptake. After filtering off the catalyst, the solvent is evaporated and the residue is crystallized from a mixture of ether and ethanol. BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NHNH2 2 CH3COOH of melting point 2650 [o] # = -570 is obtained in dimethylformamide.
Partial sequence ABCDE:
L-Seryl-L-alanyl-L-tyrosyl-L-tryptophanyl
L-arginyl-L-asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl
L-asparaginyl-L-phenylalanyl-L-histidyl-L-arginyl
L-phenylalanyl-L-s eryl-glycyl-L-norleucyl-glycyl
L-phenylalanyl-glycyl-L-prolyl-L-glutamyl-L threonyl-L-prolinamide. hexatrifluoroacetate (H-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe
His-Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu Thr-Pro-NHo 6 CFaCOoH).
15.2 g of BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn Leu-Asn-Asn-Phe-NHNH2 diacetate (partial sequence DE) are dissolved in 200 ml of dimethylformamide, cooled to - 200, and 15 ml of dioxane / HCl 2n are added and then 1.16 ml of tert-butyl nitrite and stirred for 10 minutes at -200. One gives
14 ml of triethylamine and a solution of 18.6 g of the tridecapeptide acetate obtained in partial sequence ABC in
Dimethylformamide is added and the resulting mixture is stirred
16 hours at 00, filtered and evaporated to dryness.
The residue is washed with diethyl ether and with
Chloroform, dissolved in dioxane / water (8: 2), treats the solution obtained with 100 ml of Amberlite IRA-410 (acetate form), evaporates and recrystallizes the residue from isopropanol / water. You get that
BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn
Phe-His (Trt) -Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly
Pro-Glu-Thr-Pro-NH2. acetate, m.p. 145 (dec.), [α] # zu = = -71 in acetic acid, which is dissolved in 50 () ml of trifluoroacetic acid under a nitrogen atmosphere. The mixture is left to stand at 25 for 1 hour, concentrated to 100 ml and precipitated by adding 1000 ml of diethyl ether.
It is filtered, the residue is dissolved in dimethylformamide and precipitated with diethyl ether. This is obtained after drying over KOH chips
H-Ser-Ala-Try-Trp-Arg-Ans-Leu-Asn-Asn-Ph
His-Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro-Gl Thr-Pro-NH2- to 6 CFe, CO, H,
M.p. 130 (dec.), [Α] # = -45 in acetic acid.
Example 1 tert-Butyloxycarbonyl-L-hemicystinyl-L-seryl L-asparaginyl-L-leucyl-L-seryl-L-threonyl-L-hemicystinyl-L-valyl-L-leucyl-L-seryl-L-alanyl- L-tyoxyl L-tryptophanyl-L-arginyl-L-asparaginyl-L-leucyl L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenylalanyl-L-histidyl L-arginyl-L-phenylalanyl-L-seryl-glycyl-L-norleucylglycyl -L-phenylalanyl-glycyl-L-prolyl-L-glutamyl L-threonyl-L-prolinamide. Hexaacetate. Octahydrate
EMI8.1
<SEP> I
<tb> (BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Len
<tb>
Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg
Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro
NH2. Hexaacetate. Octahydrate).
1.05 g of nonapeptide hydrazide (partial sequence F) are dissolved in a mixture of 50 ml of dimethylformamide and 1.2 ml of dioxane / HCl 2n at -20. 0.116 ml of tert-butyl nitrite is added, the mixture is stirred for 10 minutes at -20, 1.4 ml of trihydric amine and 3.1 g of tricosapeptide hexatrifluoroacetate (partial sequence ABCDE) and 5 ml of water are added and the mixture is stirred for 16 hours 0. It is evaporated to dryness, and the residue is washed with methyl ether, chloroform and acetone.
This gives the crude, protected dotriacontapeptide, which is dissolved in 100 ml of 0.3N acetic acid, treated with 20 ml of Amberlite IRA-410 (acetate) and 50 ml of 0.6N ammonium hydroxide are added. The pH is adjusted to 6.5 and the solution obtained is layered on a carboxymethylcellulose column (10X100cm) which has been equilibrated with a 0.15N ammonium acetate buffer solution. The elution is carried out with an increasing concentration and pH gradient (0.15n to 0.4n; pH 6.5 to 7.0) of an ammonium acetate buffer. The combined fractions which receive the pure peptide are freeze-dried three times, the residue is washed with methanol and then with diethyl ether and dried over potassium hydroxide in a high vacuum.
You get
EMI8.2
<tb> BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Ser
Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-A
Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro
NH2. 6 CH3CO2H. 8H2O, m.p. 220- (dec.) [Α] # = -58 in acetic acid In.
Amino acid composition after acid hydrolysis (6n, 16 hours):
Ala1.1, Arg2.0, Asn3.0, Cys / 21.6, Glu1.2, Gly3.0,
His1.1, Leu2.0, Nle1.0, Phe3.0, Pro2.1, Ser3.8,
Thr1.9, Try1.0, Val0.9 (Trp 1.0 by spectrophotometry).
Example 2 L-Hemicystinyl-L-seryl-L-asparaginyl-L-leucyl-L-seryl L-threonyl-L-hemicystinyl-L-valyl-L-leucyl-L-seryl-Lalanyl-L-tyrosyl-L-tryptophanyl -L-arginyl-L-asparaginyl L-leucyl-L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenylalanyl L-histidyl-L-arginyl-L-phenylalanyl-L-seryl-glycyl-Lnormeucyl-glycyl-L-phenylalanyl-glycyl -L-prolyl-L-glutamyl-L-threonyl-L-prolylamide. Octaacetate. Decahydrate
EMI8.3
<tb> (H-Cys-Ser-Asn-leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Ser Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Phe-His-Arg Phe-Ser-Gly- Nle-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro NH3, octaacetate, decahydrate).
EMI8.4
<SEP> I
<tb> Man <SEP> solves <SEP> 3.3 <SEP> g <SEP> BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys Val-Leu-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg- Asn-Leu-Asn-Asn-Phe His-Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro NH3. Acetate under a nitrogen atmosphere in 100 ml of trifluoroacetic acid, left to stand for 15 minutes at 20 and evaporated to dryness. WIan dissolves in 300 ml of 0.2N acetic acid, treated with 20 ml of Amberlit-IRA-410 (acetate), lyophilized, washed with diethyl ether and dried over potassium hydroxide in a high vacuum. You get
EMI8.5
<tb> H-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Ser-A
<tb>
Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phen-His-Arg-Phe
Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro
NH2. 8 CH3CO2H. 10 H2O, m.p. 220 (dec.), [Α] # # = ¯54 in acetic acid ln.
Amino acid composition after acid hydrolysis (6n, 16 hours): Alar, x, Arg2.0, Asp3, s, Cys / 2l, 6, Glut, o, Gly30,
His1.1, Leu2.9, Nle1.0, Phe3.0, Pro2.1, ser8.8, Thrl, o, Tyrl.o ValO, s (Trp 1.0 by spectrophotometry).