Verfahren zur Herstellung bisher unbekannter Polypeptidderivate
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung bisher unbekannter Polypeptidderivate der Formel
EMI1.1
worin R für eine Alkyl-, eine gegebenenfalls substituierte Aralkyl- oder eine gegebenenfalls substituierte Arylgruppe steht, seiner therapeutisch wirksamen Säureadditionssalze und Schwermetallkomplexe. Beispielsweise kann R die Methyl.-, Äthyl-, Propyl-, tert.-Butylgruppe oder aber einen gegebenenfalls durch ein Halogenatom, eine niedere Alkoxy- oder die Nitrogruppe substituierten Phenyl- oder Benzylrest bedeuten. Die neuen Polypeptidderivate zeichnen sich durch ihre Beständigkeit gegenüber der abbauenden Wirkung von Aniinopepti.- dasen aus.
Ein weiterer Vorteil ist der bekanntlich oxydationsbeständige Norleucin-Rest in Stellung 25.
Die bisher unbekannten Polypeptidderivate können hergestellt werden, indem man zu ihrem Aufbau nötige Verbindungen unter Bildung von CONH-Bindungen in beliebiger zeitlicher Reihenfolge miteinander kondensiert, wobei nicht an der Reaktion teilnehmende freie funktionelle Gruppen durch geeignete Schutzgruppen geschützt werden, zu einem beliebigen Zeitpunkt der Synthese die Schutzgruppen abspaltet, die Mercaptogruppen nach Bildung der Sequenz 1 bis 7 zum Disulfid oxydiert und die Carboxylgruppe des Prolylrestes in die Amidgruppe überführt. In der letzten Stufe sind jedoch Methoden zu verwenden, bei denen Racemisierung nicht auftritt oder gering gehalten werden kann, vorzugsweise die Azid- oder die aktivierte Ester-Methode, wobei zur Aktivierung vorzugsweise N-Hydroxysuccinimid Verwendung findet.
tSblicherweise werden die bei Cystein-haltigen Peptiden zum Schutz der SH-Gruppen verwendeten Benzylreste am Ende der Synthese durch Behandlung mit Natrium in flüssigem Ammoniak abgespalten. Es wurde nun gefunden, dass die Abspaltung der Benzylschutzgruppen sowie die Herstellung der (Cys)S-S(Cys)-Bindung vor der letzten Stufe zu besonders guten Ausbeuten an Endprodukt führt.
Beim Aufbau der neuen Polypeptide hat sich für die Blockierung der y-Carboxylgruppe, beispielsweise in der nachstehend beschriebenen Teilsequenz A, die tert. Butyloxygruppe bewährt, doch können auch andere Schutzgruppen, wie die Methoxy-* die Athoxy-, die tert.-Amyloxy-, die Amid- oder die Benzyloxygruppe verwendet werden.
Für die Blockierung der Imidazolgruppe des Histidinrestes in der nachstehend beschriebenen Teilsequenz C hat sich die Triphenylmethylgruppe bewährt, doch können auch andere geeignete Schutzgruppen, wie die Carbo-tert.-butoxy-, die Carbo-tert.-amyloxy-, die Carbobenzoxy- oder die Benzylgruppe verwendet werden.
Für die Blockierung der Guanidogruppe des Argininrestes in der nachstehend beschriebenen Teilsequenz E wurde die Nitrogruppe verwendet doch können auch andere geeignete Schutzgruppen, wie die Tosylgruppe, die p-Nitrobenzoxycarbonylgruppe oder die 2-(lsopropyloxycarbonyl)-3 -3,4,5, 6-tetrachlorobenzoy1- gruppe verwendet werden. Man kann auch den Schutzeffekt der Protonisierung der Guanidogruppe bei der Synthese verwenden.
Die neuen Polypeptidderivate lassen sich auch in Form ihrer Salze gewinnen bzw. verwenden. Als Salze kommen solche mit organischen Säuren, wie Essigsäure, Propionsäure, Glykolsäure, Milchsäure, : Brenztrauben- säure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Benzoesäure, Zimtsäure, Salicylsäure, 2-Phenoxy- oder 2-Acetoxy-benzoe säure, Mandelsäure, Methansulfonsäure, Athansulfonsäure, Hydroxyäthansulfonsäure, Eenzol- oder Toluolsulfonsäure, Naphthalinsulfonsäure, Sulfanilsäure sowie polymere Säuren, wie Gerbsäure, Alginsäure, Polygalacturonsäure, Polyphloretinphosphat oder Carboxymethylcellulose und Salze mit anorganischen Säuren, wie Halogenwasserstoffsäure, z. B. Salzsäure oder Bromwasserstoffsäure, Salpetersäure, Thiocyansäure, Schwefelsäure und Phosphorsäure in Frage. Als Schwermetallkomplex kommt z.
B. derjenige vom Zink*- in Frage.
Die Ausgangsprodukte zur Herstellung der neuen Polypeptidderivate können, sofern sie bisher nicht bekannt waren, nach den für die Peptidchemie bekannten Methoden erhalten werden, wobei die Aminosäuren einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten miteinander verknüpft werden.
Die neuen Verbindungen stellen ein wichtiges therapeutisches Prinzip dar, das den Calciumplasmaspieael, insbesondere den erhöhen Caldumplasmaspiegel, senkt und als Antagonist des Parathormons eine positive Calciumbilanz im Knochen bewirkt.
Es ist somit indiziert bei allen Zuständen, bei welchen eine Senkung des Plasmacalciuinspiegels erwünscht ist, z. B. Hypercalcämien verschiedener Genese, Mangel des endogenen Thyreocalcitonins infolge Ausfalls von Schilddrüsengeweben, Hyperfunktion der Nebenschilddrüsen.
Die neuen Verbindungen sind indiziert bei allen Knochenaffektionen, die auf einem vermehrten Abbau beruhen oder bei welchen eine vermehrte Calciumfixation im Knochen erwünscht ist, z. B. Osteoporose verschiedener Genese (z. B. postklimakterisch, posttraumatisch, bedingt durch Corticosteroidtherapie oder Inaktivität usw.), Frakturen, Osteomalacie, Rachitis sowie insbesondere zur Kombinationstherapie mit Calcium bzw. Phosphat. Die biologische Prüfung der neuen Verbindungen ergab eine Wirksamkeit von etwa 100 bis 450 MRC-Einheiten/mg Peptid. Die erforderliche Tagesdosis (i. m. verabreicht) in MRC-Einheiten beträgt 20 mE bis 10 E, vorzugsweise 100 mElkg Tiergewicht.
Beim Menschen beträgt die tägliche Dosis (i. m.
verabreicht) in MRC-Einheiten 1 bis 500 E. Vorzugsweise wird eine tägliche Dosis von 5 E. i. m. verabreicht.
Die neuen Verbindungen können als Heilmittel, z. B.
in Form pharmazeutischer Präparate, Verwendung finden. Diese enthalten die genannten Verbindungen in Mischung mit einem für die parenterale Applikation geeigneten organischen oder anorganischen Trägermaterial. Für dasselbe kommen solche Stoffe in Frage, die mit den neuen Verbindungen nicht reagieren, wie z. B.
Gelatine, Milchzucker, Stärke, Magnesiumstearat, Talk, pflanzliche Öle, Benzylalkohole, Gummi arabicum, Polyalkylenglykole, Vaseline, Cholesterin oder andere bekannte Arzneimittelträger.
Die pharmazeutischen Präparate können z. B. in flüssiger Form als Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen vorliegen. Gegebenenfalls sind sie sterilisiert und bzw. oder enthalten Hilfsstoffe, wie Konservierungs-, Stabilisierungs-, Netzmittel oder Emulgiermittel. Sie können auch noch andere, therapeutisch wertvolle Stoffe enthalten. Die neuen Verbindungen können auch in Form eines Depotpräparates verabreicht werden.
Die neuen Verbindungen und ihre Salze können auch als Zwischenprodukte zur Herstellung von pharmazeutischen Präparaten Verwendung finden.
Es werden folgende Abkürzungen verwendet:
Z = Benzyloxycarbonyl
Bzl = Benzyl
BOC = tert..-Butyloxycarbonyl
Piv = Pivaloyl
Trt = Trityl = Triphenylmethyl
OTB = tert.-Butyloxy
ONP = p-Nitrophenylester
OCP = 2,4,5-Trichlorphenoxy
OSu = Oxysuccinimid
OMe = Methoxy
OEt = Äthoxy = = Nitro
Ser = L-Seryl
Asn = L-Asparaginyl
Leu = L-Leucyl
Thr = L-Threonyl
Val = L-Valyl Ala = L-Alanyl
Tyr = L-Tyrosyl
Trp = L-Tryptophanyl
Arg = L-Arginyl
Phe -- L-Phenylalanyl
Glu = L-Glutamyl
His = L-Histidyl
Pro = L-Prolyl
Gly = Glycyl
Nle = L-Norleucyl
Cys = L-Cysteinyl
In den nachfolgenden Beispielen,
die die Ausführung des Verfahrens erläutern, den Umfang der Erfindung aber in keiner Weise einschränken sollen, erfolgen alle Temperaturangaben in Celsiusgraden.
Teilsequenz A L-Phenylalanyl-glycyl-L-prolyl- γtert.-butyloxy-
L-glutamyl-L-threonyl-L-prolinamid (H-Phc-Gly-Pro-Glu(OTB)¯Thr-Pro-NH2)
Man löst bei-5 134 g Z-Thr-NH-NHS in 2 Liter in Salzsäure und versetzt mit 0,55 Liter in Natriumnitrit. Nach 5 Minuten wird Kaliumcarbonat bis pH 9 zugegeben, das entstandene Azid mit Athylacetat extrahiert und eine Lösung von 80 g H-Pro-NH Hydrochlorid in 100 ml Wasser, 500 ml Dimethylformamid und 77 ml Triäthylamin hinzugefügt. Man verdampft das Athylacetat bei 200 im Vakuum und lässt über Nacht bei 250 stehen.
Die restliche Lösung wird im Vakuum verdampft, der Rückstand in Athylacetat gelöst, die Lösung mit Wasser, verdünnter Salzsäure und einer wässrigen Kaliumcarbonatlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Man verdampft im Vakuum, löst in warmem Äthylacetat und kühlt ab.
Man erhält Z-Thr-Pro-NH; Smp. 1480, [a] 20D = 720 in 95 % Essigsäure. Man löst hierauf 90 g Z-Thr-Pro NH.2 in 2 Liter Dioxan und 260 ml in Salzsäure und hydriert bei 200 und Normaldruck in Gegenwart eines Palladiumkatalysators. Man filtriert, verdampft die Lösung im Vakuum, wäscht den Rückstand mit Äthyl- acetat und erhält H-Thr-Pro-NH HCl; Smp. 2160, [a] 0 = -64 in 95 % Essigsäure. Dieses wird in 500 ml Dimethylformamid, 50 ml Wasser und 32 ml Triäthyl amin gelöst und 118 g Z-Glu(OTB)-OCP und 800 ml Tetrahydrofuran zugegeben.
Man lässt über Nacht bei
200 stehen, verdampft im Vakuum und kristallisiert den Rückstand mit Athyläther. Man erhält Z-Glu(OTB) Thr-Pro-NH2, Smp. 650 (Zers.), [a]0- = -18 in Dimethylformamid.
Man löst 80 g Z-Glu(OTB)-Thr-Pro-NW in 1,5 Liter Dioxan und 200 ml Wasser und hydriert bei 200 und Normaldruck in Gegenwart eines Palladiumkatalysators.
Die Lösung wird filtriert und im Vakuum verdampft und der Rückstand mit Diäthyläther versetzt, wobei H-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2 erhalten wird; Smp. 650 (Zers.), [a]20D - -28 in Dimcthylformamid,
Dieses wird in 700 ml Dimethylformamid bei 0 gelöst, 200 ml Acetonitril, 68 g ZPhe-Gly-Pro-OH und 32 g Dicyclohexylcarbodiimid hinzugefügt, über
Nacht bei 200 stehengelassen, filtriert, im Vakuum ein gedampft und mit Äthylacetat versetzt. Danach wäscht man die Lösung mit Wasser, verdünnter Salzsäure und wässriger Kaliumcarbonatlösung, trocknet über Natriumsulfat, verdampft im Vakuum und kristallisiert den Rückstand aus Äthylacetat/Äthyläther. Man erhält Z - Phe - Gly - Pro - Glu(OTB) - thr-Pro-NH2, Smp. 1200 (Zers.), [a]20d = -66 in Dimethylformamid, das man in 1500 ml Dioxan und 300 ml Wasser löst.
Man gibt
30 g Palladiumkohle (10%) zu und hydriert bis zum
Ende der Wasserstoffaufnahme. Man filtriert, dampft das Filtrat ein und kristallisiert den Rückstand aus Dioxan. Man erhält das H-Phe-Gly-Pro-Glu(OTB)-Thr Pro-NH2; Smp. 153 , [a]20D = -79 in Dimethylform amid.
Teilsequenz B
Benzyloxycarbony1-L-seryl-glycyl-L-norleucyl glycin (Z-Ser-Gly-Nle-Gly-OH) a) Benzyloxycarbonyl-L-norleucyl-glycin (Z-Nle-Gly-OH)
Man löst 31,6 g H-Gly-OH in 420 ml in NaOH, gibt 840 ml Tetrahydrofuran zu, versetzt anschliessend mit 130 g Z-Nle-ONP, schüttelt, bis die Lösung klar wird, lässt eine Nacht bei 250 stehen. Dann wird im Vakuum auf 500 ml konzentriert und die erhaltene wässrige Lösung mit in NaOH auf pH 9 gestellt, zweimal mit Äther extrahiert, dann mit 4n Salzsäure angesäuert, mit Essigester extrahiert. Die Essigesterlösung wäscht man mit Wasser und 30%iger Kochsalzlösung, trocknet über Natriumsulfat, dampft im Vakuum ein.
Den Rückstand verreibt man mit äther, lässt 2 Stunden bei -20 kristallisieren. Man erhält Z-Nle-Gly-OH, Smp. 138 , [a]20D= -4 in Dimethylformamid.
b) Benzyloxycarbonyl-glycyl-L-norleucyl-glycin (Z-Gly-Nle-Gly-OH)
Man löst 100 g Z-Nle-Gly-OH in 1000 ml 4n HBr/ Eis essig, lässt 50 Minuten bei 250, verreibt mit Äther, filtriert Kristalle ab und wäscht gut mit Äther. Man erhält HBr H-Nle-Gly-OH, [a] 20D = + 24,70 in Essigsäure (95 %). Man löst 84 g HBr H-Nle-Gly-OH in 240 ml Wasser, versetzt mit 152 ml 4n NaOH, 800 ml Tetrahydrofuran und 91 g ZGly-ONP. Man schüttelt 1 Stunde bei 250 und lässt dann 2 Tage bei 250 stehen.
Man konzentriert im Vakuum auf 500 ml, stellt mit in NaOH auf pH 9 und extrahiert mit äther. Die wässrige Phase wird mit in Salzsäure angesäuert, dann zweimal mit Essigester extrahiert. Man wäscht mit Wasser, 30%iger Kochsalzlösung, trocknet über Natriumsulfat, dampft im Vakuum ein und verreibt den Rückstand mit Äther. Man erhält Z-Gly-Nle-Gly-OH, Smp.
1550, [a]20D= -5,60 in Dimethylformamid.
c) Benzyloxycarbonyl-L-seryl-glycyl-L-norleucyl glycin (Z-Ser-Gly-Nle-Gly-OH)
Man löst 89,5 g Z-Gly-Nle-Gly-OH in 900 ml 4n HBrjEisessig, lässt 50 Minuten bei 250 stehen, dampft im Vakuum ein, verreibt mit Äther, filtriert, wäscht gut mit Äther, trocknet im Vakuum, löst in 280 ml Wasser, etwa 650 ml Dimethylformamid, gibt 66,5 ml Triäthylamin zu und versetzt mit der Lösung des Azids, die wie folgt erhalten wird:
:
Man kühlt 940 ml in Salzsäure auf 5, gibt 96 g Z-Ser-NH-NH zu und tropft dann bei -5 360 ml in Natriumnitrit ein, rührt noch 6 Minuten bei-5 , überschichtet mit etwa 600 ml Essigester von 00, stellt unter Zugabe von festem Natriumcarbonat auf pH 8,5, trennt die Essigesterphase ab, extrahiert nochmals, trocknet die Lösung über Natriumsulfat und filtriert.
Die Reaktionslösung dampft man im Vakuum ein, versetzt den Rückstand mit 600 ml Wasser, säuert an, extrahiert mit Athylacetat, wäscht mit Wasser und 30%iger Kochsalzlösung, kühlt auf 00, filtriert Kristalle ab. Man erhält Z-Ser-Gly-Nle-Gly-OH, Smp. 2100 (mit Zers.), [ei D'0 = 80 in Dimethylformamid.
Teilsequenz C
Na,Nimid, -Ditrityl-L-histidyl-L-arginyl
L-phenylalaninhydraszid. HCl (Trt-His (Trt)-Arg-Phe-NH-NH2 - HC1) a) Z-Arg(NO.--Phe-OMe
51,8 g H-Phe-OMe HCl werden in 1 Liter Äther und etwa 50 ml Eiswasser gelöst und unter Rühren und Kühlen genügend Natriumcarbonat zugegeben, bis alles Wasser abgebunden ist. Man filtriert und dampft das Filtrat bis zur Gewichtskonstanz ein, wobei ein farbloses Öl erhalten wird.
67,6 g Z-Arg(NO > ,)-OH werden in 300 ml Acetonitril und 150 ml Dimethylformamid gelöst und mit 41,2 g H-Phe-OMe versetzt. Danach wird auf -200 abgekühlt und eine Lösung von 43,4 g Dicyclohexylcarbodiimid in 100 ml Acetonitril zugegeben. Das Ganze lässt man unter zeitweiligem Umschütteln während 4 Stunden im Eiskasten stehen. Der entstandene Niederschlag wird abfiltriert und das Filtrat eingedampft. Der Eindampfrückstand wird in 1 Liter Essigester gelöst und hierauf in der Kälte mit ln Natronlauge, Wasser, in Schwefelsäure, Wasser und gesättigter Kochsalzlösung gewaschen. Die über Natriumsulfat getrocknete Essigsäureäthylester-Phase wird vollständig eingedampft.
Nach Umkristallisieren aus Essigester/Petroläther erhält man Z-Arg(NO)-Phe-OMe; Smp. 131-1330, [a] 2D -70 in Methanol, -4 in Dimethylformamid.
b) H-Arg(NO2)-Phe-OMe 0,5 H.2O 1,2 HBr
20 g Z-Arg(NO2)-Phe-OMe werden in 50 ml Eisessig gelöst und unter leichtem Kühlen 50 ml 40%ige Bromwasserstoffsäure in Eisessig zugesetzt. Danach lässt man das Ganze unter zeitweiligem Umschütteln während 1 Stunde bei 20 stehen. Nach vollständigem Eindampfen wird der Rückstand in 200 ml Wasser gelöst und zweimal mit Äther gewaschen. Die wässrige Phase wird vollständig eingedampft und der Rückstand aus Methanol/Äther umkristallisiert. Smp. 165-167 mit Zers., [cr] 20D = + 180 in Methanol, + 14 in Dimethylformamid.
c) Z-His(Z)-Arg(NO2)-Phe-OMe
46,1 g H-Arg(NO2)-Phe-OMe 0,5 HnO 1,2 HBr werden in 100 ml Wasser gelöst, hierauf erwärmt und anschliessend abgekühlt. Nach Zugabe von Chloroform und Eis wird mit Ammoniak auf pH 9 gestellt. Die Chloroformphase wird noch einmal mit Wasser gewaschen, anschliessend über Natriumcarbonat getrocknet und filtriert. Dem Filtrat wird eine Lösung von 44,5 g Z-His(Z)-OH, 12,1 g Hydroxysuccinimid in 200 ml Acetonitril und 100 ml Pyridin zugesetzt, danach das Ganze auf -200 abgekühlt und mit einer Lösung von 21,1 g Dicyclohexylcarbodiimid in 70 ml Acetonitril versetzt. Anschliessend wird unter zeitweiligem Rühren 4 Stunden im Eiskasten stehengelassen. Der entstandene Niederschlag wird abfiltriert und das Filtrat eingedampft.
Der Rückstand wird in Essigsäureäthylester aufgenommen und anschliessend folgendermassen gewaschen: 10 Die Kaliumcarbonatlösung (pH zur 10), Wasser, gesättigte Kochsalzlösung, Wasser, gesättigte Kochsalzlösung, Schwefelsäure (pH 3), Wasser, Kochsalzlösung. Die über Natriumsulfat getrocknete Essigsäureäthylester-Phase wird vollständig eingedampft, wobei ein hellbeiger Schaum erhalten wird. Dieser Schaum wird je zweimal in wenig Methanol gelöst und mit Äther gefällt. Die Atherphasen werden abdekantiert und der Niederschlag getrocknet; man erhält Z-His(Z) Arg(NO)-Phe-OMe (amorpher Schaum), [e] 0 = -80 in Methanol, -8 in Dimethylformamid.
d) H-His-Arg-Phe-OMe 4 HC1
25 g Z-His(Z)-Arg(ZO2)-Phe-OMe werden in 800 ml Eisessig gelöst. Danach werden 10 g 10% Palladium auf Aktivkohle in 200 ml in Salzsäure angerührt und in die Lösung gegeben. Das Ganze wird einer 2stündigen Hydrierung unterworfen und anschliessend der Katalysator abfiltriert. Das Filtrat wird erneut mit 5 g 10% Palladium auf Aktivkohle in Wasser versetzt und der Hydrierung unterworfen, die nach 51/2 Stunden beendet ist. Hierbei werden etwa 80 sO der theoretischen Menge Wasserstoff verbraucht. Der I(atalysator wird abfiltriert und das Filtrat vollständig eingedampft, wobei H-His Arg-Phe-OMe .4 4 HCl in Form eines amorphen Schaumes erhalten wird.
e) Trt-His(Trt)-Arg-Phe-OMe. HCl 21,5 g H-His-Arg.-Phe-OMe.4HCl zu 4 HCl werden in 100 ml Pyridin und etwa 100 ml Dimethylformamid gelöst. Bei etwa + 50 wird bis pH 9 Triäthylamin zugegeben und anschliessend eine Lösung von 29 g Tritylchlorid in 300 ml Pyridin während 5 Minuten zugetropft. Nach Beendigung der Zugabe wird von Zeit zu Zeit das pH geprüft und nötigenfalls wieder mit Tri äthylamin auf etwa pH 9 gestellt. Das Ganze wird nach ungefähr 4 Stunden eingedampft, der Rückstand in Chloroform und Wasser aufgenommen und unter Zugabe von wenig In Salzsäure auf pH 4 gestellt. Man trennt die Chloroformphase ab, wäscht sie zweimal mit Wasser, trocknet über Natriumsulfat und dampft vollständig ein.
Der Rückstand wird mit Ather versetzt und vom Äther anschliessend abfiltriert, wobei Trt-His(Trt) Arg-Phe-OMe. HC1 erhalten wird.
f) Trt-His(Trt)-Arg-Phe-NH-NH2.HCl
17 g Trt-His(Trt)-Arg-Phe-OMe. HC1 werden in 200 ml Methanol gelöst und mit 40 ml Hydrazinhydrat versetzt. Danach wird 2 Tage bei Zimmertemperatur stehengelassen. Man dampft ein, löst den Rückstand in Chloroform und wäscht zweimal mit Wasser. Die Chloroform-Phase wird über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Hierauf wird der Rückstand mit Äther gewaschen und abfiltriert; er besteht aus Trt-His(Trt) Arg-Phe-NH-NH2. HCl; Smp. 1580, [l] r) = 9 in Dimethylformamid.
Teilsequenz D
1-(H-Asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl
L-asparaginyl-L-phenylalanin)-2-benzyloxy carbonyl-hydrazid Trifluoracetat (H-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z CF:aCOOH) a) 1-(N-tert-Butyloxycarbonyl-L-phenylalanin)
2-benzyloxycarbonyl-hydrazid (BOC-Phe-NH-NH-Z)
Man löst 72 g BOC-Phe-OH und 28 g N-Methylmorpholin in 500 ml Methylenchlorid auf und tropft bei-5 26 ml Chlorameisensäuremethylester zu. Nach 10 Minuten gibt man noch 44 g Z-NHNH. in 100 ml Methylenchlorid zu und rührt 4 Stunden bei Zimmertemperatur weiter. Nach Auswaschen mit verdünnter Phosphorigersäure wird getrocknet und eingedampft.
Nach Kristallisieren aus Petroläther erhält man BOC Phe-NH-NH-Z vom Smp. 117 , [a]20D = - 5 in Dimethylformamid.
b) 1-(N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-asparaginyl
L-phenylalanin)-2-benzyloxycarbonyl-hydrazid (BOC-Asn-Phe-NH-NH-Z)
Man löst 41 g BOC-Phe-NHNH-Z in 400 ml Trifluoressigsäure und lässt eine Stunde bei 200 stehen.
Beim Verdampfen der Trifluoressigsäure erhält man das H-Phe-NHNH-Z als kristallines Trifluoracetat vom Smp. 1910, [a] b'0 = + 26,4 in Dimethylformamid.
Diese Substanz wird zusammen mit 35 g BOC-Asn ONP und 30 g N-Methylmorpholin in 200 ml Dimethylformamid gelöst. Nach 16 Stunden Stehen bei 200 wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand nacheinander mit Essigester und verdünnter Phos phorigersäure gewaschen. Man erhält BOC-Asn-Phe NH-NH-Z vom Smp. 2100, [a]D = -18 in Dimethylformamid.
c) 1-(N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-asparaginyl
L-asparaginyl-L-phenylalanin)-2-benzyloxy carbonyl-hydrazid (BOC-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z)
Man löst 26 g BOC-Asn-Phe-NH-NH-Z in 200 ml Trifluoressigsäure auf und lässt 1 Stunde bei 200 stehen.
Nach Verdampfen des Lösungsmittels versetzt man in 100 ml Dimethylformamid mit 17 g BOC-Asn-ONP und 15 g N-Methylmorpholin. Nach 16 Stunden bei 200 wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand nacheinander mit Essigester und verdünnter Phosphorigersäure gewaschen. Man erhält BOC-Asn Asn-Phe-NH-NH-Z; Smp. 2400, [a]20D = -280 in Dimethylformamid.
d) 1-(N-tert-Butyloxycarbonyl-L-lencyl-L-asparaginyl
L-asparaginyl-L-phenylalanin) -2-benzyloxy carbonyl-hydrazid (BOC-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z)
Man löst 22 g BOC-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z in 150 ml Trifluoressigsäure und lässt 1 Stunde bei 200 stehen. Nach Verdampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand mit 12 g BOC-Leu-ONP und 10 g N-Methylmorpholin in 100 ml Dimethylformamid versetzt. Nach 16 Stunden Stehenlassen bei 200 wird das Dimethylformamid verdampft und der Rückstand nacheinander mit Essigester und verdünnter Phosphorigersäure gewaschen.
Man erhält BOC-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z vom Smp. 210 , [a]22D= -34 in Dimethylformamid, e) 1-(N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-asparaginyl
L-lencyl-L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-Phenhl alanin)-2-benzyloxycarbonyl-hydrazid (BOC-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z)
Man löst 57 g BOC-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z in 300 ml Trifluoressigsäure und lässt eine Stunde bei 200 stehen. Nach Verdampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand in Ather kristallisiert. Man löst das Tetrapeptid-trifluoracetat in 400 ml Dimethylformamid und versetzt die Lösung mit 27 g BOC-Asn-ONP und 25 N-Methylmorpholin.
Nach 16 Stunden Stehenlassen bei 200 wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand nacheinander mit Essigester und verdünnter Phosphorigersäure gewaschen. - Man erhält BOC-Asn Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z vom Smp. 2500 (Zers.), [a' r, = -340 in Dimethylformamid.
f) 1-(l-Asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl
L-asparaginyl-L-phenylalanin)-2-benzyloxy carbonyl-hydrazid Trifluoracetat (H-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z Trifluor acetat
Man löst 43,5 g BOC-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH- NH-Z in 200 ml Trifluoressigsäure und lässt eine Stunde bei 200 stehen. Nach Eindampfen wird der Rückstand mit Hilfe von Äther kristallisiert. Man erhält H-Asn Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z Trifluoracetat; Smp. 2420, [aj -b0 = -220 in Dimethylformamid.
Telsequenz E tert..-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl
L-tryptophanyl-L-arginin-hydrazid Acetat (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-NHNHe CHsCOOH) a) N-tert-Butyloxycarbonyl-L-tryptophanyl (guanido)N-nitro-L-argininmethylester (BOC-Trp-Arg(NOL)-Ol\4c)
Man löst 35 g H-Arg(NO2)-OMe liCl, 63 g BOC Trp-OCP und 14 g N-Methylmorpholin in 300 ml Dimethylformamid auf und lässt 16 Stunden bei 200 stehen. Nach Verdampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand in Essigester aufgenommen und mit verdünnter Schwefelsäure gewaschen. Man engt etwas ein und fällt mit Äther aus. Dabei kristallisiert BOC-Trp Arg(NO2)-OMe vom Smp. 1300, [alLssO = -220 in Dimethylformamid.
b) N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-tyrosyl-L-tryptophanyl (guanido) N-nitro-arginimmethylester (BOC-Tyr-Trp-Arg(NOo)-OMe)
Man löst 15 g BOC-Trp-Arg(NO2)-OMe in 80 ml 5n methanolischer Salzsäurelösung auf und lässt 1 Stunde bei Zimmertemperatur stehen. Nach Verdampfen des Lösungsmittels und Behandeln mit Äther verbleiben 13 g H-Trp-Arg(NO2)-OMe als Hydrochlorid zurück; Smp. 1200, [a]D = -90 in Dimethylformamid. Dieses Dipeptid wird zusammen mit 14 g BOC-Tyr-OCP und 8g N-Methylmorpholin in 200 ml Dimethylformamid gelöst. Nach 16 Stunden Stehen bei 200 wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand in Essigester aufgenommen.
Nach Waschen mit verdünnter Phosphorigersäure und Einengen des Lösungsmittels kann man mit Hilfe von Äther BOC-Tyr-Trp-Arg(NO2)- OMe isolieren; Smp. 1300, [a] = -110 in Dimethylformamid.
c) tert-Butyloxcarbonyl-L-alanyl-L-tyrosyl
L-tryptophanyl-(guanido)N-nitro-L-arginin methylester (BOC-Ala-Tyr-Trp-Arg(NO )-OMe)
Man löst 13,5 g BOC-Tyr-Trp-Arg(NO2)-OMe in 130 ml 5n methanolischer Salzsäurelösung auf, lässt 1 Stunde bei 250 stehen, dampft zur Trockne ein, wäscht den Rückstand mit Dimethyläther, filtriert ab, löst in 100 ml Dimethylformamid auf und versetzt mit 8,0 g BOC-Ala-OCP und 3,0 ml Triäthylamin. Nach 16 Stunden bei 250 gibt man 500 ml Essigester hinzu, wäscht mit verdünnter Schwefelsäure und Kaliumbicarbonatlösung und dampft zur Trockne ein. Nach Waschen des Rückstandes mit Chloroform erhält man lBOC-Ala-Tyr-Trp-Arg(NO..)-OMe; Smp. 1200 (Zers.), [a] 2E) = 120 in Dimethylformamid.
d) tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl
L-tryptophanyl-(guanido)N-nitro-L-arginin methylester (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg(NO2)-OMo)
Man löst 12,3 g BOC-Ala-Tyr-Trp-Arg(NO-)-OMe in 100 ml 5n methanolischer Salzsäure, lässt 1 Stunde bei 250 stehen, dampft zur Trockene ein, wäscht den Rückstand mit Diäthyläther, löst ihn in 100 ml Dimethylformamid, versetzt mit 14 ml Triäthylamin und 8,5 g BOC-Ser-N3, lässt 16 Stunden bei 0 stehen, gibt 500 ml Essigester zu, wäscht nacheinander mit verdünnter Schwefelsäure und Ammoniumhydroxid, trocknet über Natriumsulfat und dampft das Lösungsmittel ab.
Nach Waschen des Rückstandes mit Chloroform löst man ihn in Essigester und fällt durch Zugabe von Di äthyläther. Man erhält 13,5 g BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp Arg(NO2)-OMe; Smp. 135 (Zers.), [a]20D = - 15 in Dimethylformamid.
c) tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl
L-tryptophanyl-L-arginin-hydrazid Acetat (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-NIINIH2 CH3COOH)
Man löst 13.2 g von dem oben erhaltenen Pentapeptidester in 300 ml Essigsäure, gibt 60 ml Wasser und 13,2 g Palladiam-Kohle (10 Eig) zu und hydriert bis zum Ende der Wasscrstoffaufnahme. Man filtriert, dampft ab, löst den Rückstand in Dimethylformamid auf, dampft wiederum ab, um die Spuren von Essigsäure zu beseitigen. Anschliessend löst man den Rückstand in 260 ml Methanol, versetzt mit 26 ml Hydrazinhydrat und lässt 16 Stunden bei 40j stehen. Nach Zugabe von 260 ml Diäthvläther filtriert man die ausgeschiedene kristalline Masse ab, wäscht mit Diäthyl äther und trocknet im Hochvakuum über Schwefelsäure.
Man erhält BOC-S-zr-Ala-Tyr-Trp-Arg-NHNH- CH3COOH; Smp. l82C, [a]D20 = -8 < in Dimethylformamid.
Teilsequenz Fl
L-Threonyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-valyl-L-leucin (H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OH) a) H-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe. HBr
Man löst 21,0 g Z-Cys(Bzl)-OCP und 12,3 g H-Val Leu-OMe HCl in 120 ml Dimethylformamid. Danach gibt man 5,9 ml Triäthylamin hinzu, lässt 16 Stunden bei 250 stehen, fügt Essigester hinzu, wäscht mit ver dünnter Salzsäure, trocknet über Natriumsulfat, dampft zur Trockne ab und kristallisiert den Rückstand aus Essigsäureäthylester/Diäthyläther. Man erhält Z-Cys (Bzl)-Val-Leu-OMe, Smp. 1o0, [C] 2E) = -28 in Di methylformamid, das man in 210 ml einer 40%igen Lösung von Bromwasserstoff in Eisessig löst. Man lässt
1 Stunde bei 250 stehen, dampft zur Trockne ein und kristallisiert den Rückstand aus Isopropanol/Diäthyl äther um.
Man erhält H-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe HBr, Smp. 1680, [a] .-D0= + 14 in Dimethylformamid.
b) H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe .1,3 HBr
Man löst 20 g Z-Thr-NHNH2 in 350 ml Dimethyl formamid, kühlt auf -20 , gibt 100 ml einer Lösung von 2n Salzsäure in Dioxan und anschliessend noch
10 ml tert.-Butylnitrit zu. Nach 10 Minuten bei 200 werden 45 ml Triäthylamin und 25,5 g H-Cys(Bzl)-Val
Leu-OMe HBr hinzugefügt und das erhaltene Gemisch während 16 Stunden bei 0 geschüttelt. Man dampft zur Trockne ein, löst den Rückstand in einem Gemisch von Essigsäureäthylester/Wasser, wäscht die organische
Phase mit verdünnter Salzsäure, trocknet über Natrium sulfat, dampft ein und kristallisiert den Rückstand aus
Essigester um. Man erhält Z-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu
OMe; Smp. 2080, [a]20D = -27 in Dimethylformamid.
Man löst 20 g von dem oben erhaltenen Tetrapeptid in 200 ml eines Gemisches von Trifluoressigsäure/Essig ester (1:1) auf, leitet während 1 Stunde bei 0 einen
Strom gasförmigen Bromwasserstoffs ein, dampft an schliessend ein und kristallisiert den Rückstand aus Methanol/Diäthyläther um. Man erhält H-Thr-Cys(Bzl) Val-Leu-OMe .1,3 HBr; Smp. 2020, [f] 20D = -100 in
Dimethylformamid.
c) H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OH
Man löst 372 g H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe
1,3 HBr in 1800 ml Methanol, fügt 900 ml 2n Natron lauge hinzu, lässt 1 Stunde bei 250 slehen, gibt 240 ml
Eisessig zu und lässt 2 Stunden bei 0 stehen. Man filtriert die ausgeschiedene kristalline Masse ab, wäscht zuerst mit la Essigsäure und anschliessend mit Wasser und trocknet bei 500 im Hochvakuum. Man erhält das H-Tbr-Cys-(Bzl)-Val-Leu-OH, Smp 219 , [a]20D - -53 in In Ammoniak.
Teilsequenz F2 tert-Butyloxycarbenyl-S-benzyl-L-cysteinyl
L-seryl-L-asparaginyl-L-leucyl-L-serin-hydrazid (BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu-ser-NH-NH2) a) H-Asn-Len-Ser-OMe. HCl
Man löst 43 g H-Leu-Ser-OMe HCl und 53 g BOC-Asn-ONP in 400 ml Dimethylformamid auf, gibt 22 ml Triäthylamin zu, lässt 16 Stunden bei 255 stehen, dampft zur Trockne ein und kristallisiert den Rückstand aus Methanol um. Man erhält 51,6 g BOC-Asn-Leu Ser-OMe, Smp 190 , [a]20D- -24 in Dimcthylformamid, das man in 500 ml einer 4n-Lösung von Salzsäure in Methanol löst. Man lässt 1 Stunde bei 250 stehen, dampft zur Trockne ein, löst den Rückstand in Methanol und fällt mit Diäthyläther. Man erhält H-Asn-Leu-Ser-OMe.HCl; Smp. 180 , [a]20D= -23 in Dimethylformamid.
b) H-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe.HCl
Man löst 39,5 g BOC-Ser-NHNHo in 500 ml Dimethylformamid, kühlt auf -200. gibt 200 ml einer 2n-Lösung von Salzsäure in Dioxan und anschliessend 20 ml tert.-Butylnitrit zu. Nach 10 Minuten bei-20 werden 40 ml Triäthylamin und 38,0 g H-Asn-Leu Ser-OMe-HCl hinzugefügt, danach 16 Stunden bei 0 gerührt, zur Trockne eingedampft und der Rückstand aus Chloroform/Diäthyläther umkristallisiert. Man erhält BOC-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe, Smp. 135 , [a]20D = -22 in Dimethylformamid das man in 420 ml einer 4n Salzsäurelösung in Methanol löst. Man lässt 1 Stunde bei 250 stehen, dampft zur Trockne ein und kristallisiert aus Methanol/Essigsäureäthylester um.
Man erhält H-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe. HCI, Smp. 1550 (Zers.), [all D0 = -15 in Dimethylformamid.
c) BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Len-Sen-NHNH2
Man löst 18,5 g H-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe HCl und
18,0 g BOC-Cys(Bzl)-ONP in 100 ml Dimethylformamid auf, gibt 10 ml Wasser, 3,5 ml Essigsäure und
5,6 ml Triäthylamin zu, lässt 16 Stunden bei 250 stehen, dampft zur Trockne ein und kristallisiert aus Methanol um. Man erhält 25,1 g BOC-Cys(Bzl)-Ser
Asn-Leu-Ser-OMe, Smp. 1820, [a]20D = -17 in Di methylformamid, das man unter leichtem Erwärmen in
200 ml Dimethylformamid löst. Man gibt 200 ml
Methanol und 20 ml Hydrazinhydrat zu, lässt 16 Stun den bei 300 stehen, fällt mit Diäthyläther, wäscht den Niederschlag mit Diäthyläther/Methanol (1:1) und trocknet das so erhaltene BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu Ser-NHNH.2, Smp. 2240, [ei = -13 in Dimethylformamid.
Teilsequenz F
Pivaloyl-L-hemicystinyl-L-seryl-L-asparaginyl
L-leucyl-L-seryl-L-threonyl-L-hemicystinyl
L-valyl-L-leucin
EMI6.1
<tb> (piv-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Len-OH)
<tb>
Man löst 18,4 g BOC-Cvs(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser- NHNH2 (Teilsequenz F2) in 150 ml Dimethylformamid, kühlt auf -200, gibt 40 ml einer 2n-Lösung von Salzsäure in Dioxan und 15 ml tert.-Butylnitrit zu. Nach 10 Minuten bei -20 gibt man noch 28 ml Triäthylamin und 16,2 g H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-Oh (Teilsequenz F1) zu und rührt 16 Stunden bei 250. Danach wird filtriert' die Lösung eingedampft und der Rückstand mit in Essigsäure durchgewaschen. Man erhält
BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Seu-Thr-Cys(Bzl)
Val-Leu-OH, Smp. 2170, [a]20D = -27 in Dimethylformamid.
Man löst das erhaltene Produkt in 5000 ml getrocknetem Ammoniak, gibt unter Rühren und Sieden des Ammoniaks Natriummetall bis zur tiefblauen Färbung zu. Zwecks Entfärbung wird Ammoniumchlorid hinzugefügt. Man dampft zur Trockne ein und wäscht den Rückstand mit ln Essigsäure und Aceton durch.
Nach dem Trocknen erhält man BOC-Cys-Ser-Asn-Leu Ser-Thr-Cys-Val-Leu-OH, Smp. 2480 (Zers.), [a]20D - -41 in Dimethylformamid/Wasser (3 :1).
Man löst das so erhaltene Nonapeptid in 5000 ml 0,01n Ammoniak auf, gibt unter Rühren in Wasser stoffperoxyd bis zur negativen Nitroprussiatreaktion zu, dann noch 200 ml Eisessig, filtriert und lyophilisiert.
EMI7.1
<tb>
Man <SEP> erhält <SEP> BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr <SEP> Ser-Thr-Cys-Val Leu-OH, Smp. 2380 (Zers.), [a]20D = -180 in Dimethylformamid/Wasser (7: 3), das man in 300 ml Trifluoressigsäure löst, lässt 30 Minuten bei 250 stehen, dampft ab, wäscht den Rückstand mit Essigester und löst ihn in 300 ml Dimethylformamid auf. Zu dieser Lösung gibt man 30 g Pivalinsäure-p-nitrophenylester - der wie nachstehend beschrieben hergestellt ist - sowie 14 ml Triäthylamin, lässt 16 Stunden bei 250 stehen, dampft ab und wäscht den Rückstand mit Chloroform. Man löst in 300 ml Dimethylformamid, gibt 50 ml Wasser und 50 g DOWEX-50 hinzu, riihrt 15 Minuten, abfiltriert, wäscht das Harz mit Dimethylformamid und dampft das Filtrat zur Trockne ein.
Man wäscht den Rückstand zuerst mit Chloroform, anschliessend mit Essigester und trocknet. Man erhält das
EMI7.2
<tb> Piv-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-OH,
<tb> Smp. 243 ,[a]20D= -17 in Dimethylformamid/Wasse (3:1),
Pivalins äure-p-nitrophenylester
Man löst 95 g Pivalinsäure und 131 g p-Nitro phenyl in 1000 ml Essigester, gibt 197 g Dicyclohexyl carbodiimid zu, rührt 2 Stunden bei 250, filtriert, dampf das Filtrat ein und kristallisiert den Rückstand auq einem Gemisch von Essigester-Petroläther um. Mar erhält Pivalinsäure-p-nitrophenylester, Smp. 1040.
Teilsequenz ABC N'm-Trityl-L-histidyI-l-arginyl-Gphenyl alanyl-
L-seryl-glycyl-L-norleucyl-glycyl-L-phenylalanyl glycyl-L-prolyl-L-glutamyl-L-threonyl
L-prolinamid Triacetat (H-His(Trt)-Arg-Phe-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly Pro-Glu-Thr-Pro-NH2- 3 CHsC02H) a) L-Seryl-glycyl-L-norleucyl-glycyl-L-phenylalanyl glycyl-L-proly-L-glutamyl-L-threonyl-L-prolin amid Tetrahydrochlorid (H-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr
Pro-NH2.4 HCl)
Man löst 6,7 g Z-Ser-Gly-Nle-Gly-OH (Teilsequenz B), 12 g H-Phe-Gly-Pro-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2 (Teilsequenz A) und 2,1 g Hydroxysuccinimid in 50 ml Di methylformamid und 20 ml Acetonitril auf, kühlt auf 0 gibt 4,0 g Dicyclohexylcarbodiimid hinzu und läss 16 Stunden bei 0 stehen. Man dampft das Lösung.
mittel ab, wäscht den Rückstand mit Wasser, Diäthyl äther und Essigester und kristallisiert aus Chloroform um. Man erhält Z-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu- (OTB)-Thr-Pro-NH.-., Smp. 125-138 (Zers.), [ul 20D -44 in Dimethylformamid, das man in 250 ml einer Lösung von 8n Chlorwasserstoff in Dioxan löst und bei Normaldruck in Gegenwart von Palladium-Katalysator bis zum Ende der Wasserstoffaufnahme hydriert. Man filtriert, dampft zur Trockene ein und verarbeitet den Rückstand in Diäthyläther. Man erhält H-Ser-Gly-Nle- Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NHa 4 HC1, Smp. 1300 (Zers.), [aj D0 --- -52 in Dimethylformamid.
b) Nim-Trityl-L-histidyl-L-arginyl-L-phenylalanyl
L-seryl-glycyl-L-norleucyl-glycyl-L-phenylalanyl glycyl-L-prolyl-L-glutamyl-L-threonyl-
L-prolinamid Triacetat (H-His(Trt)-Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly
Pro-Glu-Thr-Pro-NH2.3CH3CO2H)
Man löst 9,9 g Trt-His(Trt)-Arg-Phe-NHNH2. HCl (Teilsequenz C) in 100 ml Dimethylformamid, kühlt auf -200, gibt 15 ml Dioxan/HCl 2n und anschliessend 1,16 ml tert.-Butylnitrit zu, rührt 10 Minuten bei -200, gibt 28 ml Triäthylamin und 10,0 g H-Ser-Gly-Nle-Gly Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2.HCl zu, riührt 4 Stunden bei 00, filtriert und dampft zur Trockne ein.
Man löst den Rückstand in einem Gemisch von Essigester/ Methanol (8 : 2) auf, wäscht mit verdünntem Ammoniak und anschliessend mit Wasser bis zur Neutralität, trocknet über Natriumsulfat, konzentriert auf 100 ml und fällt durch Zugabe von Diäthyläther. Man löst den Niederschlag wiederum in Dimethylformamid auf und fällt durch Zugabe von Diäthyläther. Man erhält
Trt-HIs(Trt)Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly Pro-Glu-Thr-Pro-NHg [Smp. 168 (Zers.),[a]20D= -43 in Dimethylformamid], das man in 500 ml essigsäure/Wasser (8:2) löst Man lässt 3 Stunden bei 400 stehen, dampft ein, wäscht den Rückstand in Diäthyläther und trocknet im Hochvakuum über KOH-Spänen. Man erhält
H-His(Trt)-Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly
Pro-Glu-Thr-Pro-NH2.3CH3COOH, Smp. 1800 (Zers., [all D0 = 610 in Essigsäure.
Teilsequenz DE
N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl
L-tyrosyl-L-tryptophanyl-L-arginyl-L-asparaginyl
L-leucyl-L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenyl alanin. hydrazid. diacetat (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn
Phe-NHNH2.2 CH3COOH) a) l-(N-tert. -Butyloxycarbonyl-L-seryl-Lalanyl-
L-tyrosyl-L-tryptophanyl-L-arginyl-L-asparaginyl L-leucyl-L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenyl- alanin)-2-benzyloxycarbonyl-hydrazid diacetat (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn
Phe-NH-NH-Z 2 CH3COOH)
Man kühlt 320 ml Dimethylformamid auf 200 C, gibt 100 ml 2n Chlorwasserstoff in Dioxan zu und löst darin 68 g BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-NHNH2-Acetat (Teilsequenz E).
Anschliessend versetzt man mit 12 ml tert.-Butylnitrit, lässt 10 Minuten bei 200 rühren und tropft 35 ml Triäthylamin zu. Das so erhaltene Gemisch wird mit einer Lösung, entstanden aus 8,8 g H-Asn Leu-Asn-Asn-Phe-NHNH-Z Trifluoracetat (Teilsequenz D) und 17 ml Triäthylamin in 150 ml Dimethylformamid vereinigt. Nach 16 Stunden Stehenlassen bei 0 wird eingedampft. Man löst den Rückstand in Essig ester/Butanol und wäscht mit verdünnter Essigsäure und Ammoniaklösung. Nach Eindampfen des Lösungsmittels verbleibt das
BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Ain-Leu-Asn-Asn Phe-NHNH-Z .2 2 CH:,COOH vom Smp. 175, [a] 20D = -19,50 in Dimethylformamid.
b) tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L alanyl-L-tyrosyl
L-tryptophanyl-L-arginyl-L-asparaginyl-L-lcucyl
L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenylalanin.
Hydrazid Diacetat (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-asn Phe-NHNHa 2 CHlCOOH)
Man löst 90 g BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu Asn-Asn-Phe-NHNH-Z.2CH3COOH in 500 ml Dimethylformamid und hydriert mit 10 g Pd/C (10%ig) bis zum Ende der Wasserstoffaufnahme. Nach Abfiltrieren des Katalysators wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand aus einem Gemisch von Ather und Äthanol kristallisiert. Man erhält
BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Leu-Asn-Asn Phe-NHNHa 2 CHsCOOH vom Smp. 2650, [a]2rB0 = -57 in Dimethylformamid.
Teilsequenz ABCDE L-Seryl-L-alanyl-L-tyrosyl-L-tryptoph anyl-
L-arginyl-L-asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl
L-asp[araginyl-L-phenylalanyl-L-histidyl
L-arginyl-L-phenylalanyl-L-seryl-glycyl
L-norleucyl-glycyl-L-phenylalanyl-glycyl
L-prolyl-L-glutamyl-L-threonyl-L-prolinamid,
Hexa-trifluoracetat (H-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn
Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly
Pro-Glu-Thr-Pro-NH5 6 CFsCOoH)
Man löst 15,2 g
BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Len-Asn-Asn
Phe-NHNH2.Diactat (Teilsequenzen D, E) in 200 ml Dimethylformamid, kühlt auf -200, gibt 15 ml Dioxan/HCl 2n und anschliessend 1,16 ml tert.-Butylnitrit zu und rührt 10 Minuten bei -200. Man gibt 14 ml Triäthylamin und eine Lösung von 18,6 g des in Teilsequenz A, B, C erhaltenen Tridecapeptidacetats zu,
rührt das erhaltene Gemisch 16 Stunden bei 00, filtriert und dampft zur Trockne ein. Man wäscht den Rückstand mit Diäthyl äther und mit Chloroform, löst in Dioxan/Wasser (8 : 2), behandelt die erhaltene Lösung mit 100 ml Amberlit IRA-410 (Acetat-Form), dampft ein und kristallisiert den Rückstand aus Isopropanol/Wasser um. Man erhält das
BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Ser-Asn-Asn Phe-His (Trt) -Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-
Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH acetat, Smp. 1450 (Zers.), [a} 0 = -670 in Essigsäure, das man unter Stickstoffatmosphäre in 500 ml Trifluoressigsäure löst. Man lässt 1 Stunde bei 250 stehen, konzentriert auf 100 ml und fällt durch Zugabe von 1000 ml Di äthyläther. Man filtriert, löst den Rückstand in Dimethylformamid und fällt mit Diäthyläther.
Nach Trocknen über KOH-Spänen erhält man das H-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-
Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-gly-Phe-Gly Pro-Glu-Thr-Pro-NH2.6CF3CO@H, Smp. 1300 (Zers.), [a] r) = -450 in Essigsäure.
Beispiet Pivaloyl-L-Hemicystinyl-L-seryl-L-asparaginyl L-leucyl-L-seryl-L-threonyl-L-hemicystinyl L-valyl-L-leucyl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl L-tryptophanyl-L-arginyl-L-asparaginyl-L-leucyl L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenyulalanyl L-histidyl-L-arginyl-L-phenylalanyl-Lserylglycyl-L-norleucyl-glycyl-L-phenylalanylglycyl-L-prolyl-L-glutamyl-L-threonyl L-prolinamid Hexaacetat.Octahydrat
EMI8.1
<tb> (Piv-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu
Ser-Ala-Tyr-Trp-Arp-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe
His-Arg-Phc-Ser-Gly-Nle-gly-Phe-Gly-Pro-Glu
Thr-Pro-NH3.Hcxaacctat. Octahydral)
Man löst 1,0 g Nonapeptid (Teilsequenz F) in 10 ml Dimethylformamid, gibt 1,5 g N-Hydroxysuccinimid und 0,52 g Dicyclohexylcarbodiimid zu, rührt 6 Stunden bei 255, filtriert und dampft das Filtrat zur Trockne ein.
Man wäscht den Rückstand mit Essigester und Diäthyl äther und trocknet. Man erhält
EMI8.2
<tb> Piv-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val.-Leu-OSu, <SEP>
<tb> Smp. 2420, das man in 10 ml Dimethylformamid löst.
Zu dieser Lösung gibt man 3,1 g Tricosapeptid-Hexa Trifluoracetat (Teilsequenz A, B, C, D, E), 0,4 ml Tri äthylamin sowie 1,2 g N-Hydroxysuccinimid und rührt 16 Stunden bei 250. Man dampft zur Trockne ein, wäscht den Rückstand mit Diäthyläther, Chloroform und Aceton. So erhält man das rohe, geschützte Dotria contapeptid, das man in 100 ml 0,3n Essigsäure löst, mit 20 ml Amberlit-IRA-410 (Acetat) behandelt und gibt 50 ml 0,6n Ammoniumhydroxid hinzu. Man stellt das pH auf 6,5 ein und schichtet die erhaltene Lösung auf eine Carboxymethylcellulosesäule (10 X 100 cm), die mit einer 0,15n-Ammoniumacetatpufferlösung equilibriert wurde. Die Elution wird mit einem steigenden Konzentrations- und pH-Gradient (0,1 5n auf 0,4n; pH 6,5 auf pH 7,0) eines Ammoniumacetatpuffers durchgeführt.
Die vereinigten Fraktionen die das reine Peptid erhalten, werden dreimal gefriergetrocknet, der Rückstand wird mit Äthanol und anschliessend mit Di äthyläther gewaschen und über Kaliumhydroxid im Hochvakuum getrocknet. Man erhält
EMI8.3
<tb> Piv-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Ser Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-
His-Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro
Glu-Thr-Pro-NII2.6 CH3CO2H.8 H2O.
Smp. 2160 (Zers.), [a]20D = -560 in Essigsäure in.
Aminosäurezusammensetzung nach Säurehydrolyse (6n, 16 Std.) : Ala1,1, Arg2,0, Asn3,9, Cys/21,6, Glu1,2, Gly3,0, His1,1, Leu2,9, Nle1,0, Phe3,0, Pro2,1, Serd,8, Thr1,9, Tyr1,0, Val0,, (Trp 1,0 durch Spektrophotometrie).
Process for the production of previously unknown polypeptide derivatives
The present invention relates to a process for the preparation of previously unknown polypeptide derivatives of the formula
EMI1.1
wherein R stands for an alkyl, an optionally substituted aralkyl or an optionally substituted aryl group, its therapeutically effective acid addition salts and heavy metal complexes. For example, R can represent the methyl, ethyl, propyl, tert-butyl group or a phenyl or benzyl radical which is optionally substituted by a halogen atom, a lower alkoxy or nitro group. The new polypeptide derivatives are characterized by their resistance to the degrading action of aniinopepti.- demen.
Another advantage is the well-known oxidation-resistant norleucine residue in position 25.
The previously unknown polypeptide derivatives can be prepared by condensing the compounds necessary for their construction to form CONH bonds with one another in any chronological order, with free functional groups not participating in the reaction being protected by suitable protective groups at any point in the synthesis Splitting off protective groups, oxidizing the mercapto groups after formation of the sequence 1 to 7 to the disulfide and converting the carboxyl group of the prolyl radical into the amide group. In the last stage, however, methods are to be used in which racemization does not occur or can be kept low, preferably the azide or the activated ester method, with N-hydroxysuccinimide preferably being used for activation.
The benzyl radicals used to protect the SH groups in cysteine-containing peptides are usually split off at the end of the synthesis by treatment with sodium in liquid ammonia. It has now been found that the splitting off of the benzyl protective groups and the production of the (Cys) S-S (Cys) bond before the last stage lead to particularly good yields of the end product.
When building the new polypeptides, the blocking of the y-carboxyl group, for example in the partial sequence A described below, the tert. Butyloxy group proven, but other protective groups, such as the methoxy *, the ethoxy, the tert-amyloxy, the amide or the benzyloxy group can also be used.
The triphenylmethyl group has proven useful for blocking the imidazole group of the histidine residue in the partial sequence C described below, but other suitable protective groups, such as the carbo-tert-butoxy, the carbo-tert-amyloxy, the carbobenzoxy or the Benzyl group can be used.
The nitro group was used to block the guanido group of the arginine residue in the partial sequence E described below, but other suitable protective groups, such as the tosyl group, the p-nitrobenzoxycarbonyl group or the 2- (isopropyloxycarbonyl) -3 -3,4,5, 6- tetrachlorobenzoy1- group can be used. The protective effect of protonation of the guanido group can also be used in the synthesis.
The new polypeptide derivatives can also be obtained or used in the form of their salts. Salts include those with organic acids such as acetic acid, propionic acid, glycolic acid, lactic acid, pyruvic acid, malonic acid, succinic acid, maleic acid, fumaric acid, tartaric acid, citric acid, benzoic acid, cinnamic acid, salicylic acid, 2-phenoxy- or 2-acetoxy-benzoin acid, mandelic acid, methanesulphonic acid, ethanesulphonic acid, hydroxyethanesulphonic acid, eenzene or toluenesulphonic acid, naphthalenesulphonic acid, sulphanilic acid and polymeric acids such as tannic acid, alginic acid, polygalacturonic acid, polyphloretin phosphate or carboxymethyl cellulose acid and salts with inorganic acids, e.g. B. hydrochloric acid or hydrobromic acid, nitric acid, thiocyanic acid, sulfuric acid and phosphoric acid in question. As a heavy metal complex z.
B. that of zinc * - in question.
The starting products for the production of the new polypeptide derivatives can, if they were not previously known, be obtained by the methods known for peptide chemistry, the amino acids being linked to one another individually or after prior formation of smaller peptide units.
The new compounds represent an important therapeutic principle that lowers the calcium plasma level, in particular the increased calcium plasma level, and, as an antagonist of the parathyroid hormone, brings about a positive calcium balance in the bones.
It is therefore indicated in all conditions in which a lowering of the plasma calcium level is desired, e.g. B. Hypercalcemias of various origins, deficiency of endogenous thyrocalcitonin due to the failure of thyroid tissues, hyperfunction of the parathyroid glands.
The new compounds are indicated for all bone affections that are based on increased degradation or in which increased calcium fixation in the bone is desired, e.g. B. osteoporosis of various origins (e.g. post-climacteric, post-traumatic, caused by corticosteroid therapy or inactivity, etc.), fractures, osteomalacia, rickets and especially for combination therapy with calcium or phosphate. Biological testing of the new compounds showed an efficacy of about 100 to 450 MRC units / mg peptide. The required daily dose (administered in the same way) in MRC units is 20 mU to 10 U, preferably 100 mElkg animal weight.
In humans, the daily dose (i.m.
administered) in MRC units 1 to 500 U. Preferably, a daily dose of 5 U. i. m. administered.
The new compounds can be used as remedies, e.g. B.
in the form of pharmaceutical preparations, use. These contain the compounds mentioned in a mixture with an organic or inorganic carrier material suitable for parenteral administration. For the same, substances come into question that do not react with the new compounds, such as. B.
Gelatin, lactose, starch, magnesium stearate, talc, vegetable oils, benzyl alcohol, gum arabic, polyalkylene glycols, petrolatum, cholesterol or other known excipients.
The pharmaceutical preparations can e.g. B. in liquid form as solutions, suspensions or emulsions. If necessary, they are sterilized and / or contain auxiliaries such as preservatives, stabilizers, wetting agents or emulsifiers. They can also contain other therapeutically valuable substances. The new compounds can also be administered in the form of a depot preparation.
The new compounds and their salts can also be used as intermediates for the production of pharmaceutical preparations.
The following abbreviations are used:
Z = benzyloxycarbonyl
Bzl = benzyl
BOC = tert-butyloxycarbonyl
Piv = pivaloyl
Trt = trityl = triphenylmethyl
OTB = tert-butyloxy
ONP = p-nitrophenyl ester
OCP = 2,4,5-trichlorophenoxy
OSu = oxysuccinimide
OMe = methoxy
OEt = ethoxy = = nitro
Ser = L-seryl
Asn = L-asparaginyl
Leu = L-leucyl
Thr = L-threonyl
Val = L-valyl Ala = L-alanyl
Tyr = L-tyrosyl
Trp = L-tryptophanyl
Arg = L-arginyl
Phe - L-phenylalanyl
Glu = L-glutamyl
His = L-histidyl
Pro = L-prolyl
Gly = glycyl
Nle = L-norleucyl
Cys = L-cysteinyl
In the following examples,
which explain the implementation of the method, but are not intended to limit the scope of the invention in any way, all temperatures are given in degrees Celsius.
Partial sequence A L-phenylalanyl-glycyl-L-prolyl- γ-tert-butyloxy-
L-glutamyl-L-threonyl-L-prolinamide (H-Phc-Gly-Pro-Glu (OTB) ¯Thr-Pro-NH2)
Dissolve at -5 134 g of Z-Thr-NH-NHS in 2 liters in hydrochloric acid, and add 0.55 liters in sodium nitrite. After 5 minutes, potassium carbonate is added to pH 9, the azide formed is extracted with ethyl acetate and a solution of 80 g of H-Pro-NH hydrochloride in 100 ml of water, 500 ml of dimethylformamide and 77 ml of triethylamine is added. The ethyl acetate is evaporated off at 200 in vacuo and left to stand at 250 overnight.
The remaining solution is evaporated in vacuo, the residue is dissolved in ethyl acetate, the solution is washed with water, dilute hydrochloric acid and an aqueous potassium carbonate solution and dried over sodium sulfate. It is evaporated in vacuo, dissolved in warm ethyl acetate and cooled.
Z-Thr-Pro-NH is obtained; M.p. 1480, [a] 20D = 720 in 95% acetic acid. 90 g of Z-Thr-Pro NH.2 are then dissolved in 2 liters of dioxane and 260 ml in hydrochloric acid and hydrogenated at 200 and normal pressure in the presence of a palladium catalyst. It is filtered, the solution is evaporated in vacuo, the residue is washed with ethyl acetate and H-Thr-Pro-NH HCl is obtained; M.p. 2160, [a] 0 = -64 in 95% acetic acid. This is dissolved in 500 ml of dimethylformamide, 50 ml of water and 32 ml of triethyl amine and 118 g of Z-Glu (OTB) -OCP and 800 ml of tetrahydrofuran are added.
You leave it overnight
200 stand, evaporated in vacuo and the residue crystallized with ethyl ether. Z-Glu (OTB) Thr-Pro-NH2, mp. 650 (decomp.), [A] 0- = -18 in dimethylformamide is obtained.
80 g of Z-Glu (OTB) -Thr-Pro-NW are dissolved in 1.5 liters of dioxane and 200 ml of water and hydrogenated at 200 and normal pressure in the presence of a palladium catalyst.
The solution is filtered and evaporated in vacuo, and diethyl ether is added to the residue, H-Glu (OTB) -Thr-Pro-NH2 being obtained; M.p. 650 (decomp.), [A] 20D - -28 in dimethylformamide,
This is dissolved in 700 ml of dimethylformamide at 0, 200 ml of acetonitrile, 68 g of ZPhe-Gly-Pro-OH and 32 g of dicyclohexylcarbodiimide are added over
Left to stand overnight at 200, filtered, evaporated in vacuo and mixed with ethyl acetate. The solution is then washed with water, dilute hydrochloric acid and aqueous potassium carbonate solution, dried over sodium sulfate, evaporated in vacuo and the residue is crystallized from ethyl acetate / ethyl ether. Z - Phe - Gly - Pro - Glu (OTB) - thr-Pro-NH2, m.p. 1200 (decomp.), [A] 20d = -66 in dimethylformamide, which is dissolved in 1500 ml of dioxane and 300 ml of water, is obtained .
One gives
30 g of palladium carbon (10%) and hydrogenated until
End of hydrogen uptake. It is filtered, the filtrate is evaporated and the residue is crystallized from dioxane. The H-Phe-Gly-Pro-Glu (OTB) -Thr Pro-NH2 is obtained; M.p. 153, [a] 20D = -79 in dimethyl form amide.
Partial sequence B
Benzyloxycarbony1-L-seryl-glycyl-L-norleucyl glycine (Z-Ser-Gly-Nle-Gly-OH) a) Benzyloxycarbonyl-L-norleucyl-glycine (Z-Nle-Gly-OH)
31.6 g of H-Gly-OH are dissolved in 420 ml of NaOH, 840 ml of tetrahydrofuran are added, 130 g of Z-Nle-ONP are then added, and the mixture is shaken until the solution becomes clear, and left to stand at 250 for one night. It is then concentrated to 500 ml in vacuo and the aqueous solution obtained is adjusted to pH 9 with NaOH, extracted twice with ether, then acidified with 4N hydrochloric acid and extracted with ethyl acetate. The ethyl acetate solution is washed with water and 30% strength sodium chloride solution, dried over sodium sulfate and evaporated in vacuo.
The residue is triturated with ether and left to crystallize for 2 hours at -20. Z-Nle-Gly-OH, m.p. 138, [a] 20D = -4 is obtained in dimethylformamide.
b) Benzyloxycarbonyl-glycyl-L-norleucyl-glycine (Z-Gly-Nle-Gly-OH)
100 g of Z-Nle-Gly-OH are dissolved in 1000 ml of 4N HBr / glacial vinegar, left at 250 for 50 minutes, rubbed with ether, crystals are filtered off and washed well with ether. HBr H-Nle-Gly-OH, [a] 20D = + 24.70 in acetic acid (95%) is obtained. 84 g of HBr H-Nle-Gly-OH are dissolved in 240 ml of water, and 152 ml of 4N NaOH, 800 ml of tetrahydrofuran and 91 g of ZGly-ONP are added. Shake at 250 for 1 hour and then let stand at 250 for 2 days.
It is concentrated in vacuo to 500 ml, adjusted to pH 9 with NaOH and extracted with ether. The aqueous phase is acidified with hydrochloric acid, then extracted twice with ethyl acetate. It is washed with water, 30% sodium chloride solution, dried over sodium sulfate, evaporated in vacuo and the residue is triturated with ether. Z-Gly-Nle-Gly-OH, m.p.
1550, [a] 20D = -5.60 in dimethylformamide.
c) Benzyloxycarbonyl-L-seryl-glycyl-L-norleucyl glycine (Z-Ser-Gly-Nle-Gly-OH)
89.5 g of Z-Gly-Nle-Gly-OH are dissolved in 900 ml of 4N HBrjEisessig, left to stand for 50 minutes at 250, evaporated in vacuo, triturated with ether, filtered, washed well with ether, dried in vacuo, dissolved in 280 ml of water, about 650 ml of dimethylformamide, are 66.5 ml of triethylamine and mixed with the solution of the azide, which is obtained as follows:
:
940 ml are cooled to 5 in hydrochloric acid, 96 g of Z-Ser-NH-NH are added and then at -5 360 ml in sodium nitrite, stirred for a further 6 minutes at -5, covered with about 600 ml of 00 ethyl acetate with the addition of solid sodium carbonate to pH 8.5, the ethyl acetate phase is separated off, extracted again, the solution is dried over sodium sulfate and filtered.
The reaction solution is evaporated in vacuo, the residue is treated with 600 ml of water, acidified, extracted with ethyl acetate, washed with water and 30% sodium chloride solution, cooled to 00, and crystals are filtered off. Z-Ser-Gly-Nle-Gly-OH, m.p. 2100 (with decomposition), [ei D'0 = 80 in dimethylformamide is obtained.
Partial sequence C
Na, nimide, -ditrityl-L-histidyl-L-arginyl
L-phenylalanine hydrazide. HCl (Trt-His (Trt) -Arg-Phe-NH-NH2-HC1) a) Z-Arg (NO .-- Phe-OMe
51.8 g of H-Phe-OMe HCl are dissolved in 1 liter of ether and about 50 ml of ice water and enough sodium carbonate is added with stirring and cooling until all of the water has set. It is filtered and the filtrate is evaporated to constant weight, a colorless oil being obtained.
67.6 g of Z-Arg (NO>,) - OH are dissolved in 300 ml of acetonitrile and 150 ml of dimethylformamide, and 41.2 g of H-Phe-OMe are added. It is then cooled to -200 and a solution of 43.4 g of dicyclohexylcarbodiimide in 100 ml of acetonitrile is added. The whole thing is left in the ice box for 4 hours while shaking from time to time. The resulting precipitate is filtered off and the filtrate is evaporated. The evaporation residue is dissolved in 1 liter of ethyl acetate and then washed in the cold with 1N sodium hydroxide solution, water, sulfuric acid, water and saturated sodium chloride solution. The ethyl acetate phase, dried over sodium sulfate, is completely evaporated.
After recrystallization from ethyl acetate / petroleum ether, Z-Arg (NO) -Phe-OMe is obtained; 131-1330, [a] 2D -70 in methanol, -4 in dimethylformamide.
b) H-Arg (NO2) -Phe-OMe 0.5 H.2O 1.2 HBr
20 g of Z-Arg (NO2) -Phe-OMe are dissolved in 50 ml of glacial acetic acid and 50 ml of 40% strength hydrobromic acid in glacial acetic acid are added with slight cooling. Then the whole thing is left to stand at 20 for 1 hour with occasional shaking. After complete evaporation, the residue is dissolved in 200 ml of water and washed twice with ether. The aqueous phase is completely evaporated and the residue is recrystallized from methanol / ether. M.p. 165-167 with dec., [Cr] 20D = + 180 in methanol, + 14 in dimethylformamide.
c) Z-His (Z) -Arg (NO2) -Phe-OMe
46.1 g of H-Arg (NO2) -Phe-OMe 0.5 HnO 1.2 HBr are dissolved in 100 ml of water, then heated and then cooled. After adding chloroform and ice, the pH is adjusted to 9 with ammonia. The chloroform phase is washed once more with water, then dried over sodium carbonate and filtered. A solution of 44.5 g of Z-His (Z) -OH, 12.1 g of hydroxysuccinimide in 200 ml of acetonitrile and 100 ml of pyridine is added to the filtrate, then the whole is cooled to -200 and treated with a solution of 21.1 g Dicyclohexylcarbodiimide in 70 ml of acetonitrile was added. The mixture is then left to stand for 4 hours in the ice chest with occasional stirring. The resulting precipitate is filtered off and the filtrate is evaporated.
The residue is taken up in ethyl acetate and then washed as follows: 10 The potassium carbonate solution (pH to 10), water, saturated saline solution, water, saturated saline solution, sulfuric acid (pH 3), water, saline solution. The ethyl acetate phase, dried over sodium sulfate, is evaporated completely, a light beige foam being obtained. This foam is dissolved twice in a little methanol and precipitated with ether. The ether phases are decanted off and the precipitate is dried; one obtains Z-His (Z) Arg (NO) -Phe-OMe (amorphous foam), [e] 0 = -80 in methanol, -8 in dimethylformamide.
d) H-His-Arg-Phe-OMe 4 HC1
25 g of Z-His (Z) -Arg (ZO2) -Phe-OMe are dissolved in 800 ml of glacial acetic acid. Then 10 g of 10% palladium on activated charcoal are stirred in 200 ml of hydrochloric acid and added to the solution. The whole is subjected to a 2 hour hydrogenation and then the catalyst is filtered off. The filtrate is again mixed with 5 g of 10% palladium on activated charcoal in water and subjected to the hydrogenation, which is complete after 51/2 hours. This consumes around 80% of the theoretical amount of hydrogen. The analyzer is filtered off and the filtrate is completely evaporated, H-His Arg-Phe-OMe.44 HCl being obtained in the form of an amorphous foam.
e) Trt-His (Trt) -Arg-Phe-OMe. HCl 21.5 g of H-His-Arg.-Phe-OMe.4HCl to 4 HCl are dissolved in 100 ml of pyridine and about 100 ml of dimethylformamide. At about + 50, triethylamine is added to pH 9 and then a solution of 29 g of trityl chloride in 300 ml of pyridine is added dropwise over 5 minutes. After the addition is complete, the pH is checked from time to time and, if necessary, adjusted to about pH 9 with triethylamine. The whole is evaporated after about 4 hours, the residue is taken up in chloroform and water and adjusted to pH 4 with the addition of a little 1N hydrochloric acid. The chloroform phase is separated off, washed twice with water, dried over sodium sulfate and completely evaporated.
Ether is added to the residue and the ether is then filtered off, Trt-His (Trt) Arg-Phe-OMe. HC1 is obtained.
f) Trt-His (Trt) -Arg-Phe-NH-NH2.HCl
17 g of Trt-His (Trt) -Arg-Phe-OMe. HC1 are dissolved in 200 ml of methanol and mixed with 40 ml of hydrazine hydrate. It is then left to stand for 2 days at room temperature. It is evaporated, the residue is dissolved in chloroform and washed twice with water. The chloroform phase is dried over sodium sulfate and evaporated. The residue is then washed with ether and filtered off; it consists of Trt-His (Trt) Arg-Phe-NH-NH2. HCl; M.p. 1580, [l] r) = 9 in dimethylformamide.
Partial sequence D
1- (H-asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl
L-asparaginyl-L-phenylalanine) -2-benzyloxy carbonyl hydrazide trifluoroacetate (H-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z CF: aCOOH) a) 1- (N-tert-butyloxycarbonyl-L -phenylalanine)
2-benzyloxycarbonyl hydrazide (BOC-Phe-NH-NH-Z)
72 g of BOC-Phe-OH and 28 g of N-methylmorpholine are dissolved in 500 ml of methylene chloride and 26 ml of methyl chloroformate are added dropwise at -5. After 10 minutes, another 44 g of Z-NHNH are added. in 100 ml of methylene chloride and stirring is continued for 4 hours at room temperature. After washing with dilute phosphoric acid, it is dried and evaporated.
Crystallization from petroleum ether gives BOC Phe-NH-NH-Z of melting point 117, [a] 20D = -5 in dimethylformamide.
b) 1- (N-tert-butyloxycarbonyl-L-asparaginyl
L-phenylalanine) -2-benzyloxycarbonyl-hydrazide (BOC-Asn-Phe-NH-NH-Z)
41 g of BOC-Phe-NHNH-Z are dissolved in 400 ml of trifluoroacetic acid and left to stand at 200 for one hour.
When the trifluoroacetic acid is evaporated, the H-Phe-NHNH-Z is obtained as crystalline trifluoroacetate with a melting point of 1910, [a] b'0 = + 26.4 in dimethylformamide.
This substance is dissolved in 200 ml of dimethylformamide together with 35 g of BOC-Asn ONP and 30 g of N-methylmorpholine. After standing at 200 for 16 hours, the solvent is evaporated and the residue is washed successively with ethyl acetate and dilute phosphoric acid. BOC-Asn-Phe NH-NH-Z of melting point 2100 is obtained, [a] D = -18 in dimethylformamide.
c) 1- (N-tert-butyloxycarbonyl-L-asparaginyl
L-asparaginyl-L-phenylalanine) -2-benzyloxy carbonyl hydrazide (BOC-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z)
26 g of BOC-Asn-Phe-NH-NH-Z are dissolved in 200 ml of trifluoroacetic acid and left to stand at 200 for 1 hour.
After evaporation of the solvent, 17 g of BOC-Asn-ONP and 15 g of N-methylmorpholine are added to 100 ml of dimethylformamide. After 16 hours at 200, the solvent is evaporated and the residue is washed successively with ethyl acetate and dilute phosphoric acid. BOC-Asn Asn-Phe-NH-NH-Z is obtained; M.p. 2400, [a] 20D = -280 in dimethylformamide.
d) 1- (N-tert -Butyloxycarbonyl-L-lencyl-L-asparaginyl
L-asparaginyl-L-phenylalanine) -2-benzyloxy carbonyl hydrazide (BOC-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z)
22 g of BOC-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z are dissolved in 150 ml of trifluoroacetic acid and left to stand at 200 for 1 hour. After evaporation of the solvent, 12 g of BOC-Leu-ONP and 10 g of N-methylmorpholine in 100 ml of dimethylformamide are added to the residue. After 16 hours of standing at 200, the dimethylformamide is evaporated and the residue is washed in succession with ethyl acetate and dilute phosphoric acid.
BOC-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z of melting point 210, [a] 22D = -34 in dimethylformamide, e) 1- (N-tert-butyloxycarbonyl-L-asparaginyl) is obtained
L-lencyl-L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenhl alanine) -2-benzyloxycarbonyl-hydrazide (BOC-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z)
57 g of BOC-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z are dissolved in 300 ml of trifluoroacetic acid and left to stand at 200 for one hour. After evaporation of the solvent, the residue is crystallized from ether. The tetrapeptide trifluoroacetate is dissolved in 400 ml of dimethylformamide, and 27 g of BOC-Asn-ONP and 25 g of N-methylmorpholine are added to the solution.
After 16 hours of standing at 200, the solvent is evaporated and the residue is washed successively with ethyl acetate and dilute phosphoric acid. - One receives BOC-Asn Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z of melting point 2500 (decomp.), [A 'r, = -340 in dimethylformamide.
f) 1- (1-asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl
L-asparaginyl-L-phenylalanine) -2-benzyloxy carbonyl-hydrazide trifluoroacetate (H-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z trifluoroacetate
43.5 g of BOC-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z are dissolved in 200 ml of trifluoroacetic acid and left to stand at 200 for one hour. After evaporation, the residue is crystallized with the aid of ether. H-Asn Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z trifluoroacetate is obtained; M.p. 2420, [aj -b0 = -220 in dimethylformamide.
Telsequence E tert ..- butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl
L-tryptophanyl-L-arginine hydrazide acetate (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-NHNHe CHsCOOH) a) N-tert-butyloxycarbonyl-L-tryptophanyl (guanido) N-nitro-L-arginine methyl ester (BOC- Trp-Arg (NOL) -Ol \ 4c)
Dissolve 35 g of H-Arg (NO2) -OMe liCl, 63 g of BOC Trp-OCP and 14 g of N-methylmorpholine in 300 ml of dimethylformamide and leave to stand at 200 for 16 hours. After evaporation of the solvent, the residue is taken up in ethyl acetate and washed with dilute sulfuric acid. One constricts a little and falls out with ether. BOC-Trp Arg (NO2) -OMe with a melting point of 1300, [alLssO = -220 in dimethylformamide, crystallizes.
b) N-tert-butyloxycarbonyl-L-tyrosyl-L-tryptophanyl (guanido) N-nitro-arginine methyl ester (BOC-Tyr-Trp-Arg (NOo) -OMe)
15 g of BOC-Trp-Arg (NO2) -OMe are dissolved in 80 ml of 5N methanolic hydrochloric acid solution and left to stand for 1 hour at room temperature. After evaporation of the solvent and treatment with ether, 13 g of H-Trp-Arg (NO2) -OMe remain as hydrochloride; 1200, [a] D = -90 in dimethylformamide. This dipeptide is dissolved together with 14 g of BOC-Tyr-OCP and 8 g of N-methylmorpholine in 200 ml of dimethylformamide. After 16 hours of standing at 200, the solvent is evaporated and the residue is taken up in ethyl acetate.
After washing with dilute phosphorous acid and concentration of the solvent, BOC-Tyr-Trp-Arg (NO2) - OMe can be isolated with the aid of ether; M.p. 1300, [a] = -110 in dimethylformamide.
c) tert-butyloxcarbonyl-L-alanyl-L-tyrosyl
L-tryptophanyl- (guanido) N-nitro-L-arginine methyl ester (BOC-Ala-Tyr-Trp-Arg (NO) -OMe)
13.5 g of BOC-Tyr-Trp-Arg (NO2) -OMe are dissolved in 130 ml of 5N methanolic hydrochloric acid solution, left to stand at 250 for 1 hour, evaporated to dryness, the residue is washed with dimethyl ether, filtered off, dissolved in 100 ml of dimethylformamide and treated with 8.0 g of BOC-Ala-OCP and 3.0 ml of triethylamine. After 16 hours at 250, 500 ml of ethyl acetate are added, washed with dilute sulfuric acid and potassium bicarbonate solution and evaporated to dryness. After washing the residue with chloroform, IBOC-Ala-Tyr-Trp-Arg (NO ..) - OMe is obtained; 1200 (dec.), [A] 2E) = 120 in dimethylformamide.
d) tert-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl
L-tryptophanyl- (guanido) N-nitro-L-arginine methyl ester (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg (NO2) -OMo)
12.3 g of BOC-Ala-Tyr-Trp-Arg (NO -) - OMe are dissolved in 100 ml of 5N methanolic hydrochloric acid, left to stand at 250 for 1 hour, evaporated to dryness, the residue is washed with diethyl ether and dissolved in 100 ml of dimethylformamide, mixed with 14 ml of triethylamine and 8.5 g of BOC-Ser-N3, left to stand for 16 hours at 0, added 500 ml of ethyl acetate, washed successively with dilute sulfuric acid and ammonium hydroxide, dried over sodium sulfate and the solvent evaporated.
After washing the residue with chloroform, it is dissolved in ethyl acetate and precipitated by adding diethyl ether. 13.5 g of BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp Arg (NO2) -OMe are obtained; M.p. 135 (dec.), [A] 20D = - 15 in dimethylformamide.
c) tert-butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl
L-tryptophanyl-L-arginine hydrazide acetate (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-NIINIH2 CH3COOH)
13.2 g of the pentapeptide ester obtained above are dissolved in 300 ml of acetic acid, 60 ml of water and 13.2 g of palladium charcoal (10 egg) are added and the mixture is hydrogenated until the hydrogen uptake is complete. It is filtered, evaporated, the residue is dissolved in dimethylformamide, and again evaporated to remove the traces of acetic acid. The residue is then dissolved in 260 ml of methanol, treated with 26 ml of hydrazine hydrate and left to stand for 16 hours at 40 °. After adding 260 ml of dietary ether, the precipitated crystalline mass is filtered off, washed with diethyl ether and dried over sulfuric acid in a high vacuum.
BOC-S-zr-Ala-Tyr-Trp-Arg-NHNH-CH3COOH is obtained; M.p. 182C, [a] D20 = -8 <in dimethylformamide.
Partial sequence Fl
L-Threonyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-valyl-L-leucine (H-Thr-Cys (Bzl) -Val-Leu-OH) a) H-Cys (Bzl) -Val-Leu-OMe. HBr
21.0 g of Z-Cys (Bzl) -OCP and 12.3 g of H-Val Leu-OMe HCl are dissolved in 120 ml of dimethylformamide. Then 5.9 ml of triethylamine are added, left to stand for 16 hours at 250, ethyl acetate is added, washed with dilute hydrochloric acid, dried over sodium sulfate, evaporated to dryness and the residue crystallized from ethyl acetate / diethyl ether. Z-Cys (Bzl) -Val-Leu-OMe, melting point 10, [C] 2E) = -28 is obtained in dimethylformamide, which is dissolved in 210 ml of a 40% solution of hydrogen bromide in glacial acetic acid. One lets
Stand at 250 for 1 hour, evaporate to dryness and recrystallize the residue from isopropanol / diethyl ether.
H-Cys (Bzl) -Val-Leu-OMe HBr, melting point 1680, [a].-D0 = + 14 in dimethylformamide is obtained.
b) H-Thr-Cys (Bzl) -Val-Leu-OMe .1,3 HBr
20 g of Z-Thr-NHNH2 are dissolved in 350 ml of dimethyl formamide, cooled to -20, 100 ml of a solution of 2N hydrochloric acid in dioxane are added, followed by another
10 ml of tert-butyl nitrite. After 10 minutes at 200, 45 ml of triethylamine and 25.5 g of H-Cys (Bzl) -Val
Leu-OMe HBr was added and the mixture obtained was shaken at 0 for 16 hours. It is evaporated to dryness, the residue is dissolved in a mixture of ethyl acetate / water and the organic one is washed
Phase with dilute hydrochloric acid, dried over sodium sulfate, evaporated and the residue crystallized out
Ethyl acetate around. Z-Thr-Cys (Bzl) -Val-Leu is obtained
OMe; M.p. 2080, [a] 20D = -27 in dimethylformamide.
20 g of the tetrapeptide obtained above are dissolved in 200 ml of a mixture of trifluoroacetic acid / ethyl acetate (1: 1), and a mixture is passed at 0 for 1 hour
A stream of gaseous hydrogen bromide is evaporated and the residue is recrystallized from methanol / diethyl ether. H-Thr-Cys (Bzl) Val-Leu-OMe .1,3 HBr is obtained; 2020, [f] 20D = -100 in
Dimethylformamide.
c) H-Thr-Cys (Bzl) -Val-Leu-OH
372 g of H-Thr-Cys (Bzl) -Val-Leu-OMe are dissolved
1.3 HBr in 1800 ml of methanol, add 900 ml of 2N sodium hydroxide solution, leave for 1 hour at 250 ml, give 240 ml
Glacial acetic acid and let stand at 0 for 2 hours. The precipitated crystalline mass is filtered off, washed first with 1 A acetic acid and then with water and dried at 500 in a high vacuum. The H-Tbr-Cys- (Bzl) -Val-Leu-OH, mp 219, [a] 20D - -53 in In ammonia is obtained.
Partial sequence F2 tert-butyloxycarbenyl-S-benzyl-L-cysteinyl
L-seryl-L-asparaginyl-L-leucyl-L-serine-hydrazide (BOC-Cys (Bzl) -Ser-Asn-Leu-ser-NH-NH2) a) H-Asn-Len-Ser-OMe. HCl
43 g of H-Leu-Ser-OMe HCl and 53 g of BOC-Asn-ONP are dissolved in 400 ml of dimethylformamide, 22 ml of triethylamine are added, the mixture is left to stand for 16 hours at 255, evaporated to dryness and the residue is recrystallized from methanol . 51.6 g of BOC-Asn-Leu Ser-OMe, mp 190, [a] 20D-24 in dimethylformamide are obtained, which is dissolved in 500 ml of a 4N solution of hydrochloric acid in methanol. The mixture is left to stand at 250 for 1 hour, evaporated to dryness, the residue is dissolved in methanol and precipitated with diethyl ether. H-Asn-Leu-Ser-OMe.HCl is obtained; M.p. 180, [a] 20D = -23 in dimethylformamide.
b) H-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe.HCl
39.5 g of BOC-Ser-NHNHo are dissolved in 500 ml of dimethylformamide, and the mixture is cooled to -200. add 200 ml of a 2N solution of hydrochloric acid in dioxane and then 20 ml of tert-butyl nitrite. After 10 minutes at -20, 40 ml of triethylamine and 38.0 g of H-Asn-Leu Ser-OMe-HCl are added, then the mixture is stirred at 0 for 16 hours, evaporated to dryness and the residue is recrystallized from chloroform / diethyl ether. BOC-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe, melting point 135, [a] 20D = -22 in dimethylformamide is obtained, which is dissolved in 420 ml of a 4N hydrochloric acid solution in methanol. The mixture is left to stand at 250 for 1 hour, evaporated to dryness and recrystallized from methanol / ethyl acetate.
H-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe is obtained. HCl, m.p. 1550 (dec.), [All D0 = -15 in dimethylformamide.
c) BOC-Cys (Bzl) -Ser-Asn-Len-Sen-NHNH2
Dissolve 18.5 g of H-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe HCl and
18.0 g of BOC-Cys (Bzl) -ONP in 100 ml of dimethylformamide, are 10 ml of water, 3.5 ml of acetic acid and
5.6 ml of triethylamine, left to stand for 16 hours at 250, evaporated to dryness and crystallized from methanol. 25.1 g of BOC-Cys (Bzl) -Ser are obtained
Asn-Leu-Ser-OMe, m.p. 1820, [a] 20D = -17 in dimethylformamide, which can be prepared with gentle warming in
Dissolves 200 ml of dimethylformamide. Add 200 ml
Methanol and 20 ml of hydrazine hydrate are allowed to stand at 300 for 16 hours, precipitate with diethyl ether, wash the precipitate with diethyl ether / methanol (1: 1) and dry the BOC-Cys (Bzl) -Ser-Asn-Leu Ser- NHNH.2, m.p. 2240, [ei = -13 in dimethylformamide.
Partial sequence F
Pivaloyl-L-hemicystinyl-L-seryl-L-asparaginyl
L-leucyl-L-seryl-L-threonyl-L-hemicystinyl
L-valyl-L-leucine
EMI6.1
<tb> (piv-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Len-OH)
<tb>
Dissolve 18.4 g of BOC-Cvs (Bzl) -Ser-Asn-Leu-Ser-NHNH2 (partial sequence F2) in 150 ml of dimethylformamide, cool to -200, add 40 ml of a 2N solution of hydrochloric acid in dioxane and 15 ml tert-butyl nitrite too. After 10 minutes at -20, 28 ml of triethylamine and 16.2 g of H-Thr-Cys (Bzl) -Val-Leu-Oh (partial sequence F1) are added and the mixture is stirred at 250 for 16 hours. The solution is then filtered and evaporated and the residue washed through in acetic acid. You get
BOC-Cys (Bzl) -Ser-Asn-Leu-Seu-Thr-Cys (Bzl)
Val-Leu-OH, m.p. 2170, [a] 20D = -27 in dimethylformamide.
The product obtained is dissolved in 5000 ml of dried ammonia, and sodium metal is added with stirring and boiling of the ammonia until it turns deep blue. Ammonium chloride is added to decolorize. It is evaporated to dryness and the residue is washed through with 1N acetic acid and acetone.
After drying, BOC-Cys-Ser-Asn-Leu Ser-Thr-Cys-Val-Leu-OH, m.p. 2480 (decomp.), [A] 20D - -41 in dimethylformamide / water (3: 1) is obtained .
The nonapeptide obtained in this way is dissolved in 5000 ml of 0.01N ammonia, hydrogen peroxide is added with stirring until the nitroprussiate reaction is negative, then another 200 ml of glacial acetic acid, filtered and lyophilized.
EMI7.1
<tb>
<SEP> is obtained <SEP> BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr <SEP> Ser-Thr-Cys-Val Leu-OH, m.p. 2380 (dec.), [A] 20D = -180 in dimethylformamide / water (7: 3), which is dissolved in 300 ml of trifluoroacetic acid, left to stand at 250 for 30 minutes, evaporated, the residue was washed with ethyl acetate and dissolved in 300 ml of dimethylformamide. To this solution are added 30 g of pivalic acid p-nitrophenyl ester - which is prepared as described below - and 14 ml of triethylamine, left to stand at 250 for 16 hours, evaporated and the residue was washed with chloroform. It is dissolved in 300 ml of dimethylformamide, 50 ml of water and 50 g of DOWEX-50 are added, the mixture is stirred for 15 minutes, filtered off, the resin is washed with dimethylformamide and the filtrate is evaporated to dryness.
The residue is washed first with chloroform, then with ethyl acetate and dried. You get that
EMI7.2
<tb> Piv-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-OH,
<tb> m.p. 243, [a] 20D = -17 in dimethylformamide / water (3: 1),
Pivalic acid p-nitrophenyl ester
95 g of pivalic acid and 131 g of p-nitrophenyl are dissolved in 1000 ml of ethyl acetate, 197 g of dicyclohexyl carbodiimide are added, the mixture is stirred at 250 for 2 hours, the filtrate is evaporated and the residue is recrystallized from a mixture of ethyl acetate-petroleum ether. Mar receives pivalic acid p-nitrophenyl ester, melting point 1040.
Partial sequence ABC N'm-Trityl-L-histidyI-l-arginyl-Gphenyl alanyl-
L-seryl-glycyl-L-norleucyl-glycyl-L-phenylalanyl glycyl-L-prolyl-L-glutamyl-L-threonyl
L-prolinamide triacetate (H-His (Trt) -Arg-Phe-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly Pro-Glu-Thr-Pro-NH2- 3 CHsC02H) a) L-Seryl-glycyl-L-norleucyl- glycyl-L-phenylalanyl glycyl-L-proly-L-glutamyl-L-threonyl-L-proline amide tetrahydrochloride (H-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr
Pro-NH2.4 HCl)
6.7 g of Z-Ser-Gly-Nle-Gly-OH (partial sequence B), 12 g of H-Phe-Gly-Pro-Glu (OTB) -Thr-Pro-NH2 (partial sequence A) and 2.1 are dissolved g of hydroxysuccinimide in 50 ml of dimethylformamide and 20 ml of acetonitrile, cool to 0, add 4.0 g of dicyclohexylcarbodiimide and leave to stand at 0 for 16 hours. The solution is evaporated.
medium, the residue washes with water, diethyl ether and ethyl acetate and recrystallized from chloroform. One obtains Z-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu (OTB) -Thr-Pro-NH.-., M.p. 125-138 (dec.), [Ul 20D -44 in dimethylformamide , which is dissolved in 250 ml of a solution of 8N hydrogen chloride in dioxane and hydrogenated at normal pressure in the presence of palladium catalyst until the hydrogen uptake has ceased. It is filtered, evaporated to dryness and the residue is processed in diethyl ether. H-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NHa 4 HC1, melting point 1300 (decomp.), [Aj D0 --- -52 in dimethylformamide is obtained.
b) Nim-Trityl-L-histidyl-L-arginyl-L-phenylalanyl
L-seryl-glycyl-L-norleucyl-glycyl-L-phenylalanyl glycyl-L-prolyl-L-glutamyl-L-threonyl-
L-prolinamide triacetate (H-His (Trt) -Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly
Pro-Glu-Thr-Pro-NH2.3CH3CO2H)
9.9 g of Trt-His (Trt) -Arg-Phe-NHNH2 are dissolved. HCl (partial sequence C) in 100 ml of dimethylformamide, cools to -200, adds 15 ml of dioxane / HCl 2N and then 1.16 ml of tert-butyl nitrite, stirs at -200 for 10 minutes, gives 28 ml of triethylamine and 10.0 g H-Ser-Gly-Nle-Gly Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2.HCl, stir for 4 hours at 00, filtered and evaporated to dryness.
The residue is dissolved in a mixture of ethyl acetate / methanol (8: 2), washed with dilute ammonia and then with water until neutral, dried over sodium sulfate, concentrated to 100 ml and precipitated by adding diethyl ether. The precipitate is again dissolved in dimethylformamide and precipitated by adding diethyl ether. You get
Trt-HIs (Trt) Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly Pro-Glu-Thr-Pro-NHg [m.p. 168 (decomp.), [A] 20D = -43 in dimethylformamide], which is dissolved in 500 ml of acetic acid / water (8: 2). The mixture is left to stand at 400 for 3 hours, evaporated, the residue is washed in diethyl ether and dried in High vacuum using KOH chips. You get
H-His (Trt) -Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly
Pro-Glu-Thr-Pro-NH2.3CH3COOH, m.p. 1800 (dec., [All D0 = 610 in acetic acid.
Partial sequence DE
N-tert-butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl
L-tyrosyl-L-tryptophanyl-L-arginyl-L-asparaginyl
L-leucyl-L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenyl alanine. hydrazide. diacetate (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn
Phe-NHNH2.2 CH3COOH) a) l- (N-tert-butyloxycarbonyl-L-seryl-lalanyl-
L-tyrosyl-L-tryptophanyl-L-arginyl-L-asparaginyl L-leucyl-L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenyl-alanine) -2-benzyloxycarbonyl-hydrazide diacetate (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp -Arg-Asn-Leu-Asn-Asn
Phe-NH-NH-Z 2 CH3COOH)
320 ml of dimethylformamide are cooled to 200 ° C., 100 ml of 2N hydrogen chloride in dioxane are added and 68 g of BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-NHNH2-acetate (partial sequence E) are dissolved therein.
Then 12 ml of tert-butyl nitrite are added, the mixture is stirred at 200 for 10 minutes and 35 ml of triethylamine are added dropwise. The mixture obtained in this way is combined with a solution formed from 8.8 g of H-Asn Leu-Asn-Asn-Phe-NHNH-Z trifluoroacetate (partial sequence D) and 17 ml of triethylamine in 150 ml of dimethylformamide. After 16 hours of standing at 0 it is evaporated. The residue is dissolved in ethyl acetate / butanol and washed with dilute acetic acid and ammonia solution. The remains after evaporation of the solvent
BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Ain-Leu-Asn-Asn Phe-NHNH-Z.2 2 CH:, COOH of m.p. 175, [a] 20D = -19.50 in dimethylformamide.
b) tert-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl
L-tryptophanyl-L-arginyl-L-asparaginyl-L-lcucyl
L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenylalanine.
Hydrazide diacetate (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-asn Phe-NHNHa 2 CHlCOOH)
90 g of BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu Asn-Asn-Phe-NHNH-Z.2CH3COOH are dissolved in 500 ml of dimethylformamide and hydrogenated with 10 g of Pd / C (10%) to the end the hydrogen uptake. After filtering off the catalyst, the solvent is evaporated and the residue is crystallized from a mixture of ether and ethanol. You get
BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Leu-Asn-Asn Phe-NHNHa 2 CHsCOOH of m.p. 2650, [a] 2rB0 = -57 in dimethylformamide.
Partial sequence ABCDE L-Seryl-L-alanyl-L-tyrosyl-L-tryptoph anyl-
L-arginyl-L-asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl
L-asp [araginyl-L-phenylalanyl-L-histidyl
L-arginyl-L-phenylalanyl-L-seryl-glycyl
L-norleucyl-glycyl-L-phenylalanyl-glycyl
L-prolyl-L-glutamyl-L-threonyl-L-prolinamide,
Hexa-trifluoroacetate (H-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn
Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly
Pro-Glu-Thr-Pro-NH5 6 CFsCOoH)
15.2 g are dissolved
BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Len-Asn-Asn
Phe-NHNH2.Diactate (partial sequences D, E) in 200 ml of dimethylformamide, cools to -200, adds 15 ml of dioxane / HCl 2N and then 1.16 ml of tert-butyl nitrite and stirs at -200 for 10 minutes. 14 ml of triethylamine and a solution of 18.6 g of the tridecapeptide acetate obtained in partial sequence A, B, C are added,
stir the mixture obtained for 16 hours at 00, filtered and evaporated to dryness. The residue is washed with diethyl ether and with chloroform, dissolved in dioxane / water (8: 2), the solution obtained is treated with 100 ml of Amberlite IRA-410 (acetate form), evaporated and the residue is recrystallized from isopropanol / water . You get that
BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Ser-Asn-Asn Phe-His (Trt) -Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-
Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH acetate, m.p. 1450 (decomp.), [A} 0 = -670 in acetic acid, which is dissolved in 500 ml of trifluoroacetic acid under a nitrogen atmosphere. The mixture is left to stand at 250 for 1 hour, concentrated to 100 ml and precipitated by adding 1000 ml of diethyl ether. It is filtered, the residue is dissolved in dimethylformamide and precipitated with diethyl ether.
After drying over KOH chips, the H-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-
Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-gly-Phe-Gly Pro-Glu-Thr-Pro-NH2.6CF3CO@H, m.p. 1300 (dec.), [A] r) = -450 in Acetic acid.
Example pivaloyl-L-hemicystinyl-L-seryl-L-asparaginyl L-leucyl-L-seryl-L-threonyl-L-hemicystinyl L-valyl-L-leucyl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl L- tryptophanyl-L-arginyl-L-asparaginyl-L-leucyl L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenyulalanyl L-histidyl-L-arginyl-L-phenylalanyl-L-serylglycyl-L-norleucyl-glycyl-L-phenylalanyl-Lglycyl-L prolyl-L-glutamyl-L-threonyl L-prolinamide hexaacetate, octahydrate
EMI8.1
<tb> (Piv-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu
Ser-Ala-Tyr-Trp-Arp-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe
His-Arg-Phc-Ser-Gly-Nle-gly-Phe-Gly-Pro-Glu
Thr-Pro-NH3.Hcxaacctate. Octahydral)
1.0 g of nonapeptide (partial sequence F) is dissolved in 10 ml of dimethylformamide, 1.5 g of N-hydroxysuccinimide and 0.52 g of dicyclohexylcarbodiimide are added, the mixture is stirred at 255 for 6 hours, filtered and the filtrate is evaporated to dryness.
The residue is washed with ethyl acetate and diethyl ether and dried. You get
EMI8.2
<tb> Piv-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val.-Leu-OSu, <SEP>
<tb> Mp. 2420, which is dissolved in 10 ml of dimethylformamide.
3.1 g of tricosapeptide hexa trifluoroacetate (partial sequence A, B, C, D, E), 0.4 ml of triethylamine and 1.2 g of N-hydroxysuccinimide are added to this solution and the mixture is stirred at 250 for 16 hours Dry up, wash the residue with diethyl ether, chloroform and acetone. In this way the crude, protected Dotria contapeptide is obtained, which is dissolved in 100 ml of 0.3N acetic acid, treated with 20 ml of Amberlite IRA-410 (acetate) and 50 ml of 0.6N ammonium hydroxide are added. The pH is adjusted to 6.5 and the solution obtained is layered on a carboxymethylcellulose column (10 × 100 cm) which has been equilibrated with a 0.15N ammonium acetate buffer solution. The elution is carried out with an increasing concentration and pH gradient (0.1 5n to 0.4n; pH 6.5 to pH 7.0) of an ammonium acetate buffer.
The combined fractions containing the pure peptide are freeze-dried three times, the residue is washed with ethanol and then with diethyl ether and dried over potassium hydroxide in a high vacuum. You get
EMI8.3
<tb> Piv-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Ser Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-
His-Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro
Glu-Thr-Pro-NII2.6 CH3CO2H.8 H2O.
M.p. 2160 (dec.), [A] 20D = -560 in acetic acid in.
Amino acid composition after acid hydrolysis (6n, 16h): Ala1.1, Arg2.0, Asn3.9, Cys / 21.6, Glu1.2, Gly3.0, His1.1, Leu2.9, Nle1.0, Phe3 , 0, Pro2.1, Serd, 8, Thr1.9, Tyr1.0, Val0 ,, (Trp 1.0 by spectrophotometry).