Verfahren zur Herstellung eines bisher unbekannten Polypeptidderivates
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines bisher unbekannten Polypeptidderivates der Formel
EMI1.1
11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2, seiner therapeutisch wirksamen Säureadditionssalze und Schwermetallkomplexe.
Das bisher unbekannte Polypeptidderivat kann nach für die Synthese von Verbindungen dieser Art allgemein bekannten Methoden hergestellt werden, wobei die Aminosäuren und die Mercaptopropionsäure in der, in der obigen Formel festgelegten Reihenfolge einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten miteinander verknüpft werden, und bei einer geeigneten Stufe der Synthese die Disulfidbrücke gebildet wird.
Beim Aufbau des neuen Polypeptidderivates haben sich für die Blockierung der ^z-Carboxylgruppe, beispielsweise in der nachstehend beschriebenen Teilsequenz A die tert.-Butyloxygruppe bewährt, doch können auch andere Schutzgruppen, wie die Methoxy-, die Äthoxy-, die tert.-Amyloxy-, die Amid- oder die Benzyloxygruppe verwendet werden.
Für die Blockierung der Imidazolgruppe des Histidinrestes in der nachstehend beschriebenen Teilsequenz C hat sich die Triphenylmethylgruppe bewährt, doch können auch andere geeignete Schutzgruppen, wie die Carbo - tert. - butoxy-, die Carbo - tert. - amyloxy-, die Carbobenzoxy- oder die Benzylgruppe, verwendet werden.
Für die Blockierung der Guanidogruppe des Argininrestes in der nachstehend beschriebenen Teilsequenz E wurde die Nitrogruppe verwendet, doch können auch andere geeignete Schutzgruppen, wie die Tosylgruppe, die p-Nitrocarbobenzoxygruppe oder die 2-(Isopropyloxycarbonyl)-3 ,4,5,6-tetrachloro- benzoylgruppe, verwendet werden. Man kann auch den Schutzeffekt der
Protonisierung der Guanidogruppe bei der Synthese verwenden.
Das neue Polypeptidderivat lässt sich auch in Form seiner Salze gewinnen bzw. verwenden. Als Salze kom men solche mit organischen Säuren, wie Essigsäure, Propionsäure, Glykolsäure, Milchsäure, Brenztrauben säure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Benzoesäure, Zimtsäure, Salicylsäure, 2-Phenoxy- oder 2-Acetoxybenzoesäure, Mandelsäure, Methansulfonsäure, Sithansulfon- säure, Hydroxyäthansulfonsäure, Benzol- oder Toluolsulfonsäure, Naphthalinsulfonsäure, Sulfanilsäure sowie polymere Säuren wie Gerbsäure, Alginsäure, Polygalacturonsäure, Polyphloretinphosphat oder Carboxymethylcellulose und Salze mit anorganischen Säuren, wie Halogenwasserstoffsäure, z.B. Salzsäure oder Bromwasserstoffsäure, Salpetersäure, Thiocyansäure, Schwefelsäure und Phosphorsäure in Frage. Als Schwermetallkomplex kommt z.
B. derjenige vom Zinks in Frage.
Die Ausgangsprodukte zur Herstellung des neuen Polypeptidderivates können, sofern sie nicht bekannt waren, nach den für die Peptidchemie bekannten Methoden erhalten werden, wobei die Aminosäuren einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten miteinander verknüpft werden.
Die neue Verbindung stellt ein wichtiges therapeutisches Prinzip dar, das den Calciumplasmaspiegels, insbesondere den erhöhten Calciumplasmaspiegel senkt und als Antagonist des Parathormons eine positive Calciumbilanz im Knochen bewirkt.
Es ist somit indiziert bei allen Zuständen, bei welchen eine Senkung des Plasmacalciumspiegels erwünscht ist, z. B. Hypercalcämien verschiedener Genese, Mangel des endogenen Thyreocalcitonins infolge Ausfalls von Schilddrüsengewebe, Hyperfunktion der Nebenschilddrüsen.
Die neue Verbindung ist indiziert bei allen Knochenaffektionen, die auf einem vermehrten Abbau beruhen oder bei welchen eine vermehrte Calciumfixation im Knochen erwünscht ist, z. B. Osteoporose verschiedener Genese (z. B. postklimakterisch, posttraumatisch, bedingt durch Corticosteroidtherapie oder Inaktivität usw.), Frakturen, Osteomalacie, Rachitis sowie insbesondere zur Kombinationstherapie mit Calcium bzw.
Phosphat. Die biologische Prüfung der neuen Verbindung ergab eine Wirksamkeit von etwa 100 bis 450 MRC-Einheiten/mg Peptid. Die erforderliche Tagesdosis (i. m. verabreicht) in MRC-Einheiten beträgt 20 mE bis 10 E, vorzugsweise 100 mE/kg Tiergewicht.
Beim Menschen beträgt die tägliche Dosis (i. m.
verabreicht) in MRC-Einheiten 1 bis 500 E. Vorzugsweise wird eine tägliche Dosis von 5 E i. m. verabreicht.
Die neue Verbindung kann als Heilmittel, z.B. in Form pharmazeutischer Präparate, Verwendung finden.
Diese enthalten die genannte Verbindung in Mischung mit einem für die parenterale Applikation geeigneten organischen oder anorganischen Trägermaterial. Für dasselbe kommen solche Stoffe in Frage, die mit der neuen Verbindung nicht reagieren, wie z. B. Gelatine, Milchzucker, Stärke, Magnesiumstearat, Talk, pflanzliche Öle, Benzylalkohole, Gummi arabicum, Polyalkylenglykole, Vaseline, Cholesterin oder andere bekannte Arzneimittelträger. Die pharmazeutischen Präparate können z. B. in flüssiger Form als Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen vorliegen. Gegebenenfalls sind sie sterilisiert und bzw. oder enthalten Hilfsstoffe wie Konservierungs-, Stabilisierungs-, Netzmittel oder Emulgiermittel. Sie können auch noch andere, therapeutisch wertvolle Stoffe enthalten. Die neue Verbindung kann auch in Form eines Depotpräparates verabreicht werden.
Die neue Verbindung und ihre Salze kann auch als Zwischenprodukt zur Herstellung von pharmazeutischen Präparaten Verwendung finden.
Es werden folgende Abkürzungen verwendet:
Z = Carbobenzoxy
Bzl = Benzyl
BOC = tert.-Butyloxycarbonyl
Trit = Trityl = Triphenylmethyl
OTB = tert.-Butyloxy
ONP = p-Nitrophenylester
OCP = 2,4,5-Trichlorphenoxy
OMe = Methoxy
OEt = Äthoxy NO = Nitro
Ser = L-Seryl
Asn = L-Asparaginyl
Leu = L-Leucyl
Thr = L-Threonyl
Val = L-Valyl
Ala = L-Alanyl
Tyr = L-Tyrosyl
Trp = L-Tryptophanyl
Arg = L-Arginyl
Phe = L-Phenylalanyl
Glu = L-Glutamyl
His = L-Histidyl
Pro = L-Prolyl
Gly = Glycyl
Nie = L-Norleucyl
MCP = A-Mercaptopropionyl
Cys = L-Cysteinyl
In den folgenden Beispielen, die die Ausführung des Verfahrens erläutern, den Umfang der Erfindung aber in keiner Weise einschränken sollen, erfolgen alle Temperaturangaben in Celsiusgraden.
Teilsequenz A
L-Phenylalanyl-glycyl-L-prolyl-y-tert.-butyloxy L-glutamyl-L-threonyl-L-prolinamid (H-Phe-Gly-Pro-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH.,)
Man löst bei -5 134 g Z-Thr-NH-NH7 in 2 Liter
In Salzsäure und versetzt mit 0,55 Liter in Natriumnitrit. Nach 5 Minuten wird Kaliumcarbonat bis pH 9 zugegeben, das entstandene Azid mit Äthylacetat extrahiert und eine Lösung von 80 g H-Pro-NH2.Hydro- chlorid in 100 ml Wasser, 500 ml Dimethylformamid und 77 ml Triäthylamin hinzugefügt. Man verdampft das Athylacetat bei 200 im Vakuum und lässt über Nacht bei 250 stehen. Die restliche Lösung wird im Vakuum verdampft, der Rückstand in Athylacetat gelöst, mit Wasser, verdünnter Salzsäure und einer wässrigen Kaliumcarbonatlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet.
Man verdampft im Vakuum, löst in warmem Äthylacetat und kühlt ab. Man erhält Z-Thr-Pro-NH2; Smp. 148 , [α]D20= -72 in 95 % Essigsäure.
Man löst hierauf 90 g Z-Thr-Pro-NH2. in 2 Liter Dioxan und 260 ml in Salzsäure und hydriert bei 200 und Normaldruck in Gegenwart eines Palladiumkatalysators. Man filtriert, verdampft die Lösung im Vakuum, wäscht den Rückstand mit Äthylacetat und erhält H-Thr-Pro-NHe HCl; Smp. 2160, [a] D0 = -64 in 95 % Essigsäure. Dieses wird in 500 ml Dimethylformamid, 50 ml Wasser und 32 ml Triäthylamin gelöst und 118 g Z-Glu(OTB)-OCP und 800 ml Tetrahydrofuran zugegeben. Man lässt über Nacht bei 200 stehen, verdampft im Vakuum und kristallisiert den Rückstand mit Athyläther. Man erhält Z-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2, Smp. 650 (Zers.). [cc]D = -18 in Dimethylformamid.
Man löst 80 g Z-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2 in 1,5 Liter Dioxan und 200 ml Wasser und hydriert bei 200 und Normaldruck in Gegenwart eines Palladiumkatalysators. Die Lösung wird filtriert und im Vakuum verdampft und der Rückstand mit Diäthyläther versetzt, wobei H-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH3 erhalten wird; Smp.
65 (Zers.), [α]D20 = -28 in Dimethylformamid.
Dieses wird in 700 ml Dimethylformamid bei 0 gelöst, 200 ml Acetonitril, 68 g Z-Phe-Gly-Pro-OH, 18 g N-Hydroxysuccinimid und 32 g Dicyclohexylcarbodiimid hinzugefügt, über Nacht bei 200 stehengelassen, flitriert, im Vakuum eingedampft und mit Athylacetat versetzt. Danach wäscht man die Lösung mit Wasser, verdünnter Salzsäure und wässriger Kaliumcarbonatlösung, trocknet über Natriumsulfat, verdampft im Vakuum und kristallisiert den Rückstand aus Athylacetat/Äthyläther. Man erhält Z-Phe-Gly-Pro-Glu(OTB) Thr-Pro-NHz, Smp. 1200 (Zers.), [α]D20 = -66 in Dimethylformamid, das man in 1500 ml Dioxan und 300 ml Wasser löst. Man gibt 30 g Palladiumkohle (1050) zu und hydriert bis zum Ende der Wasserstoffaufnahme.
Man filtriert, dampft das Filtrat ein und kristallisiert den Rückstand aus Dioxan. Man erhält das H-Phe-Gly-Pro-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2; Smp. 1530, [α]D20= -79 in Dimethylformamid.
Teilsequenz B
Benzyloxycarbonyl-L-seryl-glycyl-L-norleucin glycin (Z-Ser-Gly-Nle-Gly-OH) a) Benzyloxycarbonyl-L-norleucyl-glycin (Z-Nle-Gly-OH)
Man löst 31,6 g H-Gly-OH in 420 ml in Natronlauge, gibt 840 ml Tetrahydrofuran zu, versetzt anschliessend mit 130 g Z-Nle-ONP, schüttelt bis die Lösung klar wird, lässt eine Nacht bei 250 stehen Dann wird im Vakuum auf 500 ml konzentriert und die erhaltene wässrige Lösung mit In NaOH auf pH 9 gestellt, 2mal mit Äther extrahiert, dann mit 4n Salzsäure angesäuert, mit Essigester extrahiert. Die Essigesterlösung wäscht man mit Wasser mit NaCl 30%, trocknet über Natriumsulfat, dampft im Vakuum ein Den Rückstand verreibt man mit Äther, lässt 2 Stunden bei-20 kristallisieren. Man erhält Z-Nle-Gly-OH, Smp.
138 , [α]D20 = -4 in Dimethylformamid.
b) Benzyloxycarbonyl-glycyl-L-norleucyl-glycin (Z-Gly-Nle-Gly-OH)
Man löst 100 g Z-Nle-Gly-OH in 1000 ml 4n HBr/ Eisessig, lässt 50 Minuten bei 250, verreibt rnit Äther, filtriert die Kristalle ab, wäscht gut mit äther. Man erhält HBr H-Nle-Gly-OH; [aj 208 = + 24,70 in Essigsäure 95%.
Man löst 84 g HBr H-Nle-Gly-OH in 240 ml H2.O, versetzt mit 152 ml 4n NaOH, 800 ml Tetrahydrofuran und 91 g Z-Gly-ONP. Man schüttelt 1 Stunde bei 250, lässt dann 2 Tage bei 250 stehen. Man konzentriert im Vakuum ein auf 500 ml, stellt mit 1n Natronlauge auf pH 9 ein, extrahiert mit Äther. Die H2O-Phase wird mit in Salzsäure angesäuert, dann 2mal mit Essigester extrahiert. Man wäscht mit H90, NaCl 30%, trocknet über Natriumsulfat, dampft im Vakuum ein, verreibt Rückstand mit Äther. Man erhält Z-Gly-Nle-Gly-OH, Smp. 1550, [a] = -5,60 in Dimethylformamid.
c) Benzyloxycarbonyl-L-seryl-glycyl-L-norleucyl glycin (Z-Ser-Gly-Nle-Gly-OH)
Man löst 89,5 g Z-Gly-Nle-Gly-OH in 900 ml 4n HBr/Eisessig, lässt 50 Minuten bei 250 stehen, dampft im Vakuum ein, verreibt mit Äther, flitriert, wäscht gut mit äther, trocknet im Vakuum, löst in 280 ml Wasser etwa 650 ml Dimethylformamid, gibt 66,5 ml Triäthylamin zu, versetzt mit dem Azid, das wie folgt erhalten wurde:
Man kühlt 940 ml in Salzsäure auf -5 , gibt 96 g Z-Ser-NH-NH2 zu und tropft dann bei -5 360 ml in Natriumnitrit ein, rührt noch 6 Minuten bei -5 , überschichtet mit etwa 600 ml Essigester von 00, stellt unter Zugabe von festem Na9COg auf pH 8,5, trennt Essigesterphase ab, extrahiert nochmals, trocknet die Lösung über Natriumsulfat und filtriert.
Die Reaktionslösung dampft man im Vakuum ein, versetzt den Rückstand mit 600 ml Wasser, säuert extrahiert mit Äthylacetat, wäscht mit Wasser mit Nach 30%, kühlt auf 00, und filtriert die Kristalle ab.
Man erhält Z-Ser-Gly-Nle-Gly-OH, Smp. 2100 mit Zers., []D20α= -8 in Dimethylformamid.
Teilsequenz C N,,Ni,id.-Ditrityl-L-histidyl-L-arginyi-
L-phenylalaninhydrazid HC1 [(Trt)-His(Trt)-Arg-Phe-NH-NH2 - HC1] a) Z-Arg(NO2)-Phe-OMe
51,8 g H-Phe-OMe HCl werden in I Liter Äther und etwa 50 ml Eiswasser gelöst und unter Rühren und Kühlen genügend Natriumcarbonat zugegeben, bis alles Wasser abgebunden ist. Man filtriert und dampft das Filtrat bis zur Gewichtskonstanz ein, wobei ein farbloses Öl erhalten wird.
67,6 g Z-Arg(NOb)-OH werden in 300 ml Acetonitril und 150 ml Dimethylformamid gelöst und mit 41,2 g H-Phe-OMe versetzt. Danach wird auf -200 abgekühlt und eine Lösung von 43,4 g Dicyclohexylcarbodiimid in 100 ml Acetonitril zugegeben. Das Ganze lässt man unter zeitweiligem Umschütteln während 4 Stunden im Eiskasten stehen. Der entstandene Niederschlag wird abfiltriert und das Filtrat eingedampft. Der Eindampfrückstand wird in 1 Liter Essigester gelöst und hierauf in der Kälte mit in Natronlauge, Wasser, 1n Schwefelsäure, Wasser und gesättigter Kochsalzlösung gewaschen. Die über Natriumsulfat getrocknete Essigsäureäthylester-Phase wird vollständig eingedampft.
Nach Umkristallisieren aus Essigester/Petroläther erhält man Z-Arg(NO9)-Phe-OMe; Smp. 131 bis 1330, [a]2D0 = -70 in Methanol, -4 in Dimethylformamid.
b) H-Arg(NO2)-Phe-OMe.0,5 H2O . 1,2 Hbr
20 g Z-Arg(NO. -Phe-OMe werden in 50 ml Eisessig gelöst und unter leichtem Kühlen 50 ml 40,0ige Bromwasserstoffsäure in Eisessig zugesetzt. Danach lässt man das Ganze unter zeitweiligem Umschütteln während 1 Stunde bei 200 stehen. Nach vollständigem Eindampfen wird der Rückstand in 200 ml Wasser gelöst und zweimal mit Äther gewaschen. Die wässrige Phase wird vollständig eingedampft und der Rückstand aus Methanol/Äther umkristallisiert. Smp. 165-167 mit Zers., [α]D20 = + 180 in Methanol, + 140 in Dimethylformamid.
c) Z-His(Z)-Arg(NOo)-Phe-OMe 46,1 g H-Arg(NOs)-Phe-OMe 0,5 H2O 1,2 HBr werden in 100 ml Wasser gelöst, hierauf erwärmt und anschliessend abgekühlt. Nach Zugabe von Chloroform und Eis wird mit Ammoniak auf pH 9 gestellt. Die Chloroformphase wird noch einmal mit Wasser gewaschein, anschliessend über Natriumcarbonat getrocknet und filtriert. Dem Filtrat wird eine Lösung von 44,5 g Z-His(Z)-OH, 12,1 g Hydroxysuccinimid in 200 ml Acetonitril und 100 ml Pyridin zugesetzt, danach das Ganze auf -20 abgekühlt und mit einer Lösung von 21,1 g Dicyclohexylcarbodiimid in 70 ml Acetonitril versetzt. Anschliessend wird unter zeitweiligem Rühren 4 Stunden im Eiskasten stehengelassen. Der entstandene Niederschlag wird abfiltriert und das Filtrat eingedampft.
Der Rückstand wird in Essigsäureäthylester aufgenommen und anschliessend folgendermassen gewaschen: 10 ziege Kaliumcarbonatlösung (pH zur 10), Wasser, gesättigte Kochsalzlösung, Wasser, gesättigte Kochsalziösung, Schwefelsäure (pH 3), Wasser, Kochsalzlösung. Die über Natriumsulfat getrocknete Essigsäure äthylester-Phase wird vollständig eingedampft, wobei ein hellbeiger Schaum erhalten wird. Dieser Schaum wird je zweimal in wenig Methanol gelöst und mit Äther gefällt. Die Ätherphasen werden abdekantiert und der Niederschlag getrocknet; man erhält Z-His(Z) Arg(NO9)-Phe-OMe (amorpher Schaum) [a] D20 = in Methanol, -8 in Dimethylformamid.
d) H-His-Arg-Phe-OMe 4 HC1
25 g Z - His(Z) - Arg(NO2) - Phe - OMe werden in 800 ml Eisessig gelöst. Danach werden 10 g 10% Palladium auf Aktivkohle in 200 ml in Salzsäure angerührt und in die Lösung gegeben. Das Ganze wird einer 2stündigen Hydrierung unterworfen und anschliessend der Katalysator abfiltriert. Das Filtrat wird erneut mit 5 g 10 % Palladium auf Aktivkohle in Wasser versetzt und der Hydrierung unterworfen, die nach 51/2 Stunden beendet ist. Hierbei werden etwa 80 % der theoretischen Menge Wasserstoff verbraucht. Der Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat vollständig eingedampft, wobei H-His-Arg-Phe-OMe 4 4 HCl in Form eines amor- phen Schaumes erhalten wird.
e) Trt-His(Trt)-Arg-Phe-OMe HC1
21,5 g H - His - Arg - Phe - OMe . 4 HCl werden in 100 ml Pyridin und etwa 100 ml Dimethylformamid gelöst. Bei etwa + 50 wird bis pH 9 Triäthylamin zugegeben und anschliessend eine Lösung von 29 g Tritylchlorid in 300 ml Pyridin während 5 Minuten zugetropft. Nach Beendigung der Zugabe wird von Zeit zu Zeit das pH geprüft und nötigenfalls wieder mit Triäthylamin auf etwa pH 9 gestellt. Das Ganze wird nach ungefähr 4 Stunden eingedampft, der Rückstand in Chloroform und Wasser aufgenommen und unter Zugabe von wenig in Salzsäure auf pH 4 gestellt.
Man trennt die Chloroformphase ab, wäscht sie zweimal mit Wasser, trocknet über Natriumsulfat und dampft vollständig ein. Der Rückstand wird mit Äther versetzt und vom Äther anschliessend abfiltriert, wobei Trt-His(Trt)-Arg-Phe-OMe HC1 erhalten wird.
f) Trt-His(Trt)-Arg-Phe-NH-NH2.HCl
17 g Trt-His(Trt)-Arg-Phe-OMe. HCl werden in 200 ml Methanol gelöst und mit 40 ml Hydrazinhydrat versetzt. Danach wird 2 Tage bei Zimmertemperatur stehengelassen. Man dampft ein, löst den Rückstand in Chloroform und wäscht zweimal mit Wasser. Die Chloroform-Phase wird über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Hierauf wird der Rückstand mit Äther gewaschen und abfiltriert; er besteht aus Trt His(Trt)-Arg-Phe-NH-NH.2 HCl; [a] 1D8 = -93 in Dimethylformamid; Smp. 1580.
Teilseaquenz D
1-(L-Asparaginyl-L-leucyl-L-asaparaginyl
L-asparaginyl-L-phenylalanin)-2-benzyloxy carbonyl-hydrazid Trifluoracetat (H-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z CFsCOOH) a) 1-(N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-phenylalanin)
2-benzyloxycarbonyl-hydrazid (BOC-Phe-NH-NH-Z)
Man löst 72 g BOC-Phe-OH und 28 g N-Methylmorpholin in 500 ml Methylenchlorid auf und tropft bei -53 26 ml Chlorameisensäuremethylester zu. Nach 10 Minuten gibt man noch 44 g Z-NHNH2 in 100 ml Methylenchlorid zu und rührt 4 Stunden bei Zimmertemperatur weiter. Nach Auswaschen mit verdünnter Phosphorigersäure wird getrocknet und eingedampft.
Nach Kristallisieren aus Petroläther erhält man BOC Phe-NH-NH-Z vom Smp. 1170, k]D'0 = -5 in Dimethylformamid.
b( 1-(N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-asparaginyl
L-phenylalanin)-2-benzyloxycarbonyl-hydrazid (BOC-Asn-Phe-NH-NH-Z)
Man löst 41 g BOC-Phe-NHNH-Z in 400 ml Trifluoressigsäure und lässt eine Stunde bei 200 stehen.
Beim Verdampfen der Trifluoressigsäure erhält man das H-Phe-NHNH-Z als kristallines Trifluoracetat vom Smp. 1910, [e] D0 = + 26,40 in Dimethylformamid.
Diese Substanz wird zusammen mit 35 g BOC-Asn ONP und 30 g N-Methylmorpholin in 200 ml Dimethylformamid gelöst. Nach 16 Stunden Stehen bei 200 wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand nacheinander mit Essigester und verdünnter Phosphorigersäure gewaschen. Man erhält BOC-Asn-Phe NH-NH-Z vom Smp. 2100, [α] 20 = -18 in Dimethylformamid.
c) 1-(N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-asparaginyl
L-asparaginyl-L-phenylalanin)-2-benzyloxy carbonyl-hydrazid (BOC-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z)
Man löst 26 g BOC-Asn-Phe-NH-NH-Z in 200 ml Trifluoressigsäure auf und lässt 1 Stunde bei 200 stehen.
Nach Verdampfen des Lösungsmittels versetzt man in 100 ml Dimethylformamid mit 17 g BOC-Asn-ONP und 15 g N-Methylmorpholin. Nach 16 Stunden bei 200 wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand nacheinander mit Essigester und verdünnter Phosphorigersäure gewaschen. Man erhält BOC-Asn-Asn Phe-NH-NH-Z; Smp. 2400, [α] 2r) = -280 in Dimethylformamid.
d) 1-(N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-leucyl
L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenylalanin)
2-benzyloxycarbonyl-hydrazid (B OC-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z)
Man löst 22 g BOC-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z in 150 ml Trifluoressigsäure und lässt 1 Stunde bei 200 stehen. Nach Verdampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand mit 12 g BOC-Leu-ONP und 10 g N-Methylmorpholin in 100 ml Dimethylformamid versetzt. Nach 16 Stunden Stehenlassen bei 200 wird das Dimethylformamid verdampft und der Rückstand nacheinander mit Essigester und verdünnter Phosphorigersäure gewaschen. Man erhält BOC-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z vom Smp. 2100, [a] 2D = -34 in Dimethylformamid.
e) 1-(N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-asparaginyl L-leucyl-L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenyl- alanin) -2-benzyloxycarbonyl-hydrazid (BOC-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z)
Man löst 57 g BOC-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z in 300 ml Trifluoressigsäure und lässt eine Stunde bei 200 stehen. Nach Verdampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand in Äther kristallisiert. Man löst das Tetrapeptid-trifluoracetat in 400 ml Dimethylformamid und versetzt die Lösung mit 27 g BOC-Asn-ONP und 25 g N-Methylmorpholin. Nach 16 Stunden Stehenlassen bei 200 wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand nacheinander mit Essigester und verdünnter Phosphorigersäure gewaschen. Man erhält BOC-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z vom Smp. 2500 (Zers.), zeins = -340 in Dimethylformamid.
f) 1-(L-Asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl L-asparaginyl-L-phenylalanin)-2-benzyloxy- carbonyl-hydrazid Trifluoracetat (H-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z Trifluor- acetat)
Man löst 43,5 g BOC-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH- NH-Z in 200 ml Trifluoressigsäure und lässt eine Stunde bei 200 stehen. Nach Eindampfen wird der Rückstand mit Hilfe von Äther kristallisiert. Man erhält H-Asn Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z.Trifluoracetat; Smp.
2420, [a]2r) = -22 in Dimethylformanaid.
Teilsequenz E tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl
L-tryptophanyl-L-arginin-hydrazid Acetat (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-NHNH2.CH3COOH) a) N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-tryptophanyl (guanido)N-nitro-L-argininmethylester (BOC-Trp-Arg(NO2)-OMe)
Man löst 35 g H-Arg(NO)-OMe- HCI, 63 g BOC Trp-OCP und 14 g N-Methylmorpholin in 300 ml Dimethylformamid auf und lässt 16 Stunden bei 200 stehen. Nach Verdampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand in Essigester aufgenommen und mit verdünnter Schwefelsäure gewaschen. Man engt etwas ein und fällt mit Ather aus. Dabei kristallisiert BOC-Trp Arg(NO2)-OMe vom Smp. 1300, [α]D20 = -220 in Dimethylformamid.
b) N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-tyrosyl-L-trypto phanyl-(guanido)N-nitro-argininmethylester (B OC-Tyr-Trp-Arg(NO!)-OMe)
Man löst 15 g BOC-Trp-Arg(NO2)-OMe in 80 ml 5n methanolischer Salzsäurelösung auf und lässt 1 Stunde bei Zimmertemperatur stehen. Nach Verdampfen des Lösungsmittels und Behandeln mit Äther verbleiben 13 g H-Trp-Arg(NO2)-OMe als Hydrochlorid zurück; Smp. 1200, [a]D = -90 in Dimethylformamid. Dieses Dipeptid wird zusammen mit 14 g BOC-Tyr-OCP und 8 g N-Methylmorpholin in 200 ml Dimethylformamid gelöst. Nach 16 Stunden Stehen bei 200 wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand in Essigester aufgenommen.
Nach Waschen mit verdünnter Phosphorigersäure und Einengen des Lösungsmittels kann man mit Hilfe von Äther BOC-Tyr-Trp-Arg(NO2)-OMe isolieren; Smp. 1300 [a] i, -110 in Dimethylformamid.
c) tert.-Butyloxycarbonyl-L-alanyl-L-tyrosyl
L-tryptophanyl-(guanido)N-nitro-L-arginin methylester (BOC-Ala-Tyr-Trp-Arg(NOs)-OMe)
Man löst 13,5 g BOC-Tyr-Trp-Arg(NO2)-OMe in 130 ml 5n methanolischer Salzsäurelösung auf, lässt 1 Stunde bei 250 stehen, dampft zur Trockne ein, wäscht den Rückstand mit Diäthyläther, filtriert ab, löst in 100 ml Dimethylformamid auf und versetzt mit 8,0 g BOC-Ala-OCP und 3,0 ml Triäthylamin. Nach 16 Stunden bei 25 gibt man 500 ml Essigester hinzu, wäscht mit verdünnter Schwefelsäure und Kaliumbicarbonatlösung und dampft zur Trockne ein. Nach Waschen des Rückstandes mit Chloroform erhält man BOC-Ala-Tyr-Trp-Arg(NO.2)-OMe; Smp. 1200 (Zers.), [z7]D = -120 in Dimethylformamid.
d) tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl
L-tyrosyl-L-tryptophanyl-(guanido)N-nitro
L-argininmethylester (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg(NO2)-OMe)
Man löst 12,3 g BOC-Ala-Tyr-Trp-Arg(NO)-OMe in 100 ml 5n methanolischer Salzsäure, lässt 1 Stunde bei 250 stehen, dampft zur Trockene ein, wäscht den Rückstand mit Diäthyläther, löst ihn in 100 ml Dimethylformamid, versetzt mit 14 ml Triäthylamin und 8,5 g BOC-Ser-N:3, lässt 16 Stunden bei 0 stehen, gibt 500 ml Essigester zu, wäscht nacheinander mit verdünnter Schwefelsäure und Ammoniumhydroxid, trocknet über Natriumsulfat und dampft das Lösungsmittel ab.
Nach Waschen des Rückstandes mit Chloroform löst man ihn in Essigester und fällt durch Zugabe von Di äthyläther. Man erhält 13,5 g BOCSer-Ala-Tyr-Trp Arg(NO2)-OMe; Smp. 1350 (Zers.), [a] D0 = -150 in Dimethylformamid.
c) tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl
L-tyrosyl-L-tryptophanyl-L-arginin hydrazid.
Acetat (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-NHNH2.CH3COOH)
Man löst 13,2 g von dem oben erhaltenen Pentapeptidester in 300 ml Essigsäure, gibt 60 ml Wasser und 13,2 g Palladium-Kohle (10 %ig) zu und hydriert bis zum Ende der Wasserstoffaufnahme. Man filtriert, dampft ab, löst den Rückstand in Dimethylformamid auf, dampft wiederum ab, um die Spuren von Essigsäure zu beseitigen. Anschliessend löst man den Rückstand in 260 ml Methanol, versetzt mit 26 ml Hydrazinhydrat und lässt 16 Stunden bei 400 stehen. Nach Zugabe von 260 ml Diäthyläther filtriert man die ausgeschiedene kristalline Masse ab, wäscht mit Diäthyl äther und trocknet im Hochvakuum über Schwefelsäure. Man erhält BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-NHnH2.
CHsCOOH; Smp. 1820, [α] i) = -8 in -Dimethylformamid.
Teilsequenz Fl
L-Threonyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-valyl
L-leucinmethylester Hydrobromid (H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe HBr) a) H-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe HBr
Man löst 21,0 g Z-Cys(Bzl)-OCP und 12,3 g H-Val Leu-OMe-HC1 in 120 ml Dimethylformamid. Danach gibt man 5,9 ml Triäthylamin hinzu, lässt 16 Stunden bei 250 stehen, fügt Essigester hinzu, wäscht mit verdünnter Salzsäure. trocknet über Natriumsulfat, dampft zur Trockne ab und kristallisiert den Rückstand aus Essigsäureäthylester/Diäthyläther. Man erhält Z-Cys (Bzl)-Val-Leu-OMe, Smp. 160 , [α] 20 = -28 in Dimethylformamid, das man in 210 ml einer 40 40 %igen Lösung von Bromwasserstoff in Eisessig löst.
Man lässt 1 Stunde bei 250 stehen, dampft zur Trockne ein und kristallisiert den Rückstand aus Isopropanol/Diäthyl äther um. Man erhält H-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe. HBr, Smp. 1680, [α]D20 = + 140 in Dimethylformamid.
b) H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe . HBr
Man löst 20 g Z-Thr-NHNH in 350 ml Dimethylformamid, kühlt auf 200, gibt 100 ml einer Lösung von 2n Salzsäure in Dioxan und anschliessend noch 10 ml tert.-Butylnitrit zu. Nach 10 Minuten bei -200 werden 45 ml Triäthylamin und 25,5 g H-Cys(Bzl) Val-Leu-OMe . HBr hinzugefügt und das erhaltene Gemisch während 16 Stunden bei 0 geschüttelt. Man dampft zur Trockne ein, löst den Rückstand in einem Gemisch von Essigsäureäthylester/Wasser, wäscht die organische Phase mit verdünnter Salzsäure, trocknet über Natriumsulfat, dampft ein und kristallisiert den Rückstand aus Essigester um.
Man erhält Z-Thr Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe; Smp. 2080, [a] D = 270 in Dimethylformamid.
Man löst 20 g von dem oben erhaltenen Tetrapeptid in 200 ml eines Gemisches von Trifluoressigsäure/Essigester (1:1) auf, leitet während 1 Stunde bei 0 einen Strom gasförmigen Bromwasserstoffs ein, dampft anschliessend ein und kristallisiert den Rückstand aus Methanol/Diäthyläther um. Man erhält H-Thr-Cys(Bzl)- Val-Leu-OMe. 1,3 HBr; Smp. 2020, [ei20 = -100 in Dimethylformamid.
Teilsequenz F2
S-Benzyl-ss-mercaptopropionyl-L-seryl
L-asparaginyl-L-leucyl-L-serin-hydrazid (Bzl-MCP-Ser-Asn-Leu-Ser-NH-NH2) a) H-Asn-Leu-Ser-OMe . HCl
Man löst 43 g H-Leu-Ser-OMe . HCl und 53 g BOC-Asn-ONP in 400 ml Dimethylformamid auf, gibt 22 ml Triäthylamin zu, lässt 16 Stunden bei 250 stehen, dampft zur Trockne ein und kristallisiert den Rückstand aus Methanol um. Man erhält 51,6 g BOC-Asn-Leu Ser-OMe, Smp. 1900, [α] D20 = -240 in Dimethylformamid, das man in 500 ml einer 4n-Lösung von Salzsäure in Methanol löst. Man lässt 1 Stunde bei 25s stehen, dampft zur Trockne ein, löst den Rückstand in Methanol und fällt mit Diäthyläther.
Man erhält H-Asn-Leu-Ser-OMe HCl, Smp. 1800, [α] D20 = -230 in Dimethylformamid.
b) H-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe . HCl
Man löst 39,5 g BOC-Ser-NHNH2 in 500 ml Dimethylformamid, kühlt auf 200, gibt 200 ml einer 2n-Lösung von Salzsäure in Dioxan und anschliessend 20 ml tert.-Butylnitrit zu. Nach 10 Minuten bei -200 werden 40 ml Triäthylamin und 38,0 g H-Asn-Leu-Ser OMe . HCl hinzugefügt, danach 16 Stunden bei 0 gerührt, zur Trockne eingedampft und der Rückstand aus Chloroform/Diäthyläther umkristallisiert. Man erhält BOC-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe, Smp. 1350, [ei 2D0 -22 in Dimethylformamid, das man in 420 ml einer 4n Salzsäurelösung in Methanol löst. Man lässt 1 Stunde bei 25 stehen, dampft zur Trockne ein und kristallisiert aus Methanol/Essigsäureäthylester um.
Man erhält H-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe HCI, Smp. 1550 (Zers.), [α] D20 = - 150 in Dimethylformamid.
c) Bzl-MCP-Ser-Asn-Leu-Ser-NHNH2
Man löst 18,5 g H-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe HCl und 13,5 g Bzl-MCP-ONP in 100 ml Dimethylformamid auf, gibt 10 ml Wasser, 3,5 ml Essigsäure und 5,6 ml Triäthylamin zu, lässt 16 Stunden bei 250 stehen, dampft zur Trockne ein und kristallisiert aus Athanol um. Man erhält 21,3 g Bzl-MCP-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe, Smp. 1930 [ei 20 = -18 in Dimethylformamid. das man unter leichtem Erwärmen in 200 ml Dimethylformamid löst.
Man gibt 200 ml Methanol und 20 ml Hydrazinhydrat zu, lässt 16 Stunden bei 300 stehen, fällt mit Diäthyläther, wäscht den Niederschlag mit Diäthyläther/Methanol (1:1) und trocknet das so erhaltene Bzl-MCP-Ser-Asn-Leu-Ser-NHNH2, Smp. 251', [α]D20 = -16 in Dimethylformamid.
Teilsequenz F ss-Mercaptopropionyl-L-seryl-L-asparaginyl
L-leucyl-L-seryl-L-threonyl-L-hemicystinyl
L-valvl-L-leucin-hvdrazid
EMI6.1
Man löst 16,2 g Bzl-MCP-Ser-Asn-Leu-Ser-NHNH2 (Teilsequenz F2) in 150 ml Dimethylformamid, kühlt auf -200, gibt 40 ml einer 2n-Lösung von Salzsäure in Dioxan und 14 ml tert.-Butylnitrit zu. Nach 10 Minuten bei -200 gibt man noch 28 ml Triäthylamin und 24,8 g H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe. 1,3 HBr zu und rührt 16 Stunden bei 25 . Danach wird filtriert, die Lösung abgedampft und der Rückstand mit heissem Methanol durchgewaschen.
Man erhält 24,1 g
Bzl-MCP-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys(Bzl)
Val-Leu-OMe, Smp. 2440, [e] D20 = -22 in Dimethylformamid, das man bei 600 in 100 ml Dimethylformamid löst, gibt 10 ml Hydrazinhydrat zu und lässt 2 Stunden bei 600 stehen. Das entstandene Octapeptidhydrazid kristallisiert aus. Man wäscht mit Diäthyläther, Wasser und Methanol und trocknet im Hochvakuum über Phosphorpentoxid. Man erhält 15,1 g Octapeptidhydrazid, Smp.
2650 [a] "DO = -35 in Dimethylformamid/Wasser (3 1).
Man löst das erhaltene Produkt in 5000 ml getrocknetem Ammoniak, gibt unter Rühren und Sieden des Ammoniaks Natriummetall bis zur tiefblauen Färbung zu. Zwecks Entfärbung wird Ammoniumchlorid hinzugefügt und danach ein Luftstrom bis zur negativen Nitroprussiatreaktion durch die Lösung geleitet. Man dampft zur Trockne ab und wäscht den Rückstand mit Wasser und Aceton durch. Nach Trocknen erhält man
EMI7.1
278 , [α]D20= -19 in Dimethylformamid/Wasser (3:1).
Teilsequenz ABC
Nim-Trityl-L-histidyl-L-araginyl-L-phenylalanyl
L-seryl-glycyl-L-norleucyl-glycyl-L-phenylalanyl glycyl-L-prolyl-L-glutamyl-L-thereonyl
L-prolinamid Triacetat (H-His (Trt)-Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-
Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2. 3 CHsCOOH) a) L-Seryl-glycyl-L-norleucyl-glycyl-L-phenyl alanyl-glycyl-L-prolyl-L-glutamyl-L-threonyl-
L-prolinamid Tetrahydrochlorid (H-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr
Pro-NH2 .
4 HCl)
Man löst 12 g H-Phe-Gly-Pro-Glu(OTB)-Thr-Pro- NH,.- in 100 ml Dimethylformamid und 20 ml Acetonitril bei 0 und gibt 2,1 g Hydroxysuccinimid, 8,0 g Z-Ser-Gly-Nle-Gly-OH, 4,0 g Dicyclohexylcarbodiimid zu, lässt über Nacht bei 0 stehen, filtriert, verdampft im Vakuum und kristallisiert aus Chloroform. Man erhält
Z-ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu(OTB)
Thr-Pro-NH2, Smp. 125-138 , [α]D20 = -44 in Dimethylformamid.
Man löst in 400 ml Dioxan und 400 ml HCl/Dioxan und hydriert bei Normaldruck in Gegenwart von Palladiumkatalysator und Säure bis zum Ende der Wasserstoffaufnahme. Man filtriert, dampft im Vakuum ein, löst in Methanol, versetzt mit Äther und erhält
H-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr Pro-NH.2- 4 HCI, Smp. 1300 (Zers.), [(Ii -b'0 = -52 in Dimethylformamid.
b) Nim-Trityl-L-histidyl-L-araginyl-L-phenylalanyl
L-seryl-glycyl-L-norleucyl-glycyl-L-phenyl alanyl-glycyl-L-prolyl-L-glutamyl-L-threonyl-
L-prolinamid Triacetat (H-His(Trt)-Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly
Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 . 3 CH2CO2H)
Man löst 9,9 g N-Trt-Ni"-Trt-His-Arg-Phe-NHNHg HCl in 100 ml Dimethylformamid, kühlt auf -200, gibt 30 ml Dioxan/HCl 2n und anschliessend 1,16 ml tert.-Butylnitrit zu, rührt 10 Minuten bei -200, gibt 28 ml Triäthylamin und 9,7 g H-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 . 4 HCl zu, rührt 4 Stunde bei 00, filtriert und dampft zur Trockne ein.
Man löst den Rückstand in einem Gemisch von Essigester/Met] nol (8 : 2) auf, wäscht mit verdünntem Ammoniak u anschliessend mit Wasser bis Neutralität, trocknet ül Natriumsulfat. konzentriert auf 100 ml und fällt dm Zugabe von Diäthyläther. Man löst den Niedersch wiederum in Dimethylformamid auf und fällt dui Zugabe von Diäthyläther. Man erhält
Trt-His(Trt)-Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe
Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 Smp. 1680 (Zers.), [α]D20 = -43 in Dimethylformam das man in 500 ml Essigsäure/Wasser (8 : 2) löst. M lässt 3 Stunden bei 400 stehen, dampft ein, wäscht c Rückstand in Diäthyläther und trocknet im Ho@ vakuum über KOH-Späne.
Man erhält
H-His(Trt)-Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe
Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 . 3 CH3COOH, Smp. 1800 (Zers.), [α]D20 = -61 in Essigsäure.
Teilsequenz DE
N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl
L-tyrosyl-L-tryptophanyl-L-arginyl
L-asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl
L-asparaginyl-L-phenylalanin . Hydrazid . Diacetat (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn Phe-NHNH2 2 CH3COOH) a) 1-(N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl
L-tyrosyl-L-tryptophanyl-L-arginyl-
L-asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl-
L-asparaginyl-L-phenylalanin)-2-benzyloxy carbonyl-hydrazid. Diacetat (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-ASN¯
Phe-NH-NH-Z 2 CH3COOH)
Man kühlt 320 ml Dimethylformamid auf -20 gibt 100 ml 2n Chlorwasserstoff in Dioxan zu und 11 darin 68 g BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-NHNH2 : Ace (Teilsequenz E).
Anschliessend versetzt man mit 12 tert.-Butylnitrit, lässt 10 Minuten bei -20 rühren u tropft 35 ml Triäthylamin zu. Das so erhaltene Gemis wird mit einer Lösung, entstanden aus 8,8 g H-Asn-Le Asn-Asn-Phe-NHNH-Z . Trifluoracetat (Teilsequenz; und 17 ml Triäthylamin in 150 ml Dimethylformarr vereinigt. Nach 16 Stunden bei 0 wird eingedamp Man löst den Rückstand in Essigester. und wäscht n verdünnter Phosphorsäure und Ammoniaklösung.
Na Eindampfen des Lösungsmittels verbleibt das
BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn
Phe-NHNH-Z 2 CHn,COOH vom Smp. 1750, α]D20 = -19,50 in Dimethylformami b) tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl L-tyrosyl-L-tryptophanyl-L-arginyl-
L-asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl-
L-asparaginyl-L-phenylalanin . Hydrazid . Diacetat (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn Phe-NHNH2- 2 CH8COOH)
Man löst 90 g BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Le Asn-Asn-Phe-NHNH-Z 2 CH:COOH in 500 ml r methylformamid und hydriert mit 10 g Pd/C (10 %i bis zum Ende der Wasserstoffaufnahme.
Nach Abf trieren des Katalysators wird das Lösungsmittel ve dampft und der Rückstand aus einem Gemisch v Äther und Äthanol kristallisiert. Man erhält
BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn Phe-NHNH2- 2 CHsCOOH vom Smp. 2650, [α
;] 25 = -57 in Dimethylforrnanaic
Teilsequenz ABCDE
L-Seryl-L-alanyl-L-tyrosyl-L-typtophanyl
L-arginyl-L-asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl
L-asparaginyl-L-phenylalanyl-L-histidyl
L-arginyl-L-phenylalanyl-L-seryl-glycyl L-norleucyl-glycyl-L-phenylalanyl-glycyl
L-prolyl-L-glutamyl-L-threonyl-
L-prolinamid Hexatrifluoracetat (H-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-
Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly
Pro-Glu-Thr-Pro-NH2.6 CF3CO2H)
Man löst 15,2 g BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn Leu-Asn-Asn-Phe-NHNH" Diacetat (Teilsequenz DE) in 200 ml Dimethylformamid,
kühlt auf -200, gibt 15 ml Dioxan/HCl 2n und anschliessend 1,16 ml tert. Butylnitrit zu und rührt 10 Minuten bei -230. Man gibt 14 ml Triäthylamin und eine Lösung von 18,6 g des in Teilsequenz ABC erhaltenen Tridecapeptidacetats in Dimethylformamid zu, rührt das erhaltene Gemisch 16 Stunden bei 00, filtriert und dampft zur Trockene ein. Man wäscht den Rückstand mit Diäthyläther und mit Chloroform, löst in Dioxan/Wasser (8 : 2), behandelt die erhaltene Lösung mit 100 ml Amssberlit-IRA-410 (Acetat-Form), dampft ein und kristallisiert den Rückstand aus Isopropanol/Wasser um.
Man erhält das
BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn Phe-His(Trt)-Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-
Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH Acetat, Smp. 145 (Zers.), [α]D20 = -71 in Essigsäure, das man unter Stickstoffatmosphäre in 500 ml Trifluoressigsäure löst. Man lässt 1 Stunde bei 25 stehen, konzentriert auf 100 ml und fällt durch Zugabe von 1000 ml Diäthyläther. Man filtriert, Iöst den Rückstand in Dimethylformamid und fällt mit- Diäthyläther. Nach Trocknen über KOH-Späne erhält man das
H-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn
Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly
Pro-Glu-Thr-Pro-NH2.6 HCF8CO2H.
Smp. 1300 (Zers.), [ei20 = -45 in Essigsäure.
Beispiel ss-Mercaptosspropi9onyl-L-seryl-L-asparaginyl
L-leucyl-L-seryl-L-threonyl-L-hemicystinyl -valyl-L-leucyl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl
L-typtophanyl-L-arginyl-L-asparaginyl
L-leucyl-L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenyl alanyl-L-h istidyl-L-arginyl-L-phenylal anyl
L-seryl-glycyl-L-norleucyl-glycyl-L-phenyl alanyl-glycyl-L-prolyl-L-glutamyl-L-threonyl-
L-prolinamid.Hexaacetat.Dodecahydrat
EMI8.1
Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His Arg-Phe-Ser-Gly-Nle -Gly-Phe-Gly-Pro-Glu Thr-Pro-NHe 6 ;
CH3COOH 12 HrO)
Man löst 1,05 g Octapeptid-Hydrazid (Teilsequenz
F) in einem Gemisch von 50 ml Dimethylformamid und 1,2 ml DioxaníHCl 2n bei -200. Man gibt
0,116 ml tert-Butylnitrit zu, rührt 10 Minuten bei -200, gibt 1,4 ml Triäthylamin und 3,1 g Tricosa peptid-Tn.fluoracetat (Teilsequenz ABCDE) und 5 ml
Wasser zu und rührt 16 Stunden bei 00. Man dampft zur Trockne ein, wäscht den Rückstand mit Diäthyl äther, Chloroform und Aceton. So erhält man das rohe Peptidderivat, das man in 100 ml 0,3n Essigsäure löst, mit 20 ml Ämbeflit-IRA-4 10 (Acetat) behandelt und gibt 50 ml 0,6n Ammoniumhydroxyd hinzu.
Man stellt das pH auf 6.5 cin und schichtet die erhaltene Lösung auf eine Carboxymethylcellulosesäule (10 X 100 cm).
die mit einer 0,15n Ammoniumacetatpuffer-Lösung equilibriert wurde. Die Elution wird mit einem steigenden Konzentrations- und pH-Gradient (0,15n auf 0,4n; pH 6,5 auf pH 7,0) eines Ammoniumacetatpuffers durchgeführt. Die vereinigten Fraktionen, die das reine Peptid erhalten, werden 3mal gefriergetrocknet, der Rückstand wird mit Athanol und anschliessend mit Diäthyläther gewaschen und über Kaliumhydroxyd im Hochvakuum getrocknet Man erhält
EMI8.2
Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe
His-Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly
Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 6 CHsCOh2H 12 H2O, Smp. 2200 (Zers.), [ei 20 - 570 in Essigsäure ln
Aminosäurezusammensetzung nach Säurehydrolyse (6n, 16 Sid.):
Ala1.1, Arg2.0, Asn3.0, Cys21.0, Glu1.2, Gly3.0, His.1.1, Leu2,9, Nle1.0, Phe3.0, Pro2.1, Ser3.8, Thr1.0, Tyr1.0, Val0.9 (Trp 1,0 durch Spektrophotometrie).