CH509980A - Verfahren zur Herstellung eines bisher unbekannten Polypeptidderivates - Google Patents

Verfahren zur Herstellung eines bisher unbekannten Polypeptidderivates

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CH509980A
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Bossert Heinz
Stephan Dr Guttmann
Sandrin Edmond
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Sandoz Ag
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Description


  
 



  Verfahren zur Herstellung eines bisher unbekannten Polypeptidderivates
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines   bisher    unbekannten   Polypeptid-    derivates der Formel
EMI1.1     


<tb>  <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> 9
<tb> MCP-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Ser
<tb>  <SEP> 10 <SEP> 11 <SEP> 12 <SEP> 13 <SEP> 14 <SEP> 15 <SEP> 16 <SEP> 17 <SEP> 18 <SEP> 19 <SEP> 20
<tb>   Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His <SEP> -Lys-    <SEP> 
<tb>  <SEP> 21 <SEP> 22 <SEP> 23 <SEP> 24 <SEP> 25 <SEP> 26 <SEP> 27 <SEP> 28 <SEP> 29 <SEP> 30 <SEP> 31
<tb> Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro
<tb> NH2, <SEP> seiner <SEP> therapeutisch <SEP> wirksamen <SEP> Säureadditions
<tb> salze <SEP> und <SEP> Schwermetallkomplexe.
<tb> 



   Das bisher unbekannte Polypeptidderivat kann nach für !die Synthese von Verbindungen dieser Art   allige-    mein bekannten Methoden hergestellt werden, wobei die Aminesäuren in der, in der obigen Fonmel festge legten Reihenfolge einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten miteinander verknüpft werden, indem man entsprechende zu seinem Aufbau nötige   Aminosäuren      und    Mercaptopropionsäure unter Bildung von   CONH-Bindungen    in   beliebiger    zeitlicher Reihenfolge miteinander kondensiert, wobei nicht an der Reaktion teilnehmende freie funktionelle Gruppen intermediär durch geeignete Schutzgruppen geschützt werden,

   zu einem beliebigen Zeitpunkt der Synthese die Mercaptogruppen nach Bildung der Teilsequenz 1 bis 6 ,und vor Einbau !der eine Methionylgruppe ent   haltenden    Teilsequenz zum Disulfid oxydiert und   die    Carboxylgruppe des terminalen Prolyhestes in die Amidgruppe überführt.



   Beim Aufbau des neuen Polypeptidderivates haben sich für die Blockierung der   #-Carboxylgruppe,    beispielsweise in der nachstehend beschriebenen Teilscquenz A, die tert. - Butyloxygruppe bewährt, doch können auch andere Schutzgruppen, wie die Methoxy-, die Äthoxy-, die tert.-Amyloxy-, die Amid- oder die   Benzyloxygruppe    verwendet werden.



   Für die Blockierung der Imidazolgruppe des Histidinrestes in der nachstehend beschriebenen Teilsequenz C hat sich die Triphenylmethylgruppe bewährt, doch können auch andere geeignete Schutzgruppen, wie die Carbo-tert.-butoxy-, die Carbo-tert.-amhyloxy-, die Carbobenzoxy- oder die Benzylgruppe verwendet werden.



   Für die Blockierung der   #-Aminogruppe    des Lysinrestes in der nachstehend beschriebenen. Teilsequenz C kann eine tert. - Alkoxy-carbonylgruppe, vorzugsweise die   tert.4uto.xy-car,boniyllgruppe,    verwendet werden.



   Für die Blockierung der Guanidogruppe des Argininrestes in der nachstehend beschriebenen Teilsequenz E wurde die   Nitrogruppe    verwendet, doch können auch andere geeignete Schutzgruppen, wie die Tosylgruppe, die p-Nitrocarbobenzoxygruppe oder die
2-(Isopropyloxycarbonyl)-3,4,5,6,-tetrachloro benzoylgruppe verwendet werden. Man kann auch den Schutzeffekt ,der   Protonisierung    der Guanidogruppe bei der Synthese   verwenden.   



   Zum Schutz der Sulfhydrylgruppe in der nachstehend beschriebenen Teilsequenz F1 und F2 kann z. B. die BenzylL,   die    p-Brombenzyl- oder die p-Me- thylbenzylgruppe verwendet werden.



   Das neue   Polypeptidderivat    lässt sich auch in Form seiner Salze gewinnen   bzw.    verwenden. Als Salze   Ikom-    men solche mit organischen Säuren, wie Essigsäure, Propionsäure, Glykolsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Benzoesäure, Zimtsäure, Salicylsäure, 2-Phenoxy- oder 2-Acetoyxbenzoesäure, Mandelsäure, Methansulfonsäure, Äthansulfonsäure, Hydroxyäthansulfonsäure, Benzol- oder Toluclsulfonsäure, Naphthalinsulfonsäure, Sulfanilsäure   sowie    polymere   Säuren    wie Gerbsäure, Alginsäure, Polygalacturonsäure, Polyphloretinphosphat oder Carboxymethylcellulose und Salze mit anorganischen Säuren, wie Halogenwasserstoffsäure, z. B.

  Salzsäure oder Bronwasserstoffsäure, Salpetersäure, Thiocyansäure, Schwefelsäure und Phosphorsäure in Frage. Als Schwer  metallkomplex kommt z.B. derjenige vom Zink   ##    in frage.



   Die Ausgangsprodukte zur Herstellung der neuen Polypeptidderivates können, sofern sie nicht   bekannt      waren,    nach den für die Peptidchemie bekannten Methoden erhalten werden, wobei die Aminosäuren einzeln   oder    nach vorheriger Bildung kleinerer   Peptidein-    heiten miteinander verknüpft werden.



   Die neue Verbindung stellt ein wichtiges therapeutisches Prinzip dar,   das    den Calciumplasmaspiegel, insbesondere den erhöhten Calciumplasmaspiegel senkt und als Antagonist des Parathormons eine positive   Caiciumbilanz    im Knochen bewirkt.



   Es ist somit indiziert bei allen Zuständen, bei welchen eine Senkung des Plasmacalciumspiegels erwünscht ist, z. B. Hypercalcämien verschiedener Genese, Mangel des endogenen Thyreocalcitonins infolge Ausfall von Schilddrüsengewebe, Hyperfunktion der Nebenschild   düsen.   



   Die neue Verbindung ist indiziert bei allen Knochenaffektionen, die auf einem vermehrten Abbau be   ruhen    oder bei welchen eine vermehrte   Calciumlfixa-    tion in Knochen erwünscht ist, z.B. Osteoporose verschiedener Genese (z.B. postklimakterisch, posttraumatisch, bedingt durch Corticosteroidtherapie oder Inaktivität usw.), Frakturen, Osteomalacie, Rachitis sowie insbesondere zur Kombinationstherapie mit Calcium bzw. Phosphat.   Die    biologische Prüfung der   neuen      Verbindung    ergab eine   Wirksamkeit    von etwa 100 bis 450   MRC-Einheiten/ing    Peptid.

  Die erforderliche Tagesdosis (i. m. verabreicht) in   MRC-Einheiten    beträgt 20   mE    bis 10 E, vorzugsweise 100   mE/kg      Tierge-    wicht.



   Beim Menschen Ibeträgt   die    tägliche Dosis (i. m.



  verabreicht) in MRC-Einheiten 1 bis 500 E. Vorzugs- weise wird eine tägliche Dosis von 5 E i. m. verabreicht.



   Die neue   Verbindung    kann als Heilmittel, z. B. in Form pharmazeutischer   Präparate,    Verwendung fin   den.    Diese   enthalten    die genannte Verbindung in Mischung mit einem für die parenterale Applikation geeigneten ortganischen oder anorganischen Trägermaterial. Für dasselbe kommen solche Stoffe in Frage, die mit der neuen Verbindung nicht reagieren, wie z.B.



     Gelatine,      Milchzucker,    Stärke, Magnesiumstearat, Talk, pflanzliche Öle, Benzylalkohole, Gummi arabicum, Polyalkylenglykole, Vaseline, Cholesterin oder andere bekannte Arzneimittelträger. Die pharmazeutischen Präparate können z. B. in flüssiger Form als Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen vorliegen. Gegebenenfalls   sind    sie sterilisiert und bzw. oder enthalten Hilfsstoffe, wie Konservierungs-,   Stabikisieorungs-,    Netzmittel oder   Emulgiermittel.    Sie können auch noch andere, therapeutisch vertvolle Stoffe enthalten. Die neue Ver   bindung kann    auch in Form eines Depotpräparates verabreicht werden.



   Die neue Verbindung und ihre Salze kann auch als Zwischenprodukt zur Herstellung von pharmazeutischen Präparaten Verwendung finden.

 

   Es werden folgende   Abkürzungen    verwendet:
Z = Carbobenzoxy
Bzl = Benzyl
BOC = tert.-Butyloxycarbonyl
Trt = Trityl = Triphenylmethyl
OTB = tert.-Butyloxy
ONP = p-Nitrophenylester
OCP = 2,4,5-Trichlorphenoxy
OMe = Methoxy
OEt =   Äthoxy   
NO2 = Nitro
Ser = L-Seryl
Asn = L-Asparaginyl
Leu = L-Leucyl
Thr = L-Threonyl
Val = L-Valyl
Ala = L-Alanyl
Tyr = L-Tyrosyl
Trp = L-Tryptophanyl
Arg = L-Arginyl
Lys = L-Lysyl
Phe = L-Phenylalanyl
Glu = L-Glutamyl
His = L-Histidyl
Pro = L-Prolyl
Gly = Glycyl
Met = L-Methionyl
MCP = ss-Mercaptopropionyl
Cys = L-Cysteinyl
In den   folgenden    Beispielen, die die Ausführung des Verfahrens erläutern, den   Umfang    der Erfindung aber in keiner Weise einschränken sollen, erfolgen alle   Temperaturangaben in    Celsiusgraden.  



  Teilsequenz A:   L-Phenylalanyl-glycyI-l-prolyl-y-       tert.-butyl-oxy-L-glutamyl-L-threonyl-L-prolinamid     (H-Phe-Gly-Pro-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2)
Man löst bei   -5     134 g Z-Thr-NH-NH2 in 2 1 in Salzsäure und versetzt mit 0,55 1 in Natriumnitrit.



  Nach 5 Minuten wird Kaliumcarbonat bis pH 9 zugegeben, das entstandene Azid mit   Äthylacetat    extrahiert und eine Lösung von 80 g   H-Pro-NH2    . hydrochlorid in 100 ml Wasser, 500 ml Dimethylformamid und 77 ml Triäthylamin hinzugefügt. Man verdampft das Athylacetat bei 200 im Vakuum und lässt über Nacht bei 250 stehen. Die restliche Lösung wird im Vakuum verdampft, der Rückstand in Äthylacetat gelöst, mit Wasser, verdünnter Salzsäure und einer wässrigen Kaliumcarbonatlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Man verdampft im Vakuum, löst in warmem Äthylacetat und kühlt ab. Man erhält Z-Thr-Pro-NH2 ; Samp. 148 ,   [&alpha;]20D    = - 72  in 95 % Essigsäure.

  Man löst hierauf 90 g Z-Thr-Pro-NH2 in 21 Dioxan und 260   ml    in Salzsäure und hydriert bei 200 und Normaldruck in Gegenwart eines Palladiumkatalysators. Man filtriert, verdampft die Lösung im Vakuum, wäscht den Rückstand mit Äthylacetat und erhält H-Thr-Pro-NH2 . HCl, Smp.   2160,    [a]   2E)0    = - 640 in 95 % Essigsäure. Dieses wird in 500 ml Dimethylformamid, 50   ml    Wasser und 32 ml Triäthylamin gelöst und 118 g Z-Glu(OTB)-OCP und 800 ml Tetrahydrofuran zugegeben. Man lässt über Nacht bei 200 stehen, verdampft im Vakuum und kristallisiert den Rückstand mit   Äthyl äther.    Man erhält   Z - Glu (OTB) -Thr-Pro- NH2,    Smp. 650 (Zers.), [a] 2D = - 180 in Dimethylformamid.



   Man löst 80 g   Z-Glu(OTB)-Thr-Pro-NHe    in 1,5 1 Dioxan und 200 ml Wasser und hydriert bei 200 und Normaldruck in Gegenwart eines Palladiumkatalysators. Die Lösung wird filtriert und im Vakuum verdampft und der Rückstand mit Diäthyläther versetzt, wobei   H-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH;    erhalten wird, Smp.



  650 (Zers.),   [&alpha;]20D = - 28 C    in Dimethylformamid. Dieses wird in 700 ml Dimethylformamid bei   0     gelöst, 200 ml Acetonitril, 68 g Z-Phe-Gly-Pro-OH und 32 g Dicyclohexylcarbodiimid hinzugefügt, über Nacht bei 200 stehengelassen, filtriert, im Vakuum eingedampft und mit   Athylacetat    versetzt. Danach wäscht man die Lösung mit Wasser, verdünnter Salzsäure und wässriger Kaliumcarbonatlösung, trocknet über Natriumsulfat, verdampft im Vakuum und kristallisiert den Rückstand aus   Äthylacetat/Äthyläther.    Man erhält Z-Phe-Gly-Pro    Glu(OTB)-Thr-Pro-NH    vom Smp. 1200 (Zers.), [a]   2D    =   -660    in Dimethylformamid, das man in 1500 ml Dioxan und 300 ml Wasser löst.

  Man gibt 30 g Palladiumkohle   (102;)    zu und hydriert bis zum Ende der Wasserstoffaufnahme. Man filtriert, dampft das Filtrat ein und kristallisiert den   Rückstand    aus Dioxan. Man erhält das H-Phe-Gly-Pro-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2, Smp.   1530,    [a]   20    = - 790 in Dimethylformamid.



  Teilsequenz B:N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl glycyl-L-methionyl-glycin (BOC-Ser-Gly-Met
Gly-OH) a) L-Methionyl-glycin-äthylester-hydrochlorid  (H-Met-Gly-OEt    HCl)   
Man löst 65 g BOC-Met-OH in 900 ml Chloroform, kühlt auf   -10 ,    gibt 30 ml N-Methylmorpholin und 35,6 g Chlorameisensäureisobutylester zu. Nach 10 Minuten fügt man langsam eine Lösung von 30 g Glycin äthylester in 200 ml Chloroform hinzu und lässt bei 200 eine Stunde reagieren. Man extrahiert mit 0,5 n Ammoniumhydroxid, dann mit 0,2n Schwefelsäure und wäscht mit Wasser neutral, trocknet über Na   triumsulfat    und engt ein. Nach Umkristallisieren aus Petroläther erhält man BOC-Met-OEt; Smp. 490,   [&alpha;]20D    = 19  in Äthanol.

  Man löst es in 750 ml 4n HCl/Äthanol, lässt 1 Stunde bei 25  stehen, dampft ein, wäscht den Rückstand mit Diäthyläther und trocknet bis zur Gewichtskonstanz. Man erhält das H-Met-Gly OEt    HC1    in Form eines Öles.



  b)   tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-glycin-äthylester     (BOC-Ser-Gly-OEt)
Man löst 12,5 g tert.-Butyloxycarbonyl-serin in 100 ml Chloroform und gibt 6,1 g N-Methylmorpholin dazu; danach tropft man 8,2 g Chlorameisensäureisobutylester hinzu. Nach 10 Minuten wird eine Lösung von 6,6 g Glycin-äthylester in 50   ml    Chloroform hinzugefügt und 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wird mit verdünntem Ammoniak, dann mit Salzsäurelösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und die organische Phase abgedampft.



  Man erhält BOC-Ser-Gly-OEt als Ö1;   [a] u0 =30    in Dimethylformamid.



  c) tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-glycin-hydrazid   (B,OC-Ser-Gly-NHNHs)   
Man löst 19,4 g BOC-Ser-Gly-OEt in 270 ml Äthylalkohol, gibt 48,6   ml    Hydrazinhydrat hinzu und lässt 2 Tage bei Raumtemperatur stehen. Anschliessend dampft man die Lösung ab und kristallisiert den Rückstand aus einem Methylalkohol/Äthyläther-Gemisch (1: 3). Man erhält BOC-Ser-Gly-NHNH2, Smp.   1570,      [&alpha;]20D    = -5  in Dimethylformamid.



  d) tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-glycyl-L-methionyl    glycinäthylester    (BOC-Ser-Gly-Met-Gly-OEt)
Zu 200 ml Dimethylformamid werden 25 ml einer 4n Chlorwasserstofflösung in Äthyläther gegeben und darin bei   -10     11 g BOC-Ser-Gly-NHNH2 gelöst. Anschliessend tropft man bei   -10     5,4 ml tert.-Butylnitrit hinzu, fügt der Lösung zuerst 18   ml    Triäthylamin und dann eine Lösung von 12 g   H-Met-Gly-OEt VCl    in 100   ml    Dimethylformamid und 6,2   ml    Triäthylamin bei. Es wird 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, nach 12 Stunden filtriert und eingedampft. Den Rückstand löst man in Chloroform, wäscht nacheinander mit verdünnter Ammoniak- und Salzsäurelösung, trocknet über Natriumsulfat und dampft ein.

  Man erhält BOC-Ser-Gly-Met-Gly-OEt, [a] 2D0 =-140 in Dimethylformamid.

 

  e) tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-glycyl-L-methionyl glycin (BOC-Ser-Gly-Met-Gly-OH)
Man löst 24 g BOC-Ser-Gly-Met-Gly-OEt in 250 ml Dioxan, gibt 75   ml    in Natronlauge zu, rührt 1 Stunde bei 250, behandelt mit 150 ml Dowex-50 (H+-Form), filtriert, dampft das Filtrat ein und kristallisiert den   Rückstand    aus Essigester/Diäthyläther. Man erhält
BOC-Ser-Gly-Met-Gly-OH, Smp. 870 (Zers.),    [&alpha;]20D      = 170    in Dimethylformamid.



  Teilsequenz C: Na,   Nimid    Ditrityl-L-histidyl-tert.-butyl- oxy-carbonyl-L-lysyl-L-phenylalaninhydrazid  (Trt)-His(Trt)-Lys(BOC)-Phe-NH-NH2 a) Z-Lys(BOC)-Phe-OMe
94,8 g H-Phe-OMe HC1 werden in 1   Liter Äther    und etwa 50 ml Eiswasser gelöst und unter Rühren und Kühlen genügend Natriumcarbonat zugegeben, bis  alles Wasser abgebunden ist. Man filtriert und dampft das Filtrat bis zur Gewichtskonstanz ein, wobei ein farbloses Öl erhalten wird.



   144 g -Lys(BOC)-OH werden in 300 ml Acetonitril und 150 ml Dimethylformamid gelöst und mit dem oben erhaltenen H-Phe-OMe versetzt. Danach wird auf   200    abgekühlt und eine Lösung von 90,8 g Dicyclohexylcarbodiimid in 100 ml Acetonitril zugegeben. Das Ganze lässt man unter zeitweiligem Umschütteln während 4 Stunden im Eiskasten stehen. Der entstandene Niederschlag wird abfiltriert und das Filtrat eingedampft. Der Eindampfrückstand wird in 1 Liter Essigester gelöst und hierauf in der Kälte mit in Sodalösung, Wasser, in Schwefelsäure, Wasser und gesättigter Kochsalzlösung gewaschen. Die über Natriumsulfat getrocknete Essigsäureäthylester-Phase wird vollständig eingedampft. Nach Umkristallisieren aus Essigester/ Petroläther erhält man Z-Lys(BOC)-Phe-OMe; Smp.



     102-1050, [&alpha;]20D = 70 in Methanol, 120 in Dime-    thylformamid.



  b) H-Lys(BOC)-Phe-OMe . HCl
29 g Z-Lys(BOC)-Phe-OMe werden in 500 ml Methanol gelöst und nach Zugabe von 53 ml in HCl/ Methanol in Anwesenheit von Palladiumkohle hydriert.



  Nach Filtrieren und Eindampfen wird der Rückstand im Hochvakuum getrocknet.



  c)   Z-His-Lys(BOC)-Phe-OiMe   
45 g H-Lys(BOC)-Phe-OMe   Ha    werden in einem Gemisch von 300 ml Acetonitril und 50 ml Dimethylformamid gelöst, danach eine Lösung von 40 g Z-His   N8    in 150 ml Essigester und 20 ml Triäthylamin zugegeben und das Ganze 4 Stunden bei   0     stehengelassen.



  Nach Abfiltrieren wird das Filtrat eingedampft. Der Rückstand wird in Essigsäureäthylester aufgenommen und anschliessend dreimal mit   Wasserlgesättigte    Kochsalzlösung (1:1) gewaschen. Die über Natriumsulfat getrocknete Essigsäureäthylester-Phase wird vollständig eingedampft, wobei   Z-His-Lys(B OC)-Phe-OMe    (hellbeiger, amorpher Schaum)erhaltenwird.   [al20      =-11     in Dimethylformamid.



  d)   H-His-Lys(BOC)-Phe-OMe       HCI   
96 g Z-His-Lys(BOC)-Phe-OMe werden in 2000 ml Methanol gelöst. Danach werden 10 g   10 S    Palladium auf Aktivkohle in 120 ml in Salzsäure angerührt und in die Lösung gegeben. Das Ganze wird einer 2-stündigen Hydrierung unterworfen und anschliessend der Katalysator abfiltriert. Das Filtrat wird erneut mit 5 g 10 % Palladium auf Aktivkohle in Wasser versetzt und der Hydrierung unterworfen, die nach 5 1/2 Stunden beendet ist. Hierbei werden etwa 80 % der theoretischen Menge Wasserstoff verbraucht. Der Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat vollständig eingedampft, wobei H-Hys-Lys(BOC)-Phe-OMe.   Ha    in Form eines amorphen Schaumes erhalten wird.



  e)   Trt-His(Trt)-Lys(BOC)-Phe-OMe   
144 g H-His-Lys(BOC)-Phe-OMe   HCI    werden in 3000 ml Pyridin gelöst. Bei etwa +50 werden 122 ml Triäthylamin zugegeben und anschliessend eine Lösung von 207 g Tritylchlorid in 1000 ml Pyridin während
15 Minuten zugetropft. Nach Beendigung der Zugabe wird von Zeit zu Zeit das pH geprüft und nötigenfalls mit Triäthylamin auf etwa pH 9 gestellt. Das Ganze wird nach ungefähr 24 Stunden eingedampft, der Rückstand in Chloroform und Wasser aufgenommen und unter Zugabe von wenig in Salzsäure auf pH 4 gestellt. Man trennt die Chloroformphase ab, wäscht sie zweimal mit Wasser, trocknet über Natriumsulfat und dampft vollständig ein.

  Der Rückstand wird in wenig   Äther    gelöst, mit Petroläther gefällt und anschliessend abfiltriert, wobei Trt-His(Trt)-Lys(BOC)-Phe-OMe erhalten wird. [a]   D    =   -260    in Dimethylformamid.



  f)   Trt-His(Trt)-Lys(BoC)-Phe-NH-NH-   
134 g Trt-His(Trt)-Lys(BOC)-Phe-OMe werden in 1000 ml Methanol gelöst und mit 60 ml Hydrazinhydrat versetzt. Danach wird 2 Tage bei Zimmertemperatur stehengelassen. Man dampft ein, löst den   Rück-    stand in einem Gemisch von Essigester/n-Butanol   (9: 1)    und wäscht zweimal mit Wasser. Die organische Phase wird über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft.



  Hierauf wird der Rückstand mit   Äther    gewaschen und abfiltriert. Er besteht aus Trt-His(Trt)-Lys(BOC)-Phe NH-NH2 vom Smp. 1250 mit Zers.,   [&alpha;]20D C = + 10     in Dimethylformamid.



  Teilsequenz D : I-(L-Asparaginyl
L-leucyl-L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenyl alanin)-2-benzyloxycarbonyl-hydrazid.Triffuor acetat   (H-Asn-Leu-Asn-Asn-Plze-NH-NHZ      Tri-       Jluoracetat)    a) 1-(N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-phenylalanin)    2-benzyloxycarbonyi-hydrazid     (BOC-Phe-NH-NH-Z)
Man löst 72 g BOC-Phe-OH und 28 g N-Methylmorpholin in 500 ml Methylenchlorid auf und tropft bei   -5     26 ml Chlorameisensäuremethylester zu. Nach 10 Minuten gibt man noch 44 g   ZNHNH,    in 100 ml Methylenchlorid zu und rührt 4 Stunden bei Zimmertemperatur weiter. Nach Auswaschen mit verdünnter Phosphorigersäure wird getrocknet und eingedampft.



  Nach Kristallisieren aus Petroläther erhält man BOC Phe-NH-NH-Z vom Smp.   1170,      [cc]D    =-5  in Dimethylformamid.



  b) I-(N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-asparaginyl
L-phenylalanin)-2-benzyloxycarbonyl-hydrazid  (BOC-Asn-Phe-NH-NH-Z)
Man löst 41 g BOC-Phe-NHNH-Z in 400   ml    Trifluoressigsäure und lässt eine Stunde bei 200 stehen.



  Beim Verdampfen der Trifluoressigsäure erhält man das H-Phe-NHNH-Z als kristallines Trifluoracetat vom Smp.   1910,      [ai20 = + 26,40    in Dimethylformamid.



  Diese Substanzwirdzusammen   mit 35 g BOC-Asn-ONP    und 30 g N-Methylmorpholin in 200 ml Dimethylformamid gelöst. Nach 16 Stunden Stehen bei 200 wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand nacheinander mit Essigester und verdünnter Phosphorigersäure gewaschen. Man erhält BOC-Asn-Phe-NH-NH-Z vom Smp.   2100,    [a]   2r0      = - 180    in Dimethylformamid.

 

  c) 1-(N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-asparaginyl
L-asparaginyl-L-phenylalanin)-2-benzyloxycarb onyl-hydrazid (BOC-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z)
Man löst 26 g BOC-Asn-Phe-NH-NH-Z in 200 ml Trifluoressigsäure auf und lässt 1 Stunde bei 200 stehen.



  Nach Verdampfen des Lösungsmittels versetzt man in
100 ml Dimethylformamid mit 17 g BOC-Asn-ONP und 15 g N-Methylmorpholin. Nach 16 Stunden bei
200 wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand nacheinander mit Essigester und verdünnter Phosphorigersäure gewaschen. Man erhält BOC-Asn-Asn Phe-NH-NH-Z, Smp.   2400,    [a]   b0 = 280    in Dimethylformamid.  



  d) 1-(N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-leucyl-L-asparaginyl    L-asparaginyl-L-phenylalanin)-2    -benzyloxycarb onyl-hydrazid   (B OC-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z)   
Man löst 22 g BOC-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z in 150 ml Trifluoressigsäure und lässt 1 Stunde bei 200 stehen. Nach Verdampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand mit 12 g BOC-Leu-ONP und 10 g N-Methylmorpholin in 100 ml Dimethylformamid versetzt.



  Nach 16 Stunden Stehenlassen bei 200 wird das Dimethylformamid verdampft und der Rückstand nacheinander mit Essigester und verdünnter Phosphorigersäure gewaschen. Man erhält BOC-Leu-Asn-Asn-Phe    NH-NH-Z vom Smp. 210 , [a]22D -- 34  in Dimethylformamid.   



  c) 1-(N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L leucyl-L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenylalanin)    2-benzytoxycarbonyl-hydrazid    (BOC-Asn-Leu-Asn
Asn-Phe-NH-NH-Z)
Man löst 57 g BOC-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z in 300   ml    Trifluoressigsäure und lässt eine Stunde bei 200 stehen. Nach Verdampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand in Äther kristallisiert. Man löst das Tetrapeptid-trifluoracetat in 400 ml Dimethylformamid und versetzt die Lösung mit 27 g BOC-Asn-ONP und 25 g N-Methylmorpholin. Nach 16 Stunden Stehenlassen bei 200 wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand nacheinander mit Essigester und verdünnter Phosphorigersäure gewaschen. Man erhält BOC-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z vom Smp. 2500   (Zers.), [a] 20 = - 340 in Dimethylformamid.   



  f) 1-(L-Asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl-L asparaginyl-L-phenylalanin)-2-benzyloxycarbonyl    hydrazid       trifluoracetat    (H-Asn-Leu-Asn-Asn
Phe-NH-NH-Z   Trifluoracetat)   
Man löst 43,5 g   BOC-Äsn-Leu-Asn-Phe-NH-NH-Z    in 200 ml Trifluoressigsäure und lässt eine Stunde bei 200 stehen. Nach Eindampfen wird der Rückstand mit Hilfe von Äther kristallisiert. Man erhält H-Asn Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z   Trifluoracetat,    Smp.   2420,    [a]   20    = - 220 in Dimethylformamid.



  Teilsequenz E: Trityl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl
L-tryptophanyl-L-arginin-hydrazid (Trt-Ser
Ala-Tyr-Trp-Arg-NHNH2) a) tert.-Butylaxycarbonyl-L-tryptophanyl-(guanido)N    nitro-L-argininmethylester    (BOC-Trp    Arg(NO.,)-OMe)   
Man löst 35 g   H-Arg(NO2)-OMe- HCl,    63 g   BOC-Trp-OCP'und    14 g N-Methylmorpholin in 300 ml Dimethylformamid auf und lässt 16 Stunden bei 200 stehen. Nach Verdampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand in Essigester aufgenommen und mit verdünnter Schwefelsäure gewaschen. Man engt etwas ein und fällt mit Äther aus. Dabei kristallisiert BOC-Trp-Arg(NO2)-OMe vom    Smp. 1300, [1 II,O D =220    in Dimethylformamid.



  b)   N-tert.-Butylaxycarbonyl-L-tyrosyl-L-tryptophanyl-     (guanido)N-nitro-argininmethylester (BOC-Tyr
Trp-Arg (NO2)-OMe)
Man löst 15 g   BOC-Trp-Arg(NO,)-OMe    in 80 ml 5n methanolischer Salzsäurelösung auf und lässt 1 Stunde bei Zimmertemperatur stehen. Nach Verdampfen des Lösungsmittels und Behandeln mit   seither    verbleiben
13 g H-Trp-ArgNO2)-OMe als Hydrochlorid zurück;
Sp. 120 , [a]20D = -9  in Dimethylformamid. Dieser Dipeptid wird zusammen mit 14 g BOC-Tyr-OCP und 8 g N-Methylmorpholin in 200 ml Dimethylformamid gelöst. Nach 16 Stunden Stehen bei 200 wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand in Essigester aufgenommen.

  Nach Waschen mit verdünnter Phosphorigersäure und Einengen des Lösungsmittels kann man mit Hilfe von Äther BOC-Tyr-Trp   Arg(NO,)-OMe    isolieren; Smp.   1300,      [r±] D - 110    in Dimethylformamid.



  c) tert.-Buytloxycarbonyl-L-alanyl-L-tyrosul-L tryptophanyl-(guanido)N-nitro-L-argininmethyl ester (BOC-Ala-Thr-Trp-Arg (NO2)-OMe)
Man löst 13,5 g   BOC-Tyr-Trp-Arg(NOs)-OMe    in 130 ml 5n methanolischer Salzsäurelösung auf, lässt
1 Stunde bei 250 stehen, dampft zur Trockne ein, wäscht den Rückstand mit Dimethyläther, filtriert ab, löst in 100 ml Dimethylformamid auf und versetzt mit 8,0 g BOC-Ala-OCP und 3,0 ml Triäthylamin. Nach
16 Stunden bei 250 ergibt man 500 ml Essigester hinzu, wäscht mit verdünnter Schwefelsäure und Ka   llumbicarbonatlösung    und dampft zur Trockne ein.



  Nach Waschen des Rückstandes mit Chloroform erhält man   BOC-Ala-Tyr-TrpArg(NO;)-OMe    vom
Smp. 1200 (Zers.),   [ai20      = - 120    in Dimethylformamid.



  d) tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-L tyrosyl-L-tryptophanyl-(guanido)N-nitro-L    argininme thlyester    (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp
Arg(NO2)-OMe)
Man löst 12,3 g   BOC-Ala-Tyr-TrpArg(NO-)-OMe    in 100 ml 5n methanolischer Salzsäure, lässt 1 Stunde bei 250 stehen, dampft zur Trockne ein, wäscht den Rückstand mit Diäthyläther, löst ihn in 100 ml Di   methyllormamid,    versetzt mit 14 ml Triäthylamin und 8,5 g BOC-Ser-Ns, lässt 16 Stunden bei   0     stehen, gibt 500 ml Essigester zu, wäscht nacheinander mit verdünnter Schwefelsäure und Ammoniumhydroxid, trocknet über Natriumsulfat und dampft das Lösungsmittel ab. Nach Waschen des Rückstandes mit Chloroform löst man ihn in Essigester und fällt durch Zugabe von Diäthyläther.

  Man erhält 13,5 g BOC-Ser Als-Tyr-Trp-Arg(NO2)-Ome; Smp. 1350 (Zers.), [a] 2D0 =   - 150    in Dimethylformamid.



  e) Trityl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosul-L-tryptophanyl    L-arginin      hydrazid    (Trt-Ser-Ala-Tyr-Trp    Arg-NHNH7)   
Man löst 13,2 g von dem obigen Pentapeptidester in 300 ml Essigsäure, gibt 60 ml Wasser und 13,2 g Palladium-Kohle (10 % ig) zu und hydriert bis zum Ende der Wasserstoffaufnahme. Man filtriert, dampft ab, löst den Rückstand in Dimethylformamid auf, dampft wiederum ab, um die Spuren von Essigsäure zu beseitigen. Anschliessend löst man den Rückstand in 250   ml    5n methanolischer Salzsäure, lässt 1 Stunde bei 250 stehen, dampft ab, löst in Methanol, dampft ab und löst in 250 ml Pyridin auf. Danach gibt man
10 ml Triäthylamin zu, kühlt auf 00, gibt 9,5 g Triphenylchlormethan zu und lässt 16 Stunden bei   0     stehen. 

  Man dampft zur Trockne ein, löst in Essigester und wäscht mit einer 5 % igen NaCl-Lösung.



  Man trocknet, dampft ab, wäscht den Rückstand mit einem Gemisch von Diäthyläther-Petroläther (2:1)  und löst in 260 ml Methanol, versetzt mit 26 ml Hydrazinhydrat und lässt 16 Stunden bei 400 stehen. Man dampft ab, wäscht den Rückstand bis zur   Neutralität    mit Wasser und trocknet im Hochvakuum über Schwefelsäure. Man erhält Trt-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-NHNH,   Smp. 1530, [a] D <  >  20D = = 60 in Dimethylformamid.   



  Teilsequenz Fl:L-Threonyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L    valyl-L-leucinmethylester hydrobromid  (H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe HB HBr)    a) H-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe.HBr
Man löst 21,0 g Z-Cys(Bzl)-OCP und 12,3 g H Val-Leu-OMe HC1 in 120 ml Dimethylformamid. Danach gibt man 5,9 ml Triäthylamin hinzu, lässt 16 Stunden bei 250 stehen, fügt Essigester hinzu, wäscht mit verdünnter Salzsäure, trocknet über Natriumsulfat, dampft zur Trockne ab und kristallisiert den Rückstand aus Essigsäureäthylester/Diäthyläther. Man erhält Z Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe, Smp.   1600,      [a]      =    =   -280    in Dimethylformamid, das man in 210 ml einer 40   %    igen Lösung von Bromwasserstoff in Eisessig löst.

  Man lässt 1 Stunde bei 250 stehen, dampft zur   Trockne    ein und kristallisiert den Rückstand aus Isopropanol/Di äthyläther um. Man erhält H-Cys(Bzl)-Val-Leu   OMe. HBr,    Smp.   1680,    [a]   D0      = + 140    in Dimethylformamid.



  b)   H-Thr-Cys(BzlXVal-Leu-OMe      HBr   
Man löst 20 g   ZThr-NHNH    in 350 ml Dimethylformamid, kühlt auf   - 200,    gibt 100 ml einer Lösung von 2n Salzsäure in Dioxan und anschliessend noch 10 ml tert.-Butylnitrit zu. Nach 10 Minuten bei - -20  werden 45 ml Triäthylamin und 25,5 g H-Cys(Bzl) Val-Leu-OMe   HBr    hinzugefügt und das erhaltene Gemisch während 16 Stunden bei   0     geschüttelt. Man dampft zur Trockne ein, löst den Rückstand in einem Gemisch von Essigsäureäthylester/Wasser, wäscht die organische Phase mit verdünnter Salzsäure, trocknet über Natriumsulfat, dampft ein und kristallisiert den Rückstand aus Essigester um. Man erhält.

  Z-Thr Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe, Smp.   2080,      [aJ      D      = 270    in Dimethylformamid.



   Man löst 20 g von dem oben erhaltenen Tetrapeptid in 200 ml eines Gemisches von   Trifluoressigsäure/Essig-    ester (1:1) auf, leitet während 1 Stunde bei   0     einen Strom gasförmigen Bromwasserstoffs ein, dampft anschliessend ein und kristallisiert den Rückstand aus Methanol/Diäthyläther um. Man erhält H-Thr-Cys(Bzl)- Val-Leu-OMe.1,3 HBr, Smp. 202 . [a]20D = -10  in Dimethylformamid.



  Teilsequenz F2: S-Benzyl-ss-mercaptopropionyl-L seryl-L-asparaginyl-L-leucyl-L-serin-hydrazid    (MCP(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser-NH-NH)    a)   H-Asn-Leu-Ser-OMe       HCI   
Man löst 43 g   H-Leu-Ser-OMe HCl    und 53 g BOC-Asn-ONP in 400 ml Dimethylformamid auf, gibt 22 ml Triäthylamin zu, lässt 16 Stunden bei 250 stehen, dampft zur Trockne ein und kristallisiert den Rückstand aus Methanol um. Man erhält 51,6 g BOC-Asn-Leu Ser-OMe, Smp.   1900      [aJ 20    = -24  in Dimethylformamid, das man in 500 ml einer 4n Lösung von Salzsäure in Methanol löst. Man lässt 1 Stunde bei 250 stehen, dampft zur Trockne ein, löst den Rückstand in Methanol und fällt mit Diäthyläther.

  Man erhält H   Asn-Leu-Ser-OMe      HCl,    Smp.   1800,      [a] D0      = - 230    in Dimethylformamid.



  b) H-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe    HCI   
Man löst 39,5 g   BOC-Ser-NHNH2    in 500 ml Dimethylformamid, kühlt auf   - 200,    gibt 200 ml einer 2n Lösung von Salzsäure in Dioxan und anschliessend 20 ml tert.-Butylnitrit zu. Nach 10 Minuten bei   - 200    werden 40 ml Triäthylamin und 38,0 g H-Asn-Leu-Ser OMe hinzugefügt, danach 16 Stunden bei   0     gerührt, zur Trockne eingedampft und der Rückstand aus Chloroform/Diäthyläther umkristallisiert. Man erhält BOC-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe, Smp. 135 , [a]20D = -22  in Dimethylformamid, das man in 420 ml einer 4n Salzsäurelösung in Methanol löst. Man lässt 1 Stunde bei 250 stehen, dampft zur Trockne ein und kristallisiert aus Methanol/Essigsäureäthylester um.

  Man erhält H-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe    HCI,    Smp. 1550 (Zers.), [a] 20D = - 150 in Dimethylformamid.



  c) MCP(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser-NH-NH2
Man löst 18,5 g H-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe.TCl und 13,5 g MCP(Bzl)-ONP in 100 ml Dimethylformamid auf, gibt 10 ml   Wasser, .3,5    ml Essigsäure und 5,6 ml Triäthylamin zu, lässt 16 Stunden bei 250 stehen, dampft zur Trockne ein und kristallisiert aus Äthanol um. Man erhält 21,3 g MCP(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser OMe, Smp.   1930,      [a]9D    = -18  in Dimethylformamid, das man unter leichtem Erwärmen in 200 ml Dimethylformamid löst. Man gibt 200 ml Methanol und 20 ml Hydrazinhydrat zu, lässt 16 Stunden bei 300 stehen, fällt mit Diäthyläther, wäscht den Niederschlag mit Diäthyläther/Methanol (1 : 1) und trocknet das so erhaltene MCP(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser-NH-NH2,
Smp.   2510    [a]   2D    = -16  in Dimethylformamid.



  Teilsequenz F:ss-Mercaptopropionyl-L-seryl-Lasparaginyl-L-leucyl-L-seryl-L-threonyl-L hemicystinyl-L-valyl-L-leucin-hydrazid (MCP-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Len-NHNH2)
Man löst 16,2 g MCP(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser NH-NH2 (Teilsequenz F2) in 150 ml Dimethylformamid, kühlt auf - 200, gibt 40 ml einer 2n Lösung von Salzsäure in Dioxan und 14 ml tert.-Butylnitrit zu.



  Nach 10 Minuten bei   200    gibt man noch 28 ml Triäthylamin und 24,8 g H-Thr-Cys(Bzl)-Val Leu   OMe 1,3    HBr zu und rührt 16 Stunden bei 250.



  Danach wird filtriert, die. Lösung abgedampft und der Rückstand mit heissem Methanol durchgewaschen. Man erhält 24,1 g MCP(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys(Bzl) Val-Leu-OMe, Smp.   2440,    [a]20D = -22  in Dimethylformamid, das man bei 600 in 100 ml Dimethylformamid löst, gibt 10 ml Hydrazinhydrat zu und lässt 2 Stunden bei 600 stehen. Das entstandene Nonapeptidhydrazid kristallisiert aus. Man wäscht mit Diäthyl äther, Wasser und Methanol und trocknet im Hochvakuum über Phosphorpentoxid. Man erhält 15,1 g Nonapeptidhydrazid, Smp. 265,   Tnl    20D = -35  in Dimethylformamid/Wasser   (3 :1).    Man suspendiert das erhaltene Produkt in 5000 ml getrocknetem Ammoniak, gibt unter Rühren und Sieden des Ammoniaks Natriummetall bis zur tiefblauen Färbung zu. 

  Zwecks Entfärbung wird Ammoniumchlorid hinzugefügt und danach ein Luftstrom bis zur negativen Nitroprussiatreaktion durch die Lösung geleitet. Man dampft zur Trockne ab und wäscht den Rückstand mit Wasser und Aceton durch. Nach Trocknen erhält man MCP-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-NYHNH2,   Smp. 278 , [a]20D = -19  in Dimethylformamid/Wasser (3 : 1).



  Teilsequenz ABC:   L-Histidyl-E-tert.-butyloxycarb-    onyl-L-lysyl-L-phenylalanyl-L-seryl-glycyl-L methionyl-glycyl-L-phenylalanyl-glycyl-L-prolyl
L-glutarnyl-L-threonyl-L-prolinamid . 3 Acetat  (H-His-Lys(BOC)-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly
Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 . 3 CHCO2H).



  a) L-Seryl-glycl-L-methionyl-glycyl-L-phenylalanyl glycyl-L-prolyl-L-glutamyl-L-threonyl-L-prolin amid . Hydrochorid (H-Ser-Gly-Met-Gly-Phe
Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 . (CHl)
Man löst 6,7 g BOC-Ser-Gly-Met-Gly-OH (Teilsequenz B), 12 g H-Phe-Gly-Pro-Glu(OTB)-Thr-Pro NH2 (Teilsequenz A) in 50 ml Dimethylformamid und 20 ml Acetonitril auf, kühlt auf 00, gibt 4 g Dicyclohexylcarbodiimid hinzu und lässt 16 Stunden bei   0     stehen.



  Man dampft das Lösungsmittel ab, wäscht den Rückstand mit Wasser, Diäthyläther und Essigester und kristallisiert aus Chloroform um. Man erhält    BOC-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu(OTB)   
Thr-Pro-NHo,
Samp. 121  (Zers.) [a]20D = -47  in Dimethylformamid, das man in 250 ml einer Lösung von 8n Chlorwasserstoff in Dioxan löst. Man rührt während 2 Stunden bei 250, dampft zur Trockne ein und verarbeitet den Rückstand in Diäthyläther. Man erhält    H-Ser-Gly-Met-Gly-Phe- Gly-Pro-Glu-Thr-   
Pro-NH3 . HCl, Smp. 1300 (Zers.), [a] 20D = -48  in Dimethylformamid.



  b)   L-Histidyl-#-tert.-butoxycarbonyl-L-lysyl-L-    phenylalanyl-L-seryl-glycyl-L-methionyl-glycyl
L-phenylalanyl-glycyl-L-propyl-L-glutamyl-L threonyl-L-prolinamid . triacetat (H.His
Lys(BOC)-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro
Glu-Thr-Pro-NH2 . 3 CH3COOH)
Man löst 9,9 g Trt-His(Trt)-Lys(BOC)-Phe-NH   NH    (Teilsequenz C) in 100 ml Dimethylformamid, kühlt auf - 200, gibt 15 ml   Dioxan/HCl    2n und anschliessend 1,16 ml tert.-Butylnitrit zu, rührt 10 Minuten bei - 200, gibt 28 ml Triäthylamin und
10 g H-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu
Thr-Pro-NH2 . HCl zu, rührt 4 Stunden bei 00, filtriert und dampft zur Trockne ein.

  Man löst den Rückstand in einem Gemisch von Essigester/Methanol   (8 : 2)    auf, wäscht mit verdünntem Ammoniak und anschliessend mit Wasser bis zur Neutralität, trocknet über Natriumsulfat, konzentriert auf 100 ml und fällt durch Zugabe von Di äthyläther. Man löst den Niederschlag wiederum in Dimethylformamid auf und fällt durch Zugabe von Diäthyläther. Man erhält   
Trt-His (Trt)-Lys(B OC) -Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-
G1y-PrGlu-Thr-Pro-NH2.,    Smp. 1500 (Zers.), [a] 20D = - 48  in Dimethylformamid, das man in 500 ml Essigsäure/Wasser   (8 : 2)    löst. Man lässt 3 Stunden bei 400 stehen, dampft ein, wäscht den Rückstand in Diäthyläther und trocknet im Hochvakuum über KOH-Späne.

  Man erhält
H-Hls-Lys(BOC)-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly
Pro-Glu-Thr-Pro-NY2 . 3 CH3COOOH, Smp. 2010 (Zers.), [al   2D      = - 530    in Dimethylformamid.



  Teilsequenz DE : Trityl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl
L-tryptophanyl-L-arginyl-L-asparaginyl-L leucyl-L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenyl alanin-hydrazid . diazetat (Trt-Ser-Ala-Tyr    Trp-Arg-Asn=Leu-Asn-Asn-Phe-   
NHNH2 . 2   CH3COOH)    a) 1-(N-Trityl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosul-L-trypto phanyl-L-arginyl-L-asparaginyl-L-leucyl-L asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenylalanyl)-2    benzyloxycarbonyi-hydrazid diace tat (Trt-Ser
Ala-Tyr-TrpiArg-Asn-Leu-Asn-AsIlr-Phe-   
NH-NH-Z    diacetat)   
Man kühlt 320 ml Dimethylformamid auf - 200 C, gibt 100 ml 2n Chlorwasserstoff in Dioxan zu und löst darin
72 g Trt-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-NHNH2 . Acetat  (Teilsequenz E).



  Anschliessend versetzt man mit 12 ml tert.-Butylnitrit, lässt 10 Minuten bei   - 200    rühren und tropft 35 ml Triäthylamin zu. Das so erhaltene Gemisch wird mit einer Lösung, entstanden aus 8,8 g BOCAsn-Leu-Asn Asn-Phe-NHNH-Z   Trifluoracetat    (Teilsequenz D) und 17 ml Triäthylamin in 150 ml Dimethylformamid vereinigt. Nach 16 Stunden bei   0     wird eingedampft. Man löst den Rückstand in Essigester und wäscht mit verdünnter Essigsäure und Sodalösung. Nach Eindampfen des Lösungsmittels verbleibt das
Trt-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe
NHNH-Z    2      CHsCOOH    vom Smp.   1680,       [a] 20    =   190    in Dimethylformamid.



  b) Trityl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl-L-tryptophanyl
L-arginyl-L-asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl
L-asparagtnyl-L-phenylalanin-hydrazid . Diacetat  (Trt-Ser-Ala-Thr-Trp-Arg-Asn-Len-Asn-Asn-Phe
NHNH2 . 2 CH3COOH)
Man löst 90 g Trt-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu Asn-Asn-Phe-NHNH-Z in 500 ml Dimethylformamid und hydriert mit 10 g Pd/C (10 % ig) bis zum Ende der Wasserstoffaufnahme. Nach Abfiltrieren des Katalysators wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand aus einem Gemisch von Äther und Äthanol, enthaltend 1   %      Essigsäure,    kristallisiert. Man erhält
Trt-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe
NHNH2 . 2 CH3COOH vom Smp.   2150    [a] 20D = - 53  in Dimethylformamid.



  Teilsequenz ABCDE:   L-Servl-L-alanyi-L-tvrosyl-L-    tryptophanyl-L-arginyl-L-asparaginyl-L-leucyl-L asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenylalanyl-L    histidyl-#-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-    phenyl-alanyl-L-seryl-glycyl-L-methionyl-glycyl
L-phenylalanyl-glycyl-L-prolyl-L-glutamyl-L    threonyl-L-prolinam?d Hexaacetat (H-Ser-AlaF   
Try-Trp-Arg-Asnh-Leu-Asn-Asn-Phe-His
Lys(BOC)-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro    Glu-Thr-Pro-NH2    . 6   CH3CO2H)     
Man löst 15,8 g   TrtSer-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-    Asn-Asn-Phe-NHNH2 .

  Diacetat (Teilsequenz DE) in 200 ml Dimethylformamid, kühlt auf -   200,    gibt 15 ml   Dioxan/HCl    2n und anschliessend 1,16 ml tert.-Butylnitrit zu und rührt 10 Minuten bei   -200.    Man gibt 14 ml Triäthylamin und eine Lösung von 18,9 g des in Teilsequenz ABC erhaltenen Tridecapeptidacetats in Dimethylformamid zu, rührt das erhaltene Gemisch 16 Stunden bei 00, filtriert und dampft zur Trockne ein. Man wäscht den Rückstand mit Diäthyläther und Chloroform, löst in Dioxan/Wasser   (8 : 2),    behandelt die erhaltene Lösung mit 100 ml   Amberlit-IRAI0    (Acetat-Form), dampft ein und kristallisiert den Rückstand aus Isopropanol/Wasser um. Man erhält das
Trt-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Len-Asn-Asn-Phe
His-Lys(BOC)-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly
Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 .

  Acetat, Smp. 1280   (Zers)      [a] 2D =-4()     in Dimethylformamid, das man unter Stickstoffatmosphäre in 500 ml 80%iger Essigsäure löst. Man lässt 1 Stunde bei 450 stehen, konzentriert auf 100 ml und fällt durch Zugabe von 1000 ml Diäthyläther. Man filtriert, löst den Rückstand in Dimethylformamid und fällt mit Diäthyl äther. Nach Trocknen über KOH-Späne erhält man das
H-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe    His-Lys(B OC)-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-       Pro-Glu-Thr-Pro-NHe      6    CH3CO2H, Smp. 1300 (Zers.),   [a]      20    = - 48  in Essigsäure.



  Beispiel: ss-Mercaptopropionyl-L-seryl-L-asparaginyl
L-leucyl-L-seryl-L-threonyl-L-hemicystinyl-L valyl-L-leucyl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosul-L tryptophanyl-L-arginyl-L-asparaginyl-L-leucyl-L asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenylalanyl-L    histidyl-L-lysyl-L- phenylalanyl-L-seryl -glycyl-L-    methionyl-glycyl-L-phenylanyl-glycyl-L-prolyl
L-glutamyl-L-threonyl-L-prolinamid . penta acetat Hydrat
EMI8.1     


<tb>   (MCPSer-Asn-LeuSer-Thr-Cys-Val-Leu-Ser-A    <SEP> 
<tb> Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Lys-Phe
<tb> Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2.
<tb>



  penta <SEP> Acetat <SEP>    Hydrat)    <SEP> 
<tb> 
Man löst 1,05 g Nonapeptid-Hydrazid (Teilsequenz F) in einem Gemisch von 50 ml Dimethylformamid und 1,2 ml 2n Dioxan/HCl bei 200. Man gibt 0,116 ml tert.-Butylnitrit zu, rührt 10 Minuten   bei - -200, gibt 1,4 ml Triäthylamin und 3,1 g Tri-    cosapeptid-Acetat (Teilsequenz ABCDE) und 5 ml Wasser zu und rührt 16 Stunden bei 00. Man dampft zur Trockne ein, wäscht den Rückstand mit Diäthyl äther, Chloroform und Aceton, löst in Trifluoressigsäure, lässt 1 Stunde bei 250 stehen, dampft ab und wäscht mit Essigester. So erhält man das rohe Dotriacontapeptid, das man in 100 ml 0,3n Essigsäure löst, mit 20 ml Amberlit-IRA-410 (Acetat) behandelt und anschliessend 50 ml 0,6n Ammoniumhydroxid hinzugibt.

  Man stellt das pH auf 6,5 ein und schichtet die erhaltene Lösung auf eine Carboxymethylcellulosesäule (10 x 100 cm), die mit einer 0,15n Ammoniumacetatpuffer-Lösung equilibriert wurde. Die Elution wird mit einem steigenden Konzentrations- und pH-Gradient (0,15n auf 0,4n; pH 6,5 auf pH 7,0) eines Ammoniumacetatpuffers durchgeführt. Die vereinigten Fraktionen, die das reine Peptid enthalten, werden dreimal gefriergetrocknet, der Rückstand mit   Athanol    und anschliessend mit Diäthyläther gewaschen und über Kaliumhydroxid im Hochvakuum getrocknet. Man erhält
EMI8.2     


<tb> (MCP-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Ser-Ala
<tb> Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Lys-Phe
<tb> Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 <SEP> .
<tb>

 

  5 <SEP>    CHssCO;,H    <SEP> 8 <SEP>    H2O,    <SEP> 
<tb>  Smp. 2300 (Zers.), [a]   D    = -61  in Essigsäure In Aminosäurezusammensetzung nach Säurehydrolyse (6n, 16 Std.):
Ala1,1, Arg1,0, Asn3,9, Cys/20,8,Glu1,2, $Gly3,02, His1,1, Leu2,0, Lys0,9, Met1,0, Phe3,0, Pro2,1, Ser3,8 Thr1,9, Thr1,0,   Val0,0    (Trp 1,0 durch Spektrophotometrie).

Claims (1)

  1. PATENTANSPRÜCHE
    I. Verfahren zur Herstellung eines bisher unbekannten Polypeptidderivates der Formel EMI8.3 <tb> <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> 9 <tb> MCP-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cyc-Val-Leu-Ser <tb> <SEP> 10 <SEP> 11 <SEP> 12 <SEP> 13 <SEP> 14 <SEP> 15 <SEP> 16 <SEP> 17 <SEP> 18 <SEP> 19 <SEP> 20 <tb> Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His- <SEP> <tb> <SEP> 21 <SEP> 22 <SEP> 23 <SEP> 24 <SEP> 25 <SEP> 26 <SEP> 27 <SEP> 28 <SEP> 29 <SEP> 30 <SEP> 31 <tb> Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Gly-THr-Pro NH und seiner therapeutisch wirksamen Säureadditionssalze, dadurch gekennzeichnet, dass man entsprechende zu seinem Aufbau nötige Aminosäuren und Mercaptopropionsäure unter Bildung von CONH-Bindungen in beliebiger zeitlicher Reihenfolge miteinander kondensiert,
    wobei nicht an der Reaktion teilnehmende freie funktionelle Gruppen intermediär durch geeignete Schutzgruppen geschützt werden, zu einem beliebigen Zeitpunkt der Synthese die Mercaptogruppen nach Bildung der Teilsequenz 1 bis 6 und vor Einbau der eine Methionylgruppe enthaltenden Teilsequenz zum Disulfid oxydiert, die Carboxylgruppe des terminalen Prolylrestes in die Amidgruppe überführt und gegebenenfalls anschliessend die Säureadditionssalze herstellt, indem man das Polypeptidderivat der obigen Formel durch Umsetzung mit organischen oder anorganischen Säuren in die entsprechenden Salze überführt.
    II. Verwendung des nach Patentanspruch I hergestellten Polypeptidderivates der Formel EMI8.4 <tb> <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> 9 <tb> MCP-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Ser <tb> <SEP> 10 <SEP> 11 <SEP> 12 <SEP> 13 <SEP> 14 <SEP> 15 <SEP> 16 <SEP> 17 <SEP> 18 <SEP> 19 <SEP> 20 <tb> Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Lys <tb> <SEP> 21 <SEP> 22 <SEP> 23 <SEP> 24 <SEP> 25 <SEP> 26 <SEP> 27 <SEP> 28 <SEP> 29 <SEP> 30 <SEP> 31 <tb> Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro NH zur Herstellung von Schwermetallkomplexen, dadurch gekennzeichnet, dass man das Polypeptidderivat obiger Formel durch Umsetzung mit Schwermetallsalzen in die entsprechenden Schwermetallkomplexe überführt.
    UNTERANSPRUCH Verfahren zur Herstellung des neuen Polypeptidderivates nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass man aus Bzl Bzl MCP-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-NHNH die beiden Benzylreste abspaltet, die Thiolgruppen zu Disulfid oxydiert und das entstandene EMI9.1 <tb> <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 8 <tb> <SEP> MCP-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Cal-Leu <tb> NHNH2 <SEP> nach <SEP> Umwandlung <SEP> in <SEP> das <SEP> Nonapeptidazid <SEP> mit <tb> <SEP> 9 <SEP> 10 <SEP> 11 <SEP> 12 <SEP> 13 <SEP> 14 <SEP> 15 <SEP> 16 <SEP> 17 <SEP> 18 <tb> H-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe BOC 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 His-Lys-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu 30 31 Thr-Pro-NH2 kondensiert und die Schutzgruppe des geschützten Peptidderivates abspaltet.
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