Verfahren zur Herstellung eines bisher unbekannten Polypeptidderivates
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines bisher unbekannten Polypeptidderivates der Formel
EMI1.1
11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg
22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 Phe-Ser-Cly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro NH2., seiner therapeutisch wirksamen Säureadditionssalze und Schwermetallkomplexe.
Das erfindungsgemässe Polypeptidderivat zeichnet sich durch Beständigkeit gegenüber der abbauenden Wirkung von Aminopeptidasen aus.
Das bisher unbekannte Polypeptidderivat kann nach für die Synthese von Verbindungen dieser Art allgemein bekannten Methoden hergestellt werden, wobei die Aminosäuren in der, in der obigen Formel festge legten Reihenfolge einzeln oder nach vorheriger Bil- dung kleinerer Peptideinheiten miteinander verknüpft werden, indem man entsprechende zu seinem Aufbau nötige Verbindungen unter Bildung von CONH-Bindungen in beliebiger zeitlicher Reihenfolge miteinander kondensiert, wobei nicht an der Reaktion teilnehmende freie funktionelle Gruppen intermediär durch geeignete Schutzgruppen geschützt werden, zu einem beliebigen Zeitpunkt der Synthese sowohl die Schutzgruppen mit Ausnahme der BOC-Gruppe in Stellung 1 abspaltet,
als auch die Mercaptogruppen nach Bildung der Teilsequenz I bis 7 und vor Einbau der eine Methionylgruppe enthaltenden Teilsequenz zum Disulfid oxydiert sowie die Carboxylgruppe des Prolylrestes in die Amidgruppe überführt und anschliessend gegebenenfalls die Säureadditionssalze herstellt, indem man das Polypeptidderivat der obigen Formel durch Umsetzung mit organischen oder anorganischen Säuren in die entsprechenden Salze überführt.
In der letzten Stufe sind jedoch Methoden zu verwenden, bei denen Racemisierung nicht auftritt oder gering gehalten werden kann, vorzugsweise die Azid- oder die aktivierte Ester-Me thode, wobei zur Aktivierung vorzugsweise N-Hydroxy succinimid Verwendung findet. Üblicherweise werder die bei cysteinhaltigen Peptiden zum Schutz der SH Gruppen verwendeten Benzylreste am Ende der Syn these durch Behandlung mit Natrium in flüssigen Ammoniak abgespalten.
Es wurde nun gefunden, dass die Abspaltung de Benzylschutzgruppen und die Herstellung der (Cys)S S(Cys)-Bindung vor der letzten Stufe zu besonder guten Ausbeuten an Endprodukt führt.
Beim Aufbau des neuen Polypeptidderivates habe sich für die Blockierung der ,-Carboxvlgruppe, bei spielsweise in der nachstehend beschriebenen Teilse quenz A, die tert.-Butyloxygruppe bewährt, doch kön nen auch andere Schutzgruppen, wie die Methoxydie Athoxy-, die tert.-Amyloxy-, die Amid- oder di Benzyloxygruppe verwendet werden.
Für die Blockierung der imidazolgruppe des H stidinrestes in der nachstehend beschriebenen Teilse quenz C hat sich die Triphenylmethylgruppe bewähr doch können auch andere geeignete Schutzgrupper wie die Carbo-tert.-butoxy-, die Carbo-tert.-amyloxy die Carbobenzoxy- oder die Benzylgruppe verwende wcrden.
Für die Blockierung der Guanidogruppe des Arg ninrestes in der nachstehend beschriebenen Teilsequer E wurde die Nitrogruppe verwendet, doch können auc andere geeignete Schutzgruppen, wie die Tosylgrupp die p-Nitrobenzoxycarbonylgruppe oder die 2-(lsoprz pyloxycarbonyL)-3,4,5,ó-tetrachlorobenzoylgruppc ve wcndet werden. Man kann auch den Schutzeffekt d Protonisierung der Guanidogruppe bei der Synth vcrwenden.
Das neue Polypeptidderivat lässt sich auch in For seiner Salze gewinnen bzw. verwenden. Als Salze kor men solche mit organischen Säuren, wie Essigsäur Propionsäure, G lykolsäure, Milchsäure, Brenztraube säure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, F marsäure. Weinsäure, Zitronensäure, Benzoesäure, Zimtsäure. Salicylsäure, '-Phenoxv- oder 2-Acetoxy- benzoesäure, Mandelsäure, Nlcthansulfonsäure, Athansulfonsäure, Hydroxyithansulfonsäure. Benzol- oder Toluolsulfonsäure, Naphthalinsulfonsäure, Sulfanilsäure sowie polymere Säuren wie Gerbsäure,
Alginsäure, Polygalncturonsäure. Polyphloretinphosphat oder Carboxymethylcellulose und Salze mit anorganischen Säuren, wie Halogenwasserstoffsäure, z. B. Salzsäure oder Bromwasserstoffsäure. Salpetersäure, Thiocyansäure, Schwefelsäure und Phosphorsäure in Frage. Als Schwermetallkomplex kommt z. B. derjenige vom Zink- in Frage.
Die Ausgangsprodukte zur Herstellung des neuen Polypeptidderivates können, sofern sie bisher nicht bekannt waren, nach den für die Peptidchemie bekannten Methoden erhalten werden, wobei die Aminosäuren einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten miteinander verknüpft werden.
Die neue Verbindung stellt ein wichtiges therapeutisches Prinzip dar, das den Calciumpiasmaspiegel, insbesondere den erhöhten Calciumplasmaspiegel, senkt und als Antagonist des Parathormons eine positive Calciumbilanz im Knochen bewirkt.
Es ist somit induziert bei allen Zuständen, bei welchen eine Senkung des Plasmacalciumspiegels erwünscht ist, z. B. Hypercalcämien verschiedener Genese, Mangel des endogenen Thyreocalcitonins in Folge Ausfalls von Schilddrüsengewebe, Hyperfunktion der Nebenschilddrüsen.
Die neue Verbindung ist indiziert bei allen Knochenaffektionen, die auf einem vermehrten Abbau beruhen oder bei welchen eine vermehrte Calciumfixation im Knochn erwünscht ist, z.B. Osteoporose verschiedener Genese (z. B. postklimakterisch, posttraumatisch, bedingt durch Corticosteroidtherapie oder In aktivität usw.). Frakturen, Osteomalacie. Rachitis sowie insbesondere zur Kombinationstherapie mit Calciumbzw. Phosphat.
Die biologische Prüfung der neuen Verbindung ergab eine Wirksamkeit von etwa 100 bis 450 MRC-Ein heitenímg Peptid. Die erforderliche Tagesdosis (i. m.
verabreicht) in MRC-Einheiten beträgt 20 mE bis 10 E, vorzugsweise 100 mm kg Tiergewicht.
Beim Menschen beträgt die tägliche Dosis (i. m.
verabreicht) in MRC-Einheiten 1 bis 500 E. Vorzugsweise wird eine tägliche Dosis von 5 E i. m. verabreicht.
Die neue Verbindung kann als Heilmittel, z. B. in Form pharmazeutischer Präparate. Verwendung finden. Diese enthalten die genannte Verbindung in Mischung mit einem für die parenterale Applikation ge- eigneten organischen oder anorganischen Trägermaterial. Für dasselbe kommen solche Stoffe in Frage, die mit der neuen Verbindung nicht reaoieren, wie z. B. Gelatine, Milchzucker. Stärke, Magnesiumstearat.
Talk, pflanzliche Öle, Benzylalkohol. Gummi arabicum, Polynlkylenglykole, Vaseline, Cholesterin oder andere bekannte Arzneimittelträger.
Die pharmazeutischen Präparate können z. B. in flüssiger Form als Lösungen, Suspcnsionen oder Emulsionen vorliegen. Gegebenenfalls sind sie bterilisiert und bzw. oder enthalten Hilfsstoffe. wie ic l;Onscrvic- rungs-, Stabilisierungs-. Netzmittel oder Emulgiermittel.
Sie können auch noch andere, therapeutisch wertvolle Stoffe enthalten. Die neue Verbindung kann auch in Form eines Depotpräparates verabreicht werden.
Die neue Verbindung und ihre Salze können auch als Zwischenprodukte zur Herstellung von pharmazeutischen Präparaten Verwendung finden.
Es werden folgende Abkürzungen verwendet:
Es werden folgende Abkürzungen verwendet: Z = Carbobenzoxy
Bzl = Benzyl
BOC = tert.-Butyloxycarbonyl
Trt = Trityl = Triphenylmethyl
OTB = tert.-Butyloxy
ONP = p-Nitrophenylester
OCP = 2,4,5-Trichlorphenoxy
OMe = Methoxy OEt = Athoxy
NO.2 = Nitro Ser = L-Seryl
Asn = L-.Asparaginyl
Leu = L-Leucyl
Thr = L-Threonyl
Val = L-Valyl
Ala = L-Alanyl
Tyr = L-Tyrosyl
Trp = L-Tryptophanyl Arg = L-Arginyl
Phe = L-Phenylalanyl
Glu - L-Glutamyl
His = L-Histidyl
Pro = L-Prolyl
Gly = Glycyl
Met -= <RTI
ID=2.40> L-Nlethionyl
Cys = L-Cysteinyl
OSu = Oxysuccinimid
In den folgenden Beispielen. die die Ausführung des Verfahrens erläutern, den Umfang der Erfindung aber in keiner Weise einschränken sollen, erfolgen allen Temperaturangaben in Celsiusgraden.
Teilsequenz A: L-Phenylalanyl-glycyl-L-prolyl-y tert.-butyloxy-L-glutamyl-L-threonyl-L-prolinamid (H-Phe-Gly-Pro-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH27)
Man löst bei 5- 134 g Z-Tlir-NH NH. in 2 l in Salzsäure und versetzt mit 0,55 1 In Natriumnitrit.
Nach 5 Minuten wird Kaliumcarbonat bis pH 9 zugegeben, das entstandene Azid mit Äthylacetat extrahiert und eine Lösung von SO g H-Pro-NH2 . hydrochlorid in 100 ml Wasser, 500 ml Dimethylformamid und 77 ml Triäthylamin hinzugefügt. NIan verdampft das A thyl- acetat bei 20@ im Vakuum und lässt über Nacht bei 25 stehen. Die restliche Lösung wird im Vakuum verdampft, der Rückstand in Äthylacetat gelöst, die Lösung mit Wasser, verdünnter Salzsäure und einer wässrigen Kaliumcarbonatlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Man verdampft im Vakuum, löst in warmem Äthylacetat und kühlt ab. Man erhält Z-Thr-Pro-NH2; Smp. 148@, [α]D20 = - 72 in 95 % Essigsäure.
Man löst hierauf 90 g Z-Thr-Pro-NH2 in 2 1 Dioxan und 260 ml ln Salzsäure und hydriert bei 200 und Normaldruck in Gegenwart eines Palladiumkatalysators. Man filtriert, verdampft die Lösung im Vakuum, wäscht den Rückstand mit Äthylacetat und erhält H-Thr-Pro-NH2-HH2 # HCl;; Smp. 216 , [α]D20 = - 64 in 95 % Essigsäure. Dieses wird in 500 ml Dimethylformamid, 50 ml Wasser und 32 ml Triäthylamin gelöst und 118 g Z-Glu(OTB)-OCP und 800 ml Tetrahydrofuran zugegeben. Man lässt über Nacht bei 200 stehen, verdampft im Vakuum und kristallisiert den Rückstand mit Äthyläther. Man erhält Z-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2, Smp. 65 (Zers.), [α]D20 = - 18 in Dimethylformamid.
Man löst 80 g Z-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2 in 1.5 1 Dioxan und 200 ml Wasser und hydriert bei 20 und Normaldruck in Gegenwart eines Palladiumkatalysators. Die Lösung wird filtriert und im Vakuum verdampft und der Rückstand mit Diäthyläther versetzt, wobei H-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2 erhalten wird;
Smp. 65 (Zers.), [α]D20 = - 28 in Dimethylformamid.
Dieses wird in 700 ml Dimethylformamid bei 0 gelöst, 200 ml Acetonitril, 68 g Z-Phe-Gly-Pro-OH und 32 g Dicyclohexylcarbodiimid hinzugefügt, über Nacht bei 200 stehengelassen, filtriert, im Vakuum eingedampft und mit Athylacetat versetzt. Danach wäscht man die Lösung mit Wasser, verdünnter Salzsäure und wässriger Kaliumcarbonatlösung, trocknet über Natriumsulfat, verdampft im Vakuum und kristallissiert den Rückstand aus Äthylacetat Äthyläther. Man erhält Z-Phe-Gly-Pro-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2 Smp. 120 (Zers.), [α]D20 = - 66 in Dimethylformamid, das man in 1500 ml Dioxan und 300 ml Wasser löst. Man gibt 30 g Palladiumkohle (10 %) zu und hydriert bis zum Ende der Wasserstoffaufnahme. Man filtriert, dampft das Filtrat ein und kristallisiert den Rückstand aus Dioxan.
Man erhält das H-Phe-Gly-Pro-Glu(OTB) Thr-Pro-NH2; Smp. 153@. [α]D20 = - 79 in Dimethylformamid.
Teilsequenz B: N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl glycyl-L-methionyl-glycin (BOC-Ser-Gly-Met
Gly-OH) a) L-Methionyl-glycin-äthylester-hydrochlorid (H-Met-Gly-OEt. MCI)
Man löst 65 g BOC-Met-OH in 900 ml Chloroform, kühlt auf - l0w, gibt 30 ml N-Methylmorpholin und 35,6 g Chlorameisensäureisobutylester zu. Nach 10 Minuten fügt man langsam eine Lösung von 30 g Glycin-äthylester in 200 ml Chloroform hinzu und lässt bei 20 eine Stunde reagieren. Man extrahiert mit 0,5n Ammoniumhydroxid, dann mit 0,2n Schwefelsäure, wäscht mit Wasser neutral, trocknet über Natriumsulfat und engt ein. Nach Umkristallisieren aus Petroläther erhält man BOC-Met-Gly-OEt; Smp. 490, [α]D20 = - 19 in Äthanol.
Man löst es in 750 ml 4n HCl/Äthanol, lässt 1 Stunde bei 25 stehen, dampft ein, wäscht den Rückstand mit Diäthyläther und trocknet bis zur Gewichtskonstanz. Man erhält das H-Met Gly-OEt HCI in Form eines Öles.
b) N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-glycin-äthylester (BOC-Ser-Gly-OEt)
Man löst 12,5 g N-tert.-Butyloxycarbonyl-serin in 100 ml Chloroform und gibt 6,1 g N-Methylmorpholin dazu; danach tropft man 8,2 g Chlorameisensäureisobutylester hinzu. Nach 10 Minuten wird eine Lösung von 6,6 g Glycin-äthylester in 50 ml Chloroform hinzugefügt und 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt.
Das Reaktionsgemisch wird mit verdünntem Ammoniak, dann mit Salzsäurelösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und die organische Phase abgedampft. Man erhält BOC-Ser-Gly-OEt als Öl; [α]D20 = - 3 im Dimethylformamid.
c) N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-glycin-hydrazid (BOC-Ser-Gly-NHNH2)
Man löst 19,4 g BOC-Ser-Gly-OEt in 270 ml Äthylalkohol, gibt 48,6 ml Hydrazinhydrat hinzu und lässt 2 Tage bei Raumtemperatur stehen. Anschliessend dampft man die Lösung ab und kristallisiert den Rückstand aus einem Methylalkohol/Äthyläther-Gemisch (1: 3). Man erhält BOC-Ser-Gly-NHNH2, Smp. 1570, [α]D20 = - 5 in Dimethylformamid.
d) N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-glycyl-L methionyl-glycin-äthylester (BOC-Ser-Gly-Met
Gly-OEt)
Zu 200 ml Dimethylformamid werden 25 ml einer 4n Chlorwasserstofflösung in Äthyläther gegeben und darin bei - 10 11 g BOC-Ser-Gly-NHNH2 gelöst.
Anschliessend tropft man bei - 10 5,4 ml tert.-Butylnitrit hinzu, fügt der Lösung zuerst 18 ml Triäthylamin und dann eine Lösung von 12 g H-Met-Gly-OEt # HCl in 100 ml Dimethylformamid und 6,2 ml Triäthylamin bei. Es wird 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, nach 12 Stunden filtriert und eingedampft. Den Rückstand löst man in Chloroform, wäscht nacheinander mit verdünnter Ammoniak- und Salzsäurelösung, trocknet über Natriumsulfat und dampft ein. Man erhält BOC-Ser-Gly-Met-Gly-OEt, [α]D20 = - 14 in Dimethylformamid.
e) tert.-Butyloxycarbonyl-r-servl-glyovl-L-methionyl- glycin (BOC-Ser-Gly-Met-Gly-OH)
Man löst 24 g BOC-Ser-Gly-Met-Gly-OEt in 250 ml Dioxan, gibt 75 ml in Natronlauge zu, rührt 1 Stunde bei 25 , behandelt mit 150 ml Dowex-50 (H+-Form), filtriert, dampft das Filtrat ein und kristallisiert den Rückstand aus Essigester/Diäthyläther.
Man erhält BOC-Ser-Gly-Met-Gly-OH, Smp. 870 (Zers.), [a] bzw = - 170 in Dimethylformamid.
Teilsequenz C:Na,Nimid # Ditrityl-L-histidyl-L- phenylalaninhydrazid # HCl(Trt-His(Trt)-Arg Phe-NH-NHa HCl) a) Z-Arg(NO2)-Phe-OMe
51,8 g H-Phe-OMe HCl werden in 1 Liter Äther und etwa 50 ml Eiswasser gelöst und unter Rühren und Kühlen genügend Natriumcarbonat zugegeben, bis alles Wasser abgebunden ist. Man filtriert und dampft das Filtrat bis zur Gewichtskonstanz ein, wobei ein farbloses Öl erhalten wird. 67,6 g Z-Arg(NO.)-OH werden in 300 ml Acetonitril und 150 ml Dimethylformamid gelöst und mit 41,2 g H-Phe-OMe versetzt. Danach wird auf - -20 abgekühlt und eine Lösung von 43,4 g Dicyclohexylcarbodiimid in 100 ml Acetonitril zugegeben. Das Ganze lässt man uner zeitweiligem Umschütteln während 4 Stunden im Eiskasten stehen.
Der entstandene Niederschlag wird abfiltriert und das Filtrat eingedampft. Der Eindampfrückstand wird in 1 Liter Essigester gelöst und hierauf in der Kälte mit In Natronlauge, Wasser, 1 n Schwefelsäure, Wasser und gesättigter Kochsalzlösung gewaschen. Die über Natriumsulfat getrocknete Essigsäureäthylester-Phase wird vollständig eingedampft. Nach Umkristallisieren aus Essigester/Pertroläther erhält man Z-Arg(NO2)-Phe OMe; Smp. 131-133 , [α]D20 = - 7 in Methanol, -4 in Dimethylformamid.
b) H-Arg(NO2)-Phe-OMe 0,5 H20 2 12 HBr
20 g Z-Arg(NO2)-Phe-OMe werden in 50 ml Eisessig gelöst und unter leichtem Kühlen 50 ml 40 % ige Bromwasserstoffsäure in Eisessig zugesetzt. Danach lässt man das Ganze unter zeitweiligem Umschütteln während 1 Stunde bei 20 stehen. Nach vollständigem Eindampfen wird der Rückstand in 200 ml Wasser gelöst und zweimal mit Äther gewaschen. Die wässrige Phase wird vollständig eingedampft und der Rückstand aus MethanollÄther umkristallisiert. Smp. 165-167 mit Zers., [α]D20 = + 18 in Methanol, + 14 in Dimethylformamid.
c) Z-HisfZ)-Arg(NO)-Phe-OMe
46,1 g H-Arg(NO2)-Phe-OMe 0,5 HeO 1,2 HBr werden in 100 ml Wasser gelöst, hierauf erwärmt und anschliessend abgekühlt. Nach Zugabe von Chloroform und Eis wird mit Ammoniak auf pH 9 gestellt. Die Chloroformphase wird noch einmal mit Wasser gewaschen, anschliessend über Natriumcarbonat getrocknet und filtriert. Dem Filtrat wird eine Lösung von 44,5 g Z-His(Z)-OH, 12,1 g Hydroxysuccinimid in 200 ml Acetonitril und 100 ml Pyridin zugesetzt, danach das Ganze auf - -20 abgekühlt und mit einer Lösung von 21,1 g Dicyclohexylcarbodiimid in 70 ml Acetonitril versetzt. Anschliessend wird unter zeitweiliegem Rühren 4 Stunden im Eiskasten stehengelassen.
Der entstandene Niederschlag wird abfiltriert und das Filtrat eingedampft. Der Rückstand wird in Essigsäureäthylester aufgenommen und anschliessend folgendermassen gewaschen: 10 , ige Kaliumcarbonatlösung (pHx 10), Wasser, gesättigte Kochsalzlösung, Wasser, gesättigte Kochsalzlösung, Schwefelsäure (pH 3), Wasser, Kochsalzlösung. Die über Natriumsulfat getrocknete Essigsäureäthylester-Phase wird vollständig eingedampft, wobei ein hellbeiger Schaum erhalten wird.
Dieser Schaum wird je zweimal in wenig Methanol gelöst und mit Äther gefällt. Die Atherphasen werden abdekantiert und der Niederschlag getrocknet; man erhält Z-His(Z)-Arg(NO. > )-Phe-OMe (amorpher Schaum), [E] D20 = - 8 in Methanol, - 8 in Dimethylformamid.
d) H-His-Arg-Phe-OMe # 4 HCl
25 g Z-His(Z)-Arg-(NO.,)-Phe-O.Me werden in 80U ml Eisessig gelöst. Danach werden 10 g 10% Palladium auf Aktivkohle in 200 ml ln Salzsäure angerührt und in die Lösung gegeben. Das Ganze wird einer 2stündi- gen Hydrierung unterworfen und anschliessend der Katalysator abfiltriert. Das Filtrat wird erneut mit 5 5 10% Palladium auf Aktivkohle in Wasser versetzt und der Hydrierung unterworfen, die nach S¸ Stunden beendet ist. Hierbei werden etwa 80% % der theoretischen Menge Wasserstoff verbraucht. Der Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat vollständig eingedampfl, wobei H-His-Arg-PHe-OMe # 4 HCI in Form eines amorphen Schaumes erhalten wird.
e) Trt-His(Trt)-Arg-Phe-OMe. HCI
21,5 g H-His-Arg-Phe-OMe .4 HCl werden in 100 ml Pyridin und etwa 100 ml Dimethylformamid gelöst. Bei etwa +5 wird bis pH 9 Triäthylamin zugegeben und anschliessend eine Lösung von 29 g Tritylchlorid in 300 ml Pyridin während 5 Minuten zugetropft. Nach Beendigung der Zugabe wird von Zeit zu Zeit das pH geprüft und nötigenfalls wieder mit Tri äthylamin auf etwa pH 9 gestellt. Das Ganze wird nach ungefähr 4 Stunden eingedampft, der Rückstand in Chloroform und Wasser aufgenommen und unter Zugabe von wenig in Salzsäure auf pH 4 gestellt.
Man trennt die Chloroformphase ab, wäscht sie zweimal mit Wasser, trocknet über Natriumsulfat und dampft vollständig ein. Der Rückstand wird mit Äther versetzt und vom Ather anschliessend abfiltriert, wobei Trt-His(Trt)-Arg-Phe-OMe HCl erhalten wird.
f) Trt-His(Trt)-Arg-Phe-NH-NH2 # HCl
17 g Trt-His(Trt)-Arg-Phe-OMe MCI werden in 200 ml Methanol gelöst und mit 40 ml Hydrazinhydrat versetzt. Danach wird 2 Tage bei Zimmertemperatur stehengelassen. Man dampft ein, löst den Rückstand in Chloroform und wäscht zweimal mit Wasser. Die Chloroform-Phase wird über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Hierauf wird der Rückstand mit Äther gewaschen und abfiltriert: er besteht aus Trt-His(Trt)-Arg-Phe-NH-NH2#HCl; Smp. 158 [u] D - 9 in Dimethylformamid.
Teilsequen D: l -(L-A sparaginyl-L-leucyl-L-aspara- ginyl-L-asparaginyl-L-phenyl-alanin)-2-benzyl oxycarb onyi4iydruzid id rar (H-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z # CF@COOH) a) 1-(N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-phenylalanin)-2 benzytoxycarbonyi-hydraziii (BOC-Phe-NH-NH-Z)
Man löst 72 g BOC-Phe-OH und 28 g N-Methyl- morpholin in 500 ml Methylenchlorid auf und tropft bei - 5 26 ml Chlorameisensäuremethylester zu. Nach
10 Minuten gibt man noch 44 g Z-NHNH2 in 100 ml Methylenchlorid zu und rührt 4 Stunden bei Zimmertemperatur weiter. Nach Auswaschen mit verdünnter Phosphorigersäure wird getrocknet und eingedampft.
Nach Kristallisieren aus Petroläther erhält man BOG- Phe-NH-NH-Z vom Smp. 117 , [u]bi' --5- iii Dt- methylformamid.
b) 1-(N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L phenylalanin)-2-benzyloxycarbonyl-hydrazid (BOC-As-Phc-NH-NH-Z)
Man löst 41 g BOC-Phe-NHNH-Z in 400 ml Trifluoressigsäurc und lässt eine Stunde bei 20' stehen.
Beim Verdampfen der Trifluoressigsäure erhält man das H-Phe-NHNH-Z als kristallines Trifluoracetat vom Smp. 191@ ]α[D20 = - 26.40 in Dimethylformamid.
Diese Substanz wird zusammen mit 35 g BOC-Asn ONP und 30 g N-Methylmorpholin in 200 ml Dimethylformamid gelöst. Nach 16 Stunden Stehen bei 200 wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand nacheinander mit Essigester und verdünnter Phosphorigersäure gewaschen. Man erhält BOC-Asn-Phe-NH NH-Z vom Smp. 2100, [α]D20 = - 18 in Dimethylformamid.
c) 1-(N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L asparaginyl-L-phenylalanin)-2-benzyloxy carbonyl4iydrazid (B OC-A sn-A sn-Phe-NH-N H-Z)
Man löst 26 g BOC-Asn-Phe-NH-NH-Z in 200 ml Trifluoressigsäure auf und lässt 1 Stunde bei 20 stehen.
Nach Verdampfen des Lösungsmittels versetzt man in 100 ml Dimethylformamid mit 17 g BOC-Asn-ONP und 15 g N-Methylmorpholin. Nach 16 Stunden bei 200 wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand nacheinander mit Essigester und verdünnter Phosphorigersäure gewaschen. Man erhält BOC-Asn-Asn Phe-NH-NH-Z; Smp. 240C. [α]D20 = - 28 in Dimethylformamid.
d 1-(N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-leucyl-L-asparaginyl
L-asparaginyl-L-phenylalanin)-2-benzyloxy carbonyl-hydrazid (BOC-Leu-Asn-Asn-Phe-
NH-NH-Z)
Man löst 22 g BOC-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z in 150 ml Trifluoressigsäure und lässt 1 Stunde bei 200 stehen. Nach Verdampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand mit 12 g BOC-Leu-ONP und 10 g N-Methylmorpholin in 100 ml Dimethylformamid versetzt. Nach 16 Stunden Stehenlassen bei 200 wird das Dimethylformamid verdampft und der Rückstand nacheinander mit Essigester und verdünnter Phosphorigersäure gewaschen. Man erhält BOC-Leu-Asn-Asn-Phe NH-NH-Z vom Smp. 210 . [α]D22 = - 34 in Dimethylformamid.
e) 1-(N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L leucyl-L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenyl alanin)-2-benzyloxycarbonyl-hydrazid (BOC-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z)
Man löst 57 g BOC-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z in 300 ml Trifluoressigsäure und lässt eine Stunde bei 200 stehen. Nach Verdampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand in Äther kristallisiert. Man löst das Tetrapeptid-trifluoracetat in 400 ml Dimethylformamid und versetzt die Lösung mit 27 g BOC-Asn-ONP und 25 g N-Methylmorpholin. Nach 16 Stunden Stehenlassen bei 20 wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand nacheinander mit Essigester und verdünnter Phosphorigersäure gewaschen. Man erhält
BOC-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z vom Smp. 2500 (Zers.), [α]D20 D20 = - 34' in Dimethyl- formamid.
f) l -(L-A sparagitzyI-L-Ieuvi-L asparaginyl-L- asparaginyl-L-phenylalanin)-2-benzyloxy carbonyl-hydrazid # trifluoracetat (H-Asn-Leu Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z # Trifluoracetat)
Man löst 43,5 g BOC-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH- NH-Z in 200 ml Trifluorcssigsäure und lässt eine Stunde bei 200 stehen. Nach Eindampfen wird der Rückstand mit Hilfe von Ather kristallisiert. Man erhält H-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z # Trifluor- acetat; Smp. 2420, [α]D20 = - in in Dimethylformamid.
Teilsequenz E: tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L alanyl-L-tyrosyl-L-tryptophanyl-L-arginin hydrazid. acetat (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp Arg-NHNH2 # CH3COOH) a) N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-tryptophanyl (guanido)N-nitro-L-argininmethylester (BOC-Trp-Arg(NO -) -OMe)
Man löst 35 g H-Arg(NO2)-OMe # HCl, 63 g BOC Trp-OCP und 14 g N-Methylmorpholin in 300 ml Dimethylformamid auf und lässt 16 Stunden bei 200 stehen. Nach Verdampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand ih Essigester aufgenommen und mit verdünnter Schwefelsäure gewaschen. Man engt etwas ein und fällt mit Ather aus. Dabei kristallisiert
BOC-Trp-Arg(NO2)-OMe vom Smp. 130 , [α]D20 = - 22 in Dimethylformamid.
b) N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-tyrosyl-L-trypto phanyl-(guanido)N-nitro-argininmethylester (BOC-Tyr-Trp-Arg(NO.2)-OMe)
Man löst 15 g BOC-Trp-Arg(NO2)-OMe in 80 ml 5n methanolischer Salzsäurelösung auf und lässt 1 Stunde bei Zimmertemperatur stehen. Nach Verdampfen des Lösungsmittels und Behandeln mit Ather verbleiben 13 g H-Trp-Arg(NO2)-OMe als Hydrochlo- rid zurück; Smp. 1200, [α]D20 =-9 in Dimethylformamid. Dieses Dipeptid wird zusammen mit 14 v BOC Tyr-CCP und 8 g N-Methylmorpholin in 200 ml Dimethylformamid gelöst. Nach 16 Stunden Stehen bei 700 wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand in Essigester aufgenommen.
Nach Waschen mit verdünnter Phosphorigersäure und Einengen des Lösungsmittels kann man mit Hilfe von Äther BOC-Tyr-Trp-Arg(NO )-OMe isolieren: Smp. 130O, [α]D20 = - 11 in Dimethylformamid.
c) tert.-Butyloxycarbonyl-L-alanyl-L-tyrosyl-L tryptophanyl-(guanido)N-nitro-L-arginin methylester (BOC-Ala-Tyr-Trp-Arg(NO2)-OMe)
Man löst 13.5 g BOC-Tyr-Trp-Arg(NO2)-OMe in 130 ml 5n methanolischer Salzsäurelösung auf. Iässt 1 Stunde bei 25c stehen. dampft zur Trockne ein.
wäscht den Rückstand mit Dimethyläther. filtriert ab.
Iöst in 100 mi Dimethylformamid auf und versetzt mit 8,0 g BOC-Ala-OCP und 3,0 ml Triäthylamin.
Nach 16 Stunden bei 25 gibt man 500 ml Essigester hinzu, wäscht mit verdünnter Schwefelsäure und Ka liumbicarbonatlösunt und dampft zur Trockne ein.
Nach Waschen des Rückstandes mit Chloroform erhält man BOC-Ala-Tyr-Trp-Arg(NO2)-OMe; Smp. 1200 (Zers.), [a] D20 = - 125 in Dirnethylformamid.
d) tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-L tyrosyl-L-tryptophanyl-(guanido)N-nitro-L argininmethylester (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp
Arg(NO2)-OMe)
Man Iöst 12.3 g BOC-Ala-Tyr-Trp-Arg(NO2)-OMe in 100 ml 5n methanolischer Salzsäure. lässt 1 Stunde bei 25 stehen, dampft zur Trockne cin. wäscht den Rückstand mit Diäthvläther, löst ihn in @ 100 ml Di- methylformamid, versetzt mit 14 ml Triäthvlamin und 8,5 g BOC-Ser-N@. lässt 1 6 Stunden bei 0 stehen, gibt 500 ml Essigester zu. wäscht nacheinander mit verdünnter Schwefelsäure und Ammoniumhydroxid, trocknet über Natriumsulfat und dampft das Lösung mittel ab.
Nach Waschen des Rückstandes mit Chloroform löst man ihn in Essigester und fällt durch Zugabe von Diäthyläther. Man erhält 13.5 g BOC-Ser-Ala-Tyr- Trp-Arg(NO2)-OMe; Smp. 135 (Zers.), [α]D20 = - 15 in Dimethylformamid.
e) tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-L tyrosyl-L-tryptophanyl-L arginin # hydrazid # Acetat (BOC-Ser-Ala Tyr-Trp-Arg-NHNH2 # CH2COOH)
Man löst 13,2 g von dem oben erhaltenen Pentapeptidester in 300 ml Essigsäure. gibt 60 ml Wasser und 13,2 g Palladium-Kohle (10 % ig) zu und hydriert bis zum Ende der Wasserstoffaufnahme. Man filtriert, dampft ab. Iöst den Rückstand in Dimethylformamid auf, dampft wiederum ab. um die Spuren von Essigsäure zu beseitigen. Anschliessend löst man den Rückstand in 260 ml Methanol, versetzt mit 26 ml Hydrazinhydrat und lässt 16 Stunden bei 40 stehen.
Nach Zugabe von 260 ml Diäthyläther filtriert man die ausgeschiedene kristalline Masse ab. wäscht mit Diäthv!- äther und trocknet im Hochvakuum über Schwefel- säure. Man erhält
B OC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg NHNH2 # CH3COOH: Smp. 182 , [α]D20 = - 8 in Dimethylformamid.
Teilsequenz Fl: L-Threonyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L valyl-L-leucinmethylester # hydrobromid (H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Lcu-OMe # HBr) a) H-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe # HBr
Man löst 21.0 g Z-Cys(Bzl)-OCP und 12.3 g H Val-Leu-OMe HCl in 120 ml Dimethvlformamid. Danach gibt man 5.9 ml Triäthylamin hinzu lässt 16 Stunden bei 250 stehen, fügt Essigester hinzu. wäscht mit verdünnter Salzsäure. trocknet über Natriumsulfat, dampft zur Trockne ab und kristallisiert den Rückstand aus Essigsäureäthylester/Diäthyläther. Man erhält
Z-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe.
Smp. 160 . [α]D20 = - 28 in Dimethylformamid, das man in 210 ml einer 4() % igen Lösung von Brom- wasserstoff in Eisessig löst. Man lässt 1 Stunde bei 25 stehen, dampft zur Trockne ein und kristallisiert den Rückstand aus Isopropanol/Diäthyläther um. Man erhält H-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe # HBr.
Smp. 168 , [α]D20 @ + 14 in Dimethylformamid.
b) H-Th-rCys(Bzl)-Val-Leu-OMe # HBr Man löst 20 g Z-Thr-NHNH2 in 350 ml Dimethylformamid. kühlt auf -20=. gibt 100 ml einer Lö Lösung von 2n Salzsäure in Dioxan und anschliessend noch 10 ml tert.-Butylnitrit zu. Nach 10 Minuten bei -20- werden 45 ml Triäthylamin und 25.5 g H-Cys (Bzl)-Val-Leu-OMe HBr hinzugefügt und das erhaltene Gemisch während 16 Sunden bei 0 geschüttelt.
Man dampft zur Trockne ein, Iöst den Rückstand in cinem Gemisch von Essigsäureäthylester Wasser, wäscht die organische Phase mit verdünnter Salzsäure.
trocknet über Natriumsulfat. dampft ein und kristallisiert den Rückstand aus Essigester um. Man erhält
Z-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe; Smp. 208, [α]D20 = - 27 in Dimethylformamid.
Man löst 20 g von dem oben erhaltenen Tetrapeptid in 200 ml eines Gemisches von Trifluoressigsäure Essigester (1 : :1) auf. leitet während 1 Stunde bei 0 einen Strom gasförmigen Bromwasserstoffs ein. dampft anschliessend ein und kristallisiert den Rückstand aus Methanol/Diäthyläther um. Man erhält
H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe 1.3 HBr; Smp. 202 , [cr] D - 10 in Dimethylformnmid.
Teilsequenz F3: L-Threonyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L valyl-L-leucin (H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OH)
Man löst 372 g H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu- OMe HBr (Teilsequenz F1) in 1800 ml Methanol: fügt 900 ml 2n Natronlauge hinzu, lässt 1 Stunde bei 250 stehen, gibt 240 ml Eisessig zu und lässt 2 Stunden bei 0 stehen. Danach filtriert man die ausgeschiedene kristalline Masse ab, wäscht diese zuerst mit 1 n Essigsäure, anschliessend mit Wasser und trocknet bei 505 im Hochvakuum. Man erhält das
H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-Oh Smp. 219 , [α]D20 = - 53 in 1n Ammoniak.
Teilsequenz F2: tert.-Butyloxycarbonyl-S-benzyl-L cysteinyl-L-seryl-L-asparaginyl-L-leucyl-L serin-hydrazid (BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu Ser-NH-NMo) a) H-Asn-Leu-Ser-OMe # HCl
Man löst 43 g H-Leu-Ser-OMe OCl und 53 @ BOC-Asn-ONP in 400 ml Dimethylformamid auf. gibt 22 ml Triäthvlamin zu. Iässt 16 Stunden bei 250 stehen.
dampft zur Trockne ein und kristallisiert den Rückstand aus Methanol um. Man erhält 51.6 g BOC-Asn Leu-Ser-OMe. Smp. 1900. [α]D20 D20 = 242 in Dimethylformamid, das man in 500 ml einer 4n Lösung von Salzsäure in Methanol löst. Man lässt I Stunde bei 250 stehen. dampft zur Trockne ein. Iöst den Rückstand in Methanol und fällt mit Diäthvläther. Man erhält H-Asn-Leu-Ser-OMe HCI: Smp. 1800.
[α]D20 = - 23 in Dimethylformamid.
b) H-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe # HCl
Man löst 39.5 e BOC-Ser-NHNH@ in 500 ml r)imethylformamid, kühlt auf -20 . gibt 200 mi einer 2n Lösung von Salzsäure in Dioxan und anschliessend 20 ml tert-Butylnitrit zu. Nach 10 Minuten hei -20 werden 40 ml Triäthylamin und 38.0 R H- Nsn-T eu- Ser-OMe HCl hinzugefügt, danach 16 Stunden hei fl gerührt. zur Trockne eingedampft und der Riic';stand aus Chloroform /Diäthyläther umkristallisiert. Man erhält
BOC-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe.
Smp. 135 , [α]D20 = - 22 in Dimethylformamid, das man in 420 ml einer 4n Salzsäurelösung in Methanol löst. Man lässt I Stunde bei 25 stehen. dampft zur Trockne ein und kriszallisiert aus Methanol/Essigsäure- äthylester um. Man erhält
H-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe HCl, Smp. 155 (Zers.), [α]D20 = - 15 in Dimethylform- amid.
c) BOC-C-S(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser-NHNH2
Man löst 18,5 g H-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe HCI und 18,0 g BOC-Cys(Bzl)-ONP in 100 ml Dimethylformamid auf, gibt 10 ml Wasser, 3,5 ml Essigsäure und 5,6 ml Triäthylamin zu, Iässt 16 Stunden bei 250 stehen, dampft zur Trockne ein und kristallisiert aus Methanol um. Man erhält 25.1 g B OC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu Ser-OMe, Smp. 182e, [n]D - 170 in Dimethylformamid, das man unter leichtem Erwärmen in 200 ml Dimethylformamid löst. Man gibt 200 ml Methanol und 20 ml Hydrazinhydrat zu, lässt 16 Stunden bei 300 stehen, fällt mit Diäthyläther, wäscht den Niederschlag mit Diäthyläther/Methanol (1 . 1) und trocknet das so erhaltene BOC-Cys(Bzl-Ser-Asn-Leu-Ser-NHNH.., Smp.
224 , [α]D20 = - 13 in Dimethylformamid.
Teilsequenz F: tert.-Butyloxycarbonyl-L-hemicystinyl
L-asparaginyl-L-leucyl-L-seryl-L-threonyl-L hemicystinyl-L-valyl-L-leucin-hydrazid
EMI7.1
Man löst 18,4 g BOC-Cys(Bzl?-Ser-Asn-Leu-Ser- NHNH. (Teilsequenz F2) in 150 ml Dimethylform- amid. kühlt auf -203, gibt 40 ml einer 2n Lösung von Salzsäure in Dioxan und 15 ml tert.-Butylnitrit zu.
Nach 10 Minuten bei 200 gibt man noch 28 ml Triäthylamin und 24,8 g H-Thr-Cvs(Bzl)-Val-Leu OMe. 1.3 HBr (Teilsequenz Fl) zu und rührt 16 Stunden bei 250. Danach wird filtriert, die Lösung eingedampft und der Rückstand mit heissem Methanol durchgewaschen. Man erhält BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-
Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe.
Smp. 242-244 . [α]D20 = - 25 in Dimethylformamid.
das man bei 600 in 100 ml Dimethylformamid löst. Man gibt 10 ml Hydrazinhydrat zu und lässt 2 Stunden bei 600 stehen; das entstandene Nonapeptidhydrazid kristallisiert aus. Man wäscht mit Diäthvläther. Wasser und Methanol und trocknet im Hochvakuum über Phosphorpentoxid. Man erhält Nonapeptidhydrazid vom Smp. 260 (Zers.), [α]D20 = - 33 in Dimethyl formamid/Wasser (3 : 1). Man löst das erhaltene Produkt in 5000 ml getrocknetem Ammoniak, gibt unter Rühren und Sieden des Ammoniaks Natriummetall bis zur tiefblauen Färbung zu. Zwecks Entfärbung wird Ammoniumchlorid hinzugefügt und danach ein Luftstrom bis zur negativen Nitropntssiatreaktion durch die Lösung geleitet. Man dampft zur Trockne ein und wäscht den Rückstand mit Wasser durch.
Nach Trocknen erhält man
EMI7.2
Smp. 298. (Zers.), [α]D20 = - 20 in Dimethylform amidiWasser (3 :1).
Teilsequenz F4: tert.-Butyloxycarbonyl-L-hemicysti nyl-L-seryl-L-asparaginyl-L-leucyl-L-seryl-L threonyl-L-hemicystinyl-L-valyl-L-leucin
EMI7.3
Man löst 18,4 g BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser- NHNH2 (Teilsequenz F2) in 150 ml Dimethylformamid, kühlt auf - 20 , gibt 40 ml einer 2n Lösung von Salzsäure in Dioxan und 15 ml tert.-Butylnitrit zu Nach 10 Minuten bei - 200 gibt man noch 28 m Triäthylamin und 16,' g H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OH (Teilsequenz F3) zu und rührt 16 Stunden bei 25 Danach wird filtriert, die Lösung eingedampft und der Rückstand mit 1n Essigsäure durchgewaschen. Mar erhält
BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr
Cys(Bzl)-Val-Leu-OH, Smp. 217 , [α]D20 = 270 in Dimethylformamid.
Man löst das erhaltene Produkt in 5000 ml getrocknetem Ammoniak, gibt unter Rühren und Sieder des Ammoniaks Natriummetall bis zur tiefblauen Fär- bung zu. Zwecks Entfärbung wird Ammoniumchloric hinzugefügt. Man dampft zur Trockne ein und wäscht den Rückstand mit 1n Essigsäure und Aceton durch Nach Trocknen erhält man BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser.
Thr-Cys-Val-Leu-OH, Smp. 248 (Zers.), [α]D20 = - 41 in Dimethylformamid/Wasser (7 : 3).
Man löst das erhaltene Nonapeptid in 5000 m 0,01n Ammoniak auf, gibt unter Rühren in Wasser stoffperoxyd bis zur negativen Nitroprussiatreaktior hinzu, dann noch 200 ml Eisessig, filtriert und lyophi@ lisiert. Man erhält
EMI7.4
Smp. 2380 (Zers.), [α]D20 = - 18 in Dimethylform amidiWasser (7 @ 3).
Teilsequenz ABC: Nim-Trityl-L-histidyl-L-arginyl
L-phenyl-alanyl-L-seryl-glycyl-L-methionyl glycyl-L-phenylalanyl-glycyl-L-prolyl-L-glutamyl L-threonyl-L-proünarnid Tri-Acetar (H-His-(Trt)-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Pro Glu-Thr-Pro-NH2 # 3 CH3CO2H) a) L-Seryl-glycyl-L-methionyl-glycyl-L-phenylalanyl glycyl-L-prolyl-L-glutamyl-L-threonyl-L prolinamid # Hydrochlorid (H-Ser-Gly-Met
Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 # HCl)
Man löst 6,7 g BOC-Ser-Gly-Met-Gly-OH (Teil sequenz B), 12g H-Phe-Gly-Pro-Glu(OTB)-Thr-Pro NH.2 (Teilsequenz A) und 2,1 g Hydroxysuccinimi@ in 50 ml Dimethylformamid und 20 ml Acetonitril auf kühlt auf 00,
gibt 4,0 g Dicyclohexylcarbodiimid hinn und lässt 16 Stunden bei 0 stehen. Man dampft da Lösungsmittel ab, wäscht den Rückstand mit Wasser Diäthyläther und Essigester und kristallisiert aus Chlo roform um. Man erhält BOC-Ser-Gly-Met-Gly-Phe Gly-Pro-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2, Smp. 121 (Zers.) [α]D20 = - 47 in Dimethylformamid, das man i@ 250 ml einer Lösung von 8n Chlorwasserstoff ii Dioxan löst. Man rührt während 2 Stunden bei 250 dampft zur Trockne ein und verarbeitet den Rückstau in Diäthyläther. Man erhält H-Ser-Gly-Met-Glv-Phe Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 HCl Smp. 1300 (Zers.), [al D20 = - 480 in Dimethylformamid.
h) Nim-Trityl-L-histidyl-L-arginyl-L-phenylalanyl
L-seryl-glycyl-L-methionyl-glycyl-L-phenylalanyl glycyl-L-prolyl-L-glutamyl-L-threonyl-L prolinamid # Tri-Acetat(H-His(Trt)-Arg-Phe Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Giu-Thr- Pro NH2 # 3CH3COOH)
Man löst 9,9 g Trt-His(Trt)-Arg-Phe-NHNHe HC (Teilsequenz C) in 100 ml Dimethylformamid, kühl auf -20, gibt 15 ml Dioxan/HC1 2n und anschliessen
1,16 ml tert.-Butylnitrit zu, rührt I n Minuten bei -20 , gibt 28 ml Triäthylamin und ]0.0 g H-Ser-Glv- Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 zu HCI zu, rührt 4 Stunden bei 0 , filtriert und dampft zur Trocicnc ein.
Man löst den Rückstand in einem Gcmisch von Essig ester/Methanol (8: 9) auf. wäscht mit vcrdünntem Ammoniak und anschliessend mit Wasser bis zur Neutralität, trocknet über Natriumsulfat. Iionzentricrt auF
100 ml und fällt durch Zugabe von Diäthyläther.
Man löst den Niederschlag wiederum in Dimethylformamid auf und fällt durch Zugabe von Diäthvläther. Man erhält
Trt-His(Trt)-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly
Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 [Smp. 168 (Zers.), [α]D20 = - 43 in Dimethylform- arnid], das man in 500 ml EssigsäurelWasser (8: 2) löst Man lässt 3 Stunden bei 40 stehen. dampft ein, wäscht den Rückstand in Diäthyläther und trocknetim Hochvakuum über KOH-Spänen. Man erhält
H-His(Trt)-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly Pro-Glu-Thr-Pro-NH.- zu 3 CH8COOH, Smp. 182 (Zers.), [α]D20 = - 56 in Essigsäure.
Teilsequenz DE: N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L alanyl-L-tyrosyl-L-tryptophanyl-L-arginyl-L asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl-L-aspariginyl L-phenylalanin # hydrazid # diacetat (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn Asn-Phe-NHNH2 # 2 CH3(COOH) a) 1-(N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl
L-tyrosinyl-L-tryptophanyl-L-arginyl-L asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl-L asparaginyl-L - phenylalanin)- -benzyloxy carbonyl-liydrazid # diacetat (BOC-Ser-Ala-Tyr-
Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH
NH-Z @ 2 CHsCOOH)
Man kühlt 320 ml Dimethylformamid auf -20 C, gibt 100 ml 2n Chlorwasserstoff in Dioxan zu und löst darin
68 g BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp Arg-NHNH2 zu acetat (Teilsequenz E).
Anschliessend versetzt man mit 12 ml tert.-Butylnitrit, lässt 10 Minuten bei-9OS rühren und tropft 35 ml Triäthvlamin zu. Das so erhaltene Ge- misch wird mit einer Lösung, entstanden aus 8.8 g
H-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NHNH-Z # Trifluoracetat (Teilsequenz D) und 17 ml Triäthylamin in 150 ml Dimethylformamid vereinigt. Nach 16 Stunden Stehen- lassen bei 0 wird eineedampft. Man löst den Rücl;
;- stand in Essigester!Butanol und wäscht mit verdünnter Essigsäure und Ammonial.lösung. Nach Eindampfen des Lösungsmittels verbleibt das
BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn Asn-Phe-NHNH-Z # 2 CH3COOH vom Smp. 175-, [α]D20 =19,5 in Dimethylformamid.
b) tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-L tyrosinyl-L-tryptophanyl-L-arginyl-L asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl-L asparaginyl-L-phenylalanin # hydrazid # diacetat (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn
Asn-Phe-NHNH2 zu 2 CH-COOH) 'tan löst 90 g BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu- Asn-.Asn-Phe-NHNH-Z 2 CH,COOH in 500 ml Di- r.ethylforrnamid und hydriert mit 10 g PdjC (10% ig) bis zum Ende der Wasserstoffaufnahme. Nach Abfiltrieren des Katalysators wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand aus einem Gemisch von Äther und Äthanol kristallisiert. Man erhält
BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn Asn-Phe-NHNH2 # 2 CH3COOH vom Smp. 265 , [α]D20 = - 57 in Dimethylformamid.
Teilsequenz A B C D E : L-Seryl-L-alanyl-L-tyrosyl-L tryptophanyl-L-arginyl-L-asparaginyl-L-leucyl
L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenylalanyl-L histidyl-L-arginyl-L-phenylalanyl-L-seryl glycyl-L-methionyl-glycyl-L-phenylalanyl glycyl-L-prolyl-L-glutamyl-L-threonyl-L prolinamid # hexa-trifluoracetat (H-Ser-Ala-
Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg
Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr Pro-NH2 # 6CF3CO2H)
Man löst 15,9 o BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn- Leu-Asn-Asn-Phe-NHNH2 # diacetat (Teilsequenzen D.
E) in 200 ml Dimethylformamid, kühlt auf -^0 , oibt 15 ml Dioxan,/HCI 2n und anschliessend 116 ml tert.- Butylnitrit zu und rührt 10 Minuten bei -90v. Man gibt 14 ml Triäthylamin und eine Lösung von 18,6 g des in Teilsequenz A. B C erhaltenen Tridecapeptidacetats zu. rührt das erhaltene Gemisch 16 Stunden bei 0s, filtriert und dampft zur Trockne ein.
Man wäscht den Rückstand mit Diäthyläther und mit. Chlo roform, löst in DioxansWasser (8: 2), behandelt die erhaltene Lösung mit 100 ml Amberlit-IRA-410 (Acc- tat-Form), dampft ein und kristallisiert den Rückstand aus IsopropanolfWasser um. Man erhält das
BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Ser-Asn-Asn
Phe-His(Trt)-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe
Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 # Acetat, Smp. 145 (Zers.), [α]D20 = - 67 in Essigsäure, das man unter Stickstoffatmosphäre in 500 ml Trifluoressigsäure löst. Man lässt 1 Stunde bei 25 stehen.
konzentriert auf 100 ml und fällt durch Zufrabe von 1000 ml Diäthyläther. .Man filtriert. Iöst den Rücl;- stand in Dimethylformamid und fällt mit DiäthYläther.
Nach Trocknen über KOES-Späne erhält man das
H-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn
Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 # 6 CF@CO2H, Smp 130 (Zers.). [α]D20 = -4n¯ in Essigsäure.
Beispiel: tert.-Butyloxycarbonyl-L-hemicystinyl-L seryl-L-asparaginyl-L-leucyl-L-seryl-L-threonyl
L-hemicystinyl-L-valyl-L-leucyl-L-seryl-L alanyl-L-tyrosyl-L-tryptophanyl-L-arginyl-L asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl-L-aspara ginyl-L-histidyl-L-arginyl-L-phenylalanyl-L seryl-glycyl-L-methionyl-glycyl-L-phenylalanyl glycyl-L-prolyl-L-glutamyl-L-threonyl-L prolinamid # Hexaacetat # Octahydrat
EMI8.1
Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe
His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro Glu-Thr-Pro-.SH, - Hexaacetat zu Octahydrat)
I.
jllcronp
Man löst 1.05 g Nonapeptid-Hydrazid (Teilsequenz F) in einem Gemisch von 50 ml Dimethylformamid und 1,2 ml dioxan HCl 2n bei - 20 , Man gibt 0,116 ml tert.-Butylnitrit zu. rührt 10 Minuten bei -20 , gibt 1,4 ml Triäthylamin und 3,1 g Tricosa peptid-Hexa-Trifluoracetat (Teilsequenz A. B, C, D, E) und 5 ml Wasser zu und rührt 16 Stunden bei 00. Man dampft zur Trockne ein, wäscht den Rückstand mit Diäthyläther, Chloroform und Aceton. So erhält man das rohe, geschützte Dotriacontapeptid, das man in 100 ml 0,3n Essigsäure löst, mit 20 ml Amberlit-IRA410 (Acetat) behandelt und gibt 50 ml 0,6n Ammoniumhydroxid hinzu.
Ma stellt das pH auf 6.5 ein und schichtet die erhaltene Lösung auf eine Carboxymethylcellulosesäule (10 x 100 cm), die mit einer 0,15n Ammoniumacetatpufferlösung cquilibriert wurde. Die Elution wird mit einem steigenden Konzentrations- und pH-Gradient (0,15n auf 0.4n; pH 6,5 auf pH 7 0) eines Ammoniumacetatpuffers durchgeführt. Die vereinigten Fraktionen, die das reine Peptid enthalten, werden dreimal gefriergctrocknet, der Rückstand mit Äthanol und anschliessend mit Diäthyläther gewaschen und über Kaliumhydroxid im Hochvakuum getrocknet.
Man erhält
EMI9.1
Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe
His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro Glu-Thr-Pro-NH.,- 6 CH3CO2H 8 HaO Smp. 2200 (Zers.), [α]D20 =-56 in Essigsäure in.
Aminosäurezusammensetzung nach Säurehydrolyse (6n, 16 Stunden):
Ala1.1, Arg2.0, Asp3.0, Cys/2 1.6, Glu1.2, Gly3.0, His1.1
Leu2.0; Met1.0 Phe3,0, Pro2,1 Ser3@@, Thr1.9, Tyr1.@,
Val 0,9 (Trp 1,0 durch Spektrophotometrie).
2. Methode
Man löst 1,0 g Nonapeptid (Teilsequenz F4) in 10 ml Dimethylformamid, gibt 1,5 g N-Hydroxysuccinimid und 0,52 g Dicyclohexy!carbodiimid hinzu, rührt 6 Stunden bei 250, filtriert und dampft das Filtrat zur Trockne ein. Man wäscht den Rückstand mit Essigester und Diäthyläther und trocknet. Man erhält 1,2 ,
EMI9.2
Smp. 2420, das man in 10 ml Dimethylformamid löst, gibt 3,1 g Tricosapeptid-Trifluoracetat (Teilsequenz A, B, C, D, E), 0,4 ml Triäthylamin und 1,2 g N Hydroxysuccinimid zu und rührt 16 Stunden bei 25C.
Man dampft zur Trockne ein, wäscht den Rückstand mit Diäthyläther, Chloroform und Aceton und verfährt weiter wie bei Methode 1.