DE2324239C3 - Verfahren zur Herstellung von Asparaginylgruppen enthaltenden biologisch aktiven Polypeptiden - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von Asparaginylgruppen enthaltenden biologisch aktiven Polypeptiden

Info

Publication number
DE2324239C3
DE2324239C3 DE2324239A DE2324239A DE2324239C3 DE 2324239 C3 DE2324239 C3 DE 2324239C3 DE 2324239 A DE2324239 A DE 2324239A DE 2324239 A DE2324239 A DE 2324239A DE 2324239 C3 DE2324239 C3 DE 2324239C3
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
otbu
glu
mmol
ala
pro
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired
Application number
DE2324239A
Other languages
English (en)
Other versions
DE2324239A1 (de
DE2324239B2 (de
Inventor
Sandor Dipl.-Chem. Dr. Bajusz
Rozsa Dipl.-Chem. Beke
Laszlo Dipl.- Chem.Ing.Dr. Graf
Attila Dipl.-Chem.Ing. Juhasz
Lajos Dipl.-Chem.Ing. Dr. Kisfaludy
Miklos Dipl.-Chem. Loew
Kalman Dipl.-Chem.Dr. Medzihradszky
Istvan Dipl.-Chem. Schoen
Maria Dipl.- Chem. Sz.Sarkoezi
Tamas Dipl.-Chem. Szirtes
Laszlo Dr. Szporny
Andras Dipl.-Chem.Ing. Turan
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Richter Gedeon Vegyeszeti Gyar Nyrt
Original Assignee
Richter Gedeon Vegyeszeti Gyar RT
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Richter Gedeon Vegyeszeti Gyar RT filed Critical Richter Gedeon Vegyeszeti Gyar RT
Publication of DE2324239A1 publication Critical patent/DE2324239A1/de
Publication of DE2324239B2 publication Critical patent/DE2324239B2/de
Application granted granted Critical
Publication of DE2324239C3 publication Critical patent/DE2324239C3/de
Expired legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C271/00—Derivatives of carbamic acids, i.e. compounds containing any of the groups, the nitrogen atom not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C271/06—Esters of carbamic acids
    • C07C271/08—Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to acyclic carbon atoms
    • C07C271/10—Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to acyclic carbon atoms with the nitrogen atoms of the carbamate groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C07C271/22—Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to acyclic carbon atoms with the nitrogen atoms of the carbamate groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms to carbon atoms of hydrocarbon radicals substituted by carboxyl groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/06—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents
    • C07K1/061—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents using protecting groups
    • C07K1/066—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents using protecting groups for omega-amido functions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/06—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents
    • C07K1/08—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents using activating agents
    • C07K1/088—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents using activating agents containing other elements, e.g. B, Si, As
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/665—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans derived from pro-opiomelanocortin, pro-enkephalin or pro-dynorphin
    • C07K14/695—Corticotropin [ACTH]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Seasonings (AREA)

Description

Die Erfindung bezieht sich au!" ein Verfahren zur Herstellung von biologisch aktiven Polypeptiden, die Asparaginylgruppen, vor allem einen Asparaginyl-Glycin-Teil enthalten.
Aus der Literatur ist bekannt, daß bei der Synthese der Asparagin-Peptide einerseits die /i-Carboxamidgruppe unter Wasserabspaltung leicht in ein /i-Cyanoalanin-Derivat übergeht (M. Bodanszky, V.duVigneaud: J. Am. Chem. Soc. 81,5688 [1959]; E. Schröder, K. Lübke: Peptides I, S. 110). andererseits, daß die Peptide, die eine am //-Carboxyl veresterte Asparaginylgruppe enthalten, sich leicht zu ringförmigen Succinimid-Derivaten umlagern (E. Schröder, K. Lübke: Peptides I, S. 203; M. A. O η d e 11 i u. a.: Biochemistry 7, 4069 [1968]). Die letztere Reaktion tritt besonders leicht ein, wenn in der Peptidkette auf den Asparaginteil Glycin folgt. So wird z. B. das synthetische Tetrapeptid Pro-Asn-GIy-Pro schon in 0,1-M ammoniakalischer Lösung quantitativ desamidiert (L. Graf u.a.: Polypeptide Hormones,S. 255, Akademiai Kiado, Budapest [1971 ]). Zur Vermeidung dieser Schwierigkeiten wird neuerdings bei der Synthese von Peptiden, die die Asparaginylgruppe enthalten, in steigendem Maße mit Carboxamid-Schutzgruppen gearbeitet (vgl. z.B. W. König, R. Geiger: Ber. 103, 2041 [1970]), und es ist verständlich, daß über die Acylierung mit der Sequenz Asparaginyl-Glycin in der Literatur keine Beispiele zu finden sind.
Mit der leichten Desamidierbarkeit der Carboxamidgruppe des Asparaginyl-Glycin-Teils ist erklärbar, daß nach neueren Untersuchungen die früher angenommene Struktur der adrenokortikotropcn Hormone einer geringfügigen Modifikation bedarf. So führte der systematische Vergleich zwischen natürlichen und synthetischen Präparaten zu der Erkenntnis, daß die früher an 30. Stelle angenommene Carboxamidgruppe sich an 25. Stelle befindet und an 26. und 27. Stelle sowohl beim menschlichen Corticotropin als auch bei dem des Schweins die Sequenz Gly-Ala steht (L. G r a f u. a.: Acta Biochim. Biophys. Hung. 6, 415 [1971], sowie B. Riniker u.a.: Nature New Biology 235, 114 [1972]). Demnach ist die tatsächliche Struktur des menschlichen adrcnocorticotropcn Hormons die folgende:
H-Scr-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-12 3 4 5 6 7 8 9
GIy- Ly s- Pro-Val-Gly-1 .y s-Ly s-Arg-, \rg- Pro-
)0 11 12 13 14 15 16 17 18 19
Val-Lys-Val-Tyr-Pro-Asn-Gly-Ala-Glu-Asp-2G 21 22 23 23 25 26 27 28 29
Glu-Ser-Ala-Glu-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu-Phe-OH. 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39
Es ist bekannt, daß die Synthese des menschlichen
ίο Adrenocorticotrop-Hormons der durch T. H Lee u.a. (J. Biol. Chem. 236, 2970 [1961]), beseht>.-,nen Struktur sowie die der Fragmente dieses Huimons zuerst in der ungarischen Patentschrift 155 254 und den dementsprechenden ausländischen Patentschriften
(z.B. österreichische Patentschrift 295 051) beschrieben wurde.
Das Ziel der Erfindung ist die Synthese des menschlichen adrenocorticotropen Hormons mit der obenerwähnten modifizierten Struktur sowie die Synthese von dessen artspezifischen Fragmemen.
Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis, daß die zur Synthese von biologisch aktiven Polypeptiden bisher nicht angewandte Pentafluorphenol-Methodik (L. K i s fa 1 ud y u.a.: Proc. 8th Europ. Peptide Symp.
1966 ρ 25 [1967]; L. Kisfaludy u.a.: J. Org. Chem. 35, 3563 [1970]; J. K ο vacs u.a.: J. Am. Chem. Soc. 89, 183 [1967]) unter entsprechenden Bedingungen zur Synthese von Polypeptiden obenerwähnter Struktur, die die Asparaginylgruppe enthalten. ausgezeichnet geeignet ist.
überraschenderweise wurde gefunden, daß aus dem Z-Asn-OH ohne Schutz der Carboxamidgruppe der entsprechende Pentafluorphenylester mit einer Ausbeute von über 90% hergestellt werden kann.
wenn bei Temperaturen von um 0l C gearbeitet wird, weil dadurch dk Bildung des ringförmigen Succinimid-Derivates und die des fJ-Cyanoalanin-Derivates praktisch völlig zurückgedrängt wird. Das auf diese Weise hergestellte Z-Asn-OPFP ist geeignet. Aminosäure- oder Peptid-Derivate ohne Ablauf von Nebenreaktionen zu acylieren. So ist z. B. das geschützte Dipeptid Z-Asn-Gly-OtBu ebenfalls in 90%iger Ausbeute und aus diesem durch Behandlung mit Trifiuoressigsäure das Z-Asn-Gly-OH herstellbar. Aus diesem Dipeptid wurde ebenfalls in ausgezeichneter Ausbeute der entsprechende Pentafluorphenylester erhalten, mit dem die in den Beispielen beschriebenen C-terminalen Peptide(ACTH27.31; ACTH27 _ j2; ACTH27 _ j„) in ausgezeichneter Ausbeute und ohne Nebcnreaktionen acyliert werden können.
Bei der Synthese von Peptiden mit größerer Gliederzahl, die Asparaginylgruppen enthalten, war ein weiterer Vorteil der Pentafluorphenol-Methodik besonders gut nachzuweisen, und zwar wurde beobachtet, daß bei der Acylierung mit Pentafluorphenylestern das in Freiheit gesetzte Pentafluorphenol keine derartigen Schwierigkeiten verursacht, wie sie bei der Pentachlorphenol-Methodik in vielen Fällen auftreten (österreichische Patentschrift 295051). Der Nachteil der letzteren besteht darin, daß sich bei der Verknüpfung ein Gleichgewicht einstellt, welches fallweise in Gegenwart von im Überschuß eingesetzten Aininkomponenten oder tertiärer Basen in die gewünschte Richtung verschoben werden kann. Bei Anwendung der Pentafluorphenol·Methode ist der Überschuß ar Base nicht notwendig. Diese Beobachtung schein mit der Tatsache in Widerspruch zu stehen, daß di< pK-Wcrtc der beiden erwähnten Phcnoldcrivaie nacl
den Angaben in der Literatur identisch sind (pK: 5,3). überraschenderweise wurde gefunden, daß die in Dimethylformamid gemessenen pK-Werte der beiden Phenolderivate wesentlich voneinander abweichen: Der des Pentachlorphenols beträgt 5,05, der des Pentafluorphenols 6,35. Anders ausgedrückt bedeutet dies, daß letzteres in Dimethylformamid in weniger dissoziierter Form vorliegt, wodurch verständlich wird, daß die dauerhafte Protonierung der basischen Komponente und damit das Abbremsen der Verknüpfungsreaktion ausbleibt. Ein weiterer Vorteil der Pentafluorphenol-Methodik besteht darin, daß das im Laufe der Reaktion frei werdende Pentafluorphenol leicht aus dem Reaktionsprodukt entfernt werden kann. Dies kann vom Pentachlorphenol beziehungsweise von dessen mit organischen Basen gebildeten Salzen nicht gesagt werden, was den Nachteil mit sich bringt, daß aus diesen Verbindungen — auch wenn sie nur in verschwindend geringer Menge im Reaktionsgemisch zurückbleiben — bei der auf die Verknüpfung folgenden katalytischen Hydrierung Salzsäure entsteht und diese die säureempfindlichen Schutzgruppen schädigt. Demgegenüber kann das Pentafluorphenol auf einfache Weise — indem man das Reaktionsgemisch in Äther gießt — und quantitativ entfernt werden, wodurch die erwähnte schädliche Wirkung vermeidbar ist. Vom Standpunkt der Praxis bedeutet die wesentlich größere Löslichkeit der Pentafiuorphenylester in organischen Lösungsmitteln einen weiteren Vorteil. Als Beispiel diene die Herstellung von Z-Asn-Gly-OPFP, bei der zur Bildung des Pentafluorphenylesters 1/10 der Dimethylformamidmenge als Lösungsmittel benötigt wird, die zur Bildung des Pentachlorphenylesters notwendig wäre. Weiterhin wurde gefunden, daß die Pentafluorphenol-Methode auch zur Synthese von Peptiden mit größerer Gliederanzahl ausgezeichnet geeignet ist. In diesem Falle wird nach neuesten Literaturangaben im Interesse einer höheren Ausbeute und der Erzielung eines reineren Endproduktes bei erhöhter Temperatur gearbeitet und/oder das Acylierungsmittel im Überschuß eingesetzt (vgl. z. B. R. S c h w y ζ e r, P. W. S c h i 11 e r: HeIv. Chim. Acta 54, 897 [1971]; E. Wünwch: Ber. 104, 2445 [1971]). Nach eigenen Erfahrungen ist bei der Anwendung der Pentafluorphenol-Methode zur Erreichung obiger Ziele weder erhöhte Temperatur noch ein Überschuß an Acylierungsmittel notwendig. So geht z. B. nach den Ergebnissen der Kontrolluntersuchung mittels Dünnschichtchromatographie die Reaktion des geschützten Decapeptids
Z-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Arg(NO2)-Arg(NO2)-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr(tBu)-Pro-OH
mit dem Heptapeptid
H-Asn-Gly-Ala-Glu(OtBu)-Asp( OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-(OtBu)
oder dem Octapeptid
H-Asn-Gly-Ala-Glu(OtBu)-Asp(OtBu|-
Glu( OtBu)-Ser-Ala-OtBu
in Dimethylformamid-Lösung mit dem Komplex von Pentafluorphenol und Dicyclohexylcarbodiimid bei Zimmertemperatur praktisch innerhalb von 5 bis 6 Stunden vor sich, und das geschützte Hcptadecapeptid (15-31) bzw. Octadecapeptid (15-32) kann durch einfache Aufarbeitung mit einer Ausbeute von über 80% isoliert werden. Ein ähnliches, ausgezeichnetes Ergebnis wird bei Umsetzen des in der östeireichischen Patentschrift 295 051 beschriebenen Tetradecapeptids ACTH 1-14 mit dem Heptadecapeptid 15-31, dem Octadecapeptid 15-32 und dem Pentacosa-
peptid 15-39 unter den erwähnten Reaktionsbedingungen erhalten.
Nach einer Alternativmethode zum Aufbau des gewünschten Zwischenproduktes kann auch in der Weise vorgegangen werden, daß mit dem aus
ίο Z-Arg(NO2)-Arg(NO2)-Pro-OH hergestellten Pentafiuorphenylester das Pentapeptid H-Val-Lys(BOC)-' Val-Tyr(tBu)-Pro-OH acyliert und das gewonnene Octapeptid einer katalytischen Hydrierung unterworfen wird, wobei auch die zum Schütze der
!5 Guanidinogruppe des Argimns dienenden Nitrogruppen entfernt werden und schrittweise das geschützte Decapeptid 15-24 aufgebaut wird, welches sich von dem oben beschriebenen Decapeptid 15-24 dadurch unterscheidet, daß die Guanidinogruppen des Arginins in protonierter Form vorliegen. Der Vorteil dieses Aufbaus besteht darin, daß die C-terminalen Peptide, die säureempfindliche Schutzgruppen enthalten, nicht der gleichen katalytischen Hydrierung ausgesetzt werden müssen, die außerdem zur Entfernung der Nitrogruppen dient und — wie bekannt — nur in essigsaurem Medium mit langen, in manchen Fällen tagelangen Reaktionszeiten ausführbar ist.
Nach obigen Ausführungen ist also das neue Verfahren zur Herstellung von das menschliche Adreno-
corticotrop-Hormon und dessen artspezifische Fragmente repräsentierenden Peptiden der allgemeinen Formel I
H-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Ply-
Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-
Val-Tyr-Pro-Asn-Gly-Ala-Glu-Asp-Glu-Q
worin Q die Bedeutungen
a) Ser-OH,
b) Ser-Ala-OH,
c) Ser-Ala-Glu-OH,
d) Ser-Ala-Glu-Ala-OH.
c) Ser-Ala-Glu-Ala-Phe-OH,
0 Ser-Ala-Glu-Ala-Phe-Pro-OH,
g) Ser-Ala-Glu-Ala-Phe-Pro-Leu-OH,
h) Ser-Ala-Glu-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu-OH,
i) Ser-Ala-Glu-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu-Phe-OH
hat, sowie der geschützten Derivate dieser Peptide geeignet.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Asparaginylgruppen enthaltenden, biologisch aktiven Polypeptiden durch Verknüpfung der entsprechenden geschützten Peptidkomponenten nach der Aktivestermethode und anschließende Ab-
SS spaltung der Schutzgruppen, das dadurch gekennzeichnet ist. daß die Carboxylgruppe der Acylierungskomponente bei Raumtemperatur bis ungefähr 0"C durch Umsetzen zum Pentafiuorphenylester aktiviert und die Acylierungsreaklion innerhalb des
gleichen Temperaturbereichs durchgeführt wird.
Ausgangsstoffe und Zwischenprodukte werden mit Hilfe bekannter peptidchemischcr Methoden hergestellt. Demnach werden zum Schutz der Aminogruppen in erster Linie Benzyloxycarbonyl-, t-Butyloxy-
carbonyl-, p-Chlorbenzyloxycarbonylgruppen, zum Schutz der Carboxylgruppen in erster Linie die Methode der Veresterung, vor allem mit Methanol. Äthanol und t-Bulanol angewandt. Die Hydroxyl-
gruppen der Seitenketten werden fallweise durch Verithern geschützt, wofür t-Butanol oder Benzylalkohol Verwendung finden. Zum Schutz der Guanidinogruppe des Arginins ist vor allem die Nitrogruppe geeignet, doch kann die Guanidinogruppe auch in j protonierter Form eingesetzt werden. Durch entsprechende Kombination der Schutzgruppen kann erreicht werden, daß diese durch Hydrogenolyse beziehungsweise Acidolyse selektiv der aber auch gleichzeitig entfernt werden können.
Die Peptide mit kleinerer Gliederzahl können nach der schrittweisen Methode oder durch Kondensation von Fragmenten hergestellt werden, wobei nach der Gemischtanhydrid-, Azid-, Aktivester- oder Dicyclohexylcarbodiimid-Methode gearbeitet werden kann.
Das Wesen der Erfindung besteht darin, daß bei der Verknüpfung der Asparaginylgruppen enthaltenden Peptide die Carboxylgruppe der Acylierungskomponente durch Umsetzen zu einem Pentafluorphenylester aktiviert wird. Der Pentafluorphenylester kann vor der Acylierung getrennt hergestJlt werden, es ist aber auch möglich, ihn unmittelbar im Reaktionsgemisch zu erzeugen. Der aktive Ester kann hergestellt werden, indem dem Reaktionsgemisch Pentafluorphenol und Dicyclohexylcarbodiimid zugesetzt wird. Eine besonders vorteilhafte Ausführungsform der Bereitung des aktiven Esters besteht darin, den Pentafluorphenyl-dicyclohexylcarbodiimid-Komplex getrennt herzustellen und im Molverhältnis 1,2 bis 1,5 dem Reaktionsgemisch zuzusetzen. Außer der leichteren Handhabbarkeit hat diese Methode den Vorteil, daß die eventuell im Dicyclohexylcaibodiimid enthaltenen schwefelhaltigen Verunreinigungen entfernt werden können. Diese Verunreinigungen können bei der Hydrierung, die meistens auf die Verknüpfung folgt, von schädlichem Einfluß sein. Ein weiterer Vorteil dieser Verknüpfungsmethode, die ohne Nebenreaktionen und mit ausgezeichneter Ausbeute abläuft, besteht darin, daß es nicht notwendig ist, die geschützten Zwischenprodukte einer besonderen, z. B. säulenchromatographischen Reinigung zu unterwerfen, sondern die Reinigung des von den Schutzgruppen befreiten Endproduktes ausreichend ist. Diese Reinigung kann auf der Grundlage des Prinzips der Gegenstromverteilung, aber auch nach der säulenchromatographischen Methode vorgenommen werden. Im letzteren Falle gelangen z. B. verschiedene Carboxymethylzellulose-Arten zum Einsatz.
In den Kreis der Erfindung gehört auch die Umsetzung der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Peptide zu Säureadditionssalzen oder zu pharmazeutisch anwendbaren Komplexen. Zur Bildung von Säureadditionssalzen können pharmazeutisch verträgliche Säuren, z. B. Essigsäure, Salzsäure, höhere Fettsäuren, aber auch Schwefelsäure und Phosphorsäure verwendet werden. Unter pharmazeutisch anwendbaren Komplexen sind Verbindungen der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Peptide zu verstehen, welche durch Zugabe gewisser organischer oder anorganischer Stoffe entstehen und eine verzögernde Wirkung der Peptide bewirken. Solche organischen Verbindungen können z. B. gewisse Gelatinearten, Carboxymethylcellulose, Alginsäureester, Aminosäurepolymere und andere Polymere und Copolymere sein. Unter den anorga- 6j nischen Verbindungen kommen die schwerlöslichen Salze, so die Phosphate oder Pyrophosphate bestimmter Metalle, vor allem die des Zinks, in Frage.
Zur Erreichung der erwähnten Wirkung sind auch bestimmte Silikate geeignet, die mit den Peptiden ebenfalls unlösliche Komplexe beziehungsweise Kondensate bilden, deren Struktur noch nicht geklärt ist.
Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Peptide können in Gestalt der üblichen Arzneimittelpräparate zur pharmazeutischen Verwendung gelangen. Solche Arzneimittelpräparate können feste Lyophilisate sein, bei denen als Trägerstoff nicht mit den Peptiden reagierende Substanzen, z. B. Mannit, Milchzucker, Stärke usw. Verwendung finden. Weiterhin können die Peptide als Suspensionen oder Emulsionen zubereitet werden, in denen als Hilfsstoffe verschiedene neutrale Konservierungs- und Stabilisierungsmittel enthalten sein können. Eine besonders vorteilhafte Art der Zubereitung sind die obenerwähnten Komplexe und Kondensate, die die verzögerte Wirkung des Präparates bewirken.
Die normale Dosis des adrenocorticotropen Hormons beträgt 1- bis 7mal wöchentlich 0,1 bis 3,0 mg in subcutaner, parenteraler oder intramuskulärer Verabreichung.
Die in den Beispielen beschriebenen Zwischenprodukte sind neu.
Die in den Beispielen benutzten Abküizungen sind durch das IUPAC-IUB anerkannt (J. Biol. Chem. 247, 977 [1972]). Als weitere Abkürzung wird hinter den Titelworten ein Symbol verwendet, das den Sequenztei! mit Zahlen angibt und ferner die N-terminalen und C-terminalen Endgruppen bezeichnet. Die Schutzgruppen der Seitenketten sind im jeweiligen Titelwort enthalten. Folgende weitere Abkürzungen werden verwendet: DCC = Dicyclohexylcarbodiimid. PFPOH = Pentafluorphenol, PCPOH = Pentachlorphenol, DCHA = Dicyclohexylamin.
Die Bestimmung der Schmelzpunkte erfolgte mit dem Apparat nach Dr. T ο 11 ο 1 i (Büchi, Schweiz).
Die dünnschichtchromatographischen Untersuchungen wurden auf Silikagel nach Stahl unter Verwendung folgender Lösungsmittelgemische durchgeführt :
1. Äthylacetat-[ Pyridin-Essigsäure-Wasser
= 20:6:11] = 95:5,
2. Äthylacetat-CPyridin-Essigsäure-Wasser
= 20:6:11] = 9:1,
3. Äthylacetat-[Pyridin-Essigsäure-Wasser
= 20:6:11] = 4:1,
4. Äthylacetat-ITyridin-Essigsäure-Wasser
= 20:6:11] = 3:2,
5. Äthylacetat-Pyridin-Essigsäure-Wasser
= 240:20:6:11,
6. Äthylacetat-Pyridin-Essigsäure-Wasser
= 120:20:6:11,
7. Äthylacetat-Pyridin-Essigsäure-Wasser
= 60:20:6:11,
8. Äthylacetat- Pyridin-Essigsäure-Wasser
= 30:20:6:11,
9. Äthylacetat-Pyridin-Essigsäure-Wasser
= 480:20:6:11,
10. Chloroform-Hexan-Essigsäure = 8:1:1,
11. Chloroform-Methanol = 98:2,
12. Chloroform-Methanol =95:5,
13. Chloroform-Methanol = 9:1,
14. Chloroform-Methanol = 85:5,
15. n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser
= 30:20:6:24,
16. Chloroform-Melhanol-Essigsäure = 8:1:1.
Zum Nachweis wird Ninhydrin und/oder Chlor + Tolidin verwendet.
Beispiel 1
Synthese des menschlichen ACTH1 _31
Schritt 1
Z-GIu(OtBu)- Ser(tBu)-OtBu(Z-30-31 -OtBu)
10,85 g (25 mMol) Z-GIu(OtBu)-ONSu werden in 100 ml Äthylacetat gelöst und 7,0 g (27,5 mMol) H-Ser(tBu)-OtBu · HCl in die Lösung eingetragen. Die erhaltene Suspension wird auf O0C abgekühlt und unter Rühren mit 3,85 ml (27,5 mMol) Triäthylamin versetzt. Das Reaktionsgemisch wird eine halbe Stunde lang bei 0°C, dann eine Nacht lang bei '5 Zimmertemperatur weitergerührt, dann nacheinander mit 2 · 20 ml n-Salzsäure, 3 · 20 ml n-NaHCO3-Lösung und schließlich mit Wasser ausgeschüttelt. Die Äthylacetatphase wird getrocknet und danach eingedampft. Der erhaltene ölige Rückstand wird mit Petroläther verrieben. Auf diese Weise werden 10,45 g (77,8%) Z-30-31-OtBu erhalten. Schmelzpunkt: 92 bis 95°C; RV: 0,8.
Analyse C28H44O8N2 (536,68):
Berechnet ... C 62,7, H 8,3;
gefunden .... C 62,4, H 8,2.
Schritt 2
H-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-OtBu(H-30-31 -OtBu)
17,2 g (32 mMol) Z-30-31-OtBu werden in 350 ml Methanol gelöst und in Gegenwart von 2,5 g Palladium-Aktivkohle 1 Stunde lang Wasserstoff durch die Lösung geleitet. Nach Abfiltrieren des Katalysators wird das Filtrat unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft und der feste Rückstand mit Petroläther auf ein Filter aufgebracht. Ausbeute: 10,97 g(83,4%)H-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-OtBu.Schmelzpunkt: 78 bis 82° C; Rl r": 0,4.
Analyse C20H38O6N2 (402,54):
Berechnet ..
gefunden
C 59,7, H 9,5, N 6,9;
C 59,8, H 9,4, N 6,6.
Schritt 3
35
40
45
Z-Asp( OtBu)-Glu( OtBu)-Ser(tBu)- OtBu
(Z-29-31-Ot8u)
9,45 g (22,5 mMol) Z-Asp(OtBu)-ONSu und 10,1 g (25 mMol) H-30-31-OtBu werden in 200 ml Äthylacetat gelöst und über Nacht stehengelassen. Anderntags wird die Lösung nacheinander mit 2 ■ 50 ml n-Salzsäure, 3 ■ 50 ml n-NaHC O3-Lösung und schließlich mit Wasser ausgeschüttelt. Das nach dem Abdestillieren des Äthylacetats erhaltene öl wird mit Wasser zum Erstarren gebracht!, dann das Wasser abfiltriert. Ausbeute: 15,2 g (95,0%) Z-29-31-OtBu. Schmelzpunkt: 84 bis 87°C, R'r': 0.70.
Analyse C36H57O11N3 (707,88):
Berechnet ... C 61,1, H 8,1;
gefunden .... C 61,3, H 8,3.
60
Schritt 4
Z-GIU(OtBU)-As(OtBU)-GIu(OtBu)-SCr(IBu)-OtBu 6, (Z-28-31-OtBu)
14,18 g (20 mMol) Z-29-31-OtBu werden in 280 ml Methanol gelöst, und in Gegenwart von 2,1 g Palladium-Aktivkohle wird eine halbe Stunde lang Wasserstoff durch die Lösung geleitet. Die Lösung wird nach Abfiltrieren des Katalysators unter vermindertem Druck eingedampft und der ölige Rückstand (11,65 g; RY: 0,2) mit der Lösung von 8,25 g (19 mMol) Z-GIu(OtBu)-ONSu in 200 ml Äthylacetat zur Reaktion gebracht. Die Lösung wird über Nacht stehengelassen und dann nacheinander mit 2 · 50 ml n-Salzsäure, 3-5OmI n-NaHCO3-Lösung und schließlich mit Wasser ausgeschüttelt. Die Lösung wird getrocknet, das Äthylacetat abdestilliert, der feste Rückstand mit η-Hexan verrieben und filtriert. Das rohe Produkt wird in 43 ml heißem Äthylacetat gelöst und die Lösung mit 7 ml η-Hexan versetzt. Die abgeschiedenen Kristalle werden am nächsten Tage abfiltriert und getrocknet. Ausbeute: 13,0 g (76,5%) Z-28-31-OtBu. Schmelzpunkt: 184 bis 185°C; R'f: 0,80.
Analyse C45H72O14N4 (893,1):
Berechnet ... C 60,5, H 8,1;
gefunden .... C 60,8, H 8,0.
Schritt 5
H-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-
Ser(tBu)-OtBu (H-28-31-OtBu)
12,5 g (14 mMol) Z-28-31-OtBu werden in 250 ml Methanol gelöst und in Gegenwart von 1,8 g Palladium-Aktivkohle eine halbe Stunde lang hydriert. Der Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat zur Trockne eingedampft. Der feste Rückstand wird mit η-Hexan verrieben und filtriert. Ausbeute: 10,09 g (95%) H-28-31-OtBu. Schmelzpunkt: 139 bis 14O0C; R^: 0,3; Rf: 0,25.
Analyse C27H66O12N4 (758.97):
Berechnet ... N 7,4;
gefunden .... N 7,6.
Schritt 6
Z-Ala-Glu(OtBu)-Asp( OtBu)-GIu(OtBu)-Ser(tBu)-OtBu (Z-27-31-OtBu)
6,62 g (8,7 mMol) H-28-31-OtBu werden in 65 ml Äthylacetat gelöst und 2,72 g(8,5 mMol) Z-AIa-ONSu zugesetzt, welches sich nach Sminütigem Rühren ebenfalls löst. Nach einstündigem Rühren beginnt sich das Produkt aus der Lösung auszuscheiden. Das Reaktionsgemisch wird über Nacht stehengelassen, das Produkt anderntags abfiltriert und mit Äthylacetat gewaschen. Das Rohprodukt wird aus 65 ml Äthylacetat umkristallisiert. Ausbeute: 6,61 g (80,7%) Z-27-31-OtBu. Schmelzpunkt: 193 bis 195°C; RV: 0,35^:0,75.
Analyse C48H77O15N5 (64,18):
Berechnet ... C 59,9, H 8,1;
gefunden .,.. C 59,6, H 8,1.
Schritt 7
H-Ala-Glu( OtBu)-Asp(OtBu)-Glu( OtBu)-Ser(tBu)-OtBu (H-27-31-OtBu)
6,61 g (6,85 mMol) Z-27-31-OtBu werden unter leichtem Erwärmen in 150 ml Methanol gelöst, die Lösung auf Zimmertemperatur abgekühlt und in Gegenwart von Palladium-Aktivkohle eine halbe Stunde lang Wasserstoff hindurchgeleitet. Nach Abfiltriercn des
509 622/284
ίο
Katalysators wird die Lösung zur Trockne eingelampft, der feste Rückstand mit η-Hexan durchgearbeitet und filtriert. Ausbeute: 5.55 g 197,6%) rI-27-31-OtBu. Schmelzpunkt: 138 bis 14?. C;Rj: 0.15.
\nalyse C40H71013N5 (830,05):
Berechnet ... C 57,9, H 8,6. N 8.4:
gefunden .... C 57,7, H 8,3. N 8,1.
Schritt 8
Z-Asn-OPFP
1,33 g (5 mMol) Z-Asn-OH und 3,04 g Pentafluorphenol werden in 3.5 ml Dimethylformamid gelöst und die Lösung mit 10,5 ml Dioxan versetzt. Die Lösung wird auf 00C abgekühlt und unter Rühren 1,13 g (5,5 mMol) DCC zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird 2 Stunden lang bei 0° C gerührt, danach das DCU abfiltriert und das Filtrat unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird mit 8 ml Äther verrieben, die kristalline weiße Substanz abnitriert und mit wenig kaltem Äther gewaschen. Ausbeute: 2,02 g (93.5%) Z-Asn-OPFP. Schmelzpunkt: 149 bis 15O0C; R1/3: 0.35.
Analyse C18H13O5N2F5 (432.31):
Berechnet ... C 50.0. H 3,0, N 6.5;
gefunden .... C 50,2. H 3,1, N 6,4.
Schritt 9
Z-Asn-Gly-OtBu (Z-25-26-OtBu)
0.43 g (1 mMol) Z-Asn-OPFP werden unter schwachem Frwärmen in 10 ml Dioxan gelöst, die Lösung auf IOC abgekühlt und 0,185 g (1.1 mMol) H-GIy-OtBu · HCl zugesetzt. Zu der erhaltenen Suspension werden unter Rühren 0,154 ml (1,1 mMol) Triäthylamin zugesetzt, das Reaktionsgemisch eine halbe Stunde lang bei Zimmertemperatur gerührt, danach filtriert und das Filtrat eingedampft. Der erhaltene aelartige Rückstand wird mit Äther verrieben und filtriert. Auf diese Weise werden 0.34 g (89.8%) Z-Asn-Gly-OtBu erhalten. Schmelzpunkt: 150 bis 15TC: Rf: 0.6.
Analyse C18H25O6N3 (379.42):
Berechnet ... N 11.1;
gefunden .... N 11,2.
Schritt 10
Z-Asn-Gly-OH (Z-25-26-OH)
9.13 g (26 mMol) Z-Asn-Gly-OtBu werden in 90 ml Trifluoressigsäure gelöst und eine halbe Stunde stehengelassen, danach mit 450 ml trockenem Äther versetzt. Der ausgeschiedene weiße Niederschlag wird filtriert und mit Äther gewaschen. Das Rohprodukt wird aus 35 ml Wasser umkristallisiert, wobei 6.56 g (78%) Z-Asn-Gly-OH gewonnen werden. Schmelzpunkt: 170 bis 172" C: R?: 0.45.
Schritt 11
Z-Asn-Gly-Ala-Glu( OtBu)-ASp(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-OtBu(Z-25-31-OtBu)
2,59 g (8 mMol) Z-Asn-Gly-OH. 6,65 g (8 mMol) H-Ala-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-OtBu und 4.86 g Pentafluorphenol werden in 28 ml Dimethylformamid gelöst, die Lösung auf 0 C gekühlt und 11,81 g (8,8 mMol) DCC zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird eine halbe Stunde lang bei 0 C. dann bei Zimmertemperatur 2.5 Stunden gerührt. Nach Abfiltrieren des DCU wird die Lösung zur Trockne eingedampft, der Rückstand mit Äthylacetat durchgearbeitet und filtriert. Ausbeute: 7,3 g (80.5%) Z-25-.M-OtBu. Schmelzpunkt: 194° C (Zers.): R?: 0,6.
Schritt 12
H-ASn-GIy-AIa-GIU(OtBu)-ASp(OtBu)-GIu(OtBu)-Ser(tBu)-OtBu (H-25-31-OtBu)
6,47 g (5,7 mMol) H-25-31-OtBu werden in einem Gemisch von 220 ml Äthanol und 20 ml Dimethylformamid gelöst, und in Gegenwart von 1 g Palladium-Aktivkohle wird 1 Stunde lang Wasserstoff durch die Lösung geleitet. Der Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat zur Trockne eingedampft. Der gelartige Rückstand wird mit Äther durchgearbeitet, filtriert und getrocknet. Ausbeute: 4,9 g(86,2%) H-25-31 -OtBu. Schmelzpunkt: 174 bis 176 C (Zers.); R?: 0.2.
Schritt 13
Z-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Arg(N O, )-Arg(N O2)-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr(tBu)-Pro-Asn-Gly-A1a-
GIU(OtBU)-ASP(OtBU)-GIu(OtBu)-SCr(IBu)-OiBu
(Z-15-31-OtBu)
7.4 g (4 mMol) Z-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Arg(NO,)-Arg(NO2)-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr(tBu)-Pro-O"H (österreichische Patentschrift 295 051) und 4,2 g (4,2 mMol) H-25-31-OtBu werden in 25 ml Dimethylformamid gelöst, die Lösung wird auf O0C abgekühlt und 3.64 g (4.8 mMol) DCC-PFPOH-Komplex. in dem die Reaklionskomponenten im Verhältnis 1:3 enthalten sind, werden in die Lösung eingetragen. Das Reaktionsgemisch wird 20 Minuten bei O" C. dann 5 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt. AnschÜe-
ßend wird das Rcaklionsgemisch in 300 ml wasserfreien Äther filtriert; der sich abscheidende Niederschlagwird isoliert. 11,0 g (97%) rohes Produkt werden gewonnen. Schmelzpunkt: ISO C. Das Rohprodukt wird in 33 ml Methanol gelöst und durch Zugabe von 430 ml Äthylacetat ausgefüllt. Ausbeute: 8.75 g (77%) Z-lS-31-OtBu. Schmelzpunkt (Zers.): 185 C: Rf: 0.5.
Schritt 14
H-LyS(BOC)-I.yslBOC.>Arg-Artt-Pro-Val-Lys(B0C)-Val-Tyr(tBu)-Pro-Asn-Gly-Ala-Glu(OtBu)-/\sp(OtBu)-GIu(OtBu)-Ser(tBu)-OtBu · 3HCl
(11-15-31-OtBu-3 HCl)
6.5 g (2.3 mMol) Z-15-31-OtBu werden in 85 ml lissigsiiure gelöst, und in Gegenwart von 2 g Palladium-Aktivkohle wird Wasserstoff durch die Lösung geleitet. Das Fortschreiten der Reaktion wird mittels Dünnschichtchromatographie kontrolliert. Nach Be-
endigung der Reaktion wird der Katalysator abfiltriert und das Filtrat zur Trockne eingedampft. Das erhaltene Produkt (6.72 g) wird in 70 ml Wasser gelöst und der pH-Wert der Lösung unter Kühlen mit verdünnter Salzsaure auf vier eingestellt. Danach werden der
ö5 Lösung 20 ml 30%ige Kochsalzlösung zugesetzt und der ausgeschiedene Niederschlag abfiltriert und getrocknet. Zum Zwecke der Entsalzung wird das Pro dukt in Äthanol und Chloroform suspendiert, das SaI;
Aminosäureanalyse:
Lys 4,08 (4); His 1,0 (1); Arg 2,94 (3); Asp 2,01 (2); Met 0,78 (1); Ser 2,78 (3); GIu 3,07 (3); Pro 2,86 (3); GIy 2,97 (3); AIa 1.09 (1); VaI 2,96 (3); Tyr 2,1 (2); Phc 1,09(1).
Beispiel 2
Alternativweg zur Synthese des menschlichen ACTH,..,,
Schritt 1
Z-Arg(NO2)-Arg(NO2)-Pro-OPFP (Z-17-19-OPFP)
3.26 g (5mMol) Z-Arg(NO2)-Arg(NO2)-Pro-OH (österreichische Patentschrift 295 051) werden in 30 ml Dimethylformamid gelöst und der Lösung 5,31 g (7mMol) DCC-PFPOH-Komplex zueeselzt. Das
IO
abfiltriert und das Filtral zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird mit Äther durchgearbeitet und filtriert. Ausbeute: 5,35g(85.6%)H-15-31-OtBu-3HCl. R?: 0,45.
Schritt 15
BOC-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu(OtBu)-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC)- Arg-Arg-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr(tBu)-Pro-Asn-Gly-Ala-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)- Ser(tBu)-OtBu · 3HCl (BOC-l-31-OtBu · 3HC1)
2,96 g (1,5 mMol)BOC-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu( OtBu)-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-OH (österreichische Patentschrift 295 051) und 4,08 g (l,5mMol) H-15-31-OtBu-3HCl werden in 20 ml Dimethylformamid gelöst, die Lösung wird auf 0c C abgekühlt und zuerst mit 0,21 ml Triäthylamin, danach mit 1,36 g (1,8 mMol) DCC-PFPOH-Komplex verfetzt. Das Reaktionsgemisch wird 10 Minuten lang bei einer Temperatur von 0JC, dann 24 Stunden lang bei Zimmertemperatur gehalten und schließlich in 250 ml trockenen Äther filtriert. Der abgeschiedene Niederschlag wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und dann getrocknet. Ausbeute: 6,84 g (98,4%) BOC-l-31-OtBu · 3HCl; Rf: 0,45.
Schritt 16
H-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Üly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro- Asn-Gly-Ala-Glu-Asp-Glu-Ser-OH · 3 CH3COOH (H-1-31-OH -3CH3COOH)
3,0 g (0.647 mMol) BOC-l-31-OtBu -3HCl werden in einem Gemisch von Trifluoressigsäurc, Wasser und Anisol im Verhältnis 8:1:1 gelöst und die Lösung bei Zimmertemperatur 1 Stunde lang gerührt. Danach werden der Lösung 300 ml Äther zugesetzt. Der ausgeschiedene Niederschlag wird abfiltriert und mit Äther gewaschen. Das erhaltene Trifiuoracetat (2.89 g) wird in Wasser gelöst und die Lösung über eine Säule von Dowex 1 χ 8 (Acetatform) filtriert. Nach dem Ionenaustausch wird die Lösung auf eine mit 500 ml CM 23 gefüllte Säule aufgebracht. Die Reinigung erfolgt durch Gradienteneluierung. Die Fraktionen, die den gewünschten Stoff enthalten, werden vereinigt und lyophilisiert. Ausbeute: 1,64 g (70%) chromatographisch einheitliches, biologisch völlie aktives H-1-31-OH.
Reaktionsgemisch wird bei Zimmertemperatur 5 Stunden lang gerührt, danach das abgeschiedene DCU abfiltriert und das Filtrat zur Trockne eingedampft. Der ölige Rückstand wird in Äther zum Erstarren gebracht. Dieser Niederschlag wird abfiltriert und mit Äther gewaschen (3.8 g = 92,9% Rohprodukt). Das rohe Produkt wird in 11 ml Tetrahydrofuran gelöst und mit 60 ml Äther ausgefällt. Ausbeute: 3,42 g (83,6%) Z-17-19-OPFP; R'r 6:0,55.
Analyse C31H36O10N11F5 (817,9):
Berechnet ... C 45,5, H 4,4, N 18,8, F 11,6;
gefunden .... C 46,0, H 4,7, N 18,7, F 11,8.
Schritt 2
Z-Arg(NO2)-Arg(NO2)-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr(tBu)-Pro-OH (Z-17-24-OH)
2,22 g (2,92 mMol) H-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr(tBu)-Pro-OH (österreichische Patentschrift 295 051) werden in 25 ml Dimethylformamid suspendiert und unter Rühren 2,64 g (3,22 mMol) Z-17-19-OPFP zugesetzt. Durch zweicinhalbstündiges Rühren wird eine klare Lösung erhalten, die noch zweieinhalb Stunden weitergerührt und dann zur Trockne eingedampft wird. Der Rückstand wird mit Tetrahydrofuran auf ein Filter aufgebracht und mit Tetrahydrofuran gewaschen. Das rohe Produkt (3.8 g = 93,3%) wird in 15 ml Methanol gelöst und mit 100 ml Äthylacetat ausgefällt. Der Niederschlag wird abfiltriert und getrocknet. Ausbeute: 3,55 g (87,2%) Z-17-24-OH. Rf: 0,7.
Analyse C64H99O18N7 (1394,61):
Berechnet ... C 55.1, H 7,2. N 17,1;
gefunden .... C 55.0. H 7.0. N 17,2.
Schritt 3
H-Arg-Arg-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr(tBu)-Pro-OH · 3HCl (H-17-24-OH · 3HCl)
0.4 g (0.29 mMol) Z-17-24-OH werden in 8 ml Essigsäure gelöst und in Gegenwart von 0,1 g Palladium-Aktivkohle hydriert. Das Fortschreiten dei Reaktion wird mittels Dünnschichtchromatographie kontrolliert. Nach Beendigung der Reaktion wird dei Katalysator abfiltriert und das Filtrat zur Trockne eingedampft. Der ölige Rückstand wird in 3 m Methanol gelöst und der pH-Wert der Lösung untei Kühlung mit verdünnter Salzsäure auf vier eingestellt Danach wird die Lösung zur Trockne eingedampf und der Eindampfrückstand mit Äthylacetat auf eir Filter aufgebracht. Es werden 0,26 g (70.2% H-17-24-OH · 3HCl gewonnen; Rf: 0,1.
Schritt 4
Z-LyS(B OC)-A rg-Arg-Pro-Val-Lys(B OC)-VaI-Tyr(tBu)-Pro-OH · 2HCl (Z-16-24-OH · 2 HCl)
0,65 g (0,49 mMol) H-17-24-OH · 3HCl werden ii 7 ml Dimethylformamid suspendiert und 0,07 m Triäthylamin sowie 0,3 g(0,6 mMol) Z-Lys(BOC)-ON 1 zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird 24 Stunde: lang bei Zimmertemperatur gerührt und dann zu Trockne eingedampft. Der Rückstand wird mit Äthyl acetat auf ein Filter aufgebracht und mit wenig Wasse gewaschen. Ausbcutc:0,6g(76,3%)Z-16-24-QH -2HC Rf: 0,45.
Schritt 5
Z-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Arg-Arg-Pro-Val-
Lys(BOC)-Val-Tyr(tBu)-Pro-OH · 2HCl
(Z-15-24-OH-2HC1)
0,5 g (0,3 mMol) Z-16-24-OH · 2HCl werden in 20 ml Methanol gelöst und in Gegenwart von Palladium-Aktivkohle hydriert. Nach Beendigung der Reaktion wird der Katalysator abfiltriert und das Filtrat zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird mit Äthylacetat auf ein Filter aufgebracht. Ausbeute: 0,42 g (97,3%) H-16-24-OH-2HC1 (Rf: 0,15). 0,33 g (0,23 mMol) dieses Produktes werden in 3 ml Dimethylformamid suspendiert und mit 0,14 g (0,25 mMol) Z-Lys(BOC)-OPFP versetzt. Nach zehnminütigem Rühren wird eine klare Lösung erhalten, die noch 3 Stunden weitergerührt und dann zur Trockne eingedampft wird. Der Rückstand wird mit Äthylacetat verrieben. Ausbeute: 0,36 g (85,4%) Z-15-24-OH · 2HCl; Rf: 0,45.
Schritt 6
Z-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Arg-Arg-Pro-Val-Lys(BOQ-Val-Tyr(tBu)-Pro-Asn-Gly-Ala-Glu(OtBu)-
Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-OtBu · 2HCl
(Z-15-31-OIBU-2HC1)
0,18 g (0,ImMoI) Z-15-24-OH · 2HCl und 0,10 g (0,1 mMol) H-25-31-OtBu werden in 1 ml Dimethylformamid gelöst und der Lösung 0,091 g (0,12 mMol) DCC-PFPOH-Komplex zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird 5 Stunden lang gerührt und dann mit Äthylacetat verdünnt. Das abgeschiedene DCU wird abfiltriert und das Filtrat zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird mit Äther verrieben. Es werden 0,25 g (88,8%) Z-15-31-OtBu-2HCl gewonnen. Rf: 0,5. Das Produkt wird auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise weiterverarbeitet.
Beispiel 3
Die Synthese des menschlichen ACTH1 _32
Schritt 1
Z-Glu(OtBu)-Ser-Ala-OtBu(Z-30-32-OtBu)
23,9 g (100 mMol) Z-Ser-OH und 14,5 g( 100 mMol) H-AIa-OtBu werden in 150 ml Methylenchlorid gelöst, und die Lösung wird auf — 100C abgekühlt. Danach wird eine aus 20,6 g (100 mMol) DCC und 100 ml Methylenchlorid bereitete Lösung zugetropft. Das Reaktionsgemisch wird 2 Stunden lang bei 0° C gerührt und über Nacht stehengelassen. Anderntags wird das ausgeschiedene DCU abfiltriert und das Filtrat nacheinander mit 3 · 70 ml n-Salzsäure, 3 -70 ml 5%iger NaHCO3-Lösung und schließlich mit Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen der Lösung wird das Methylenchlorid abdestilliert und der ölige Rückstand in η-Hexan zum Erstarren gebracht. Es werden 30,0 g (82%) rohes Z-Ser-Ala-OtBu gewonnen, die in 600 ml Methanol gelöst und in Gegenwart von 2 g Palladium-Aktivkohle hydriert werden. Die Reaktion wird mittels Dünnschichtchromatographie kontrolliert. Nach Beendigung der Reaktion wird der Katalysator abfiltriert, das Filtrat zur Trockne eingedampft und der ölige Rückstand in 220 ml Äthylacetat gelöst. Dieser Lösung werden 33,0 g (76 mMol) Z-GIu(OtBu)-ONSu zugesetzt. Anderntags wird die Lösung mit 3 χ 50 ml n-Salzsäure, dann mit 3 χ 50 ml 5%iger NaHCO3-Losung und schließlich mit Wasser ausgeschüttelt. Die Lösung wird getrocknet, danach der Äthylacetat abdestilliert und der ölige Rückstand aus einem Gemisch von Äthylacetat und Petroläther kristallisiert. Es werden 31,5 g (75%) Z-30-32-OtBu gewonnen. Schmelzpunkt: 72 bis 74° C; RV : 0,6; [«] „ = - 28,9n.
Analyse C27H41N3O9 (551,84):
Berechnet ... C 58,8, H 7,5, N 7,7; gefunden .... C 58,8, H 7,7, N 7,8.
Schritt 2
H-Glu(OtBu)-Ser-Ala-OtBu (H-30-32-OlBu)
.16,Og (29 mMol) Z-30-32-OtBu werden in 350 ml Methanol gelöst und in Gegenwart von 1,6 g Palladium-Aktivkohle hydriert. Nach Beendigung der Reaktion wird der Katalysator abfiltriert und das Filtrat zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird aus einem Gemisch von Methanol und Äther kristallisiert. Es werden 9,06 g (75%) H-30-32-OtBu gewonnen. Schmelzpunkt: 135bis 1360CjRi-1:0,15; [α], = -25,9° (c = 1; Äthanol).
Analyse C19H35N3O7 (417,80):
Berechnet ... C 54,6, H 8,5, N 10,1: gefunden .... C 54,5, H 8,4, N 9,8.
Schritt 3
Z-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser-Ala-OtBu (Z-29-32-OtBu)
8,2 g (19,6 mMol) H-30-32-OtBu und 8,0 g (19,OmMoI) Z-Asp(OtBu)-ONSu werden in 80 ml Äthylacetat zur Reaktion gebracht. Die Lösung wird anderntags nacheinander mit 3 · 20 ml n-Salzsäure, 3-20ml 5%iger NaHCO3-Lösung und schließlich mit Wasser ausgeschüttelt. Die Lösung wird getrocknet, das Äthylacetat abdestilliert und der Rückstand mit Petroläther auf ein Filter aufgebracht. Es werden 12,08 g (85,5%) Z-29-32-OtBu gewonnen. Schmelzpunkt: 85 bis 87° C; RV: 0,55; [a]„ = -32,8° [C= 1; Äthanol).
Analyse C35H54O12N4 (722,81):
Berechnet
gefunden .
C 58,2. H 7,5, N 7,8; C 58,3, H 7,6. N 7,3.
Schritt 4
H-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser-Ala-OtBu (H-29-32-OtBu)
10,5 g (14,5 mMol) Z-29-32-OtBu werden in 130 m! Methanol gelöst und in Gegenwart von 1 g Palladium-Aktivkohle hydriert. Nach Beendigung der Reaktior wird der Katalysator abfiltriert und das Filtrat zui Trockne eingedampft. Der Rückstand wird mit Petrol äther verrieben. Es werden 8,35 g (97,5% H-29-32-OtBu gewonnen. Schmelzpunkt: 81 bis 82° C RV: 0,1; [«]„ = -24,3° (c = 1; Äthanol).
Schritt 5
Z-GIU(OtBU)-As(OtBu)-GIu(OtBu)-SCr-AIa-OtBu (Z-28-32-OtBu)
5,0 g (11,5 mMol) Z-GIu(OtBu)-ONSu und 6,6 (11,2 mMol) H-29-32-OtBu werden in 100 ml Chlore form zur Reaktion gebracht. Anderntags wird da
Reaktionsgemisch nacheinander mit 3 · 30 ml n-Salzsäure, 3 · 30 ml NaHCO3-Lösung und schließlich mit Wasser ausgeschüttelt. Die Lösung wild getrocknet und das Chloroform abdestilliert. Der Rückstand wird durch Umfallen aus Chloroform-Petroläther gereinigt. Ausbeute: 8,45 g (83%) Z-28-32-OtBu. Schmelzpunkt: 168 bis 169°C; R'f': 0,5; [«]„ =-- -29 (c = 1; Äthanol).
Analyse C44H69N5O15 (908,07):
Berechnet ... C 58,2, H 7,7, N 7,7;
gefunden .... C 58,4, H 7,7, N 7,5.
Schritt 6
H-GIU(OtBU)-ASp(OtBu)-GIu(OtBu)-SCr-AIa-OtBu (H-28-32-OtBu)
8,0 g (8,8 mMol) Z-28-32-OtBu werden in 160 ml Methanol gelöst und in Gegenwart von 1 g Palladium-Aktivkohle hydriert. Nach Beendigung der Reaktion wird der Katalysator abfiltriert und das Filtrat zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird mit einem Gemisch aus Äther und Petroläther verrieben. Es werden 6,4 g (94%) H-28-32-OtBu gewonnen. Schmelzpunkt: 138 bis 139° C; R'f 2: 0,1; [Y], = -29,7° (c = 1; Äthanol). 1S
Schritt 7
Z-Ala-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser-Ala-OtBu (Z-27-32-OtBu)
5,2 g (6,7 mMol) H-28-32-OtBu werden in 50 ml Chloroform mit 2,15 g (6,7 mMol) Z-AIa-ONSu zur Reaktion gebracht. Anderntags wird das Reaktionsgemisch nacheinander mit 3 · 10 ml n-Salzsäure, 3 ■ 10 ml 5%iger NaHCO3-Lösung und mit Wasser ausgeschüttelt. Die Lösung wird getrocknet und das Chloroform abdestilliert. Der Rückstand wird mit Petroläther auf ein Filter aufgebracht. Ausbeute: 6,1 g (93,l%)Z-27-32-OtBu. Schmelzpunkt: 194 bis 195°C; R'r2: 0,5; O]0 = 30,9° (c = 1; Äthanol). Analyse C47H74Ok6N6 (979,14):
Berechnet ... C 57,7, H 7,6, N 8,6;
gefunden .... C 57,6, H 7,7, N 8,5.
Schritt 8
H-Als-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-
Ser-Ala-OtBu (H-27-32-OtBu)
6,1g (6,2 mMol) Z-27-32-OtBu werden in 120 ml Methanol gelöst und in Gegenwart von 1 g Palladium-Aktivkohle hydriert. Nach Beendigung der Reaktion wird der Katalysator abfiltriert und das Filtrat zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird aus einem Gemisch von Äthanol und Äther kristallisiert. Ausbeute: 4,35 g (83%) H-27-32-OtBu. Schmelzpunkt: 192 bis 1940C; R?: 0,1.
Analyse C39H68N6O14 (845,0):
Berechnet ... C 55,4, H 8,1, N 9,9;
gefunden .... C 55,2, H 7,8, N 9,6.
Schritt 9
Z-Asn-Gly-Ala-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser-Ala-OtBu (Z-25-32-OtBu)
2,45 g (13,3 mMol) Pentafluorphenol, 1.31g (4,02 mMol) Z-Asn-Gly-OH (Beispiel 1) und 3,4 g (4,02 mMol) H-27.32-OtBu werden in 24 ml trokkenem Dimethylformamid gelöst, die Lösung wird auf 00C abgekühlt.und 0,915 g (4,43 mMol) DCC werden zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird eine halbe Stunde lang bei O0C, dann 2,5 Stunden lang bei Zimmertemperatur gerührt. Das ausgeschiedene DCU wird abfiltriert und das Filtrat zur Trockne eingedampft. Der feste Rückstand wird mit Äthylacetat durchgearbeitet, abfiltriert und mit heißem Äthylacetat gewaschen. Ausbeute:4,l 2 g(89%)Z-25-32-OtBu. Schmelzpunkt: 200 bis 201°C; R?: 0.6; [«]* = - 13,9° (c· = 1; DMF).
Schritt 10
H-Asn-Gly-Ala-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser-Ala-OtBu (H-25-32-OtBu)
4,0 g (3,48 mMol) Z-25-32-OtBu werden in 140 ml Methanol gelöst und in Gegenwart von 0,5 g Palladium-Aktivkohle hydriert. Nach Beendigung der Reaktion wird der Katalysator abfiltriert und das Filtrat zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird mit Äther durchgearbeitet und filtriert. Ausbeute: 3,4 g (96%) H-25-32-OtBu. Schmelzpunkt: 188 bis 190"C; R^: 0,5; [,i], = -6,6C (c = 0,89; DMF).
Schritt 11
Z-LyS(B OC)-LyS(B OC)-Arg(N O2 )-Arg(N O2 )-Pro-
Val-Lys(BOC)-Val-Tyr(tBu)-Pro-Asn-Gly-Ala-
Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser-Ala-OtBu
(Z-15-32-OtBu)
3,0 g (2,95 mMol) H-25-32-OtBu und 5,46 g (2,95 mMol) Z - Lys (BOC) - Lys (BOC) - Arg (NO2)-Arg(NO2)-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr(tBu)-Pro-OH (österreichische Patentschrift 295 051) werden in 33 ml Dimethylformamid gelöst, die Lösung wird auf 0° C abgekühlt, und 3,35 g (4,42 mMo!) DCC-PFPOH-Komplex werden zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird 15 Minuten lang bei O1 C, dann 6 Stunden lang bei Zimmertemperatur gehalten. Das ausgeschiedene DCU wird abfiltriert, wobei das Filtrat in 450 ml trockenen Äther einlaufen gelassen wird. Das ausgeschiedene Rohprodukt wird durch Umfallen aus einem Methanol-Äther-Gemisch gereinigt. Ausbeute: 7,18 g (85,1%) Z-15-32-OtBu. R?: 0,35; [«]0 = -26,4° (c = 0,42; DMF).
Schritt 12
H-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Arg(NO2)-Arg(NO2)-Pro-
Val-Lys(BOC)-Val-Tyr(tBu)-!Pro-Asn-Gly-Ala-
Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Glu|ΌtBu)-Ser-Ala-
OtBu · 3HCl (H-15-32-OtBu · 3HCl)
6,5 g (2,28 mMol) Z-15-32-OtBu werden in 85 ml Essigsäure gelöst und in Gegenwart von 2 g Palladium-Aktivkohle hydriert. Die Reaktion wird mittels Dünnschichtchromatographie verfolgt. Nach Beendigung der Reaktion wird der Katalysator abfiltriert, das Filtrat zur Trockne eingedampft und der ölige Rückstand mit trockenem Äther zum Erstarren gebracht. Nach dem Abfiltrieren wird das Produkt in 70 ml Wasser gelöst und der pH-Wert der Lösung mit verdünnter Salzsäure auf vier eingestellt. Danach wird das Produkt durch Zugabe von 30%iger Kochsalzlösung aus der Lösung ausgefällt. Nach dem Filtrieren und Trocknen wird das Produkt durch Umfallen aus einem Methanol-Chloroform-Gemisch vom Salz befreit. Das Lösungsmittel wird abdestilliert und der
509 622/284
10
15
Rückstand mit Äther durchgearbeitet und filtriert. Ausbeute: 5,6 g (89,6%) H-15-32-OtBu · 3HU; Rf: 0,35; [o]e = -26,1° (c = 1; DMF).
Aminosäureanalyse:
Lys 3,0(3); Arg 1,8(2); Asp 1,98(2); Ser 1,0(1); GIu 2,2(2); Pro 2,1(2); GIy 1,05(1); AIa 2,0(2); VaI 1,96(2); Tyr 0,96(1).
Schritt 13
BOC-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu(OtBu)-His-Phe-Arg-Trp-
G!y-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC)-
Arg-Arg-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr(tBu)-Pro-Asn-
Gly-Ala-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser-
AIa-OtBu · 3HCl (BOC-1-31-OtBu · 3HC1)
3,11g (1,57 mMol) BOC-Ser-Tyr-Ser-Met-GIu(OtBu)-HiS-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-OH ■ HCl (österreichische Patentschrift 295 051) und 4,30 g (1,57 mMoJ) H-15-32-OtBu werden in 25 ml Dimethylformamid gelöst und der Lösung0,22 ml Triäthylamin sowie 1,79 g(2,36 mMol) DCC-PFPOH-Komplex zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird bei Zimmertemperatur 24 Stunden lang gerührt und dann in 300 ml trockenen Äther filtriert. Das ausgeschiedene Produkt wird abfiltriert und gewaschen. Ausbeute: 7,2 g (98,5%) BOC-1-32-OtBu -3 HCl; Rf: 0,5; [«]0 = -27,6o(c= 1;DMF).
Schritt 14
H-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-
Val-Tyr-Pro-Asn-Gly-Ala-Glu-Asp-Glu-Ser-AIa · 3 CH3COOH (H-1-32-OH · 3 CH3COOH)
3,0 g (0,64 mMol) BOC-l-32-OtBu · 3HCl werden unter Rühren in einem Gemisch aus 3,0 ml Anisol, 3,0 ml Wasser und 24 ml Trifluoressigsäure gelöst. Nach einstündigem Rühren werden dem Reaktionsgemisch 300 ml Äther zugesetzt. Der ausgeschiedene Niederschlag wird abfiltriert und mit Äther gewaschen. Das erhaltene Trifluoracetat (2,86 g) wird in Wasser gelöst und die Lösung über eine Säule mit Ionenaustauschharz (Acetatform) filtriert. Danach wird die Lösung auf eine mit 500 ml Carboxymethylcellulose gefüllte Säule aufgebracht. Die säulenchromatopraphische Reinigung erfolgt durch Gradienteneluier \.g. Die das Hauptprodukt enthaltenden Fraktionen werden gesammelt und lyophilisiert. Auf diese Weise werden 1,7 g (70%) chromatographisch einheitliches und biologisch völlig aktives H-1-32-OH gewonnen.
Aminosäureanalyse:
Lys 3,94(4); His 1,0(1); Arg 2,81 (3);
Asp 2,07(2); Met 0,72(1); Ser 2,72(3);
GIu 2,94(3); Pro 2,96(3); GIy 2,89(3); AIa 2,2(2); VaI 2,97(3); Tyr 1,98(2): Phe 0.99(1).
eelöst und in Gegenwart von Palladium-Aktivkohle hydriert Nach Beendigung der Reaktion wird der Katalysator abfiltriert und das Filtrat auf 100 ml eingedampft, auf -20 C abgekühlt und in f:jne Lösung folgender Zusammensetzung eingegossen· 38 35 g (47,7 mMol) Z-Ser-Ala-GIu(OtBu)-Ala-Phe-Pr'o-OH (österreichische Patentschrift 295 051) werden in 100 ml Dimethylformamid gelöst, mit 5.27 ml (47 4 mMol) N-Methylmorpholin versetzt, auf -K)0C abgekühlt und unter Rühren 6,26 ml (47.4 mMol) Chlorkohlensäurebutylester zugesetzt. Dai "-aktionseemisch wird bei -100C 8 Minuten !:.- gerührt, dann auf -203C abgekühlt und die oben beschriebene, vorgekühlte Lösung der Amino-Komponente zugegossen. Das Reaktionsgemisch wird 15 Minuten lang |ei -100C, 1 Stunde lang bei O0C und schließlich 1 Stunde lang bei Zimmertemperatur gerührt. Dann wird das Reaktionsgemisch in 2 1 Eiswasser gegossen, ebs 45 ml N-Methylmorpholin enthält. Der Niederschlag wird filtriert, mit verdünnter Zitronensäure, dann mit Wasser und schließlich mit Äther gewaschen Ausbeute: 55,85 g (89,9%) Z-31-39-OtBu. Schmelzpunkt (Zers.): 180° C; R?: 0,7.
Beispiel 4 Synthese des menschlichen ACTH
Schritt 1
Z-Ser-Ala-Glu(OtBu)-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu(OtBu)-
Phe-OtBu(Z-31-39-OtBu)
31,6 g (48,3 mMol) Z-Leu-Glu(OtBu)-Phe-OtBu (s. S. Bajusz, T. Läzar: Acta Chim. Hung. 48, 111 [1966]) werden in 310ml Dimethylformamid
60 Schritt 2
H-Ser-Ala-GlutOtBuJ-Ala-Phc-Pro-Leu-GIu(OlBu)-Phe-OtBu(H-31-39-OtBu)
78.95 g (60,15 mMol) Z-31-39-OtBu werden in 1500 ml 80%iger Essigsäure gelöst und in Gegenwart von Palladium-Aktivkohle hydriert. Nach Beendigung der Reaktion wird der Katalysator abfiltriert und das Filtrat zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird mit Äther durchgearbeitet und filtriert. Ausbeute: 74,35 g (99%) H-31-39-OtBu. Schmelzpunkt (Zers.): 105° C; R?: 0,5.
Schritt 3
Z-GIu(OtBu)-SCr-AIa-GIu(OiBu)-AIa-PhC-PrO-Leu-Glu(OtBu)-Phe-OtBu (Z-30-39-OtBu)
44,5 g (85,8 mMol) des DCHA-Salzes von Z-GIu(OtBu)-OH werden in 450 ml trockenem Äther suspendiert und 9,6 ml (85,8 mMol) N-Methylmorpholin zugesetzt. Bei einer Temperatur von - 10 C werden unter Rühren 11.3 ml (85,8 mMol) Chlorkohlensäureisobutylester in die Lösung eingetropft und dann auf -20° C abgekühlt. Bei dieser Temperatur wird die vorher auf - 20" C gekühlte Lösung von 88,5 g (71,5 mMol) H-31-39-OtBu in 300 ml trockenem Dimethylformamid zugesetzt und dann das Reaktionsgemisch 15 Minuten lang bei - 100C, 1 Stunde lang bei 00C und schließlich 1 Stunde lang bei Zimmertemperatur gerührt. Anschließend wird das Reaktionsgemisch in 8 1 η-Zitronensäure gegossen. Der ausgeschiedene Niederschlag wird abfiltriert und mit Wasser und dann mit Äther gewaschen. Es werden 1041g (97,2%) Z-30-39-OtBu erhalten. Schmelzpunkt: 136 bis 138°C (Zers.); Rf: 0,8.
Schritt 4
H-Glu(OtBu)-Ser-Ald-Glu(OtBu)-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu(OtBu)-Phe-OtBu(H-30-39-OtBu)
103,1 g(68,8 mMol) Z-30-39-OlBu werden in 1500ml 80%igcr Essigsäure gelöst und in Gegenwart von Pailadium-Aktivkohlc hydriert. Nach Beendigung der Reaktion wird der Katalysator abfiltriert und das
Filtrat zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird mit Äther durchgearbeitet, abfiltriert und mit Äther gewaschen. Es werden 90,75 g (92,7%) H-30-39-OtBu gewonnen. Schmelzpunkt: 118°C (Zers.); Rf: 0,5.
Schritt 5
Z-Asp(OtBu)-Glu(OtBu}-Ser-Ala-Glu(OtBu)-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu(OtBu)-Phe-OtBu(Z-29-39-OtBu)
38,3 g (75,9 mMol) des DCHA-Salzes von Z-Asp(OtBu)~OH werden in 400 ml trockenem Dimethylformamid suspendiert und 8,5 ml (76,6 mMol) N-Methylmorpholin zugesetzt. Das Gemisch wird auf -1O0C gekühlt und unter Rühren mit 10 ml (75,9 mMol) Chlorkohlensäureisobutylester versetzt. Das Reaktionsgemisch wird aaf -200C gekühlt und eine auf -200C vorgekühlte Lösung von 90 g (63,25 mMol) H-30-39-OtBu in 250 ml Dimethylformamid zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird bei -10° C 15 Minuten lang, bei 0°C 1 Stunde lang und bei Zimmertemperatur eine weitere Stunde lang gerührt. Das ausgeschiedene Salz wird abfiltriert und das Filtrat zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird mit η-Zitronensäure durchgearbeitet, filtriert und bis zur Neutralität gewaschen. Ausbeute: 98,5 g (93%) Z-29-39-OtBu. Schmelzpunkt (Zers.): 185°C; Rf: 0,8.
Schritt 6
H-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-$er-Ala-Glu(OtBu)-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu(OtBu)-Phe-OtBu(H-29-39-OtBu)
67,25 g (42,ISmMoI) Z-29-39-OtBu werden in 1300 ml 80%iger Essigsäure gelöst und in Gegenwart von Palladium-Aktivkohle hydriert. Nach Beendigung der Reaktion wird der Katalysator abfiltriert und das Filtrat zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird mit Äther durchgearbeitet, filtriert und getrocknet. Ausbeute: 63,8 g (95%) (Z-29-39-OtBu). Schmelzpunkt (Zers.): 128 bis 132°C; Rp: 0,3.
Schritt 7
Z-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Glu(OlBu)-Ser-Ala-
Glu(OtBu)-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu(OtBu)-Phe-OtBu
(Z-28-39-OtBu)
Schritt 8
Z-Ala-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser-Ala-Glu(OtBu)-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu(OtBu)-Phe-OtBu (Z-27-39-OtBu)
69,0 g (37,2 mMol) Z-29-39-OtBu werden in 1800 ml trockenem Dimethylformamid gelöst und ia Gegenwart von Palladium-Aktivkohle hydriert. Nach Beendigung der Reaktion wird der Katalysator abfiltriert
ίο und das Filtrat auf 300 ml eingeengt. Unter Rühren werden 20,2 g (42,85 mMol) Z-AIa-OPCP, danach in Portionen 4,76 ml (42,85 mMol) N-Methylmorpholin zugegeben. Anderntags wird die zähe, harzartige Mischung unter Rühren und Kühlen in 41 5%ige NaHCO3-Lösung eingegossen. Die ausgeschiedene Substanz wird abfiltriert und bis zur Neutralität gewaschen. Das rohe Produkt wird in 1900 ml Methanol heiß gelöst und mit 1100 ml Wasser ausgefällt. Anderntags wird filtriert, das Produkt gewaschen und getrocknet. Ausbeute: 59,2 g (82,6%) Z-27-39-OtBu. Schmelzpunkt: 210 C; R'f 2: 0,7.
Schritt 9
H-Ala-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser-Ala-Glu(OtBu)-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu(OtBu)-Phe-OtBu (H-27-39-OtBu)
8,5 g (4,41 mMol) Z-27-39-OtBu werden in 850 ml trockenem Dimethylformamid gelöst und in Gegenwart von Palladium-Aktivkohle hydriert. Nach Beendigung der Reaktion wird der Katalysator abfiltriert, die Lösung eingedampft, mit Äther durchgearbeitet und anschließend filtriert. Ausbeute: 7,65 g (96,9%) H-27-39-OtBu. Schmelzpunkt (Zers.): 197°C;
JS R1,2:0,3.
Schritt 10
Z-Asn-Gly-Ala-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser-Ala-G!u(OtBu)-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu(OtBu)-Phe-OtBu (Z-25-39-OtBu)
3,58g(2,0mMol)H-27-39-OtBuund0,65g(2,0mMol)
Z-Asn-Gly-OH (Beispiel 1) werden in 30 ml trockenem Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird auf 00C
4S abgekühlt und mit 1,8 g (2,4 mMol) DCC-PFPOH-
"" Komplex versetzt. Nach vierstündigem Rühren wird
das Reaktionsgemisch in 300 ml Äther filtriert, der ausgeschiedene Niederschlag abfiltriert und mit Äther gewaschen. Ausbeute: 3,7 g (88%) Z-25-39-OtBu.
.„ Schmelzpunkt (Zers.): 1940CiR^2: 0,3.
27,3 g des DCHA-Salzes von Z-GIu(OtBu)-OH werden in 270 ml trockenem Dimethylformamid suspendiert, 5,6 ml (53,2 mMol) N-Methylmorpholin werden zugesetzt, das Reaktionsgemisch wird auf
— 100C abgekühlt, und bei dieser Temperatur werden unter Rühren 6,95 ml (52,55 mMol) Chlorkohlensäureisobutylester zugetropft. Nach 8 Minuten wird auf
— 20°C abgekühlt. Bei dieser Temperatur wird die auf - 20° C vorgekühlte Lösung von 69,9 g (43,8 mMol) H-29-39-OtBu in 270 ml Dimethylformamid zügesetzt. Die Temperatur wird 15 Minuten lang auf
— 100C, 1 Stunde lang auf 00C und 1 Stunde lang bei Zimmertemperatur gehalten. Danach wird das ausgeschiedene Salz abfiltriert, das Filtrat zur Trockne eingedampft, der Rückstand mit η-Zitronensäure auf ein Filter aufgebracht und bis zur Neutralität gewaschen. Ausbeute: 70,15 g (86,2%) Z-28-39-OtBu. Schmelzpunkt (Zers.): 205°C; R'r 3: 0,9.
Schritt 11
H-Asn-Gly-Ala-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser-Ala-Glu(OtBu)-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu(OtBu)-
Phe-OtBu · HCl (H-25-39-OtBu · HCl) 3,92 g (1,87 mMol) Z-25-39-OtBu werden in 400 ml 80%iger Essigsäure gelöst und in Gegenwart von Palladium-Aktivkohle hydriert. Nach Beendigung der Reaktion wird der Katalysator abfiltriert und das Filtrat zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in trockenem Dimethylformamid gelöst und der Lösung Pyridin zugesetzt, das 6 bis; 8 Äquivalente Salzsäure enthält. Das nach Abdestillieren des Lösungsmittels erhaltene öl wird mit Wasser auf ein Filter aufgebracht, danach mit Wasser und schließlich mit Äthylacetat gewaschen. Ausbeute: 3,22 g (86,1%) H-25-39-OlBu · HCl. Schmelzpunkt (Zers.): 1870C; R'f 3:0,31.
Schritt 12
gewonnene Rückstand wird mit Wasser durchgearbdfet, filtriert und mit Wasser gewaschen Ausbeute. 4,0 g Z-Lys(BOO-Lys(BOC)-Arg(NO,)-Arg(N02)-Pro- (85o/o} H-15-39-OtBu-3HC1. Schmelzpunkt (Zers.): Val-LysfBOCKVal-TyrttBuJ-Pro-Asn-Gly-Ala- 208= C; R/: 0,35.
Schritt 14
H-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lvs-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tvr-Pro-Asn-Gly-Ala-Glu-Asp-Glu-Ser-Ala-Glu-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu-Phe-OH (H-1-39-OH)
36 g (1,OmMoI) H-15-39-OtBu · 3HCl und 2,0 g (1 JnMoI) BOC-Ser-Tyr-Ser-Met-G]u(OtBu)-His-PhT-Arg-Trp-Gly-LysiBOq-Pro-Val-Gly-OHHCl
■ 5 (s österreichische Patentschrift 295 051) werden in ^O ml Dimethylformamid gelöst, die Losung wird auf OC abgekühlt, und 0,11ml (ImMoI) N-Methylmorphofin sowie 0,95 g DCC-PFPOH-Komplex werden zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird 24 Stunden
lang bei Zimmertemperatur gerührt und danach in WmI Äther filtriert. Das ausgeschiedene Produkt (5 6 g· Rf- 0 55) wird abfiltriert und zuerst mit Äther, dann mit Wasser gewaschen. 1 g des so gewonnenen Produktes wird in einem Gemisch aus 20 ml Tnfluor-
essigsäure und 1 ml Mercaptoäthanol gelost. Die Lösung wird 1 Stunde lang bei Zimmertemperatur stehengelassen und dann im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird in 20 ml Wasser gelöst und wieder im Vakuum eingedampft. Der Eindampfruckstand
wird in 10 ml Wasser gelöst, und mit Hilfe eines acetatcyclischen Ionenaustauscherharzes werden die Trifluoracetationen gegen Acetationen ausgetauscht. Die Lösung wird lyophilisiert und das Produkt auf einer mit dem Ionenaustauscher CM-32 gefüllten
Säule mit einer Puffergradienten von 0,13 Mol (pH 6.6) bis 0 25 Mol (pH 7) gereinigt. Die Fraktionen, die den gewünschten Stoff enthalten, werden vereinigt und lyophilisiert. Es werden 0,6 g (60%) H-1-39-OH erhalten. Rf*: 0,25.
40 Aminosäureanalyse:
Asp 1,9(2); Ser 2,7(3); GIu 4,7(5); Pro 3,8(4);
GIy 3,0(3); AIa 3,0(3); Leu 1,0(1); VaI 2.9(3):
Met 0,95(1); Tyr 1,9(2); Phe 3,0(3); His 0.95(1); Lys 3,8(4): Arg 2.8(3).
GluiOtBuJAspiOtBuJGlutO^ Glu(OtBu)-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu(OtBu)-Phe-OtBu (Z-15-39-OtBu)
3,0 g (],5mMol) H-25-39-OtBu HCI und 3,1g (1,65 mMol) Z - Lys (BOC) - Lys (BOC) - Arg (NO2)-Arg(NO2)-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr(tBu)-Pro-OH (s. österreichische Patentschrift 295 051) werden in 20 ml trockenem Dimethylformamid gelöst, und die Lösung wird auf 0°C abgekühlt und mit 0,166 ml (1,5 mMol) N-Methylmorpholin, dann mit 1,4 g DCC-PFPOH-Komplex versetzt. Das Reaktionsgemisch wird 24 Stunden lang bei Zimmertemperatur gerührt, danach in 400 ml Äther filtriert. Der ausgeschiedene Niederschlag wird abfiltriert, in Aceton suspendiert, gerührt und auf ein Filter aufgebracht. Ausbeute: 5,15 g (90%) Z-15-39-OtBu. bchmelzpunkt (Zers.): 220°C; R1^: 0,2; Rf: 0,65.
Schritt 13
H-LyS(BOC)-LyS(BOC)-ArS-ArS-PrO-VaI-LyS(BOC)-
Val-Tyr(tBu)-Pro-Asn-Gly-Ala-Glu(OtBu>
ASP(OtBu)-GIu(OtBu)-SCr-AIa-GIu(OtBu)-AIa-PhC-
Pro-Leu-Glu(OtBu)-Phe-OtBu · 3HCl
(H-15-39-OtBu-3HCl)
5,0 g (1,31 mMol) Z-15-39-OtBu werden in 100 ml 80%iger Essigsäure gelöst, 3 g aktivierter Zinkstaub wird zugesetzt und das Reaktionsgemisch bei Zimmertemperatur gerührt. Die Reduktion wird mittels" Dünnschichtchromatographie kontrolliert. Nach Beendigung der Reduktion wird die Suspension nitriert, das Filtrat eingedampft und der Rückstand mit Wasser durchgearbeitet, danach filtriert. Das Produkt wird in 300 ml 80%iger Essigsäure gelöst und in Gegenwart von Palladium-Aktivkohle hydriert. Nach Beendigung der Reaktion wird der Katalysator abfiltriert, die Lösung zur Trockne eingedampft, der Rückstand mit Äther durchgearbeitet und filtriert. Das Produkt wird in 40 ml Pyridin gelöst und unter Kühlung mit 10 ml Pyridin versetzt, das 1.5 ml konzentrierte Salzsäure enthält. Der durch Eindampfen der Lösung

Claims (1)

  1. Patentanspruch:
    Verfahren zur Herstellung von Asparaginylgruppen enthaltenden, biologisch aktiven Polypeptiden durch Verknüpfung der entsprechenden geschützten Peptidkomponenten nach der Aktivestermethode und anschließende Abspaltung der Schutzgruppen, dadurch gekennzeichnet, daß die Carboxylgruppe der Acylierungskomponente bei Raumtemperatur bis ungefähr 00C durch Umsetzen zum Pentafiuorphenylester aktiviert und die Acylierungsreaktion innerhalb des gleichen Temperaturbereichs durchgeführt wird.
DE2324239A 1972-05-15 1973-05-14 Verfahren zur Herstellung von Asparaginylgruppen enthaltenden biologisch aktiven Polypeptiden Expired DE2324239C3 (de)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
HURI465A HU166913B (de) 1972-05-15 1972-05-15

Publications (3)

Publication Number Publication Date
DE2324239A1 DE2324239A1 (de) 1973-12-06
DE2324239B2 DE2324239B2 (de) 1974-10-10
DE2324239C3 true DE2324239C3 (de) 1975-05-28

Family

ID=11000888

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE2324239A Expired DE2324239C3 (de) 1972-05-15 1973-05-14 Verfahren zur Herstellung von Asparaginylgruppen enthaltenden biologisch aktiven Polypeptiden

Country Status (26)

Country Link
US (1) US3953415A (de)
JP (1) JPS5516417B2 (de)
AT (1) AT351683B (de)
BE (1) BE799552A (de)
BG (1) BG20341A3 (de)
CA (1) CA1027111A (de)
CH (1) CH580064A5 (de)
CS (1) CS173632B2 (de)
DD (1) DD105603A5 (de)
DE (1) DE2324239C3 (de)
DK (1) DK147944C (de)
EG (1) EG11309A (de)
ES (1) ES414589A1 (de)
FI (1) FI56830C (de)
FR (1) FR2184814B1 (de)
GB (1) GB1429251A (de)
HU (1) HU166913B (de)
IL (1) IL42108A (de)
NL (1) NL176946C (de)
NO (1) NO139268C (de)
PL (1) PL91030B1 (de)
RO (1) RO72336A (de)
SE (1) SE421790B (de)
SU (1) SU505352A3 (de)
YU (1) YU36689B (de)
ZA (1) ZA733242B (de)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2296427A1 (fr) * 1974-12-31 1976-07-30 Choay Sa Agent peptidique de regulation de la glycemie
CA1315229C (en) * 1987-06-10 1993-03-30 Patrick J. Baker Chromatographic purification process
US6031074A (en) * 1989-08-25 2000-02-29 National Institutes Of Health Automated Peptide design and synthesis
JP2593495Y2 (ja) * 1991-05-31 1999-04-12 矢崎総業株式会社 高圧抵抗電線の端部構造
SE520392C2 (sv) * 1996-09-27 2003-07-01 Creative Peptides Sweden Ab C Specifika peptider för behandling av diabetes mellitus
DE10054687A1 (de) * 2000-11-03 2002-05-16 N Zyme Biotec Gmbh Inhibitoren von Transglutaminasen
WO2022217395A1 (zh) 2021-04-12 2022-10-20 南京汉欣医药科技有限公司 一种高纯的人促肾上腺皮质激素或其类似物及其规模化制备方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL6509727A (de) * 1965-07-28 1967-01-30
NL6611701A (de) * 1965-08-24 1967-02-27

Also Published As

Publication number Publication date
SU505352A3 (ru) 1976-02-28
BG20341A3 (bg) 1975-11-05
DD105603A5 (de) 1974-05-05
ES414589A1 (es) 1976-02-01
NL176946C (nl) 1985-07-01
US3953415A (en) 1976-04-27
JPS5516417B2 (de) 1980-05-01
PL91030B1 (de) 1977-02-28
DK147944B (da) 1985-01-14
BE799552A (fr) 1973-08-31
HU166913B (de) 1975-06-28
FI56830C (fi) 1980-04-10
FR2184814B1 (de) 1977-04-22
ATA306973A (de) 1979-01-15
IL42108A0 (en) 1973-06-29
NL7306764A (de) 1973-11-19
AU5457673A (en) 1974-10-17
YU36689B (en) 1984-08-31
CH580064A5 (de) 1976-09-30
SE421790B (sv) 1982-02-01
FI56830B (fi) 1979-12-31
RO72336A (ro) 1982-02-26
AT351683B (de) 1979-08-10
JPS49100031A (de) 1974-09-20
DE2324239A1 (de) 1973-12-06
NO139268C (no) 1979-01-31
YU127373A (en) 1982-02-25
NL176946B (nl) 1985-02-01
ZA733242B (en) 1974-04-24
CA1027111A (en) 1978-02-28
EG11309A (en) 1978-03-29
DK147944C (da) 1985-08-26
NO139268B (no) 1978-10-23
DE2324239B2 (de) 1974-10-10
FR2184814A1 (de) 1973-12-28
IL42108A (en) 1975-12-31
GB1429251A (en) 1976-03-24
CS173632B2 (de) 1977-02-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE2858718C2 (de)
DE2324239C3 (de) Verfahren zur Herstellung von Asparaginylgruppen enthaltenden biologisch aktiven Polypeptiden
DE2463205C2 (de) Octapeptid und Verfahren zu dessen Herstellung
CH570972A5 (en) Decapeptide
DE2731308A1 (de) Psychopharmakologisch wirksame peptide und peptidderivate und verfahren zu deren herstellung
DE1518097B1 (de) Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden
DE3340208A1 (de) Neue biologisch aktive peptide, verfahren zu deren herstellung und veterinaerpraeparate, welche diese enthalten
DE1643496C3 (de) Verfahren zur Herstellung von menschlichem Corticotropin bzw. analoger Verbindungen
DE3886656T2 (de) Lösungssynthese eines Oktapeptids.
DE2311786C2 (de) Verfahren zur Herstellung von Peptiden
DE2460469A1 (de) Neue peptide mit biologischer wirkung und verfahren zu ihrer herstellung
DE2341775B2 (de) In Nterminaler Stellung den Rest einer Aminooxysäure aufweisende Peptide mit ACTH-Wirkung, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie diese Peptide enthaltende Arzneimittel
DE1941511C2 (de) Calcitonin-Analoga und ihre &amp;alpha;-Desamino- und N&amp;uarr;&amp;alpha;&amp;uarr;-Acylaminoderivate, diese Peptide enthaltende pharmazeutische Präparate, und synthetische Verfahren zu ihrer Herstellung sowie zur Herstellung von Calcitonin M
DE2754770C2 (de) N-Acyltetrapeptidamide, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel
DE3886655T2 (de) Verfahren zur Herstellung eines Oktapeptids.
DE3312399A1 (de) Biologisch aktive peptide und arzneimittel, welche diese enthalten
DE1493559C3 (de) Neue Peptide mit adrenocorticotroper Wirkung und Verfahren zu ihrer Herstellung
DE2727048C2 (de) 8-Norleucyl-ceruletide
DE1800129C3 (de) Biologisch aktive Polypeptide und Verfahren zu ihrer Herstellung
US4407745A (en) Heptacosapeptide
AT300207B (de) Verfahren zur Herstellung neuer hypocalcämischer Peptide
DE1768814A1 (de) Neue Peptide mit ACTH-Wirkung und Verfahren zu ihrer Herstellung
DE1543485A1 (de) Neue Peptide mit ACTH-Wirkung
DE1800129B2 (de) Biologisch aktive Polypeptide und Verfahren zu ihrer Herstellung
DE1493559B2 (de) Neue peptide mit adrenocorticotroper wirkung und verfahren zu ihrer herstellung

Legal Events

Date Code Title Description
C3 Grant after two publication steps (3rd publication)
E77 Valid patent as to the heymanns-index 1977