Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania zawartego w organizmie ludzkim hormonu adrenokortiko¬ tropowego o ogólnym wzorze H-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Fen-Arg-Trp-Gli-Liz-Pro-Wal-Gli-Liz-Liz-Arg-Arg-Pro-Wal- Liz-Wal-Tyr-Pro-Asp.NH2-Gli-Ala-Glu-Asp^lu-Q, w którym Q oznacza:SerOH, Ser-Ala-OH, Ser-Ala^Glu-OH, Ser- Ala-Glu-Ala-OH, Ser-Ala-Glu-Ala-Fen-OH, Ser-Ala-Glu-Ala-Fen-Pro-OH, Ser-Ala-Glu-Ala-Fen-Pro-Leu-OH, Ser- Ala-Glu-Ala Fen-Pro-Leu-Glu-OH lub Ser-Ala-Glu-Ala-Fen-Pro-Leu-Glu-Fen-OH.Uzyte skróty maja nastepujace znaczenie* Ala - alanina, Arg — arginina, Asp — kwas asparaginowy, Fen — - fenyloalanina, Gli - glicyna, Glu - kwas glutaminowy, His — histydyna, Leu — leucyna, Liz — lizyna, Met — me¬ tionina, Pro - prolina, Ser- seryna, Trp- tryptofan, Tyr- tyrozyna, Wal- walina, BOC - III rzed-butyloksy- karbonyl, tBu — III-rzed-butyl.Z literatury jest wiadomo, zjednej strony, ze w czasie syntezy peptydów asparaginowyeh grupa 0-karboksy- amidowa przechodzi latwo z odszczepieniem wody w pochodna 0-cyjanoalaninowa (M.Bodanszky, V. du Vig- neaud, J.Am.Chem.Soc. 81,5688(1959), E.Schróder, K.Liibke: Peptides I. str. 110) z drugiej zas, ze peptydy, które zawieraja przy grupie 0-karboksylowej zestryfikowana grupe asparaginylowa, ulegaja latwo przegrupowaniu na pierscieniowe pochodne imidu kwasu bursztynowego (E.Schróder, K.LUbke: Peptides I, str.203;M.A.Ondetti i wsp.: Biochemistry 7,4069 (1968). Ostatnia reakcja zachodzi szczególnie latwo, jezeli w lancuchu peptydowym po czesci asparaginowej nastepuje glicyna. Tak np. syntetyczny czteropeptyd Pro-Asp.NH2-Gli-Pro ulega iloscio¬ wo reakcji odamidowania juz w 0,1 m roztworze amoniakalnym (L. Graf i wsp.: Polypeptide Hormones, str.225, Akademia Kiadó Budapest (1971). Dla unikniecia tych trudnosci w czasie syntezy peptydów zawierajacych grupe asparaginylowa stosuje sie w ostatnich czasach w coraz wiekszym stopniu karboksyamidowe grupy ochronne (porównac np. W.Kónig, R.Geiger: Ber.103,2041 (1970) i zrozumialym jest, ze na acylowanie przy uzyciu sekwencji asparaginyloglicyny w pismiennictwie brak jest przykladów.Zdolnoscia latwego odamidowywania grupy karboksyamidowej czesci asparaginylo-glicynowej wytluma¬ czyc mozna to, ze wedlug nowszych badan przyjmowane dawniej poglady na strukture adrenokortikotropowych hormonów wymagaja poczynienia pewnych niewielkich modyfikacji. Tak wiec systematyczne porównanie mie¬ dzy naturalnymi i syntetycznymi preparatami doprowadzilo do stwierdzenia, ze lokalizowana dawniej na pozycji2 91030 grupa karboksyamidowa znajduje sie na pozycji 25, a na pozycji 26 i 27. zarówno w ludzkiej,jak i wieprzowej kortikotropinie znajduje sie sekwencja Gli-Ala (L.Graf i wsp.: Acta Biochim.Biophys. Hung. 6,415 (1971), a tak¬ ze B.Riniker i wsp.: Nature New Biology 235, 114 (1072). Zgodnie z tym rzeczywista struktura ludzkiego hormonu adrenokortikotropowegojest nastepujaca: H-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His- Fen-Arg-Trp-Gli-Liz-Pro-Wd-Gli- 12 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 -Liz-Liz-Arg-Arg-Pro-Wal-IJz-Wal-Tyr-Pro^Asp.NH2-Gli.Ala- 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 ¦Glu-Asp-Glu-Ser-Ala-Glu-Ala-Fen-Pro-Leu-Glu-Fen-OH 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 Wiadomo jest, ze synteza ludzkiego hormonu adrenokortikotropowego o strukturze opisanej przez T.H.Lee i wsp. CJ.Bioi.Chem. 236,2970 (1961), jak równiez synteza fragmentów tego hormonu opisana zostala najpierw w wegierskim opisie patentowym nr 155254 i odpowiadajacych mu zagranicznych opisach patentowych, np. brytyjskim opisie patentowym nr 1201053 oraz austriackim opisie patentowym nr 295051.Celem wynalazku jest opracowanie syntezy ludzkiego hormonu adrenokortikotropowego o okreslonej wyzej, zmodyfikowanej strukturze oraz syntezy jej specyficznych fragmentów.Wynalazek wywodzi sie z odkrycia, ze nie stosowana dotychczas do syntezy biologicznie czynnych polipep- tydów metodyka pieciofluorofenolowa (L.Kisfaludy i wsp.: Proc. 8th Europ.Peptide Symp. 1966, str.25 (1967); L.Kisfaludy i wsp.: .rOrg.Chem. 35,3563 (1970) J.Kovacs i wsp,: J.Am.Chem.Soc. 89,183 (1967) doskonale nadaje sie w odpowiednich warunkach do syntezy polipeptydów o wyzej okreslona' strukturze, które zawieraja giupe asparaginylowa.Nieoczekiwanie stwierdzono, ze z Z-Asp.NH2-OH, w którym Z oznacza benzyloksykarbonyl mozna bez ochraniania grupy karboksyamidowej wytwarzac odpowiedni ester pieciofluorofenylowy z wydajnoscia powyzej 90%, jezeli reakcje prowadzi sie w temperaturze okolo ,0°C, poniewaz na skutek tego powstrzymuje sie prak* tycznie calkowicie proces tworzenia pierscieniowej pochodnej imidu kwasu bursztynowego oraz pochodnej j3cy- janoalaniny. Wytworzona tym sposobem Z-A3p,NH2OPFP nadaje sie do acylowania pochodnych aminokwaso- wych lub peptydowych, z uniknieciem reakcji pobocznych. Taknp. mozna wytwarzac chroniony dwupeptyd Z-Asp.NHa -Gli-OtBu równiez z 90% wydajnoscia, a z niego przez traktowanie kwasem trójfluorooctowym wy¬ twarzac Z-Asp.NH2 -Gli-OH. Z tego dwupeptydu wytworzono równiez z doskonala wydajnoscia adpowiedni ester pieciofluorofenylowy, którym mozna z doskonala wydajnoscia i bez reakcji ubocznych acylowac opisane w przy¬ kladach peptydy o atomach koncowych C (ACTH27_3 j; ACTH27_32 ACTH27_29)- Przy syntezie zawierajacych grupy asparaginylowe peptydów o wiekszej liczbie czlonów, szczególnie wy¬ raznie obserwowac mozna dalsze zalety metodyki pieciofluorofenylowej. Stwierdzono, mianowicie, ze przy acylowaniu estrami pieciofluorofenylowymi uwalniany pieciofluorofenol nie powoduje zadnych trudnosci tego rodzaju, jakie w wielu przypadkach wystepuja przy stosowaniu metodyki pieciochlorofenylowej (patrz brytyjski opis patentowy nr 1201053). Wada tej ostatniej metody polega _na tym, ze przy sprzeganiu ustala sie stan równowagi, który moze byc niekiedy przesuwany w zadanym kierunku w obecnosci nadmiaru skladników amii nowych lub zasad trzeciorzedowych. W przypadku stosowania metody pieciofluorofenylowej nadmiar zasady nie jest konieczny. Obserwacja ta wydaje sie byc sprzeczna z faktem, ze wartosci pk obu wspomnianych pochod¬ nych fenylowych sa wedlug danych literaturowych identyczne (wartosc pk 5,3). Nieoczekiwanie stwierdzono, ze zmierzone w srodowisku dwumetyloformamidowym wartosci pk obu pochodnych znacznie róznia sie miedzy soba: dla pieciochlorofenolu wynosi ona 5,05, a dla pieciofluorofenolu 6,35. Innymi slowy oznacza to, ze pochodna pieciofluorofenylowa jest w dwumetyloformamidzie w mniejszym stopniu zdysocjowana, na skutek czego zrozumialym jest, ze trwale przylaczenie protonu do skladowej zasady, a tym samym zahamowanie reakcji sprzegania nie jest mozliwe, Dalsza zalete metodyki pieciofluorofenylowej stanowi to, ze wydzielany wtoku reakcji pieciofluorofenol moze byc latwo usuniety z produktu reakcji. Nie mozna tego powiedziec o pieciochlorofenolu lub tez jego solach z organicznymi zasadami. Wiaze sie to z niedogodnoscia polegajaca na tym, ze z tych zwiazków, nawet gdy pozostaja cne w mieszaninie reakcyjnej w sladowych ilosciach, powstaje w nastepujacym po etapie sprzegania procesie katalitycznego uwodorniania kwas solny, oddzialywujacy szkodli¬ wie na wrazliwe na dzialanie kwasu grupy ochronne. W przeciwienstwie do tego mozna pieciofluorofenol pros¬ tym sposobem ilosciowo usuwac, wylewajac mieszanine reakcyjna do eteru; ta droga unikac mozna wspomniane¬ go wyzej szkodliwego oddzialywania. Z praktycznego punktu widzenia, znacznie wieksza rozpuszczalnosc estru pieciofluorofenylowego w rozpuszczalnikach organicznych stanowi dalsza zalete. Za przyklad niech posluzy wytwarzanie Z-Asp.NH2 -Gli-OPFP^przy którym do tworzenia estru pieciofluorofenylowego potrzebnajest stoso- I91030 3 wania w charakterze rozpuszczalnika 1/10 tej ilosci dwumetyloformamidu, jak&bylaby potrzebna do wytworze¬ nia estru pieciochlorofenylowego. Stwierdzono ponadto, ze metoda pieciofluorofenylowa nadaje sie doskonale równiez do syntezy peptydów o wiekszej liczbie czlonów. W tym przypadku wedlug najnowszych danych litera¬ turowych nalezy dla uzyskania wyzszych wydajnosci i wiekszej czystosci produktu koncowego prowadzic proces w wyzszej temperaturze i/lub stosowac nadmiar srodka acylujacego (porównac np. R.Schwyzer, P.W.Schiller: Helv.Chem.Acta 54, 897 (1971); E.Wiinsch: Ber. 104, 2445 (1971). Wedlug wlasnych doswiadczen nie nalezy w przypadku stosowania metody pieciofluoroieiiylowej stosowac dla osiagniecia powyzszych celów ani podwyz¬ szonej temperatury, ani nadmiaru srodka acylujacego. Tak na przyklad, wedlug wyników badan kontrolnych metoda chromatografii w cienkiej warstwie, reakcja ochranianego dekapeptydu Z-Liz(BOC)-Liz-(BOC)-Arg(N02)- -Arg(N02)-Pro-Wal-Liz(BOC)-Wal-Tyr -Ser(tBu)-OtBu lub oktapeptydem H-Asp.NH2-Gli-Ala dzi w roztworze dwumetyloformamidowym z kompleksem pieciofluorofenylowym oraz dwucykloheksylo- karbouwuimidem w temperaturze pokojowej, praktycznie w ciagu 5-6 godzin, a ochraniany heptadeka- peptyd (15-32) moze byc w prosty sposób wyodrebniany z wydajnoscia przeszlo 80%. Analogiczny, dosko¬ naly wynik osiaga sie przez reakcje opisanego w wegierskim opisie patentowym nr 155880 tetradekapeptydu ACTH 1-4 z heptadekapeptydem 15-31, oktadekapeptydem 15-32 i pentakosapeptydem 15-39 w omówio¬ nych warunkach roboczych.Alternatywna droga sposobu wedlug wynalazku mozna dla utworzenia zadanego produktu przejsciowego postepowac w ten sposób, ze acyluje sie wytworzonym z Z-Arg(N02)- Arg(N02 )-Pro-OH estrem pieciofluorofe¬ nylowym pentapeptyd H-Wal-Liz(BOC)-Wal-Tyr(tBu)-Pro-OH,a uzyskany oktapeptyd poddaje katalitycznemu uwodornieniu, przy czym usuniete zostaja równiez sluzace do ochraniania grupy guanidynowej argininy grupy nitro i stopniowo budowany jest ochraniany dekapeptyd 15—24, rózniacy sie od opisanego wyzej dekapeptydu -24 tym, ze grupy* guanidynowe argininy wystepuja w niej w uwodornionej postaci. Zalete tego sposobu budowy stanowi to, ze peptydy o koncowych atomach C, zawierajace wrazliwe na dzialanie kwasu grupy ochron¬ ne, nie musza byc poddawane takiemu uwodornianiu katalitycznemu, majacemu ponadto na celu usuwanie grup nitro i dajacemu sie jak wiadomo przeprowadzac tylko w srodowisku kwasu octowego w ciagu dlugich, niekiedy calodniowych czasów reakcji.Sposób wedlug wynalazku wytwarzania zawartego w organizmij ludzkim hormonu adrenokortikotropowe- go o ogólnym wzorze H-SerTyr-Ser-Met-Glu-His-Fen-Arg-Trp-Glii^ Tyr-Pro- -Asp-NH2-Gli-Ala-Glu-Asp-Glu-Q, w którym Q oznacza: Ser-OH, Ser-Ala-OH, Ser-Ala-Glu-OH, Ser-Ala- % Glu-Ala-OH, Ser-Ala-Glu-Ala-Fen-OH, Ser-Ala-Glu-Ala-Fen-Pro-OH, Ser-Ala-Glu-Ala-Fen-Pro-Leu-OH, Ser-Ala- Glu-Ala-Fen-Pro-Leu-Glu-OH lub Ser-Ala-Glu-Ala-Fen-Pro-Leu-Glu-Fen-OH, polega na tym, ze polipeptyd o wzo¬ rze BOC-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu- (OtBu)-His-Fen-Arg-Trp-Gli-Liz- (BOC)-Pro-Wal-Gli-OH poddaje sie reakcji z równowazna iloscia polipeptydu o wzorze H^Liz(BOC)-Liz(BOC)-Arg-ArgJro-Wal-Liz(BOC)-Wal-Tyr(tBu)-Pro- Asp*NH2-Gli- -Ala-Glu-(OtBu)-Asp(OtBu)- Glu(OtBu)-Q, w którym Q posiada wyzej podane znaczenie, w obec¬ nosci pieciofluorofenolu i dwucykloheksylo-karbodwuimidu dodanego w nadmiarze, w temperaturze okolo 0°C i nastepnie odszczepia gcupy ochronne.Wtoku reakcji sprzegania produktów przejsciowych w ochranianej postaci, grupy karboksy skladnika acy¬ lujacego ulegaja uaktywnieniu wskutek przegrupowania w ester pieciofluorofenylowy, a uzyskane po usunieciu grup ochronnych wolne peptydy zostaja przetworzone w kwasowe sole addycyjne lub uzyteczne do celów farma¬ ceutycznych kompleksy, wzglednie kondensaty.Materialy wyjsciowe i produkty przejsciowe wytwarzac mozna znanymi, stosowanymi w chemii peptydów sposobami. Tak wiec, do ochrony grup aminowych stosowane sa w pierwszym rzedzie grupy benzoksykarbonylo- we, t-butoksykarbonylowe, p-chlorobenzoksykarbonylowe; do ochrony grup karboksy wykorzystuje sie metode estryfikacji, zwlaszcza przy pomocy metanolu, etanolu i t-butanólu. Grupy hydroksy w lancuchach bocznych sa niekiedy ochraniane przez eteryfikacje, przy zastosowaniu t-butanolu lub alkoholu benzylowego. Do ochrony grupy argininy nadaje sie przede wszystkim grupa nitrowa lecz grupe guanidynowa mozna równiez stosowac w uwodornionej postaci. Przez odpowiednia kombinacje grup ochronnych mozna osiagac to, ze moga one byc usuwane droga wodorolizy, np. hydrolizy kwasowej, selektywnie lub równoczesnie.Peptydy o mniejszej liczbie czlonów moga byc wytwarzane metoda stopniowa lub droga kondensacji fragmentów, przy czym stosowac mozna metode mieszanych bezwodników, kwasów, estrów czynnych lub dwucykloheksylokarbodwuimidowa.Istota wynalazku polega na tym, ze przy sprzeganiu peptydów zawierajacych grupy asparaginylowe, grupy karboksy skladnika acylujacego ulegaja aktywacji przez przemiane w ester pieciofluorofenylowy. Ester piecioflu¬ orofenylowy moze byc wytwarzany osobno przez reakcje acylowania, lecz mozliwym jest równiez wytwarzanie4 91030 go wprost w mieszaninie reakcyjnej. Ester aktywny wytwarzac mozna przez dodanie do mieszaniny reakcyjnej pieciofluorofenolu i dwucykloheksylokarbodwuimidku. Szczególnie korzystna mozliwosc wytwarzania aktywne* go estru polega na tym, ze kompleksowy zwiazek pieciofluorofenylowo-dwucykloheksylokarbodwuimidkowy wytwarza sie osobno i dodaje do mieszaniny reakcyjnej w stosunku molowym 1,2—1,5. Poza wieksza prostota, zalete tego sposobu stanowi to, ze moga byc usuwane zawierajace siarke zanieczyszczenia, ewentualnie wystepu¬ jace w dwucykloheksylokarbodwuimidku. Zanieczyszczenia te moga wywierac szkodliwy* wplyw w czasie proce¬ su uwodorniania prowadzonego zazwyczaj po etapie sprzegania. Dalsza zaleta tego sposobu sprzegania przebiega¬ jacego-bez reakcji ubocznych z doskonala wydajnoscia jest to, ze nie ma potrzeby poddawania chronionych produktów przejsciowych specjalnym zabiegom oczyszczania, np. metoda chromatografii kolumnowej, a czystosc uwolnionego od grup ochronnych produktu koncowego jest dostateczna. Ten proces oczyszczania mozna prze¬ prowadzac technika przedwpradowa lecz równiez i metoda chromatografii kolumnowej. W tym przypadku zasto- " sowanie znajduja rózne gatunki karboksymetylocelulozy.Wynalazek obejmuje równiez przemiane peptydów wytworzonych sposobem wedlug wynalazku w kwaso¬ we sole addycyjne lub w uzyteczne pod wzgledem farmaceutycznym kompleksy. Do wytwarzania kwasowych soli addycyjnych mozna stosowac tolerowane farmaceutycznie kwasy, np. kwas octowy, kwas solny, wyzsze kwasy tluszczowe, lecz równiez kwas siarkowy i fosforowy. Pod okresleniem farmaceutycznie stosowanycii kompleksów nalezy rozumiec zwiazki peptydów wytworzonych sposobem wedlug wynalazku, które powitaja przez dodanie pewnych organicznych lub nieorganicznych substancji powodujacych opózniajace dzialanie pepty¬ dów. W charakterze tych zwiazków organicznych mozna stosowac np. pewne gatunki zelatyny, karboksymetylo- celuloze, estry kwasu alginowego, polimery aminokwasów oraz inne polimery i kopolimery. Sposród zwiazków nieorganicznych wgre wchodza trudno rozpuszczalne sole, takie jak fosforany lub pirofosforany pewnych metali, a przede wszystkim sole cynku. Dla osiagniecia wspomnianego dzialania nadaja, sie równiez pewne krzemiany, które z peptydami tworza równiez nierozpuszczalne kompleksy, wzglednie kondensaty, o niewyjasnionej dotych¬ czas strukturze.Peptydy wytwarzane sposobem wedlug wynalazku moga byc stosowane w postaci zwyklych preparatów lecznicznych. Takimi preparatami leczniczymi moga byc stale liofilizaty, w których w charakterze nosnika stosu¬ je sie substancje niereagujace z peptydami, np. mannit, laktoze, skrobie Ud. Peptydy moga byc ponadto przetwa¬ rzane na zawiesiny lub emulsje, które moga zawierac w charakterze substancji pomocniczych rózne obojetne srodki konserwujace i stabilizujace. Szczególnie korzystnym sposobem preparowania jest wytwarzanie wyzej wspomnianych kompleksów i kondensatów, powodujacych opóznione dzialanie preparatu.Normalna dawka adrenokortikotrópowego hormonu wynosi 1-7 razy tygodniowo, 0,1—3,0 mg przy poda¬ waniu parenteralnym lub w postaci domiesniowych preparatów.Opisane w przykladach produkty przejsciowe sa nowe.Stosowane w przykladach skróty przyjete sa przez JUBAC-JGB- (J.Biol.Chem. 247,977 (1092)). W cha¬ rakterze skrótu za slowami znamionowymi stosuje sie symbol, okreslajacy czesc sekwencji za pomoca liczb a ponadto okresla koncowe grupy zakonczone atomem N i C. Grupy ochronne lancuchów bocznych ujete sa / w kazdym slowie znamionowym. Stosowane sa ponadto dalsze skróty: DCC — dwucykloheksylokarbodwu- - imid, PPOH = pieciofluorofenol, PCPOH = pieciochlorofenol, DCHA = dwucykloheksyloamina. Oznaczen tem¬ peratury topnienia dokonuje sie za pomoca aparatu wedlug Dr Tottoli(Buchi, Szwajcaria).Badania chromatografii w cienkiej warstwie przeprowadza sie na zelu krzemionkowym metoda Stahla przy uzyciu nastepujacych mieszanin rozpuszczalników: 1. Octan etylu-/pirydyna-kwas octowy-woda = 20:6:11/ = 95:5 v 2. Octan etylu-/pirydyna-kwas octowy-woda = 20:6:11/ = 9:1 v 3. Octan etylu-/pirydyna-kwas octowy-woda = 20:6:11/= 4:1 4. Octan etylu-/pirydyna-kwas octowy-woda = 20:6:11/ = 3:2 . Octan etylu—pirydyna-kwas octowy—woda = 240:20:6:11 6. Octan etylu-pirydyna-kwas octowy-woda = 120:20:6:11 7. Octan etylu—pirydyna-kwas octowy—woda = 60:20:6:11 8. Octan etylu-pirydyna kwas octowy—woda = 30:20:6:11 9. Octan etylu—pirydyna kwas octowy—woda = 480:20:6:11 . Chloroform -heksan -kwas octowy = 8:1:1 11. Chloroform-metanol = 98:2 12. Chloroform—metanol = 95:5 13. Chloroform—metanol = 9:1 14. Chloroform—metanol = 85:5 . n-Butanol-pirydyna-kwas octowy-woda = 30:20:6:24 , * 16. Chloroform-metanol-kwas octowy = 8:1:1 Do wywolania stosuje sie ninhydryne i/lub chlor + tolidyne.91030 5 Przyklad I. Synteza ludzkiego ACTHj 3 j Etap 1: Z-Glu(Ot-Bu)-Ser(tBu)-OtBu(Z-30-31-OtBu); 10,85 g (25 mmola) Z-Glu(OtBuONSu rozpuszcza sie w 100 ml octanu etylu i do roztworu wprowadza 7,0 g (27,5 mmola) H-Ser(tBu)-OtBu.HCl. Otrzymana zawie¬ sine oziebia sie do temperatury 0°C i mieszajac zadaje 3,85 ml (27,5 mmola) trójetyloaminy. Mieszanine reakcyj¬ na miesza sie nadal w ciagu 0,5 godziny w temp. 0°C, a nastepnie odstawia do nastepnego dnia w temperaturze pokojowej i kolejno wytrzasa nastepnie z dwoma porcjami po 20 ml IN roztworu kwasu solnego, trzema porcja¬ mi po 20 ml IN roztworu NaHC03 i na koniec z woda. Faze octanu etylu nastepnie osusza sie i zateza.Otrzymana oleista pozostalosc rozciera sie z eterem naftowym. Tyrn sposobem otrzymuje sie 10,45 g (77,8%) Z-30-31-OtBu.Sklad elementarny: C28H4408N2 (536,68) Wedlug obliczenia: C 62,7%; H 8,3% Wedlug oznaczenia: C 62,4%; H 8,2% Temperaturatopnienia: 92-95°C; R11 =0,8.Etap 2: H-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-OtBu; (H-30-31-OtBu). 17,2 g (32 mmoli) Z-30-31-OtBu rozpuszcza sie w 350 ml metanolu i przez roztwór przepuszcza w ciagu 1 godziny wodór w obecnosci 2,5 g aktywnego wegla pokrytego palladem. Po odsaczeniu katalizatora przesacz zateza sie do sucha pod zmniejszonym cisnieniem a stala pozostalosc nanosi na saczek za pomoca eteru naftowe¬ go. Wydajnosc: 10,97 g (83,4%) H-Glu-(OtBu)-Ser(tBu)-OtBu. Temperatura topnienia 78-82°C; R\l =0,4.Sklad elementarny: C2oH3806N2 (402,54) Wedlug obliczenia: C 59,7%; H9,5%; N 6,9% Wsdlug oznaczenia: C59,8%; H9,4%; N6,6%.Etap 3: Z-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBuOtBu. (Z-29-31-OtBu). 9,45 g (22,5 milimola) Z-Asp(0tBu)-0NSu i 10,1 g (25 mmoli) H-30-31-OtBu rozpuszcza sie w 200 ml octanu etylu i pozostawia do nastepnego dnia. Nastepnie roztwór wytrzasa sie kolejno z 2 porcjami po 50 ml HCl IN, 3 porcjami po 50 ml IN roztworu NaHC03 i na koniec z woda. Otrzymany po oddestylowaniu octanu etylu olej zastala sie przy pomocy wody, a nastepnie wode odsacza. Wydajnosc: 15,2 g (95,0%) Z-29-31-OtBu. Tempe¬ ratura topnienia 84-87°C; R1 \ =0,70.Sklad elementarny: C36HS 7OnN3 (707,88).Wedlug obliczenia: C 61,1%; H 8,1% Wedlug oznaczenia: C61,3%; H8,3%.Etap 4: Z-Glu(0tBu)-Asp(0tBu)-Glu(0tBu)-Ser(tBu)-0tBu. (Z-28-31 -OtBu). 14,18 g (20 mmoli) Z-29-31-OtBu rozpuszcza sie w 280 ml metanolu i przez roztwór przepuszcza w ciagu 0,5 godziny wodór w obecnosci 2,1 g aktywnego wegla palladowanego. Po odsaczeniu katalizatora roztwór zateza sie pod zmniejszonym cisnieniem, a oleista pozostalosc (11,65 g; R^1 =0,2) doprowadza do reakcji z roz¬ tworem 8,25 g (19 mmoli) Z-Glu-(OtBu)-ONSu w 200 ml octanu etylu. Roztwór pozostawia sie do nastepnego dnia, a nastepnie wytrzasa 2-krotnie z 50 ml IN roztworu HCl, 3-krotnie z 50 ml roztworu IN NaHC03 i na koniec z woda. Roztwór osusza sie, octan etylu oddestylowuje, stala pozostalosc rozciera z n-heksanem i przesa¬ cza. Nieoczyszczony produkt rozpuszcza sie w 43 ml goracego octanu etylu i roztwór zadaje 7 ml n-heksanu.Wydzielone krysztaly nastepnego dnia odsacza sie i suszy. Wydajnosc: 13,0g (76,5%) Z-28-31-OtBu. Tempera¬ tura topnienia: 184-185°C; R^1 =0,80.Sklad elementarny: C45H72014N4 (893,1) Wedlug obliczenia: C 60,5%; H8,l% Wedluganalizy: C 60,8%; H8,0% Etap 5: H-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBuOtBu (H-28-31-OtBu).' 12,5 g (14 mmoli) Z-28-31-OtBu rozpuszcza sie w 250 ml metanolu i w ciagu 0,5 godziny uwodornia w obecnosci aktywnego wegla palladowanego Katalizator odsacza sie, a przesacz odparowuje do sucha. Stala pozostalosc rozciera sie n-heksanem i przesacza. Wydajnosc: 10,09 g (95%) H-18-31-OtBu. Temperatura topnie¬ nia: 139-140°C; R[l =0,3; R{-=0,25.Sklad elementarny: . C27H66012N4 (758,97) Wedlug obliczenia: N 7,4% Wedluganalizy: N 7,6% Etap 6: Z-Ala-Glu-(OtBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-OtBu. (Z-27-31-PtBu). 6,62 (8,7 mmola) H-28-3.l-OtBu rozpuszcza sie w 65 ml octanu etylu ido roztworu dodaje 2,72 g (8,5 mmola) Z-Ala-ONSu, który po 5 minutowym mieszaniu równiez ulega rozpuszczeniu. Po jednogodzinnym okresie mieszania produkt zaczyna sie wytracac z roztworu. Mieszanine reakcyjna pozostawia sie przez noc, nastepnego6 91030 dnia produkt odsacza sie i przemywa octanem etylu. Surowy produkt przekrystaiizujesie z 65 ml octanu etyh - Wydajnosc: 6,61 g (80/7%) Z-27-31-OtBu. Temperatura topnienia: 193-195°C; Rp =0,35 Rj-=0,75.Sklad elementarny: "'¦'¦'/'.';-'C48H770i 5N5 (9 Wedlug obliczenia: G 50,9%; H 8,1% , Wedlug analizy: C59,6%; H8,l%. • Etap 7: H-Ala-Glu(OtBu)-Asp(OtBuGlu(OtBu)-Ser(tBuOtBu (H-27-31-OtBu). 6,61 g (6,85 mrnola) Z-27-31-OtBu lekko ogrzewajac rozpuszcza sie w 150 ml metanolu, roztwór oziebia do temperatury pokojowej i przepuszcza wodór w ciagu 0,5 godziny, w obecnosci wegla palladowego. Po odsa¬ czeniu katalizatora roztwór odparowuje sie do sucha, stala pozostalosc miesza z n-heksanem i odsacza. Wydaj¬ nosc: 5,55 g (97,6%) H-27-31-OtBu. Temperatura topnienia: 138- 142°C; R} =0,15.Sklad elementarny: C40H7j Oj 3N5 (830-05) Wedlug obliczenia- C57,9%; H8,6%; N8,4% Wedlug analizy: C57,7%; H8,3%; N8,l%.Etap8:Z-Asp.NH2-OPFP 1,33 g (5 mmoli) Z-Asp.NH2 -OH i 3,0 g pieciofluorofenolu rozpuszcza sie w 3,5 ml dwumetyloformamidu, a roztwór zadaje 10,5 ml dioksanu. Roztwór oziebia sie do temperatury 0°C i mieszajac dodaje 1,13 g (5,5 mmoli) DCC. Mieszanine reakcyjna miesza sie w ciagu 2 godzin w temperaturze 0°C, nastepnie DCU odsacza sie i zateza przesacz do sucha pod zmniejszonym cisnieniem. Pozostalosc rozciera sie z 8 ml eteru, krystaliczna biala substancje odsacza i przemywa niewielka iloscia zimnego eteru. Wydajnosc: 2,02 g (93,5%) Z-Asp.NH2-OPFP.Temperatura topnienia: 149-150°C; R\° =0,35.Sklad elementarny: d8Hi 305N2F5 (432,31) Wedlug obliczenia: C 50,0%; H3,0%; N 6,5% Wedluganalizy: C 50,2%; H 3,1%; N 6,4%.Etap 9: Z-Asp.NH2-Gli-OtBu (Z-25-26-OtBu). 043 g (1 mmol) Z-Asp.NH2-OPFP slabo ogrzewajac rozpuszcza sie w 10 ml dwuoksanu, roztwór oziebia do temperatury 10°C i dodaje 0,185 (1,1 mmol) H-Gli-OtBu.HCl. Do wytworzonej zawiesiny dodaje sie miesza¬ nine 0,154 ml (1,1 mmol) trójetyloaminy, mieszanine reakcyjna miesza wciagu 0,5 godziny w temperaturze pokojowej, a nastepnie odsacza. Przesacz zateza sie. Otrzymana galaretowata pozostalosc rozciera sie z eterem i saczy. Tym sposobem otrzymuje sie 0,34 g (89,8%) Z-Asp.NH2-Gli-OtBu. Temperatura topnienia 150 151°C; R£=0,6.Sklad elementarny: Cl8H2506N3 (379,42) Wedlug obliczenia: NI 1,1% Wedluganalizy: NI 1,2%.Etap 10: Z-Asp.NH2 -Gli-OH (Z-25-26-OH). 9,13 g (26 mmoli) Z-Asp.NH2-Gli-OtBu rozpuszcza sie w 90 ml kwasu trójfluorooctowego, pozostawia na okres 0,5 godziny, a nastepnie zadaje 450 ml bezwodnego eteru. Wytracony bialy osad odsacza sie i przemywa eterem. Surowy produkt przekrystalizowuje sie z 35 ml wody, uzyskujac przy tym 6,56 g (78%) Z-Asp.NH2-Gli- OH. Temperaturatopnienia: 170-172°C; R^=0,45.Etap 11. Z-Asp.NH2-Gli-Ala-(OtBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBuSer-(tBuOtBu (Z-25-31-OtBu). 2,59 g (8 mmoli) Z-Asp.NH2 -Gli-OH, 6,65 g (8 mmoli) (H-AJa-Glu-(OtBu) -Asp(OtBu)-Glu(OtBuSer(tBiJr -OtBu i 4 8 g pieciofluorofenolu rozpuszcza sie w 28 ml dwumetyloformamidu, roztwór oziebia do temperatury 0°C i dodaje 11,81 g (8,8 mmoli) DCC. Mieszanine reakcyjna miesza sie w ciagu 0,5 godziny w temperaturze 0°C, a nastepnie wciagu 2,5 godziny w temperaturze pokojowej. Po odsaczeniu DCU roztwór odparowuje sie do sucha, pozostalosc traktuje octanem etylu i odsacza. Wydajnosc: 7,3 g (80,5%) Z-25-31-OtBu. Temperatura topnienia: 194°C (z rozkladem); R| =0,6.Etap 12. H-Asp.NH2-Gli-Ala-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBuOtBu. (H-25-31-OtBu). 6,47 g (5,7 mmola) Z-25-31-OtBu rozpuszcza sie w mieszaninie 2,20 ml etanolu i 20 ml dwumetylofor¬ mamidu i w ciagu 1 godziny przez roztwór przepuszcza wodór w obecnosci 1 g aktywnego wegla palladowanego.Katalizator odsacza sie a przesacz odparowuje do sucha. Pozostalosc o charakterze zelu rozprowadza sie w ete¬ rze, odsacza i osusza. Wydajnosc 4,9 g (86,2 g) H-25-31-OtBu. Temperatura topnienia: 174-176° C (z rozkla¬ dem); R^:0,2.Etap 13. Z-yz(BOC)-Uz(BOC)-Arg(N02)-Arg(N02)-Pro-Wal- -Liz(BOC)-Wa]-Tyr(tBu)-Pro-Asp.NH2- Gli- Ala-Glu(0tBu)-Asp(0tBu)-Glu-(0tBu)-Ser(tBu)-0tBu)-(Z-15-31-0tBu). 7,4 g (4 mmoli) Z-Liz(BOC)-Liz(BOC)-Arg(N02) Arg-(N02 -Pro-Wal-Liz(BOC)-Wal-Tyr(tBu)-PROOH (wegierski opis patentowy nr 155254) oraz 4,2 g (4,2 mmole) H-25-31-OtBu rozpuszcza sie w 25 ml dwumetylo-91030 7 formamidu, roztwór oziebia do temperatury ;-.0°C ido roztworu wprowadza 3,64g (4,8 mmoli) kompleksu DCC-PEPOH, w którym stosunek ilosci skladników reakcji wynosi 1:3. Mieszanine reakcyjna miesza sie w ciagu minut w temperaturze 20°C, a nastepnie wciagu 5 godzin w temperaturze pokojowej. Potem mieszanine reakcyjna przesacza sie do 300 ml bezwodnego eteru, a wydzielajacy sie osad wyodrebnia. Uzyskuje sie ll,0g (97%) nie oczyszczonego produktu o temperaturze topnienia 180°C. Surowy produkt rozpuszcza sie w 33 ml metanolu i wytraca przez dodanie 430 ml octanu etylu. Wydajnosc: 8,75 g (77%) Z-15-31-OtBu. Temperatura topnienia z rozkladem: 185°C;R|~:0,5. ' Etap 14. H Uz(BOC)-Liz(POC)-Arg-Arg-Pro-Wal-Uz-(BOC)-Wal-Tyr(tBu)- -Pro-Asp.NH2 -Gli-Ala-Giu(OtBu) Asp.(OtBu)-G!u(OtBu) .Ser(tBu)-aBu^Ha;(H-15-31:OtBu.3HCl). 6,5 g (2,3 mmola) Z-15-31-OtBu rozpuszcza sie w 85 ml kwasu octowego i przez roztwór przepuszcza wodór w obecnosci aktywnego wegla palladowanego. Postep reakcji kontroluje sie metoda chromatografii w cien¬ kiej warstwie. Po ukonczeniu reakcji katalizator odsacza sie, a przesacz odparowuje do sucha. Otrzymane 6,72 g produktu rozpuszcza sie w wodzie i przy pomocy rozcienczonego HC1 oziebiajac nastawia odczyn roztworu na wartosc pH 4. Nastepnie do roztworu dodaje sie 20 ml 30% roztworu soli kuchennej, wydzielony osad odsacza i suszy, W celu usuniecia soli produkt suspenduje sie w wodzie i chloroformie, sól odsacza, a przesacz odparowuje do sucha. Pozostalosc rozprowadza sie w eterze i odsacza. Wydajnosc: 5,35 g (85,6%) H-15-31-OtBu. 3HC1.Rj=0,45.Etap 15. BOC-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu(OtBu)-His-Fen-Arg-Trp-Gli-Uz(BOC)- Pro-Wal-Gli-Liz(BOC)-Liz(BOC Arg-Arg-Pro-Wal-Uz(BOC)-Wal-Tyr(tBu)-Pro-Asp-NH2-Gli-Ala-Glu(OtBu)-Asp(OtBuGlu(OtBuSer(tBu 3HC1; (BOC-l-31-OtBu.3HCl).' 2,96 g (1,5 rrimola) BOC-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-(OtBu)-His-Fen-Arg-Trp- Gli-Liz(BOC)-Pro-Wal-Gli-OH (wegierskie opisy patentowe nr 155254 i 155880) oraz 4,08 g (1,5 mmola) H-15-31-OtBu.3HCl rozpuszcza sie w 20 ml dwumetyloformamidu, roztwór oziebia do temperatury 0°C i zadaje najpierw 0,21 ml trójetyloaminy, a nastepnie 1,36 g (1,8 mmola) kompleksu DCC-PEPOH. Mieszanine reakcyjna przetrzymuje sie wciagu 10 minut w temperaturze 0°C a nastepnie w ciagu 24 godzin w temperaturze pokojowej, i na koniec przesacza do 250 ml bezwodnego eteru. Wydzielony osad odsacza sie, przemywa eterem, a nastepnie osusza. Wydajnosc: 6,84g(98,4%). BOC-l-31-OtBu.3HCl; R^.0,45.Etap 16. H-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-FeivArg-Trp-Gli-Liz-Pro-Wal-Gli-Liz- Liz-Arg-Arg-Pro-WaMiz-Wal-Tyr- Pro-Asp.NH2- Gli-Ala-Glu-Asp-Glu-Ser-OH.3CH3COOH; (H-l-31-OH.3CH3COOH). 3,0 g (0,647 mmola) BOC-l-31-OtBu.3HCl rozpuszcza sie w mieszaninie kwasu trójfluorooctowego, wody ianizolu o stosunku 8:1:1 i roztwór miesza w ciagu 1 godziny w temperaturze pokojowej. Nastepnie dodaje sie do roztworu 300 ml eteru. Wytracony osad odsacza sie i przemywa eterem. Otrzymany trójfluorooctan (2,89 g) rozpuszcza sie, a roztwór przepuszcza przez zloze jonitowe sporzadzone z zywicy jonitowej marki Dowex IX—8 obsadzonej anionami octanowymi. Po zakonczeniu wymiany jonowej roztwór wprowadza sie na kolumne wypel¬ niona 500 ml CM 23. Oczyszczania dokonuje sie droga gradientowej eluacji. Frakcje zawierajace zadana substan¬ cje laczy sie i poddaje liofilizacji. Wydajnosc: 1,64 g (70%) jednorodnego pod wzgledem chromatograficznym w pelni czynnego biologicznie H-l-31 -OH.Wynik oznaczen aminokwasów: Uz-4,08 (4); His 1,0 (1); Arg 2,94 (3); Asp 2,01 (2); Met 0,78 (1); Ser 2,78 (3); Glu 3,07 (3); Pro 2,86 (3); Gli 2,97 (3); Ala 1,09 (1); Wal 2,95 (3); Tyr 2,1 (2); Fen 1,09 (1).Przyklad II. Alternatywna droga sposobu syntezy ludzkiego ACTH ^ 3 j Etap 1. Z-Arg(N02Arg(N02)-Pro-OPPP(Z-17-19-OPPP) 3,26g (5 mmoli) Z-ARG(N02)?Arg(N02)Pro-OH (wegierski opis patentowy nr 155254) rozpuszcza sie w 30 ml dwumetyloformamidu ido roztworu dodaje 5,31 g (7 mmoli) kompleksu DCC-PEPOH. Mieszanine reakcyjna miesza sie w temperaturze pokojowej w ciagu 5 godzin, a nastepnie odsacza wydzielony DCU, a prze¬ sacz odparowuje do sucha. Oleista pozostalosc doprowadza sie do zestalenia w obecnosci eteru. Osad ten odfil- trowuje sie i przemywa eterem, uzyskujac 3,8 g to jest 92,9% wydajnosci nie oczyszczonego produktu. Surowy produkt rozpuszcza sie w 11 ml czterowodorofuranu i wytraca przy pomocy eteru. Wydajnosc 3,42 g (83,6%) Z-17-19-OPPP. R^:0,55.Sklad elementarny: C3iH36O10Ni1Fs (817,9) Wedlug obliczenia: N 18,8% wedluganalizy: N 18,6%.Etap 2. Z-Arg(N02)(-Arg(N02)-Pro-Wal-Liz(BOC)-WalTyr(tBu); Pro-OH (Z-17-24-OH)./ Z 2,22 g (2,92 mmola)( H-Wal-Liz(BOC)-Wal-Tyr-(tBu)-Pro-OH(wegierski opis patentowy nr 155254) spo- - rzadza sie zawiesine w 25 ml dwumetyloformamidu i mieszajac dodaje sie 2,64 g (3,22 mmoli) Z-17-19-OPFP.Przez mieszanie w ciagu 2,5 godzin otrzymuje sie klarowny roztwór, który miesza sie w ciagu dalszych 2,5 godzin a nastepnie odparowywuje do sucha. Pozostalosc nanosi sie za pomoca czterowodorofuranu na saczek i przemy-8 91030 wa czterowodorofuranem. Otrzymane 3,8 g (=93,3%) surowego produktu rozpuszcza sie w 15 ml metanolu i wytraca przy pomocy octanu etylu. Osad odsacza sie i suszy. Wydajnosc: 3,55 g (87,2%) Z-17-24-OH. R| :0,7.Etap 3. H-Arg-Arg-Pro-Wal-Liz(BOC)-Wal-Tyr(tBu)-Pro-OH.3HCl (H-l 7-244DH.3HC1). 0,4 g (0,29 mmoli) Z-17-24-0H rozpuszcza sie w 8 ml kwasu octowego i uwodornia w obecnosci 0, i g aktywnego wegla palladowanego. Postep reakcji kontroluje sie metoda chromatografii w cienkiej warstwie. Po ukonczeniu reakcji katalizator odsacza sie a przesacz odparowuje do sucha. Oleista pozostalosc rozpuszcza sie w 3 ml metanolu i oziebiajac doprowadza za pomoca rozcienczonego kwasu solnego odczyn roztworu do war¬ tosci pH 4. Nastepnie roztwór odparowuje sie do sucha, a pozostalosc po odparowaniu nanosi na saczek przy pomocy octanu etylu. Otrzymuje sie 0,26 g (70,2%) H-l 7-24-OH.3HC1. RAf:0,1.Etap 4. Z~Uz(BOCArg-Arg-Pro-Wa^ Z 0,65 g (0,40 mmoli) H-l 7-24-OH.3HC1 sporzadza sie zawiesine w 7 ml dwumetyloformairiidu i dodaje do niej 0,07 ml trójetyloaminy oraz 0,3 g (0,6 mmoli) Z-Iiz(BOC)-ONP. Mieszanine reakcyjna miesza sie w ciagu 24 godzin w temperaturze pokojowej a nastepnie odparowuje do sucha. Pozostalosc nanosi sie za pomoca octanu etylu na saczek i przemywa niewielka iloscia wody. Wydajnosc: 0,6 g (76.3%) Z-16-24-OH. 2HC1. Rj .0,45.Etap 5. Z-liz(BOC)-Uz(BOC)-Arg-Arg-Pro-Wal-Uz(BOC)-Wal-Tyr(tBu)-Pro-OH.2HCl; (Z-l 5-24-OH.2HC1). 0,5 g (0,3 mmola) Z-16-24-OH.2HC1 rozpuszcza sie w 20 ml metanolu i uwodornia w obecnosci palladowa nego wegla aktywnego. Po zakonczeniu reakcji katalizator odsacza sie, a przesacz odparowuje do sucha. Pozosta¬ losc nanosi sie za pomoca octanu etylu na saczek. Wydajnosc 0,42 g (97,3%) H-16-24-OH.2HC1 (Rjf:0,15).Z 0,33 g (0,23 mmola) tego produktu sporzadza sie zawiesine w 3 ml dwumetyloformamidu i zadaje 0,14 (0,25 mmola) Z-Liz(BOC)-OPEP. Po 10 minutowym mieszaniu otrzymuje sie klarowny roztwór, który miesza sie w ciagu dalszych 3 godzin i nastepnie odparowuje do sucha. Pozostalosc rozciera sie z octanem eiyiu. Wydaj¬ nosc: 0,36g (85,4%) Z-l5-24-OH.2HC1. Rj*:0,45.Etap 6. Z-Uz(BOCliz(BOC)-Arg-Arg-Pro-Wal-Liz(BOC)-Wal-Tyr(tBu-Pro-Asp.NH2 -Gli-Aia-Glu(OtBu Asp(OtBuGlu(OtBu)-Ser(tBu)-OtBu.2Ha; (Z-15-31-OtBu.2Hd). 0,18 g (0,1 mmola) Z-15-24-OH.2HC1 i 0,10 g (0,1 mmola) H-25-31-OtBu rozpuszcza sie w 1 ml dwumety¬ loformamidu i do roztworu dodaje 0,091 g (0,12 mmola) kompleksu DCC—PFPOH. Mieszanine reakcyjna miesza sie w ciagu 5 godzin, a nastepnie rozciencza octanem etylu. Wydzielony DCU odsacza sie, a przesacz odparowuje do sucha. Pozostalosc rozciera sie z eterem. Tym sposobem uzyskuje sie 0,25 g (88,8%) Z-15-31-OtBu.2HCl.Rj:0,5. Produkt przerabia sie dalej sposobem zilustrowanym w przykladzie I.P r z y k l a d III. Synteza ludzkiego ACTHj _31 Etap 1. Z-Glu(OtBuSer-Ala*OtBu. (Z-30-32-OtBu). 23,9 g (100 mmoli) Z-Ser-OHi 14,5 g (100 mmoli) H-Ala-OtBu rozpuszcza sie w 150 ml chlorku metylenu i oziebia roztwór do temperatury —10°C. Nastepnie do tego roztworu wkrapla sie roztwór sporzadzony z 20,6 g (100 moli) DCC i 100 ml chlorku metylenu. Mieszanine reakcyjna miesza sie w ciagu 2 godzin w temperaturze 0°C i pozostawia do nastepnego dnia. Wtedy odsacza sie wydzielony DCU, a przesacz przemywa sie kolejno 3 porcjami po 70 ml IN HC1, 3 porcjami po 70 ml 5% roztworu NaHC03 i na koniec woda. Po osuszeniu roztworu chlorek metylenu oddestylowuje sie, a oleista pozostalosc doprowadza do zestalenia w n-heksanie. Uzyskuje sie 30fi g (82%) nie oczyszczonego Z-Ser-Ala-OtBu, który rozpuszcza sie w 600 ml metanolu i uwodornia w obecnosc ci 2 g palladowanego wegla aktywnego. Postep reakcji kontroluje sie metoda chromatografii w cienkiej warstwie.Po zakonczeniu reakcji katalizator odsacza sie, przesacz odparowuje do sucha, a oleista pozostalosc rozpuszcza w 220 ml octanu etylu. Do tego roztworu dodaje sie 33,0 g (76 mmoli) Z-Glu(OtBu)-ONSu. Nastepnego dnia roztwór wytrzasa sie trzykrotnie z 50 ml IN HC1, potem 3-krotnie z 50 ml 5% roztworu NaHC03 i na koniec z woda. Po osuszeniu roztworu oddestylowuje sie chlorek metylenu, a oleista pozostalosc doprowadza sie do zestalenia w n-heksanie. Ta droga uzyskuje sie 30,0 g (82%) nie oczyszczonego Z-Ser-Ala-OtBu,który rozpuszcza sie w 600 ml metanolu i uwodornia w obecnosci 2 g palladowanego wegla aktywowanego. Po zakonczeniu reakcji katalizator odsacza sie, przesacz odparowywuje do sucha, a oleista pozostalosc rozpuszcza w 220 ml octanu etylu. Do tego roztworu dodaje sie 33,0 g (76 mmoli) Z-Glu(OtBu)-ONSu. Nastepnego dnia wytrzasa sie roztwór z 3 porcjami po 50 ml IN HC1, potem 3 porcjami po 50 ml 5% roztworu NaHC03 i na koniec woda. Roztwór osusza sie i nastepnie oddestylowuje octan etylu, a potem przekrystalizowuje oleista pozostalosc z mieszaniny octanu etylu i eteru naftowego. Otrzymuje sie 31,5 g (75%) Z-30-32-OtBu. Temperatura topnienia: 72-74°C.Rf!:0,6;[a]D = -28,9o.Sklad elementarny: C2 7 H4, N309 (551,84) Wedlug obliczenia: C58,8%; H7,5%; N 7,7% Wedluganalizy: C 58,8%; H7,7%; N 7,8%91030 9 Etap 2. H-Glu(OtBuSer-Ala-OtBu (H-30-32-OtBu). 16,0 g (29 mmoli) Z-30-32-OtBu rozpuszcza sie w 350 ml metanolu i uwodornia w obecnosci 1,6 g pallado- wanego wegla aktywnego. Po ukonczeniu reakcji katalizator odsacza sie, a przesacz odparowuje do sucha. Pozos¬ talosc przekrystalizowuje sie z mieszaniny metanolu i eteru. Otrzymuje sie 9,06 g (75%) H-30-32-OtBu. Tempe¬ ratura topnienia: 135-136°C; R}1:0,15; [a]D =-25,9° (c =1, etanol).Sklad elementarny: C19H35N307 (417,80) Wedlugobliczenia: C54,6%; H8,5%; N 10,1% Wedlug analizy: C54,5%; H8,4%; N9,8%.Etap 3. Z-Asp(OtBu)-Glu(OtBuSef-Ala-OtBu (Z-29-32-OtBu). 8,2 g (19,6 mmoli) H-30-32-OtBu i 8,0 g (19,0 mmoli) Z-Asp(OtBuONSu doprowadza sie do reakcji w 80 ml octanu etylu. Roztwór wytrzasa sie nastepnego dnia kolejno z: 3x20 ml IN HC1, 3x20 ml 5% roztworu NaHC03 i na koniec z woda. Roztwór osusza sie, octan etylu oddestylowuje i pozostalosc nanosi sie wraz z eterem naftowym na saczek. Ta droga uzyskuje sie 12,08g (85,5%) Z-29-32-OtBu. Temperatura topnienia: 85-87°C; Rf1:0,55; [a]D = -32,8° (c = 1, etanol).Sklad elementarny: C35H54Oi2N4 (722,81) Wedlug obliczenia: C58,2%; H7,5%; N7,8% Wedlug analizy: C58,3%; H7,6%; N7,3%.Etap 4. H-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser-Ala-OtBu (H-29-32-OtBu). ,5 g (14,5 mmoli) Z-29-32-OtBu rozpuszcza sie w 130 ml metanolu i uwodornia w obecnosci 1 g pallado- wanego wegla aktywnego. Po ustaniu reakcji katalizator odsacza sie, a przesacz odparowuje do sucha. Pozosta¬ losc rozciera sie z eterem naftowym. Otrzymuje sie przy tym 8,35 g (97,5%) H-29-32-OtBu. Temperatura topnie¬ nia: 81-82°C; Rj-1:0,l;[a]D = -24,3° (c = 1, etanol).Etap 5. Z-Glu(0tBu)-Asp(0tBu)-Glu(0tBu)-Ser-Ala-0tBu (Z-28-32-OtBu). ,0 g (11,5 mmoli) Z-Glu(OtBu)-ONSu i6,6g (11,2 mmoli) H-29-32-OtBu doprowadza sie do reakcji w obecnosci 100 ml chloroformu. Nastepnego dnia mieszanine wytrzasa sie kolejno z 3 porcjami po 30 ml IN kwasu solnego, 3 porcjami po 30 ml roztworu NaHC03 i na koniec z woda. Roztwór osusza sie, a chloroform oddestylowuje. Pozostalosc oczyszcza sie przez wytracanie z mieszaniny chloroformu i eteru naftowego. Wydaj¬ nosc: 8,45 g (83%) Z-28-32-OtBu. Temperatura topnienia: 168-169°C; R\l :0,5; [a]D = 29° (c = 1, etanol).Sklad elementarry: (^mH^NjO^ (908,07) Wedlug obliczenia: C 58,2%; H 7,7%; N 7,7% Wedluganalizy: C 58,4%; H7,7%; N7,5%.Etap 6. H-Glu(OtBuAsp(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser-Ala-OtBu (H-28-32-OtBuj. 8.0 g (8,8 mmoli) Z-28-32-OtBu rozpuszcza sie w 160 ml metanolu i uwodornia w obecnosci 1 g palladowa- nego wegla aktywnego. Po zakonczeniu reakcji katalizator odsacza sie i odparowuje przesacz do sucha. Pozosta¬ losc rozciera sie z mieszanina etelu i eteru naftowego. Uzyskuje sie przy tym 6,4 g (94%) H-28-32-OtBu o tempe¬ raturze topnienia 138-139°C, Rj-2:0,1; [a]D = -29,7° (c = 1, etanol).Etap 7. Z-Ala-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser-Ala-OtBu (Z-27-32-OtBu). ,2 g (6,7 mmoli) H-28-32-OtBu doprowadza sie w obecnosci 50 ml chloroformu do reakcji z 2,15 g (6,7 mmoli) Z-Ala-ONSu. Nastepnego dnia mieszanine reakcyjna wytrzasa sie kolejno trzykrotnie z 10 ml IN HC1, trzykrotnie z 10 ml 5% roztworu NaHC03 oraz z woda. Roztwór osusza sie, a chloroform oddestylowuje. Pozos¬ talosc nanosi sie na saczek za pomoca eteru naftowego. Wydajnosc: 6,1 g (93,1%) Z-27-320tBu. Temperatura topnienia: 194-195°C. R}2:0,5; [a]D = 30,9° (c = 1, etanol).Sklad elementarny: C47H74016N6 (979,14) Wedlug obliczenia: C 57,7%; H 7,6%; ' N 8,6% Wedluganalizy: C 57,6%; H 7,7%; N 8,5% Etap 8. H-Ala-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser-Ala-OtBu (H-27-32-OtBu). 6.1 g (6,2 mmoli) Z-27-32-OtBu rozpuszcza sie w 120 ml metanolu i uwodornia w obecnosci 1 g palladowa- nego wegla aktywnego. Po zakonczeniu reakcji katalizator odsacza sie, a przesacz odparowuje do sucha. Pozosta¬ losc przekrystalizowuje sie z mieszaniny etanolu i eteru. Wydajnosc: 4,35 g (83%). H-27-32-OtBu. Temperatura topnienia 192-194°C, Rj-2.0,1.Sklad elementarny: C^H^^Om (845,0) Wedlug obliczenia: C55,4%; H8,l%; N9,9% Wedlug analizy: C55,2%; H7,8%; N9,6%10 91030 Etap 9. Z-Asp.NH2^!i-Ala-Glu(OtBu^ 2,45 g (13,3 mmoli) pieciofluorofenoiu, 1,31 g (4,02 mmoli) Z-Asp.NH2-Gli-OH (przyklad I) oraz 3,4 g (4,02 mmoli) H-27-32-OtBu rozpuszcza sie w 24 ml bezwodnego dwumetyloformamidu, roztwór oziebia do temperatury 0°C i dodaje 0,915 g (4,43 mmoli) DCC. Mieszanine reakcyjna miesza sie w ciagu 0,5 godziny w temperaturze 0°C, a potem wciagu 2,5 godziny w temperaturze pokojowej. Wytracony DCCI odsacza sie, a przesacz odparowuje do sucha. Stala pozostalosc traktuje sie octanem etylu, odsacza i przemywa goracym octanem etylu. Wydajnosc: 4,12g (89%) Z-25-32-OtBu. Temperatura topnienia: 200-201°C; R^.0.6: [a]D = -13,9°(c= 1,DMF).Etap 10. H-Asp.NH2-Gli-Ala-Glu(OtBu)'Asp(OtBuGlu(OtBu)-8er-Ala-OtBu;(H-25^2-OtBu). 4,0 g (3,48 mmoli) Z-25-32-OtBu rozpuszcza sie w 140 mi metanolu i uwodornia w obecnosci 0,5 g palki- dowanego wegla aktywnego. Po zakonczeniu reakcji katalizator odsacza sie, a przesacz odparowuje do sucha.Pozostalosc traktuje sie eterem i przesacza. Wydajnosc: 3,4 g (96%) H-25-32-OtBu. Temperatura topnienia; 188.-190°C; R£:0,5; [a]D.= -6,6° (c = 0,89, DMF).Etap 11. Z-Liz(BOC)-Uz(BOC)-Arg(N02)-Arg(N02Pro-Wal-Liz(BOC)-Wal- -Tyr(tBu)-Pro-Asp.NH2 Gli- Ala^Glu(0tBu)--Asp(0tBu)-Glu(0tBu)-Ser-Ala-0tBu. (Z-15-32-OtBu). 3,0 g (2,95 mmola) H-25-32-OtBu i 5,46 g (2,95 mmola) Z-Iiz(BOC)-Liz(BOC Arg(N02 )-Arg(N02 Pro- Wal-Liz(BOC)- Wal-Tyr(tBu)-Pro-OH (wegierskie opisy patentowe nr 155254 i 155880) rozpuszcza sie w 39 ml dwumetyloformamidu, roztwór oziebia sie do temperatury 0°C i dodaje 3,35 g (4,42 mmoli) kompleksu DCC—PFPOH. Mieszanine reakcyjna przetrzymuje sie wciagu 15 minut w temperaturze 0°C, a nastepnie wciagu 6 godzin w temperaturze pokojowej. Wydzielony DCU odsacza sie, a przesacz wprowadza do 450 ml bezwodnego eteru. Wydzielony surowy produkt oczyszcza sie przez ponowne wytracanie z mieszaniny metanolu i eteru. Wydajnosc: 7,18 g (85,1%) Z-15-32-OtBu. R|:0,35; [a]D = -26,4° (c = 0,42; DMF).Etap 12. H-Uz(BOC)-Liz(BOC)-Arg(N02)-Arg(N02)-Pro-Wal-Uz(BOC WalTyr(tBu)Pro-Asp.NH2-Gli- Ala-Glu(OtBu)- Asp.(0tBu)-Glu(0tBu)-Ser-Ala-0tBu.3HCl. (H-15-32-OtBu.3HCl). 6,5 g (2,28 mmola) Z-15-32-OtBu rozpuszcza sie w 85 ml kwasu octowego i uwodornia w obecnosci 2g palladowanego wegla aktywnego. Przebieg reakcji kontrolowany jest metoda chromatografii w cienkiej warstwie.Po zakonczeniu reakcji katalizator przesacza sie, przesacz odparowuje do sucha, a oleista pozostalosc doprowa¬ dza do zestalenia za pomoca bezwodnego eteru. Po odsaczeniu produkt rozpuszcza sie w 70 ml wody i nastawia wartosc pH roztworu na 4 za pomoca rozcienczonego kwasu solnego. Nastepnie produkt wytraca sie z roztworu przez dodanie 30% roztworu soli kuchennej. Po przesaczeniu i osuszeniu produkt uwalnia sie od soli przez ponowne wytracenie z mieszaniny metanolu i chloroformu. Rozpuszczalnik oddestylowuje sie, a pozostalosc traktuje eterem i przesacza. Wydajnosc: 5,6 g (89,6%) H-15-32-OtBu.3HCl. Rf:0,35; [a]D =-26,1° (c=l; DMF). Analiza zawartosci aminokwasów: liz 3,0 (3); Arg 1,8 (2); Asp 1,98 (2); Ser 1,0 (1); Glu 2,2 (2); Pro 2,1 (2); Gli 1,05 (1); Ala 2,0 (2); Wal 1,96 (2); Tyr 0,96 (1).Etap 13.BOC3er-Tyr-Ser.Met^lu(OtBu)-His-Fe^ Pro-Wal-Liz(BOC)- Wal-Tyr(tBu)-Pro-Asp.NH2 -Gli-Ala-Glu(OtBu)-Asp(OtBu Glu-(OtBu)-Ser-Ala-OtBu.3HCl; (BOC-l-31-OtBu.3HCl). 3,11 (1,57 mmoli) BOC-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu(OtBu)-His-Fen-Arg-Trp-Gli-Liz(BOC)- Pro-Wal-Gli-OH.HCI (wegierskie opisy patentowe nr 155254 i 155880) oraz 4,30 g (1,57 mmola) H-15-32-OtBu rozpuszcza sie w 25 ml dwumetyloformamidu i do roztworu dodaje 0,22 ml trójetyloaminy, jak równiez 1,79 g (2,36 mmoli) kompleksu DCC—PFPOH. Mieszanine reakcyjna miesza sie w temperaturze pokojowej wciagu 24 godzin a nas¬ tepnie przesacza do 300 ml bezwodnego eteru. Wydzielony produkt odsacza sie i przemywa. Wydajnosc: 7,2 g (98,5%) BOC-l-32-OtBu.3HCl. Rf :0,5; [a]D = -27,6° (c = 1,DMF).Etap 14. H-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His^Fen-Arg-Trp^Gli-JJz-Pro-Wal-Gli-Liz-Liz-Arg^Arg- -Pro-Wal-Liz-Wal-Tyr- Pro-Asp.NH2 -Gli-Ala-Glu-Asp-Glu-Ser-Ala.3CH3 COOH; (H-l-32-OH.3CH3 -COOH). 3,0 g (0,64 mmola) BOC-l-32-OtBu,3HCl rozpuszcza sie mieszajac w mieszaninie 3,0 ml anizolu. 3,0 ml wody i 24 ml kwasu trójfluorooctowego Po jednogodzinnym mieszaniu do mieszaniny reakcyjnej dodaje sie 300 ml eteru. Wytracony osad odsacza sie i przemywa eterem. Uzyskane 2,86 g trójfluorooctanu rozpuszcza sie w wodzie i roztwór przetwarza na octan przez przepuszczenie przez zloze jonitowe wypelnione jonitem marki DOWEX IX—8. Nastepnie roztwór wprowadza sie do kolumny wypelnionej 500 ml CM 23. Oczyszczanie w ko¬ lumnie chromatograficznej prowadzone jest droga eluacji gradientowej. Frakcje zawierajace produkt glówny zbiera sie i liofilizuje. Tym sposobem uzyskuje sie 1,7 g (70%) H-1-32-OH jednorodnego pod wzgledem chroma¬ tograficznym i w pelni aktywnego biologicznie. Analiza zawartosci aminokwasów: Liz 3,94 (4); His 1,0 (1); Arg 2,81 (3); Asp 2,0 (2); Met 0,72 (1); Ser 1,72 (3); Glu 2,94 (3); Pro 2,96 (3); Gli 2,89 (3); Ala 2,2 (2); Wal 2,97 (3); Tyr 1,98 (2); Fen 0,99(1).91030 11 Przyklad IV. Synteza ludzkiego ACTH.Etap 1. Z-Ser-AIa-G!u(OtBu)-Ala-Fen-Pro-Leu-Glu(OtBu)-Fen-OtBu- (Z-31-39-OtBu). 3U6g (48,3 mmoli) Z Leu-Glu(OtBu)-Fen-OtBu (porównac S.Bajusz, T.Lazar: Acta Chim.Hung. 48, 111 (1966) rozpuszcza sie w 310 ml dwumetyloformamidu i uwodornia w obecnosci palladowanego wegla aktywne¬ go. Po zakonczeniu reakcji katalizator odsacza sie, a przesacz zateza do objetosci 100 ml, schladza do temperatu¬ ry -20°C i wlewa do roztworu o nastepujacym skladzie sporzadzonym w nastepujacy sposób: 38,35 g (47,7 mmoli) Z-Ser-Ala-Glu(OtBu)-Ala-Fen-Pro-OII (wegierski opis patentowy nr 155254) rozpuszcza sie w 100 ml dwumetyloformamidu, zadaje 5,27 ml (47,4 mancli) N-metylomorfoliny, oziebia do temperatury —10°C i miesza¬ jac dodaje 6,26 ml (47,4 mmoli) estru butylowego kwasu chloroweglowego. Mieszanine reakcyjna miesza sie wciagu 8 minut w temperaturze -10°C, nastepnie oziebia do temperatury -20°C i dolewa do niej opisany wyzej, oziebiony wstepnie roztwór skladnika aminowego. Mieszanine reakcyjna miesza sie wciagu 15 minut w temperaturze -10°C, wciagu 1 godziny w temperaturze 0°C i, na koniec wciagu 1 godziny w temperaturze pokojowej. Nastepnie mieszanine reakcyjna wylewa sie do 21 wody z lodem, zawierajacej 45 ml N-metylomor¬ foliny. Osad odsacza sie, a nastepnie przemywa rozcienczonym kwasem cytrynowym, woda i na koniec eterem.Wydajnosc: 55,85 g (89,9%) Z-31-39-OtBu. Temperatura topnienia (z rozkladem) 180°C; Rf =0,7.Etap 2. H-Ser Ala Glu(OtBu)-Ala-Fen-Pro-Leu-Glu(OtBu)-Fen-OtBu. (H-31 39-OtBu). 78,95 g (60,15 mmoli) Z-31-39-OtBu rozpuszcza sie w 1500 ml 80% kwasu octowego i uwodornia w obec¬ nosci palladowanego wegla aktywnego. Po zakonczeniu reakcji katalizator odsacza sie, a przesacz odparowuje do sucha. Pozostalosc traktuje sie eterem i przesacza. Wydajnosc: 74,35 g (99%) H-31-39-OtBu. Temperatura top¬ nienia (z rozkladem): 105°C. Rf:0,5.Etap 3. Z-Glu(OtBu) Ser-Ala-Glu(OtBu)-Ala Fen-Pro-Leu Glu(OtBu)-Fen-OtBu. (Z-30-39-OtBu).Z 44,85 g (85,8 mmoli) soli DCHA z Z-Glu(OtBuOH sporzadza sie zawiesine w 450 ml bezwodnego eteru i do zawiesiny dodaje 9,6 ml (85,8 mmoli) N-metylomorfoliny. Do roztworu wkrapla sie w temperaturze —10°C 11,3 ml (85,8 mmoli) estru izobutylowego kwasu chloroweglowego i oziebia nastepnie do temperatury —20°C.W tej temperaturze dodaje sie uprzednio oziebiony do temperatury —20°C roztwór 88,5 g (71,5 mmoli) H-31-39-OtBu w 300 ^ml bezwodnego dwumstyloformamidu, a potem mieszanine reakcyjna miesza wciagu 15 minut w temperaturze — 10°C, w ciagu 1 godziny w temperaturze 0°C i w ciagu 1 godziny w temperaturze poko¬ jowej. Na koniec mieszanine reakcyjna wylewa sie do 8 litrów IN kwasu cytrynowego. Wytracony osad odsacza sie i przemywa woda, a nastepnie przemywa woda i na koniec eterem. Tym sposobem otrzymuje sie 104,1 g (97,2%) Z-30-39-OtBu. Temperatura topnienia: 136- 138°C (z rozkladem); R^.0,8.Etap 4. H-Gli(OtBu)-Ser-Ala-Glu(OtBu)-A]a-Fen-Pro-Leu-Glu(OtBu)-Fen-OtBu. (H-30-39-OtBu). 103,1 g (68,8 mmoli) Z-30-39-OtBu rozpuszcza sie w 1500 ml 80% kwasu octowego i uwodornia w obec¬ nosci palladowanego wegla aktywnego. Po zakonczeniu reakcji katalizator odsacza sie a przesacz odparowuje do sucha. Pozostalosc traktuje sie eterem, odsacza i przemywa eterem. Otrzymuje sie 90,75 g (92,7%) H-30-39-OtBu. Temperatura topnienia: 118°C (z rozkladem); R^:0,5.Etap 5. Z-Asp(0tBu)-Glu(0tBu)-Ser-Ala-Glu(0tBu)-Ala-Fen-Pro-Leu-Glu(0tBu)-Fen-0tBu. (Z-29-39-OtBu).Z 38,3 g (75,9 mmoli) soli DCHA z Z-Asp(OtBu)-OH sporzadza sie zawiesine w 400 ml bezwodnego dwu¬ metyloformamidu i dodaje 8,5 ml (76,6 mmoli) N-metylomorfoliny. Mieszanine oziebia sie do temperatury —10°C i mieszajac zadaje 10 ml (75,9 mmoli) estru izobutylowego kwasu chloroweglowego. Mieszanine reakcyj¬ na oziebia sie do temperatury -20°C i dodaje oziebiony uprzednio do temperatury —20°C roztwór 90 g (63,25 mmoli) H-30-39-OtBu w 250 ml dwumetyloformamidu. Mieszanine reakcyjna miesza sie wciagu 15 minut w temperaturze ~10°C, wciagu 1 godziny w temperaturze 0° i w ciagu nastepnej 1 godziny w temperaturze pokojowej. Wydzielona sól odsacza sie, a przesacz odparowuje do sucha. Pozostalosc traktuje sie IN kwasem cytrynowym, przesacza i przemywa az do odczynu obojetnego. Wydajnosc: 98,5 g (93%) Z-29-39-OtBu. Tempe¬ ratura topnienia (z rozkladem): 185°C; R^:0,8.Etap 6. H-Asp(OtBu)-Ser-Ala-Glu(OtBu)-Ala-Fen Pro-Leu-Glu(OtBu)-Fen-OtBu. (H-29-39-OtBu). 67,25 g (42,15 mmoli) Z-29-39-OtBu rozpuszcza sie w 1300 ml 80% kwasu octowego i uwodornia w obec¬ nosci palladowanego wegla aktywnego. Po zakonczeniu reakcji katalizator odsacza sie, a przesacz odparowuje do sucha. Pozostalosc traktuje sie eterem, odsacza i suszy. Wydajnosc: 63,8 g (95%) H-29-39-OtBu. Temperatura topnienia (z rozkladem): 128-132°C; Rf :0,3.Etap 7. Z-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser-Ala-Glu(OtBu)-Ala-Fen-Pro-Leu-Glu(OtBu)-Fen-OtBu.(Z-28-39-OtBu).Z 27,3 g soli DCHA z Z-Glu(OtBu)-OH sporzadza sie zawiesine w 270 ml bezwodnego dwumetyloforma¬ midu, dodaje 5,6 ml (53,2 mmoli) N-metylomorfoliny, mieszanine reakcyjna oziebia do temperatury -10°€12 91030 i wkrapla do niej w tej temperaturze mieszajac 6,95 ml (52,55 mmoU) estru izobutylowego kwasu chloróweglo- wego. Po 8 minutach mieszanine oziebia sie do temperatury —20° C. W tej temperaturze do mieszaniny dodaje sie oziebiony uprzednio do temperatury -20°C-'roztwór 69,9 g (43,3 mmoii) H-29-39-OtBu w 270 ml dwumetylo¬ formamidu. Temperature utrzymuje sie w ciagu 15 minut na poziomie -10°C w ciagu 1 godziny - na poziomie 0°C i wciagu 1 godziny w temperaturze pokojowej. Nastepnie wytracona sól odsacza sie, przesacz odparowuje do sucha, pozostalosc nanosi sie za pomoca IN kwasu cytrynowego na saczek i przemywa do obojetnego odczynu. Wydajnosc: 70,15 g (86,2%) Z-28-39-OtBu. Temperatura topnienia (z rozkladem): 205°C; R\3 :0,39, Etap 8. Z-Ala-Glu(OtBu)-Glu(OtB^^ (Z-27-39- OtBu). 69,0 g (37,2 mmoli) Z-28-39-OtBu rozpuszcza sie w 1800 ml bezwodnego dwumetyloformamidu i uwodor- nia w obecnosci wegla aktywnego pokrytego palladem. Po zakonczeniu reakcji katalizator odsacza sie, a przesacz zateza do objetosci 300 ml. Natepnie mieszajac dodaje sie 20,2 g (42,85 mmoli) Z-Ala-OPCP* a potem porcjami 4,76 ml (42,85 mmoli) N-metylomorfoliny. Gesta, posiadajaca zywicowata konsystencje mieszanine wlewa sie nastepnego dnia mieszajac i oziebiajac do 4 litrów 5% roztworu NaHC03. Wydzielona substancje odsacza sie i przemywa az do odczynu obojetnego wycieku. Surowy produkt rozpuszcza sie na goraco w 1900 ml metanolu i wytraca za pomoca 1100 ml wody. Nastepnego dnia produkt odsacza sie, przemywa i suszy. Wydajnosc: 59,2 g (82,6%) Z-27-39-OtBu. Temperatura topnienia: 210°C; R}-2:0,7.Etap 9. H-Ala^lu(OtBu)-AsrXOtBu) (H27-39-OtBu).' 8,5 g (4,41 mmoli) Z-27-39-OtBu rozpuszcza sie w 850 ml bezwodnego dwumetyloformamidu i uwodornia w obecnosci palladowanego wegla aktywnego. Po zakonczeniu reakcji katalizator odsacza sie, roztwór zateza, traktuje eterem i nastepnie przesacza. Wydajnosc: 7,65 g (96,9%) H-27-39-OtBu. Temperatura topnienia (z roz¬ kladem): 197°C; R[2 :Q,3.Etap 10. Z-Asp.NH2-Gli-Ala-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBuSer-Ala-Glu(OtBu) ;Ala-Fen-Pro-Leu-Glu (OtBu)-FenOtBu (Z-25-39-OtBu). 3,58 g (2,0 mmoli) H-27-39-OtBu oraz 0,65 g (2,0 mmoli) Z-Asp.NH2 -Gli-OH (Przyklad I) rozpuszcza sie w 300 ml bezwodnego dwumetyloformamidu. Roztwór oziebia sie do temperatury 0°C i zadaje 1,8 g (2,4 mmola) kompleksu DCC—PEPOH. Po czterogodzinnym mieszaniu mieszanine reakcyjna przesacza sie do 300 ml eteru, wytracony osad odsacza i przemywa eterem. Wydajnosc: 3,7 g (88%) Z-25-39-OtBu. Temperatura topnie¬ nia (z rozkladem): 194°C; R\2:0,3.Etap 11. H-Asp.NH2-Gli-Ala-Glu(0tBu)-Asp(0tBu)-Glu(0tBu)-Ser-Ala-Glu(0tBu)- -Ala-Fen-Pro-Leu-Glu;- (0tBu)-Fen-0tBu.HC](H-25-39-0tBu.HCl). 3,92 g (1,87 mmola) Z-25-39-OtBu rozpuszcza sie w 400 ml 80% kwasu octowego i uwodornia w obecnosci palladowanego wegla aktywnego. Po zakonczeniu reakcji katalizator odsacza sie, a przesacz odparowuje do sucha.Pozostalosc rozpuszcza sie w bezwodnym dwumetyloformamidzie i do roztworu dodaje pirydyny zawierajacej 6—8 równowazników kwasu solnego. Pozostajaca po oddestylowaniu rozpuszczalnika oleista substancje nanosi sie na saczek za pomoca wody, a potem przemywa woda i na koniec octanem etylu. Wydajnosc: 3,22 g (86,1%) H-25-39-OtBu.HCl. Temperatura topnienia (z rozkladem): 187°C; R\3.0,3.Etap 12. Z-Liz(BOC)-Uz(BOC)'Arg(N02)-Arg(N02)-Pro-Wal-Liz(BOC)-Wal-Tyr(tBu-Pro-Asp.NH2-Gli- Ala-Glu(0tBu)-Asp(0tBuGlu(0tBu)-Ser- Ala-Glu(OtBu)-Ala-Fen-Pro-Leu- Glu(OtBu)-Fen-OtBu. (Z-l 5-39- -OtBu). 3,0 g (1,5 mmola ) H-25-39-OtBu.HCl i 3,1 g (1,65 mmola) Z-Liz(BOC)-Liz(BOC)-Arg (N02 )-Arg(N02 )- Pro-Wal-Liz(BOC)- Wal-Tyr(tBu)-Pro-OH (patrz: brytyjski opis patentowy nr 1201053) rozpuszcza sie w 20 ml bezwodnego dwumetyloformamidu, roztwór oziebia sie do temperatury 0°C i zadaje 0,166 ml (1,5 mmola) N-metylomorfoliny a nastepnie 1,4g kompleksu DCC-PEPOH. Mieszanine reakcyjna miesza sie wciagu 24 godzin w temperaturze pokojowej, a potem przesacza do 400 ml eteru. Wydzielony osad odsacza sie, suspenduje w acetonie, miesza i nanosi na saczek. Wydajnosc: 5,15 g (90%) Z-15-39-OtBu. Temperatura topnienia: (z rozkla¬ dem): 220°C; RP :0,2; Rjf :0,65.Etap 13. H-Dz(BOC)-Liz(BOC)-Arg-Arg-Pro-Wal-Liz(BOC)-Wal-Tyr(tBu)-Pro-Asp.NH2 - Gli-Ala-Glu(OtBu)- -Asp(OtBu Glu(OtBu)-Ser-Ala-Glu(OtBu)-Ala-Fen-Pro- Leu-Glu(OtBu)-Fen-QtBu.3HCl. (H-l5-39-OtBu.3HCl). ,0 g (1,31 mmola) Z-15-39-OtBu rozpuszcza sie w 100 ml 80% kwasu octowego, dodaje 3 g aktywowane¬ go pylu cynkowego, a mieszanine reakcyjna miesza w temperaturze pokojowej. Przebieg redukcji kontroluje sie metoda chromatografii w cienkiej warstwie. Po zakonczeniu redukcji zawiesine przesacza sie, a przesacz zateza i pozostalosc traktuje woda, a nastepnie przesacza. Produkt rozpuszcza sie w 300 ml 80% kwasu octowego i uwodornia w obecnosci palladowego wegla aktywnego. Po zakonczeniu reakcji katalizator odsacza sie, roztwór91030 13 odparowuje do sucha, pozostalosc przemywa eterem i przesacza. Produkt rozpuszcza sie w 40 ml pirydyny i oziebiajac zadaje 10 ml pirydyny zawierajacej 1,5 ml stezonego kwasu solnego. Uzyskana przez odparowanie roztworu pozostalosc traktuje sie woda, przesacza i przemywa woda. Wydajnosc: 4,0 g (85%) H-15-39-OtBu.Temperatura topnienia (z rozkladem): 208°C; Rf :0,35.Etap 14. H-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Fen-Arg-Trp-Gli-Uz-Pro-WaWli-Iiz-Liz-Arg-Arg- Pro-Wal-Liz-Wal-Tyr- Pro-Asp.NH2- Gli-Ala-Glu-Asp-Glu-Ser-Ala-Glu- Ala-Fen-Pro-Leu-Glu-Fen-OH (H-1-39-OH). 3,6 g (1,0 mmol) H-15-39-OtBu.3HCl oraz 2,0 g (1 mmol) BOC-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-(OtBu)-His-Fen-Arg- Trp-Gli-Liz(BGCPro-Wal-Gli-OH.HCl (brytyjski opis patentowy nr 1201053) rozpuszcza sie w 20 ml dwumety- loformamidu, roztwór oziebia do temperatury 0°C i dodaje 0,11 ml (1 mmol) N-metylomorfoliny oraz 0,95 g kompleksu DCC—PEPOH. Mieszanine reakcyjna miesza sie wciagu 24 godzin w temperaturze pokojowej, a po¬ tem przesacza do 200 ml eteru. Wytracony produkt (5,6 g; Rf:0,55) odsacza sie i przemywa najpierw eterem, a potem woda. 1 g uzyskanego ta droga produktu rozpuszcza sie w mieszaninie 20 ml kwasu trójfluorooctowego i 1 ml merkaptoetanolu. Roztwór pozostawia sie na przeciag 1 godziny w temperaturze pokojowej, a nastepnie zateza pod zmniejszonym cisnieniem. Pozostalosc rozpuszcza sie w 10 ml wody i za pomoca obsadzonej jonami octanowymi zywicy jonitowej Amberlite IRA—410 wymienia jony trójfluorooctowe na jony octanowe. Roztwór poddaje sie liofilizacji i produkt oczyszcza za pomoca kolumny wypelnionej jonitem CM—32, przy uzyciu 0,13 moiarnego (wartosc pH 6,6), ewentualnie 0,25 molarnego (pH 7) eluentu. Frakcje zawierajace zadana substancje laczy sie i poddaje liofilizacji. Ta droga otrzymuje sie 0,6 g (60%) H-1-39-OH. Rf4:0,25.Analiza zawartosci aminokwasów: Asp 1,9 (2); Ser 2,7 (3); Glu 4,7 (5); Pro 3,8 (4); Gli 3,0 (3); Ala 3,0 (3); Leu 1,0 (1); Wal 2,9 (3); Met 0,95 (1); Tyr 1,9.(2); Fen 3,0 (3); His 0,95 (1); Liz 3,8 (4); Arg 2,8 (3); Tyr:Trp= 2,1:2. PL PL