DE2324239B2 - Verfahren zur Herstellung von Asparaginylgruppen enthaltenden biologisch aktiven Polypeptiden - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von Asparaginylgruppen enthaltenden biologisch aktiven Polypeptiden

Info

Publication number
DE2324239B2
DE2324239B2 DE2324239A DE2324239A DE2324239B2 DE 2324239 B2 DE2324239 B2 DE 2324239B2 DE 2324239 A DE2324239 A DE 2324239A DE 2324239 A DE2324239 A DE 2324239A DE 2324239 B2 DE2324239 B2 DE 2324239B2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
otbu
mmol
glu
pro
filtered
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
DE2324239A
Other languages
English (en)
Other versions
DE2324239C3 (de
DE2324239A1 (de
Inventor
Sandor Dipl.-Chem. Dr. Bajusz
Rozsa Dipl.-Chem. Beke
Laszlo Dipl.Chem.Ing.Dr. Graf
Attila Dipl.-Chem.Ing. Juhasz
Lajos Dipl.-Chem.Ing. Dr. Kisfaludy
Miklos Dipl.-Chem. Loew
Kalman Dipl.-Chem.Dr. Medzihradszky
Istvan Dipl.-Chem. Schoen
Maria Dipl.Chem. Sz.Sarkoezi
Tamas Dipl.-Chem. Szirtes
Laszlo Dr. Szporny
Andras Dipl.-Chem.Ing. Turan
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Richter Gedeon Vegyeszeti Gyar Nyrt
Original Assignee
Richter Gedeon Vegyeszeti Gyar RT
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Richter Gedeon Vegyeszeti Gyar RT filed Critical Richter Gedeon Vegyeszeti Gyar RT
Publication of DE2324239A1 publication Critical patent/DE2324239A1/de
Publication of DE2324239B2 publication Critical patent/DE2324239B2/de
Application granted granted Critical
Publication of DE2324239C3 publication Critical patent/DE2324239C3/de
Expired legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C271/00—Derivatives of carbamic acids, i.e. compounds containing any of the groups, the nitrogen atom not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C271/06—Esters of carbamic acids
    • C07C271/08—Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to acyclic carbon atoms
    • C07C271/10—Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to acyclic carbon atoms with the nitrogen atoms of the carbamate groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C07C271/22—Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to acyclic carbon atoms with the nitrogen atoms of the carbamate groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms to carbon atoms of hydrocarbon radicals substituted by carboxyl groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/06—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents
    • C07K1/061—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents using protecting groups
    • C07K1/066—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents using protecting groups for omega-amido functions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/06—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents
    • C07K1/08—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents using activating agents
    • C07K1/088—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents using activating agents containing other elements, e.g. B, Si, As
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/665—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans derived from pro-opiomelanocortin, pro-enkephalin or pro-dynorphin
    • C07K14/695—Corticotropin [ACTH]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Seasonings (AREA)

Description

Die Erfindung bc/ieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung vor, biologisch aktiven Polypeptiden, die Aspaniginylgruppen. vor allem einen Asparaginyl-Glycin-Teil enthalten.
Aus der Literatur ist bekannt, daß bei der Synthese der Asparagin-Peptide einerseits die ,«-Carboxamidgruppc unter Wasserabspaltung leicht in ein ,/-Cyanoalanin-Dcrivat übergeht (M. B ο d a η s / k y . V.duVigneaud: J. Am. ("hem. Soc. 81.5688 [ 1959]: E. Schröder. K. Lübke: Peptides I. S. 110). andererseits, daß die Peptide, die eine am ,»-Carboxyl ve-estcrtc Asparaginylgruppc enthalten, sich leicht zu ringförmigen Succhimid-Derivaten umlauern (E. Schröder. K. Lübkc: Peptides I. S. 203: M. A. Ondet t i u. a.: Biochemistry 7. 4069 [1968]). Die letztere Reaktion tritt besonders leicht ein. wenn in der Pcptidkcttc auf den Asparaginteil Glycin folgt. So wird z. B. das synthetische Tetrapeptid Pro-Asn-Gly-Pro schon in 0.1-M ammoniakalischer Lösung quantitativ desamidiert (L. Graf u.a.· Polypeptide Hormoncs-S. 255. Akadcmiai Kiadö. Budapest [1971 ]). Zur Vermeidung dieser Schwierigkeiten wird neuerdings bei der Synthese von Pcptidcn. die die Asparaginylgruppc enthalten, in steigendem Maße mit Carboxamid-Schutzgruppcn gearbeitet (vgl. /. B. VV. K ö-η ig. R. Geiger: Bcr. 103. 2Ο4Γ[Ι97Ο]). und es ist verständlich, daß über die Acylierung mit der Sequenz Asparaginyl-Glycin in der Literatur keine Beispiele zu finden sind.
Mit der leichten Desamidicrbarkcit der C'arboxam'dgruppe des Asparaginyl-Glycin-Tcils ist erklärbar, daß nach neueren Untersuchungen die früher angenommene Struktur der adrenokorlikotropen Hormone einer geringfügigen Modifikation bedarf. So führte der systematische Vergleich /wischen natürlichen und synthetischen Präparaten /u der Erkenntnis, daß die früher an 30. Stelle angenommene Carboxamidgruppe sich an 25. Stelle befindet und an 26. und 27. Stelle sowohl beim menschlichen Corticotropin als auch bei dem des Schweins die Sequenz GIy-AIa steht (L.Graf u. a.: Acta Biochim. Biophys. Hung. 6. 415 [197I]. sowie B. Piniker u.a.: Nature New Biology 235, 114 [1972]). Demnach ist die tatsächliche Struktur des menschlichen adrcnocorticotropen Hormons die folgende:
H-Ser-Tyr-Scr-Mct-Glu-His-Phe-Arg-Trp-12 3 4 5 6 7 8 9
Gly-Lys-Pro-Val-GIy-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-
10 Jl 12 13 14 15 16 17 18 19
Val-Lys-Val-Tyr-Pro-Asn-Gly-AIa-Glu-Asp-20 21 22 23 23 25 26 27 28 29
Glu-Ser-Ala-Glu-Ala-Phe-Pro-Leu-GIu-Phe-OH 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39
Es ist bekannt, daß die Synthese des menschlicher
ίο Adrenocorticotrop-Hormons der durch T. H. Let u. a. (J. Biol. Chem. 236, 2970 [ 1961]). beschriebener Struktur sowie die der Fragmente dieses Hormon; zuerst in der ungarischen Patentschrift 155 254 unc den dementsprechenden ausländischen Patentschrifter
(z.B. österreichische Patentschrift 295 051) beschrieben wurde.
Das Ziel der Erfindung ist die Synthese des menschlichen adrenocorlicotropen Hormons mit der obenerwähnten modifizierten Struktur sowie die Synthese von dessen artspe/ifischen Fragmenten.
Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis, daß die zur Synthese von biologisch aktiven Polypeptiden bisher nicht angewandte Penlafluorphenol-Methodik (L. K isfaludy u.a.: Proc. Sth Europ. Peptide Symp.
1966 ρ 25 [1967]: L. Kisfaludy u.a.: J. Org. Chem. 35. 3563 [1970]: J. K ο \ ä c s u.a.: J. Am. Chem. Soc. 89. 183 [1967]) unter entsprechenden Bedingungen zur Synthese von Polypeptiden obenerwähnter Struktur, die die Asparaginylgruppe enthalten. ausgezeichnet geeignet ist.
t'berraschenderweise wurde gefunden, daß aus dem Z-Asn-OH ohne Schutz der Carboxamidgruppe der entsprechende Pentafluorphenylester mit einer Ausbeute von über 90"., hergestellt werden kann.
wenn bei Temperaturen von um 0 C gearbeitet wird, weil dadurch die Bildung des ringförmigen Succinimid-Derivates und die des ,.-Cvanoalanin-Derivatcs praktisch völlig zurückgedrängt wird. Das auf diese Weise hergestellte Z-Asn-OPFP ist geeignet. Aminosäure- oder Pcptid-Derivale ohne Ablauf von Nebcnrcaktionen zu acylieren. So ist z. B. das geschützte Dipeptid Z-Asn-Gly-OtBu ebenfalls in 90°oiger Ausbeute und aus diesem durch Behandlung mit Trifluorcssigsäure das Z-Asn-Gly-OH herstellbar. Aus diesem Dipeptid wurde ebenfalls in ausgezeichneter Ausbeute der entsprechende Pentafluorphenylester erhallen, mit dem die in den Beispielen bc-jhricbenen C-terminalen PeplidefACTH,- „:Λ( IH,- ,,:AC"TH,, .,., 1 in ausgezeichneter Ausbeute und ohne Nebcnreaktioncn acylierl ,verdcn können.
Bei der Synthese von Pcptidcn mit größerer Glicderzahl. die Asparaginylgruppen enthalten, war ein weiterer Vorteil der Penlafluorphenol-Methodik besonders gut nachzuweisen, und zwar wurde beob-
y, achtel, daß bei der Acylierung mit Ponlafluorphcnylestcrn das in Freiheit gesetzte Pentafluorphenol keine derartigen Schwierigkeiten \: 1 ursacht, wie sie bei der Pcntachlorphcnol-Methodik in vielen Fällen auftreten (österreichische Patentschrift 295 051). Der Nachteil der letzteren besteht darin, daß sich bei der Verknüpfung ein Gleichgewicht einstellt, welches fallweise in Gegenwart von im Überschuß eingesetzten Aminkomponcntcn oder tertiärer Basen in die gewünschte Richtung verschoben werden kann. Bei Anwendung der Pcntafluorphcnol-Mcthode ist der Überschuß an Base nicht notwendig. Diese Beobachtung scheint mit der Tatsache in Widerspruch zu stehen, daß die pK-Wcrtc der beiden erwähnten Phcnoklerivate nach
den Angaben in der Literatur identisch sind (pK: 5,3). überraschenderweise wurde gefunden, daß die in Dimethylformamid gemessenen pK-Werte der beiden Phenülderivate wesentlich voneinander abweichen: Der des Pentachlorphenole betragt 5,05, der des s Pentafluorphenols 6,35. Anders ausgedrückt bedeutet dies, daß letzteres in Dimethylformamid in weniger dissüziierter Form vorliegt, wodurch verständlich wird, daß die dauerhafte Protonierung der basischen Komponente und damit das Abbremsen der Ver- ro knüpfungsreaktion ausbleibt. Ein weiterer Vorteil der Pcntafiuorphenol-Methodik besteht darin, daß das im Laufe der Reaktion frei werdende Pentafluorphenol leicht aus dem Reaktionsprodukt entfernt werden kann. Dies kann vom Pentachlorphenol i$ beziehungsweise von dessen mit organischen Basen gebildeten Salzen nicht gesagt werden, was den Nachteil mit sich bringt, .daß aus diesen Verbindungen
auch wenn sie nur in verschwindend geringer Menge im Rjaktionsgei. lisch zurückbleiben bei der auf die Verknüpfung folgenden katalytischen Hydrierung S.il/s;iure entsteht und diese die säureempfindlichen Schutzgruppen schädigt. Demgegenüber kann das Pentatluorphenol auf einfache Weise indem man d.is Reaktionsgemisch in Äther gießt und quantilain entfernt werden, wodurch ».lic erwähnte schädliche Wirkung vermeidbar ist. Vom Standpunkt der Praxis bedeutet die wesentlich größere Löslichkeit der Pentafluorphenylester in organischen Lösungsmitteln einen wr.'tcren Vorteil. aTs Beispiel diene die 1 lerstcllung von Z-Asn-Gly-OPi- P, bei der zur Bildung des Pentafluorphenylester j 1 IO der Dimethylformamidmengc als Lösungsmittel beritigt wird, die zur Bildung des Pentachlorpl.enylestcr.v notwendig wäre. Weiterhin wurde gefunden, daß die Pentafluorphenol-Methode auch zur Synthese von Peptidcn mit größerer Gliederanzahl ausgezeichnet geeignet ist. In diesem E.ille wird nach neuesten Litcraturangabcn im Interesse einer höheren Ausbeute und der F.rziclung eines reineren Endproduktes bei erhöhter Temperatur gearbeitet und oder das Acylicrungsmittel im Überschuß eingesetzt I vgl. z. B. R. S c h w y ζ c r. P. W. Schill e r: lieh. ClW Acta 54, 897 [1971]: F:. Wünwch: Her. 104. 2445 [1971]). Nach eigenen Erfahrungen ist hei der Anwendung der Pentafluorphenol-Mcthodc zur Erreichung obiger Ziele weder erhöhte Temperatur noch ein Hberschuß an Acylicrungsmittcl notwendig. So geht z. B. nach den Ergebnissen der Kontrollunlerluchung mittels Dünnschichlchromatographie die Reaktion ties geschützten Dccapcptids
/-LyS(BOC)-EyS(BOC )-Arg(NO,)-Arg(NO,)-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-'lyr(t Bu)-Pro-OH
mit dem Heptapcptid
H-Asn-Gly-Ala-Glu(()tBu)-Asp(i)lBu)-GIu(OtBu)-Scr(tBu)-( OtBu)
oder dem Octapeptid
H-Asn-Gly-Ala-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-GIu(OtBu)-SCi-AIa-OtBu
in Dimcthylformamid-Lösung mit dem Komplex von Pentafluorphenol und Dicyclohexylcarbodiimid bei Zimmertemperatur praktisch innerhalb von 5 bis ft Stunden vor sich, und das geschützte Hcptadccapeptid (15-31) bzw. Octadecapeplid (15-32) kann durch einfache Aufarbeitung mit einer Ausbeute von über 80% isoliert werden. Ein ähnliches, ausgczeich-
60 netes Ergebnis wird bei Umsetzen des in der öster reichiscben Patentschrift 295 051 beschriebenen Tetra decapeptids ACTH 1-14 mit dem Heptadecapeptii 15-31, dem Octadecapeptid 15-32 wad dem Pentacosa peptid 15-39 unter den erwähnten Reakttonsbedin gungen erhalten.
Nach einer Alternativmethode zum Aufbau de: gewünschten Zwischenproduktes kann auch in de Weise vorgegangen werden, daß mit dem aui Z-Arg(NO,)-Arg(NO2)-Pro-OH hergestellten Penta fluorphenyiester das Pentapeptid H-Val-Lys(BOC) Val-Tyr(tBu)-Pro-OH acyliert und das gewonnen« Octapeptid einer katalytischen Hydrierung unterworfen wird, wobei auch die zum Schütze dei Guanidinogruppe des Arginins dienenden Nitrogruppen entfernt werden und schrittweise das geschützte Decapeptid 15-24 aufgebaut wird, welches sich von dem oben beschriebenen Decapeptid i5-24 dadurch unterscheidet, daß die Guanidinogruppen des Arginins in protonierter Form vorliegen. Der Vorteil dieses Aufbaus besteht darin, daß die C-terminalen Peptide, die säureempfindliche Schutzgruppen enthalten, nicht der gleichen katalytischen Hydrierung ausgesetzt werden müssen, die außerdem zur Entfernung der Nitrogruppen dient und wie bekannt — nur in essigsaurem Medk.m mit langen, in manchen Fällen tagelangen Reaktionszeiten ausführbar ist.
Nach obigen Ausführungen ist also das neue Verfahren zur Herstellung von das menschliche Adrenoeorticotrop-Hormon und dessen artspezifische Fragmente repräsentierenden Peptiden der allgemeinen Formel 1
I.'-Ser-Tyr-Ser-Mct-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Ply-I ys-Pro-Val-GIy-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-VaI-ryr-Pro-Asn-Gly-Ala-Glu-Asp-Glu-O
worin O die Bedeutungen
a) Ser-OH.
b) Ser-Ala-OH.
O Ser-Ala-Glu-OH.
d) Scr-Ala-Glu-Ala-OH.
c) Ser-Ala-Glu-Ala-Phe-OH.
O Ser-A Ia-GIu-AIa-Phc-Pro-OH.
g) Ser-Ala-Glu-Ala-Phc-Pro-Leu-OH.
h) Ser-Ala-Glu-Ala-Phc-Pro-Lcu-Glu-OH.
i) Scr-Ala-Glu-Ala-Phe-Pro-Lcu-Glu-Phc-OH
hat. sowie der geschützten Derivate dieser Peptide geeignet.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Asparaginylgruppen enthaltenden, biologisch aktiven Polypeptiden durch Verknüpfung der entsprechenden geschützten Peptidkomponenten nach der Aklivcstermelhode und anschließende Abspaltung der Sch utzgruppcn. das dadurch gekennzeichnet ist. daß die Carboxylgruppe der Acylierungskomponentc bei Raumtemperatur bis ungefähr O C durch Umsetzen /um Pentafluorphenylester aktiviert und die Acyiierungsreaktion innerhalb des gleichen Temperaturbereichs durchgeführt wird.
Ausgangsstoffe und Zwischenprodukte werden mit Hilfe bekannter peptidchcmischcr Methoden hergestellt. Demnach werden zum Schutz der Aminogruppen in erster Linie Bcnzyloxycarbonyl-, t-Bulyloxycarbonyl-. p-Chlorbcnzyloxycarbonylgruppen. zum Schutz der Carboxylgruppen in erster Linie die Methode der Veresterung, vor allem mit Methanol. Äthanol und t-Butanol angewandt. Die Hydroxvl-
gruppen der Seitenketten werden fallw ise durch Veräthern geschützt, wofür t-Butanol oder Benzylalkohol Verwendung finden. Zum Schutz der Guanidinogruppe des Arginine ist vor allem die Nitrogruppe geeignet, doch kann die Guanidinogruppe auch in protonierter Form eingesetzt werden. Durch entsprechende Kombination der Schutzgruppen kann erreicht werden, daß diese durch Hydrogenolyse beziehungsweise Acidolyse selektiv oder aber auch gleichzeitig entfernt werden können.
Die Peptide mit kleinerer Gliederzahl können nach der schrittweisen Methode oder durch Kondensation von Fragmenten hergestellt werden, wobei nach der Gemischtanhydrid-, Azid-, Aktivester- oder Dicyclohexylcarbodiimid-Methode gearbeitet werden kann.
Das Wesen der Erfindung besteht darin, daß bei der Verknüpfung der Asparaginylgruppen enthaltenden Peptide die Carboxylgruppe der Acylierungs- komponente durch Umsetzen zu einem Pentaflaorphenylestcr aktiviert wird. Der Pentafluorphenylesicr kann vor der Acylierung getrenni hergestellt werden. es ist aber auch möglich, ihn unmittelbar im Reaktionsgemisch zu erzeugen. Der aktive Ister kann hergestellt werden, indem dem Reaktionsgemisch Pentafluorphcnol und Dicyclohcxylcarbodiimid zu- 2: gesetzt wird. Eine besonders vorteilhafte Ausführungs-ϊοπη der Bereitung des aktiven Esters besteht darin, den Pentafluorphenyl-dicyclohexylrarbodiimid-Komplex getrennt herzustellen und im M öl verhältnis 1.2 bis 1.5 dem Reaktionsgemisch zuzusetzen. Außer der leichteren Handhabbarkeit hat diese Methode den Vorteil, daß die eventuell im Dicyclohexylcarbodiimid enthaltenen schwefelhaltigen Verunreinigungen entfernt werden können. Diese Verunreinigungen können bei der Hydrierung, die meistens auf die Verknüpfung folgt, von schädlichem Einfluß sein, im weiterer Vorteil dieser Verknüpfungsmcthode. die ohne Nebenreaktionen und mit ausgezeichneter Ausbeute abläuft, besteht darin, daß es nicht notwendig ist, die geschützten Zwischenprodukte einer bosonderen, z. B säulenchromatographischcn Reinigung zu unterwerfen, sondern die Reinigung des von den Schutzgruppen befreiten Endproduktes ausreichend ist. Diese Reinigung kann auf der Grundlagt des Prinzips der Gegenstromverteilung, aber auch nach der säulenchromatographischen Methode vorgenommen werden. Im letzteren Falle gelangen z. B. verschiedene Carboxymethylzellulose-Arten zum Einsatz.
in den Kreis der Erfindung gehört auch die Umsetzung der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hei gestellten Peptide zu Säureadditionssalzcn oder zu pharmazeutisch anwendbaren Komplexen Zur Bildung von Säureadditionssalzcn können pliarnv/eu- tisch verträgliche Säuren, z. B. Essigsäure. Salzsäure, höhere Fettsäuren, aber auch Schwefelsäure und Phosphorsäure verwendet werden. Unter pharmazeutisch anwendbaren Komplexen sind Verbindungen der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren herge stellten Peptide zu verstehen, weiche durch Zugabe gewisser organischer oder anorganischer Stoffe ent- stehen und eine verzögernde Wirkung der Peptide bewirken. Solche organischen Verbindungen können z. B. gewisse Gelatinearten, Carboxymethylcellulose. Alginsäureester, Aminosäurepolymere und andere Polymere unu Copolymere sein. Unter den anorga- nischen Verbindungen kommen die schwerlöslichen Salze, so die Phosphate oder Pyrophosphate bestimmter Metalic, vor allem die des Zinks, in Franc.
Zur Erreichung der erwähnten Wirkung sind aud bestimmte Silikate geeignet, die mit den Peptider ebenfalls unlösliche Komplexe beziehungsweise Kon densate bilden, deren Struktur noch nicht geklärt ist
Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren her gestellten Peptide können in Gestalt der üblicher Arzneimittelpräparate zur pharmazeutischen Verwen dung gelangen. Solche Arzneimittelpraparate könnet feste Lyophilisate sein, bei denen als Trägerstof nicht mit den Peptiden reagierende Substanzen, ζ. Β Mannit. Milchzucker, Stärke usw. Verwendung finden Weiterhin können die Peptide als Suspensionen odei Emulsionen zubereitet werden, in denen als Hilfs stoffe verschiedene neutrale Konservierungs- unc Stabilisierungsmittel enthalten sein können. Eint besonders vorteilhafte Art der Zubereitung sind du obenerwähnten Komplexe und Kondensate, die dit verzögerte Wirkung des Präparates bewirken.
Die normale Dosis des adrcnocorticotrup'rn Hör mons betragt 1- bis 7mal wöchentlich 0,1 bis 3.(1 mi in suhc'itaner. parenteral oder intramuskulärer Ver abreichung.
Die in den Beispielen beschriebenen Zwischen produkte sind neu.
Die in den Beispielen benutzten Abkürzunger, si nt durch das IL' PAC-! UB anerkannt (J. Bio!. C hem 247 977 [1972]). Als weitere Abkürzung wird hinter der Titdworten ein Symbol verwendet, das den Sequenz teil mit Zahlen angibt und ferner die N-tcrminalei und C'-terminalen Endgruppen bezeichnet. Die Schul/ gruppen der Seitenketten sind im jeweiligen Titelwor enthalten. Folgende weitere Abkürzungen werder verwendet: DCC - Dicyclohexylcarbodiimul PFPOH = Pentafluorphcnol. PCPOH = Pentachlnr phenol. DCHA = Dicyclohexylamin.
Die Bestimmung der Schmelzpunkte erfolgte mi dem Apparat nach Dr. T ο 11 ο I i (Büchi. Schweizi.
Die dünnschichtchromatograph.rxhen l'ntcrsu chungen wurden auf Silikagel nach Stahl unter Ver wendung folgender Lösungsmittelgemische durch gefühn:
1. Äthy'acetat-CPyridin-Essigsäure-Wasser
= 20:6:11 ] = 95:5.
2. Äthylacetat-f.Pyridin-Essigsäurc-Wasser
= 20:6:11] = 9:1,
3. Athylacetat-[Pyridin-Essigsäure-Wasser
= 20:6:11] = 4:1,
4. Athylacetat-fPyridin-Essigsäure-Wasser
= 20:6:11] --= 3:2,
5. Äthylacetat-Pyridin-Essigsäure-Wasser
= 240:20:6:11.
6. Äthylacetat-Pyridin-Essigsäurc-Wasser
= Γ?0:20:6: M.
7. Äthylacetat-Pyridin-Essigsäurc-Wasser
= 60:20:6:Π.
H. Äf.ylacctat-Pyridin-Essigsäurc-Wasser
= .10:20:6: 11.
9. Äthylacetat-Pyridin-Essigsäurc-Wasser
= 480:20:6:11.
10. Chloroform-Hexan -Essigsäure = 8: 1 : i.
11. Chloroform-Methanol = 98:2.
12. Chloroform-Methanol =95:5,
13. Chloroform-Methanol =9:1.
14. Chloroform-Methanol = 85:5.
15. n-Butnnol-Pyridin-Essigsäurc-Wasser
== 30:20:6:24.
16. Chloroform-Methanol-Essigsäure = 8:1:1.
Zum Nachweis wird Ninhydrin und oder r.'hlor ι Tolidin verwendet.
I) e i s r> i c I 1
Synthese des menschlichen AC I H1 .„
Schritt I
Z-GIu(OlBu)-Ser(tBu)-OlBu(Z-30-31-OtBu)
10.85 ρ (25mMol) Z-CiIu(OtBu)-ONSu werden in K)OmI Äthylacetat gelöst und 7.0 g (27.5 mMol) H-Scr(tBu)-OtBu ■ HCI in die Lösung eingetragen. Die erhaltene Suspension wird auf O C abgekühlt und unter Rühren mit 3.85 ml (27.5 mMol) Triiithylamin versetzt. Das Reaktionsgemisch wird eine halbe Stunde lang bei O C, dann eine Nacht lang bei Zimmertemperatur weitergerührt, dann nacheinander mit 2-2OmI n-Salzsäurc. 3 · 20 ml n-NaHCO,-Lösung und schließlich mit Wasser ausgeschüttelt. Die Äthylacctatphase wird getrocknet und danach eingedampft. Der erhaltene ölige Rückstand wird mit Petroläthcr verrieben. Auf diese Weise werden 10.45 g (77.8%) /.-30-31-OtBu erhalten. Schmelzpunkt: 92 bis 95 C": R'r": 0,8.
Analyse C28H44 O8N2 (536.68):
Berechnet
gefunden .
C 62.7. H 8.3:
C 62.4. H 8.2.
Schritt 2
H-Cilu(OtBu)-Scr(tBu)-OtBu(H-30-3l-OtBu)
17.2 g (32 mMol) Z-30-3l-OlBu werden in 350 ml Methanol gelöst und in Gegenwart von 2.5 g Palladium-Aktivkohle I Stunde lang Wasserstoff durch die Lösung geleitet. Nach Abfiltrieren des Katalysators wird das Filtrat unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft und der feste Rückstand mit Petroläthcr "auf ein Filter aufgebracht. Ausbeute: 10.97 ü(83.4%)H-GIu(OtBu)-SCrItBu)-OtBu.Schmelzpunkt": 78 bis 82 C: R'r1: 0.4.
Analyse C20H38O6N2 (402.54):
Berechnet ... C 59.7. H 9.5. N 6.9;
gefunden .... C 59.8. H 9.4. N 6.6.
Schritt 3
Z-ASP(OtBu)-GIu(OtBu)-SCr(IBu)-OtBu
(Z-29-31-OtBu)
9.45 ε (22.5 mMol) Z-Asp(OtBu)-ONSu und 10.1 g (25 mMol) H-30-31-OtBu werden in 200 ml Äthylacetat gelöst und über Nacht stehengelassen. Anderntags wird die Lösung nacheinander mit 2 · 50 ml n-Salzsäure, 3 · 50 mi n-NaHCO3-Lösung und schließlich mit Wasser ausgeschüttelt. Das nach dem Abdestillieren des Äthylacetats erhaltene öl wird mit Wasser zum Erstarren gebracht, dann das Wasser abfiltriert. Ausbeute: 15.2g (95,0%) Z-29-3!-OtBu. Schmelzpunkt: 84 bis 87 C. R'f': 0.70.
Analyse C36H57O11N3 (707,88):
Berechnet ... C 61,1. H 8.1:
gefunden .... C 61.3, H 8.3.
Schritt 4
Z-Glu(OtBu)-As( OtBu)-Glu( OlBu)-Ser(tBu)-OtBu
(Z-28-31-OtBu)
14,18 g (20 mMol) Z-29-31-OtBu werden in 280 ml Methanol gelöst, und in Gegenwart von 2.1 g Palla-
dium-Aktivkohle wird eine halbe Stunde lang Wasserstoff durch die Lösung geleitet. Die Lösung wird nach Abfiltrieren des Katalysators unter vermindertem Druck eingedampft und der ölige Rückstand (11.65 g; R'r1: 0.2) mit der Lösung von 8,25 g (19 mMol) Z-GIu(OtBu)-ONSu in 200 ml Äthylacetat zur Reaktion gebracht. Die Lösung wird über Nacht stehengelassen und dann nacheinander mit 2 · 50 ml n-Salzsiiure. 3 50 ml n-NaHCO,-Lösung und schließlich
ίο mit Wasser ausgeschüttelt. Die Lösung wird getrocknet, das Äthylacetat abdcstilliert, der feste Rückstand mit η-Hexan verrieben und filtriert. Das rohe Produkt wird in 43 ml heißem Äthylacetat gelöst und die Lösung mit 7 ml η-Hexan versetzt. Die abgeschiedenen Kristalle werden am nächsten Tage abfiltriert und getrocknet. Ausbeute: 13,0 g (76,5%) Z-28-31-OtBu. Schmelzpunkt: 184 bis 185 C; R'r: 0,80.
Analyse C45H72O14N4 (893.1):
Berechnet ... C 60,5. H 8,1;
gefunden .... C 60.8. H 8,0.
Schritt 5
H-Glu(OtBu)-Asp( OtBu)-GIu(Ot Bu)-
Ser(lBu)-OtBu (H-28-3l-OtBu)
12.5 g (14 inMol) Z-28-31-OtBu werden in 250 ml Methanol gelöst und in Gegenwart von 1.8 g Palladium-Aktivkohle eine halbe Stunde lang hydriert. Der Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat zur Trockne eingedampft. Der feste Rückstand wird mit n-Hcxan verrieben und filtriert. Ausbeute: 10.09 g (95%) H-28-31-OtBu. Schmelzpunkt: 139 bis 140 C: R'r': 0,3: R'r: 0.25.
Analyse C27H66O12N4 (758.97):
Berechnet
gefunden .
N 7.4;
N 7.6.
Schritt 6
Z-Ala-Glu(OtBu)-Asp( OtBu)-Glu( OtBu)-Ser(tBu)-OtBu (Z-27-31-OtBu)
6.62 g (8JmMoI) H-28-3I-OtBu werden in 65 ml Äthylacetat gelöst und 2.72 g (8.5 mMol) Z-AIa-ONSu zugesetzt, welches sich nach 5minütigem Rühren ebenfalls löst. Nach einstündigem Rühren beginnt sich das Produkt aus der Lösung auszuscheiden. Das Reaktionsgemisch wird über Nacht stehengelassen, das Produkt anderntags abfiltriert und mit Äthylacetat gewaschen. Das Rohprodukt wird aus 65 ml Äthylacetat um kristallisiert. Ausbeute: 6,61 g (80,7%) Z-27-31-OtBu. Schmelzpunkt: 193 bis 195°C; R'f': 0.35: R'r: 0.75.
Analyse C48H^7O15N5 (64.Ϊ8):
Berechnet
gefunden .
C 59.9. H 8.1:
C 59.6. H 8.1.
Schritt 7
H-Ala-GIu( OtBu)-Asp(OtBu)-Glu( OtBu)-SeHtBu)-OtBu (H-27-31-OtBu)
6,61 g (6,85 mMol) Z-27-3I-OtBu werden u *er leichtem Erwärmen in 150 ml Methanol gelöst, di. Lösung auf Zimmertemperatur abgekühlt und in Gegenwart von Palladium-Aktivkohle eine halbe Stunde lang Wasserstoff hindurchgeleitet. Nach Abfiltrieren des
Katalysators wird die Lösung zur Trockne eingeiampft, der feste Rückstand mit η-Hexan durchgearbeitet und filtriert. Ausbeute: 5,55 g (97.6%) H-27-31 -OtBu.Schmelzpunkt: 138bis 142 C;Rj:0.15.
Analyse C40H710,.,N5 (830,05):
ik'echnet ... C 57,9, H 8.6. N 8.4; gefunden .... C 57,7. H 8.3. N 8.1.
Schritt 8
Z-Asn-OPFP
1,33 g (5 mMol) Z-Asn-OH und 3.04 g Pentafluorphenol werden in 3,5 ml Dimethylformamid gelöst und die Lösung mit 10,5 ml Dioxan versetzt. Die Lösung wird auf 00C abgekühlt und unter Rühren 1,13 g (5.5 mMol) DCC zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird 2 Stunden lang bei 0r C gerührt, danach das DCU abfiltriert und das Filtrat unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird mit 8 ml Äther verrieben, die kristalline weiße Substanz abfiltriert und mit wenig kaltem Äther gewaschen. Ausbeute: 2,02 g (93,5%) Z-Asn-OPFP. Schmelzpunkt: 149 bis 150° C; R'r°: 0,35.
Analyse C18HnO5N2F5 (432,31): *5
Berechnet ... C 50.0. H 3.0. N 6.5; gefunden .... C 50,2, H 3.1. N 6,4.
Schritt 9
Z-Asn-Gly-OtBu (Z-25-26-OtBu)
3°
0.43 g (1 mMol) Z-Asn-OPFP werden unter schwachem Erwärmen in 10 ml Dioxan gelöst, die Lösung auf 100C abgekühlt und 0,185 g (1,1 mMol) H-GIy-OtBu · HCl zugesetzt. Zu der erhaltenen Suspension werden unter Rühren 0.154 ml (1.1 mMol) Triälhylamin zugesetzt, das Reaktionsgemisch eine halbe Stunde lang bei Zimmertemperatur gerührt, danach filtriert und das Filtrat eingedampft. Der erhaltene gelartige Rückstand wird mit Äther verrieben und filtriert. Auf diese Weise werden 0,34 g (89,8'Vn) Z-Asn-Gly-OlBu erhalten. Schmelzpunkt: 150 bis 15rC;R?:0,6.
Analyse C18H25O6Nj (379.42):
Berechnet ..
gefunden
N 11,1:
N 11.2.
45 Dimethylformamid gelöst, die Lösung auf 0 C gekühlt und 11,81 g (8,8 mMol) DCC zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird eine halbe Stunde lang bei OC, dann bei Zimmertemperatur 2.5 Stunden gerührt. Nach Abfiltrieren des DCU wird die Lösung zur Trockne eingedampft, der Rückstand mit Äthylacetat durchuearbeitet und filtriert. Ausbeute: 7.3 g (80,5%) Z-25-31-OtBu. Schmelzpunkt: 194 C (Zers.): R?: 0.6.
Schritt 12
H-Asn-Gly-Ala-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(iBu)-OtBu (H-25-31-OtBu)
6.47 g (5,7 mMol) H-25-31-OtBu werden in einem Gemisch von 220 ml Äthanol und 20 ml Dimethylformamid gelöst, und in Gegenwart von I g Palladium-Aktivkohle wird 1 Stunde lang Wasserstoff durch die Lösung geleitet. Der Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat zur Trockne eingedampft. Der gclartige Rückstand wird mit Äther durchgearbeitet, filtriert und getrocknet. Ausbeute:4,9g(86,2%)H-25-3i-OlBu. Schmelzpunkt: 174 bis 176' C (Zers.); R?: 0,2.
Schritt 13
Z.-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Arg(NO,)-Arg(NO2)-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr(tBu)-Pro-Asn-Gly-Ala-
Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Scr(tBu)-OtBu
(Z-15-3l-OtBu)
7.4 g (4 mMol) Z-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Arg(NO,)-Arg(NO2)-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr(tBu)-Pro-OH (österreichische Patentschrift 295 051) und 4.2 g (4,2 mMol) H-25-31-OtBu werden in 25 ml Dimethylformamid gelöst, die Lösung wird auf 0°C abgekühlt und 3,64 g (4.8 mMol) DCC-PFPOH-Komplex. in dem die Reaktionskomponenten im Verhältnis 1:3 enthalten sind, werden in die Lösung eingetragen. Das Reaktionsgemisch wird 20 Minuten bei 0" C. dann 5 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt. Anschließend wird das Reaktionsgemisch in 300 ml wasserfreien Äther filtriert; der sich abscheidende Niederschlagwird isoliert. 11.0 g (97%) rohes Produkt werden gewonnen. Schmelzpunkt: 18O0C. Das Rohprodukt wird in 33 ml Methanol gelöst und durch Zugabe von 430 ml Äthylacetat ausgefällt. Ausbeute: 8,75 g (77%) Z-15-31-OtBu. Schmelzpunkt (Zers.): 185"C R?: 0.5.
Schritt 10
Z-Asn-Gly-OH (Z-25-26-OH)
9,13 g (26 mMol) Z-Asn-Gly-OtBu werden in 90 ml Trifluoressigsäure gelöst und eine halbe Stunde stehengelassen, danach mit 450 ml trockenem Äther versetzt. Der ausgeschiedene weiße Niederschlag wird filtriert end mit Äther gewaschen. Das Rohprodukt wird aus 35 ml Wasser umkristallisiert, wobei 6,56 g (78%) Z-Asn-Gly-OH gewonnen werden. Schmelzpunkt: 170 bis 172=C;Rf:0.45.
Schritt 11
Z-Asn-Gly-Ala-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-OtBu (Z-25-31-OtBu)
2,59 g (8 mMol) Z-Asn-Gly-OH, 6,65 g (8 mMol) H-Ala-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-SeΓ(tBu)-OtBu und 4,86 g Pentafluorphenol werden in 28 ml Schritt 14
H-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Arg-Arg-Pro-Val-Lys(BOC> Val-Tyr(tBu)-Pro-Asn-Gly-Ala-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-OtBu · 3HCl
(1-1-15-31-OtBu-SHCl)
6,5 g (2,3 mMol) Z-15-31-OtBu werden in 85 m Essigsäure gelöst, und in Gegenwart von 2 g Palla dium-Aktivkohle wird Wasserstoff durch die Lösun geleitet. Das Fortschreiten der Reaktion wird mittel Dünnschichtchromatographie kontrolliert. Nach Be
endigung der Reaktion wird der Katalysator abfiltnei und das Filtrat zur Trockne eingedampft. Das erha tene Produkt (6,72 g) wird in 70 ml Wasser gelöst un der pH-Wert der Lösung unter Kühlen mit verdünnt* Salzsäure auf vier eingestellt. Danach werden d<
Lösung 20 ml 30%ige Kochsalzlösung zugesetzt un der ausgeschiedene Niederschlag abfiltriert und g trocknet. Zum Zwecke der Entsalzung wird das Pr* dukt in Äthanol und Chloroform suspendiert, das Sa
abfiltriert und das Filtrat zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird mit Äther durchgearbeitet und filtriert. Ausbeute: 5,35 g (85.6%) Η-Ι5-.Ή-OtBu-3 HCI. Rf: 0.45.
S Schritt 15
BOC-Scr-Tyr· i,or-Mct-ülu( OtBu)-MiS-Phe-Arg-Trp-(ily-[.ys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys( FHX)-LyS(BOO-Ani-Arg-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr(tBu)-Pro-
Asn-üly-Ala-Glu(OtHu)-Asp(()tBu)-Olu(OtBu)-Ser(tBu)-OtBu 3HCI (BOC-l-31-OtBu · 3HCI)
2.96g(l,5mMol)BOC-Scr-Tyr-Ser-Met-Glu(OtBu)-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-OH (österreichische Patentschrift 295 051) und 4.08 g (1.5 mMol) H-I5-31-Ot8u-3HCI werden in 20 ml Dimethylformamid gelöst, die Lösung wird auf O C abgekühlt und zuerst mit 0,21 ml Triäthylamin, danach mit 1.36 g (1,8 mMol) DCC-PFPOH-Komplex versetzt. Das Reaktionsgernisch wird 10 Minuten lang bei einer Temperatur von O' C, dann 24 Stunden lang bei Zimmertemperatur gehalten und schließlich in 250 ml trockenen Äther filtriert. Der abgeschiedene Niederschlag wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und dann getrocknet Ausbeute: 6.84 g (98.4%) BOC-1-31-OtBu ■ 3HCI; R?: 0,45.
Schritt 16
H-Ser-Tyr-Scr-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro- Asn-Gly-Ala-Glu-Asp-Glu-Ser-OH-3CH3COOH (H-I-3I-0H· 3CH3COOH)
3,0 g (0.647 mMol) BOC-1-31-OtBu · 3 HCI werden in einem Gemisch von Trifluoressigsäure, Wasser und Anisol im Verhältnis 8:1:1 gelöst und die Lösung bei Zimmertemperatur I Stunde lang gerührt. Danach werden der Lösung 300 ml Äther zugesetzt. Der ausgeschiedene Niederschlag wird abfiltricrt und mit Äther gewaschen. Das erhaltene Trifluoracetat (2,89 g) wird in Wasser gelöst und die Lösung über eine Säule von Dowex 1 χ 8 (Acetatform) filtriert. Nach dem Ionenaustausch wird die Lösung auf eine mit 500 ml CM 23 gefüllte Säule aufgebracht. Die Reinigung erfolgt durch Gradienteneluierung. Die Fraktionen, die den gewünschten Stoff enthalten, werden vereinigt und lyophilisiert. Ausbeute: 1,64 g (70%) chromatographisch einheitliches, biologisch völlig aktives H-1-31-OH.
Aminosäureanalyse:
Lys 4,08 (4); His 1,0 (1); Arg 2,94 (3); Asp 2,01 (2); Met 0,78 (1); Ser 2,78 (3); GIu 3,07 (3); Pro 2,86 (3); GIy 2,97 (3); AIa 1,09 (1); VaI 2,96 (3); Tyr 2.1 (2);
Phe 1,09 (1).
Beispiel 2
Alternativweg zur Synthese des menschlichen
ACTH, _3,
Schritt 1
Z-Arg(NO2)-Arg(NO2)-Pro-OPFP (Z-17-19-OPFP)
3,26 g (5 mMol) Z-Arg(NO2)-Arg(NO2)-Pro-OH (österreichische Patentschrift 295 051) werden in 30 ml Dimethylformamid gelöst und der Lösung 5,31 g (7 mMol) DCC-PFPOH-Komplex zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird bei Zimmertemperatur 5 Stunden lang gerührt, danach das abgeschiedene DCU abfiltriert und das Filtrat zur Trockne eingedampft. Der ölige Rückstand wird in Äther zum Erstarren gebracht. Dieser Niederschlag wird abfiltriert und mit Äther gewaschen (3,8 g = 92.9% Rohprodukt). Das rohe Produkt wird in 11ml Tetrahydrofuran gelöst und mit 60 ml Äther ausgefällt. Ausbeute: 3.42 g (83.6%) Z-l7-l9-OPFP;R'r 6: 0,55.
Analyse Cj1H36O1nN11F, (817,9):
Berechnet ... C 45,5. H 4,4, N 18,8, F 11,6;
gefunden .... C 46,0, H 4,7, N 18,7, F 11,8.
Schritt 2
Z-Arg(NO2)-Arg(NO2)-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr(tBu)-Pro-OH (Z-17-24-OH)
2,22 g (2,92 mMol) H-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr(tBu)-Pro-OH (österreichische Patentschrift 295 051) werden in 25 ml Dimethylformamid suspendiert und unter Rühren 2,64 g (3,22 mMol) Z-17-19-OPFP zugesetzt. Durch zweieinhalbstündiges Rühren wird eine klare Lösung erhalten, die noch zweieinhalb Stunden weitergerührt und dann zur Trockne eingedampft wird. Der Rückstand wird mit Tetrahydrofuran auf ein Filter aufgebracht und mit Tetrahydrofuran gewaschen. Das rohe Produkt (3,8 g = 93,3%) wird in 15 ml Methanol gelöst und mit 100 ml Äthylacetat ausgefällt. Der Niederschlag wird abfiltriert und getrocknet. Ausbeute: 3,55 g (87,2%) Z-17-24-OH. Rf: 0,7.
Analyse C64H99O18N7 (1394,61):
Berechnet ... C 55,1, H 7,2, N 17,1;
gefunden .... C 55,0. H 7,0, N 17,2.
Schritt 3
H-Arg-Arg-Pro-Val-LysfBOC)-Val-Tyr(tBu)-Pro-OH · 3HCl (H-17-24-OH · 3HC1)
0,4 g (0,29 mMol) Z-17-24-OH werden in 8 ml Essigsäure gelöst und in Gegenwart von 0,1 g Palladium-Aktivkohle hydriert. Das Fortschreiten der Reaktion wird mittels Dünnschichtchromatographie kontrolliert. Nach Beendigung der Reaktion wird der Katalysator abfiltriert und das Filtrat zur Trockne eingedampft. Der ölige Rückstand wird in 3 ml Methanol gelöst und der pH-Wert der Lösung unter Kühlung mit verdünnter Salzsäure auf vier eingestellt. Danach wird die Lösung zur Trockne eingedampft und der Eindampfrückstand mit Äthylacetat auf ein Filter aufgebracht. Es werden 0,26 g (70,2%) H-17-24-OH · 3HCl gewonnen; Rj: 0,1.
Schritt 4
Z-Lys(BOC)-Arg-Arg-Pro-VaI-Lys(B OQ-VaI-Tyr(tBu)-Pro-OH · 2HCl (Z-16-24-OH · 2HC1)
0,65 g (0,49 mMol) H-17-24-OH - 3HQ werden in 7 ml Dimethylformamid suspendiert und 0,07 ml Triäthylamin sowie 0,3 g(0,6 mMol) Z-Lys(BOC)-ONP zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird 24 Stunden lang bei Zimmertemperatur gerührt und dann zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird mit Äthylacetat auf ein Filter aufgebracht und mit wenig Wasser gewaschen. Ausbeute: 0,6 g(76,3%)Z-16-24-OH-2HCI; Rf: 0,45.
Schritt 5
Z-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Arg-Arg-Pro-Val-
Lys(BOC)-Val-Tyr(tBu)-Pro-OH · 2HCI
(Z-15-24-OH-2HCI)
0.5 g (0,3 mMol) Z-I6-24-OH · 2HCI werden in 20 ml Metrnnol gelöst und in Gegenwart von Palladium-Aktivkohle hydriert. Nach Beendigung der Reaktion wird der Katalysator abfiltriert und das Filtrat zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird mit m Athylacetat auf ein Filter aufgebracht. Ausbeute: 0.42g (97,3%) H-16-24-OH 2IK 1 (R/. 0.15). 0.33g (0.23 mMol) dieses Produktes werden in 3 ml Dimethylformamid suspendiert und mit 0.14 g (0,25 mMol) Z-Lys(BOC)-OPFP versetzt. Nach zehn"-mipütigem Rühren wird eine klare Lösung erhalten, die noch 3 Stunden weitergerührt und dann zur Trockne eingedampft wird. Der Rückstand wird mit Äthylacetat verrieben. Ausbeute: 0.36 u (85.4%) Z-l5-24-OH-2HCI;R?:0,45.
Schritt 6
Z-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Arg-Arg-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr(tBu)-Pro-Asn-Gly-Ala-Glu(OtBu)-
Asp(OtBu)-Glii(OtBu)-Scr(tBu)-OiBu ■ 21ΚΊ
(Z-15-3l-OtBu-2HCI)
0.18 g (0,1 mMol) Z-15-24-OH ■ 2HCI und 0.10 11 (0.1 mMol) H-25-3l-OtBu werden in 1 ml Dimethylformamid gelöst und der Lösung 0.091 g (0.12 mMol) DCC-PFPOH-Komplex zugesetzt. Das Reaktionsgemis<-h wird 5 Stunden lang gerührt und dann mit Äthylacetat verdünnt. Das abgeschiedene DCU wird abfiltriert und das Filtrat zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird mit Äther verrieben Es werden 0.25 g (88.8%) Z-15-31-OtBu-2HCI gewonnen. Rf: 0.5. Das Produkt wird auf die im Beispiel I beschriebene Weise weiterverarbeitet.
n-Salzsäurc. dann mit 3 χ 50 ml 5%igcr N.iHC(),-Lösung und schließlich mit Wasser ausgeschüttelt. Die Lösung wird getrocknet, danach der Äthylacetat abdfstilliert und der ölige Rückstand aus einem Gemisch von Äthylacctal und Pctroläthcr kristallisiert. Fs werden 31.5g (75%) Z-30-32-OtBu gewonnen. Schmelzpunkt: 72 bis 74 C; R'f1: 0.6: („], = 28.9.
Analyse (VH41 N,O„ (551.84):
Berechnet ... C 58,8. H 7,5. N 7.7; gefunden .... C 58,8. H 7.7. N 7.8.
Schritt 2
H-GIu(OtBu)-SCr-AIa-OtBu (H-30-32-OIBu)
45
Beispiel 3
Die Synthese des menschlichen ACTH, ,,
Schritt 1
Z-GIuI OtBu)-Ser-Ala-OtBu(Z-30-32-OtBu)
23,9 g(100mMol)Z-Ser-OH und 14.5 g( 100 mMol) H-AIa-OtBu werden in 150 ml Methylenchlorid gelöst, und die Lösung wird auf - 10 C abgekühlt. Danach wird eine aus 20,6 g (100 mMol! DCC und 100 ml Methylenchlorid bereitete Lösung 'igetropft. Das Reaktionsgemisch wird 2 Stunden lang bei Π C gerührt und über Nacht stehengelassen. Anderntags wird das ausgeschiedene DCU abfiltriert und das Filtrat nacheinander mit 3 · 70 ml n-Salzsäure. 3 70 ml 5%iger NaHCO3-Lösung und schließlich mit Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen der Lösung wird das Methylenchlorid abdestilüert und der ölige Rückstand in η-Hexan zum Erstarren gebracht. Es werden 30.0 g (82%) rohes Z-Ser-Ala-OtBu gewonnen, die in 600 ml Methanol gelöst und in Gegenwart von 2 g Palladium-Aktivkohle hydriert werden. Die Reaktion wird mittels Dünnschichtchromatographie kontrolliert. Nach Beendigung der Reaktion wird der Katalysator abfiltriert, das Filtrat zur Trockne eingedampft und der ölige Rückstand in 220 ml Äthylacetat gelöst. Dieser Lösung werden 33,0 g (76 mMol) Z-GIu(OtBu)-ONSu zueesetzt. Anderntags wird die Lösung mit 3 < 50 ml 16.0 μ (29 mMol) Z-30-32-OtBu werden in 350 ml Methanol gelöst und in Gegenwart von 1.6 g Palladium-Aktivkohle hydriert, μ h Beendigung der Reaktion wird der Katalysator aofiltricrt und das Filtrat ίο zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird aus einem Gemisch von Methanol und Äther kristallisiert. Fs werden 9.06 g (75%) H-30-32-OtBu gewonnen. Schmelzpunkt: 135 bis 136' C: R}·1 :0,15; [r/'l = 25.9 (c = I: Äthanol).
Analyse C19H15N1O7 (4i7.P0>:
Berechnet ... C 54.6. H 2,5 NIO.I: gefunden C 54.5. H 8,4, N 9,8.
Schritt 3
Z-ASp(OtBU)-GIu(OlBu)-SCr-AIa-OtBu (Z-29-32-OtBu)
8.2 g (19.6 mMol) H-30-32-OtBu und H.lln 119.OmMoI) Z-Asp(OtBu>-ONSu werden in XOmI Äthylacetat zur Reaktion gebracht. Die Lösung wird anderntags nacheinander mit 3-2OmI n-Salzsaure. 3-2OmI 5%iger NaHCOj-Lösung und schließlich mit Wasser ausgeschüttelt. Die Lösung wird getrocknet, das Äthylacetat abdestilüert und der Rifcksund mit Petroläther auf ein Filter aufgebracht. Fs werden 12.0Sg (85.5%) Z-29-32-OtBu gewonnen. Schmelzpunkt: 85 bis 87 C: R1,1: 0.55; [>] ---- 31* If = 1: Äthanol).
Analyse C35H54O12N4 (722.81):
Berechnet ... C 58.2. H 7.5. N 7.8: gefunden .... C 58.3. H 7.6. N 7.3.
35
40 Schritt 4
H-AsplOtBu)-Glu(OtBu)-Ser-Ala-OtBu (H-29-32-OtBu)
10,5 g (14.5 mMol) Z-29-32-OtBu werden in 130 ml Methanol gelöst und in Gegenwart von 1 g Palladium-
Aktivkohle hydriert. Nach"Beendigung der Reaktion wird der Katalysator abfiltriert und das Filtrat zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird mit Pet; blather verrieben. Es werden 8,35 ε (97.5%) H-29-32-OtBu gewonnen. Schmelzpunkt: 81 bis 82 C:
R1,': 0.1: [„]„ = -24,3° (c = 1; Äthanol).
Schritt 5
Z-Glu(OtBu)-As(OtBu)-Glu{OtBu)-Ser-Ala-OtBu (Z-28-32-OtBu)
5,0 g (11,5 mMol) Z-GIu(OtBu)-ONSu und 6.6 g (11,2 mMol) H-29-32-OtBu werden in 100 ml Chloroform zur Reaktion gebracht. Anderntags wird das
X5
Reaktionsgemisch nacheinander mit 3 · 30 ml n-Salzsäure, 3 · 30 ml NaHCO3-Lösung und schließlich mit Wasser ausgeschüttelt Die Lösung wird getrocknet und das Chloroform abdestilliert. Der Rückstand wird durch Umfallen aus Cbloroform-Petroläther gereinigt. Ausbeute: 8,45 g (83%) Z-28-32-OtBu. Schmelzpunkt: J68 bis 169' C; R'r': 0,5; [«] = - 29' (c = I; Äthanol).
Analyse C44H69N5O15 (908,07):
Berechnet ... C 58,2, H 7,7, N 7,7; gefunden .... C 58,4. H 7,7, N 7,5.
Schritt 6
H-Glu(Ot3u)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser-Ala-OtBu (H-2S-32-OtBu)
N.Og (H.SmMol) Z-28-32-OtBu werden in I60ml Methanol gelöst und in Gegenwart von 1 g Palladium-Aktivkohle hydriert. Nach Beendigung der Reaktion wird der Katalysator abfiltriert und das Filtrat zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird mit einem Gemisch aus Äther und Petroläther verrieben. Es werden 6.4 g(94%) H-28-32-OtBu ccwonnen. Schmelzpunkt: 138 bis 139 C: R'f 2: (11: [.,) = --29.7 [c = I: Äthanol).
Schritt 7
/-AIa-GIuI OtBu)-Asp( Oi Bu)-GIuI Oi Bu)-Ser-Ala-OtBu (Z-27-32-OtBui
30
5.2 g (6.7mMol) H-28-32-OtBu werden in 50 ml Chloroform mit 2.15 g (6.7 mVfol) Z-AIa-ONSu zur Reaktion gebracht. Anderntags wird das Reaktionsgemisch nacheinander mit 3 10 ml n-Salzsäure. 3 · 10 ml 5%iger NaHCO,-Lösung und mit Wasser ausgeschüttelt. Die Lösung wird getrocknet und das Chloroform abdestilliert. Der Rückstand wird mit Petrolälher auf ein Falter aufgebracht. Ausbeute: 6.1 g (93.1%) Z-27-32-OtBu. Schmelzpunkt: 194 bis 195 c": R'f 2:0.5:[«] = 30.9 (c = 1: Äthanol).
Analyse C47H74O^N6 (979.14):
Berechnet ... C 57.7. H 7.6. N 8.6: gefunden .... C 57.6. H 7.7. N 8.5.
Schrill 8
H-AIs-Glu(OtBu)-Asp( OtBu)-GIuI OtBu)-
Ser AIa-OlBu (H-27-32-OtBu) 6.1 g (6,2mMol) Z-27-32-OtBu werden in 120 ml Methanol gelöst und in Gegenwart von I g Palladium-Aktivkohle hydriert. Nach Beendigung der Reaktion wird der Katalysator abfiltriert und das Filtrat zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird aus einem Gemisch von Äthanol und Äther kristallisiert. Ausbeute: 4.35 g (83%) H-27-32-OtBu. Schmelzpunkt: 192 bis 194C; Rf: 0.1.
Analyse C39H68N6O14 (845,0):
Berechnet ... C 55.4, H 8.1. N 9,9; gefunden .... C 55,2, H 7.8, N 9.6.
Schritt 9
Z-Asn-GIy-Ala-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser-Ala-OtBu (Z-25-32-OtBu)
2,45 g (13,3 mMol) Pentafluorphenol, 1,31g (4,02 mMol) Z-Asn-Gly-OH (Beispiel 1) und 3,4 g (4,02 mMol) H-27-32-OtBu werden in 24 ml trockenem Dimethylformamid gelöst, die Lösung wird auf 0 C abgekühlt und 0,915 g (4,43 roMol) DCC werden zugesetzt. Das Reaktionsgeroiscb wird eine halbe Stunde lang bei 00C, dann 2,5 Stunden lang bei Zimmertemperatur gerührt. Das ausgeschiedene DCU wird abfiltriert und das Filtrat zur Trockne eingedampft. Der feste Rückstand wird mit Äthylacetat durchgearbeitet, abfiltriert und mit heißem Ätbylacetatgewasehen.Ausbeute:4,l2g(89%)Z~25-32-OtBu. ίο Schmelzpunkt: 200 bis 201 C; Rf: 0,6; [«],. = - 13,9r (C= I; DMF).
Schritt 10
H-Asn-Gly-AIa-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser-Ala-OtBu (H-25-32-OtBu)
4.0 g (3.48 mMol) Z-25-32-OtBu werden in 140 ml Methanol gelöst und in Gegenwart von 0.5 g Palladium-Aktivkohle hydriert. Nach Beendigung der Reaktion wird der Katalysator abfiltriert und das Filtrat zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird mit Äther durchgearbeitet und filtriert. Ausbeute: 3.4 g 196%) H-25-32-OtBu. Schmelzpunkt: 188 bis 190 C: Rf: 0.5: O] = -6.6 (c = 0.89: DMF).
Schritt 11
Z-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Arg(NO,)-Arg(NO,)-Pro-
Val-Lys(BOC)-Val-Tyr(tBu)-Pro-Asn-Gly-Ald-
GIU(OiBu)-ASp(OtBu)-GIu(OtBu)-SCr-AIa-Ot Bu
(Z-15-32-OtBu)
3.0 g (2.95 mMol) H-25-32-OtBu und 5.46 g (2.95 mMol) Z - Lys (BOC)- Lys (BOC) -Arg (NO2 )-ArglNO,)-Pro-VaI-Lys(BOC)-Val-Tyr(l Bu)-Pm-OH (österreichische Patentschrift 295 051) werden in 33 ml Dimethylformamid gelöst, die Lösung wird auf O C abgekühlt, und 3.35 g (4.42 mMol) DCC-PFPOH-Komplcx werden zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird 15 Minuten lang bei OC. dann 6 Stunden lang bei Zimmertemperatur gehalten. Das ausgeschiedene DCU wird abfiltriert, wobei das Filtrat in 450 ml trockenen Äther einlaufen gelassen wird. Das ausgeschiedene Rohprodukt wird durch Umfallen aus einem Methanol-Äther-Gemisch gereinigt. Ausbeute: 7.18 g (85.1%) Z-l5-32-OtBu. Rf: 0.35; O]» = -26.4 Ic- - 0.42: DMF).
Schritt 12
H-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Arg(NO2)-Arg(NO2)-Pro-
Val-Lys(BOC)-Val-Tyr(tBu)-Pro-Asn-Gly-Ala-
GiU(OtBu)-ASp(OtBu)-GIu(OtBu)-SCr-AIa-
OtBu-3HCI (H-l5-32-OtBu-3HCl)
6.5 g (2,28 mMol) Z-15-32-OtBu werden in 85 ml F.ssigsäure gelöst und in Gegenwart von 2 g Palladium-Aktivkohle hydriert. Die Reaktion wird mittels Dünnschichtchromatographie verfolgt. Nach Beendigung der Reaktion wird der Katalysator abfiltriert, das Filtrat zur Trockne eingedampft und der ölige Rück stand mit trockenem Äther zum Erstarren gebracht. Nach dem Abfiltrieren wird das Produkt in 70 ml Wasser gelöst und der pH-Wert der Lösung mit verdünnter Salzsäure auf vier eingestellt. Danach wird das Produkt durch Zugabe von 30%iger Kochsalz lösung aus der Lösung ausgefällt. Nach dem Filtrieren und Trocknen wird das Produkt durch Umfallen aus einem Methanol-Chloroform-Gcmisch vom Salz befreit. Das Lösungsmittel wird abdestilliert und der
Rückstand mit Äther durchgearbeitet und filtriert. Ausbeute: 5,6 g (89,6%) H-15-32-OtBu -3HCI; R?; 0,35; [α], = -26,r(c= 1;PMF).
Aminosäureanalyse:
Lys 3,0(3); Arg 1.8(2); Asp 1,98(2); Ser 1,0(1); GIu 2,2(2); Pro 2,1(2); GIy 1,05(1); AIa 2,0(2); VaI 1,96(2); Tyr 0,96(1).
Schritt 13 ίο
BOC-Ser-Tyr-Ser-Met-GlufOtBuJ-His-Pbe-Arg-Trp-GIy-LyS(BOC)-PrO-VaI-GIy-LyS(BOC)-LyS(BOC)- Arg-Arg-Pro-Val-LysiBOCj-Val-TyritBuJ-Pro-Asn-Gly-Ala-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser-
AIa-OtBu · 3 HCl (BOC-I-31-OtBu ■ 3 HCl)
3,11g (1,57 mMol) BOC-Ser-Tyr-Ser-Met-
GlufOtBu)-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC)-Pro-VaI-GIy-OH · HCI (österreichische Patentschrift 295 051) und 4.30 g (1,57 mMol) H-15-32-OtBu werden in 25 ml Dimethylformamid gelost und der Lösung0.22 ml Triäthylamin sowie 1.79 g(2,36 mMol) DCC-PFPOH-Komplex zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird bei Zimmertemperatur 24 Stunden lang gerührt und dann in 300 ml trockenen Äther filtriert. Das ausgescniedene Produkt wird abliltriert und gewaschen!" Ausbeute: 7.2 e (9S.5"i.) BOC-1-32-Ot Bu -3 HCI: R/: 0.5; [./J- = -27.6 (r = I: DMF).
Schritt 14
H-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-
Val-Tyr-Pro-Asn-Gly-Ala-Glu-Asp-Glu-Ser-AIa · 3CH3COOH (H-1-32-OH · 3CH3COOH)
3°
35
3.0 g (0,64 mMol) BOC-l-32-OtBu ■ 3HCl werden unter Rühren in einem Gemisch aus 3.0 ml Anisol. 3.0 ml Wasser und 24 ml Trifluoressigsäure gelöst. Nach einstündigem Rühren werden dem Reaktionsgemisch 300 ml Äther zugesetzt. Der ausgeschiedene Niederschlag wird abfiltriert und mit Äther gewaschen. Das erhaltene TriOuoracetat (2,86 g) wird in Wasser gelöst und die Lösung über eine Säule mit Ionenaustauschharz (Acetatform) filtriert. Danach wird die Lösung auf eine mit 500 ml Carboxymethylcellulose gefüllte Säule aufgebracht. Die säulenchromatogra-Chische Reinigung erfolgt durch Gradienteneluierung. Die das Hauptprodukt enthaltenden Fraktionen werden gesammelt und lyophilisiert. Auf diese Weise werden 1,7 g (70%) chromatographisch einheitliches lind biologisch völlig aktives H-1-32-OH gewonnen.
Aminosäureanalyse:
Lys 3,94(4); His 1,0(1); Arg 2,81 (3):
Asp 2,07(2): Met 0.72(1); Scr 2.7:(3); GIu 2.94(3); Pro 2.96(3): GIy 2.89(3):
AIa 2,2(2); VaI 2.97(3); Tyr 1,98(2); Phe 0.99(1).
Beispiel 4
Synthese des menschlichen ACTH
Schritt I
Z-Ser-AIa-Glu(OtBu)-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu(OtBu)-
Phe-OtBu (Z-3I-39-OtBu)
31.6 g (48,3 mMol) Z-Leu-Glu(OtBu)-Phe-OtBu (s. S. Bajusz, T. Läzar: Acta Chim. Hung. 48, 111 [1966]) werden in 31OmI Dimethylformamid
te celöst und in Gegenwart von Palladium Aktivkohle hvdriert Nach Beendigung der Reaktion wird der Katalysator abfiltriert und das Filtrat auf 100 ml eingedampft, auf -20 C abgekühlt und in eine Lösung folgender Zusammensetzung eingegossen: 38 35 g (47,7 mMol) Z-Ser-Ala-GlufOtBuhAIa-Phe-Pro-OH (österreichische Patentschrift 295 051) werden in 100 ml Dimethylformamid gelöst, mit 5,27 ml (47 4 inMoll N-Methylmorpholin versetzt, auf IOC abgekühlt und unter Rühren 6,26 ml (47,4 mMol) Chlorkohlensäurebutylester zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird bei -10 C 8 Minuten lang gerührt, dann auf - 20 C abgekühlt und die oben beschriebene, vorgekühlte Lösung der Amino-Komponente /ugeeossen Das Reaktionsgemisch wird 15 Minuten lang bei -10 C. 1 Stunde lang bei 00C und schließlich I Stunde lang bei Zimmertemperatm gerührt. Dann wird das Reaktionsgemisch in 2 I Eiswasser geerwisen. das 45 ml N-Meth\lmorpholin enthält. Der \;..-derschlas: wird filtriert, mit verdünnter Zitroncn-.iure, J-tnn"mit W asscr und schließlich mit Äther gevo-ihcn. Ausbeute: 55.85 ü (89.9°„| Z-31-39-OtBu. Sl;:..:cI/-punkt (/ers.l: ISO C: R,5: 0,7.
Schritt 2
H-Si-T-AIa-UIu(OtBu)-AIa-PhC-Pro-Leu
(ilu(OtBul-Phe-OtBu (H-3l-39-OtBui
78.95g (60.ISmMoIi Z-31-39-OtBu werd.:-, in 1500 ml^ü^niger Hssigsäure gelöst und in Geyer: ...art von Palladium-Aktivkohle hydriert. Nach Beend aing der Reaktion wird der Katalysator abfiltriert un i das Filtrat zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird mit Äther durchgearbeitet und filtriert. Ausbeute: 74.35s: (99nn) H-31-39-OtBu. Schmelzpunkt l/crs): 105 C: Rf": 0.5
Schritt 3
Z-GIuI Ot BuI-SCr-AIa-GIu(OtBu)-AIa-Phe-Pro-LeU-GIu(OtBu)-PhC-OtBu (Z-30-39-OtBui
44.5 g (85.8 mMol) des DCHA-Sal/cs von Z-GIu(OtBu)-OH werden in 450 ml trockenem Äther suspendiert und 9.6 ml (85.8 mMol) N-Mcthylmorpholin zugesetzt. Bei einer Temperatur von - 10 C werden unter Rühren 11.3 ml (85,8 mMol) Chlorkohlensäureisobutylester in die Lösung eingetropft und dann auf -20 C abgekühlt. Bei dieser Temperatur wird die vorher auf -20 C gekühlte Lösung von 88.5 g (71.5 mMol) H-3l-39-OtBu in 300 ml trockenem Dimethylformamid zugesetzt und dann das Reaktionsgemisch 15 Minuten lang bei —10 C, 1 Stunde lang bei 0 C und schließlich 1 Stunde lang bei Zimmertemperatur gerührt. Anschließend wird das Reaktionsgemisch in 8 I η-Zitronensäure gegossen. Der ausgeschiedene Niederschlag wird abfillriert und mit Wasser und dann mit Äther gewaschen. Hs werden 104.1 g (97,2%) Z-30-39-OtBu erhalten. Schmelzpunkt: 136 bis 138°C (Zers.); Rf 5: 0,8.
Schritt 4
H-Glu(OtBu)-Ser-Ala-Glu(OtBu)-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu(OtBu)-Phe-OtBu (H-30-39-OtBu)
103, Ig (68,8 mMoI) Z-30-39-Ot Bu werden in 1500 ml 80%iger Essigsäure gelöst und in Gegenwart von Palladium-Aktivkohle hydriert. Nach Beendigung der Reaktion wird der Katalysator abfiltriert und das
Filtrat zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird mit Äther durchgearbeitet, abfiltriert und mit Äther gewaschen. Es werden 90,75 g (92,7%) H-3Q-39-QtBu gewonnen. Schmelzpunkt: 118"C (Zers.); Rf: 0,5.
Schritt 5
Z-ASp(OtBu)-GfU(OtBuJ-SCr-AIa-GtU(OtBu)-AIa-Phe-Pro-Leu-GIu(OtBu)-Phe-OtBu (Z-29-39-OtBu)
38,3 g (75,9 raMol) des DCHA-Salzes von Z-Asp(OtBu)-OH werden in 400 ml trockenem Dimethylformamid suspendiert und 8,5 ml (76,6 mMol) N-Methylmorpholin zugesetzt. Das Gemisch wird auf -10=C gekühlt und unter Rühren mit IO ml (75,9 mMol) CbJorkohlensäureisobutylester versetzt. Das Reaktionsgemisch wird auf — 20"C gekühlt und eine auf —20°C vorgekühlte Lösung von 90s (63,25 mMol) H-30-39-OtBu in 250 ml Dimethylfornv amid zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird bei - 10 C 15 Minuten lang, bei OC 1 Stunde lany und bei Zimmertemperatur eine weitere Stunde lang gerührt. Das ausgeschiedene SaI/ wird abfiltriert und das Filtrat zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird mit η-Zitronensäure durchgearbeitet, filtriert und bis zur Neutralität gewaschen Ausbeute: 98,5 g (93%) Z-29-39-OtBu. Schmelzpunkt (Zers.): 185 C; Rf 5: 0.8.
30 Schritt *
H-ASp(OtBu)-GIu(OtBu)-SCr Ma-GIu(OtBu)-AIa-Phe-Pro-Leu-Glu(OtBu)-Phe-OtBu(H-29-39-OtBu)
35
67,25 g (42,15 mMol) Z-29-39-OtBu werden in 1300 ml 80%iger Essigsäure gelöst und in Gegenwart von Palladium-Aktivkohle hydriert. Nach Beendigung der Reaktion wird der Katalysator abfiltriert und das Filtrat zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird mit Äther durchgearbeitet. Filtriert und getrocknet. Ausbeute: 63,8 g (95%) (Z-29-39-OtBu). Schmelzpunkt (Zers.): 128 bis 132°C; Rf: 0.3.
Schritt 8
Schritt 7
Z-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser-Ala-
GIu(OtBu)-AIa-PhC-PrO-LeU-CiIu(OtBu)- Phe-OtBu
(Z-28-39-OtBu)
5-
27,3 g des DCHA-Salzes von Z-GIu(OtBu)-OH werden in 270 ml trockenem Dimethylformamid Suspendiert, 5,6 ml (53,2 mMol) N-Methylmorpholin herden zugesetzt, das Reaktionsgemisch wird auf
— 10°C abgekühlt,und bei dieser Temperatur werden Unter Rühren 6,95 ml (52,55 mMol)Chlorkohlensäurehobutylester zugetropft. Nach 8 Minuten wird auf -20 C abgekühlt. Bei dieser Temperatur wird die auf - 20° C vorgekühlte Lösung von 69,9 g (43,8 mMol) H-29-39-OtÖu in 27OmI Dimethylformamid züge- «o setzt. Die Temperatur wird 15 Minuten lang auf
- 100C, I Stunde lang auf 00C und I Stunde lang bei Zimmertemperatur gehalten. Danach wird das ausgeschiedene Salz abfiltriert, das Filtrat zur Trockne eingedampft, der Rückstand mit η-Zitronensäure auf 6$ ein Filter aufgebracht und bis zur Neutralität gewaschen. Ausbeute: 70,15 g (86,2%) Z-28-39-OtBu. Schmelzpunkt (Zers.): 2O5°C; R'f J: 0,9.
Z-Ala-G!u(OtBu)-Asp(OtBu)-GJu(OtBu)-Ser-Ala-
Glu(OtBu)-Alft-Phe-Pro-Leu-Glu(OtBu)-Phe-OtBu
(Z-27-39-OtBu)
69,0 g (37,2 mMol) Z-29-39-OtBu werden in 1800 ml trockenem Dimethylformamid gelöst und in Gegenwart von Palladium-Aktivkohle hydriert. Nach Beendigung der Reaktion wird der Katalysator abnltriert und das Filtrat auf 300 ml eingeengt. Unter Rühren werden 20,2 g (42,85 mMol) Z-AIa-OPCP, danach in Portionen 4,76 ml (42,85 mMol) N-Methylmorpliolin zugegeben. Anderntags wird die zähe, harzartige Mischung unter Rübren und Kühlen in 41 5%ige NaHCO3-Lösung eingegossen. Die ausgeschiedene Substanz wird abfiltriert und bis zur Neutralität gewaschen. Das rohe Produkt wird in 1900 ml Methanol heiß gelöst und mit 1100 ml Wasser ausgefallt. Anderntags wird filtriert, das Produkt gewaschen und getrocknet. Ausbeute: 59,2 g (82,6%) Z-27-39-OtBu. Schmelzpunkt: 2)0 C; R'f 2: 0,7.
Schritt 9
H-Ala-Glu(OtBu)-Asρ(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser-Ala-Glu(OtBu)-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu(OtBu)-Phe-OtBu
(H-27-39- OtBu)
8,5 g (4,41 mMol) Z-27-39-OtBu werden in 850 ml trockenem Dimethylformamid gelöst und in Gegenwart von Palladium-Aktivkohle hydriert. Nach Beendigung der Reaktion wird der Katalysator abfiltriert, die Lösung eingedampft, mit Äther durchgearbeitet und anschließend filtriert. Ausbeute: 7,65 g (96.9%) H-27-39-OtBu. Schmelzpunkt (Zers.): 197 C; R'f 2: 0.3.
Schritt 10
Z-Asn-Gly-Ala-Glu(OiBu)-Asp(OtBu)-GIu(OtBu)-Ser-Ala-GIu(OtBu)-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu(OtBu)-
Phe-OtBu (Z-25-39-OtBu)
3,58g(2.0mMol)H-27-39-OtBuundO,65g(2,OmMoi) Z-Asn-Gly-OH (Beispiel 1) werden in 30 ml trockenem Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird auf 00C abgekühlt und mit 1,8 g (2,4 mMol) DCC-PFPOH-Komplex versetzt. Nach vierstündigem Rühren wird das Reaktionsgemisch in 300 ml Äther filtriert, der ausgeschiedene Niederschlag abfiltriert und mit Äther gewaschen. Ausbeute: 3,7g (88%) Z-25-39-OtBu. Schmelzpunkt (Zers): 194"C; R'f 2: 0,3.
Schritt 11
H-Asn-Gly-Ala-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBi!)-Ser-Ala-Glu(OtBu)-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu(OtBu)-
Phe-OtBu · HCI (H-25-39-OtBu · HCl) 3,92 g (1,87 mMol) Z-25-39-OtBu werden in 400 ml 80%iger Essigsäure gelöst und in Gegenwart von Palladium-Aktivkohle hydriert. Nach Beendigung der Reaktion wird der Katalysator abfiltriert und das Filtrat zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in trockenem Dimethylformamid gelöst und der Lösung Pyridin zugesetzt, das 6 bis 8 Äquivalente Salzsäure enthält. Das nach Abdestillieren des Lösungsmittels erhaltene Dl wird mit Wasser auf ein Filter aufgebracht, danach mit Wasser und schließlich mit Äthylacetat gewaschen. Ausbeute: 3,22 g (86,1%) H-25-39-OtBu · HCI. Schmelzpunkt (Zers.): 187°C; R'f 3:0.3l.
Schritt i;
324
Z-Ly8(BaC}-Lys(BOC)-Arg(NOa)-Arg(NO,i-Pro-Val-LysfBOCJ-Val-TyrftBul-Pro-Asn-Gly-Ala-
GIuiOtBuJ-AspiOtBuJ-GluiOtBuJ-Ser-Ala- s
Glu(OtBu)-AIa-Phe-Pro-Leu-Glu(OtBu)-Phe-OtBu (Z-15-39-OtBu)
3,0 g (1,5 mMol) H-25-39-OtBu · HCl und 3,1 g (1,65 mMol) Z - Lys (BOC) - Lys (BOC) - Arg (NO2 )-Arg(NO.)-Pro-VaI-Lys(BOC)-VaI-Tyr(tBu)-Pro-OH <° (S. österreichische Patentschrift 295 051) werden in 20 ml trockenem Dimethylformamid gelöst, und die Lösung wird auf 00C abgekühlt und mit 0,166 ml (1,5 mMol) N-Metbylmorpholm, dann mit 1,4 g DCC-PFPOH-Komplex versetzt. Das Reaktionsge- '5 misch wird 24 Stunden lang bei Zimmertemperatur gerührt, danach in 400 ml Äther filtriert. Der ausgeschiedene Niederschlag wird abfiltriert, in Aceton suspendiert, gerührt und auf ein Filter aufgebracht. Ausbeute: 5,15 g (90%) Z-15-39-OtBu. Schmelzpunkt (Zers.): 220 C; R1,2: 0,2; Rf: 0.65.
Schritt 13
H-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Arg-Arg-Pro-Val-L>s(BOC)- 2r
VaI-Tyr(tBu)-Pro-Asn-Gly-~Ala-Glu| OtBu)-
Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Scr-Ala-Glu(Ot Bu)-AIa-Phc-
Pro-Leu-Glu(OtBu)-Phc-Otßu -3 HCI
(H-15-39-OtBu-3HC!)
5.0 g (1,31 mMol) Z-15-39-OtBu werden in 100 ml 80%iger Essigsäure gelöst. 3 g aktivierter Zinkstaub wird zugesetzt und das Reaktionsgemisch bei Zimmertemperatur gerührt. Die Reduktion wird mittels Dünnschichtchromatographie kontrolliert. Nach Beendigung der Reduktion wird die Suspension filtriert. das Filtral eingedampft und der Rückstand mit Wasser durchgearbeitet, danach filtriert. Das Produkt wird in 300 ml 80%iger Essigsäure gelöst und in Gegenwart von Pilladium-Aktivkohle hydriert. Nach Beendigung der Reaktion wird der Katalysator abliltriert, die Lösung zur Trockne eingedampft, der Rückstand mil Äther durchgearbeitet und filtrier;. Das Produkt wird in 40 ml Pyridin gelöst und unter Kühlung mit IO ml Pyridin versetzt, das 1.5 ml konzentrierte Salzsäure enthalt. Der durch Eindampfen der Lösung gewonnene Rückstand wird mit Wasser durchgearbeitet, filtriert und mit Wasser gewaschen. Ausbeute :4,0 g (85%) H-15-39-OtBu-3HCI. Schmelzpunkt (Zers.): 208 C; Rf 7:0.35.
Schritt 14
H-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp GIj · Lys-Pro-Val-GIy-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-Asn-Gly-AIa-GIu-Asp-Glti-Ser-AIa-Glu-AIa-Phe-Pro-Leu-Glu-Phe-OH(H-!-39-OH)
3,6 g (1.0 mMol) H-15-39-OtBu-3HCI und 2,0 g (I mMol) BOC-Ser-Tyr-Ser-Met-GIu(OtBu)-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC)-Pro-Va!-Gly-OHHCl (s. österreichische Patentschrift 295 051) werden in 20 ml Dimethylformamid gelöst, die Lösung wird auf 0cC abgekühlt, und 0,11ml (ImMoI) N-Methyl- morpholin sowie 0,95 g DCC-PFPOH-Komplex werden zugesetzt. Das Reaklionsgcmisch wird 24 S'unden lang bei Zimmertemperatur gerührt und danach in 200 ml Äther filtriert. D^ ausgeschiedene Produkt 15.6 g: Rf: 0.55) wird abfiltrieit und zuerst mit Äther dann mit Wasser gewaschen. 1 g des so gewonnenen Produktes wird in einem Gemisch aus 20 ml Trilluoressigsäure und I ml Mercaploäthanol gelöst. Die Lösung wird I Stunde lang bei Zimmertemperatur stehengelassen und dann im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird in 20 ml Wasser gelöst und wieder im Vakuum eingedampft. Der Eindampfrückstand wird in K) ml Wasser gelöst, und mit Hilfe eines acctatcyclischen lonenaustauscherharzcs werden die (rilluoracetationen gegen Acetationen ausgetauscht. Die Lösung wird Iyophilisiert und das Produkt auf einer mit dem Ionenaustauscher CM-32 gefüllten Säule mit einer Puffergradienten von 0,13 Mol(pH6.6i bis 0.25 MoI (pH 7) gereinigt. Die Fraktionen, die den gewünschten Stoff enthalten, werden vereinigt und Iyophilisiert. Es werden 0.6 e (60Vj) H-1-39-OH erhalten. Rj4: 0,25.
Aminosäureanalyse:
Asp 1.9(2): Ser 2.7(3); GIu 4.7(5); Pro 3.8(4): GIy 3.0(3); AIa 3.0(3); Leu 1,0(1); VaI 2.9(3): Met 0.95(1): Tyr 1,9(2); Phe 3.0(3); His 0,95(1) Lys 3.8(4); Are 2,8(3).

Claims (1)

  1. Patentanspruch:
    Verfahren zur Herstellung von Asparaginylgruppen enthaltenden, biologisch aktiven Polypeptiden durch Verknüpfung der entsprechenden geschützten Peptidkoraponenten nach der Aktivesterroethode und anschließende Abspaltung der Schutzgruppen, dadurch gekennzeichnet, daß die Carboxylgruppe der Acylierungskomponente bei Raumtemperatur bis ungefähr 00C durch Umsetzen zum Pentafl-orphenylester aktiviert und die Acylierungsreakuon innerhalb des gleichen Temperaturbereichs durchgeführt wird.
DE2324239A 1972-05-15 1973-05-14 Verfahren zur Herstellung von Asparaginylgruppen enthaltenden biologisch aktiven Polypeptiden Expired DE2324239C3 (de)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
HURI465A HU166913B (de) 1972-05-15 1972-05-15

Publications (3)

Publication Number Publication Date
DE2324239A1 DE2324239A1 (de) 1973-12-06
DE2324239B2 true DE2324239B2 (de) 1974-10-10
DE2324239C3 DE2324239C3 (de) 1975-05-28

Family

ID=11000888

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE2324239A Expired DE2324239C3 (de) 1972-05-15 1973-05-14 Verfahren zur Herstellung von Asparaginylgruppen enthaltenden biologisch aktiven Polypeptiden

Country Status (26)

Country Link
US (1) US3953415A (de)
JP (1) JPS5516417B2 (de)
AT (1) AT351683B (de)
BE (1) BE799552A (de)
BG (1) BG20341A3 (de)
CA (1) CA1027111A (de)
CH (1) CH580064A5 (de)
CS (1) CS173632B2 (de)
DD (1) DD105603A5 (de)
DE (1) DE2324239C3 (de)
DK (1) DK147944C (de)
EG (1) EG11309A (de)
ES (1) ES414589A1 (de)
FI (1) FI56830C (de)
FR (1) FR2184814B1 (de)
GB (1) GB1429251A (de)
HU (1) HU166913B (de)
IL (1) IL42108A (de)
NL (1) NL176946C (de)
NO (1) NO139268C (de)
PL (1) PL91030B1 (de)
RO (1) RO72336A (de)
SE (1) SE421790B (de)
SU (1) SU505352A3 (de)
YU (1) YU36689B (de)
ZA (1) ZA733242B (de)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2296427A1 (fr) * 1974-12-31 1976-07-30 Choay Sa Agent peptidique de regulation de la glycemie
ZA883887B (en) * 1987-06-10 1990-02-28 Lilly Co Eli Chromatographic purification process
US6031074A (en) * 1989-08-25 2000-02-29 National Institutes Of Health Automated Peptide design and synthesis
JP2593495Y2 (ja) * 1991-05-31 1999-04-12 矢崎総業株式会社 高圧抵抗電線の端部構造
SE520392C2 (sv) * 1996-09-27 2003-07-01 Creative Peptides Sweden Ab C Specifika peptider för behandling av diabetes mellitus
DE10054687A1 (de) * 2000-11-03 2002-05-16 N Zyme Biotec Gmbh Inhibitoren von Transglutaminasen
CN116761809A (zh) 2021-04-12 2023-09-15 南京汉欣医药科技有限公司 一种高纯的人促肾上腺皮质激素或其类似物及其规模化制备方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL6509727A (de) * 1965-07-28 1967-01-30
NL6611701A (de) * 1965-08-24 1967-02-27

Also Published As

Publication number Publication date
BG20341A3 (bg) 1975-11-05
RO72336A (ro) 1982-02-26
IL42108A0 (en) 1973-06-29
JPS49100031A (de) 1974-09-20
EG11309A (en) 1978-03-29
CA1027111A (en) 1978-02-28
AT351683B (de) 1979-08-10
SU505352A3 (ru) 1976-02-28
NL7306764A (de) 1973-11-19
NO139268B (no) 1978-10-23
NO139268C (no) 1979-01-31
NL176946B (nl) 1985-02-01
FI56830C (fi) 1980-04-10
US3953415A (en) 1976-04-27
DK147944C (da) 1985-08-26
FR2184814A1 (de) 1973-12-28
DE2324239C3 (de) 1975-05-28
DE2324239A1 (de) 1973-12-06
ATA306973A (de) 1979-01-15
IL42108A (en) 1975-12-31
FR2184814B1 (de) 1977-04-22
CH580064A5 (de) 1976-09-30
BE799552A (fr) 1973-08-31
AU5457673A (en) 1974-10-17
HU166913B (de) 1975-06-28
NL176946C (nl) 1985-07-01
ES414589A1 (es) 1976-02-01
YU127373A (en) 1982-02-25
GB1429251A (en) 1976-03-24
SE421790B (sv) 1982-02-01
DK147944B (da) 1985-01-14
CS173632B2 (de) 1977-02-28
JPS5516417B2 (de) 1980-05-01
ZA733242B (en) 1974-04-24
YU36689B (en) 1984-08-31
PL91030B1 (de) 1977-02-28
FI56830B (fi) 1979-12-31
DD105603A5 (de) 1974-05-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE3000225C2 (de)
WO1980002560A1 (en) Process for producing polypeptide alpha -thymosine and derivatives therefrom
DE2324239B2 (de) Verfahren zur Herstellung von Asparaginylgruppen enthaltenden biologisch aktiven Polypeptiden
DE2463205C2 (de) Octapeptid und Verfahren zu dessen Herstellung
CH570972A5 (en) Decapeptide
DE3446997C2 (de)
DE69018914T2 (de) Pharmakologisch aktive Präparate und sie enthaltende Arzneimittel.
DE1518097B1 (de) Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden
CH658661A5 (de) Peptidverbindungen.
DE2601820A1 (de) Kathepsin d-inhibitoren
DE3124818A1 (de) Oxytocin-analoga, ihre herstellung und pharmazeutische mittel
DE2341775C3 (de) In N-terminaler Stellung den Rest einer Aminooxysäure aufweisende Peptide mit ACTH-Wirkung, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie diese Peptide enthaltende Arzneimittel
AT389704B (de) Verfahren zur herstellung von neuen gonadoliberin-derivaten
DE3886656T2 (de) Lösungssynthese eines Oktapeptids.
DE2628006C2 (de) Tridecapeptid, Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung
DE1643496C3 (de) Verfahren zur Herstellung von menschlichem Corticotropin bzw. analoger Verbindungen
CH654841A5 (de) Appetitzuegelnde tripeptide und verfahren zur herstellung derselben.
DE2754770C2 (de) N-Acyltetrapeptidamide, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel
DE2311786A1 (de) Verfahren zur herstellung von peptiden
DE2727048C2 (de) 8-Norleucyl-ceruletide
DE1493559C3 (de) Neue Peptide mit adrenocorticotroper Wirkung und Verfahren zu ihrer Herstellung
DE1800129C3 (de) Biologisch aktive Polypeptide und Verfahren zu ihrer Herstellung
AT249282B (de) Verfahren zur Herstellung neuer Heneikosapeptide
DE1543485A1 (de) Neue Peptide mit ACTH-Wirkung
DE1643274C3 (de) Neue Peptide mit ACTH-Wirkung

Legal Events

Date Code Title Description
C3 Grant after two publication steps (3rd publication)
E77 Valid patent as to the heymanns-index 1977