DK147944B - Fremgangsmaade til fremstilling af biologisk aktive polypeptider som indeholder asparaginylgrupper - Google Patents
Fremgangsmaade til fremstilling af biologisk aktive polypeptider som indeholder asparaginylgrupper Download PDFInfo
- Publication number
- DK147944B DK147944B DK257773AA DK257773A DK147944B DK 147944 B DK147944 B DK 147944B DK 257773A A DK257773A A DK 257773AA DK 257773 A DK257773 A DK 257773A DK 147944 B DK147944 B DK 147944B
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- glu
- ala
- otbu
- ser
- pro
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C271/00—Derivatives of carbamic acids, i.e. compounds containing any of the groups, the nitrogen atom not being part of nitro or nitroso groups
- C07C271/06—Esters of carbamic acids
- C07C271/08—Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to acyclic carbon atoms
- C07C271/10—Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to acyclic carbon atoms with the nitrogen atoms of the carbamate groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
- C07C271/22—Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to acyclic carbon atoms with the nitrogen atoms of the carbamate groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms to carbon atoms of hydrocarbon radicals substituted by carboxyl groups
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/06—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents
- C07K1/061—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents using protecting groups
- C07K1/066—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents using protecting groups for omega-amido functions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/06—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents
- C07K1/08—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents using activating agents
- C07K1/088—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents using activating agents containing other elements, e.g. B, Si, As
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/665—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans derived from pro-opiomelanocortin, pro-enkephalin or pro-dynorphin
- C07K14/695—Corticotropin [ACTH]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Seasonings (AREA)
Description
U79U
i
Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde af den i indledningen til patentkrav 1 angivne art til fremstilling af biologisk aktive polypeptider som indeholder asparagi-nylgrupper, navnlig asparaginyl-glycin-grupper. Specielt tager fremgangsmåden sigte på fremstilling af humant kortiko-tropt hormon eller artsspecifikke fragmenter deraf.
Fra litteraturen er det på den ene side kendt at B-kar-boxamidgruppen i asparagin ved syntese af asparaginylpepti-der under vandfraspaltning let omdannes til en B-cyanogruppe {M. Bodanszky, V. du Vigneaud, J. Am. Chem. Soc. 81, 5688, 1959; E. Schroder og K. Liibke, Peptides I s. 110). Således undergår fx det syntetiske tetrapeptid Pro-Asn-Gly-Pro allerede i 0,1M ammoniakalsk opløsning kvantitativ desamidering (L. Graf m.fl.: Polypeptides Hormones, side 255, Akadémiai Kiado, Budapest, 1971). Til undgåelse af disse vanskeligheder arbejdes der i den nyeste tid ved syntese af peptider, som indeholder en asparaginylgruppe, i stigende omfang med karbox-amid-beskyttelsesgrupper (se fx W. Konig og R. Geiger: Ber.
103, 2041, 1970).
På den anden side er det kendt at en ved B-karboxyl-gruppen forestret aspartylgruppe ved syntese af aspartyl-pep-tider let omlejres til en ringformet succinimidgruppe (E.
Schroder og K. Liibke: Peptides I, side 203; Μ. A. Ondetti m.fl.: Biochemistry 7, 4069, 1968). Sidstnævnte reaktion indtræder særlig let når der i peptidkæden følger glycin efter aspartylgruppen. Det er forståeligt at der i litteraturen ikke kan findes nogen eksempler på acylering med sekvensen asparaginyl-glycin.
Det er opfindelsens formål at tilvejebringe en fremgangsmåde til at eliminere ulempen ved den lette desamiderbarhed af asparaginylpeptider, og dette formål opnås hvis man ifølge opfindelsen går frem som angivet i krav l's kendetegnende del.
Ifølge opfindelsen fremstiller man særlig hensigtsmæssigt humant kortikotropt hormon eller artsspecifikke framen-ter deraf eller beskyttede derivater deraf som angivet i krav 2. Det opnås ved syntese af forbindelser med en asparaginyl-glycin-gruppe at denne under hele syntesen foreligger i fri karboxamidform.
147944 2 I betragtning a£ den lette des ami der bar hed a£ karboxamid-gruppen i asparaginyl-glycindelen er det forklarligt at man efter nyere undersøgelser må foretage en lille modifikation af den tidligere antagne struktur af det adrenolcortilcotrope hormon. Således har den systematiske sammenligning mellem naturlige og syntetiske præparater ført til den erkendelse, at den tidligere på 30. position antagne karboxamidgruppe befinder sig på 25. position, og at der på 26. og 27. position både hos humant korticotropin og hos svinets findes sekvensen Gly-Ala (L. Graf m.fl.: Acta Biochim. Biophys.
Hung. 6, 415, 1971; B. Riniker m.fl.: Nature New Biology 235, 114, 1972). Som følge heraf er den virkelige struktur af menneskets ad-renokortikotrope hormon som følger: H-Ser-Tyr-S er-Met-Glu-Hi s-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 -Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-Asn-Gly-14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 -Ala-Glu-Asp-Glu-Ser-Ala-Glu-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu-Phe-OH.
27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39
Syntesen af det humane adrenokortikotrope hormon med den af T. H. Lee m.fl. (J. Biol. Chem. 236, 2970, 1961) beskrevne struktur såvel som af fragmenter af dette hormon blev første gang beskrevet i ungarsk patentskrift nr. 155.254, jfr. DK patentskrift nr. 124.329.
Den foreliggende opfindelse beror på den erkendelse at den til syntese af biologisk aktive polypeptider hidtil ikke anvendte pentafluorfenol-me to dik (L. Kisfaludym.fi.: Proc. 8th Europ. Peptide Symp. 1966, side 25, 1967; L. Kisfaludym.fi.: J. Org. Chem. 35, 3563, 1970; J. Kovåcs m.fl.: J. Am. Chem Soc. 89, 183, 1967) under passende betingelser egner sig udmærket til syntese af poly-peptider af den ovenfor angivne struktur, som indeholder asparagi-nyl grupper.
Det har overraskende vist sig at man af Z-Asn-0H uden beskyttelse af karboxamidgruppen kan fremstille den tilsvarende pen-tafluorfenylester i et udbytte på over 90%, når der arbejdes ved temperaturer på omkring 0°C, idet derved dannelse af B-cyano-alaninderivatet og af det ringformede succinimidderivat ud fra eventuelt til Asp deamideret Asn praktisk talt fuldstændig undertrykkes. Det på denne måde fremstillede Z-Asn-0PFP egner sig
H79U
3 til acylering af aminosyre- eller peptidderivater uden forekomst af bireaktioner. Man kan fx ligeledes fremstille det beskyttede dipeptid Z-Asn-Gly-OtBu i et udbytte på 90%, og heraf kan man ved behandling med trifluoreddikesyre fremstille Z-Asn-Gly-OH. Af dette dipeptid kan man ligeledes i udmærket udbytte vinde den tilsvarende pentafluorfenylester, med hvilken de i omstående eksempler beskrevne C-terminale peptider (ACTH27_31; ACTH27_32; ACTH27_39) kan acyleres i udmærket udbytte og uden bireaktioner.
Ved syntese af peptider med større antal led (aminosyrer), som indeholder asparaginylgrupper, kunne der specielt påvises en yderligere fordel ved pentafluorfenol-metodikken, idet det blev iagttaget at det ved acylering med pentafluor-fenylestere frigjorte pentafluorfenol ikke forårsager vanskeligheder af den art der optræder i mange tilfælde ved penta-klorfenol-metodikken (DK patentskrift 124.329). Vanskelighederne består i at der ved sammenknytningen indstiller sig en ligevægt, som i nærværelse af i overskud anvendte aminkom-ponenter eller tertiære baser eventuelt kan forskydes i den ønskede retning. Ved anvendelse af pentafluorfenol-metoden er overskud af base ikke nødvendigt. Denne iagttagelse synes at stå i modstrid med den kendsgerning, at pK-værdierne af pentaklor- og -fluorfenolderivaterne efter angivelser i litteraturen er identiske (pK = 5,3). Det har overraskende vist sig at de i dimetylformamid målte pK-værdier af de to fenolderivater afviger væsentligt fra hinanden: pentaklorfenolderi-vatets er 5,05, pentafluorfenolderivatets 6,35. Udtrykt på en anden måde betyder dette at sidstnævnte foreligger i mindre dissocieret form i dimetylformamid, hvorved det bliver forståeligt at den varige protonering af de basiske komponenter og dermed afbremsningen af sammenknytningsreaktionen udebliver.
En yderligere fordel ved pentafluorfenol-metodikken består i at det i løbet af reaktionen frigjorte pentafluorfenol let kan fjernes fra reaktionsproduktet. Dette kan ikke siges om pentaklorfenol eller om denne forbindelses med organiske baser dannede salte, hvilket medfører den ulempe at der opstår saltsyre af disse forbindelser, altså pentaklorfenol og saltene deraf - også når de kun bliver tilbage i reaktionsblandingen 147944 4 i forsvindende ringe mængde - ved den efter sammenknytningen til fjernelse af beskyttelsesgruppen, fx CgH^CI^OCO, fra det ved koblingsreaktionen vundne reaktion gennemførte katalytiske hydrogenering (hvorved den N-terminale aminogruppe kan frigives til næste koblingsreaktion), og denne saltsyre be-skadiger de syreømfindtlige beskyttelsesgrupper. I modsætning hertil kan pentafluorfenol fjernes på simpel måde og kvantitativt - ved at man hælder reaktionsblandingen i æter - hvorved den nævnte skadelige virkning kan undgås. Fra et praktisk standpunkt betyder den væsentligt større opløselighed af penta-fluorEenylestere i organiske opløsningsmidler en yderligere fordel. Som eksempel herpå kan tjene fremstilling af Z-Asn-Gly-OPFP, ved hvilken der til dannelse af pentafluorfenyl-esteren behøves 1/10 af den mængde dimetylformamid som opløsningsmiddel, der behøves til dannelse af pentaklorfenylesteren. Desuden har det vist sig at pentafluorfenol-metoden også egner sig udmærket til syntese af peptider med større antal enheder.
I dette tilfælde arbejdes der ifølge de nyeste litteraturangi-velser med henblik på opnåelse af et højere udbytte og et renere slutprodukt ved forhøjet temperatur, og/eller acyleringsmidlet anvendes i overskud (se Z. B. R. Schwyzer og P.W. Schiller: Helv. Chim. Acta 54, 897, 1971; E. Wiinch: Ber. 104, 2445, 1971). Ved de erfaringer der er gjort i forbindelse med udarbejdelse af den foreliggende opfindelse har det vist sig at det ved anvendelse af pentafluorfenol-metoden til opnåelse af de ovennævnte formål hverken behøves at bruge forhøjet temperatur eller overskud af acyleringsmiddel. Således foregår eksempelvis efter erfaringer ved kontrolundersøgelse ved tyndlagskromatografi reaktionen mellem det beskyttede dekapeptid Z-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Arg(N(>2)-Arg(NO2)-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr(tBu)-Pro-OH og heptapeptidet H-Asn-Gly-Ala-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-OtBu eller oktapeptidet H-Asn-Gly-Ala-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser-Ala-OtBu i dime-tylformamidopløsning indeholdende et kompleks af pentafluorfenol og dicyklohexylkarbodiimid ved stuetemperatur praktisk talt i løbet af fem til seks timer, og det beskyttede heptade-kapeptid (15-32) kan isoleres ved simpel oparbejdning i et udbytte på over 80%. Et lignende udmærket resultat opnås ved 147944 5 omsætning af det i DK patentskrift nr. 124.329 beskrevne te-tradekapeptid ACTH^_^ med heptadekapeptidet 15-31, oktadeka-peptidet 15-32 og pentakosapeptidet 15-39 af ACTH under de nævnte reaktionsbetingelser.
I henhold til foranstående egner den foreliggende fremgangsmåde sig til fremstilling af menneskeligt adrenokortikotropt hormon og artsspecifikke fragmenter deraf i form af peptider med den almene formel I
H-Ser-Tyr-S er-Met-Glu-Hi s-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val--Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-Asn-Gly- I
-Ala-Glu-Asp-Glu-Q hvor Q har betydningerne
a) Ser-OH
b) Ser-Ala-OH
c) Ser-Ala-Glu-OH
d) S er-Ala-Glu-Ala-OH
e) Ser-Ala-Glu-Ala-Phe-OH
f) S er-Ala-Glu-Ala-Phe-Pro-OH
g) Ser-Ala-Gin-Ala-Phe-Pro-Leu-OH
h) Ser-Ala-Glu-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu-OH eller i) Ser-Ala-Glu-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu-Phe-OH, samt af beskyttede derivater af disse peptider.
Udgangsmaterialer og mellemprodukter fremstilles ved kendte peptidkemiske metoder. Ifølge disse anvendes der til beskyttelse af aminogrupper i første række benzyloxylcarbonyl-, t-butyloxykarbonyl- og p-klorbenzyloxykarbonylgrupper, mens man til beskyttelse af karboxylgrupper i første række anvender forestrings-metoden, fremfor alt med metanol, ætanol og t-butanol. Hydroxyl-grupper i sidekæder beskyttes eventuelt ved forætring, til hvilket - formål t-butanol eller benzylalkohol egner sig. Til beskyttelse af guanidinogruppen i arginin egner sig navnlig nitrogruppen, men gu-anidinogruppen kan også foreligge i protoneret fom. Ved passende kcm- ’ bination af beskyttelsesgrupperne kan der opnås at disse selektivt eller i givet fald samtidig kan fjernes ved hydrogenolyse eller acidolyse.
U79U
6
Peptider med forholdsvis lille antal led kan fremstilles ved den trinvise metode eller ved kondensation af fragmenter, hvorved der kan arbejdes ved metoden med blandet anhydrid, azid, aktiv ester eller dicyklohexylkarbodiimid.
Opfindelsens grundtanke ligger i at man ved trinvis sammenknytning af peptider eller aminosyrer indeholdende as-paraginylgrupper aktiverer acyleringskomponentens karboxyl-gruppe ved omsætning til en pentafluorfenylester. Pentafluor-fenylesteren af den acylerende komponent kan ifølge opfindelsen isoleres fra reaktionsblandingen og bringes til reaktion med den komponent som skal acyleres. Det er også muligt at frembringe den umiddelbart i reaktionsblandingen, hvilket ifølge opfindelsen er hensigtsmæssigt i de tilfælde hvor de komponenter, der skal acyleres, ikke indeholder fri karboxyl-grupper. Den aktive ester kan fremstilles ved at der ifølge opfindelsen sættes pentafluorfenol og dicyklohexylkarbodiimid til reaktionsblandingen. En særlig fordelagtig udførelsesform herfor opnås hvis man ifølge opfindelsen til reaktionsblandingen sætter et af pentafluorfenol og dicyklohexylkarbodiimid bestående kompleks. Der anvendes fortrinsvis 1,2-1,5 mol af dette kompleks pr. mol peptid eller aminosyre med fri C-ter-minal. Foruden den lette håndterbarhed har denne udførelsesform den fordel, at de eventuelt i dicyklohexylkarbodiimidet tilstedeværende svovlholdige forureninger kan fjernes. Disse forureninger kan give skadelig indvirkning ved den hydrogenering, der ofte følger efter sammenknytningen for at fjerne beskyttelsesgrupper. En yderligere fordel ved denne sammenknytningsmetode, der forløber uden bireaktioner og med udmærket udbytte, består i at det ikke er nødvendigt at underkaste de beskyttede mellemprodukter en særlig, fx søjlekromatografisk rensning, idet rensning af det for beskyttelsesgrupperne befriede slutprodukt er tilstrækkelig. Denne rensning kan ske på grundlag af modstrømsfordelingsprincippet, men den kan også foretages ved den søjlekromatografiske metode. I sidstnævnte tilfælde kan der fx bruges forskellige slags karboxymetylcellulose.
Ved fremstilling af biologisk aktive peptider indeholdende en asparaginyl-glycin-gruppe kan der ved opbygning af 147944 7 asparaginyl-glycin-gruppen ifølge opfindelsen hensigtsmæssigt arbejdes ved 0-4°C.
De ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede peptider kan omdannes til syreadditionssalte eller til farmaceutisk anvendelige komplekser. Til dannelse af syreadditionssalte kan man anvende farmaceutisk acceptable syrer som fx eddike-'syre, saltsyre, højere fedtsyrer, svovlsyre og fosforsyre.
Ved farmaceutisk anvendelige komplekser forstås her komplekser af de ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede peptider, der dannes ved tilsætning af visse organiske eller uorganiske stoffer og som forsinker peptidernes biologiske virkning. Som sådanne organiske forbindelser kan som eksempler nævnes visse gelatinearter, karboxymetylcellulose, alginsyre-estere, aminosyrepolymerer og andre polymerer og copolymerer.
Blandt organiske forbindelser kan nævnes tungtopløselige salte såsom fosfater eller pyrofosfater og visse metaller, navnlig zink. Til opnåelse af den nævnte virkning egner sig også visse silikater, der med peptiderne ligeledes danner uopløselige komplekser eller kondensater, hvis struktur endnu ikke er opklaret.
De i omstående eksempler beskrevne pentafluorfenylester-mellemprodukter er hidtil ukendte.
De i eksemplerne benyttede forkortelser er dem der er anerkendt af IUPAC-IUB (J. Biol. Chem. 247, 977, 1972). Som videre forkortelse anvendes der efter overskrifterne i eksemplerne et symbol, der betegner sekvensdelen med tal og desuden angiver de N-terminale og C-terminale endegrupper. Beskyttelsesgrupperne på side-lcæderne indgår desuden i overskrifttitlerne. Desuden anvendes følgende forkortelser: DCC = dicyklohexylkarbodiimid; PFPOF = penta-fluorfenol; PCPOH = pentaklorfenol; DCHA = dicyklohexylamin; Z = benzyloxykarbonyl; ONSu = N-hydroxysuccinimidester.
Smeltepunktsbestemmelser skete med dr. Tottolis apparat (Buehi, Schweiz).
8 147964
Tyn dlagskromatografiske undersøgelser blev gennemført på silikagel ifølge Stahl under anvendelse af følgende opløsningsmiddelblandinger : 1. ætylacetat/(pyridin/eddikesyre/vand 20:6:11)=95:5 2. ætylacetat/(pyridin/eddikesyre/vand · 20:6:11)= 9:1 3. ætylacetat/(pyridin/eddikesyre/vand 20:6:11)= 4:1 4. ætylacetat/(pyridin/eddikesyre/vand · 20:6:11)= 3:2 5. ætylacetat /pyridin/eddikesyre/vand =240:20:6:11 6. ætylacetat/pyridin/eddilcesyre/vand =120:20:6:11 7. ætylacetat/pyridin/eddikesyre/vand = 60:20:6:11 8. ætylacetat/pyridin/eddikesyre/vand = 30:20:6:11 9. ætylacetat/pyridin/eddikesyre/vand =480:20:6:11 10. kloroform/hexan/eddikesyre = 8:1:1 11. kloroform/metanol = 98:2 12. kloroform/metanol =95:5 13. kloroform/metanol = 9:1 14· kloroform/metanol = 85:5 15·. n-butanol/pyridin/eddikesyre/vand = 30:20:6:24 16. kloroform/metanol/eddikesyre = 8:1:1
Til fremkaldelse anvendes ninhydrin og/eller klor + to- lidin.
Eksempel 1
Syntese af humant ACTH^_3^ I trin 1-7 fremstilledes H-ACTH27_3]OtBu (H-Ala-Glu (OtBu) -Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-OtBu) ud fra Z-Glu(OtBu)-ONSu ved successiv addition af Ser(nr. 31)/ Asp (nr. 29), Glu (nr. 28) og Ala (nr. 27) ved sædvanlige peptidkemiske metoder.
Trin 8: Z-Asn-OPFP
1,33 g (5 mmol) Z-Asn-OH og 3,04 g pentafluorfenol opløses i 3,5 ml dime tylf ormamid og til opløsningen sættes 10,5 ml di-oxan. Opløsningen afkøles til 0°C og sættes under omrøring til 1,13 g (5,5 mmol) DCC. Reaktionsblandingen omrøres i to timer ved 0°C hvorefter DCU frafiltreres og filtratet inddampes til tørhed under 9 U7944 vakuum. Remanensen rives med 8 ml æter og den krystallinske hvide substans frafiltreres og vaskes med en smule kold æter. udbytte 2,02 g (93,5°/») Z-Asn-OPFP med smeltepunkt 149-150°C, R^0 = 0,35.
Beregnet for Cl8H1305N2F5 (432,31): C 50,0 H 3,0 N 6,5 fundet: C 50,2 H 3,1 N 6,4%
Trin 9: Zr-Asn-Gly-0tBu. (Z-25-26-0tBu) 0,43 g (1 mmol) z-Asn-0PFP opløses under svag opvarmning i 10 ml dioxan hvorefter opløsningen afkøles til 10°C og sættes til 0,185 g (l,l mmol) H-Gly-OtBu,HCl. Til den vundne suspension sættes der under omrøring 0,154 ml (l,l mmol) triætylamin hvorefter reaktionsblandingen omrøres i en halv time ved stuetemperatur og derpå filtreres, hvorefter filtratet inddampes. Den vundne gelag-tige remanens rives med æter og filtreres. På denne måde vindes 0,34 g (89,8% Z-Asn-Gly-0tBu med smeltepunkt 150-151°C, Rp = 0,6. Beregnet for C18H25°6N3 (379,42): N 11,1 fundet: N 11,2%
Trin 10: Z-Asn-Gly-OH. (Z-25-26-OH) 9,13 g (26 mmol) Z-Asn-Gly-OtBu opløses i 90 ml trifluor-eddikesyre og henstår i en halv time, hvorefter der tilsættes 450 ml tør æter. Det udfældede hvide bundfald frafiltreres og vaskes med æter. Råproduktet omkrystalliseres fra 35 ml vand, hvorved der vindes 6,56 g (78% Z-Asn-Gly-OH med smeltepunkt 170-172°C, r| = 0,45.
Trin 11: z-Asn-Gly-Aia-Glu(otBu)-Asp(otBu)-Glu(otBu)-Ser(tBu)-OtBu. (z-25-31-OtBu) 2,59 g (8 mmol) Z-Asn-Gly-OH, 6,65 g (8 mmol) H-Ala-Glu (0tBu)-Asp(0tBu)-Glu(0tBu)-Ser(tBu)-OtBu og 4,86 g pentafluorfenol opløses i 28 ml dimetylformamid, hvorefter opløsningen afkøles til 0°C og sættes til 11,81 g (8,8 mmol) DCC. Reaktionsblandingen omrøres i en halv time ved 0°C og derefter i to og en halv time ved stuetemperatur. Efter frafiltrering af DCU inddampes opløsningen til tørhed og remanensen gennemarbejdes med ætylacetat og filtreres. Udbytte 7,3 g (80,5%) Z-25-31-OtBu med smeltepunkt 194°C (sønderdeling), r| = 0,6.
147944 ίο
Trin 12: H-Asn-Gly-Ala-Glu(O tBu)-Asp(O tBu)-Glu(O tBu)-Ser(tBu)-OtBu. (H-25-31-OtBu) 6,47 g (5,7 mmol) Z-25-31-OtBu opløses i en blanding af 220 ml ætanol og 20 ml dimetylformamid og i nærværelse af 1 g palladium på aktive kul ledes der i en time hydrogen gennem opløsningen. Katalysatoren frafiltreres og filtratet inddampes til tørhed.
Den gelagtige remanens gennemarbejdes med æter, filtreres og tørres. Udbytte 4,9 g (86,2%) H-25-31-OtBu med smeltepunkt 174-176°C (sønderdeling), Ep = 0,2.
Trin 13: Z-Lys(B0C)-Lys(B0C)-Arg(N02)-Arg(N02)-Pro-Val-
Lys(BOC)-Val-Tyr(tBu)-Pro-Asn-Gly-Ala-Glu(01 Bu) -Asp(0tBu)-Glu(0tBu)-Ser(tBu)-0tBu. (Z-15-31-0tBu) 7.4 g (4 mmol) Z-Lys(B0C)-Lys(B0C)-Arg(N02)-Arg(N02)-Pro-Val-Lys(B0C)-Val-Tyr(tBu)-Fro-0H (DK patentskrift nr.
124.329) og 4,2 g (4,2 mmol) H-25-31-0tBu opløses i 25 ml dime-tylformamid hvorefter opløsningen afkøles til 0°C og 3,64 g (4,8 mmol) DCC-PFPOH-kompleks, hvori reaktionskomponenterne er til stede i forholdet 1:3, sættes til opløsningen. Reaktionsbiandingen omrøres i tyve minutter ved 0°C og derefter i fem timer ved stuetemperatur. Derefter filtreres reaktionsblandingen i 300 ml vandfri æter og det derved udskilte bundfald isoleres. Der vindes 11,0 g (97%) råprodukt med smeltepunkt 180°C. Råproduktet opløses i 33 ml metanol og udfældes ved tilsætning af 430 ml ætylacetat. Udbytte 8,75 g (77%) Z-15-31-OtBu med smeltepunkt 185°C (sønderdeling), r| = 0,5-
Trin 14: H-Lys(B0C)-Lys(B0C)-Arg-Arg-Pro-Val-Lys(B0C)-Val-Tyr (t Bu) -Pr o-Asn-Gly-Al a-Glu (01 Bu)-Asp-(0tBu)-Glu(0tBu)-Ser (tBu)-OtBu, 3HC1.
(H-15-31-OtBu,3 HCl) 6.5 g (2,3 mmol) Z-15-31-OtBu opløses i 85 ml eddikesyre og i nærværelse af 2 g palladium-aktive kul føres der hydrogen gennem opløsningen. Reaktionens forløb kontrolleres ved tyndlagskro-matografering. Efter reaktionens afslutning frafiltreres katalysatoren og filtratet inddampes til tørhed. Det vundne produkt, der 147944 11 andrager 6,72 g, opløses i 70 ml vand og opløsningens pH-værdi indstilles med fortyndet saltsyre på 4. Derefter sættes der 20 ml 30%s kogsaltopløsning til opløsningen, det dannede bundfald fra-filtreres og tørres. Med henblik på afsaltning suspenderes produktet i ætanol og kloroform og saltet frafiltreres og filtratet inddampes til tørhed. Remanensen gennemarbejdes med æter og filtreres. Udbytte 5,35 g (85,6%) H-15-31-OtBu,3HCl. r| = 0,45.
Trin 15: BO C-S er-Tyr-Ser-Met-Glu(01Bu)-Hi s-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC)-Fro-Val-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Arg-Ar g-Pro-Val-Lys (BOC )-Val-Tyr (tBu)-Pro-Asn-Gly-Ala-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-OtBu, 3 HC1. (BOC—1-31—OtBu, 3 HCl) 2,96 g (1,5 mmol) BOC-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu(OtBu)-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-OH (dk patentskrift nr.
124.329) og 4,08 g (l,5 mmol) H-15-31-0tBu,3 HCl opløses i 20 ml dimetylformamid hvorefter opløsningen afkøles til 0°C og der først tilsættes 0,21 ml triætylamin og derpå 1,36 g (1,8 mmol) DCC-PFPOH-kompleks. Reaktionsblandingen holdes i ti minutter på en temperatur på 0°C og derefter i 24 timer på stuetemperatur, hvorefter den til sidst filtreres i 250 ml tør æter. Det udskilte bundfald frafiltreres, vaskes med æter og tørres, udbytte 6,84 g (98,4%) B0C-l-31-0tBu,3 HCl med R^ = 0,45.
Trin 16: H-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-
Pro-Val-Gly-Lys-Iiys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-Asn-Gly-Ala-Glu-Asp-Glu-Ser-OH,3 CHgCOOH. (H-1-31-0H,3CH„C00H) O * 3,0 g (0,647 mmol) B0C-l-31-0tBu, 3 HCl opløses i en blanding af trifluoreddikesyre, vand og anisol i forholdet 8:1:1, hvorefter opløsningen omrøres i en time ved stuetemperatur. Derpå sættes der 300 ml æter til opløsningeruDet udskilte bundfald frafiltreres og vaskes med æter. Det vundne trifluoracetat, 2,89 g, opløses i vand og opløsningen filtreres over en kolonne af "Dowex" (et i Danmark indregistreret varemærke) 1x8 (acetatform). Efter ionbytningen anbringes opløsningen på en søjle der er fyldt med 500 ml CM 23. Rensningen sker ved gradient-eluering. De fraktioner 167944 12 der indeholder det ønskede stof forenes og frysetørres. Udbytte 1,64 g (70%) af et kromatografisk ensartet, biologisk fuldstændig aktivt H-1-31-0H.
Aminosyreanalyse: Lys 4,08 (4); His 1,0 (l); Arg 2,94 (3); Asp 2,01 (2); Met 0,78 (l); Ser 2,78 (3); Glu 3,07 (3); Pro 2,86 (3); Gly 2,97 (3); Ala 1,09 (l); Val 2,96 (3); Tyr 2,1 (2);
Phe 1,09 (l).
Eksempel 2
Anden syntesevej for humant Α0ΤΗ1_31
Ved sædvanlige peptidkemiske metoder fremstilles Z-Lys (BOC)-Lys(BOC)-Arg-Arg-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr(tBu)-Pro-0H,2HCl (Z-15-24-OH ,2HC1) ved kondensation af H-16-24-OH,2HCl med Z-Lys (BOC)-OPFP. H-16-24-OH,2HC1 vindes ved hydrogenering af Z-16-24-0H, vundet ved kondensation af Z-Lys(BOC)-ONP med H-17-24-OH,3HC1, der atter var vundet ved kondensation af det kendte peptid H-Val-Lys (BOC) -Val-Tyr (tBu) -Pro-OH med Z^-17-19-OPFP og påfølgende reduktion og behandling med saltsyre. Z-17-19-OPFP fremstilledes ved behandling af det kendte peptid Z-Arg(N02)-Arg(NO2)-Pro-OH med DCC-PFPOH-kompleks.
Z-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Arg-Arg-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr(tBu)-Pro-Asn-Gly-Ala-Glu(01Bu)-Asp(0 tBu)-Glu(0tBu)-Ser(tBu)-0tBu, 2 HC1. (Z-15-31-OtBu, 2 HC1) 0,18 g (0,1 mmol) Z-15-24-OH, 2 HC1 og 0,10 g (0,1 mmol) H-25-31-0tBu opløses i 1 ml dimetylformamid og til opløsningen sættes 0,091 g (0,12 mmol) DCC-PFPOH-kompleks. Reaktionsblandingen omrøres i fem timer og fortyndes derefter med ætylacetat. Det fraskilte DCU frafiltreres og filtratet inddampes til tørhed. Remanensen rives med æter. Der vindes 0,25 g (88,8%) Z-15-31-OtBu, 2 HC1 med RJ = 0,5· Produktet vi der efor arbejdes på den i eksempel 1 beskrevne måde.
147944 13
Eksempel 3
Syntese af humant ACTH1_32
Ved sædvanlige peptidkemiske metoder fremstilles i trin 1 Z-Glu(OtBu)-Ser-Ala-OtBu ud fra Z-Ser-OH og H-Ala-OtBu og ved kondensation af produktet med Z-Glu(OtBu)-ONSu. Det i trin 2 hydrogenerede produkt (H-30-32-OtBu) omsattes i trin 3 med Z-Asp(OtBu)-ONSu og produktet reduceredes i trin 4 til Η-Asp(OtBu)-Glu{OtBu)-Ser-Ala-OtBu, der i trin 5-8 ved omsætning med Z-Glu(OtBu)-ONSu, hydrogenering, omsætning med Z-Ala-ONSu og til slut hydrogenering på ny opbyggedes til H-Ala-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser-Ala-OtBu (H-27-32-OtBu).
Trin 9: Z-Asn-Gly-Ala-Glu(OtBu)-Asp(otBu)-Glu(OtBu)-Ser-Ala-OtBu. (Z-25-32-0tBu) 2,45 g (13,3 mmol) pentafluorfenol, 1,31 g (4,02 mmol) Z-Asn-Gly-OH (eksempel l) og 3,4 g (4,02 mmol) H-27-32-0tBu opløses i 24 ml tørt dimetylformamid, opløsningen afkøles til 0°C og der tilsættes 0,915 g (4,43 mmol) DCC. Reaktionsblandingen omrøres i en halv time ved 0°C og derefter i to og en halv time ved stuetemperatur. Det udskilte DCU frafiltreres og filtratet inddampes til tørhed. Den faste remanens gennemarbejdes med ætylacetat, frafiltreres og vaskes med varmt ætylacetat. Udbytte 4,12 g (89%) Z-25-32-0tBu med smeltepunkt 200-201°C, Rp = 0,6, /a/ = -13,9° (c = 1 i DMF).
Trin 10: H-Asn-Gly-Ala-Glu(0tBu)-Asp(0tBu)-Glu(0tBu)-Ser-Ala-OtBu. (H-25-32-0tBu) 4,0 g (3,48 mmol) Z-25-32-0tBu opløses i 140 ml metanol og hydrogeneres i nærværelse af 0,5 g palladium på aktive kul. Efter reaktionens afslutning frafiltreres katalysatoren og filtratet inddampes til tørhed. Remanensen gennemarbejdes med æter og filtreres. Udbytte 3,4 g (96%) H-25-32-0tBu med smeltepunkt 188-190°C, r| = 0,5, /α/Ό = 6,6° (c = 0,89 i DMF).
14
U79U
Trin 11: Z-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Arg(TO2)-Ar g(NO2)-Pro-Val-
Lys (BOC)-Val-Tyr (tBu) -Pr o-Asn-Gly-Al a-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)—Glu(OtBu)-Ser-Ala-OtBu. (z-15-32-0tBu) 3,0 g (2,95 mmol) H-25-32-0tBu og 5,46 g (2,95 mmol) Z-Lys(B0C)-Lys(B0C)-Arg(N02)-Arg(N02)-Pro-Val-Lys(B0C)-Val-Tyr(tBu)-Pro-OH (dansk patentskrift nr. 124.329) opløses i 33 ml dimetyl-f ormamid hvorefter opløsningen afkøles til 0°C og der tilsættes 3,35 g (4,42 mmol) DCC-PPPOH-lcompleks. Reaktionsblandingen holdes i 15 minutter ved 0°C og derefter i seks timer på stuetemperatur.
Det udskilte DCU frafiltreres hvorefter filtratet filtreres i 450 ml tør æter. Det udskilte råprodukt renses ved omfældning fra en blanding af metanol og æter. Udbytte 7,18 g (85,1%) Z-15-32-0tBu med r| = 0,35, ^7D = -26,4° (c = 0,42 i DMF).
Trin 12: H-Lys(B0C)-Lys(B0C)-Arg(N02)-Arg(N02)-Pro-Val-
Lys(BOC)-Val-Tyr(tBu)-Pro-Asn-Gly-Ala-Glu(OtBu)-Asp(0 tBu)-Glu(0 tBu)-Ser-Ala-0tBu, 3 HC1.
(H-l5-32-0tBu, 3 HCl) 6,5 g (2,28 mmol) Z-15~32-0tBu opløses i 85 ml eddikesyre og hydrogeneres i nærværelse af 2 g palladium på aktive kul. Reaktionens forløb følges ved tyndlagskromatografering. Efter re- aktionens afslutning frafiltreres katalysatoren og filtratet inddampes til tørhed og den olieagtige remanens bringes til størkning med tør æter. Efter frafiltrering opløses produktet i 70 ml vand og opløsningens pH-værdi indstilles på 4 med fortyndet saltsyre. Derefter udfældes produktet fra opløsningen ved tilsætning af 30%s kogsaltopløsning. Efter filtrering og tørring afsaltes produktet ved omfældning fra en blanding af metanol og kloroform. Opløsningsmidlet afdestilleres og remanensen gennemarbejdes med æter og filtreres. Udbytte 5,6 g (89,6%) H-15-32-0tBu, 3 HCl med r| = 0,35, /a7D = -26,la (c = 1 i DMF).
Aminosyreanalyse: Lys 3,0 (3); Arg 1,8 (2); Asp 1,98 (2); Ser 1,0 (1); Glu 2,2 (2); Pro 2,1 (2); Gly 1,05 (l); Ala 2,0 (2);
Var 1,96 (2); Tyr 0,96 (l).
15 U794Å
Trin 13: BOC-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu(OtBu)-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Arg-Arg-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr(tBu)-Pro-Asn-Gly-Ala-Glu(0tBu)-Asp(0tBu)-Glu(0tBu)-Ser-Ala-0tBu, 3 HCL. (BOC-l-32-OtBu, 3 HCl) 3,11 g (l,57 mmol) BOC-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu(OtBu)-His-Phe-Arg-irp-Gly-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-OH, HCl (dansk patentskrift nr. 124.329) 0g 4,30 g (1,57 mmol) H-15-32-0tBu opløses i 25 ml dimetylformandd og til opløsningen sættes 0,22 ml triætylamin og 1.79 g (2,36 mmol) DCC-PFPOH-kompleks. Reaktionsblandingen omrøres ved stuetemperatur i 24 timer og filtreres derefter i 300 ml tør æter. Det udskilte produkt frafiltreres og vaskes, udbytte 7,2 g (98,5%) BOC-l-32-OtBu, 3 HCl, r| = 0,5, = -27,6° (c = 1 i DMF).
Trin 14: H-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-pro-Asn-Gly-Al a- Glu-As p- Glu- S er-Al a, 3 CH3C00H. (H-1-32-0H, 3 CH3C00H) 3,0 g (0,64 mmol) B0C-l-32-0tBu, 3 HCl opløses under omrøring i en blanding af 3,0 ml anisol, 3,0 ml vand og 24 ml tri-fluoreddikesyre. Efter en times omrøring sættes der 300 ml æter til reaktionsblandingen. Det udfældede bundfald frafiltreres og vaskes med æter. Det vundne trifluoracetat, 2,86 g, opløses i vand og opløsningen filtreres over en kolonne af "Dowex" ®1 x 8 (acetatform). Derefter anbringes opløsningen på en kolonne fyldt med 500 ml CM 23. Den søjlekromatografiske rensning sker ved gra-dient-eluering. De fraktioner der indeholder hovedproduktet opsamles og frysetørres, på denne måde vindes 1,7 g (70%) kromatografisk ensartet og biologisk fuldstændig aktivt H-1-32-0H.
Aminosyreanalyse: Lys 3,94 (4); His 1,0 (l); Arg 2,8l (3); Asp 2,07 (2); Met 0,72 (l); Ser 2,72 (3); Glu 2,94 (3); Pro 2,96 (3); Gly 2,89 (3); Ala 2,2 (2); Val 2,97 (3); Tyr 1,98 (2);
Phe 0,99 (1).
16 14794Λ
Eksempel 4
Syntese af humant ACTH (H-1-39-OH) På lignende måder som i de foregående eksempler opbyggedes i ni trin H-27-39-OtBu, dvs. H-Ala-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser-Ala-Glu(OtBu)-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu(OtBu)-Phe-OtBu ud fra Z-Leu-Glu(OtBu)-Phe-OtBu ved omsætning med Z-Ser-Ala-Glu(OtBu)-Ala-Phe-Pro-OH til dannelse af Z-Ser-Ala-Glu(OtBu)-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu(OtBu)-Phe-OtBu (Z-31-39-OtBu), der derpå hydrogeneredes til H-Ser-Ala-Glu(OtBu)-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu(OtBu)-Phe-OtBu (H-31-39-OtBu), der videreomdannedes over Z-Glu(OtBu)-Ser-Ala-Glu(OtBu)-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu (OtBu) -Phe-OtBu (Z-30-39-OtBu), Η-Glu(OtBu)-Ser-Ala-Glu-(OtBu)-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu(OtBu)-Phe-OtBu (H-30-39-OtBu), Z-Asp-(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser-Ala-Glu(OtBu)-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu(OtBu)-Phe-OtBu (Z-29-39-OtBu), Η-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser-Ala-Glu(OtBu)-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu (OtBu) -Phe-OtBu (H-29-39-OtBu), Z-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser-Ala-Glu(OtBu)-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu(OtBu)-Phe-OtBu (Z-28-39-OtBu), og Z-Ala-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser-Ala-Glu (OtBu)-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu(OtBu)-Phe-OtBu (Z-27-39-OtBu).
Trin 10: Z-Asn-Gly-Ala-Glu(0tBu)-Asp(0tBu)-Glu(0tBu)--h Ser-Ala-Glu(OtBu)-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu(OtBu)-
Phe-OtBu. (Z-25-39-0tBu) 3,58 g (2,0 mmol) H-27-39-0tBu og 0,65 g (2,0 mmol) Z-Asn-Gly-OH (eksempel l) opløses i 30 ml tørt dimetyl formamid. Opløsningen afkøles til 0°C og der tilsættes 1,8 g (2,4 mmol) DCC-PFPOH-kompleks. Efter fire timers omrøring filtreres reaktionsblandingen i 300 ml æter og det udskilte bundfald frafiltreres og vaskes med æter. udbytte 3,7 g (88%) Z-25-39-0tBu med smeltepunkt 194°C (sønderdeling), R^2 =0,3.
17 U7944
Trin 11: H-Asn-Gly-Ala-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-S er-Ala-Glu(O tBu)-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu(01Bu)-Phe-OtBu, HC1. (H-25-39-0tBu, HCl) 3,92 g (1,87 mmol) Z-25-39-0tBu opløses i 400 ml 80%s eddikesyre og hydrogeneres i nærværelse af palladium på aktive kul. Efter reaktionens afslutning frafiltreres katalysatoren og filtratet inddampes til tørhed. Remanensen opløses i tørt dimetyl-formamid og til opløsningen sættes pyridin som indeholder 6-8 ækvivalenter saltsyre. Den olie der vindes efter afdestillering af opløsningsmidlet afbringes med vand på et filter og vaskes derefter med vand og til slut med ætylacetat. Udbytte 3,22 g (86,1%) H-25-39-0tBu, HCl med smeltepunkt 187°C (sønderdeling), R^3 = 0,31.
Trin 12: Z-Lys(B0C)-Lys(B0C)-Arg(N02)-Arg(N02)-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr(tBu)-Pro-Asn-Gly-Ala-Glu(0tBu)-Asp(0tBu)-Glu(0tBu)-Ser-Ala-Glu-(0 tBu)-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu(0 tBu)-Phe-OtBu. (Z-15-39-OtBu) 3,0 g (1,5 mmol) H-25-39-OtBu, HCl og 3,1 g (l,65 mmol) Z-Lys (BOC)-Lys (BOC)-Arg(N02)-Arg(N02)-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr(tBu)-Pro-OH (DK patentskrift nr. 124.329) opløses i 20 ml tørt dimetylformamid, hvorefter opløsningen afkøles til 0°C og der tilsættes 0,166 ml (1,5 mmol) N-metylmorfolin og derefter 1,4 g DCC-PPPOH-lcompleks. Reaktionsblandingen omrøres i 24 timer ved stuetemperatur og filtreres derefter i 400 ml æter. Det udskilte bundfald frafiltreres, suspenderes i acetone, omrøres og anbringes på et filter. Udbytte 5,15 g (90%) Z-15~39-OtBu med smeltepunkt 220°C (sønderdeling), R^2 = 0,2, R^ = 0,65.
1479U
18
Erin 13: Η-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Arg-Arg-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr(tBu)-Pro-Asn-Gly-Ala-Glu(OtBu)-Asp-(0 tBu)-Glu(0tBu)-S er-Ala-Glu(0 tBu)-A1a-phe-Pro-Leu-Glu(0tBu)-Phe-0tBu, 3 HC1.
(H-15-39-OtBu, 3 HCl) 5,0 g (1,31 mmol) Z-15-39-OtBu opløses i 100 ml 80%s eddikesyre, tilsættes 3 g aktiveret zinkstøv og reaktionsblandingen omrøres ved stuetemperatur. Reduktionen kontrolleres ved tyndlags-kromatografering. Efter reduktionens afslutning filtreres suspensionen, filtratet inddampes og remanensen gennemarbejdes med vand og filtreres derefter. Produktet opløses i 300 ml 80%s eddikesyre og Hydrogeneres i nærværelse af palladium på aktive kul. Efter reaktionens afslutning frafiltreres katalysatoren, opløsningen inddampes til tørhed og remanensen gennemarbejdes med æter og filtreres. Produktet opløses i 40 ml pyridin og under afkøling tilsættes der 10 ml pyridin som indeholder 1,5 ml koncentreret saltsyre. Den ved inddampning af opløsningen vundne remanensen gennemarbejdes med vand, filtreres og vaskes med vand. Udbytte 4,Og (85%) H-15-39-OtBu, 3 HCl med smeltepunkt 208°C (sønderdeling), R^ = 0,35.
Trin.14: H-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-
Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val- Tyr-Pr o- Asn-Gly- Al a-Glu-Asp-Glu-S er-Ala-Glu-Ala-Phe-Fro-Leu-Glu-Phe-OH. (H-l-39-0H) 3,6 g (1,0 mmol) H-15-39-OtBu, 3 HCl og 2,0 g (l mmol) BOC-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu(OtBu)-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-OH, HCl (dansk patentskrift nr. 124.329) opløses i 20 ml dimetylformamid hvorefter opløsningen afkøles til 0°C og der tilsættes 0,11 ml (l mmol) N-metylmorfolin samt 0,95 g DCC-PFPOH-kompleks. Reaktionsblandingen omrøres i 24 timer ved stuetemperatur og filtreres derefter i 200 ml æter. Det udskilte produkt (5,6 g med R^ = 0,55) frafiltreres og vaskes først med æter og derefter med vand. 1 g af det på denne måde vundne produkt opløses derefter i en blanding af 20 ml trifluoreddikesyre og 1 ml merkapto-ætanol. Opløsningen henstår i en time ved stuetemperatur og inddampes derefter i vakuum. Remanensen opløses i 20 ml vand og inddampes påny i vakuum. Inddampningsremanensen opløses i 10 ml vand 147944 19 og ved hjælp af ionbytterharpiks "Amberlite" ^ IRA 410 i acetatcyklus udbyttes trifluoracetationerne med acetationer. Opløsningen frysetørres og produktet renses på en kolonne fyldt med ionbytter af karboxymetylcellulose ved hjælp af puffergradienter fra 0,13 mol (pH 6,6) til 0,25 mol (pH 7).
De fraktioner som indeholder det ønskede stof .renses og frysetørres. Der vindes 0,6 g (60%) H-1-39-OH med = 0,25.
Aminosyreanalyse: Asp 1,9 (2); Ser 2,7 (3); Glu 4,7 (5); Pro 3,8 (4); Gly 3,0 (3); Ala 3,0 (3); Leu 1,0 (l); Val 2,9 (3);
Met 0,95 (1); Tyr 1,9 (2); Phe 3,0 (3); His 0,95 (l); Lys 3,8 (4); Arg 2,8 (3).
Claims (2)
1. Fremgangsmåde til fremstilling af biologisk aktive poly-peptider som indeholder asparaginylgrupper, navnlig asparagi-nylglycin-grupper ved trinvis sammenknytning af de tilsvarende beskyttede aminosyre- eller peptidkomponenter ved aktivester-metoden under anvendelse af dicyklohexylcarbodiimid som kondensationsmiddel og om ønsket påfølgende fraspaltning af beskyttelsesgrupperne samt om ønsket omdannelse til syreadditionssalte eller farmaceutisk anvendelige komplekser eller kondensater, hvorved i hvert trin enten acyleringskomponenten eller den komponent, der skal acyleres, indeholder mindst én aspara-ginylgruppe, kendetegnet ved at i hvert trin acyleringskomponentens karboxylgruppe i dimetylformamid og ved stuetemperatur eller derunder, hensigtsmæssigt ved en temperatur på ca. 0°C, aktiveres ved omdannelse til pentafluorfenyl-esteren, hvorefter acyleringsreaktionen ligeledes udføres i dimetylformamid ved stuetemperatur eller derunder under anvendelse af ækvimolære mængder af acyleringsmidlet og den komponent der skal acyleres.
2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved at der fremstilles humant kortikotropt hormon eller artsspecifikke fragmenter deraf med den almene formel Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro- I Asn-Gly-Ala-Glu-Asp-Glu-Q hvor Q betyder a) Ser-OH, b) Ser-Ala-OH, c) Ser-Ala-Glu-OH, d) Ser-Ala-Glu-Ala-OH, e) Ser-Ala-Glu-Ala-Phe-OH, £) Ser-Ala-Glu-Ala-Phe-Pro-OH, g) Ser-Ala-Glu.-Ala-Phe-Pro-Leu.-OH, h) Ser-Ala-Glu-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu-OH eller i) Ser-Ala-Glu-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu-Phe-OH,
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HURI000465 | 1972-05-15 | ||
| HURI465A HU166913B (da) | 1972-05-15 | 1972-05-15 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK147944B true DK147944B (da) | 1985-01-14 |
| DK147944C DK147944C (da) | 1985-08-26 |
Family
ID=11000888
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK257773A DK147944C (da) | 1972-05-15 | 1973-05-10 | Fremgangsmaade til fremstilling af biologisk aktive polypeptider som indeholder asparaginylgrupper |
Country Status (26)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US3953415A (da) |
| JP (1) | JPS5516417B2 (da) |
| AT (1) | AT351683B (da) |
| BE (1) | BE799552A (da) |
| BG (1) | BG20341A3 (da) |
| CA (1) | CA1027111A (da) |
| CH (1) | CH580064A5 (da) |
| CS (1) | CS173632B2 (da) |
| DD (1) | DD105603A5 (da) |
| DE (1) | DE2324239C3 (da) |
| DK (1) | DK147944C (da) |
| EG (1) | EG11309A (da) |
| ES (1) | ES414589A1 (da) |
| FI (1) | FI56830C (da) |
| FR (1) | FR2184814B1 (da) |
| GB (1) | GB1429251A (da) |
| HU (1) | HU166913B (da) |
| IL (1) | IL42108A (da) |
| NL (1) | NL176946C (da) |
| NO (1) | NO139268C (da) |
| PL (1) | PL91030B1 (da) |
| RO (1) | RO72336A (da) |
| SE (1) | SE421790B (da) |
| SU (1) | SU505352A3 (da) |
| YU (1) | YU36689B (da) |
| ZA (1) | ZA733242B (da) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2296427A1 (fr) * | 1974-12-31 | 1976-07-30 | Choay Sa | Agent peptidique de regulation de la glycemie |
| ZA883887B (en) * | 1987-06-10 | 1990-02-28 | Lilly Co Eli | Chromatographic purification process |
| US6031074A (en) * | 1989-08-25 | 2000-02-29 | National Institutes Of Health | Automated Peptide design and synthesis |
| JP2593495Y2 (ja) * | 1991-05-31 | 1999-04-12 | 矢崎総業株式会社 | 高圧抵抗電線の端部構造 |
| SE520392C2 (sv) * | 1996-09-27 | 2003-07-01 | Creative Peptides Sweden Ab C | Specifika peptider för behandling av diabetes mellitus |
| DE10054687A1 (de) * | 2000-11-03 | 2002-05-16 | N Zyme Biotec Gmbh | Inhibitoren von Transglutaminasen |
| CN116761809A (zh) | 2021-04-12 | 2023-09-15 | 南京汉欣医药科技有限公司 | 一种高纯的人促肾上腺皮质激素或其类似物及其规模化制备方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NL6509727A (da) * | 1965-07-28 | 1967-01-30 | ||
| NL6611701A (da) * | 1965-08-24 | 1967-02-27 |
-
1972
- 1972-05-15 HU HURI465A patent/HU166913B/hu unknown
-
1973
- 1973-03-28 CH CH444873A patent/CH580064A5/xx not_active IP Right Cessation
- 1973-04-09 AT AT306973A patent/AT351683B/de not_active IP Right Cessation
- 1973-04-12 BG BG23284A patent/BG20341A3/xx unknown
- 1973-04-26 IL IL42108A patent/IL42108A/xx unknown
- 1973-05-04 FI FI1434/73A patent/FI56830C/fi active
- 1973-05-08 DD DD170693A patent/DD105603A5/xx unknown
- 1973-05-09 ES ES414589A patent/ES414589A1/es not_active Expired
- 1973-05-10 RO RO7374737A patent/RO72336A/ro unknown
- 1973-05-10 DK DK257773A patent/DK147944C/da not_active IP Right Cessation
- 1973-05-10 SE SE7306619A patent/SE421790B/sv unknown
- 1973-05-11 JP JP5306373A patent/JPS5516417B2/ja not_active Expired
- 1973-05-11 CS CS3374A patent/CS173632B2/cs unknown
- 1973-05-14 US US05/360,198 patent/US3953415A/en not_active Expired - Lifetime
- 1973-05-14 DE DE2324239A patent/DE2324239C3/de not_active Expired
- 1973-05-14 NO NO1980/73A patent/NO139268C/no unknown
- 1973-05-14 EG EG178/73A patent/EG11309A/xx active
- 1973-05-14 ZA ZA733242A patent/ZA733242B/xx unknown
- 1973-05-14 GB GB2287973A patent/GB1429251A/en not_active Expired
- 1973-05-14 FR FR7317377A patent/FR2184814B1/fr not_active Expired
- 1973-05-14 CA CA171,220A patent/CA1027111A/en not_active Expired
- 1973-05-14 SU SU1924054A patent/SU505352A3/ru active
- 1973-05-15 YU YU1273/73A patent/YU36689B/xx unknown
- 1973-05-15 BE BE131126A patent/BE799552A/xx not_active IP Right Cessation
- 1973-05-15 PL PL1973162559A patent/PL91030B1/pl unknown
- 1973-05-15 NL NLAANVRAGE7306764,A patent/NL176946C/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US3929758A (en) | Cyclization of cysteine-containing peptides | |
| CA1241643A (en) | Peptides affecting the immune regulation and a process for their preparation | |
| Garsky et al. | Chemical synthesis of echistatin, a potent inhibitor of platelet aggregation from Echis carinatus: synthesis and biological activity of selected analogs. | |
| CA3017926C (en) | Methods for synthesizing .alpha.4.beta.7 peptide antagonists | |
| WO2017114191A9 (zh) | 索玛鲁肽的制备方法 | |
| SG175744A1 (en) | Method for the manufacture of degarelix | |
| CN106632604A (zh) | 一种Teixobactin类似物及其制备方法和应用 | |
| US4866039A (en) | Peptides containing the 18 to 23 residues of vasoactive intestinal peptide, and analogues | |
| DK154437B (da) | Fremgangsmaade til fremstilling af pentapeptidet h-arg-x-z-y-tyr-r ved oploesningssyntese | |
| DK147944B (da) | Fremgangsmaade til fremstilling af biologisk aktive polypeptider som indeholder asparaginylgrupper | |
| CN109096388A (zh) | 一种特立帕肽的制备方法 | |
| NO149998B (no) | Analogifremgangsmaate til fremstilling av peptider med ubiquitinlignende aktivitet | |
| Albericio et al. | Solid phase synthesis and HPLC purification of the protected 1-12 sequence of apamin for rapid synthesis of apamin analogues differing in the C-terminal region | |
| US4062746A (en) | Solid phase synthesis of protected peptides | |
| NO844123L (no) | Fremgangsmaate for fremstilling av nonapeptider og dodekopeptider | |
| Bodanszky et al. | 8-L-citrulline vasopressin and 8-L-citrulline oxytocin | |
| NO149843B (no) | Analogifremgangsmaate for fremstilling av peptider med tymopoietin-lignende aktivitet | |
| US5190921A (en) | Amino acids and peptides having a modified tyrosine residue, their preparation and their application as medicaments | |
| DE69312698T2 (de) | Trizyklische tachikinin-antagonisten, deren herstellung und diese enthaltende pharmazeutische präparate | |
| US4101721A (en) | Solid phase synthesis of protected peptides | |
| US4784988A (en) | Peptides correlated to lysozyme | |
| US4474765A (en) | Biologically active peptides | |
| Ohno et al. | Synthesis of the fully protected, carboxyl-terminal tetradecapeptide sequence of staphylococcal nuclease | |
| Hörig et al. | Structure-activity relationship of C-terminal hexa-and heptapeptide substance P antagonists as studied in the guinea-pig ileum | |
| AP546A (en) | Peptides for inhibiting pepsin release. |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PBP | Patent lapsed |