DE1493559B2 - Neue peptide mit adrenocorticotroper wirkung und verfahren zu ihrer herstellung - Google Patents

Description

Es ist bekannt, daß man die Peptidkette des ^-Corticotropins weitgehend ändern kann, insbesondere am Carboxylende, ohne daß die adrenocorticotrope Wirkung verloren geht. So bleibt z. B. die Aktivität, bezogen auf 1 mg Peptid, erhalten (etwa 100 I. E./mg), wenn man vom Carboxylende des natürlichen ACTH die Aminosäuren bis zur 20-Aminosäure abspaltet. Weitere Abspaltung führt zu zunehmendem Wirkungsverlust. So besitzt das /^-"-Corticotropin noch etwa 30% der ACTH-Aktivität/mg, das ^-"-Corticotropin etwa 1%/mg. Am Aminoende konnte ohne Beeinträchtigung der Aktivität die erste Aminosäure, Serin¹, durch Glycin ersetzt werden (D ix on, Biochem. J. 84, 462 [1962]). Andere, relativ geringfügige Änderungen bewirken ein Absinken der Aktivität. Nimmt man /3¹"²³-Corticotropin-23-amid, das etwa 100 I. E./ mg aufweist, als Vergleichssubstanz, so zeigt sich, daß das Entfernen der 1-Aminosäure, Serin¹, zu einem Rückgang der Aktivität auf die Hälfte führt; Ersatz

ίο der dritten Aminosäure, Serin³, durch Alanin, reduziert die Aktivität ebenfalls auf die Hälfte, während Ersatz der 2-Aminosäure, Tyrosin, durch Phenylalanin, die Aktivität auf ²I₃ herabsetzt (vgl. Z. Naturf. 19 b, S. 858 bis 860 [1964]). In keinem Fall konnte man bisher durch Abänderung der Sequenz des ACTH eine Steigerung der Aktivität, berechnet auf 1 mg Peptid, über diejenige des natürlichen ACTH hinaus erzielen.

Man hat auch schon in einem Bruchstück des ACTH, das keine ACTH-Aktivität, wohl aber MSH-Aktivität aufweist, nämlich in dem Pentapeptid der Aminosäuresequenz 6 bis 10 des Corticotropins, H-His-Phe-Arg-Try-Gly-OH, die natürlichen Aminosäuren L-Histidin, L-Phenylalanin, L-Arginin und L-Tryptophan durch die entsprechenden D-Aminosäuren ersetzt; das so erhaltene Pentapeptid zeigte keine MSH-Aktivität mehr (vgl. H a η ο et al., Biochim. Biophys. Acta 90, 201 [1964]).
Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß Peptide, die sich von ACTH-wirksamen Peptiden mit mindestens zum N-Terminus hin vollständiger ACTH-Sequenz, in der jedoch einzelne Aminosäuren unter Erhaltung der ACTH-Wirkung gegen andere natürliche α-Aminosäuren ausgetauscht sein können, nur dadurch unterscheiden, daß sie als erste Aminosäure eine Aminosäure mit D-Konfiguration aufweisen, eine höhere Aktivität aufweisen als die entsprechenden Peptide, die keine D-Aminosäure in N-terminaler 1-Stellung aufweisen. Sie sind außerdem von langer Wirkung.

Ein weiterer Vorteil der neuen Peptide ist, daß sie synthetisch billiger herstellbar sind als die Peptide mit i.-Serin als erster Aminosäure.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher ACTH-wirksame Peptide mit 16- bis 39-Aminosäuren und zum N-Terminus hin vollständiger Sequenz der natürlichen Corticotropine, in der jedoch eine oder mehrere der Aminosäuren in den Stellungen 1 bis 5, 17, 18 und 25 in bekannter Weise gegen andere L-a-Aminosäuren ausgetauscht sein können, und die als erste Aminosäure eine Aminosäure mit D-Konfiguration aufweisen, ihre C-terminalen Amide sowie Säureadditionssalze und Komplexe, insbesondere Metall-, wie Zinkkomplexe, der genannten Peptide und Verfahren zu ihrer Herstellung.

Die ACTH-aktiven Peptide oder Peptidamide, von denen sich die neuen Peptide durch die genannte Konfigurationsabänderung unterscheiden, sind insbesondere Peptide, welche die ersten 20- bis 25-Aminosäuren des ACTH-Moleküls enthalten. In diesen Peptiden können auch einzelne Aminosäuren der natürlichen Sequenz gegen andere ausgetauscht sein, sofern dadurch die ACTH-Wirkung im wesentlichen erhalten bleibt (vgl. z. B. Zeitschrift für Naturforschung, Bd. 19b [1964], S. 858 bis 860; irisches Patent 694/64 [Dervent Basic No. 13, 420]; schweizerisches Patent 4 41 363). So kann z. B. die zweite Aminosäure, Tyrosin, gegen Phenylalanin und/oder

die dritte Aminosäure, Serin, gegen Glycin und/oder die vierte Aminosäure, Methionin, gegen Norvalin, Leucin oder a-Aminobuttersäure und/oder die fünfte Aminosäure, Glutaminsäure, gegen Glutamin und/ oder die 17. und 18. Aminosäure, Arginin, gegen Ornithin oder Lysin ausgetauscht sein. Auch die erste Aminosäure, die erfindungsgemäß in der D-Konfiguration (bzw. als racemische D,L-Säure) vorliegt, kann die D-Form einer anderen natürlichen «-Aminosäure als Serin sein, vor allem z. B. D-Alanin, D-Prolin, D-Threonin. Von den neuen Peptiden sind diejenigen hervorzuheben, die 20- bis 25-Aminosäuren aufweisen, sich aber von der Sequenz der ersten 20- bis 25-Aminosäuren des ACTH dadurch unterscheiden, daß die erste Aminosäure D-Serin ist, ferner besonders diejenigen, in denen die erste Aminosäure D-Serin ist und ίη denen die Arginin^17a8-Reste durch Ornithinreste und/oder der Serin³-Rest durch Glycyl und/oder der Glutamyl⁵-Rest durch Glutaminyl ersetzt ist.

Als Säureadditionssalze sind besonders Salze von therapeutisch anwendbaren Säuren, wie Salzsäure, Essigsäure, vor allem aber schwerlösliche Salze, wie Sulfate, Phosphate oder Sulfonate, zu nennen.

Unter Komplexen sind die komplexartigen, in ihrer Struktur noch nicht abgeklärten Verbindungen zu verstehen, die beim Zusatz gewisser anorganischer oder organischer Stoffe zu adrenocorticotrop wirksamen Peptiden entstehen und vor allem diejenigen, die ihnen eine verlängerte Wirkung verleihen. Solche anorganischen Stoffe sind Verbindungen, die sich von Metallen, wie Calcium, Magnesium, Aluminium, Cobalt und insbesondere von Zink, ableiten, vor allem schwerlösliche Salze, wie Phosphate und Pyrophosphate sowie Hydroxyde dieser Metalle. Organische Stoffe, die eine Verlängerung der Wirkung hervorrufen, sind beispielsweise nicht antigene Gelatine, z. B. Oxypolygelatine, Polyvinylpyrrolidon und Carboxymethylcellulose, ferner Sulfonsäure- oder Phosphorsäureester von Alginsäure, Dextrin, Polyphenolen und Polyalkoholen, vor allem Polyphloretinphosphat und Phytinsäure, sowie Polymerisate und Copolymerisate von Aminosäuren, z. B. Protamin und insbesondere von Aminosäuren, die einen überwiegenden Anteil an sauren α-Aminosäuren, wie Glutaminsäure oder Asparaginsäure, aufweisen.

Die neuen Verbindungen besitzen, wie bereits erwähnt, eine wesentlich stärkere ACTH-Aktivität als die entsprechenden Verbindungen mit L-Konfiguration in der ersten Aminosäure. Sie sollen dementsprechend in der Human- und Veterinärmedizin verwendet verden, z. B. an Stelle des natürlichen Hormons. Wegen ihrer starken und verlängerten ACTH-Wirkung ;ind besonders D-Ser^-^-Corticotropin, D-Ser¹,-Orn¹⁷· "-^-««-Corticotropin und D-SerSGly³-/?¹"²⁴-Corticotropin hervorzuheben. Auch das AIa¹-/?¹"²⁴-Corticotropin zeichnet sich durch eine besonders starke Wirkung aus.

Die neuen Peptide werden nach den für die Herstellung von Peptiden mit großer Kettenlänge bekannten Methoden hergestellt unter Verwendung einer >Aminosäure als N-terminaler Aminosäure. Dabei verden die Aminosäuren in der erwähnten Reihenfolge einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptid-■inheiten verknüpft. Beispielsweise kann man eines !er Aminosäure- bzw. Peptidmoleküle in Form eines isters mit einem weiteren Aminosäure- bzw. Peptidnolekül, das eine geschützte Aminogruppe enthält, in Jegenwart eines Kondensationsmittels, wie eines Carbodiimids oder eines Phosphorig-säureesterhalogenids, verknüpfen, oder man kann mit dem Aminosäure- bzw. Peptidester mit freier Aminogruppe eine Aminosäure bzw. ein Peptid mit aktivierter Carboxylgruppe (und geschützter Aminogruppe), z. B. ein Säurehalogenid, -azid, -anhydrid, -imidazolid, -isoxazolid, z. B. aus N-Äthyl-S-phenyl-isoxazolium-S'-sulfonat (s. Wo ο d w a r d et al., J. Am. Chem. Soc. 89, 1011 [1961]), oder einen aktivierten Ester, wie Cyanmethylester, Carboxymethylthiolester oder Nitrophenylester, umsetzen. Umgekehrt kann auch eine Aminosäure bzw. ein Peptid mit freier Carboxylgruppe (und geschützter Aminogruppe) mit einer Aminosäure bzw. einem Peptid mit aktivierter Aminogruppe (und geschützter Carboxylgruppe), z. B. einem Phosphitamid, zur Reaktion gebracht werden.

An der Reaktion nicht beteiligte, freie, funktioneile Gruppen werden zweckmäßigerweise geschützt, insbesondere mittels durch Hydrolyse oder Reduktion leicht abspaltbarer Reste, die Carboxylgruppe vorzugsweise durch Veresterung, z. B. mit Methanol, tert.-Butanol, Benzylalkohol, p-Nitrobenzylalkohol, oder Amidbildung, die Aminogruppe beispielsweise durch Einführung der Tosyl-, Trityl-, Formyl-, Trifluoracetyl-, Phthalyl- oder Carbobenzoxygruppe oder farbiger Schutzgruppen, wie der p-Phenylazo-benzyloxycarbonylgruppe und der p-(p'-Methoxy-phenylazo)-benzyloxycarbonylgruppe, oder insbesondere des tert.-Butyloxycarbonylrestes. Zum Schutz der Aminogruppe in der Guanidogruppierung des Arginins ist die Nitrogruppe geeignet; die genannte Aminogruppe des Arginins muß aber bei der Reaktion nicht notwendig geschützt werden. Die Iminogruppe des Histidins kann durch den Benzyl- oder Tritylrest geschützt werden.

Die Umwandlung einer geschützten Amino- oder Iminogruppe in eine freie Gruppe sowie die Überführung einer funktionell abgewandelten Carboxylgruppe in eine freie Carboxylgruppe im Verlaufe des Verfahrens erfolgt nach an sich bekannten Methoden durch Behandlung mit hydrolysierenden bzw. reduzierenden Mitteln.

Ein bevorzugtes Verfahren besteht darin, daß man das die ersten 3 Aminosäuren, z. B. H-D-Ser-Tyr-Ser-OH enthaltende Tripeptid (die abgekürzte Schreibweise bezieht sich auf L-Aminosäuren, wenn das D nicht besonders bezeichnet ist), oder das außerdem die 4-Aminosäure enthaltende Tetrapeptid mit dem Heptapeptid bzw. Hexapeptid der folgenden Aminosäuren bis zur Aminosäure 10 kondensiert, vorzugsweise nach der Azidmethode, und dann das Dekapeptid mit der ganzen restlichen Peptidsequenz, also z. B. bei Herstellung des Hexadekapeptids mit dem Hexapeptid der Aminosäuren 11 bis 16, beim Nonadekapeptid mit dem Nonapeptid der Aminosäuren 11 bis 19, beim Eicosapeptid mit dem Dekapeptid der Aminosäuren 11 bis 20, beim Heneicosapeptid mit dem Undekapeptid der Aminosäuren 11 bis 21, beim Docosapeptid mit dem Dodekapeptid der Aminosäuren 11 bis 22, beim Tricosapeptid mit dem Tridekapeptid der Aminosäuren 11 bis 23, beim Tetracosapeptid mit dem Tetradekapeptid der Aminosäuren 11 bis 24, beim Pentacosapeptid mit dem Pentadekapeptid der Aminosäuren 11 bis 25, beim Oktacosapeptid mit dem Oktadekapeptid der Aminosäuren 11 bis 28, beim

Nonatriacontapeptid mit dem Nonacosapeptid der Aminosäuren 11 bis 39 oder den entsprechenden Peptiden mit gegenüber der natürlichen ACTH-Sequenz bezüglich der Natur einzelner Aminosäurebausteine

abgeänderter Konstitution kondensiert. Bei dieser Kondensation wird als Kupplungsmethode vorzugsweise die Carbodiimidmethode oder die Methode der aktivierten Ester, vor allem mittels des p-Nitrophenylesters, verwendet. Im letzten Fall braucht der p-Nitrophenylester des Dekapeptids nicht als solcher isoliert zu werden, sondern kann auch in der Kondensationsstufe selbst aus dem Dekapeptid mit freier Carboxylgruppe, p-Nitrophenol und Dicyclohexylcarbodiimid gebildet werden. Das Dekapeptid liegt also als a-Amino-geschütztes Peptid mit freier Carboxylgruppe oder mit einer p-Nitrophenylestergruppe vor. Die a-Aminogruppe des Dekapeptids wird vorzugsweise durch die tert.-Butyloxycarbonylgruppe geschützt. In dem Peptidbruchstück, das mit dem Dekapeptid kondensiert wird, liegt die Endcarboxylgruppe vorzugsweise in Form der tert.-Butylestergruppe oder als Amidgruppe vor. Die in den zu kondensierenden Peptidbruchstücken vorhandenen Seitenketten-Aminogruppen werden vorzugsweise durch die tert.-Butyloxycarbonylgruppe, die Seitenkettencarboxylgruppen durch die tert.-Butylestergruppe geschützt. Diese Schutzgruppen können in der letzten Stufe mit Trifluoressigsäure abgespalten werden.

Nach einem weiteren bevorzugten Verfahren wird das die ersten 4-Aminosäuren enthaltende Tetrapeptid, vor allem H-D-Ser-Tyr-Ser-Met-OH, mit der ganzen restlichen Peptidsequenz, also z. B. bei Herstellung des Nonadekapeptids mit dem Pentadekapeptid der Aminosäuren 5 bis 19, beim Eicosapeptid mit dem Hexadekapeptid 5 bis 20, beim Heneicosapeptid mit dem Heptadekapeptid der Aminosäuren 5 bis 21, beim Docosapeptid mit dem Octadekapeptid der Aminosäuren 5 bis 22, beim Tricosapeptid mit dem Nonadekapeptid der Aminosäuren 5 bis 23, beim Tetracosapeptid mit dem Eicosapeptid der Aminosäuren 5 bis 24, beim Pentacosapeptid mit dem Heneicosapeptid der Aminosäuren 5 bis 25, usw. oder den entsprechenden in der Sequenz bezüglich der Natur einzelner Aminosäuren abgeänderten Peptiden kondensiert. Bei dieser Kondensation wird als Kupplungsmethode vorzugsweise die Azidmethode verwendet. Die a-Aminogruppe des Tetrapeptidhydrazids bzw. -azids wird vorzugsweise durch die tert.-Butyloxycarbonylgruppe geschützt. Das Peptid, das mit dem Tetrapeptid kondensiert wird, kann als freies Peptid oder als Ester, insbesondere tert.-Butylester, oder als ω-Amid vorliegen. In diesem Peptid werden die Seitenketten-Aminogruppen vorzugsweise durch die tert.-Butyloxycarbonylgruppe, Seitenketten-Carboxylgruppen durch die tert.-Butylestergruppe geschützt.

Nachdem man durch Kondensation der Peptidbruchstücke das Gesamtpeptid (Hexadekapeptid, Heptadekapeptid usw. bis zum Nonatriacontapeptid), dessen a-Aminogruppe und Seitenketten-Aminogruppen durch die tert.-Butyloxycarbonylgruppe und dessen Endcarboxylgruppe und Seitenketten-Carboxylgruppen durch die tert.-Butylestergruppe geschützt sind, erhalten hat, können alle diese Schutzgruppen gleichzeitig durch saure Hydrolyse, beispielsweise mit Trifiuoressigsäure, abgespalten werden. Liegt die Endcarboxylgruppe nicht als tert.-Butylestergruppe, sondern als Amidgruppe vor, so werden Peptidamide erhalten. Peptidhydrazide erhält man beispielsweise, wenn man ein Peptid mit endständiger Niederalkylestergruppe mit Hydrazinhydrat behandelt.

Je nach der Arbeitsweise erhält man die neuen Verbindungen in Form von Basen oder ihren Salzen. Aus den Salzen können in an sich bekannter Weise die Basen gewonnen werden. Von letzteren wiederum lassen sich durch Umsetzung mit Säuren, die zur Bildung therapeutisch verwendbarer Salze geeignet sind, Salze gewinnen, wie z. B. solche mit anorganischen Säuren, wie Halogenwasserstoffsäuren, beispielsweise Salzsäure oder Bromwasserstoffsäure, Perchlorsäure, Salpetersäure oder Thiocyansäure, Schwefel- oder Phosphorsäuren, oder organischen Säuren, wie Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Glykolsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Oxalsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Äpfelsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Ascorbinsäure, Hydroxymaleinsäure, Dihydroxymaleinsäure, Benzoesäure, Phenylessigsäure, 4-Aminobenzoesäure, 4-Hydroxybenzoesäure, Anthranilsäure, Zimtsäure, Mandelsäure, Salicylsäure, 4-Amino-saiicylsäure, 2-Phenoxybenzoesäure, 2-Acetoxybenzosäure, Methansulfonsäure, Äthansulfonsäure, Hydroxyäthansulfonsäure, Benzolsulfonsäure, p-Toluolsulfonsäure, Naphthalinsulfonsäure oder Sulfanilsäure.

Die verfahrensgemäß erhaltenen Peptide können in Form von pharmazeutischen Präparaten Verwendung finden. Diese enthalten die Peptide in Mischung mit einem für die enterale oder parenteral Applikation geeigneten pharmazeutischen, organischen oder anorganischen Trägermaterial. Für dasselbe kommen solche Stoffe in Frage, die mit den Polypeptiden nicht reagieren, wie z. B. Gelatine, Milchzucker, Glukose, Kochsalz, Stärke, Magnesiumstearat, Talk, pflanzliche Öle, Benzylalkohol, Gummi, Polyalkylenglykole, Vaseline, Cholesterin oder andere bekannte Arzneimittelträger. Die pharmazeutischen Präparate können z. B. als Lyophilisat oder in flüssiger Form als Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen vorliegen. Gegebenenfalls sind sie sterilisiert und bzw. oder enthalten Hilfsstoffe, wie Konservierungs-, Stabilisierungs-, Netz- oder Emulgiermittel. Sie können auch noch andere therapeutisch wertvolle Stoffe enthalten.

So kann man sie beispielsweise auch mit den in der ACTH-Therapie üblichen Zusätzen zur Verlängerung der Wirkung, wie z. B. Oxypolygelatine, Polyphloretinphosphat, Carboxymethylcellulose, oder den obenerwähnten schwerlöslichen Metallverbindungen, insbesondere Phosphaten, Pyrophosphaten oder Hydroxyden des Zinks, kombinieren.

Weiter kann man zur Verlängerung der Wirksamkeit die neuen Peptide in ihre Komplexe mit Polymerisaten oder Copolymerisaten von Aminosäuren, insbesondere solchen, die einen überwiegenden Anteil an sauren α-Aminosäuren, wie Glutaminsäure oder Asparaginsäure der L-, D- oder D,L-Konfiguration, aufweisen, überführen. Die genannten Polymerisate und Copolymerisate \veisen in den Seitenketten freie Carboxylgruppen auf, während die terminale Carboxylgruppe frei oder funktionell abgewandelt sein, z. B. als Estergruppe oder als eine unsubstituierte oder durch Kohlenwasserstoffreste, vor allem niedere Alkylgruppen, substituierte Amidgruppe vorliegen kann. Das MoIekulargewicht der Polymerisate kann zwischen 1000 und 100 000 liegen, vorzugsweise beträgt es 2000 bis 15 000. Man verwendet für die Herstellung der Präparate zweckmäßig ein wasserlösliches, physiologisch verträgliches Salz, z. B. das Natrium- oder Ammoniumsalz, oder ein Salz mit einer organischen Base, wie Triäthylamin, Procain, Dibenzylamin, oder anderen tertiären Stickstoffbasen.
Die Polymeren sind bekannt oder können nach be-

kannten Verfahren hergestellt werden, beispielsweise nach dem von M. 1 d e 1 s ο η et al., J. Am. Chem. Soc. 80, 4631 et seq. (1958), beschriebenen Verfahren. So kann man z. B. Glutaminsäure-a-carboxyanhydridy-benzylester oder -tert.-butylester in Dioxan mit Ammoniak oder einem Amin in einem bestimmten Molverhältnis, z. B. 100:1 (je nach dem gewünschten Polymerisationsgrad), reagieren lassen und nach beendeter Polymerisation die Schutzgruppen abspalten, z. B. die Benzyloxygruppe mit Bromwasserstoff in Eisessig, die tert.-Butyloxygruppe mit Trifluoressigsäure. Zwecks Herstellung von Polymeren mit einheitlicher, definierter Kettenlänge kann man die Polymeren auch durch Synthese nach den in der Peptidchemie bekannten Verfahren (Carbodiimidmethode, Azidmethode usw.) aufbauen.

Die Konzentration des Polymeren in den pharmazeutischen Präparaten hängt von der Löslichkeit des betreffenden Salzes und von der Viskosität ab. Das Polymere soll in den Präparaten in gelöster Form vorliegen können und injizierbar sein.

Die Konzentration des adrenocorticotrop wirksamen Peptids wird so gewählt, daß das Präparat beispielsweise pro ml 10 bis 50 I. E. aufweist.

Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen beschrieben. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben.

Die dünnschichtchromatographischen Systeme werden wie folgt bezeichnet:

System 43A: tert.-Amylalkohol-Isopropanol-Wasser

(100 : 40 :10)
System 43C: tert.-Amylalkohol-Isopropanol-Wasser

(100 : 40 : 55)

System 52: n-Butanol-Eisessig-Wasser (100:10 : 30) System 100: Äthylacetat-Pyridin-Eisessig-Wasser

(62: 21: 6 :11)
System 101: n-Butanol-Pyridin-Eisessig-Wasser

(30: 20 : 6 : 24)
System 102: Essigester-Methyläthylketon-Ameisen-

säure-Wasser (50: 30 :10: 10) System 110: Essigester-n-Butanol-Pyridin-Eisessig-

Wasser (80 : 40 : 40 :12 :19) Folgende Abkürzungen werden verwendet: Z = Carbobenzoxy,
BOC = tert.-Butyloxycarbonyl,
tBu = tert.-Butyl.

Beispiel 1 1. tert.-Butyloxycarbonyl-D-serin-hydrat

10,5 g (0,1 Mol) D-Serin werden in 50 ml 2n-Natronlauge gelöst und mit einer Lösung von 15,7 g (0,11 Mol) tert.-Butyloxycarbonylazid in 50 ml Methanol versetzt. Anschließend werden 11,1 g(0,ll Mol) Triäthylamin in 100 ml Methanol unter Rühren bei 40° innerhalb 4 Stunden zugetropft. Nach weiterem Rühren während 2 Stunden bei 40° und über Nacht bei Zimmertemperatur wird die Reaktionslösung durch Zugabe von 2n-Salzsäure auf pH 6 bis 7 gestellt und darauf im Vakuum bei 30° von Methanol befreit. Die wäßrige Lösung wird mit Essigester überschichtet und bei 0° unter Rühren mit konzentrierter Salzsäure auf pH 1 bis 2 gestellt. Die Essigesterphase wird rasch abgetrennt, mehrmals mit gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen, getrocknet und im Vakuum eingedampft/ Das erhaltene öl (19,8 g) kristallisiert als Monohydrat beim Verreiben mit wenig Wasser bei 0°:

15,95 g (71 %), F. 50 bis 52°. Nach Umkristallisieren aus wenig Wasser: F. unverändert; [α]? = +9,1 ±1° (c = 1,1 in Wasser). Die Substanz ist gemäß Dünnschichtchromatogramm einheitlich: Rf 43 = 0,31; Rf 100 = 0,65.

2. tert.-Butyloxycarbonyl-D-seryl-L-tryosyl-

L-seryl-L-methionin-methylester

8,26 g (20 mMol) L-Tyrosyl-L-seryl-L-methionin-methylester werden unter Erwärmen auf 70° in einem Gemisch von 150 ml Acetonitril und 10 ml Dimethylformamid gelöst und nach Kühlen auf Zimmertemperatur mit 4,46 g (20 mMol) tert.-Butyloxycarbonyl-D-serin versetzt. Die Lösung wird auf —5° gekühlt, unter Rühren mit einer Lösung von 4,53 g (22 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid in 10 ml Acetonitril versetzt und 1 Stunde bei —5° und über Nacht bei 0° gerührt. Nach Zugabe von 0,15 ml Eisessig wird das Reaktionsgemisch weitere 30 Minuten bei 0° gerührt, der ausgeschiedene Dicyclohexylharnstoff abfiltriert und das Filtrat bei 0,1 mm Hg eingedampft. Der Rückstand wird in Essigester aufgenommen, die Lösung bei 0° mit 1 η-Salzsäure, ln-Natriumbicarbonat und Wasser gewaschen, getrocknet und im Vakuum eingedampft. Der Rückstand verfestigt sich beim Verreiben mit Äther; nach Umkristallisieren aus Methanol-Äther: 9,1g (76%), F. 152 bis 155°; [<x]f = — 7,0 ± 1° (c = 0,9 in Methanol). Die Substanz zeigt im Dünnschichtchromatogramm folgende Rf-Werte: R_f = 0,29 in Chloroform + Methanol (9:1); R_f 43 =0,78; J?/100 =0,85.

3. tert.-Butyloxycarbonyl-D-seryl-L-tyrosyl-

L-seryl-L-methionin-hydrazid

Eine Lösung von 12 g (20 mMol) tert.-Butyloxycarbonyl-D-seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionin-methylester in 50 ml Methanol wird mit 5 ml (0,1 Mol) Hydrazinhydrat versetzt und bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Nach 3 Stunden wird das ausgeschiedene kristalline Hydrazid abfiltriert und mit Wasser und Äthanol gewaschen: 9,82 g (82%), F. 148 bis 152°; umkristallisiert aus Methanol: F. 150 bis 153°; [<x]f = —6,3 ± 1° (c = 1 in Methanol). Die Substanz ist gemäß Dünnschichtchromatogramm einheitlich:

R_f43 = 0,65; R_f52 = 0,57; A/100 = 0,51.

4. tert.-Butyloxycarbonyl-D-seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-(y-tert.-butyl)-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin

1,43 g (2,4 mMol) tert.-Butyloxycarbonyl-D-seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionin-hydrazid werden bei —10° in 15 ml Dimethylformamid aufgeschlämmt und bei dieser Temperatur mit 1,58 ml eiskalter 6n-Salzsäure versetzt. Hierauf tropft man bei —8° 0,5 ml eiskalte 5n-Natriumnitritlösung dazu und läßt 25 Minuten bei —5 bis —8° reagieren. Gleichzeitig werden 1,65 g y-tert.-Butyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin (1,9 mMol) (s. Anmeldung G. Nr. 5828/61 — Case 4556/1+2), in 5 ml warmem Dimethylformamid gelöst, auf —10⁰C gekühlt und mit 1,85 ml Triäthylamin versetzt. Bei —15° trägt man die eiskalte Lösung des BOC-Tetrapeptidazids ein, rührt noch 1 Stunde bei —10° und läßt über Nacht bei 0° weiterreagieren. Aus der Reaktionslösung scheidet sich wenig anorganisches Salz aus. Dieses wird durch Filtration abgetrennt und die resultierende Lösung am Hochvakuum auf ein kleines

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Volumen eingeengt. Das rohe amorphe BOC-Dekapeptid wird mit 100 ml 2n-Ammoniumhydroxydlösung ausgefällt, abgenutscht und mit Wasser neutral gewaschen. Nach dem Trocknen erhält man 1,88 g rohes Dekapeptidderivat. Die Kristallisation aus 50 ml 90%igem Methanol gibt 1,2 g reines BOC-Dekapeptid. F. 208° (Zersetzung). Die Dünnschichtchromatogramme auf Silicagel in den Systemen 52 und 101 zeigen nur je einen Fleck mit Pauly-Ehrlich- und Reindel-Hoppe-Reagens. R_f52 — 0,2 und Ä/101 = 0,6. [a]ö = -16 ± 1° (c = 0,9 in 50%igem Pyridin).

5. tert.-Butyloxycarbonyl-D-seryl-L-tyrosyl-

L-seryl-L-methionyl-(y-tert.-butyl)-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalkyl-L-arginyl-L-tryptophyl- glycyl-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-

tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl- L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin-tert.-butylester

Unter Stickstoff werden 0,725 g tert.-Butyloxycarbonyl-D-seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-(y-tert.-butyl)-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin (0,5 mMol) und 1,11 g (0,5 mMol) e-tert.-Butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-tert.-butyloxycarbonyl-L-Iysyl-L-arginyl-L-arginyl-L-proIyl-L-valyl-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolintert.-butylester-trihydrochlorid in 5 ml 90%igem Pyridin während 1 Stunde bei 50° gerührt, dann gibt man 175 mg (0,85 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid dazu und nach 5 Stunden nochmals die gleiche Menge Carbodiimid. Man läßt 24 Stunden bei der erwähnten Temperatur reagieren, filtriert vom abgeschiedenen Dicyclohexylharnstoff ab (161 mg) und fällt das rohe Reaktionsprodukt mit viel Essigester aus (1,77 g). Das Hydrochlorid wird an einem Ionenaustauscher Amberlite IR-4B (Acetatform) (0 16 mm, h = 27 cm) in das Triacetat übergeführt. Zur Reinigung wird die gesamte Menge des geschützten Tetracosapeptidesters in 50% tert.-Butanol an einer Carboxymethylcellulosesäule (0 16 mm, h — 17 cm) mittels 50%igem tert.-Butanol, enthaltend steigende Konzentrationen von 2n-Essigsäure, chromatographiert. Neben Randfraktionen läßt sich der reine geschützte Tetracosapeptidester mittels 50 %igem tert.-Butanol und 2 n-Essigsäure (96 : 4) eluieren. Ausbeute: 740 mg.

Im Dünnschichtchromatogramm zeigt diese Fraktion im System 101 nur einen Fleck mit Pauly-, Reindel-Hoppe- oder Ninhydrin-Reagens, Rf — 0,6. [<x]_D = 49 ± 2° (c = 0,62 in Methanol).

UV.-Spektrum in 0,1 η-Natronlauge in Methanol: Xmax 283 ιημ, ε = 8600 und X_max 289 ΐημ, e = 8950.

Verhältnis -2g. == 1,9.

6. D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl- glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-

L-tyrosyl-L-proIin-hexaacetat

500 mg geschützter Tetracosapeptid-tert.-butylester werden mit 5,5 ml 90%iger Trifluoressigsäure während 30 Minuten bei Zimmertemperatur gespalten. Das Trifluoracetat wird mit viel peroxydfreiem Äther ausgefällt, abfiltriert mit viel Äther und zum Schluß mit Petroläther gewaschen. Der amorphe Rückstand wird in Wasser gelöst und das Trifluoracetat ins Acetat an einer lonenaustauschersäule von Amberlite IR-45 übergeführt. Ausbeute: 450 mg dünnschichtchromatographisch reines Tetracosapeptid

Ä/101 = 0,5 (an Aluminiumoxyd). [a]_D = -85 ±1,5° (c = 0,62 in 1 %iger Essigsäure).

UV.-Spektrum in Ο,ΐη-Natronlauge: λ,_ηαχ 283 πιμ, ε = 8300 und 288 πιμ, ε = 8600.

ίο Das Peptid läßt sich nicht mit Leucinaminopeptidase spalten. Im Saffran- und Sayerstest zeigt es eine hohe adrenocorticotrope Wirkung. Es besitzt auch gegenüber den L-Seryl-Analogen eine verlängerte Wirkungsdauer. Die ACTH-Aktivität, gemessen im Sayerstest (Endocrinology 42, 379 [1948]) beträgt 750 internationale Einheiten (IE) pro mg; die entsprechende L-Seryl¹-Verbindung /^-"-Corticotropin (Synacthen®) weist in diesem Test etwa 100 ΙΕ/mg auf.

B e i s ρ i e 1 2

1. BOC-D-Alanin

5 g (56,2 mMol) D-Alanin in 30 ml Wasser werden mit 3,2 g (39 mMol) Magnesiumoxyd und einer Lösung von 12,4 ml (90 mMol) tert.-Butyloxycarbonyl-azid in 30 ml Dioxan versetzt und 16 Stunden unter gutem Rühren bei 45° reagieren gelassen. Man versetzt das Reaktionsgemisch mit 30 ml Wasser, filtriert vom unlöslichen Produkt ab und dampft das Filtrat im Vakuum auf ein kleines Volumen ein. Hierauf extrahiert man die konzentrierte Lösung zweimal mit Essigester, wäscht die organischen Phasen mit Natriumbicarbonat und Wasser und kühlt die vereinigten wäßrigen Lösungen auf 0° ab. Mit 10%iger Zitronensäurelösung stellt man die Lösung auf pH 4 und extrahiert das BOC-Alanin mit viel Essigester. Die Essigesterphasen werden mit gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abgedampft. Ausbeute: 4,5 g; F. 83 bis 84°. [«]» = +25 ±0,3° (c = 2,65 in Methanol). Die Verbindung weist im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel folgende Rf-Werte auf:

Rf m 0,35

Rf(IQl) 0,75

2. BOC-D-Ala-Tyr-Ser-Met-OCHa

Man löst 3 g (7,2 mMol) H-Tyr-Ser-Met-OCH₃ im Gemisch von 2,7 ml Dimethylformamid und 50 ml Acetonitril, gibt 1,37 g (7,2 mMol) BOC-D-Alanin dazu und versetzt bei —5° mit 1,65 g (7,9 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid. Unter Rühren läßt man 2 Stunden bei —5° und anschließend 13 Stunden bei 0° stehen. Neben dem Dicyclohexylharnstoff fällt ebenfalls der BOC-Tetrapeptidester aus der Reaktionslösung aus. Der Niederschlag wird abfiltriert und noch feucht dreimal mit je 7,5 ml warmem Dimethylformamid digeriert, das Lösungsmittel im Hochvakuum verdampft und der Rückstand aus Methanol kristallisiert. Ausbeute: 2,01 g geschützter Tetrapeptidmethylester; F. 186 bis 187°. [<x]f = -2 ± 1° (c = 1,05 in Methanol). Die Verbindung weist im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel folgende Rf-Werte auf:

Rf (43) 0,7

Rf (Chloroform-Methanol 9:1) 0,4

Sie zeigt eine positive Reaktion mit Javelle-Reindel-Hoppe-Reagenz, Pauly-Reagenz und Kaliumjodplatinat.

3. BOC-D-Ala-Tyr-Ser-Met-NH-NH,

Man löst 1,7 g (2,9 mMol) BOC-Tetrapeptidester heiß in 12 ml Methanol, kühlt die Lösung auf Zimmertemperatur und rührt sie mit 0,73 ml Hydrazinhydrat 16 Stunden bei Zimmertemperatur. Dabei fällt das Hydrazid als dicker weißer Niederschlag aus. Nach dem Verdünnen mit 12 ml Wasser rührt man noch 1 Stunde weiter, kühlt im Eisbad ab und filtriert den zum Teil kristallinen Niederschlag ab, wäscht ihn gut mit Wasser und trocknet ihn im Hochvakuum über Phosphorpentoxyd und Schwefelsäure. Ausbeute: 1,42 g geschütztes Tetrapeptidhydrazid; F. 176 bis 177°. [x]f = +16 ± 1° (c = 1,03 in Eisessig). Die Verbindung weist im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel folgende R_f-Werte auf:

Rf(IOO) 0,65

Rf (Chloroform-Methanol 9:1) 0,2

Es reagiert positiv auf Javelle-Reindel-Hoppe-Reagenz, Pauly-Reagenz und Kaliumjodplatinat.

4. BOC-D-Ala-Tyr-Ser-Met-Glu(OtBu)-His-Phe-Arg-Try-Gly-OH

Das Dekapeptidderivat wird wie im Beispiel 1 unter 4. beschrieben aus 1,32 g BOC-D-Ala-Tyr-Ser-Methydrazid und 1,61 g H-Glu(OtBu)-His-Phe-Arg-Try-GIy-OH hergestellt. Ausbeute: 1,9 g rohes BOC-Dekapeptid. Die Kristallisation aus 90%igem Methanol ergibt 700 mg kristallisiertes Peptidderivat vom F. 206° (Zersetzung) neben 720 mg ungelöstem amorphem Produkt, F. 210°. Gemäß Dünnschichtchromatogramm an Silicagel (System 52 und 101) sind die beiden Fraktionen rein und untereinander identisch.

(101)

0,75
0,25

[«]? = -8 ± 1° (c = 1,06 in 50%igem Pyridin).

5. BOC-D-Ala-Tyr-Ser-Met-Glu(OtBu)-His-Phe-

Arg-Try-Gly-LysiBOO-Pro-Val-Gly-LysiBOC)-

Lys(BOC)-Arg-Arg-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-

Tyr-Pro-OtBu

370 mg (0,25 mMol) BOC-D-Ala-Tyr-Ser-Met-Glu(OtBu)-His-Phe-Arg-Try-Gly-OH und 555 mg H-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Arg-Arg-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr-Pro-OtBu werden unter Stickstoff in 5 ml 80 %igem Pyridin während L Stunde bei 45° gerührt, dann mit 80 mg Dicyclohexylcarbodiimid versetzt und nach weiteren 5 Stunden nochmals mit 80 mg Dicyclohexylcarbodiimid. Man läßt 20 Stunden bei 45° reagieren, kühlt auf Zimmertemperatur ab, filtriert den ausgeschiedenen Dicycloaexylharnstoff ab und fällt das rohe Reaktionsprodukt mit viel Essigester aus. Ausbeute: 880 mg roher noch mit Ausgangsmaterial verunreinigter geschützter Teiracosapeptidester. Die Reinigung erfolgt mittels Gegenstromverteilung nach Craig im System Chloroform - Tetrachlorkohlenstoff - Methanol - Puffer (5:2:8:4) (Puffer = 28,5 ml Eisessig + 19,25 g Na-'.riumacetat auf 1 Liter Wasser) über 550 Stufen.

Aus den Elementen 69 bis 90 erhält man 400 mg meinen geschützten D-Ala¹/3¹-^2l-Corticotropin-tert.-bu- :ylester. [λ]? = -48 ± 2° (c = 0,52 in Methanol). Die Verbindung zeigt im UV.-Spektrum in 0,ln-methanolischer Natronlauge Maxima bei λ = 283 ΐημ (ε = 9300); λ = 289 τημ. (ε = 9600).

6. D-Ala-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-
Val-Tyr-Pro-OH, 6 · CH₃ · COOH
(D-Ala^-^-Corticotropin)

Das reine geschützte 24er-Peptidderivat wird unter ίο den gleichen Bedingungen wie im Beispiel 1 beschrieben mittels 90%iger Trifluoressigsäure in das reine Tetracosapeptid-hexaacetat übergeführt. Es weist im Dünnschichtchromatogramm an Aluminiumoxyd einen i?/-Wert

Rf(IOl) 0,6

auf. Im Saffrantest zeigt das Peptid eine hohe ACTH-Aktivität.

Im Sayerstest beträgt die ACTH-Aktivität etwa so 600IE/mg.

Beispiel 3
1. Z-Arg-Pro-OtBu

5,35 g Z-Arg-OH und 5 g Prolin-tert.-butylesterhydrochlorid werden bei Raumtemperatur in 70 ml absolutem Chloroform suspendiert. Nach Zugabe von 5,1 g Dicyclohexylcarbodiimid wird die Mischung auf 50° erwärmt, wobei die Ausgangsmaterialien in Lösung gehen und sich gleichzeitig eine neue kristalline Fällung bildet. Nach 5 Stunden wird auf 0° gekühlt, abgenutscht und mit Chloroform gewaschen. Das Gemisch von Dicyclohexylharnstoff und Dipeptid wird nach dem Trocknen mit 100 ml siedendem Wasser extrahiert, das unlösliche Harnstoffderivat abgenutscht und das Filtrat im Vakuum zur Trockne verdampft. Der Rückstand liefert nach Kristallisation aus 30 ml Isopropanol 7,2 g geschütztes Dipeptidester-hydrochlorid vom F. 178 bis 180°. Es weist im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagelplatten im System 102 einen Rf-Wert von 0,62 auf; Indikator: Sakaguchi-Reagens.

2. Z-Arg-Arg-Pro-OtBu

7,1 g Z-Arg-Pro-OtBu werden in 70 ml Methanol und 6,8 ml 2,18 η-Salzsäure gelöst und in Gegenwart von 700 mg Palladiumkohle (10% Palladium) in 90 Minuten hydriert. Nach Abfiltrieren des Katalysators dampft man das Filtrat im Vakuum zur Trockne ein. Der Rückstand wird zusammen mit 5,4 g Z-Arg-OH in 17 ml Dimethylformamid gelöst, mit 17 ml Chloroform versetzt und auf 0° gekühlt. Unter Rühren werden 4,5 g Dicyclohexylcarbodiimid zugegeben, dann 52 ml Chloroform. Man rührt die Mischung über Nacht bei 0° und dampft dann im Vakuum zur Trockne ein. Der Rückstand wird mit 100 ml Wasser verrieben, das unlösliche Harnstoffderivat abgenutscht und mit Wasser und Chloroform gewaschen. Dann trennt man die wäßrige Phase ab, wäscht sie noch dreimal mit Chloroform und engt sie im Vakuum ein. Man filtriert die konzentrierte Lösung durch 300 ml Amberlite IRA-400 (Acetatform) und eluiert das Diacetat des Peptidderivats mit Wasser. Das fraktionenweise aufgefangene Eluat wird im Dünnschichtchromatogramm im System 102 geprüft. Die reinen Fraktionen (R_f = 0,35) werden vereinigt und im Vakuum zur Trockne verdampft. Ausbeute: 10,2 g (97 % der Theorie).

13 14

3. H-Arg-Arg-Pro-OtBu D-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu(OtBu)-His-Phe-Arg-Try-Gly-

4,5 g Z-Arg-Arg-Pro-OtBu-Diacetat werden in 25 ml OH (vgl. Beispiel 1) versetzt. Man rührt die Mischung

Methanol in Gegenwart von 500 mg 10%iger Palla- unter Stickstoff so lange, bis vollständige Lösung eindiumkohle hydriert, die Lösung nach Abfiltrieren des tritt. Dann gibt man 100 mg Dicyclohexylcarbodiimid Katalysators zur Trockne eingedampft und der Rück- 5 zu und rührt unter Stickstoff 18 Stunden bei 24°. Der stand zusammen mit 1 ml Triäthylamin in 28 ml entstandene Niederschlag wird abfiltriert und das Dimethylformamid gelöst. Man bewahrt die Lösung Filtrat zur Trockne eingedampft. Man zerreibt den

bei 0° auf und verwendet sie direkt zur Synthese des Eindampfrückstand mit Äther und unterwirft das

Nonapeptidderivates. erhaltene feste Pulver einer Gegenstromverteilung nach

, „_T ,„„„< „ ,, , ^_{1 T} /r./~>^\ τ /F₁₁^z-N ¹⁰ Craig über 120 Stufen im System Chloroform-Tetra-

4.Z-LyS(BOC)-PrO-VaI-GIy-LyS(BOC)-LyS(BOC)- _chlorkohlenstoff (5: 2)-Methanol-0,5-mol · wäßrige

Arg-Arg-ttro-Utöu Ammoniumacetatlösung (2:1) = 1:1; Phasen-

Zu 4,4 g Z -Lys(BOC)- Pro -VaI-GIy-LyS(BOC)- volumen 3 ml. Das Rohprodukt wird in 15 ml Ober-

Lys(BOC)-NHNH₂, hergestellt beispielsweise nach und Unterphase gelöst und die Lösung auf die ersten Patentanmeldung G. Nr. 2209/63 (Case 5247/5123), 15 5 Rohre der Verteilungsapparatur verteilt. Die Frakgelöst in 44 ml absolutem Dimethylformamid, werden tionen 46 bis 55 enthalten den reinen geschützten bei —20° 10,8 ml In-Salzsäure zugetropft, dann Nonadekapeptidester (Verteilungszahl K = 0,7). Er 4,4 ml In-Natriumnitritlösung. Anschließend wird ist einheitlich gemäß Dünnschichtchromatographie an noch 20 Minuten bei —10° gerührt. Darauf wird die Silicagel; 7?/(110) = 0,42.

obige Lösung von H-Arg-Arg-Pro-OtBu zugefügt und 20

über Nacht bei 0° aufbewahrt. Man destilliert das 7 H-D-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-

Dimethylformamid im Hochvakuum ab und zerreibt Gly-Lys-Pro-Val-GIy-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-OH,

den Rückstand mit Äther zu einem Pulver. Dieses Hexaacetat

wird in warmer, mit Essigester gesättigter 1 %iger

Essigsäure gelöst und mit Amberlite IRA-400 (Acetat- 25 Man löst 50 mg des geschützten Nonadekapeptidform) versetzt, bis keine Chlorionen mehr nachzu- esters in 3 ml 95%iger Trifluoressigsäure und läßt die weisen sind. Der Ionenaustauscher wird abgenutscht, Lösung 1 Stunde bei 22° stehen. Hierauf wird zur das Filtrat zweimal mit 100 ml Essigester extrahiert, Trockne verdampft, der Rückstand in 2n-Essigsäure dieser wieder zweimal mit 1 %iger Essigsäure. Die gelöst und zur Entfernung der Trifiuoracetationen vereinigten wäßrigen Lösungen werden im Vakuum 3° über eine Säule eines schwach basischen Ionenauszur Trockne verdampft, der Rückstand in Chloro- tauschers (Merck Nr. II) in der Acetatform filtriert. form-Methanol (7: 3) gelöst und an 200 g Kieselgel Das Eluat wird lyophilisiert und ergibt 40 mg des chromatographiert. Man eluiert mit 600 ml des obigen freien Nonadekapeptids als farbloses, amorphes Choroform-Methanol-Gemisches und 400 ml Me- Pulver. Das Produkt erweist sich als einheitlich bei thanol. Dabei werden 4,56 g des geschützten Nona- 35 Papierelektrophorese (pH = 6,3, 1000 V., 2 Stunden peptidderivates (als Diacetat) erhalten. Es ist dünn- Laufzeit); Laufstrecke 8,5cm (unter gleichen Bedinschichtchromatographisch einheitlich; Rf = 0,35 im gungen läuft ^-^-Corticotropin 10,5 cm) und bei System 102. Dünnschichtchromatographie auf Aluminiumoxyd-

r TT τ ,™^ r. λ/ 1 ^, τ /r.^^ τ /r,^^ platte, Rf (101) — 0,50. Das Produkt zeigt eine starke

5.H-LyS(BOC)-PrO-VaI-GIy-LyS(BOOLyS(BOC)- ₄₀ conicotrope Wirkung; im Test nach Sayers erweist Arg-Arg-Pro-OtBu _{sich die W}i_rkung des D-Ser^-^-Corticotropins als

a) Acetat merklich erhöht gegenüber derjenigen des ß^^-Coxu-

600 mg des obigen Nonapeptidderivates werden in cotropins (alles L-Aminosäuren); sie beträgt für das 12 ml Methanol gelöst und in Gegenwart von 60 mg D-Ser^Peptid 330 ΙΕ/mg, für das entsprechende 10%iger Palladiumkohle hydriert. Nach beendigter 45 L-Ser^Peptid 30 IE/mg.
Wasserstoffaufnahme wird der Katalysator abgenutscht und das Filtrat im Vakuum zur Trockne ver- B e i s ρ i e 1 4
dampft. Ausbeute: 530 mg = 96% der Theorie. Die

Verbindung ist dünnschichtchromatographisch ein- 1. Z-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr-Pro-OtBu

heitlich, R_f = 0,08 im System 102. 5°

a) 5,14 g (6,75 mMol) des Pentapeptidesters H-VaI-

b) Hydrochlond Lys(BOC)-Val-Tyr-Pio-OtBu, hergestellt beispiels-

300 mg des unter a) erhaltenen, essigsauren Salzes weise nach Patentanmeldung G. Nr. 2209/63 (Case des Nonapeptidderivates werden mit 5 ml Pyridin ver- 5247/5123), werden in 10 ml Dimethylformamid gelöst setzt und durch Zugabe von 200 mg Pyridin-hydro- 55 und mit 3,01 g (8,15 mMol) Benzyloxycarbonylchlorid in Lösung gebracht. Die Lösung wird zur L-prolin-p-nitrophenylester versetzt. Nach 20 Stunden Trockne verdampft und der Rückstand zur Entfernung Stehen bei Zimmertemperatur wird das Reaktionsvon Pyridinacetat mehrere Stunden im Hochvakuum gemisch aufgearbeitet durch Verdünnen mit 100 ml bei 40° getrocknet. Hierauf wird zur Entfernung von Essigester und die Lösung einmal mit 50 ml Wasser, überschüssigem Pyridin-hydrochlorid mit Aceton zer- 60 viermal mit 25 ml lm-Kaliumcarbonatlösung und rieben, wobei das Nonapeptid-hydrochlorid als aceton- zweimal mit 25 ml Wasser gewaschen. Die Essigesterunlösliches Pulver erhalten wird. schicht wird darauf auf 0° gekühlt und mit 1 % Zi- r t,^^, ο -r- ο », ^,, ,_Λ r. χ TT- «ι tronensäure in Wasser (2 x 25 ml) extrahiert, neutral ⁶· BOC-D-Ser-Tyr-Ser-Met-G u OtBu)-H.s-Phe- gewaschen und mit Natriumsulfat getrocknet.
Arg-Try-Gly-LysiBOO-Pro-Val-Gly-LysiBOC)- ₆₅ Der geschützte Hexapeptidester wird durch Ver-Lys(BOC)-Arg-Arg-Pro-OtBu dünnen der konzentrierten Lösung mit trockenem 100 mg des obigen Nonapeptidester-hydrochlorids Äthyläther in Pulverform erhalten, Ausbeute 97%. in 2,2 ml absolutem Pyridin werden mit 120 mg BOC- Das Produkt ist einheitlich nach Dünnschichtchro-

matographie auf Silicagel in den folgenden Lösungsmittelsystemen:

Methanol R_f = 0,97

Chloroform-Methanol (95 : 5) .. R_f = 0,26 Benzol-Aceton (1:1) Rf = 0,47

Die Verbindung zeigt folgende R_f-Werte (entwickelt mit Reindel-Hoppe-Reagens) an Silicagelplatten: System Chloroform-Methanol (8:2): 0,61, System 43A: 0,50.

Das Produkt ist nicht kristallinisch: Schmelzpunkt etwa 156 bis 180°, [y.]T = -94,5 (c = 1,09 in Methanol); [x]f° = -46,4 (c = 1,01 in Dimethylformamid).

b) 7,61 g (10 mMol) des freien Pentapeptidesters H-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr-Pro-OtBu werden in 15 ml Dimethylformamid gelöst und 1,4 ml Triäthylamin zugegeben. Das Gemisch wird auf —10° gekühlt und

3. N^-Benzyloxycarbonyl-N^-tert.-butyloxycarbonyl-L-ornithin

26 g (112 mMol) N^-tert.-Butyloxycarbonyl-L-ornithin (dargestellt nach Patentanmeldung G. Nr. 7658/60 ίο [Case 4351/1+2]) werden in üblicher Weise carbobenzoxyliert. Zum Ansäuern der alkalischen, mit Äther extrahierten Reaktionslösung wird mit Zitronensäure bei 0° auf pH = 3 eingestellt, wieder mit Äther extrahiert, mit Wasser nachgewaschen und getrocknet, mit 4,73 g (12 mMol) Carbobenzyloxy-L-prolin-N-hy- 15 Es werden nach Abdestillieren des Lösungsmittels droxy-phthalimidester (dargestellt nach Rec. Chim. 37,8 g (92%) eines farblosen Öls erhalten. Trav. Pays-Bas 81, 683 [1962]) versetzt. Das Reak- 1 g dieses Öls wird in 5 ml Äther gelöst und mit

tionsgemisch färbt sich bald dunkelrot und wird, 600 mg Dicyclohexylamin zur Kristallisation gebracht, nachdem sich alles gelöst hat, aufgearbeitet. Das Das erhaltene Salz wird mit Äther gewaschen; Aus-Lösen des Esters und die Kupplung dauert nur 15 Mi- 20 beute: 1,28 g (85%); F. 133°.

nuten. Die Aufarbeitung geschieht durch Verdünnen Der Hauptanteil des Produkts kristallisiert nach

mit Essigester, Extraktion mit 60 ml Wasser zur Ent- Lösen in 100 ml warmem Diisopropyläther und fernung des Dimethylformamids, viermalige Extrak- Kühlen. Man erhält weiße Kristalle vom F. 99°. Nach tion mit je 25 ml gesättigter Bicarbonatlösung, ein- Umkristallisieren aus 100 ml heißem Diisopropyläther malige Extraktion mit einer 1 %igen Zitronensäure- 25 unter Zusatz von 20 ml Essigester beträgt der Schmelzlösung und Neutralwaschen. Die Lösung wird darauf punkt 101°. [a]o'° = —3,2° (c = 2,45 in absolutem

mit Natriumsulfat getrocknet, filtriert und das Filtrat unter heftigem Rühren in 500 ml Petroläther gegossen. Die erhaltene Suspension wird noch mit einem halben Liter Petroläther verdünnt und filtriert. Nach dem Trocknen erhält man 9,83 g (99 %) eines chromatographisch reinen Produktes, das mit dem im Beispiel 1 erhaltenen Produkt identisch ist.

Methanol).

4. N^-Benzyloxycarbonyl-N^-tert.-butyloxycarbonyl-L-ornithin-p-nitrophenylester

Man löst 14,6 g (40 mMol) N'-Z-N^BOC-Orn-OH und 6,72 g p-Nitrophenol (48 mMol) in 75 ml Essigester, kühlt auf —20° und versetzt das Gemisch mit 8,24 g (40 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid. Nach 2 Stunden Stehen bei 0° wird filtriert, das Filtrat zur Trockne eingeengt und der kristalline Rückstand mit 75 ml 10%igem Acetonitril in Diisopropyläther verdünnt. Nach 24 Stunden bei 0° wird filtriert und mit Diisopropyläther gewaschen. Das noch feuchte Ma-

2. H-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr-Pro-OtBu a) freier Hexapeptidester

6,5 g (6,55 mMol) geschützter Hexapeptidester
Z-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr-Pro-OtBu werden in
150 ml Methanol gelöst und in Gegenwart von 1,3 g
Palladiumkohle (10%) während 23,5 Stunden hydriert. 4° terial löst man in 50 ml Äthanol und gibt 25 ml Diiso-

Die methanolische Lösung wird darauf filtriert und propyläther zu. Nach mehrstündigem Stehen im Eisdas Filtrat im Vakuum konzentriert. schrank bilden sich kleine Nadeln des obigen p-Nitro-

Eine Probe wird bei Zimmertemperatur in einem phenylesters (11,9 g = 61,5%); F. 102°. Aus der offenen Gefäß belassen, wobei sich Kristalle bilden. .Mutterlauge werden nach Konzentrieren noch weitere Diese werden zum Animpfen des Hauptprodukts ver- 45 2,5 g (19%) dieses Esters gewonnen, wendet. Nach 20 Stunden im Eisschrank werden die Nach Umkristallisieren aus wenig Äthanol ist der

Nadeln (1,41 g) durch Filtration abgetrennt, mit Schmelzpunkt 103°; [<x]l'° — —26,7° (c = 5,01 in einem Gemisch von Methanol und Äther und zuletzt Methanol).

mit Äther allein gewaschen. Aus der Mutterlauge Der Ester ist löslich in Dimethylformamid, Aceton,

wurden mit Äther noch weitere 3,25 g des Peptidesters 5° Methylenchlorid, Äther, Essigester, Äthanol und erhalten. Insgesamt werden also 4,66 g (83 %) vom Acetonitril, schwer löslich in Diisopropyläther und F. 174 bis 176° isoliert; [α]Γ =-91 ±0,5° (c = 1,87 Petroläther. in Methanol).

Der Peptidester ist löslich in Methanol, Aceton, Dimethylformamid, unlöslich in Essigester, Äther und Petroläther.

5. N^-Benzyloxycarbonyl-N^-tert.-butyloxycarbonyl-L-ornithin-hydroxyphthalimidester

3,66 g (10 mMol) N^-Z-N^-BOC-L-Orn-OH werden in 5 ml trockenem Pyridin gelöst, auf —10° gekühlt und mit einer Lösung von 2,06 g (10 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid in 5 ml Pyridin versetzt. Nach

b) Monoacetat

2,5 g (2,52 mMol) des obigen geschützten Hexa-

peptidesters werden in Eisessig-Wasser (4:1) in Gegen- ⁶° 5 Minuten gibt man 1,96 g N-Hydroxyphthalimid zu

wart von 1,3 g Palladiumkohle hydriert. Die Wasser- und läßt das Gemisch 16 Stunden bei 0° stehen.

Stoffaufnahme ist nach 2,5 Stunden beendet. Der Hierauf wird filtriert und mit Pyridin nachgewaschen.

Katalysator wird abfiltriert, das Filtrat im Vakuum Das Filtrat wird im Vakuum bei 40° vom Pyridin

bei 40° Badetemperatur eingedampft und der Ein- befreit, mit sek.-Butanol versetzt und wieder zur

dampfrückstand im Hochvakuum über Natrium- ⁶5 Trockne verdampft und dann in wenig Äther auf-

hydroxyd getrocknet. Man erhält 2,34 g (100%) eines genommen. Nach 48 Stunden bei —8° werden die

farblosen Harzes, welches im Dünnschichtchromato- erhaltenen Kristalle (4,5 g = 88%) isoliert; F. 125

gramm einheitlich ist. bis 127°.

509 583/458

I *± OU UOd

Das Rohkristallisat wird durch Erwärmen in Acetonitril gelöst, vom restlichen Dicyclohexylharnstoff und Hydroxyphthalimid abfiltriert und das Filtrat durch Zugabe von Diisopropyläther zur Kristallisation gebracht. Dabei werden 3,12 g (61%) reines Produkt erhalten. Nach Umkristallisieren aus Isopropylalkohol ist der Schmelzpunkt 129°, [<x]f = -25,7° (c = 1 in Methanol).

6. Z-Orn(BOC)-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr-Pro-OtBu

a) 2,3 g (2,5 raMol) H-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr-Pro-OtBu-acetat wenden in 5 ml Dimethylformamid gelöst und 1,71 g (3,5 mMol) Z-Om(BOC)-ONP zugegeben. Nach 24 Stunden wird das Reaktionsgemisch unter heftigem Rühren mit 200 ml Äther verdünnt. Innerhalb 15 Minuten bildet sich ein weißer Niederschlag. Er wird filtriert, mit Äther gewaschen und getrocknet. Das erhaltene Heptapeptidderivat ist nach Dünnschichtchromatographie einheitlich in den folgenden Lösungsmittel-Systemen:

Benzol-Aceton (1:1) R_f — 0,37

Chloroform-Methanol (9:1) ... Rf = 0,47

Nach Trocknen während 48 Stunden im Vakuum werden 2,73 g (90%) eines weißen Pulvers erhalten; F. 142 bis 145°; [«]?* = -38 ± 0,5° (c = 2,061 in Dimethylformamid); = -90 ± 1° (c = 0,970 in Methanol).

Das Produkt ist löslich in Dimethylformamid, Essigsäure, Alkoholen und Aceton. Es löst sich schwerer in Acetonitril und ist unlöslich in Essigester, Äther, Benzol und Petroläther.

b) 429 mg (0,5 mMol) H-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr-Pro-OtBu, gelöst in 2 ml Dimethylformamid, werden mit 305 mg (0,60 mMol) N^-Benzyloxycarbonyl - N^d- tert. - butyloxycarbonyl -L- ornithin - hydroxyphthalimidester versetzt. Man gibt 0,14 ml Triäthylamin zu, wobei sich das Reaktionsgemisch rot färbt, und arbeitet nach einer Viertelstunde auf. Zur Lösung wird unter ständigem Rühren etwa 50 ml Äther zugegeben und nach einer halben Stunde filtriert. Dabei werden 536 mg des geschützten Heptapeptidesters erhalten (89%), der sich als analytisch rein und mit dem unter a) erhaltenen Produkt als identisch erweist.

7. H-Orn(BOC)-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr-Pro-OtBu a) essigsaures Salz

1 g (0,83 mMol) des unter b) beschriebenen geschützten Heptapeptidesters wird in 25 ml Essigsäure (80%) gelöst und hydriert, wie unter 2. angegeben. Nach Beendigung der Hydrierung wird vom Katalysator abfiltriert, dieser gut ausgewaschen und das Filtrat zur Trockne eingeengt. Es verbleiben 956 mg reines Material (100%), das dünnschichtchromatographisch nicht von der freien Base (vgl. unten) zu unterscheiden ist. [<x]f° = -87 ±1° (c = 1,028 in Methanol); = -27 ± 1° (c = 1,095 in 80% Essigsäure.

b) freier Heptapeptidester

1 g (0,83 mMol) des geschützten Heptapeptidesters wird in Methanol gelöst und hydriert, wie unter 2. beschrieben. Das Produkt wird nicht kristallin erhalten, enthält aber kein Ausgangsmaterial mehr und ist dünnschichtchromatographisch (auf Silicagelplatten) einheitlich; es hat die /?/-Werte:

System 52 0,68

System Chloroform-Methanol (90 : 10) 0,13

Nach .Totalhydrolyse und Aminosäureanalyse nach Stein und Moore wird ein Aminosäuren-Verhältnis

gefunden.

Pro : VaI: Tyr: Orn : Lys

= 2,04:2,00:0,98:1,06: 1,08

8. Z-Orn(BOC)-Orn(BOC)-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr-Pro-OtBu

2,69 g (2,38 mMol) des gemäß 7 a) erhaltenen Heptapeptidester-acetats werden in 5 ml Dimethylformamid gelöst und mit 1,4 g (2,86 mMol) Z-Om(BOC)-ONP versetzt. Das Gemisch wird über Nacht bei Zimmertemperatur stehen gelassen und dann im Hochvakuum eingeengt. Es hinterbleibt ein braunes Harz, das beim Zugeben von 100 ml warmem Acetonitril eine weiße Fällung ergibt. Nach 3 Stunden bei 0° wird diese abfiltriert und das erhaltene Pulver mit Acetonitril und mit Äther gewaschen. Nach dem Trocknen wiegt der erhaltene Oktapeptidester 3,15g (93%); F. 152 bis 154°, [«]?· = -83,3 ± 0,5° (c = 1,046 in Methanol). Das Produkt ist dünnschichtchromatographisch (auf Silicagel) einheitlich und zeigt die folgenden Ä/-Werte:

System Chloroform-Methanol (95 : 5) 0,54
System Benzol-Aceton (1:1) 0,56

Der Oktapeptidester löst sich in Dimethylformamid, Essigsäure, Methanol und Äthanol, er löst sich weniger gut in heißem Acetonitril und ist unlöslich in Essigester und Äther.

9. H-Orn(BOC)-Orn(BOC)-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr-Pro-OtBu
a) essigsaures Salz

Der geschützte Oktapeptidester gemäß 7. wird in 80%iger Essigsäure gelöst und, wie unter 2. angegeben, hydriert. Nach Abfiltrieren des Katalysators wird bei höchstens 30° Badtemperatur eingedampft. Das erhaltene Produkt ist im Dünnschichtchromatogramm (auf Silicagelplatten) einheitlich und zeigt die folgenden R_f.Werte:

System Chloroform-Methanol (95 : 5) 0,06

System Chloroform-Methanol (9 :1) 0,22

System Chloroform-Methanol (85 :15) 0,26

System Benzol-Aceton (1:1) 0,03

[Oi]I³' = —49,4 ±1° (c= 0,942 in Dimethylformamid); [«]² _D ⁵° = -85,6 ± 1° (c = 1,266 in Methanol).

b) freier Oktapeptidester

500 mg des geschützten Oktapeptidesters werden in Methanol gelöst und hydriert, wie unter 2. beschrieben. Man erhält 441 mg freie Base (96 %). Die R_f-Werte sind nicht verschieden von denen des oben beschriebenen essigsauren Salzes; [«]"° = —51,8 ± 1° (c = 1,247 im Dimethylformamid); [<x]?° = -87,7 ± 1° (c = 1,079 in Methanol).

14

Öb9

10. Z-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOQ-0rn( BOC)-Orn(BOC)-Pro- Val-Lys(B0C)-Val-Tyr-Pro-OtBu

900 mg (0,80 mMol) des Hexapeptidhydrazids Z-Lys-3OC)-Pro-VaI-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC)-NH-NH₂, ergestellt beispielsweise nach Patentanmeldung G. It. 2209/63 (Case 5247/5123), werden in 9 ml reinem )imethylformamid gelöst und die Lösung auf —10° ekühlt. Nach Zusatz von 1,6 ml 2n-Salzsäure und ,18 ml 5n-Natriumnitritlösung rührt man während 0 Minuten bei —10° und fügt dann 900 mg ),67 mMol) des unter 9a) beschriebenen Oktapeptid-.etats, gelöst in 9 ml Dimethylformamid, hinzu. )arauf gibt man 0,53 ml (4,0 mMol) Triäthylamin zu nd läßt 18 Stunden im Eisschrank stehen. Hierauf ird die Lösung im Hochvakuum zur Trockne ein- :dampft und der Rückstand mit Acetonitril zerrieben. )as im Acetonitril unlösliche Tetradekapeptidderivat ird filtriert und dreimal mit 25 ml Acetonitril geaschen.

Es werden 1,554 g (98%) eines schwach gelblich .'färbten Produktes erhalten, das im Dünnschichtiromatogramm nur eine Spur einer Verunreinigung •igt. Keines der beiden Ausgangsmaterialien kann ichsewiesen werden. Die /?/-Werte (auf Silicagel) nd:"

im System Chloroform-Methanol

(95:5) 0,31

im System Dioxan-Wasser (95 : 5) 0,76

Das Produkt ist amorph, zeigt aber einen scharfen .hmelzpunkt, 192 bis 194°; {%]?'' = -37,8 ± 1° = 1,050 in Dimethylformamid). Das Peptidderivat ;gt, wie die Elementaranalyse zeigt, als Dihydrat vor.

11. H-LyS(BOC)-PrO-VaI-GIy-LyS(BOC)-Lys(BOC)-Orn(BOC)-Orn(BOC)-Pro-Val- Lys(BOC)-Val-Tyr-Pro-OtBu-Tosylat

Der geschützte Tetradekapeptidester (1 g, 42 mMol) wird in 150 ml Methanol suspendiert und lange bei 40° geschüttelt, bis alles in Lösung gengen ist. Dann gibt man 400 mg Palladiumkohle %) zu und schüttelt die Lösung während 18 Stunden i 40° in einer Wasserstoffatmosphäre und filtriert, ach Verdampfen des Lösungsmittels erhält man 3 mg (84%) des Esters.

Zur Überführung in das Tosylat wird das Produkt 5 ml Pyridin gelöst, eine Lösung von 70 mg p-Tojlsulfosäure in 1 ml Pyridin zugegeben, das Pyridin i Vakuum zur Trockne verdampft und der Rückmd mehrmals mit Äther unter Zerreiben und Dekanren gewaschen. Nach Trocknen werden 721 mg des tradekapeptidester-tosylats als amorphes Pulver aalten. Es ist dünnschichtchromatographisch prakch einheitlich und weist folgende /?/-Werte auf:

System 43C 0,49

System 52 0,61

12. BOC-D-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu(OtBu)-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys( BOC)-PrO- Val-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Orn(BOC)-Orn(BOC)-Pro-BaI-

Lys(BOC)-Val-Tyr-Pro-OtBu

K)O mg des Tetradekapeptidester-Tosylats und ) mg BOC-D-Ser-Tyr-Ser-Met-GluiOtBuJ-His-Phe-Arg-Try-Gly-OH (vgl. Beispiel 1) werden in 5 ml Pyridin suspendiert und in einer Stickstoffatmosphäre bei 50° gerührt, bis beide Komponenten in Lösung gegangen sind (2 Stunden). Dann kühlt man auf 40° ab, gibt 500 mg Dicyclohexylcarbodiimid zu und rührt in Stickstoffatmosphäre 18 Stunden bei 40°. Hierauf wird noch 20 Stunden bei 0° gerührt und dann der ausgeschiedene Dicyclohexylharnstoff abfiltriert. Das Filtrat wird zur Trockne verdampft, der Rückstand

ίο zur Entfernung von überschüssigem Dicyclohexylcarbodiimid mehrmals mit Petroläther unter Zerreiben gewaschen und das petrolätherunlösliche Pulver zur weiteren Reinigung mit Essigester unter Zerreiben und Dekantieren gewaschen.

Das erhaltene Rohprodukt zeigt einen unscharfen Schmelzpunkt von etwa 165 bis 195°. Das Produkt wird ohne weitere Reinigung weiterverarbeitet.

13. H-D-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-

Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Orn-Orn-Pro-Val-

Lys-Val-Tyr-Pro-OH-Hexaacetat

100 mg des rohen, geschützten Tetracosapeptidderivats werden in 5 ml Trifluoressigsäure (enthaltend 5% Wasser) gelöst und die Lösung 1 Stunde bei 25° belassen. Hierauf wird im Vakuum zur Trockne eingedampft und der Eindampfrückstand sofort mit trokkenem, peroxydfreiem Äther unter Zerreiben und Dekantieren mehrmals gewaschen. Das erhaltene Pulver wird mit 10 ml ln-Essigsäure versetzt, wobei etwas Dicyclohexylharnstoff ungelöst bleibt. Die Lösung wird filtriert und das Filtrat zur Abtrennung von Trifluoracetat- und p-Toluolsulfonationen über eine Säule eines schwach basischen Ionenaustauschers (Merck Nr. II) (Acetatform) laufen gelassen. Man wäscht mit 10 ml ln-Essigsäure nach und lyophillisiert die vereinigten Eluate. Nach Papierelektrophorese (pH = 6,2; 1000 V., 2 Stunden) ist das Lyophilisat noch nicht einheitlich;neben einem dem freien D-Ser¹,-Om¹⁷,Orn¹⁸-/?¹-²⁴-Corticotropin entsprechenden Fleck (Laufstrecke 14 cm) sind zwei weitere, schwächere Nebenfiecke (Laufstrecke 2,5 und 18 cm) sichtbar.

Zur Reinigung wird das Rohprodukt an einer Säule von Carboxymethylcellulose (der Firma Serva, Heidelberg; Säulendimensionen 0,9 X 14 cm) chromatographiert. Als Lösungsmittel, in dem die Carboxymethylcellulose zum Herstellen der Säule suspendiert wird, dient 0,05 ml Ammoniumacetatlösung, pH = 5,2. Das obige Lyophilisat wird in 2 ml dieser Pufferlösung gelöst und auf die Säule einsickern gelassen. Hierauf wird mit einem linearen Puffergradienten, bereitet aus 50 ml 0,05m-Ammoniumacetatlösung, pH = 5,2 und 50 ml !,Om-Ammoniumacetatlösung, pH = 5,2, eluiert. Die Elution wird mit einem registrierenden UV.-Durchlaufabsorptionsgerät verfolgt. Die Hauptfraktionen werden vereinigt, zur Entfernung von Ammoniumacetat lyophilisiert und der trockene Rückstand bei 0,01 mm Hg und 40° getrocknet.

Das freie D-Ser¹-Orn¹⁷,Orn^I8-/3¹-²⁴-Corticotropin erweist sich als außerordentlich stark corticotrop aktiv und lang wirksam. Im Sayerstest beträgt die Aktivität etwa 1000IE/mg; auch im Test nach Desaulles und Rittel, Memoirs of the Soc. for Endocrinology No. 17 (Cambridge, At the University Press 1968), S. 124 bis 137, ist die Verbindung etwa zehnmal wirksamer als /^'-^-Corticotropin.

it a 21

Beispiel 5

1. H-LyS(BOC)-PrO-VaI-GIy-LyS(BOC)-LyS(BOC)-NH₂

5,0 g Z-LyS(BOC)-PrO-VaI-GIy-LyS(BOC)-LyS-(BOC)-OCH₃, hergestellt beispielsweise nach Patentanmeldung G. Nr. 2209/63 (Case 5247/5123) werden in 30 ml Methanol unter Erwärmen gelöst und die Lösung mit 400 ml 6n-Ammoniak in Methanol versetzt. Nach 3 Tagen bei Raumtemperatur dampft man ein und kristallisiert den Eindampfrückstand aus t-Butanol-Wasser um. Man erhält 4,8 g Hexapeptidamidvom F. 197 bis 198°; [x]? = -48 ± Γ (c = 1,05 in Methanol).

2,04 g des obigen Hexapeptidderivats werden in 60 ml Methanol in Gegenwart von 200 mg Palladiumkohle (10% Palladium) hydriert. Die Wasserstoffaufnahme ist nach 10 Stunden beendigt. Abnutschen des Katalysators und Eindampfen ergibt H-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC)-NH₂ als farbloses Harz, das sich bei Dünnschichtchromatographie an Silicagel als frei von unhydriertem Ausgangsprodukt erweist; Rf(UO) = 0,15.

2. BOC-D-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu(OtBu)-His-Phe-

Arg-Try-Gly-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-

LyS(BOC)-NH₂

150 mg BOC-D-Ser-Tyr-Ser-Met-GIu(OtBu)-His-Phe-Arg-Try-GIy-OH (vgl. Beispiel 1) und 200 mg des obigen Hexapeptidamids werden mit 4 ml Pyridin und 12 mg Pyridinhydrochlorid versetzt und 2 Stunden bei 24° unter Stickstoff gerührt. Hierauf gibt man 120 mg Dicyclohexylcarbodiimid zu und rührt weitere 24 Stunden bei 24° unter Stickstoff. Nach dieser Zeit wird die feine, gallertige Fällung abzentrifugiert, die überstehende Pyridinlösung abgegossen und eingedampft. Der Eindampfrückstand wird mit Äther zerrieben und das ätherunlösliche Pulver nach Trocknen zur Entfernung von Hexapeptidamid mit verdünnter Essigsäure unter Zerreiben gewaschen. Man erhält 135 mg rohes, geschütztes Hexadekapeptidderivat als in Essigsäure unlösliches Pulver. Zur weiteren Reinigung wird es in 10 ml Methanol-Wasser unter Rühren suspendiert, wobei eine Spur Nebenprodukt (Acylharnstoff, gebildet aus dem Dekapeptid und Dicyclohexylharnstoff) ungelöst bleibt und durch Filtration entfernt wird. Die Methanol-Wasser-Lösung wird zur Trockne verdampft und der Eindampfrückstand in Dimethylformamid aufgenommen, wobei eine zweite Portion des Acylharnstoffs ungelöst bleibt und durch Filtration entfernt wird. Eindampfen der Dimethylformamidlösung ergibt das geschützte Hexadekapeptidderivat in praktisch reiner Form. Bei Dünnschichtchromatographie auf Silicagelplatten ist Rf (101) = 0,80.

3. H-D-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-NH₂, Acetat

20 mg des gereinigten Hexadekapeptidderivats werden in ImI 95%iger Trifluoressigsäure gelöst und 1 Stunde bei 24° belassen. Hierauf wird zur Trockne verdampft und der Rückstand in verdünnter Essigsäure gelöst. Durch Elution an einer Säule eines schwach basischen Ionenaustauschers (Merck Nr. II) in der Acetatform werden die Trifluoracetat- gegen Acetationen ausgetauscht. Das Eluat wird lyophilisiert und ergibt 15 mg des freien Hexadekapeptid-amids als

farbloses Pulver. Bei Dünnschichtchromatographie auf Aluminiumoxydplatten ist Rf(IOl) = 0,6. Im Test von Sayers zeigt das u-Ser^/J^-Corticotropinamid eine merkliche corticotrope Aktivität, etwa 30IE/mg, während das entsprechende i.-Ser'-ß¹-¹⁶-Corticotropin fast keine Wirkung aufweist.

Beispiel 6

1. BOC-D-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu(OtBu)-His-Phe-

Arg-Try-Gly-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-

Lys(BOC)-Arg-Arg-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr-

PrO-ASP(OtBu)-GIy-AIa-GIu(OtBu)-ASp(OtBu)-

GIu(NHa)-LeU-AIa-GIu(OtBu)-AIa-PlIe-PrO-LeU-

GIu(OtBu)-Phe-OtBu

102 mg BOC-D-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu(OtBu)-His-Phe-Arg-Try-Gly-OH (vgl. Beispiel 1), gelöst in 1,2 ml 90%igem Pyridin bei 50°, werden nacheinander mit 0,035 ml ln-Salzsäure und einer Lösung von 150 mg H-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC>Arg-Arg-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr-Pro-Asp(OtBu)-GIy-AIa-GIU(OtBU)-ASp(OtBu)-GIu(NHo)-LeU-AIa-GIU-(OtBu) - AIa - Phe - Pro - Leu - GIu(OtBu) - Phe - OtBu · IV₂HoSO₄ (R. Schwyzer und P. Sieber, Nature 199, 172 [1963]) in 1,2 ml 90%igem Pyridin versetzt. Unter Rühren bei 50° werden nach 30 Minuten, P/₂ Stunden und 6 Stunden je 0,15 ml einer 10%igen Lösung von Dicyclohexylcarbodiimid in Pyridin zugegeben. Nach 25stündigem Rühren wird

mit 100 ml peroxidfreiem Äther gefällt. Das erhaltene Rohprodukt wird im Gemisch Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff - Methanol - 0,1 m - Ammoniumacetat (pH 6,5) (8:8:17:7) einer Craig-Verteilung über 140 Stufen unterworfen. Die auf Grund des Dünnschichtchromatogramms das geschützte /5-Corticotropin enthaltenden Fraktionen Nr. 50 bis 80 werden vereinigt und zur Trockne verdampft. Eine nochmalige Verteilung im gleichen System über 280 Stufen ergibt beim Eindampfen des Inhalts der Verteilungselemente Nr. 125 bis 154 (γ_ηαχ = 140; K = 1,0) 38 mg reines Produkt. Es zeigt im Dünnschichtchromatogramm an Aluminiumoxyd Rf (100) = 0,5.

2. H-D-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-

Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-

Lys-Val-Tyr-Pro-Asp-Gly-Ala-Glu-Asp-Glu(NH,)-Leu-Ala-Glu-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu-Phe-OH

(D-Ser¹-(3¹-³⁹-Corticotropin)

30 mg des geschützten D-Ser¹-/3¹-³⁹-Corticotropinderivats werden in 3 ml 95 %iger Trifluoressigsäure gelöst und 1 Stunde bei 24° belassen. Hierauf wird zur Trockne verdampft und der Rückstand durch Elution an einer Säule eines schwach basischen Ionenaustauschers (Merck Nr. II) in der Acetatform von Trifluoressigsäureionen befreit. Das Eluat wird lyophilisiert und ergibt das essigsaure Salz des freien D-Ser¹-/?¹-³⁹-Corticotropins als farbloses Pulver. Das Produkt zeigt bei Dünnschichtchromatographie an Silicagel und bei Papierelektrophorese gleiches Verhalten wie synthetisches /^"^-Corticotropin. Rf (101) = 0,4. Bei Papierelektrophorese (pH = 6,3, 5 V./cm, 24 Stunden) ist die Laufstrecke 7 cm.

Die corticotrope Wirkung des D-Sei ¹-/9¹~³⁹-Cortico-

⁶S tropins ist gegenüber derjenigen des natürlichen Hormons, verlängert und beträchtlich erhöht. Im Test nach Desaulles und Rittel ist die Verbindung etwa zehnmal wirksamer als ß^l~- '-Corticotropin.

23
Beispiel 7

1. BOC-Tyr-Gly-OCHs

10,12 g BOC-Tyrosin werden heiß in 45 ml Essigester gelöst und nach Abkühlen auf 20^a mit einer Lösung von 3,84 g Glycin-methylester in 10 ml Essigester versetzt. Dazu gibt man 10,4 g Dicyclohexylcarbodiimid in fester Form und rührt während 18 Stunden bei 25\ Dann wird auf 0° abgekühlt, nach 30 Minuten vom ausgeschiedenen Dicyclohexylharnstoff abfiltriert und aus dem Filtrat durch Einengen und Ausfällen mit Petroläther das rohe Dipeptidderivat als amorphe, zähe Masse isoliert. Sie wird durch nochmaliges Umfallen aus Essigester-Petroläther weiter gereinigt und kann dann aus dem gleichen Lösunasmittelgemisch kristallisiert werden; F. 124 bis 125°.

Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel werden folgende Rf-Werte erhalten:

Ä/(43A) 0,65

Rf (CHCla-Methanol = 8:2) 0,68

Rf (101) 0,77

2. H-Tyr-Gly-OCH^hydrochlorid

2 g BOC-Tyr-Gly-OCH₃ werden unter Erwärmen in 20 ml absolutem Essigester gelöst und bei 20° mit 20 ml 4n-Salzsäure in absolutem Essigester versetzt. Nach einigen Minuten beginnt ein Niederschlag auszufallen. Nach 30 Minuten engt man das Reaktionsgemisch im Vakuum auf etwa 10 ml ein und vervollständigt die Ausfällung des Dipeptidester-hydrochlorids durch Zugabe von 50 ml Petroläther. Man homogenisiert, filtriert das amorphe Produkt ab, wäscht mit Petroläther und trocknet im Hochvakuum bei 30°. Das Dipeptidester-hydrochlorid wird als hygroskopisches Pulver vom F. etwa 110 bis 115° (Zersetzung) erhalten. Es zeigt im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel folgende Ä/-Werte:

Ä/(43A) 0,33

Rf (CHCla-Methanol = 8:2) 0,36

R₁- (101) 0,60

3. BOC-D-Ser-Tyr-Gly-OCHa

1,69 g H-Tyr-Gly-OCH₃-hydrochlorid werden unter leichtem Erwärmen in 10 ml absolutem Dimethylformamid gelöst und dann auf 0° abgekühlt. Man gibt nacheinander 0,84 ml Triäthylamin, 1,23 g BOC-D-Ser-OH und 1,65 g Dicyclohexylcarbodiimid zu und rührt die Mischung während 20 Stunden bei 25° und zuletzt noch während 1 Stunde bei 0°. Das ausgeschiedene Gemisch von Triäthylammoniumchlorid und Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert und das Filtrat bis auf einen öligen Rückstand eingeengt. Durch Zugabe von 30 ml Essigester und 100 ml Petroläther wird das Rohprodukt als schmierige Masse ausgefällt. Zur Vorreinigung löst man es wieder unter Erwärmen in wenig Essigester und fällt es durch Zugabe von viel Petroläther aus (1,8 g). Das dünnschichtchromatographisch noch unreine Produkt wird zur Reinigung im Lösungsmittelsystem Essigester-Benzol-0,05m-wäßrige Ammoniumacetatlösung (2:1:2) mit Phasenvolumina von je 10 ml nach Craig multiplikativ verteilt. Nach 250 Stufen isoliert man aus den Verteilungselementen Nr. 45 bis 74 {t]_max = 60; K = 0,32) das Tripeptid-

derivat durch Verdampfen des Lösungsmittels und Wegsublimieren des Ammoniumacetates bei 45° im Hochvakuum als chromatographisch reine Verbindung. Kristalle aus Methanol-Wasser, F. 180 bis 182°. Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ergeben sich folgende £_rWerte:

Rf (52) 0,76

£/(101) 0,78

ίο Rf (CHCla-Methanol = 8:2) 0,58

4. BOC-D-Ser-Tyr-Gly-OH

Man löst 685 mg BOC-D-Ser-Tyr-Gly-OCH₃ in 5 ml ln-Natronlauge, läßt während 10 Minuten bei 20° stehen und neutralisiert dann die Lösung durch Zugabe von 5 ml 1 η-Salzsäure. Das geschützte Tripeptid wird mit 50 ml wassergesättigtem n-Butanol extrahiert, die Butanolschicht viermal mit je 4 ml Wasser gewaschen und auf etwa 3 ml eingeengt. Durch Zugabe von 30 ml Petroläther erhält man eine schmierige Fällung, die aus Essigester kristallisiert werden kann (F. 168° [Zersetzung]). Die Substanz ist dünnschichtchromatographisch einheitlich. Sie weist auf Silicagel folgende Rf-Werte auf:

Rf (52) 0,60

£/(101) 0,61

5. BOC-D-Ser-Tyr-Gly-Met-OCHj

425 mg BOC-D-Ser-Tyr-Gly-OH und 240 mg H-Met-OCH₃-hydrochlorid werden in 3 ml absolutem Dimethylformamid gelöst, 0,168 ml Triäthylamin zugegeben und dann eine Lösung von 288 mg Dicyclohexylcarbodiimid (in 5 ml absolutem Essigester) unter Rühren zugetropft. Man rührt die Mischung noch während 15 Stunden bei 20° und filtriert nach einer weiteren Stunde bei 0° vom ausgeschiedenen Dicyclohexylharnstoff ab. Aus dem Filtrat wird das rohe Kondensationsprodukt durch Zugabe von 50 ml Petroläther als schmieriger Niederschlag ausgefällt und getrocknet. Es wird durch eine Craig-Verteilung im System Methanol-Puffer-Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff (5:3:5:2) [Puffer = 28,5 ml Eisessig +19,25 g Ammoniumacetat in 960 ml Wasser] über 400 Stufen mit Phasenvolumina von je 3 ml gereinigt. Aus den Verteilungselementen Nr. 103 bis 134 (η_ηαχ — 120; K = 0,43) isoliert man beim Einengen zur Trockne und Wegsublimieren des Ammoniumacetats im Hochvakuum bei 45° das chromatographisch reine Tetrapeptidderivat als weißes, amorphes Pulver. Es zeigt im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel folgende £/-Werte:

£/ (Benzol-Aceton = 1:1) 0,21

Rf (Chloroform-Methanol = 85 :15) 0,62 £/(100) 0,84

6. BOC-D-Ser-Tyr-Gly-Met-NH-NHa

160 mg BOC-D-Ser-Tyr-Gly-Met-OCHj werden in 1 ml Methanol gelöst, mit 0,1 ml Hydrazinhydrat versetzt und über Nacht bei 20 stehen gelassen. Die zu einem Kristallkuchen erstarrte Reaktionsmischung wird mit 8 ml Benzol verdünnt und homogenisiert, abfiltriert und mit Benzol-Methanol (10:1) gewaschen. Man erhält beim Trocknen im Hochvakuum bei 50° reines Tetrapeptid-hydrazid vom F. 190° (Zersetzung).

509 583/458

Es weist im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel folgende i?/-Werte auf:

(CHClj-Methanol = 85:15)
(100)

0,21
0,65

7. Z-Glu(OtBu)-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys(BOC)-

Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Arg-Arg-Pro-

Val-Lys(BOC)-Val-Tyr-Pro-OtBu-Triacetat

625 mg (0,273 mMol) H-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC) - Lys(BOC) - Arg - Arg - Pro - VaI - Lys(BOC)-Val-Tyr-Pro-OtBu, 3 CH₃COOH, hergestellt wie in der Anmeldung G. Nr. 5242/61 (Case 4823) beschrieben, in 10 ml trockenem Pyridin werden mit 0,17 g p-Toluolsulfonsäure vermischt. Man dampft die Lösung zur Trockne ein, befreit den Rückstand im Vakuum von 0,01 mm Hg bei 35° vom Pyridinacetat und entfernt das Pyridintosylat durch Verreiben mit Aceton und Absaugen. Man erhält 726 mg geschütztes Tetradekapeptid-Tritosylat als farbloses Pulver vom F. 155 bis 162°.

525 mg (0,2 mMol) des Tritosylats und 245 mg (0,24 mMol) Z-Glu-(OtBu)-His-Phe-Arg-Try-Gly-OH (erhalten durch Kondensation von Z-Arg-OH mit H-TYy-GIy-OCH₃, Abspalten der Carbobenzoxygruppe aus dem Tripeptidderivat, Kondensation des freien Tripeptidesters mit Z-Phe-OH, Abspalten der Carbobenzoxygruppe aus dem Tetrapeptidester, Kondensation des freien Tetrapeptidesters mit Z-GIu[OtBu]-His-N₃ und Verseifung der Methylestergruppe mit 1 n-Natronlauge in 75%igem Dioxan) werden in 4 ml 80%igem Pyridin unter Rühren bei 50° gelöst. Zu der klaren Lösung gibt man 52 mg (0,25 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid. Nach 20 Stunden bei 50° wird die leicht trübe Lösung auf 10° gekühlt und der ausgeschiedene Dicyclohexylharnstoff abfiltriert. Dann versetzt man die Lösung mit viel Äther. Dabei fällt das Tritosylat des Eicosapeptids aus. Es wird abgetrennt, in 10 ml 60%igem Methanol gelöst und durch eine Säule von 4 ml Amberlite IRA-400 (Acetatform) chromatographiert. Das Eluat wird im Vakuum eingedampft und mit Äther verrieben. Man erhält 650 mg rohes geschütztes Eicosapeptidester-Triacetat. Es zeigt im Dünnschichtchromatogramm die folgenden Rf-Werte:

an Aluminiumoxyd: Rf (100) 0,34

an Silicagel: R_f (101) 0,76

0,45

Entwicklung mit Reindel-Hoppe-, Pauly- und Ehrlich-Reagentien. Außerdem findet man unverändertes Hexapeptid- und Tetradekapeptidderivat sowie mehrere rascher laufende Nebenprodukte.

8. H-Glu(OtBu)-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys(BOC>

Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Arg-Arg-Pro-

Val-Lys(BOC)-Val-Tyr-Pro-OtBu-tetraacetat

600 mg des rohen Eicosapeptidderivates werden in 10 ml Methanol gelöst und in Gegenwart von 0,5 ml Eisessig und 1 g Palladiumkohle (10%ig) über Nacht hydriert. Hierauf wird vom Katalysator abfiltriert und das Filtrat im Vakuum eingedampft. Das erhaltene decarbobenzoxylierte Produkt wird in 10 ml tert.-Butanol-Wasser (1:1) gelöst und durch eine Säule von 6 g Carboxymethylcellulose chromatographiert unter Verwendung eines Gradienten zwischen 100 ml 50%igem tert.-Butanol und 100 ml 50%igem tert.-Butanol-Eisessig (9 : 1). Die Fraktionen, welche gemäß Dünnschichtchromatogramm einheitliches Eicosapeptidderivat enthalten, werden vereint und im Vakuum eingedampft. Die ^/-Werte des geschützten Eicosapeptidester-Tetraacetates an Silicagel sind:

Rf (54) 0,50

Rf(IOl) 0,68

Λ/(110) 0,12

Nach Abspaltung aller Schutzgruppen mit 90%iger ίο Trifluoressigsäure zeigt das freie Eicosapeptid die folgenden Rf- Werte:

Rf (101) an Silicagel 0,25

Rf (101) an Aluminiumoxyd 0,30

9. BOC-D-Ser-Tyr-Gly-Met-Glu(OtBu)-His-Phe-ATg-TrV-GIy-LyS(BOC)-PrO-VaI-GIy-LyS(BOC)-Lys(BOC)-Arg-Arg-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr-Pro-OtBu

102 mg BOC-D-Ser-Tyr-Gly-Met-NHNH₂ werden in 0,7 ml absolutem Dimethylformamid gelöst und auf 0' gekühlt. Man gibt sodann 0,165 ml 4,12n-Salzsäure zu und kühlt sofort auf —10° ab. Nach Zugabe von 0,036 ml 5n-Natriumnitritlösung läßt man während 10 Minuten bei —10° reagieren und gibt dann eine auf 0° vorgekühlte Lösung von 298 mg H-GIu-(OtBu)-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys(BOQ-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Arg-Arg-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr-Pro-OtBu-tetraacetat und 0,12 ml Triäthylamin in 1 ml absolutem Dimethylformamid zu. Die Lösung wird während 24 Stunden bei 0° stehen gelassen, bis auf einen öligen Rückstand eingeengt und mit 10 ml Wasser versetzt. Man filtriert das ausgefällte Kondensationsprodukt ab und trocknet im Hochvakuum bei 40°. Zur Reinigung wird das Produkt im Lösungsmittelsystem Methanol-Puffer-Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff (32 : 16 : 21: 9) [Puffer = 28,5 ml Eisessig +19,25 mg Ammoniumacetat in 960 ml Wasser] über 350 Stufen mit Phasenvolumina von je 3 ml multiplikativ verteilt. Aus den Röhrchen Nr. 85 bis 116 (ητηαχ = 100; K = 0,4) erhält man beim Eindampfen zur Trockne und Nachtrocknen des Rückstandes bei 40° im Hochvakuum das chromatographisch reine geschützte Tetracosapeptidacetat als weißes, amorphes Pulver. Es weist im Dünnschichtchromatogramm folgende Rf-Werte auf:

an Silicagel: Ä, (43 Q 0,27 ■

Ä/(52) 0,18

an Aluminiumoxyd: R_f (100) 0,38

10. H-D-Ser-Tyr-Gly-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-OH

163 mg geschütztes Tetracosapeptid-acetat werden in 3,2 ml 90%iger Trifluoressigsäure gelöst und während 25 Minuten bei 20° stehengelassen. Man verdünnt sodann mit etwa 15 ml Wasser, engt auf etwa 2 ml ein und lyophilisiert. Das Trifluoracetat des freien Tetracosapeptids wird zur Umwandlung in das Acetat in wenig Wasser gelöst und durch eine Säule (σ = 7,5mm;/⁹ = 16cm) von schwach basischem Ionenaustauscher (z. B. Merck Nr. II) in der Acetatform filtriert. Das Eluat wird auf ein kleines Volumen (etwa 2 ml) eingeengt, lyophilisiert und während 30 Minuten bei 40° im Hochvakuum nachgetrocknet. Man erhält chromatographisch und elektrophoretisch

eines D-Ser^l-Gly³-/3¹~²⁴-Corticotropin-acetat als wei-3es, amorphes Pulver.

Es zeigt im Dünnschichtchromatogramm an Alumiliumoxyd im System 101 einen Ä/-Wert von 0,56 ^!-"-Corticotropin unter gleichen Bedingungen: R/ = 0,51) und wandert bei der Elektrophorese (16 Volt/ :m) bei pH 6,1 (Pyridinacetatpuffer) innert 2 Stunden i.e cm gegen die Kathode.

Die Verbindung ist im Test nach D e s a u 11 e s und R i 11 e 1 mehr als zehnmal so wirksam wie ^-"-Corticotropin.

Beispiel 8

Man stellt eine Trockenampulle aus folgenden Komponenten her:

D-Ser¹-/3¹~²⁴-Corticotropin-

- Hexaacetat 0,5 mg

ZnSO₄ + 7 H,0 1,23 mg

Na₃PO₄ + 12 H₂O 1,38 mg

Mannit 40,0 mg

Vor Gebrauch wird der Inhalt des Trockenvials mit 1 ml destilliertem Wasser, enthalten in einer Lösungsimpulle, vermischt. Man erhält eine Suspension mit iinem pH von 7,6.

Beispiel 9

Man stellt eine Trockenampulle aus folgenden Komponenten her:

D-Ser¹-/3¹-²⁴-Corticotropin-

Hexaacetat 0,5 mg

ZnSO₄ + 7 H₂O 1,23 mg

Mannit 40,0 mg

and eine Lösungsampulle mit folgender Zusammensetzung der Lösung:

Na₃PO₄ + 12 H₂O 1,38 mg

Versene — Fe-3 0,1 mg

dest. Wasser ad 1,0 ml

Vor Gebrauch werden der Inhalt der Trockenlmpulle und der Lösungsampulle vermischt. Die irhaltene Suspension hat ein pH von 7,6.

Beispiel 10

Man stellt eine Lösungsampulle aus folgenden Komponenten her:

D-Ser¹-/3¹-²⁴-Corticotropin-

Hexaacetat 0,5 mg

Gelatine 280,0 mg

Phenol 5,0 mg

dest. Wasser ad 1,0 ml

Beispiel 11

Eine steril filtrierte wäßrige Lösung von D-Ser¹-i¹-²⁴-Corticotropin-Hexaacetat wird unter aseptischen Bedingungen mit Natrium-Polyphloretinphosphat und Natriumchlorid vermischt und in Vials abgefüllt und !yophilisiert, so daß ein Trockenvial erhalten wird, das folgende Komponenten enthält:

D-Ser¹-/?-¹-²⁴-Corticotropin-

Hexaacetat 0,5 mg

Natrium-Polyphloretinphosphat

(86,5 %ig) 23,20 mg

NaCl 12,28 mg

D OO3

Vor Gebrauch wird der Inhalt des Trockenvials mit 2 ml destilliertem Wasser, enthalten in einer Lösungsampulle, vermischt.

Beispiel 12

Man stellt eine Suspension aus folgenden Komponenten her:

D-Ser¹-i?¹-²⁴-Corticotropin-

hexaacetat 1,0 mg

ίο ZnCl₂ 10,5 mg

Na₂HPO₄ 1,7 mg

Benzylalkohol 17,0 mg

NaCl 2,5 mg

NaOH ad pH 8,0 Aqua dest. ... ad 2 ml

Beispiel 13

2,0 g Poly-L-glutaminsäure mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 11 000 werden in etwa 5,7 ml 10%iger Natronlauge gelöst, so daß das pH der Lösung 7,4 beträgt. In dieser Lösung werden 5,0 mg D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophylglycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L - arginyl - L - arginyl - L - prolyl - l - valyl - L - lysyl - L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin-hexaacetat (D-Ser¹-/3¹~²⁴-Corticotropin-hexaacetat) und 0,2 mg Merthiolat aufgelöst und mit destilliertem Wasser auf 10 ml aufgefüllt. Die Lösung wird steril filtriert. Sie enthält pro ml:

D-Ser¹-^¹~²⁴-Corticotropin 0,5 mg

Poly-L-glutaminsäure 200,0 mg

Natronlauge bis pH 7,4

Merthiolat 0,02 mg

Aqua dest ad 1,0 ml

B e i s ρ i el 14

2,0 g Poly-L-glutaminsäure werden in etwa 5,7 ml 10%iger Natronlauge gelöst, so daß das pH der Lösung 7,4 beträgt. In dieser Lösung werden 5,0 mg D-Ser¹-/3¹~²⁴-Corticotropin-hexaacetat und 0,2 mg Merthiolat aufgelöst. Zu dieser Lösung wird 1 ml einer salzsauren Zinkchloridlösung (pH 2,8) mit 5,2 mg Zinkchlorid pro ml gegeben. Das pH wird mit Natronlauge auf 7,8 eingestellt und mit destilliertem Wasser auf ein Endvolumen von 10 ml aufgefüllt.

B e i s ρ i e 1 15

2,0 g Poly-L-glutaminsäure werden in etwa 5,7 ml 10%iger Natronlauge gelöst, so daß das pH der Lösung 7,4 beträgt. In dieser Lösung werden 5,0 mg D-Ser¹-/3-¹~²⁴-Corticotropin-hexaacetat und 0,2 mg Merthiolat aufgelöst. Zu dieser Lösung werden 1 ml einer salzsauren Lösung (pH 2,8) enthaltend 5,2 mg Zinkchlorid und 0,85 mg Dinatriumphosphat (wasserfrei) gegeben. Das pH wird mit Natronlauge auf 7,8 eingestellt. Man füllt mit Wasser auf ein Volumen von 10 ml auf.

Beispiel 16

In gleicher Weise wie in den Beispielen 8 bis 15 können Präparate hergestellt werden, die als aktives Peptid das D-AIa^l-/3¹-²⁴-Corticotropin (beschrieben im Beispiel 2), oder D-Ser^-^-Corticotropin (beschrieben im Beispiel 3) oder D-Ser^Orn¹⁷·¹⁸-/?¹-²⁴-Corticotropin (beschrieben im Beispiel 4) oder D-Ser¹- ^-"-Corticotropin-amid (beschrieben im Beispiel 5) oder D-Ser^l-/?^l-³⁹-Corticotropin (beschrieben im Beispiel 6) oder D-Ser¹,Gly³-^¹-²⁴-Corticotropin (beschrieben im Beispiel 7) enthalten.

Claims (7)

Patentansprüche:

1. ACTH-wirksame Peptide mit 16- bis 39-Aminosäuren und zum N-terminus hin vollständiger Sequenz der natürlichen Corticotropine, in der jedoch eine oder mehrere der Aminosäuren in den Stellungen 1 bis 5, 17, 18 und 25 in bekannter Weise gegen andere !.-«-Aminosäuren ausgetauscht sein können, ihre C-terminalen Amide sowie Säureadditionssalze und Komplexe dieser Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, daß sie als erste Aminosäure eine Aminosäure mit D-Konfiguration aufweisen.

2. Peptide mit einer Kettenlänge von 20- bis 25-Aminosäuren, die sich von Peptiden mit der Sequenz der ersten 20- bis 25-Aminosäuren des ACTH dadurch unterscheiden, daß die Arginin¹⁷'¹⁸-Reste durch Omithinreste und/oder der Serin³-Rest durch Glycyl und/oder der Glutamyl⁵-Rest durch Glutaminyl und der Ser^Rest durch D-Serin, D-Alanin, D-Prolin oder D-Threonin ersetzt sind.

3. Peptide gemäß Anspruch 1 oder 2, in denen die erste Aminosäure D-Serin ist.

4. Das Tetracosapeptid der Formel D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-ornithyl-L-ornithyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin und die entsprechende Verbindung, die statt des Glutamylrestes den Rest des Glutamins aufweist, ihre Säureadditionssalze und Komplexe.

5. D-Ser¹-/3¹~³⁹-Corticotropin und die entsprechende Verbindung, die statt des GlutamyP-Restes den Rest des Glutamins aufweist, ihre Säureadditionssalze und Komplexe.

6. Komplexe der Peptide gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 mit Zinkphosphat, Zinkpyrophosphat und/oder Zinkhydroxyd.

7. Verfahren zur Herstellung neuer Peptide mit ACTH-Wirkung, dadurch gekennzeichnet, daß man in an sich bekannter Weise ACTH-wirksame Peptide mit 16- bis 39-Aminosäuren und zum N-Terminus hin vollständiger Sequenz der natürlichen Corticotropine, in der jedoch eine oder mehrere der Aminosäuren in den Stellungen 1 bis 5, 17, 18 und 25 in bekannter Weise gegen andere L-a-Aminosäuren ausgetauscht sein können, und die als erste Aminosäure eine Aminosäure mit D-Konfiguration aufweisen, oder ihre C-terminalen Amide aus den entsprechenden geschützten Peptiden herstellt und, wenn erwünscht, die Verbindungen in ihre Säureadditionssalze oder Komplexe überführt.