DE1543502B2

DE1543502B2 - Neue peptide mit acth-wirkung und diese enthaltende arzneimittel

Info

Publication number: DE1543502B2
Application number: DE1966C0040617
Authority: DE
Inventors: Beat Dr Riehen; Kappeier Heini Dr Grand-Lancy; Riniker Bernhard Dr Reinach; Rittel Werner Dr Basel; Iselin (Schweiz)
Original assignee: Ciba Geigy AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 1965-11-12
Filing date: 1966-11-08
Publication date: 1977-11-24
Also published as: BR6684474D0; NL6615964A; BE689574A; NL149156B; GB1164618A; SE357556B; FI47759C; FI47759B; OA104E; NO126364B; CS158191B2; DE1543502A1; FR6134M; JPS4837031B1

Description

20

Im Hauptpatent DT-PS 14 93 559 sind Peptide beschrieben, die sich durch eine verstärkte ACTH-Wirkung auszeichnen und die sich von den bekannten Peptiden mit ACTH-Wirkung dadurch unterscheiden, daß sie am Aminoende als erste α-Aminosäure eine D-Aminosäure aufweisen.

Als Peptid mit sehr guter ACTH-Wirkung ist im Hauptpatent das

H-D-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-

Val-Lys-Val-Tyr-Pro-OH

(D-Ser'-jS¹ -^-Corticotropin)
beschrieben.

In weiterer Ausgestaltung des Hauptpatents wurde nun gefunden, daß das entsprechende Peptid, das an Stelle der Argininreste in 17,18-Stellung Lysinreste enthält, eine etwa gleich gute adrenocroticotrope Wirkung aufweist. Das neue Peptid, D-Ser¹, Lys¹⁷· ¹⁸-^¹ -^-Corticotropin, läßt sich leichter herstellen als D-Ser¹-/?¹-^-Corticotropin, weil es die Argininreste in den Stellungen 17, 18, die wegen der Guanidinogruppe in der Seitenkette die Herstellung des Peptids erschweren, nicht enthält.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher das Tetracosapeptid der Formel

D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-

L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-

L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-Iysyl-

L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-lysyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-

L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin

sowie die entsprechende Verbindung, die statt des Glutamylrestes den Rest des Glutamins aufweist, ihre C-terminalen Amide, Säureadditionssalze und Komplexe, und diese enthaltende Arzneimittel.

Als Säureadditionssalze sind besonders Salze von therapeutisch anwendbaren Säuren, wie Salzsäure, Essigsäure, vor allem aber schwerlösliche Salze, wie Sulfate, Phosphate oder Sulfonate, zu nennen, aber auch Salze von anderen anorganischen Säuren, wie Halogenwasserstoffsäuren, beispielsweise Bromwasserstoffsäure, Perchlorsäure, Salpetersäure oder Thiocyansäure, oder organischen Säuren, wie Ameisensäure, Propionsäure, Glykolsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Oxalsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Apfelsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Ascorbinsäure, Hydroxymaleinsäure, Dihydroxymaleinsäure, Benzoesäure, Phenylessigsäure, 4-Aminobenzoesäure, 4-Hydroxybenzoesäure, Anthranilsäure, Zimtsäure, Mandelsäure, Salicylsäure, 4-Amino-salicylsäure, 2-Phenoxybenzoesäure, 2-Acetoxybenzoesäure, Methansulfonsäure Äthansulfonsäure, Hydroxyäthansulfonsäure, Benzolsulfonsäure, p-Toluolsulfonsäure, Naphthalinsulfonsäure oder Sulfanilsäure.

Unter Komplexen sind die komplexartigen, in ihrer Struktur noch nicht abgeklärten Verbindungen zu verstehen, von denen bekannt ist, daß sie beim Zusatz gewisser anorganischer oder organischer Stoffe zu adrenocorticotrop wirksamen Peptiden entstehen. Von diesen sind vor allem diejenigen hervorzuheben, die diesen Peptiden eine verlängerte Wirkung verleihen. Solche anorganische Stoffe sind Verbindungen, die sich von Metallen, wie Calcium, Magnesium, Aluminium, Cobalt und insbesondere von Zink ableiten, vor allem schwerlösliche Salze, wie Phosphate und Pyrophosphate sowie Hydroxyde dieser Metalle, und ganz besonders Phosphate, Pyrophosphate und Hydroxyde des Zinks. Organische Stoffe, die eine Verlängerung der Wirkung hervorrufen, sind beispielsweise nicht antigene Gelatine, z. B. Oxypolygelatine, und Carboxymethylcellulose, ferner Polyvinylpyrrolidon, Sulfonsäure- oder Phosphorsäureester von Alginsäure, Dextrinsäure, Polyphenolen und Polyalkoholen, vor allem Polyphloretinphosphat und Phytinsäure, sowie Polymerisate und Copolymerisate von Aminosäuren, z. B. Protamin, und insbesondere von Aminosäuren, die einen überwiegenden Anteil an sauren α-Aminosäuren, wie Glutaminsäure oder Asparaginsäure der L-, D- oder D,L-Konfiguration, aufweisen. Diese Polymerisate weisen den in der DT-AS 14 93 559, Spalte 6, Zeile 53 bis Spalte 7, Zeile 16, angegebenen Aufbau auf.

Die neuen Verbindungen besitzen, wie bereits erwähnt, eine wesentlich stärkere ACTH-Aktivität als die entsprechenden Verbindungen mit L-Konfiguration an der ersten Aminosäure. Sie sollen dementsprechend in der Human- und Veterinärmedizin verwendet werden, z. B. an Stelle des natürlichen Hormons.

Die neuen Peptide werden nach den für die Herstellung von Peptiden mit großer Kettenlänge bekannten Methoden hergestellt unter Verwendung einer D-Aminosäure als N-terminaler Aminosäure, wobei mindestens die a-Aminogruppe und Seitenkettenaminogruppen sowie die terminale Carboxylgruppe und eine gegebenenfalls vorhandene Seitenkettencarboxylgruppe geschützt sind. Dabei werden die Aminosäuren in der erwähnten Reihenfolge einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten verknüpft. Am Schluß der Synthese werden die Schutzgruppen in einer einzigen oder gegebenenfalls in mehreren Stufen abgespalten und, wenn erwünscht, die erhaltenen Verbindungen in ihre C-terminalen Amide, Säureadditionssalze oder Komplexe überführt.

Ein bevorzugtes Verfahren besteht darin, daß man das die ersten 3 Aminosäuren, z. B. H-D-Ser-Tyr-Ser-OH enthaltende Tripeptid (die abgekürzte Schreibweise bezieht sich auf L-Aminosäuren, wenn das D-nicht besonders bezeichnet ist), oder das außerdem die 4. Aminosäure enthaltende Tetrapeptid mit dem Heptapeptid bzw. Hexapeptid der folgenden Aminosäuren bis zur Aminosäure 10 kondensiert, vorzugsweise nach der Azidmethode, und dann das Decapeptid mit dem Tetradecapeptid der Aminosäuren 11 —24 kondensiert. Bei dieser Kondensation wird als Kupplungsmethode vorzugsweise die Carbodiimidmethode oder die Methode der aktivierten Ester, vor allem mittels des

p-Nitrophenylesters, verwendet. Im letzten Fall braucht der p-Nitrophenylester des Decapeptids nicht als solcher isoliert zu werden, sondern kann auch in der Kondensationsstufe selbst aus dem Decapeptid mit freier Carboxylgruppe, p-Nitrophenol und Dicyclohexylcarbodiimid gebildet werden. Das Decapeptid liegt also als oc-Aminogeschütztes Peptid mit freier Carboxylgruppe oder mit einer p-Nitrophenylestergruppe vor. Das Tetradecapeptid wird in Form eines Esters, vorzugsweise des tert-Butylesters, oder des ω-Amids verwendet. Die in den zu kondensierenden Peptidbruchstücken vorhandenen Seitenketten-Aminogruppen werden vorzugsweise durch die tert-Butyloxycarbonylgruppe, die Seitenkettencarboxylgruppen durch die tert-Butylestergruppe geschützt. Diese Schutzgruppen können in der letzten Stufe mit Trifluoressigsäure abgespalten werden.

Nach einem weiteren bevorzugten Verfahren wird das die ersten 4 Aminosäuren enthaltende Tetrapeptid H-D-Ser-Tyr-Ser-Met-OH mit dem Eicosapeptid der Aminosäuren 5—24 kondensiert. Bei dieser Kondensation wird als Kupplungsmethode vorzugsweise die Azidmethode verwendet. Die a-Aminogruppe des Tetrapeptidhydrazids bzw. -azids wird vorzugsweise durch die tert-Butyloxycarbonylgruppe geschützt. Das Eicosapeptid kann als freies Peptid oder als Ester, insbesondere tert-Butylester, oder als Pro²⁴-Amid vorliegen. Auch im Eicosapeptid werden die Seitenketten-Aminogruppen vorzugsweise durch die tert-Butyloxycarbonylgruppe, die Seitenkettencarboxylgruppe durch die tert-Butylestergruppe geschützt.

Nachdem man durch Kondensation der Peptidbruchstücke das Tetracosapeptid erhalten hat, dessen Λ-Aminogruppe und Seitenketten-Aminogruppen durch die tert.-Butyloxycarbonylgruppe und dessen Endcarboxylgruppe und Seitenkettencarboxylgruppe durch die tert-Butylestergruppe geschützt sind, können alle diese Schutzgruppen gleichzeitig durch saure Hydrolyse, beispielsweise mit Trifluoressigsäure, abgespalten werden. Liegt die Endcarboxylgruppe nicht als tert-Butylestergruppe, sondern als Amidgruppe vor, so werden Peptidamide erhalten.

Die verfahrensgemäß erhaltenen Peptide können in Form von pharmazeutischen Präparaten Verwendung finden. Diese enthalten die Peptide in Mischung mit einem für die enterale oder parenterale Applikation geeigneten pharmazeutischen, organischen oder anorganischen Trägermaterial. Für dasselbe kommen solche Stoffe in Frage, die mit den Polypeptiden nicht reagieren, wie z.B. Gelatine, Milchzucker, Glukose, Kochsalz, Stärke, Magnesiumstearat, Talk, pflanzliche öle, Benzylalkohol, Gummi, Polyalkylenglykole, Vaseline, Cholesterin oder andere bekannte Arzneimittelträger. Die pharmazeutischen Präparate können z. B. als Lyophilisat oder in flüssiger Form als Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen vorliegen. Gegebenenfalls sind sie sterilisiert und bzw. oder enthalten Hilfsstoffe, wie Konservierungs-, Stabilisierungs-, Netzoder Emulgiermittel.

Die Konzentration des Polymeren in den pharmazeutischen Präparaten hängt von der Löslichkeit des betreffenden Salzes und von der Viskosität ab. Das Polymere soll in den Präparaten in gelöster Form vorliegen können und injizierbar sein.

Die Konzentration des adrenocorticotrop wirksamen Peptids wird so gewählt, daß das Präparat beispielsweise pro ml 10—501. E. aufweist.

Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen beschrieben. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben.

Die dünnschichtchromatographischen Systeme werden wie folgt bezeichnet.

System 43A: tert.-Amylalkohol-Isopropanol-Wasser

(100:40:10)
System 45: sec-Butanol 3% wäßriges Ammoniak

(100:44)
System 100: Äthylacetat-Pyridin-Eisessig-Wasser

(62:21 :6 :11)
System 101: n-Butanol-Pyridin-Eisessig-Wasser

(30 :20 :6 :24)

Folgende Abkürzungen werden verwendet:

Z = Carbobenzoxy

BOC = tert-Butyloxycarbonyl

tBu = tert-Butyl.

Beispiel 1
I)Z · Lys(BOC)-Lys(BOC) · NHNH₂

10 g Z · Lys(BOC)-Lys(BOC) · OCH₃ (hergestellt aus Z · Lys-(BOC)-OH + H · Lys(BOC)-OCH₃ (mittels Dicyclohexylcarbodiimid) werden in 160 ml Methanol gelöst und mit 7,8 ml Hydrazinhydrat versetzt. Man läßt die klare Lösung während 24 Stunden bei 25° stehen und engt dann auf ca. ^xlz des ursprünglichen Volumens ein. Beim Versetzen mit 200 ml Wasser fällt ein öliger Niederschlag aus, der sich beim Abkühlen und Zerreiben verfestigt und pulverisiert werden kann. Man nutscht ab, wäscht mit Wasser und trocknet das Rohprodukt. Es wird durch einmaliges Umkristallisieren aus Methanol-Essigester-Petroläther gereinigt und weist dann einen F. von 118—119,5° C auf. Auf Silicagel-Dünnschichtplatten werden folgende Rf-Werte erhalten:

Rf (43 A) =0,40

Rf (Chloroform-Methanol = 9:1) = 0,75

2) Z · Lys(BOC)-Lys(BOC)-Pro-OH

1,87 g Z · Lys(BOC)-Lys(BOC) · NHNH₂ werden in 15 ml frisch destilliertem Dimethylformamid gelöst und auf -25° C abgekühlt. Dazu tropft man langsam 2,07 ml 4,35 η-Salzsäure und anschließend 0,66 ml 5 n-Natriumnitritlösung.

Man rührt während 10 Minuten bei -10°C und gibt dann eine Lösung von 692 mg L-Prolin in 4,2 ml Dimethylformamid-Wasser (2:1) zu. Schließlich werden noch bei -10° C 1,82 ml Triäthylamin zugetropft und dann die Reaktionslösung über Nacht bei 0°C und während weiterer 2 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Man engt sodann im Hochvakuum auf ein Volumen von ca. 4 ml ein und versetzt den klebrigen Rückstand mit 25 ml Wasser. Durch Abkühlen auf 0°C und Zerreiben kann er pulverisiert werden. Man nutscht ab, wäscht mit wenig Wasser und trocknet im Hochvakuum bei 40⁰C. Zur Reinigung des nicht kristallisierbaren Rohproduktes wird eine multiplikative Verteilung nach Craig im Lösungsmittelsystem

Methanol-Puffer-Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff (35 :13 :15 :15) (Puffer = 28,5 ml Eisessig + 19,25 g Ammoniumacetat in 960 ml Wasser) mit Phasenvolumina von je 10 ml durchgeführt. Nach 220 Stufen isoliert man aus den Verteilungselementen Nr. 49—73 iV-max = 61; K. = 0,39) durch Einengen zur Trockne und Wegsublimieren des Ammoniumacetates chromatogra-

phisch reines, jedoch amorphes Tripeptidderivat vom F. ca. 70—80⁰C. Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel werden folgende Rf-Werte erhalten:

Rf (Chloroform-Methanol	= 9:1)	= 0,19
Rf (43 A)		= 0,29
Rf (45)		= 0,52

3) Z · LyS(BOC)-LyS(BOC)-PrO-VaI-LyS(BOC)-

Val-Tyr-Pro · OtBu ■■:··, .0; ,-■:·-.;,-;

2,4 g Z- Lys(BOC)-Lys(BOC)-Pro · OH und 3,12 g H · Val-Lys(BOC)-Val-Tyr-Pro-OtBu werden in 30 ml absolutem Chloroform gelöst. Man gibt bei 0⁰C 0,845 g Dicyclohexylcarbodiimid zu, rührt während 1 Stunde bei 0⁰C und läßt dann während 30 Stunden bei 25° C stehen. Der ausgeschiedene kristalline Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert und mit ein wenig Essigester gewaschen. Zum Filtrat gibt man 150 ml Essigester und extrahiert die organische Phase bei 0⁰C dreimal mit je 30 ml 3%iger Weinsäurelösung zur Entfernung des überschüssigen Pentapeptids. Man wäscht noch mehrmals mit Wasser bis zur neutralen Reaktion und dampft dann zur Trockene ein. Zur Abtrennung von lipophilen Verunreinigungen löst man den Rückstand in 10 ml Methanol und 20 ml Essigester und fällt das Octapeptid durch Zugabe von 120 ml Petroläther als schmierige Masse aus, die im Vakuum bei 40° C getrocknet wird. Das so erhaltene Rohprodukt (3,1 g) wird zur endgültigen Reinigung einer Craig-Verteilung im System

Methanol-Puffer-Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff
(30 :10 :3 :30) (Puffer wie unter 2) angegeben) über 225 Stufen mit Phasenvolumina von je 10 ml unterworfen. Das chromatographisch einheitliche Octapeptidderivat wird beim Einengen des Inhaltes der Elemente Nr. 65-96 (/Wr =78; K. = 0,53) zur Trockene und Wegsublimieren des Ammoniumacetates im Hochvakuum als weißes amorphes Pulver vom F. ca. 130—140°C erhalten. Es weist auf Silicagel folgende Rf-Werte auf:

Rf (43 A)

Rf (Chloroform-Methanol = 9

Rf (Benzol-Aceton = 1:1)

1)

= 0,74
= 0,54
= 0,33

tropfenweise unter Rühren mit 3,4 ml 2,115 n-Salzsäure und dann mit 0,378 ml 5 n-Natriumnitritlösung versetzt. Die klare Lösung wird während 15 Minuten bei — 10⁰C weitergerührt und dann mit einer auf —5° C vorgekühlten Lösung von 1,313 g des oben beschriebenen Octapeptidderivates in 4 ml Dimethylformamid versetzt. Man spült noch' mit 1 ml Dimethylformamid nach und tropft dann langsam bei -5⁰C 1,05 ml Triäthylamin zu. Das Reaktionsgemisch wird noch während 30 Minuten gerührt und dann während 15 Stunden bei 0°C stehengelassen. Schließlich wird bis zur Bildung eines viskosen Öles konzentriert und daraus durch Zugabe von 20 ml Wasser eine schmierige Masse ausgefällt. Diese wird unter Erwärmen in 20 ml Methanol wieder gelöst und das Peptid durch Zugabe von 30 ml Wasser abermals ausgefällt Beim Kühlen auf 0°C und Zerreiben erhält man eine pulverige Aufschlämmung, die filtriert; mit Wasser gewaschen und getrocknet wird. Dieses Rohprodukt wird zur Reinigung einer Craig-Verteilung im System Methanol-Puffer-Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff (60 :20 :3 :60) (Puffer wie unter 2) angegeben) mit Phasenvolumina von je 20 ml unterworfen. Nach 218 Stufen isoliert man aus den Elementen Nr. 105—134 (\L_max = 121; K. = 1,25) durch Einengen zur Trockene und Absublimieren des Ammoniumacetates im Hochvakuum chromatographisch einheitliches geschütztes Tetradecapeptid als weißes amorphes Pulver vom F. ca. 180—190⁰C. Es weist auf Silicagel folgende Rf-Werte auf:

Rf (43 A) =0,80

Rf (Chloroform-Methanol = 9:1) = 0,49

4) H · LyS(BOC)-LyS(BOC)-PrO-VaI-LyS(BOC)-Val-Tyr-Pro-OtBu

1,46 g Z- LyS(BOC)-LyS(BOC)-PrO-VaI-LyS(BOC)-Val-Tyr-Pro-OtBu werden in 40 ml Methanol nach Zugabe von 300 mg 10%iger Palladiumkohle in einer Schüttelente mit Kohlendioxyd-Absorption hydriert. Die Wasserstoffaufnahme ist nach 20 Min. bereits beendet. Nach 1 Stunde wird der Katalysator abfiltriert, mit Methanol nachgespült und das Filtrat zur Trockene eingedampft Man erhält in quantitativer Ausbeute das chromatographisch einheitliche decarbobenzoxylierte Octapeptidderivat als weißes amorphes Pulver vom F. ca. 110—120⁰C. Es weist im Dünnschichtchromatogrammauf Silicagel folgende Rf-Werte auf:

Rf (43 A) =0,53

Rf (Chloroform-Methanol = 9:1) = 0,34

5) Z · Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-

LyS(BOC)-LyS(BOC)-LyS(BOC)-PrO-VaI-

Lys(BOC)-Val-Tyr-Pro-OtBu

1,98 g Z-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-

Lys(BOC) · NHNH₂ werden in 22 ml absolutem Dimethylformamid gelöst und nach Abkühlen auf -25° C 6)H-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr-Pro-OtBu

1,66 g Z · Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-

LyS(BOC)-LyS(BOC)-LyS(BOC)-PrO-VaI-LyS(BOC)-Val-Tyr-Pro-OtBu werden in 40 ml Methanol mit 300 mg Palladiumkohle (10% Pd) wie üblich hydriert. Beim Einengen der .filtrierten Hydrierlösung zur Trockene erhält man direkt das chromatographisch einheitliche Produkt (1,49 g) als amorphes Pulver, das unscharf bei ca. 175—190⁰C schmilzt Es weist auf Silicagel folgende Rf-Werte auf:

'■Rf (43 A) =0,41

Rf (Chloroform-Methanol = 9 :1) =0,24

7) BOC · D-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu(OtBu)-His-

Phe-Arg-Try-Gly-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-

LyS(BOC)-LyS(BOC)-LyS(BOC)-LyS(BOC)-PrO-

Val-Lys(BOC)-Val-Tyr-Pro-OtBu

378 mg BOC-D-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu(OtBu)-His-Phe-Arg-Try-Gly-OH und 451 mg H-Lys(BOC)-Pro-

VaI-GIy-LyS(BOC)-LyS(BOC)-LyS(BOC)-LyS(BOC)-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr-Pro · OtBu werden in 4 ml absolutem Pyridin suspendiert und nach Zugabe von 0,15 ml Wasser und 0,32 ml In-Salzsäure während 10 Minuten bei 5O⁰C gerührt Zur trüben Suspension gibt man dann 145 mg Dicyclohexylvarbodiimid zu und nach 3 Stunden nochmals eine gleich große Menge. Man rührt noch während weiterer 3 Stunden bei 50⁰C und läßt dann über Nacht bei 0⁰C stehen. Der ausgeschiedene Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert und 3 mal mit je 0,8 ml 9O°/oigem Pyridin nachgewaschen. Das Filtrat wird mit 45 ml Benzol versetzt, wobei ein pulveriges Rohprodukt ausfällt, das abfiltriert und bei 45° C

getrocknet wird. Durch Umfallen aus Methanol-Benzol-Petroläther wird der größte Teil der lipophilen Verunreinigungen abgetrennt, worauf die endgültige Reinigung mittels einer Craig-Verteilung erfolgt im Lösungsmittelsystem Methanol-Puffer-Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff (10:3:17:5:4) (Puffer wie unter 2) angegeben) über 300 Stufen, mit Phasenvolumina von je 10 ml. Aus den Verteilungselementen Nr. 51—85 i\imax"= 67; K. = 0,29) isoliert man durch Einengen zur Trockene und Wegsublimieren des Ammoniumacetates bei 40⁰C im Hochvakuum 445 mg chromatographisch reines geschütztes Tetracosapeptidacetat als amorphes Pulver vom F. ca. 205—210⁰C (Zersetzung). Es weist auf Silicagel folgende Rf-Werte auf:

Rf (43 A)	= 75 :25)	= 0,63
Rf(IOO)	= 0,60
Rf (Chloroform-Methanol	= 0,42

8) H ■ D-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-GIy-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Lys-Lys-

Pro-Val-Lys-Val-tyr-Bro-OH (D-Ser¹-Lys^I7-¹⁸-j3^I-^M-Corticotropin)

370 mg geschütztes Tetracosapeptidderivat werden in 7,4 ml 90%iger Trifluoressigsäure gelöst und während 45 Minuten bei 25° C stehengelassen. Die Lösung wird dann auf ca. 2 ml eingeengt, mit 20 ml Wasser verdünnt, nochmals eingeengt und zuletzt lyophilisiert. Man erhält das Trifluoracetat des freien Tetracosapeptids, das zur Umwandlung in das Acetat in wenig Wasser gelöst und durch eine Säule (0 = 12,5 mm; l = 15cm) von schwach basischem Ionenaustauscher in der Acetatform filtriert wird. Das Eluat wird auf ca. 3 ml konzentriert, lyophilisiert und im Hochvakuum bei 40⁰C nachgetrocknet. \ Man erhält 316 mg chromatographisch und elektrophoretisch einheitliches Acetat des ; D-Ser¹-Lys^I7;!⁸-j9'-²⁴-Corticotropins als weißes, amorphes Pulver. ;

Im Dünnschichtchromatogramm an Aluminiumoxid im System 101 weist die Verbindung einen Rf-Wert von 0,40 auf. (/^-^-Corticotropin unter gleichen Bedingungen 0,51). Sie wandert bei der Elektrophorese (16Vol./cm) bei pH 6,1 (Pyridinacetatpuffer) in 2 Stunden 8,4 cm gegen die Kathode. Die Verbindung (bezeichnet als II) wird in bezug auf ihre adrenocorticotrope Wirkung im Test nach Desaulles und R i 11 e 1, Memoirs of the Soc. for Endrocrinology, Nr. 17 (Cambridge, at the University Press, 1968), S. 124—137, gegen D-Ser'-^'-^-Corticotropin (Verbindung I), vgl.

DT-PS 14 93 559, Beispiel 1, geprüft.

In der Tabelle ist die aus den Nebennieren 24 Stunden vorher hypophysektomierter Ratten nach subcutaner Injektion des Peptids ausgeschiedene Menge Corticosteron angegeben.

Tabelle

Plasma-Corticosteron mg/ml nach einmaliger s. c-Applikation

Verbinbindung

Dosis
mg/kg

1/2 Std.

1 Std.

l'/2.Std.

2 Std.

4 Std.

6 Std.

8 Std.

0,1
0,3

0,03
0,3

24.6 ±4,5

36.7 ±2,8

38,5 ±4,6
28,5 ±4,0

25,1 ±3,5 39,8 ±6,5

29,3 ±3,0 34,6 ±6,9

27,0 ±6,6 32,0 ±4,4

25,4 ±6,3 30,0 ±7,3 27,4 ±2,3

32,6 ±3,5
40,3 ±5,5

4,7 ±2,7

8,6 ±2,5
20,7 ±3,2

5,4 ±2,7 233 ±7,8

Die Tabelle zeigt, daß bei einer Dosis von 0,3 mg/kg 40 und eine Lösungsampulle mit folgender Zusammenset-

srninniinrr TT Itαϊ nroUtic/^n (τΙαίΛηοιη ΛΑ/ι»·1^ίΐηrrcmovi. minfr/iot* I nciinrr· - ' . _■.... j _ . - - . '·■-■.·■■ _f ■ ;■

Verbindung II bei praktisch gleichem Wirkungsmaximum erheblich länger wirksam ist. Bei einer Dosis von 0,03 mg/kg ist Verbindung II etwa gleich stark und gleich lange wirksam wie Verbindung I in einer Dosis von0,lmg/kg. ;■

: Beispiel 2 ; ■-

.....; Herstellung pharmazeutischer Zubereitungen ^;, _: 1) Man stellt eine Trockenampulle aus folgenden

Komponenten her: ;■ '	0,5 mg
D-Ser'-LysW-jS'-^-Corticotropin-	1,23 mg
Hexaacetat	1,38 mg
ZnSO₄ + 7H₂O	40,0 mg
Na₃PO₄ + 12H₂O
Mannit

zung der Lösung:

Na₃PO₄ + 12 H₂O 1,38 mg '^

■ Natrium-N,N-bis-(2-hydroxyäthyl)- ' . '

glycinat 0,1 mg

Dest. Wasser ad. 1,0 ml

Vor Gebrauch werden der Inhalt der Trockenampulle und der Lösungsampulle .vermischt. Die erhaltene Suspension hat ein pH von 7,6. ■ ^; ι "

3) Man stellt eine Lösungsampulle aus folgenden Komponenten her: 'i ~ s.. ■ ^: ! ;·.,;:;

55

D-Ser'-Lys¹⁷·¹⁸-/?¹	-^-Corticotropin-	0,5 mg
Hexaacetat	......	280,0 mg
Gelatine		5,0 mg
Phenol		1,0 ml
Dest. Wasser ad.

'Vor Gebrauch wird der Inhalt der Trockenampulle mit 1 ml destilliertem Wasser, enthalten in einer Lösungsampulle, vermischt. Man erhält eine Suspension mit einem pH von 7,6.

2) Man stellt eine Trockenampulle aus folgenden Komponenten her:

D-Ser'-Lys'W-jS'-^-Corticotropin-

Hexaacetat
ZnSO₄ + 7 H₂O
Mannit

0,5 mg 1,23 mg 40,0 mg

60

65 ü 4) Eine steril filtrierte wäßrige Lösung von D-Ser¹-Ly_Si7,i8.j3.i-24.c_orticotropin-Hexaacetat wird unter asepetischen Bedingungen mit Natrium-Polyphloretinphosphat und Natriumchlorid vermischt und in Ampullen abgefüllt und lyophilisiert, so daß eine Trockenampulle erhalten wird, die folgenden Komponenten enthält

D-Ser'-Lys'^-jS'-^-Corticotropin-Hexaacetat 0,5 mg

Natrium-Polyphloretinphosphat (86,5%ig) 23,20 mg

NaCl 12,28 mg

709 547/10

Vor Gebrauch wird der Inhalt der Trockenampulle mit 2 ml destilliertem Wasser, enthalten in einer Lösungsampulle, vermischt.

5) Man stellt eine Suspension aus folgenden Komponenten her:

D-Ser'-Lys'^-jS'-^-Corticotropin-

Hexaacetat 1,0 mg

'ZnCl₂- ^: '■.■■"■■·' 10,5mg '

-Na₂HPO₄ ^: -^! 1,7 mg -

-Benzylalkohol '" 17,0mg

NaCl 2,5 mg
■ NaOH ad. pH 8,0

Aqua dest. ad. 2 ml

6) 2,0 g Poly-L-glutaminsäure mit einem mittleren Molekulargewicht von ca. 11 000 werden in ca. 5,7 ml lO°/oiger Natronlauge gelöst, so daß der pH der Lösung 7,4 beträgt. In dieser Lösung werden 5,0 mg D-Ser¹-Lys^17l8-j9'-²⁴-Corticotropin-hexaacetat und 0,2 mg Thiomersal aufgelöst und mit destilliertem Wasser auf 10 ml aufgefüllt. Die Lösung wird steril filtriert. Sie enthält pro ml:

D-Ser'-Lys'^-jS'-^-Corticotropin-	0,5 mg
Hexaacetat	200,0 mg
Poly-L-glutaminsäure
Natronlauge bis pH 7,4	0,02 mg
Thiomersal	1,0 ml
Aqua dest.

7) 2,0 g Poly-L-glutaminsäure werden in ca. 5,7 ml lO°/oiger Natronlauge gelöst, so daß der pH der Lösung 7,4 beträgt. In dieser Lösung werden 5,0 mg D-Ser¹-Lys^l7'¹⁸-j9'-²⁴-Corticotropin-hexaacetat und 0,2 mg Thiomersal aufgelöst. Zu dieser Lösung wird 1 ml einer salzsauren Zinkchloridlösung (pH 2,8) mit 5,2 mg Zinkchlorid pro ml gegeben. Der pH wird mit Natronlauge auf 7,8 eingestellt und mit destilliertem Wasser auf ein Endvolumen von 10 ml aufgefüllt.

8) 2,0 g Poly-L-glutaminsäure werden in ca. 5,7 ml lO°/oiger Natronlauge gelöst, so daß der pH der Lösung

7.4 beträgt. In dieser Lösung werden 5,0 mg D-Ser¹-Lys¹⁷'¹⁸-j3'-²⁴-Corticotropin-hexaacetat und 0,2 mg Thiomersal aufgelöst. Zu dieser Lösung werden 1 ml einer salzsauren Lösung (pH 2,8), enthaltend 5,2 mg Zinkchlorid und 0,85 mg Dinatriumphosphat (wasserfrei), gegeben. Der pH wird mit Natronlauge auf 7,8 eingestellt. Man füllt mit Wasser auf ein Volumen von lOmlauf. ,.·-" ν

9) Man löst 11,12 mg Eisessig, 1,21 mg Natriumacetat,

2.5 mg Natriumchlorid und 2,0 mg D-Ser'-Lys¹⁷·¹⁸-^-²⁴-Corticotropin-hexaacetat in 0,7 ml destilliertem Wasser und füllt mit destilliertem Wasser auf 1 ml auf. Die Lösung wird bei 120⁰C 20 Minuten autoklaviert. Der pH ist nach der Sterilisation 3,7.

10) Man löst in 0,7 ml physiologischer Natriumchloridlösung 0,5 mg D-Ser'-Lys'W-jS'-^-Corticotropinhexaacetat und säuert die Lösung mit 0,1 n-Salzsäure auf pH 3,2 an. Mit destilliertem Wasser wird auf 1 ml aufgefüllt und wie in Beispiel 1 hitzesterilisiert.

11) In 0,8 ml destilliertem Wasser werden 7,05 ml Glycin und 6,08 mg Natriumchlorid gelöst und 0,055 ml 0,1 n-HCl zugefügt. Anschließend wird 1,0 mg D-Ser¹-Lys^l718-j3'-²⁴-Corticotropin-hexaacetat in der Lösung aufgelöst und mit destilliertem Wasser auf 1,0 ml aufgefüllt.

Die Lösung wird auf übliche Weise filtriert, in Ampullen abgefüllt und bei 120⁰C 20 Minuten autoklaviert.

Der pH beträgt 3,6.

12) In 0,8 ml destilliertem Wasser wird eine Lösung von 10,16 mg Zitronensäure (mit 1 Mol Kristallwasser), 0,097 ml 1 n-Natronlauge, 3,54 mg Natriumchlorid und 0,51 ml 0,1 η-Salzsäure hergestellt. In dieser Lösung werden 4,0mg D-Ser'-Lys^I7'^I8-j3'-²⁴-Corticotropin-hexaacetat aufgelöst und mit destilliertem Wasser aus 1,0 ml aufgefüllt. :,-... ■■.:

Der pH beträgt 3,6. .

13) Man stellt eine Suspension aus folgenden Komponenten her:

D-Ser'-Lys^l7'^l8-j9'-²⁴-Corticotropin-

Hexaacetat 1,0 mg

ZnCl₂ 5,25 mg

Na₂HPO₄-2 H₂O 1,05 mg

NaCl 2,0 mg

Benzylalkohol 10,0 mg
NaOH ad. pH 8,3

Dest. Wasser ad. 1,0 ml

D-Ser'-Lys'^-ß'-^-Corticotroin-	1,0 mg
Hexaacetat	6,30 mg
ZnCl₂	1,26 mg
Na₂NPO₄ · 2 H₂O	1,5 mg
NaCl	10,0 mg
Benzylalkohol
NaOH ad. pH 8,3	1,00 ml
Dest. Wasser ad.

14) Man stellt eine Suspension aus folgenden Komponenten her:

15) Man stellt 0,5 ml einer salzsauren Lösung von 0,5 mg D-Ser'-Lys'^-ß'-^-Corticotropin-hexaacetat, 5,25 mg ZnCl₂, 1,05 mg Na₂HPO₄ · 2 H₂O und 2,0 mg NaCl vom pH 3,0 her und gibt die Lösung zu 0,5 ml einer wässerigen Lösung von 10 mg Benzylalkohol, die so viel Natronlauge enthält, daß eine Suspension vom pH 8,3 erhalten wird. ;

16) 5 mg Poly-L-glutaminsäure vom mittleren Molekulargewicht 39 600 werden in 5 ml 0,1 n-Natronlauge gelöst. Man filtriert die Lösung, gibt eine Lösung von 2,5 mg D-Ser'-Lys'^-jS'-^-Corticotropin-hexaacetat hinzu, säuert dann mit Essigsäure oder Salzsäure auf pH 4 an und füllt mit Wasser auf 10 ml auf. Dabei fällt ein Poly-L-glutaminsäure-D-Ser'-Lys'W-ß'-^-Corticotropin-Komplex feinverteilt aus. Die Suspension enthält pro ml 0,5 mg Poly-L-glutaminsäure und 0,25 mg D-Ser'-Lys'^-jS'-^-Corticotropin als Komplexverbindung.

17) 2,0 g Poly-L-glutaminsäure mit einem mittleren Molekulargewicht von ca. 39 600 werden in ca. 5,7 ml 10%iger Natronlauge gelöst, so daß der pH der Lösung 7,4 beträgt. In dieser Lösung werden dann 4,0 mg D-Ser'-LysW-lJ'-^-Corticotropin-hexaacetat und 0,2 mg Thiomersal aufgelöst und mit destilliertem Wasser auf IC ml aufgefüllt. Die Lösung wurde steril filtriert. Sie enthält pro ml:

D-Ser'-Lys'^-jS'-^-Corticotropin-	4,0 mg
Hexaacetat	200,0 mg
Poly-L-glutaminsäure
Natronlauge bis pH 7,4	0,02 mg
Thiomersal	1,0 ml
Aqua dest. ad.

Claims

Patentansprüche:

1. Das Tetracosapeptid der Formel
D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-

L-proIyl- L-valyl-glycyl- L-lysyl- L-lysyl-L-lysyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin

und die entsprechende Verbindung, die statt des Glutamylrestes den Rest des Glutamins aufweist, ihre C-terminalen Amide, Säureadditionssalze und Komplexe.

2. Zinkkomplexe der Peptide gemäß Anspruch 1.

3. Arzneimittel, enthaltend eine der Verbindungen gemäß Anspruch 1 als Wirkstoff.