NO126364B

NO126364B -

Info

Publication number: NO126364B
Application number: NO00165548A
Authority: NO
Inventors: Beat Iselin; Heini Kappeler; Bernhard Riniker; Werner Rittel
Original assignee: Ciba Geigy Ag
Priority date: 1965-11-12
Filing date: 1966-11-11
Publication date: 1973-01-29
Also published as: BE689574A; BR6684474D0; CS158191B2; SE357556B; NL149156B; FI47759B; DE1543502B2; FI47759C; FR6134M; GB1164618A; OA104E; NL6615964A; DE1543502A1; JPS4837031B1

Description

Tillegg til patent nr. 124.831

I patent nr. 124.831 er det beskrevet peptider som

utmerker seg ved en forsterket ACTH-virkning og som adskiller seg fra de kjente peptider med ACTH-virkning ved at de ved aminoenden som første a-aminosyre har en D-aminosyre.

Som peptid med meget god ACTH-virkning er det i

hovedpatentet omtalt H-D-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-

] 1-24 Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-OH (D-Ser -g cortikotropin).

Det er nå blitt funnet at det.tilsvarende peptid

som i stedet for argininrestene i 17,18-stilling inneholder lysin-

rester, har en omtrent like god adrenokorticotrop virkning. Det nye

11718 12^

peptid, D-Ser , Lys ' -$ -corticotropin, lar seg fremstille

lettere enn D-Ser -3 -corticotropin, •fordi det ikke inneholder argininrestene i stillingene 17,18, som på grunn av guanidinogruppene i sidekjeden vanskeliggjør peptidets fremstilling.

Oppfinnelsen vedrører altså en fremgangsmåte til fremstilling av nye peptider med øket og/eller forlenget ACTH-virkning, og med formel D-seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-metionyl-L-glutamyl (eller L-glutaminyl)-L-histidyl-L-fenylalanyl-L-arginyl-L-tryptofyl-glycyl-L-lysyl-L-propyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-lysyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin eller deres C-terminale amider og deres syreaddisjonssalter og komplekser.

Som syreaddisjonssalter skal det spesielt nevnes salter av terapeutisk anvendbare syrer, -som saltsyre, eddiksyre, fremfor alt imidlertid tungtoppløselige salter, som sulfater, fosfater eller sulfonater.

Med komplekser er det å forstå de komplekslignende i deres struktur ennu ikke avklarede forbindelser som oppstår ved tilsetning av visse uorganiske eller organiske stoffer til adrenocor-ticotrop virksomme peptider og fremfor alt de som gir dem en forlenget virkning. Slike uorganiske stoffer er forbindelser som av-leder seg fra metaller som kalsium, magnesium, aluminium, kobolt og spesielt fra sink, fremfor alt tungtoppløselige salter, som fosfater og pyrofosfater, såvel som hydroksyder av disse metaller. Organiske stoffer som bevirker en forlengelse av virkningen, er eksempelvis ikke antigene gelatiner, f.eks. oksypolygelatiner, polyvinylpyrrolidon og karboksymetylcellulose, videre sulfonsyre- eller fosforsyreestere av alginsyre, dextrin, polyfenoler og polyalkoholer, fremfor alt polyfloretinfosfat og fytinsyre, såvel som polymerisater og kopolymerisater av aminosyrer, f.eks. protamin og spesielt av aminosyrer som har en overveiende del av sure a-aminosyrer, som glutaminsyre eller asparaginsyre.

De nye forbindelser har som allerede nevnt en ves-entlig sterkere ACTH-aktivitet enn de tilsvarende forbindelser med L-konfigurasjon ved første'aminosyre. De skal følgelig anvendes i human- og veterinærmedisin, f.eks. i stedet for det naturlige hormon.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen erkarakterisertved at aminosyrene D-serin, L-tyrosin, L-serin, L-metionin, L-glutaminsyre (eller L-glutamin), L-histidin, L-fenylalanin, L-arginin, L-tryptofan, glycin, L-lysin, L-prolin, L-valin, glycin, L-lysin, L-lysin, L-lysin, L-lysin, L-prolin, L-valin, L-lysin, L-valin,L-tyrosin, L-prolin eller L-prolinamid og/eller peptidbruddstykker som inneholder disse aminosyrer i ønsket rekkefølge., eventuelt i form av reaktive derivater av aminosyrene og/eller peptidbrostykkene, kondenseres under anvendelse av innen peptidkjemien kjente metoder og under intermediær beskyttelse av reaktive grupper til det angitte peptid eller peptidamid, som deretter, hvis ønsket, overføres i terapeutisk anvendbare syreaddisjonssalter eller komplekser.

Sammenknytningen av aminosyre- og/eller peptidenhet-ene foregår således at man omsetter en aminosyre eller et peptid med beskyttet a-aminogruppe og aktivert terminal karboksylgruppe med en aminosyre eller et peptid med frie a-aminogrupper og frie eller beskyttet, f.eks. forestret eller amidert terminal karboksylgruppe, eller at man omsetter en aminosyre eller et peptid med aktivert a-aminogruppe og beskyttet terminal karboksylgruppe med en aminosyre eller et peptid med fri terminal karboksylgruppe og beskyttet a-aminogruppe. Karboksylgruppen kan eksempelvis aktiveres ved overføring i et syrehalogenid, -azid, -anhydrid, -imidazolid, isoksazolid eller en aktivert ester, som cyanmetylester, karboksymetylester, p-nitro-fenylester, eller ved reaksjon ved hjelp av et karbodiimid (eventuelt under tilsetning av N-hydroksysuccinimid) eller N,N'-karbonyl-diimidazol, aminogruppen aktiviseres eksempelvis ved reaksjon med et fosfatamid. Som vanlige metoder kan det nevnes karbodiimidmetoden, azidmetoden, metoden av aktivert ester og anhydridmetoden. Det skal også fremheves den såkalte faststoffbæresyntesen, hvor peptidet opp-bygges fra karboksylenden, som er bundet esteraktig til en polymer, idet man påkondenserer aminosyrene i rekkefølge.

I reaksjonen ikke deltagende, frie, funksjonelle grupper beskyttes spesielt ved hjelp av ved hydrolyse eller reduksjon lett avspaltbare rester, karboksylgruppen fortrinnsvis ved forestring, f.eks. med metanol, tert.-butanol, benzylalkohol, p-nitrogenzylalko-hol, eller amiddannelsen, aminogruppen eksempelvis ved innføring av tosyl-, trityl-, formyl-, trifluoracetyl-, o-nitrofenyl-sulfenyl-, ftalyl- eller karbobenzoksygruppen eller farvede beskyttelsesgrupper som p-fenyl-azo-benzyloksykarbonylgruppen eller p-(p'-metoksy-fenyl-azo)-benzyloksykarbonylgruppen, eller spesielt av tert.-butyloksykar-bonylresten. Til beskyttelsen av aminogruppen i argininets guanido-gruppering er nitrogruppen egnet; den nevnte aminogruppe av arginin må imidlertid ikke nødvendigvis beskyttes ved reaksjonen. Histidin-ets iminogruppe kan beskyttes ved hjelp av benzyl- eller tritylresten.

Omdannelsen av en beskyttet amino- eller iminogruppe til en fri gruppe, såvel som overføringen av en funksjonell modifisert karboksylgruppe i en fri 'karboksylgruppe under fremgangsmåteforløpet foregår etter i og for seg kjente metoder ved behandling med hydro-lyserende resp. reduserende midler.

En foretrukket fremgangsmåte består i at man kon-denserer de første 3 aminosyrer, f.eks. H-D-Ser-Tyr-OH-holdige tri-peptid (den forkortede skrivemåte refererer seg til L-aminc-syren,

når D- ikke er spesielt betegnet), eller det dessuten den 4.aminosyreholdige tetrapeptid med heptapeptid, res. heksapeptid av følgende aminosyrer til aminosyre 10, fortrinnsvis etter azidmetoden, og deretter kondenseres dekapeptidet med tetradekapeptidet av aminosyre 11-24. Ved denne kondensasjon anvendes som koblingsmetode fortrinnsvis karbodiimidmetoden eller metoden av aktiverte estere, fremfor alt ved hjelp av p-nitrofenylesteren. I sistnevnte tilfelle behøver p-nitrofenylesteren av dekapeptidet ikke å isoleres som sådanne, men kan også dannes i selve kondensasjonstrinnet fra dekapeptid med fri karboksylgruppe p-nitrofenol og dicykloheksylkarbodiimid. Dekapeptidet foreligger altså som a-aminobeskyttet peptid med fri karboksylgruppe eller med en p-nitrofenylestergruppe. Tetradekapeptidet anvendes i form av en ester, fortrinnsvis av tert. butylester eller av w-amidet. De i peptidbruddstykkene som skal kondenseres, tilstede-værende sidekjeder-aminogrupper beskyttes fortrinnsvis ved tert.-butyloksykarbonylgruppen, sidekjedekarboksylgruppen ved tert.-butylestergruppen. Disse beskyttelsesgrupper kan avspaltes i siste trinn med trifluoreddiksyre.

Ifølge en ytterligere foretrukket fremgangsmåte kondenseres de første 4 aminosyreholdige tetrapeptider H-D-Ser-Tyr-Ser-Met-OH med eicosapeptidet av aminosyrene 5~24. Ved denne kondensasjon anvendes som koblingsmetode fortrinnsvis azidmetoden. Tetrapeptid-hydrazidets resp. -azidets a-aminogruppe beskyttes fortrinnsvis ved den tert. butyloksykarbonylgruppe. Eicosapeptidet kan foreligge som fritt peptid eller som ester, spesielt tert. butylester, eller som Pro 2k-amid. Også i Eicosapeptidet beskyttes sidekjede-aminogruppene fortrinnsvis ved tert.butyloksykarbonylgruppen, sidekjedekarboksylgruppen ved tert. butylestergruppen.

Etterat man ved kondensasjon av peptidbruddstykker har fått tetracosapeptid, hvis a-aminogruppe og sidekjede-aminogrupper er beskyttet med tert. butyloksykarbonylgruppe og dets endekarboksyl-gruppe og sidekjedekarbpksylgruppe med tert. butylestergruppen, kan alle disse beskyttelsesgrupper avspaltes samtidig ved sur hydrolyse, eksempelvis med trifluoreddiksyre. Foreligger endekarboksylgruppen ikke som tertbutylestergruppe, men som amidgruppe, så fåes peptidamider. Peptidhydrazider får man eksempelvis når man behandler et peptid med endeplasserte laverealkylestergrupper med hydrazinhydrat.

Alt etter arbeidsmåte får man de nye forbindelser

i form av baser eller deres salter. Fra saltene kan basene utvinnes på i og for seg kjent måte. Fra sistnevnte igjen lar det seg ved omsetning med syrer, som er egnet til dannelse av terapeutisk anvendbare salter utvinne salter som f.eks. slike med uorganiske syrer,

som halogenhydrogensyrer, eksempelvis saltsyre eller bromhydrogensyre, perklorsyre, salpetersyre eller tiocyansyre, svovel- eller fosforsyre, eller organiske syrer, som maursyre, eddiksyre, propionsyre, glykol-syre, melkesyre, pyrodruesyre, oksalsyre, malonsyre, ravsyre, malein-syre, fumarsyre, eplesyre, vinsyre, sitronsyre, ascorbinsyre, hydroksy-maleinsyre, dihydroksymaleinsyre, benzosyre, fenyleddiksyre, 4-amino-benzosyre, 4-hydroksybenzosyre, antranilsyre, kanelsyre, mandelsyre,; salicylsyre, 4-amino-salicylsyre, 2-fenoksybenzosyre, 2-acetoksy-benzosyre, metansulfonsyre, etansulfonsyre, hydroksyetansulfonsyre, benzolsulfonsyre, p-toluolsulfonsyre, naftalinsulfonsyre eller sul-fanilsyre.

De peptider som kan fremstilles ved fremgangsmåten, kan finne anvendelse i form av farmasøytiske preparater. Disse inneholder peptidene i blanding med et for den enterale eller parenterale applikasjon egnede farmasøytiske, organiske eller uorganiske bære-materialer. For dette kommer det på tale slike stoffer som ikke reagerer med polypeptidene som f.eks. gelatiner, melkesukker, glukose, kokesalt, stivelse, magnesiumstearat, talk, planteoljer, benzylalko-holer, gummi, polyalkylenglykoler, vaselin, cholesterin eller andre kjente legemiddelbærere. De farmasøytiske preparater kan f.eks. foreligge som lyofilisat eller i flytende form som oppløsninger, suspen-sjoner eller emulsjoner. Enten er de sterilisert og/eller inneholder hjelpestoffer, som konserverings-, stabiliserings-, fukte- eller emulgeringsmiddel. De kan dessuten også inneholde andre terapeutisk verdifulle stoffer.

Således kan man eksempelvis også kombinere dem med de i ACTH-terapien vanlige tilsetninger for å forlenge virkningen,

som f.eks. oksypolygelatiner, polyfloretinfosfat, karboksymetylcellulose, eller åe ovennevnte tungt oppløselige metallforbindelser, spesielt fosfater, pyrofosfater eller hydroksyder av sink.

Videre kan man for å forlenge virkningen overføre

de nye peptider i deres komplekser med polymerisater eller kopolymerisater av aminosyrer, spesielt slike som har en overveiende del av sure a-aminosyrer, som glutaminsyre eller asparaginsyre av L-, D- eller D,L-konfigurasjonen. De nevnte polymerisater og kopolymerisater har i sidekjeden frie karboksylgrupper, mens den terminale karboksylgruppe kan foreligge i fri eller være modifisert funksjonell, f.eks. som estergruppe eller som en usubstituert eller ved hydrokarbonrester, fremfor alt lavere alkylgrupper, substituerte amidgruppe. Polymeri-satenes molekylvekt kan ligge mellom 1000 og 100.000, fortrinnsvis utgjør den 2000 - 15.000. Man anvender for preparatets fremstilling hensiktsmessig et vannoppløselig, fysiologisk tålbart salt, f.eks. natrium- eller ammoniumsalt, eller et salt med en organisk base,

som trietylamin, procain, dibenzylamin, eller andre tertiære nitro-genbaser.

Polymerene er kjent eller kan fremstilles etter kjente metoder, eksempelvis'etter den av M. Idelson et al. J.Am.

Chem. Soc. 80, 4631 et seq. (1958) beskrevne fremgangsmåte. Således kan man f.eks. la glutaminsyre-a-karboksyanhydrid, -benzylester eller -tert.-butylester i dioksan reagere med ammoniakk eller et amin i et bestemt molforhold, f.eks. 100:1 (alt etter den ønskede poly-merisasjonsgrad), og etter avsluttet polymerisasjon avspalte beskyt-telsesgruppene, f.eks. benzyloksygruppene med bromhydrogeh i iseddik, den tertiære butyloksygruppe med trifluoreddiksyre. For fremstilling av polymere med enhetlig, definerte kjedelengder kan man oppbygge polymerene også ved syntese etter de i peptidkjemien kjente frem-gangsmåter (Carbodiimidmetoden, azidmetoden etc.).

Konsentrasjonen av den polymere i de farmasøytiske preparater avhenger av det angjeldende salts oppløselighet og av vis-kositeten. Den polymere skal kunne foreligge i preparatene i oppløst form og være injiserbare.

Konsentrasjonen av det adrenocorticotrope virksomme peptid velges således at preparatet eksempelvis har p. ml 10-50 I.E.

Oppfinnelsen skal i det følgende beskrives ved hjelp av noen eksempler.

Det tynnsjiktkromatografiske system betegnes på følgende måte: System 43A: tert.-amylalkohol-isopropanol-vann (100:40:10) System 45 : sek.butanol-3% vandig ammoniakk (100:44) System 100: Etylacetat-pyridin-iseddik-vann ( 62:21:6:11) System 101: n-butanol-pyridin-iseddik-vann ( 30:20:6:24)

Det anvendes følgende forkortelser:

Eksempel 1.

370 mg BOC-D-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu(OtBu)-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-Lys-(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr-Pro-OtBu oppløses i 7,4 ml 90#-ig triflucr-eddiksyre og hensettes i 45 minutter ved 25°C. Oppløsningen inndampes deretter til ca. 2 ml, fortynnes med 20 ml vann, inndampes igjen og lyofiliseres til slutt. Man får trifluoracetatet av det frie tetra-kosapeptid, som for omdannelse i acetat oppløses i litt vann og filtreres gjennom en søyle (0 = 12,5 mm, lengde = 15 cm) av svakt basisk ioneutveksler (f. eks. Merck Nr. II) i acetatform. Eluatet konsentreres til ca. 3 ml, lyofiliseres og ettertørkes i høyvakuum ved 40°C. Man får 316 mg kromatografisk og elektroforetisk enhetlig acetat av

1 17 18 12^4

D-Ser -Lys ' -B -corticotropin som hvitt, amorft pulver.

I tynnsjiktskromatogram på aluminiumoksyd i systemet 1-24

101 har forbindelsene en Rf-verdi på 0,40. (3 -corticotropin under samme betingelse 0,51). Det vandrer ved elektroforese (16 volum/cm) ved pH 6,1 (pyridinacetatpuffer) i 2 timer 8,4 cm mot katoden.

Utgangsmaterialet kan fremstilles på følgende måte: 1) Z. Lys( B0C)- Lys( B0C), NHNH2 10 g Z.Lys(B0C)-Lys(B0C).OCH^(fremstillet av Z.Lys-(BOC)-OH + H.Lys(B0C)-0CH^ved hjelp av dicykloheksylkarbodiimid) opp-løses i 160 ml metanol og blandes med 7, 8 ml .hydrazinhydrat. Man hensetter den klare oppløsning i 24 timer ved 25°C og inndamper deretter til ca. 1/3 av det opprinnelige volum. Ved blanding med 200 ml vann faller det ut et oljeaktig bunnfall, som blir fast ved avkjøling og utdrivning og kan pulveriseres. Man suger fra på nutsch, vasker med vann og tørker råproduktet. Det renses ved engangs omkrystallisering fra metanol-iseddik-petroleter og har da et smeltepunkt på 118-119,5°C.

På silikagel-tynnsjiktplater fåes følgende Rf-verdier:

2) Z. Lys ( BOC)- Lys( BOC)- Pro- QH

1,87 g Z.Lys(BOC)-Lys(BOC.NHNH„ oppløses i 15 ml nydestillert dimetylformamid og avkjøles til -25 C. Hertil drypper man langsomt 2,07 ml 4,35-n. saltsyre og deretter 0,66 ml 5-n. natri-umnitritoppløsning. Man omrører i 10 minutter ved -10°C og tilsetter deretter en oppløsning av 692 mg L-prolin i 4,2 ml dimetylformamid-vann (2:1). Endelig tildryppes dessuten ved -10°C 1,82 ml trietylamin og deretter hensettes reaksjonsoppløsningen natten over ved 0°C og i ytterligere 2 timer ved værelsestemperatur. Man inndamper deretter i høyvakuum til et volum på ca. 4 ml og blander det klebrige residuum med 25 ml vann. Ved avkjøling til 0°C og utdrivning kan det pulveriseres. Man suger fra på nutsch, vasker med litt vann og tørker i høyvakuum ved 40°C. For rensning av det ikke krystalliser-bare råprodukt gjennomføres en multiplikativ fordeling etter Craig i oppløsningsmiddelsysternets metanol-puffer-kloroform-tetraklorkarbon (35:13:15:15) /_ puffer = 28,5 ml iseddik + 19,25 g ammoniumacetat i 960 ml vann/ med fasevolum på hver gang 10 ml. Etter 220 trinn isolerer man fra fordelingselementene nr. 49-73 ( ,u . = 6l: K =

& / maks *;0,39) ved inndampning til tørrhet og bortsublimering av ammoniumacetat kromatografisk ren, imidlertid amorft tripeptidderivat av smeltepunkt ca. 70-80°C. I tynnsjiktkromatogram på silikagel fåes følgende Rf-verdier: ; ; 3) Z. Lys( BQC)- Lys( BQC)- Pro- Val- Lys( BQC)- Val- Tyr- Pro. QtBu;2,4 g Z.Lys(B0C)-Lys(B0C)-Pro.0H og 3,12 g H.Val-Lys(BOC)-Val-Tyr-Pro-OtBu-oppløses i 30 ml absolutt kloroform. Man tilsetter ved 0°C 0,845 g dicykloheksylkarbodiimid, omrører 1 time ved 0°C og hensetter deretter i 30 timer ved 25°C. Det utskilte krystallinske dicykloheksylurinstoff frafiltreres og vaskes med litt eddikester. Til filtratet setter man 150 ml eddikester og ekstraherer den organiske fasé ved 0°C tre ganger, hver gang med 30 ml 3%-ig vin-syreoppløsning for å fjerne overskytende pentapeptid. Man vasker ytterligere flere ganger med vann til nøytral reaksjon og inndamper deretter til tørrhet. For å fjerne lipofile forurensninger oppløser ;man residuet i 10 ml metanol og 20 ml eddikester og utfeller oktapep-tidet ved tilsetning av 120 ml petroleter som seig masse som tørkes i vakuum ved 40°C. Det således dannede råprodukt (3*1 g) underkastes for endelig rensning en Craig-fordeling i systemet metanol-puffer-kloroform-tetraklorkarbon (30:10:3:30), f~puffer som angitt unåer 2) over 225 trinn med fasevolum på hver gang 10 ml. Det kromatografisk enhetlige oktapeptidderivat fåes ved inndampning av innholdet av elementene nr. 65-96 (/Umaks = ?8; K = 0,53) for tørkning og bortsublimering av ammoniumacetat i høyvakuum som hvitt amorft pulver med smeltepunkt ca. 130 - 140°C. Det har på silikagel følgende Rf-verdier:

4) H. Lys( BOC)- Lys( BOC)- Pro- Val- Lys( BOC- Val- Tyr- Pro- OtBu

1,46 g Z.Lys(BOC)-Lys(BOC)-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr-Pro-OtBu hydreres i 40 ml metanol etter tilsetning av 300 ml 10%- ig palladiumkull i en rystebeholder med karbondioksyd-absorbsjon. Vann-stoffopptak er avsluttet allerede etter 20 minutter. Etter 1 time frafiltreres katalysatoren, etterspyles med metanol og filtratet inndampes til tørrhet. Man får i kvantitativt utbytte det kromatografisk enhetlige dekarbobenzoksylerte oktapeptidderivat som hvitt amorft pulver med smeltepunkt ca. 110-120°C. Det har i tynnsjiktkromatogram på silikagel følgende Rf-verdier:

5) Z.Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Pro-Val- Lys( BOC)- Val- Tyr- Pro- OtBu.

1,98 g Z-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC)-NHNH2oppløses i 22 ml absolutt dimetylformamid og blandes etter av-kjøling til -25°C dråpevis under omrøring med 3,4 ml 2,115-n. saltsyre og deretter med 0,378 ml 5-n. natriumnitritoppløsning. Den klare oppløsning videreomrøres i 15 minutter ved -10°C og blandes deretter med en til -5°C foravkjølet oppløsning av 1,313 g av ovennevnte oktapeptidderivat i 4 ml dimetylformamid. Man etterspyler ennu med 1 ml dimetylformamid og tildrypper deretter langsomt ved -5°C 1,05 ml trietylamin. Reaksjonsblandingen omrøres ytterligere i 30 minutter og hensettes deretter i 15 timer ved 0°C. Deretter konsentreres det til dannelse av en viskos olje og herav utfelles ved tilsetning av 20 ml vann en seig masse. Denne oppløses igjen under oppvarmning i 20 ml

metanol og peptidet utfelles igjen ved tilsetning av 30 ml vann.

Ved avkjøling til 0°C og utdrivning får man en pulverformet oppslem-ning som filtreres, vaskes med vann og tørkes. Dette råprodukt underkastes for rensning en Craig-fordeling i systemet metanol-puffer-kloroform-tetraklorkarbon (60:20:3:60) f~puffer som angitt under punkt 21 med fasevolum på hver gang 20 ml. Etter 218 trinn isolerer man fra elementene nr. 105 - 134 (/umaks= 121> K = !»25) ved inndampning til tørrhet og avsublimering av ammoniumacetatet i høyvakuum kromatografisk enhetlig beskyttet tetradecapeptid som hvitt, amorft pulver med smeltepunkt ca. l80-190°C. Det har på silikagel følgende Rf-verdier:

6) H-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Pro-Val- Lys( BOC)- Val- Tyr- Pro- OtBu. 1,66 g Z.Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr-Pro-OtBu hydreres i '40 ml metanol med 300 ml palladiumkull (10% Pd) som vanlig. Ved inndampning av den filtrerte hydreringsoppløsning til tørrhet får man direkte det kromatografisk enhetlige produkt (14,9 g) som amorft pulver, som smelter uskarpt ved ca. 175 - 190°C. Det har på silikagel følgende Rf-verdier. 7) BOC.D-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu(OtBu)-His-Phe-'Arg-Try-Gly-Lys(^OC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr- Pro- OtBu.

378 mg BOC-D-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu(OtBu)-His-Phe-Arg-Try-Gly-OH (og 451 mg H-Lys (BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys (BOC)-Lys(BOC)-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tur-Pro.OtBu suspenderes i 4 ml absolutt pyridin og omrøres etter tilsetning av 0,15 ml vann og 0,32 ml l-n. saltsyre 10 minutter ved 50°C. Til den uklare suspensjon setter man deretter 145 mg dicykloheksylkarbodiimid og etter 3 timer igjen en like stor mengde. Man omrører ytterligere i 3 timer ved 50°C og hensetter det deretter natten over ved G°C. Det utskilte dicykloheksylurinstoff frafiltreres og ettervaskes 3 ganger med hver gang 0,8 ml 90%-ig pyridin. Filtratet blandes med 45 ml benzol, idet det utfelles et pulverformet råprodukt, som frafiltreres og tørkes ved 45°C. Ved gjenutfelling fra metanol-benzol-petroleter adskilles

størstedelen av de lipofile forurensninger, hvorpå den endelige rensning foregår ved hjelp av en Craig-fordeling i oppløsningsmiddelsys-temet metanol-puffer-kloroform-tetraklorkarbon (10:3517:5:4) (puffer som under 2) over 300 trinn, med fasevolum på hver gang 10 ml. Av fordelingselementene nr. 51-85 (/umai{S = 67; K = 0,29) isolerer man ved inndampning til tørrhet og bortsublimering av ammoniumacetat ved 40°C i høyvakuum, 445 mg kromatisk rent beskyttet tetrakosapeptidace-tat som amorft pulver med smeltepunkt ca. 205 - 210°C (spaltning). Det har på silikagel følgende Rf-verdier:

Forbindelsen har i prøven ifølge Schuler et al., hvor det måles den minimale intravenøse dose, som bevirker en markert økning av corticosteron-utskillelsen, en terskeldose på 0,003y/kg. Ved subkutan anvendelse i samme prøve er den 10 ganger mer aktiv

enn (alt-L)-B 1-24-corticotropin.

Eksempel 2.

Man fremstiller en tørrampulle av følgende komponenter:

Før bruk blir tørrampullens innhold blandet med

1 ml destillert vann, inneholdende i en oppløsningsampulle. Man får en suspensjon med en pH 7S6.

Eksempel 3-

Man fremstiller en oppløsningsampulle av følgende komponenter:

• Eksempel 4.

En steril filtrert vandig oppløsning av D-Ser<1->17 l8 1 ~ 2 4

Lys -3 -corticotropin-heksaacetat blandes under aseptiske be-tingelser med natrium-polyfloretinfosfat og natriumklorid og fylles i Vialer og lyofiliseres, således at det fåes en tørrvial som inne-1 17 l8 1~2M holder følgende komponenter D-Ser -Lys ' -3 -corticotropin-

Før bruk blandes innholdet av tørrvialen med 2 ml destillert vann, inneholdt i en oppløsningsampulle.

Eksempel 5-

2,0 g poly-L-glutaminsyre oppløses i ca. 5,7 ml 10%-ig natronlut, således at oppløsningen pH utgjør 7,4. I denne

X 17 l8 X—24

oppløsning oppløses 5,0 mg D-Ser -Lys ' -3 -corticotropin-heksaacetat og 0,2 mg mertiolat. Til denne oppløsning settes 1 ml av en saltsur oppløsning (pH 2,8) inneholdende 5>2 mg sinkklorid og 0,85 mg dinatriumfosfat (vannfritt). pH innstilles med natronlut på 7,8. Man fyller opp med vann til et volum på 10 ml.

Eksempel 6.

Man fremstiller en suspensjon av følgende komponenter:

Eksempel 7.

Man fremstiller, en suspensjon av følgende komponenter:

Eksempel 8.

Man fremstiller 0,5 ml av en saltsur oppløsning av X X7 x8 X~24

0,5 mg D-Ser -Lys ' -3 -corticotropin-heksaacetat, 5525 mg ZnCl, 1,05 mg Na2HP0lj. 2 H20 og 2,0 mg NaCl med pH 3,0 og setter oppløsningen til 0,5 ml av en vandig oppløsning av 10 mg benzylalkohol, som inneholder så meget natronlut at det fåes en suspensjon av

PH 8,3.

Eksempel 9.

5 mg poly-L-glutaminsyre av midlere molekylvekt 39-600 oppløses i 5 ml 0,1-n. natronlut. Man filtrerer oppløsningen, 1 IT l8 1—2 4 tilsetter en oppløsning av 2,5 mg D-Ser -Lys ' -3 -corticotropin-heksaacetat, surgjør deretter med eddiksyre eller saltsyre til pH 4 og oppfyller med vann til 10 ml. Derved utfelles finfordelt et poly-L-glutaminsyre-D-Ser -Lys -3 -corticotropin-kompleks. Suspen-sjonen inneholder pr. ml 0,5 mg poly-L-glutaminsyre og 0,25 mg D-1 17 l8 1™24

Ser -Lys ' -3 -corticotropin som kompleksforbindelse.

Claims

Fremgangsmåte ifølge patent nr. 124.831 til fremstilling av nye peptider med øket og/eller forlenget ACTH-virkning, og med formel D-seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-metionyl-L-glutamyl (eller L-glutaminyl)-L-histidyl-L-fenylalanyl-L-arginyl-L-tryptofyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-lysyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin eller deres C-terminale amider og deres syreaddisjonssalter og komplekser, karakterisert ved at aminosyrene D-serin, L-tyrosin, L-serin, L-metionin, L-glutaminsyre (eller L-glutamin), L-histidin, L-fenylalanin, L-arginin, L-tryptofan, glycin, L-lysin, L-prolin, L-valin, glycin, L-lysin, L-lysin, L-lysin, L-lysin, L-prolin, L-valin, L-lysin, L-valin, L-tyrosin, L-prolin eller L-prolinamid og/ eller peptidbruddstykker som inneholder disse aminosyrer i ønsket rekkefølge, eventuelt i form av reaktive derivater av aminosyrene og/eller peptidbruddstykkene, kondenseres under anvendelse av innen peptidkjemien kjente metoder og under intermediær beskyttelse av reaktive grupper til det angitte peptid eller peptidamid, som deretter, hvis ønsket, overføres i terapeutisk anvendbare syreaddisjonssalter eller komplekser.