DE1643282A1 - Verfahren zur Herstellung neuer Peptide mit ACTH-Wirkung - Google Patents
Verfahren zur Herstellung neuer Peptide mit ACTH-WirkungInfo
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- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/665—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans derived from pro-opiomelanocortin, pro-enkephalin or pro-dynorphin
- C07K14/695—Corticotropin [ACTH]
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Description
Zusatzpatentgesuch zu Hauptpatent Nr.
Nr. C 36 439
CIBA/AKTIENGESELLSCHAFT, BASEL (SCHWEIZ)
Case 6086/1-3 1643282
Deutschland
Verfahren zur Herstellung neuer Peptide mit ACTH-Wirkung.
Im Hauptpatent Nr. (Nr. C 36 439, Case
5503/I-3/E) sind Peptide beschrieben, die sich durch eine
verstärkte ACTH-Wirkung auszeichnen und die sich von den bekannten Peptiden mit ACTH-Wirkung dadurch unterscheiden,
dass sie am Aminoende als erste α-Aminosäure eine D-Aminosäure aufweisen.
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Als Peptid mit sehr guter ACTH-Wlrkung 1st la
Hauptpatent das H-D-Ser-Tyr-Ser-Met-Olu-His-Phe-Arg-Try-Oly-Lys-Pro-Val-Oly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-QH (D-3er -£· ^·
Corticotropin) beschrieben.
Es wurde nun gefunden« das· ein Octadekapeptidamid, das an Stelle des Methloninrestee in 4-Stellung den
Norleuolnrest und an Stelle der Arginlnreste in 17#l8-Stel·
lung Lyslnreste enthält, eine bessere adrenocorticotrop
pe Wirkung aufweist. Das neue Peptid, D-Ser1, Nl·*, Lye17*1®
lift 1 ft
β -Cortiootropin-Lys -amid, läset sieh leiohter her-
• 1 1-lQ
stellen als D-Ser »0 ^-Corticotropin, weil es dl« Arginin·
reste in den Stellungen 17,18, die wegen der Guanidinogruppe in der Seltenkette die Herstellung de· Peptide er·
schweren, nicht enthält.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind da« D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-norleucy1-L-glutarayl-L·-
histidyl -L-phenylalanyl -L-arginyl -L-tryptophyl -glyoyl-L-lysyl -L-prolyl -L-valyl -glyoyl -L-lysyl -L-lyeyl -L-ly*yl-L-Lyeln-amld sowie die entsprechende Verbindung, dl· etatt
des Olutamylreste· den Rest des Olutarains aufweist« ihr·
S&ureaddltlonssalze und Komplexe und Verfahren su ihrer
Herstellung.
Als SXureaddltlonssalze sind besonder· Sals· von
therapeutisch anwendbaren Säuren» wie Salzsäure, Essigsäure,
vor allem aber eohwerlusliohe Salze, wie Sulfate, Phosphate
oder Sulfonate, zu nennen·
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Unter Komplexen sind die komplexertIgen« in ihrer
Struktur nooh nicht abgeklärten Verbindungen zu verstehen«
die beim Zusatz gewisser anorganischer oder organischer Stoffe zu adrenocorticotrop wirksamen Peptides* entstehen
und vor allem diejenigen, die ihnen ein® verlängerte Wirkung verleihen. Solche anorganische Stoffe sind Verbindungen*
die sich von Metallen« wie Calcium« Magnesium« Aluminium«
Cobalt und insbesondere von Zink ableiten« vor allem schwerlösliche Salze, wie Phosphate und Pyrophosphate sowie Hydroxyde dieser Metalle. Organische Stoffe« die eine Verlängerung der Wirkung hervorrufen, sind beispielsweise
nicht antigene Gelatine, z.B. Oxypolygelatine, Polyvinylpyrrolidon und Carboxymethylcellulose, ferner Sulfonsäure-
oder Phosphorsäureester von Alginsäure, Dextrin, Polyphenolen und Polyalkoholen, vor allem Polyphloretinphosphat und
Phytinsäure« sowie Polymerisate und Copolymerisate von Aminosäuren« z.B. Protamin und insbesondere von Aminosäuren«
die einen überwiegenden Anteil an sauren α-Aminosäuren, wie
Glutaminsäure oder Asparaginsäure« aufweisen.
Die neuen Verbindungen besitzen« wie bereits erwähnt«
eine wesentliche stärkere ACTK-Aktivität als die entsprechenden Verbindungen mit L-Konfiguration an der ersten Aminosäure. Sie sollen dementsprechend in der Human- und Veterinärmedizin verwendet werden, z.B. an Stelle des natürlichen
Hormons·
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stellung von Peptiden mit grosser Kettenlänge bekannten
Methoden hergestellt unter Verwendung von D-Serin als N-terminaler Aminosäure, Dabei werden die Aminosäuren in der
erwähnten Reihenfolge einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten verknüpft. Am Schluss der Synthese werden die Schutzgruppen in einer einzigen oder gegebenenfalls in mehreren Stufen abgespalten.
Das erfindungsgemässe Verfahren 1st daher dadurch
gekennzeichnet, dass man aus D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-norleucyl-L-'glutamyl-L-histldyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-trypt ophyl-glyoyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-lysyl-L-lysin-amid oder der entsprechenden Verbindung, die statt des Glutamylrestes den Rest des Glutamine aufweist, in welchen Peptiden mindestens die a-Aminogruppe und
die Seitenkenntenaminogruppen sowie eine gegebenenfalls vorhandene Seltenkettenoarboxylgruppe geschützt sind, die Schutz-. gruppen abspaltet und, wenn erwünscht, die erhaltenen Verbindungen in ihre Säureadditionssalze oder Komplexe überführt.
Die Verknüpfung der Aminosäure- und/oder Peptideinhetfcen erfolgt in der Welse, dass man eine Aminosäure oder ein Peptid
mit geschützter a-Aminogruppe und aktivierter terminaler Carboxylgruppe mit einer Aminosäure oder einem Peptid mit freier
o>Amlnogruppe und freier oder geschützter, z.B. veresterter
oder amidierter terminaler Carboxylgruppe, umsetzt oder dass
man eine Aminosäure oder ein Peptid mit aktivierter a-Aminogruppe und geschützter terminaler Carboxylgruppe mit einer
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Aminosäure oder einem Peptid mit freier terminaler Carboxylgruppe und geschützter ct-Aminogruppe umsetzt. Die Carboxylgruppe
kann beispielsweise durch Ueberführung in ein Säurehalogenid, -azid, -anhydrld, -imidazolid, -isoxazolid oder
einen aktivierten Ester, wie Cyanmethylester, Carboxymethylester, p-Nitrophenylester, oder durch Reaktion mittels
eines Carbodiimide (gegebenenfalls unter Zusatz von N-Hydroxysuccinimid)
oder N^-Carbonyl-diimidazols aktiviert werden,
die Aminogruppe beispielsweise durch Reaktion mit einem Phosphatamid
aktiviert werden. Als gebräuchlichste Methoden sind zu nennen die Carbodiimidmethode, die Azidmethode, die Methode
der aktivierten Ester und die Anhydridmethode.. Hervorzuheben ist auch die sogenannte Peststoffträgersynthese, bei der
das Peptid vom Carboxylende, das esterartig an ein Polymeres gebunden ist, aufgebaut wird, indem man die Aminosäuren der
Reihe nach ankondensiert.
An der Reaktion nicht beteiligte, freie, funk-1?ionelle
Gruppe werden zwejckmässigerweise gesohützt, insbesondere
mittels durch Hydrolyse oder Reduktion leicht abspaltbarer Reste, die Carboxylgruppe vorzugsweise durch Veresterung,
z.B. mit Methanol, tert.-Butanol, Benzylalkohol, p-Nltrobenzylalkohol, die Aminogruppe beispielsweise durch
Einführung der Tosyl-, Trltyl-, Pprmyl-, Trifluoracetyl-,
o-Nitraphenylsulfenyl-, Phthalyl- oder Carbobenzoxygruppe oder
farbiger Schutzgruppen, wie der p-Phenylazo-benzyloxycarbonylgruppe
und der p-ip'-MethOjxy-phenylazo^benzyloxyqarbonylgrup-
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ORtQlNAL INSPECTED
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pe, oder Insbesondere des tert.-Butyloxycarbonylrestes. Zum
Schutz der Aminogruppe in der Guanidogrupplerung des Arginine 1st die Nitrogruppe geeignet; die genannte Aminogruppe des
Arginine muss aber bei der Reaktion nicht notwendig geschützt werden. Die Iminogruppe des Histidins kann durch den Benzyl-
oder Tritylrest geschützt werden.
Die Umwandlung einer geschützten Amino- oder Iminogruppe
in eine freie Gruppe sowie die Ueberführung einer funktionell abgewandelten Carboxylgruppe in eine freie
Carboxylgruppe im Verlaufe des Verfahrens erfolgt nach an sich bekannten Methoden durch Behandlung mit hydrolysierenden
bzw. reduzierenden Mitteln.
. Ein bevorzugtes Verfahren besteht darin, dass man das die ersten 3 Aminosäuren, H.D.Ser-Tyr-Ser-OH enthaltende
Tripaptld (die abgekürzte Schreibwelse bezieht sich auf
L-Aminosäuren, wenn das D- nicht besonders bezeichnet ist),
oder das ausserdem die ^. Aminosäure enthaltende Tetrapeptid
mit dem Heptapeptid bzw. Hexapeptid der folgenden Aminosäuren bis zur Aminosäure 10 kondensiert, vorzugsweise
nach der Azidmethode, und dann das Dekapeptid mit dem Ootapeptidamid
der Aminosäuren 11-18.kondensiert,
Bei dieser Kondensation wird als Kupplungsmethode vorzugsweise die Carbodilmidmethode oder die Methode der
aktivierten Ester, vor allem mittels des p-Nitrophenylesters,
verwendet. Im letzten Falle braucht der p-Nitrophenylester des Dekapeptids nicht als solcher isoliert zu
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werden« sondern kann auch in der Kondensationsstufe selbst
aus dem Dekapeptid mit freier Carboxylgruppe, p-Nitrophenol und Dioyclohexylcarbodiimid gebildet werden. Das
Dekapeptid liegt also als a-Amino-gesehütztes Peptid mit
freier Carboxylgruppe oder mit einer p-Nitrophenylester-.
gruppe vor. Die in den zu kondensierenden Peptidbruohstüoken vorhandenen Seitenketten-Aminogruppen werden vorzugsweise
duroh die tert«-Butyloxycarbonylgruppe, die Carboxylgruppe
durch die tert.-Butylestergruppe geschützt. Diese Schutzgruppen können in der letzten Stufe mit Trifluoressigsäure
abgespalten werden«
Die Erfindung betrifft auch diejenigen Ausführungsfarmen
des Verfahrens, bei denen man von einer auf irgendeine? Stufe des Verfahrens als Zwischenprodukt erhältlichen
Verbindung ausgeht und die fhe!enden Verfahrensschritte
durchführt, oder das Verfahren auf irgendeiner Stufe abbricht, sowie die dabei erhaltenen Zwischenprodukte.
Je nach der Arbeitsweise erhält man die neuen Verbindungen in Form von Basen oder ihren Salzen. Aus den
Salzen können in an sich bekannter Weise die Basen gewonnen werden. Von letzteren wiederum lassen sich durch Umsetzung
mit Säuren, die zur Bildung therapeutisch verwendbarer Salze geeignet sind, Salze gewinnen, wie z.B. solohe mit
anorganischen Säuren, wie Halogenwasserstoffsäuren, beispielsweise
Salzsäure oder Bromwasserstoffsäure, Perchlorsäure, Salpetersäure oder Thiοcyansäure, Schwefel- oder
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PhosphorsSuren, oder organischen Säuren, wie Ameisensäure,
•Essigsäure, Propionsäure, Glycolsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Oxalsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Aepfelsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Ascorbinsäure, Hydroxymaleinsäure, Dihydroxymaleinsäure. Benzoesäure, Phenylessigsäure, 4-Aminobenzoesäuren
4-Hydröxybenzoesäure, Anthranilsäure, Zimtsäure, Mandelsäure, Salicylsäure, 4-Aminosalicylsäure, 8-Phenoxybenzoesäure, g-Acetoxybenzoesäure, Methansulfonsäure, Aethansulfonsäure, Hydroxyäthansulfonsäure, Benzolsulfonsäure, p-Toluolsulfonsäure, Naphthalinsulfonsäure oder SuIfanilsäure«
Die verfahrensgemäss erhaltenen Peptide können
in.Form von pharmazeutischen Präparaten Verwendung finden. Diese enthalten die Peptide in Mischung mit einem für
. die enterale oder parenterale Applikation geeigneten ^ pharmazeutischen, organischen oder anorganischen Trägermaterial. Für dasselbe kommen-solche Stoffe in Frage, die
mit den Polypeptiden nfc ht reagieren, wie z.B. Gelatine,
Milchzucker, Glukose, Kochsalze, Stärke, Magnesiumstearat,
Talk, pflanzliche OeIe, Benzylalkohol, Gummi, Polyalkylenglykole, Vaseline, Cholesterin oder andere bekannte Arzneimittelträger* Die pharmazeutischen Präparate können z.B.
als Lyophilisat oder in flüssiger Form als Lösungen; Suspensionen oder Emulsionen vorliegen. Gegebenenfalls sind
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sie sterilisiert und bzw. oder enthalten Hilfsstoffe, wie
Konservierungs-, Stabillsierungs-, Netz- oder Emulgiermittel. Sie können auch noch andere therapeutisch wertvolle
Stoffe enthalten.
So kann man sie beispielsweise auch mit den in der ACTH-Therapie Üblichen Zusätzen zur Verlängerung der
Wirkung, wie z.B. Oxypolygelatine, Polyphloretlnphosphat,
Carboxymethylcellulose, oder den oben erwähnten schwerlöslichen Metallverbindungen* insbesondere Phosphaten, Pyrophosphaten oder Hydroxyden des Zinks, kombinieren·
Welter kann man zur Verlängerung der Wirksamkeit die neuen Peptide In ihre Komplexe mit Polymerisaten oder
Copolymerisate^ von Aminosäuren, insbesondere solchen, die
einen überwiegenden Anteil an sauren α-Aminosäuren, wie Glutaminsäure oder Asparaginsäure der L-, D- oder D,L-Konfiguration, aufweisen, überführen, Die genannten Polymerisate und Copolymerisate weisen In den Seitenketten freie
Carboxylgruppen auf, während die terminale Carboxylgruppe
frei oder funktionell abgewandelt sein, z.B. als Estergruppe oder als eine uneubstitulerte oder durch Kohlenwasserstoffreste, vor allem niedere Alkylgruppen, substituierte Amidgruppe, vorliegen kann. Das Molekulargewicht der Polymerisate kann zwischen lOOGO und 100 000 liegen, vorzugsweise
beträgt es 20000- .80 000, Man verwendet für die Herstellung der Präparate zweckmässlg ein wasserlösliches, physiolo-
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gisoh verträgliches SaXz, z.B. das Natrium- oder Ammoniumsalze oder ein Salz mit einer organischen Base, wie Triethylamin, Procain, Dibenzylamin, oder anderen tertiären
Stickstoffbasen.
Die Polymeren sind bekannt oder können nach bekannten Verfahren hergestellt werden, beispielsweise nach
dem von M.Ideleon et al., J.Am.Chem.Soo. 80, 4631 et seq.
(1958) beschriebenen Verfahren. So kann man z.B. Glutaminsäure -a-oarboxyanhydrid^-benzylester oder -tert.-butylester
in Dioxan mit Ammoniak oder einem AmIn in einem bestimmten
Molverhältnis, z.B. 100 : 1 (Je nach dem gewünschten Polymer isationsgrad), reagieren lassen und nach beendeter Polymerisation die Sohutzgruppen abspalten, z.B. die Benzyloxygruppe mit Bromwasserstoff in Eisessig, die tert.-Butyloxygruppe mit TrIfluoressigsäure. Zwecks Herstellung von Polymeren mit elnheiltllcher, definierter Kettenlänge kann man
die Polymeren auch duroh Synthese nach den in der Peptidchemie bekannten Verfahren (Carbodilmidmethode, Azldmethode etc») aufbauen·
Die Konzentration des Polymeren in den pharmazeutischen Präparaten hängt von der Löslichkeit des betreffenden Salzes und von der Viskosität ab. Das Polymere soll in
den Präpraten in gelöster Form vorliegen können und injizierbar sein. \
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- li -
Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen
beschrieben. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben.
Die dünnschiehtchromatographischen Systeme werden wie folgt bezeichnet:
System 43A : tert.-Amylalkohol-Isopropanol-Wasser (67:26s7)
System 43C : tert.-Amylalkohol-Isopropanol-Wasser (51:21:28)
System 52 j n-Butanol-Eisessig-Wasser (1QO:10:30)
System 52A : n-Butanol-Eisessig-Wasser (67:10:23)
System 100 : Aethylacetat-Pyridin-Eisessig-Wasser (62:21:6x2 System 101 : n-Butanol-Pyridin-Eisessig-Wasser (38:24:8:30)
Folgende Abkürzungen werden verwendet: Z · Carbobenzoxy
BOC ρ tert.-Butyloxyoarbonyl
tBu « tert.-Butyl.
BOC ρ tert.-Butyloxyoarbonyl
tBu « tert.-Butyl.
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I) H-NIe-OCH
l8,4 g L-Norleucin werden in 57 ml Methanol suspendiert und
unter Rühren bei -15° innert ^O Minuten 11 ml Thionylchlorid
hinzugefügt. Man rührt noch,weitere $0 Minuten bei
-15 , dann je 9° Minuten bei 0 und bei Zimmertemperatur.
Nach 3-stündigem Stehen bei 40 dampft man die Lösung bei 35 zur Trockne ein und kristallisiert den Rückstand aus
Aceton-Hexan (2:1) um. P. l4O-l4l°.
18,1 g des Hydrochlorids werden in 20 ml Wasser gelöst, mit
200 ml Aether überschichtet und bei 0° mit 40 ml kalter
gesättigter Kaliumcarbonatlösung versetzt. Man extrahiert die wässerige Phase mehrmals mit Aether, vereinigt die
ätherischen Lösungen, trocknet sie über Natriumsulfat und dampft sie am Hochvakuum bei 0° ein. Der freie Ester wird als klares
OeI erhalten.
B) BOC-Ser-Nie-OCH
Eine Lösung von 22,3 S BOC-L-serin-hydrat in 270 ml Acetonitril
wird mit einer Lösung von 14,3 g L-Norleucinmethylester in
65 ml Acetonitril versetzt. Man kühlt auf -5° ab, gibt 22,7 g
Dicyclohexylcarbodiimid in 35 mi Acetonitril hinzu, rührt
noch 1 Stunde bei -5 , dann über Nacht bei 0°, befreit vom Dicyclohexylharnstoff und dampft die Lösung bei 35° ein. Den
Rückstand nimmt man in Essigester auf, wäscht die Lösung mit
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N-Salzsäure, N-Natriumbicarbonat und gesättigter Natriumchloridlösung
und dampft sie ein. Der kristalline Dipeptidester schmilzt bei 69-71°·
3) H-Ser-Nle-OCH,
28,0 g BOC-Ser-Nle-OCH werden in 320 ml 90 #iger Trifluoressigsäure
gelöst und 2 Stunden bei Zimmertemperatur belassen. Nach Einengen der Lösung auf das halbe Volumen versetzt man
sie mit 500 ml Aether, wobei das Trifluoracetat auskristallisiert.
Dieses (24,2 g) wird in 35 ml Wasser gelöst, die Lösung mit 700 ml Chloroform unterschichtet und unter Rühren
bei 0 mit 210 ml gesättigter Kaliumcarbonatlosung versetzt. Aus der Chloroformphase werden 16,1 g kristalliner Dipeptidester
vom P. .84-85 gewonnen.
4) BOC-Tyr-Ser-Nle-OCiL·
19,6 g BOC-Tyr-OH und 16,1 g H-Ser-Nle-OCKL werden in einem
Gemisch von 350 ml Acetonitril und 17,5 ml Dimethylformamid
gelöst, bei -5 mit einer Lösung von 15*9 S Dicyclohexylcarbodiimid
in 175 ml Acetonitril versetzt und 1 Stunde bei -5 , dann über Nacht bei 0 gerührt. Man befreit vom Dicyclohexylharnstoff,
wäscht wie oben angegeben und dampft die Lösung ein. Der geschützte Tripeptidester schmilzt nach Umkristallisieren
bei 143-145°.
5) H-Tyr-Ser-Nle-OCH
27,3 S des geschützten Tripeptidestera werden in 82,5 ml N-Salzsäure
in Methanol gelöst, 2 Stunden bei Zimmertemperatur
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stehen gelassen und dann mit 1,5 1 Aether versetzt. Man erhält
das Hydrochlorid des freien Tripeptidesters, das nach" Umkristallisation bei 218-220° (Zersetzung) schmilzt.
l4,2 g des Hydrochlorides werden in 20 ml Wasser gelöst, mit 400 ml Chloroform unterschichtet und bei 0 mit 100 ml gesättigter
Kaliumcarbonatlösung versetzt. Die freie Base schmilzt nach Umkristallisieren bei 84-86 .
P 6) BOC-D-Ser-Tyr-Ser-Nle-OCH
12,4 g H-Tyr-Ser-Nle-OCH, werden in 250 ml Acetonitril gelöst
und nach Zugabe von 15 ml Dimethylformamid mit 7,35 g BOC-D-Serin versetzt. Bei -5° fügt man eine Lösung von
7,45 g Dicyclohexylcarbodiimid in J>0 ml Acetonitril zu und
rührt dann 1 Stunde bei -5 und über Nacht bei 0 . Man befreit vom Dicyclohexylharnstoff, dampft die Lösung ein. Der
geschützte Tetrapeptidester schmilzt nach Umkristallisieren bei 149-151° (Zersetzung).
7) BOG-D-Ser-Tyr-Ser-Nie-NH-NH0
11,65 g Tetrapeptidester werden in 50 ml Methanol gelöst,
4,8 ml Hydrazinhydrat zur Lösung hinzugefügt und die Mischung 24 Stunden beim Zimmertemperatur stehen gelassen. Man gibt
50 ml Wasser hinzu und rührt, bis das gallertige Produkt
vollständig durchkristallisiert ist. Es schmilzt bei 205-207°.
8) BOC-D-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu(OtBu)-His-Phe-Arg-Try-GIy-OH
8,75 g BOC-D-Ser-Tyr-Ser-Nle-NH-NHg werden in 75 ml Dimethyl-
unter Rühren be:
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formamid gelöst und unter Rühren bei -15° mit 20 ml einer 2-N
Lösung von Chlorwasserstoff in Eisessig versetzt. Nach Zugabe von 1,65 g tert.Butylnitrit wird die Lösung 10 Minuten
bei -15° gerührt und dann mit 5,5 ml Triäthylamin versetzt. Die so erhaltene. Lösung des BOC-Tetrapeptldazids wird
tropfenweise zu einer auf -10° abgekühlten Lösung von 10 g H-GIu(OtBu)-His-Phe-Arg-Try-GIy-OH in 225 ml Dimethylformamid
und 12 ml Wasser gegeben; das Reaktionsgemisch wird 20 Stunden bei 0° gerührt und darauf mit 900 ml Wasser versetzt. Das
amorphe DekapeptidwLrd abgenutscht und mit Dimethylformamid-Wasser
(1:5) und Acetonitril gewaschen. Nach Umfallen aus wässerigem Acetonitril und Aequilibrlerung mit Luftfeuchtigkeit
erhält man 12,9 S reines geschütztes Dekapeptid-tetra-
hydrat vom F. 215-2l8°(Zersetzung);
l8° + 2° (c
0,5 in Pyridln-Wasser 1:1). Die Verbindung ist im Dünnschicht
chromatogramm auf Silicagel einheitlich; Rf (52) »
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' · ,. 1643232 - 16 - · ,: :
9) BOC-D-Ser-Tyr-Ser-Nle-Olu(OtBu)-His-Phe-Arg-Try-Oly-Lys-(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys (BOC) -Lys (BOC) -Lys (BOC) -Lys (BOC)-NH2
1 g BOC-D-Ser-Tyr-Ser-Nle-OluCOtBuJ-His-Phe-Arg-Try-Oly-OH
und 0,7 g H-LyS(BOC)-PrO-VaI-OIy-LyS(BOC)-LyS(BOC)-XyS(BOC
Lys(B0C)-NH2 (vgl. Nr. C- 40 616, Case 5806/5503/Γ+2) werden In 20 ml Pyridin und 0,83 ml 1-n. Salzsäure suspendiert. Es wird 15 Minuten bei 50° gerührt. Hierauf werden 0,4 g Dloyolohexylcarbodiimid zugegeben und weitere
3 Stunden bei 50° gerührt. Dann gibt man nochmals die gleiche Menge Carbodiimid zu und rührt weitere 3 Stunden
bei 50°. Dann entfernt man den Hauptteil des Pyridine im Vakuum, versetzt den Rückstand mit 30 ml warmem Dimethylformamid, zerreibt und filtriert vom Unlöslichen ab. Das
Flltrat wird Im Hochvakuum bei 40° auf ein Volumen von ca.
5 ml eingeengt und mit viel Wasser versetzt. Das dabei ausgeschiedene Rohprodukt wird gut zerrieben, abgenutsoht,
mit Wasser gewaschen und getrocknet. Zur weiteren Reinigung wird das Produkt aus Dimethylformamid-Essigester
umgefällt und dann einer Gegenstromverteilung Im Lösungsmittelsystem Methanol-Puffer-Chloroform-Tetraohlorkoh^snstoff (10:3:7:4) [Puffer - 28,5 ml Eisessig und 19,3 S
Ammoniumaoetat in $60 ml Wasser] unterworfen. Nach 120
Verteilungsschritten wird das reine gesohützte Oktadekapeptid-amid-derivat aus den Rohren Nr. 38 - 54 erhalten
(Gewlohtsmaxinum in Rohr Nr. 44, Verteilungszahl X - 0,58)
Das Produkt zeigt bei DÜnnschiohtohromatographie auf SiIi-
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kagelplatten folgende Rf-Werte:
Rf im System Chloroform-Methanol (75:25) = 0,22
Rf (43A) =0,46
Das als Ausgangsmaterial verwendete geschützte Oktadekapeptidamid H-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-Lys-
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(BOC)-LyS(BOC)-LyS(BOC)-NH2 wird durch Kondensation von
Z-LyS(BOC)1-OH mit H-Lys(BOC)-OCH, in Gegenwart von Di-. cyclohexylcarbodiimid, Ueberführung des geschützten Dipeptidesters in das Amid mit Ammoniakgas in Methanol« Abspaltung der Carbobenzoxygruppe mit Wasserstoff in Gegenwart von Palladiumkohle und Kondensation des so erhaltenen H-Lys(BOC)-Lys(BOC)-NH2 mit dem in der deutschen Patentschrift 1 214 242 beschriebenen Z-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC)-NH-NH2 nach der Azidmetho-
de erhalten·
10) H-D-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Lys-Lys-NH«
0,5 g des durch Gegenstromverteilung gereinigten geschützten Oktadekapeptidamids werden in 10 ml eiskalter 9° £iger
TrifluoresslgsSure gelöst und die Lösung hierauf eine
Stunde bei 25° belassen. Dann wird im Vakuum auf ein
kleines Volumen eingeengt und das trifluoressigsaure Salz * des freien Oktadekapeptidamids durch Zugabe von viel peroxydfreiem Aether ausgefällt. Das hygroskopische Produkt
wird abgenutscht, mit Aether gewaschen und getrocknet. Zur Umwandlung in das Acetat wird es in 1 #Lger Essigsäure gelöst, durch eine Säule von schwach basischem
Ionenaustauscher (Merck No. II) in der Acetatform filtriert und mit 1 #iger Essigsäure nachgewaschen. Das Eluat wird
unter Zusatz von n-Ootanol bei 40° im Vakuum eingedampft,
der Rüokstand zur Entfernung von Octanol mit Petrolfither
1 ·
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gewaschen und getrocknet. Hierauf wird das Produkt in wenig Wasser gelöst und lyophilisiert. Man erhält das
Acetat des Oktadekapeptidamids, D-Ser1-Nle2t-Lys17'l8-ß1"18-
18
Cortieotropln-Lys -amids, als trockenes, fast weisses Pulver. Das OktaÜekapeptidamid zeigt bei Papierelektrophorese bei pH 6,3 eine Laufstrecke von 10 cm (gegen Kathode) (Papier : Schleicher & Schüll 2043/b, mgl; Pyrldin-acetat-Puffer; 1 Stunde; 2000 V). Bei DünnschichtChromatographie auf Aluminiumoxydplatten weist es folgende Rf-Werte auf: Rf(52A) «.0,18
Rf(IOl) »P,25
Cortieotropln-Lys -amids, als trockenes, fast weisses Pulver. Das OktaÜekapeptidamid zeigt bei Papierelektrophorese bei pH 6,3 eine Laufstrecke von 10 cm (gegen Kathode) (Papier : Schleicher & Schüll 2043/b, mgl; Pyrldin-acetat-Puffer; 1 Stunde; 2000 V). Bei DünnschichtChromatographie auf Aluminiumoxydplatten weist es folgende Rf-Werte auf: Rf(52A) «.0,18
Rf(IOl) »P,25
Man stellt eine Lösungsampulle aus folgenden Komponenten her:
Acetat des D-Ser^Nle^-Lys17' 18^3-"l8-Corti-
18
cotropin-Lys -amide 0,5 mg
cotropin-Lys -amide 0,5 mg
Gelatine 280,0 mg
Phenol 5#0 mg
dest. Wasser ad 1,0 ml
109871
- 20 Beispiel 3:
Eine steril filtrierte wässrige Lösung von D-Ser1-
u 17 iß l.lfi ! ίο
Nie -Lys '* -ß -Corticotropin-Lys -amid-acetat wird unter
aseptischen Bedingungen mit Natrium-Polyphloretinphosphat und Natriumchlorid vermischt und in Vials abgefüllt und
lyophilisiert, sodass ein Trockenvial erhalten wird, das folgende
Komponenten enthält:
109871
INSPECTED
18
tropin-Lys -amide 0,5 °>g
Natrium-Polyphloretinphoaphat (86,5 #ig) 23,20 mg
NaCl 12,28 mg
Vor Oebrauch wird der Inhalt des Trockenvials mit 2 ml destil·
llerte» Wasser, enthalten in einer Lösungsampulle, vermischt.
Beispiel 4 ί
Man löst 11,12 mg Bisessig, 1
2,5 mg Natriurauhio^id-WiCb 2rO^mgrD-fer1^Nle^-Lys17* l8-ß1"18
18
Cortiootropin-Lys -amid-acetat in 0,7 ml destilliertem Wasser
und füllt mit destilliertem Wasser auf 1 ml auf· Die
Lösung wird bei 120° 20 Minuten autoklaviert. Das pH ist
naoh der Sterilisation 3,7·
Man löst in Oi7 ml Physiologieeher Natriuraohlorid-Itsiung 0,5 mg D-a*r1-Nlt4-Iiy)il7'l8-ß1"i8-Cortlootropin-Ly·18-amid-acetat und säuert dit Lösung mit 0,1-n, SalctKur· auf
pH 3,2 an Mit destilliertem Wasser wird auf 1 ral aufgefüllt
und bei 120° 20 Minuten autoklaviert.
1Q98?1/9100
In 0,8 ml destilliertem Wasser wird eine Lösung
von 10,16 mg Zitronensäure (mit 1 Mol Kristallwasser), 0,097 ml
1-n. Natronlauge, 3,54 mg Natriumchlorid und 0,51 ml 0,1-n»
Salzsäure hergestellt?. Ih dieser Lösung werden 4,0 mg
-amidacetat
aufgelöst und mit destilliertem Wasser auf 1,0 ml aufgefüllt.
Die Lösung wird auf üb Hohe WeUe filtriert. In Ampullen abgefüllt und bei 120° 20 Minuten autoklavlert.
Man stellt eine Suspension aus folgenden Komponenten,
her:
araidaoetat 1,0 mg
ZnCl2 5*25 mg
K2O 1*05 mg
NaCl 2,0 Hg
109871/9100
ORIGINAL INSPECTED
Man stellt eine Suspension aus folgenden Komponenten her;
amidacetat -■- —„^„^^^^^ . 1,0 mg
ZnCl2 6,30 mg
NaCl 1,5 mg
Benzylalkohol 10,0 mg NaOH ad pH 8,3
2,0 g Poly-L-glutaminsäure mit einem mittleren
Molekulargewicht von oa. 39 6OO werden in oa. 5,7 ml M
10 £iger Natronlauge gelöst, sodass das pH der Lösung 7,4
1 4 beträgt« In dieser Lösung werden (dann 10 mg D-Ser -Nie -
Lye '* ·β· Ür^-Cortlootropin-Lys -amidacetat und 0,2 mg
Merthiolat aufgelöst und mit destilliertem Wasser auf 10 ml
aufgefüllt. Die Lösung wird steril filtriert. Sie enthält mit
1098?!/?1OQ
7'l8-ß1"l8-Cortiootropin-Lysl8-
amidacetat I4O mg
Poly-L-glutaminsäure 20O4O mg
Natronlauge bis pH 7#4
1O98?1/?mo
Claims (8)
1. Verfahren zur Herstellung neuer Peptide rait ACTH-Wirkung
gemäss Hauptpatent, dadurch gekennzeichnet, dass roan aus D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-norleucyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glyoyl-L-lysy1-L-proly1-L-valy1-glycy1-L-Iysyl-L-Iysyl-L-Lysy1-L-lysin-amid
oder der entsprechenden Verbindung, die statt des Glutamylrestes den Rest des Glutamins aufweist, In welchen
Peptlden mindestens die a-Amlnogruppe und die Seltenkettenaminogruppen
sowie eine gegebenenfalls vorhandene Seitenkettenoarboxylgruppe
geschützt sind, die Sohutzgruppen abspaltet uncj, wenn erwünsoht, die erhaltenen Verbindungen in ihre
Säureadditionssalze oder Komplexe überführt.
2« Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet«
dass man von einem Peptid ausgeht, in dem die Aminogruppen
duroh did tert.-ButyXoxyoarbonylgruppe und Carboxylgruppe
durch die tert.-Butylestergruppe geschützt sind.
3* Verfahren nach Anspruoh 2, dadurch gekennzeichnet,
das· man »äratliohe Schutzgruppen mittels TvItluoressigeäure abspaltet.
10987 1 η 100
" 26 ' iö/*3282
4. Verfahren zur Herstellung von D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-norleucyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valylglyoyl-L-lysyl-L-lysyl-L-lysyl-L-lysin-amid,
seinen Säure-r additionssalzen und Komplexen, dadurch gekennzeichnet, dass
man von dem genannten Amid, in dem die a-Amino- und Seitenkettenaminogruppen
durch die tert.-Butyloxycarbonylgruppe und die Seitenkeittencarboxylgruppe durch die tert»-Butylestergruppe
geschützt sind, die;Schutzgruppen abspaltet.
5. D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-norleucyl-L-glutamyl-L-histldyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-i-L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl
-li-prolyl -L-valyl -gly cyl -L-lysy 1 -L-lysyl -L-Iy syl -L-lysin-amid
sowie die entsprechende Verbindung, die statt des Glutamylrestes den Rest des Glutamin^ aufweist, ihre Säureadditionssalze
und Komplexe,
6. Komplexe des D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-norleucyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-LTarginyl-L-tryptophylglyoy
1 -I#-rlyeyl -L-pr olyl -L-valyl -glycyl -L-lysyl -L-lyeyl -
L-lysyl-L-lysin-amids mit Zinkphosphat, Zinkpyrophosphat
und/oder ZinKhydroxyd.
7. Pharmazeutisohe Präparate, dl« als aktiven Be«
•tandtt i1 D-Stryl-L-1yroeyl-L-ieryl-L-nor1tuoy1-L-fluta«yl·
L-hiitidyl-L-phenylalanyl-L-Arginyl-L-tryptophyl-giyoyl-L-
ORJGlNAt ΙΝ
1098?1/>100
lysyl-L-prolyl-L^valyl-glycyl-L-lysyl-L-'lysyr-L-lysyl-L-lysin-amid
oder die entsprechende Verbindung, die statt
des Oiutamylrestes den Rest des Glutamine aufweist, ihre Säureadditionssalze und/oder Komplexe.enthalten.
des Oiutamylrestes den Rest des Glutamine aufweist, ihre Säureadditionssalze und/oder Komplexe.enthalten.
8. Pharmazeutische Präparate wie in den Beispielen
beschrieben,
ΙΟ9 8 2 1/71Π0
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CH1884666A CH523227A (de) | 1966-12-30 | 1966-12-30 | Verfahren zur Herstellung neuer Peptidamide mit ACTH-Wirkung |
CH895267 | 1967-06-23 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE1643282A1 true DE1643282A1 (de) | 1971-05-19 |
Family
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Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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DE19671643282 Pending DE1643282A1 (de) | 1966-12-30 | 1967-12-20 | Verfahren zur Herstellung neuer Peptide mit ACTH-Wirkung |
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AT (1) | AT324585B (de) |
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CH (1) | CH523227A (de) |
DE (1) | DE1643282A1 (de) |
FR (1) | FR7370M (de) |
GB (1) | GB1210551A (de) |
NL (1) | NL6717847A (de) |
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YU (1) | YU31935B (de) |
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JPS5664716U (de) * | 1979-10-26 | 1981-05-30 | ||
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CN110698557B (zh) * | 2019-11-06 | 2021-06-18 | 郑州伊美诺生物技术有限公司 | Acth突变体、重组蛋白及其应用,以及含有该acth重组蛋白的试剂盒 |
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1966
- 1966-12-30 CH CH1884666A patent/CH523227A/de not_active IP Right Cessation
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- 1967-12-18 YU YU246467A patent/YU31935B/xx unknown
- 1967-12-20 DE DE19671643282 patent/DE1643282A1/de active Pending
- 1967-12-29 NL NL6717847A patent/NL6717847A/xx unknown
- 1967-12-29 SE SE1802367A patent/SE358155B/xx unknown
- 1967-12-29 AT AT1177367A patent/AT324585B/de not_active IP Right Cessation
- 1967-12-29 JP JP42084563A patent/JPS4825185B1/ja active Pending
- 1967-12-29 BE BE708807D patent/BE708807A/xx unknown
-
1968
- 1968-01-01 GB GB45/68A patent/GB1210551A/en not_active Expired
- 1968-03-19 FR FR144396A patent/FR7370M/fr not_active Expired
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CH523227A (de) | 1972-05-31 |
JPS4825185B1 (de) | 1973-07-26 |
YU31935B (en) | 1974-02-28 |
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NL6717847A (de) | 1968-07-01 |
FR7370M (de) | 1969-10-20 |
AT324585B (de) | 1975-09-10 |
SE358155B (de) | 1973-07-23 |
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GB1210551A (en) | 1970-10-28 |
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