DE1643282A1 - Verfahren zur Herstellung neuer Peptide mit ACTH-Wirkung - Google Patents

Description

Zusatzpatentgesuch zu Hauptpatent Nr.

Nr. C 36 439 CIBA/AKTIENGESELLSCHAFT, BASEL (SCHWEIZ)

Case 6086/1-3 1643282

Deutschland

Verfahren zur Herstellung neuer Peptide mit ACTH-Wirkung.

Im Hauptpatent Nr. (Nr. C 36 439, Case

5503/I-3/E) sind Peptide beschrieben, die sich durch eine verstärkte ACTH-Wirkung auszeichnen und die sich von den bekannten Peptiden mit ACTH-Wirkung dadurch unterscheiden, dass sie am Aminoende als erste α-Aminosäure eine D-Aminosäure aufweisen.

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Als Peptid mit sehr guter ACTH-Wlrkung 1st la Hauptpatent das H-D-Ser-Tyr-Ser-Met-Olu-His-Phe-Arg-Try-Oly-Lys-Pro-Val-Oly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-QH (D-3er -£· ^· Corticotropin) beschrieben.

Es wurde nun gefunden« das· ein Octadekapeptidamid, das an Stelle des Methloninrestee in 4-Stellung den Norleuolnrest und an Stelle der Arginlnreste in 17#l8-Stel· lung Lyslnreste enthält, eine bessere adrenocorticotrop pe Wirkung aufweist. Das neue Peptid, D-Ser¹, Nl·*, Lye¹⁷*¹®

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β -Cortiootropin-Lys -amid, läset sieh leiohter her-

• 1 1-lQ

stellen als D-Ser »0 ^-Corticotropin, weil es dl« Arginin· reste in den Stellungen 17,18, die wegen der Guanidinogruppe in der Seltenkette die Herstellung de· Peptide er· schweren, nicht enthält.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind da« D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-norleucy1-L-glutarayl-L·- histidyl -L-phenylalanyl -L-arginyl -L-tryptophyl -glyoyl-L-lysyl -L-prolyl -L-valyl -glyoyl -L-lysyl -L-lyeyl -L-ly*yl-L-Lyeln-amld sowie die entsprechende Verbindung, dl· etatt des Olutamylreste· den Rest des Olutarains aufweist« ihr· S&ureaddltlonssalze und Komplexe und Verfahren su ihrer Herstellung.

Als SXureaddltlonssalze sind besonder· Sals· von therapeutisch anwendbaren Säuren» wie Salzsäure, Essigsäure, vor allem aber eohwerlusliohe Salze, wie Sulfate, Phosphate oder Sulfonate, zu nennen·

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Unter Komplexen sind die komplexertIgen« in ihrer Struktur nooh nicht abgeklärten Verbindungen zu verstehen« die beim Zusatz gewisser anorganischer oder organischer Stoffe zu adrenocorticotrop wirksamen Peptides* entstehen und vor allem diejenigen, die ihnen ein® verlängerte Wirkung verleihen. Solche anorganische Stoffe sind Verbindungen* die sich von Metallen« wie Calcium« Magnesium« Aluminium« Cobalt und insbesondere von Zink ableiten« vor allem schwerlösliche Salze, wie Phosphate und Pyrophosphate sowie Hydroxyde dieser Metalle. Organische Stoffe« die eine Verlängerung der Wirkung hervorrufen, sind beispielsweise nicht antigene Gelatine, z.B. Oxypolygelatine, Polyvinylpyrrolidon und Carboxymethylcellulose, ferner Sulfonsäure- oder Phosphorsäureester von Alginsäure, Dextrin, Polyphenolen und Polyalkoholen, vor allem Polyphloretinphosphat und Phytinsäure« sowie Polymerisate und Copolymerisate von Aminosäuren« z.B. Protamin und insbesondere von Aminosäuren« die einen überwiegenden Anteil an sauren α-Aminosäuren, wie Glutaminsäure oder Asparaginsäure« aufweisen.

Die neuen Verbindungen besitzen« wie bereits erwähnt« eine wesentliche stärkere ACTK-Aktivität als die entsprechenden Verbindungen mit L-Konfiguration an der ersten Aminosäure. Sie sollen dementsprechend in der Human- und Veterinärmedizin verwendet werden, z.B. an Stelle des natürlichen Hormons·

Die neuen Peptide werden naoh den für die Her-

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stellung von Peptiden mit grosser Kettenlänge bekannten Methoden hergestellt unter Verwendung von D-Serin als N-terminaler Aminosäure, Dabei werden die Aminosäuren in der erwähnten Reihenfolge einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten verknüpft. Am Schluss der Synthese werden die Schutzgruppen in einer einzigen oder gegebenenfalls in mehreren Stufen abgespalten.

Das erfindungsgemässe Verfahren 1st daher dadurch gekennzeichnet, dass man aus D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-norleucyl-L-'glutamyl-L-histldyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-trypt ophyl-glyoyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-lysyl-L-lysin-amid oder der entsprechenden Verbindung, die statt des Glutamylrestes den Rest des Glutamine aufweist, in welchen Peptiden mindestens die a-Aminogruppe und die Seitenkenntenaminogruppen sowie eine gegebenenfalls vorhandene Seltenkettenoarboxylgruppe geschützt sind, die Schutz-. gruppen abspaltet und, wenn erwünscht, die erhaltenen Verbindungen in ihre Säureadditionssalze oder Komplexe überführt. Die Verknüpfung der Aminosäure- und/oder Peptideinhetfcen erfolgt in der Welse, dass man eine Aminosäure oder ein Peptid mit geschützter a-Aminogruppe und aktivierter terminaler Carboxylgruppe mit einer Aminosäure oder einem Peptid mit freier o>Amlnogruppe und freier oder geschützter, z.B. veresterter oder amidierter terminaler Carboxylgruppe, umsetzt oder dass man eine Aminosäure oder ein Peptid mit aktivierter a-Aminogruppe und geschützter terminaler Carboxylgruppe mit einer

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Aminosäure oder einem Peptid mit freier terminaler Carboxylgruppe und geschützter ct-Aminogruppe umsetzt. Die Carboxylgruppe kann beispielsweise durch Ueberführung in ein Säurehalogenid, -azid, -anhydrld, -imidazolid, -isoxazolid oder einen aktivierten Ester, wie Cyanmethylester, Carboxymethylester, p-Nitrophenylester, oder durch Reaktion mittels eines Carbodiimide (gegebenenfalls unter Zusatz von N-Hydroxysuccinimid) oder N^-Carbonyl-diimidazols aktiviert werden, die Aminogruppe beispielsweise durch Reaktion mit einem Phosphatamid aktiviert werden. Als gebräuchlichste Methoden sind zu nennen die Carbodiimidmethode, die Azidmethode, die Methode der aktivierten Ester und die Anhydridmethode.. Hervorzuheben ist auch die sogenannte Peststoffträgersynthese, bei der das Peptid vom Carboxylende, das esterartig an ein Polymeres gebunden ist, aufgebaut wird, indem man die Aminosäuren der Reihe nach ankondensiert.

An der Reaktion nicht beteiligte, freie, funk-1?ionelle Gruppe werden zwejckmässigerweise gesohützt, insbesondere mittels durch Hydrolyse oder Reduktion leicht abspaltbarer Reste, die Carboxylgruppe vorzugsweise durch Veresterung, z.B. mit Methanol, tert.-Butanol, Benzylalkohol, p-Nltrobenzylalkohol, die Aminogruppe beispielsweise durch Einführung der Tosyl-, Trltyl-, Pprmyl-, Trifluoracetyl-, o-Nitraphenylsulfenyl-, Phthalyl- oder Carbobenzoxygruppe oder farbiger Schutzgruppen, wie der p-Phenylazo-benzyloxycarbonylgruppe und der p-ip'-MethOjxy-phenylazo^benzyloxyqarbonylgrup-

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ORtQlNAL INSPECTED

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pe, oder Insbesondere des tert.-Butyloxycarbonylrestes. Zum Schutz der Aminogruppe in der Guanidogrupplerung des Arginine 1st die Nitrogruppe geeignet; die genannte Aminogruppe des Arginine muss aber bei der Reaktion nicht notwendig geschützt werden. Die Iminogruppe des Histidins kann durch den Benzyl- oder Tritylrest geschützt werden.

Die Umwandlung einer geschützten Amino- oder Iminogruppe in eine freie Gruppe sowie die Ueberführung einer funktionell abgewandelten Carboxylgruppe in eine freie Carboxylgruppe im Verlaufe des Verfahrens erfolgt nach an sich bekannten Methoden durch Behandlung mit hydrolysierenden bzw. reduzierenden Mitteln.

. Ein bevorzugtes Verfahren besteht darin, dass man das die ersten 3 Aminosäuren, H.D.Ser-Tyr-Ser-OH enthaltende Tripaptld (die abgekürzte Schreibwelse bezieht sich auf L-Aminosäuren, wenn das D- nicht besonders bezeichnet ist), oder das ausserdem die ^. Aminosäure enthaltende Tetrapeptid mit dem Heptapeptid bzw. Hexapeptid der folgenden Aminosäuren bis zur Aminosäure 10 kondensiert, vorzugsweise nach der Azidmethode, und dann das Dekapeptid mit dem Ootapeptidamid der Aminosäuren 11-18.kondensiert,

Bei dieser Kondensation wird als Kupplungsmethode vorzugsweise die Carbodilmidmethode oder die Methode der aktivierten Ester, vor allem mittels des p-Nitrophenylesters, verwendet. Im letzten Falle braucht der p-Nitrophenylester des Dekapeptids nicht als solcher isoliert zu

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werden« sondern kann auch in der Kondensationsstufe selbst aus dem Dekapeptid mit freier Carboxylgruppe, p-Nitrophenol und Dioyclohexylcarbodiimid gebildet werden. Das Dekapeptid liegt also als a-Amino-gesehütztes Peptid mit freier Carboxylgruppe oder mit einer p-Nitrophenylester-. gruppe vor. Die in den zu kondensierenden Peptidbruohstüoken vorhandenen Seitenketten-Aminogruppen werden vorzugsweise duroh die tert«-Butyloxycarbonylgruppe, die Carboxylgruppe durch die tert.-Butylestergruppe geschützt. Diese Schutzgruppen können in der letzten Stufe mit Trifluoressigsäure abgespalten werden«

Die Erfindung betrifft auch diejenigen Ausführungsfarmen des Verfahrens, bei denen man von einer auf irgendeine? Stufe des Verfahrens als Zwischenprodukt erhältlichen Verbindung ausgeht und die fhe!enden Verfahrensschritte durchführt, oder das Verfahren auf irgendeiner Stufe abbricht, sowie die dabei erhaltenen Zwischenprodukte.

Je nach der Arbeitsweise erhält man die neuen Verbindungen in Form von Basen oder ihren Salzen. Aus den Salzen können in an sich bekannter Weise die Basen gewonnen werden. Von letzteren wiederum lassen sich durch Umsetzung mit Säuren, die zur Bildung therapeutisch verwendbarer Salze geeignet sind, Salze gewinnen, wie z.B. solohe mit anorganischen Säuren, wie Halogenwasserstoffsäuren, beispielsweise Salzsäure oder Bromwasserstoffsäure, Perchlorsäure, Salpetersäure oder Thiοcyansäure, Schwefel- oder

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PhosphorsSuren, oder organischen Säuren, wie Ameisensäure, •Essigsäure, Propionsäure, Glycolsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Oxalsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Aepfelsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Ascorbinsäure, Hydroxymaleinsäure, Dihydroxymaleinsäure. Benzoesäure, Phenylessigsäure, 4-Aminobenzoesäuren 4-Hydröxybenzoesäure, Anthranilsäure, Zimtsäure, Mandelsäure, Salicylsäure, 4-Aminosalicylsäure, 8-Phenoxybenzoesäure, g-Acetoxybenzoesäure, Methansulfonsäure, Aethansulfonsäure, Hydroxyäthansulfonsäure, Benzolsulfonsäure, p-Toluolsulfonsäure, Naphthalinsulfonsäure oder SuIfanilsäure«

Die verfahrensgemäss erhaltenen Peptide können in.Form von pharmazeutischen Präparaten Verwendung finden. Diese enthalten die Peptide in Mischung mit einem für . die enterale oder parenterale Applikation geeigneten ^ pharmazeutischen, organischen oder anorganischen Trägermaterial. Für dasselbe kommen-solche Stoffe in Frage, die mit den Polypeptiden nfc ht reagieren, wie z.B. Gelatine, Milchzucker, Glukose, Kochsalze, Stärke, Magnesiumstearat, Talk, pflanzliche OeIe, Benzylalkohol, Gummi, Polyalkylenglykole, Vaseline, Cholesterin oder andere bekannte Arzneimittelträger* Die pharmazeutischen Präparate können z.B. als Lyophilisat oder in flüssiger Form als Lösungen; Suspensionen oder Emulsionen vorliegen. Gegebenenfalls sind

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sie sterilisiert und bzw. oder enthalten Hilfsstoffe, wie Konservierungs-, Stabillsierungs-, Netz- oder Emulgiermittel. Sie können auch noch andere therapeutisch wertvolle Stoffe enthalten.

So kann man sie beispielsweise auch mit den in der ACTH-Therapie Üblichen Zusätzen zur Verlängerung der Wirkung, wie z.B. Oxypolygelatine, Polyphloretlnphosphat, Carboxymethylcellulose, oder den oben erwähnten schwerlöslichen Metallverbindungen* insbesondere Phosphaten, Pyrophosphaten oder Hydroxyden des Zinks, kombinieren·

Welter kann man zur Verlängerung der Wirksamkeit die neuen Peptide In ihre Komplexe mit Polymerisaten oder Copolymerisate^ von Aminosäuren, insbesondere solchen, die einen überwiegenden Anteil an sauren α-Aminosäuren, wie Glutaminsäure oder Asparaginsäure der L-, D- oder D,L-Konfiguration, aufweisen, überführen, Die genannten Polymerisate und Copolymerisate weisen In den Seitenketten freie Carboxylgruppen auf, während die terminale Carboxylgruppe frei oder funktionell abgewandelt sein, z.B. als Estergruppe oder als eine uneubstitulerte oder durch Kohlenwasserstoffreste, vor allem niedere Alkylgruppen, substituierte Amidgruppe, vorliegen kann. Das Molekulargewicht der Polymerisate kann zwischen lOOGO und 100 000 liegen, vorzugsweise beträgt es 20000- .80 000, Man verwendet für die Herstellung der Präparate zweckmässlg ein wasserlösliches, physiolo-

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gisoh verträgliches SaXz, z.B. das Natrium- oder Ammoniumsalze oder ein Salz mit einer organischen Base, wie Triethylamin, Procain, Dibenzylamin, oder anderen tertiären Stickstoffbasen.

Die Polymeren sind bekannt oder können nach bekannten Verfahren hergestellt werden, beispielsweise nach dem von M.Ideleon et al., J.Am.Chem.Soo. 80, 4631 et seq. (1958) beschriebenen Verfahren. So kann man z.B. Glutaminsäure -a-oarboxyanhydrid^-benzylester oder -tert.-butylester in Dioxan mit Ammoniak oder einem AmIn in einem bestimmten Molverhältnis, z.B. 100 : 1 (Je nach dem gewünschten Polymer isationsgrad), reagieren lassen und nach beendeter Polymerisation die Sohutzgruppen abspalten, z.B. die Benzyloxygruppe mit Bromwasserstoff in Eisessig, die tert.-Butyloxygruppe mit TrIfluoressigsäure. Zwecks Herstellung von Polymeren mit elnheiltllcher, definierter Kettenlänge kann man die Polymeren auch duroh Synthese nach den in der Peptidchemie bekannten Verfahren (Carbodilmidmethode, Azldmethode etc») aufbauen·

Die Konzentration des Polymeren in den pharmazeutischen Präparaten hängt von der Löslichkeit des betreffenden Salzes und von der Viskosität ab. Das Polymere soll in den Präpraten in gelöster Form vorliegen können und injizierbar sein. \

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Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen beschrieben. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben.

Die dünnschiehtchromatographischen Systeme werden wie folgt bezeichnet:

System 43A : tert.-Amylalkohol-Isopropanol-Wasser (67:26s7) System 43C : tert.-Amylalkohol-Isopropanol-Wasser (51:21:28) System 52 j n-Butanol-Eisessig-Wasser (1QO:10:30) System 52A : n-Butanol-Eisessig-Wasser (67:10:23) System 100 : Aethylacetat-Pyridin-Eisessig-Wasser (62:21:6x2 System 101 : n-Butanol-Pyridin-Eisessig-Wasser (38:24:8:30) Folgende Abkürzungen werden verwendet: Z · Carbobenzoxy
BOC ρ tert.-Butyloxyoarbonyl
tBu « tert.-Butyl.

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Beispiel 1:

I) H-NIe-OCH

l8,4 g L-Norleucin werden in 57 ml Methanol suspendiert und unter Rühren bei -15° innert ^O Minuten 11 ml Thionylchlorid hinzugefügt. Man rührt noch,weitere $0 Minuten bei -15 , dann je 9° Minuten bei 0 und bei Zimmertemperatur. Nach 3-stündigem Stehen bei 40 dampft man die Lösung bei 35 zur Trockne ein und kristallisiert den Rückstand aus Aceton-Hexan (2:1) um. P. l4O-l4l°.

18,1 g des Hydrochlorids werden in 20 ml Wasser gelöst, mit 200 ml Aether überschichtet und bei 0° mit 40 ml kalter gesättigter Kaliumcarbonatlösung versetzt. Man extrahiert die wässerige Phase mehrmals mit Aether, vereinigt die ätherischen Lösungen, trocknet sie über Natriumsulfat und dampft sie am Hochvakuum bei 0° ein. Der freie Ester wird als klares OeI erhalten.

B) BOC-Ser-Nie-OCH

Eine Lösung von 22,3 S BOC-L-serin-hydrat in 270 ml Acetonitril wird mit einer Lösung von 14,3 g L-Norleucinmethylester in 65 ml Acetonitril versetzt. Man kühlt auf -5° ab, gibt 22,7 g Dicyclohexylcarbodiimid in 35 mi Acetonitril hinzu, rührt noch 1 Stunde bei -5 , dann über Nacht bei 0°, befreit vom Dicyclohexylharnstoff und dampft die Lösung bei 35° ein. Den Rückstand nimmt man in Essigester auf, wäscht die Lösung mit

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N-Salzsäure, N-Natriumbicarbonat und gesättigter Natriumchloridlösung und dampft sie ein. Der kristalline Dipeptidester schmilzt bei 69-71°·

3) H-Ser-Nle-OCH,

28,0 g BOC-Ser-Nle-OCH werden in 320 ml 90 #iger Trifluoressigsäure gelöst und 2 Stunden bei Zimmertemperatur belassen. Nach Einengen der Lösung auf das halbe Volumen versetzt man sie mit 500 ml Aether, wobei das Trifluoracetat auskristallisiert. Dieses (24,2 g) wird in 35 ml Wasser gelöst, die Lösung mit 700 ml Chloroform unterschichtet und unter Rühren bei 0 mit 210 ml gesättigter Kaliumcarbonatlosung versetzt. Aus der Chloroformphase werden 16,1 g kristalliner Dipeptidester vom P. .84-85 gewonnen.

4) BOC-Tyr-Ser-Nle-OCiL·

19,6 g BOC-Tyr-OH und 16,1 g H-Ser-Nle-OCKL werden in einem Gemisch von 350 ml Acetonitril und 17,5 ml Dimethylformamid gelöst, bei -5 mit einer Lösung von 15*9 S Dicyclohexylcarbodiimid in 175 ml Acetonitril versetzt und 1 Stunde bei -5 , dann über Nacht bei 0 gerührt. Man befreit vom Dicyclohexylharnstoff, wäscht wie oben angegeben und dampft die Lösung ein. Der geschützte Tripeptidester schmilzt nach Umkristallisieren bei 143-145°.

5) H-Tyr-Ser-Nle-OCH

27,3 S ^des geschützten Tripeptidestera werden in 82,5 ml N-Salzsäure in Methanol gelöst, 2 Stunden bei Zimmertemperatur

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stehen gelassen und dann mit 1,5 1 Aether versetzt. Man erhält das Hydrochlorid des freien Tripeptidesters, das nach" Umkristallisation bei 218-220° (Zersetzung) schmilzt. l4,2 g des Hydrochlorides werden in 20 ml Wasser gelöst, mit 400 ml Chloroform unterschichtet und bei 0 mit 100 ml gesättigter Kaliumcarbonatlösung versetzt. Die freie Base schmilzt nach Umkristallisieren bei 84-86 .

P 6) BOC-D-Ser-Tyr-Ser-Nle-OCH

12,4 g H-Tyr-Ser-Nle-OCH, werden in 250 ml Acetonitril gelöst und nach Zugabe von 15 ml Dimethylformamid mit 7,35 g BOC-D-Serin versetzt. Bei -5° fügt man eine Lösung von 7,45 g Dicyclohexylcarbodiimid in J>0 ml Acetonitril zu und rührt dann 1 Stunde bei -5 und über Nacht bei 0 . Man befreit vom Dicyclohexylharnstoff, dampft die Lösung ein. Der geschützte Tetrapeptidester schmilzt nach Umkristallisieren bei 149-151° (Zersetzung).

7) BOG-D-Ser-Tyr-Ser-Nie-NH-NH₀

11,65 g Tetrapeptidester werden in 50 ml Methanol gelöst, 4,8 ml Hydrazinhydrat zur Lösung hinzugefügt und die Mischung 24 Stunden beim Zimmertemperatur stehen gelassen. Man gibt 50 ml Wasser hinzu und rührt, bis das gallertige Produkt vollständig durchkristallisiert ist. Es schmilzt bei 205-207°.

8) BOC-D-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu(OtBu)-His-Phe-Arg-Try-GIy-OH

8,75 g BOC-D-Ser-Tyr-Ser-Nle-NH-NHg werden in 75 ml Dimethyl-

unter Rühren be:

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formamid gelöst und unter Rühren bei -15° mit 20 ml einer 2-N

Lösung von Chlorwasserstoff in Eisessig versetzt. Nach Zugabe von 1,65 g tert.Butylnitrit wird die Lösung 10 Minuten bei -15° gerührt und dann mit 5,5 ml Triäthylamin versetzt. Die so erhaltene. Lösung des BOC-Tetrapeptldazids wird tropfenweise zu einer auf -10° abgekühlten Lösung von 10 g H-GIu(OtBu)-His-Phe-Arg-Try-GIy-OH in 225 ml Dimethylformamid und 12 ml Wasser gegeben; das Reaktionsgemisch wird 20 Stunden bei 0° gerührt und darauf mit 900 ml Wasser versetzt. Das amorphe DekapeptidwLrd abgenutscht und mit Dimethylformamid-Wasser (1:5) und Acetonitril gewaschen. Nach Umfallen aus wässerigem Acetonitril und Aequilibrlerung mit Luftfeuchtigkeit erhält man 12,9 S reines geschütztes Dekapeptid-tetra-

hydrat vom F. 215-2l8°(Zersetzung);

l8° + 2° (c

0,5 in Pyridln-Wasser 1:1). Die Verbindung ist im Dünnschicht chromatogramm auf Silicagel einheitlich; Rf (52) »

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' · ,. 1643232 - 16 - · ,: :

9) BOC-D-Ser-Tyr-Ser-Nle-Olu(OtBu)-His-Phe-Arg-Try-Oly-Lys-(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys (BOC) -Lys (BOC) -Lys (BOC) -Lys (BOC)-NH₂

1 g BOC-D-Ser-Tyr-Ser-Nle-OluCOtBuJ-His-Phe-Arg-Try-Oly-OH und 0,7 g H-LyS(BOC)-PrO-VaI-OIy-LyS(BOC)-LyS(BOC)-XyS(BOC Lys(B0C)-NH₂ (vgl. Nr. C- 40 616, Case 5806/5503/Γ+2) werden In 20 ml Pyridin und 0,83 ml 1-n. Salzsäure suspendiert. Es wird 15 Minuten bei 50° gerührt. Hierauf werden 0,4 g Dloyolohexylcarbodiimid zugegeben und weitere 3 Stunden bei 50° gerührt. Dann gibt man nochmals die gleiche Menge Carbodiimid zu und rührt weitere 3 Stunden bei 50°. Dann entfernt man den Hauptteil des Pyridine im Vakuum, versetzt den Rückstand mit 30 ml warmem Dimethylformamid, zerreibt und filtriert vom Unlöslichen ab. Das Flltrat wird Im Hochvakuum bei 40° auf ein Volumen von ca. 5 ml eingeengt und mit viel Wasser versetzt. Das dabei ausgeschiedene Rohprodukt wird gut zerrieben, abgenutsoht, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Zur weiteren Reinigung wird das Produkt aus Dimethylformamid-Essigester umgefällt und dann einer Gegenstromverteilung Im Lösungsmittelsystem Methanol-Puffer-Chloroform-Tetraohlorkoh^snstoff (10:3:7:4) [Puffer - 28,5 ml Eisessig und 19,3 S Ammoniumaoetat in $60 ml Wasser] unterworfen. Nach 120 Verteilungsschritten wird das reine gesohützte Oktadekapeptid-amid-derivat aus den Rohren Nr. 38 - 54 erhalten (Gewlohtsmaxinum in Rohr Nr. 44, Verteilungszahl X - 0,58) Das Produkt zeigt bei DÜnnschiohtohromatographie auf SiIi-

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kagelplatten folgende Rf-Werte:

Rf im System Chloroform-Methanol (75:25) = 0,22

Rf (43A) =0,46

Das als Ausgangsmaterial verwendete geschützte Oktadekapeptidamid H-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-Lys-

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(BOC)-LyS(BOC)-LyS(BOC)-NH₂ wird durch Kondensation von Z-LyS(BOC)₁-OH mit H-Lys(BOC)-OCH, in Gegenwart von Di-. cyclohexylcarbodiimid, Ueberführung des geschützten Dipeptidesters in das Amid mit Ammoniakgas in Methanol« Abspaltung der Carbobenzoxygruppe mit Wasserstoff in Gegenwart von Palladiumkohle und Kondensation des so erhaltenen H-Lys(BOC)-Lys(BOC)-NH₂ mit dem in der deutschen Patentschrift 1 214 242 beschriebenen Z-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC)-NH-NH₂ nach der Azidmetho- de erhalten·

10) H-D-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Lys-Lys-NH«

0,5 g des durch Gegenstromverteilung gereinigten geschützten Oktadekapeptidamids werden in 10 ml eiskalter 9° £iger TrifluoresslgsSure gelöst und die Lösung hierauf eine Stunde bei 25° belassen. Dann wird im Vakuum auf ein kleines Volumen eingeengt und das trifluoressigsaure Salz * des freien Oktadekapeptidamids durch Zugabe von viel peroxydfreiem Aether ausgefällt. Das hygroskopische Produkt wird abgenutscht, mit Aether gewaschen und getrocknet. Zur Umwandlung in das Acetat wird es in 1 #Lger Essigsäure gelöst, durch eine Säule von schwach basischem Ionenaustauscher (Merck No. II) in der Acetatform filtriert und mit 1 #iger Essigsäure nachgewaschen. Das Eluat wird unter Zusatz von n-Ootanol bei 40° im Vakuum eingedampft, der Rüokstand zur Entfernung von Octanol mit Petrolfither

¹ ·

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gewaschen und getrocknet. Hierauf wird das Produkt in wenig Wasser gelöst und lyophilisiert. Man erhält das

Acetat des Oktadekapeptidamids, D-Ser¹-Nle^2t-Lys¹⁷'^l8-ß¹"¹⁸-

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Cortieotropln-Lys -amids, als trockenes, fast weisses Pulver. Das OktaÜekapeptidamid zeigt bei Papierelektrophorese bei pH 6,3 eine Laufstrecke von 10 cm (gegen Kathode) (Papier : Schleicher & Schüll 2043/b, mgl; Pyrldin-acetat-Puffer; 1 Stunde; 2000 V). Bei DünnschichtChromatographie auf Aluminiumoxydplatten weist es folgende Rf-Werte auf: Rf(52A) «.0,18
Rf(IOl) »P,25

Beispiel 2:

Man stellt eine Lösungsampulle aus folgenden Komponenten her:

Acetat des D-Ser^Nle^-Lys¹⁷' ¹⁸^^3-"^l8-Corti-

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cotropin-Lys -amide 0,5 mg

Gelatine 280,0 mg

Phenol 5#0 mg

dest. Wasser ad 1,0 ml

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- 20 Beispiel 3:

Eine steril filtrierte wässrige Lösung von D-Ser¹-

u 17 iß l.lfi ^! ίο

Nie -Lys '* -ß -Corticotropin-Lys -amid-acetat wird unter aseptischen Bedingungen mit Natrium-Polyphloretinphosphat und Natriumchlorid vermischt und in Vials abgefüllt und lyophilisiert, sodass ein Trockenvial erhalten wird, das folgende Komponenten enthält:

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INSPECTED

Acetat des D-Ser^Nle^-Lys¹⁷' -^"^-Cortioo-

18 tropin-Lys -amide 0,5 °>g

Natrium-Polyphloretinphoaphat (86,5 #ig) 23,20 mg NaCl 12,28 mg

Vor Oebrauch wird der Inhalt des Trockenvials mit 2 ml destil· llerte» Wasser, enthalten in einer Lösungsampulle, vermischt.

Beispiel 4 ί

Man löst 11,12 mg Bisessig, 1 2,5 mg Natriurauhio^id-WiCb 2rO^mgrD-fer¹^Nle^-Lys¹⁷* ^l8-ß¹"¹⁸

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Cortiootropin-Lys -amid-acetat in 0,7 ml destilliertem Wasser und füllt mit destilliertem Wasser auf 1 ml auf· Die Lösung wird bei 120° 20 Minuten autoklaviert. Das pH ist naoh der Sterilisation 3,7·

Beispiel 5 :

Man löst in Oi7 ml Physiologieeher Natriuraohlorid-Itsiung 0,5 mg D-a*r¹-Nlt⁴-Iiy)i^l7'^l8-ß¹"ⁱ⁸-Cortlootropin-Ly·¹⁸-amid-acetat und säuert dit Lösung mit 0,1-n, SalctKur· auf pH 3,2 an Mit destilliertem Wasser wird auf 1 ral aufgefüllt und bei 120° 20 Minuten autoklaviert.

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Beispiel 6 :

In 0,8 ml destilliertem Wasser wird eine Lösung von 10,16 mg Zitronensäure (mit 1 Mol Kristallwasser), 0,097 ml 1-n. Natronlauge, 3,54 mg Natriumchlorid und 0,51 ml 0,1-n» Salzsäure hergestellt?. Ih dieser Lösung werden 4,0 mg

-amidacetat

aufgelöst und mit destilliertem Wasser auf 1,0 ml aufgefüllt. Die Lösung wird auf üb Hohe WeUe filtriert. In Ampullen abgefüllt und bei 120° 20 Minuten autoklavlert.

Beispiel 7 »

Man stellt eine Suspension aus folgenden Komponenten, her:

araidaoetat 1,0 mg

ZnCl₂ 5*25 mg

K₂O 1*05 mg

NaCl 2,0 Hg

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ORIGINAL INSPECTED

Beispiel 8 :

Man stellt eine Suspension aus folgenden Komponenten her;

D-Ser¹-'Nle^if-Lye^I7'^l8-ß¹"^l8-Cortiootropin-Lys¹⁸=

amidacetat -■- —„^„^^^^^ . 1,0 mg

ZnCl₂ 6,30 mg

Na₂HPO₄.2 HgO 1,26 mg

NaCl 1,5 mg

Benzylalkohol 10,0 mg NaOH ad pH 8,3

Dest. Wasser ad 11,0 ml Beispiel 9 t

2,0 g Poly-L-glutaminsäure mit einem mittleren Molekulargewicht von oa. 39 6OO werden in oa. 5,7 ml M

10 £iger Natronlauge gelöst, sodass das pH der Lösung 7,4

1 4 beträgt« In dieser Lösung werden (dann 10 mg D-Ser -Nie -

Lye '* ·β· Ür^-Cortlootropin-Lys -amidacetat und 0,2 mg Merthiolat aufgelöst und mit destilliertem Wasser auf 10 ml aufgefüllt. Die Lösung wird steril filtriert. Sie enthält mit

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⁷'^l8-ß¹"^l8-Cortiootropin-Lys^l8-

amidacetat I₄O mg

Poly-L-glutaminsäure 20O₄O mg Natronlauge bis pH 7#4

Merthiolat 0,02 rag Dest. Wasser ad 1,0 ml

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Claims (8)

Patentansprüche :

1. Verfahren zur Herstellung neuer Peptide rait ACTH-Wirkung gemäss Hauptpatent, dadurch gekennzeichnet, dass roan aus D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-norleucyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glyoyl-L-lysy1-L-proly1-L-valy1-glycy1-L-Iysyl-L-Iysyl-L-Lysy1-L-lysin-amid oder der entsprechenden Verbindung, die statt des Glutamylrestes den Rest des Glutamins aufweist, In welchen Peptlden mindestens die a-Amlnogruppe und die Seltenkettenaminogruppen sowie eine gegebenenfalls vorhandene Seitenkettenoarboxylgruppe geschützt sind, die Sohutzgruppen abspaltet uncj, wenn erwünsoht, die erhaltenen Verbindungen in ihre Säureadditionssalze oder Komplexe überführt.

2« Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet« dass man von einem Peptid ausgeht, in dem die Aminogruppen duroh did tert.-ButyXoxyoarbonylgruppe und Carboxylgruppe durch die tert.-Butylestergruppe geschützt sind.

3* Verfahren nach Anspruoh 2, dadurch gekennzeichnet, das· man »äratliohe Schutzgruppen mittels TvItluoressigeäure abspaltet.

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4. Verfahren zur Herstellung von D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-norleucyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valylglyoyl-L-lysyl-L-lysyl-L-lysyl-L-lysin-amid, seinen Säure-r additionssalzen und Komplexen, dadurch gekennzeichnet, dass man von dem genannten Amid, in dem die a-Amino- und Seitenkettenaminogruppen durch die tert.-Butyloxycarbonylgruppe und die Seitenkeittencarboxylgruppe durch die tert»-Butylestergruppe geschützt sind, die;Schutzgruppen abspaltet.

5. D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-norleucyl-L-glutamyl-L-histldyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-i-L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl -li-prolyl -L-valyl -gly cyl -L-lysy 1 -L-lysyl -L-Iy syl -L-lysin-amid sowie die entsprechende Verbindung, die statt des Glutamylrestes den Rest des Glutamin^ aufweist, ihre Säureadditionssalze und Komplexe,

6. Komplexe des D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-norleucyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L_Targinyl-L-tryptophylglyoy 1 -I#-rlyeyl -L-pr olyl -L-valyl -glycyl -L-lysyl -L-lyeyl - L-lysyl-L-lysin-amids mit Zinkphosphat, Zinkpyrophosphat und/oder ZinKhydroxyd.

7. Pharmazeutisohe Präparate, dl« als aktiven Be«

•tandtt i1 D-Stryl-L-1yroeyl-L-ieryl-L-nor1tuoy1-L-fluta«yl· L-hiitidyl-L-phenylalanyl-L-Arginyl-L-tryptophyl-giyoyl-L-

ORJGlNAt ΙΝ

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lysyl-L-prolyl-L^valyl-glycyl-L-lysyl-L-'lysyr-L-lysyl-L-lysin-amid oder die entsprechende Verbindung, die statt
des Oiutamylrestes den Rest des Glutamine aufweist, ihre Säureadditionssalze und/oder Komplexe.enthalten.

8. Pharmazeutische Präparate wie in den Beispielen beschrieben,

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