DE1668875A1 - Neue Peptide mit ACTH-Wirkung - Google Patents

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Aktenzeichen: P Ϊ6 68 875.8-42 1ßßR87R

Unser zeichen: 21 250-BR/bu .-_... ^IVWÜIiN

CIBA AKTIENGESELLSCHAFT, BASEL (SCHWEIZ) Case 6099/I-3

Deutschland

Neue Peptide mit -ACTH-Wirkung.

Im Hauptpatent Nr. (Nr. C 36 ^.39, Case

5503/I-3/E) sind Peptide beschrieben, die sich durch eine verstärkte ACTH-Wirkung auszeichnen und die sich von den bekannten Peptiden mit ACTH-Wirkung dadurch unterscheiden, dass sie am Aminoende.alserste α-Aminosäure eine D-Aminosäure aufweisen.

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BAD ORIGINAL

■Als Peptid rait sehr guter ACTH-Wirkung ist im Hauptpatent das H-D-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-OH· .(D-Ser -ß."*. -Corticotropin) beschrieben. ■ ■··■.. · . '· ' Es wurde nun gefunden, dass das entsprechende Peptid das an Stelle des Methionihrestes in 4-StelXung den Norleucinrest und an Stelle der Argininreste in=17*'l8-Stellung Lysin·»

w reste enthält, eine bessere adreno.corticotrope V/lrkung au'f-'

· · ι 4 ■ 17 l8 1-24· weist. Das neue Peptid, D-Ser·, Nie , Lys " -ß -Corticotropin, lässt sich leichter 'herstellen als D-Ser -ß " -' Corticotropin, weil es die Argininreste in den Stellungen 17*l8,. die wegen der Guanidinogruppe in der Seitenkette die :Herstellung des-Peptids 'erschweren, nicht enthält. ". . · . Gegenstand der'VOrIie'genden'Erfindung'sind daher b-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-norleu'cyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-! phenylalanyl-Lrarginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-lysyi-L~prolDyl- -L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-.L-lysyl-L-lysyr-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl~L-valyl-L-tyrosyl-L-prolln sowie die entsprechen-' de Verbindung, die statt des,.Glutamylrestes den. Rest des Glut-■ amins aufweist, ihre C-terminalen Amide, und Säureadditionssalze^: und Komplexe dieser Verbindmgen, sowie Veriahren zu ihrer Herstellung.

.Als· Säureadditionssalze .sind, besonders Salze von therapeutisch anwendbaren Säuren, wie Salzsäure, Essigsäure* vor allem aber schwerlösliche-Salze, wie Sulfate/ Phosphate oder Sulfonate, zu nennen. .

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.■■'■ Unter Komplexen.sind die-komplexartigen. In ihrer •Struktur noch nicht' abgeklärten 'Verbindungen zu .verstehen,, ^! ' die beim Zusatz gewisser anorganischer oder organischer ßtof« •fe zu'adrenocorticotrop wirksamen Peptiden "entstehen und vor' allem·, diejenigen, die-.;ihnen· eine, verlängerte Wirkung verleihen.. Solche anorganische Stoffe,sind-Verbindungen, die sich- von Metallen, wie Cäiciuln/. Magnesium, Aluminium, Cobalt und insbesondere'· von Zink'ableiten,, vor -allem schwer lösliche' Salze,;.wie Phosphate -und Pyrophosphäte' sowie Hydroxyde dieser-Metalle,· Organische Stoffe, die eine Verlängerung ··- der Wirkung hervorrufen, sind:beispielsweise'nicht antigene . Gelatine, ζ;B. Oxypolygeiätlhe,^Polyvinylpyrrolidon und. Carboxymethylcellulose; ferner. Sulfonsäuren oder "Phosphor- ·'"» säureester von Alginsäure,:·Dextrin,-Polyphenoien'und Polyr alkoholen, vor allem Polyphloretinphosphat. und .Phytinsäure/ sowie "Polymerisate"und Copolymerisate, vb, η ■'Aminosäuren., z.B. Protamin und"insbesondere.von AmlnOsäuren,.die einen über- . wiegenden Anteil an sauren, cc-Aminosäuren, wie' Glutaminsäure . oder Asparaginsäure,' aufweisen·. '.·.. ,"'^ik- "'··'.·· ",; ■'. ·· '

•Die neuen Verbindungen besitzen, wie/bereits erwähnt, eine wesentlich stärkere-AGTH-Aktivitat als "die ent-

109831/2184 OBIGEM.

-■4. -.-·■■■

• sprechenden "Verbindungen mit Argininresteri in 1J₁ 18 -St el lung»· ■ Sie sollen'dementsprechend" in der Human- und Veterinärmedlzin verwendet, werden,· z,B. an Stelle des natürlichen Hor-"mon's;· ■•."'4_._/_.;■·;■>_■■- -ν" " T-_# .-^V-¹''-"W" ·'.''.'■ · "/"'".··''-.·.'. ; ^-- .' "-■'-■ '.ν . Die neuen Peptide ,werden nach den· für die Herstellung von Peptiden mit grosser·Kettenlänge bekannten Methoden hergestellt unter'.Verwendung einer'D-Aminosäure als N-ter^ minaler Aminosäure.' Dabei werden· die.. Aminosäuren in der erwähnten Reihenfolge einzeln'.oder.nach vorheriger Bildung kleinerer· Peptideinhei ten .'verknüpft. Arn Schluss der Synthese werden die Sehutzgruppen in·einer einzigen' oder gegebenenfalls" in mehreren' ,Stufen abgespalten.' .

Demgemäss werden die neuen Peptide und Peptidamide erhalten, wenn man aus D-Seryl-L-tyrosyl-L~seryl-L-norleucyl-L-glutamyl-(oder L-glutamJnyl) -L-hlβtldylri'-phenylalanyl -L-arginyl -L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl^trprOlylrL-valyl-giycyl-L-lysyl-L-'■lysyl-t-lysyJ-A-lysyl-L-prolyirL-yalyi^-lysyl-L'-valyl-L·- tyrosyl-L-prolin oder ihren C-terminalen Amiden, in welchen Verbindungen mindestens die a-Aminogruppe und die Seitenkettenamlnogruppen sowie gegebenenfalls vorhandene Seitenketten- oder termlnale Carboxylgruppen geschützt sind, " die Schutzgruppen abspaltet und, wenn erwünscht, die erhaltenen Verbindungen in Ihre Säureadditionssalze, oder Komplexe überführt. Die Verknüpfung der Aminosäure- und/oder Peptideinheiten erfolgt in der Weise* dass

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τ· 5 -

man eine Aminosäure oder "ein Peptid mit geschützter a-Aminogruppe und aktivierter terminaler·Carboxylgruppe mit.einer Aminosäureoder, einem Peptid· .mit freier a-Aminogruppe und freier oder geschützter, z.Bv.Veresterter oder' amidierter.terminäler Carboxylgruppe, umsetzt oder dass man eine Aminosäure oder ein Peptid mit aktivierter a-'Äminögruppe. und geschützter terminaler Carboxylgruppe mit einer'^vAminosäure "oder einem Peptid mit freier terminäler ,Carboxylgruppe" und'· geschützter a-Aminogruppe umsetzt·.·"·Die..Carboxylgruppe 'kann beispielsweise durch Ueberführung in ein Säurehaiogeni'd_/; -azid, ;-anhydrid, · -Imidazolid,-isoxäzoiid oder einen aktivierten Ester, wie Cyanmethylester, -Carboxymethylesteiv p-Nltrop'henyiester, oder durch Reaktion· mittels· eines Carbodiimids^;(gegebenenfalls unter· Zusatz' von N-Kydroxy-suc'cinimid;) oder.. N^N' -Carbonyi-diimida'zols aktiviert • .werdeni-"die. Aminogruppe-beispielsweise "durch Reaktion mit·' · einem-Phosphatamid aktiviert.werden..Als gebräuchlichste Me-· thoden .sind zu nennen'die .Carbodiimidmethode/ die- Azidmethode, die Methode der aktivierten Ester und die .Anhydridmethode .· -Hervorzuheben ist auch, die' Feststoffträgersynth'ese^ bei der das Peptid vom Carboxylende, das esterartig an ein • Polymeres gebunden ist/ aufgebaut wird, ^:inde*m man die * säuren der Reihe |iach ankondensiert.' .; " '■'!

'·-.. " ; ": -An^;der^: Reaktion¹, hicht· beteiligte., tionelle -Gruppen werden zwecianässigerweise geschützt> insbesondere' mitteis durch Hydrolyse.oder Reduktion .leicht ab-

' 0 iNAtinspected

Amino-

spaltbarer Reste, die. Carboxylgruppe vorzugsweise durch Veresterung, z.B. mit Methanol, tert.-Butanol, Benzylalkohol, p-Nitrobenzylalkohol, oder Amidbildung, die Aminogruppe beispielsweise durch Einführung der Tosyl-, Trityl-, Pormyl-, Trifluoracetyl-, ο-Nitrophenylsulfenyl-, Phthalyl- oder Carbobenzoxygruppe oder farbiger Schutzgruppen, wie der p-Phenylazo-benzyloxycarbonylgruppe und der p^Cp'-Methoxy-phenylazo)« benzyloxycarbonylgruppe, oder insbesondere des tert.-Butyl« oxycarbonylrestes. Zum Schutz der Aminogruppe in der Guanidogruppierung des Arginine ist die Nitrögruppe geeignet; die ' genannte Aminogruppe des Arginins muss aber bei der .Reaktion nicht notwendig geschützt werden. Die Iminogruppe des Histidins kann durch den Benzyl- oder Tritylrest geschützt werdent

Die Umwandlung.einer geschützten Amino- odor Iminogruppe in ein© freie Gruppe sowie die Ueberführung einer funktionell abgewandelten Carboxylgruppe in eine- freie Carboxylgruppe im Verlaufe des Verfahrens erfolgt nach an sich bekannten Methoden durch Behandlung mit hydrolysierehden bzw. reduzierenden Mitteln. '

Ein bevorzugtes Verfahren besteht darin, dass man das die ersten 3-Aminosäuren,. z.B. H-D-Ser-Tyr~Ser-OH enthaltende Tripeptid (die abgekürzte Schreibweise bezieht sich auf"L-Aminosäuren, wenn das D- nicht besonders bezeichnet ' ist)j oder das ausserdem die 4. Aminosäure enthaltende Tetrapeptid mit dem Heptapeptid bzw* Hexapeptid der folgenden Aminosäuren bis zur Aminosäure 10 .kondensiert, vorzugsweise

.-;-1098'31/2i»4 iad original

nach der Azidmethode, und dann das Dekapeptid mit dem Tetradekapeptid der Aminosäuren 11 - 24 kondensiert. Bei dieser Kondensation wird als Kupplungsmethode vorzugsweise die Carbodiimidmethode oder die Methode der aktivierten Ester, .vor allem mittels des p-Nitrophenylesters, verwendet.-Im letzten Fall braucht der p-Nitrophenylester des Dekapeptids nicht als solcher isoliert zu werden, sondern kann auch in der Kondensationsstufe selbst aus dem Dekapeptid mit freier Carboxylgruppe, p-Nitrophenol und Dicyelohexylcarbodiimid gebildet werden. Das Dekapeptid liegt also als a-Aminogeschütztes Peptid mit freier.''Carboxylgruppe oder mit einer p-Nitrophenylestergruppe vor. Das Tetradekapeptld wird in •Form eines Esters, vorzugsweise des tert.-Butylesters, oder des $-Amlds verwendet. Die "in den zu kondensierenden Peptidbruchstücken vorhandenen Seitenketten-Aminogruppen.werden vorzugsweise durch die tert.-Butyloxycarbonylgruppe, die Seitenkettencarboxylgruppen durch die tert.-Butylestergruppe geschützt. Diese Schutzgruppen können in der letzten Stufe mit Trifluoressigsäure abgespalten werden,

Nach einem weiteren bevorzugten Verfahren wird das die ersten 4.· Aminosäuren enthaltende Tetrapeptid H-D- ·. Ser-Tyr-Ser-Nle-OH mit dem Eikosapeptid der Aminosäuren 5 - 24 kondensiert. Bei dieser Kondensation wird als Kupplungs· methode vorzugsweise die Azidmethode verwendet. Die a-Amino· gruppe des Tetrakosapeptidhydrazids bzw. -azids wird vor- . zugsweise durch die tert^-rButyloxycarbonylgrupp^ ^

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BAD ORIGINAL

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Das Eikosapeptid kann als freies Peptid oder als Ester, ins-«·

' 24■ - · ■ ·

besondere tert.-Butylester, oder als Pro -Amid vorliegen.

Auch im Eikosapeptid werden die Seitenketten-Aminogruppen vorzugsweise durch die tert.-Butyl oxycarbonylgruppe:,.-· die Seitenkettencarboxylgruppe durch die tert.-Butylestergruppe geschützt.

Nachdem man durch Kondensation der Peptidbruchstük« ke das Tetrakosapeptid erhalten hat, dessen a-Aminogruppe und Seitenkeiten-Ärainogruppen durch die. tert.-Butyloxycarbonylgruppe und dessen Endcarboxylgruppe'und Seitenkettencarboxylgruppe durch die tert.-Butylestergruppe geschützt sind, können alle diese Schutzgruppen gleichzeitig durch saure Hydrolyse, beispielsweise mit Trifluoressigsäure, abgespalten werden. Liegt*die Endcarboxylgruppe nicht als tert.-Butylestergruppe, sondern als Amidgruppe vor, so v/erden Peptidamide. erhalten. . . "

.Je nach der Arbeitsweise erhält man die neuen Verbindungen in Form von Basen oder ihren Salzen*. Aus den Salzen können in an sich bekannter Weise die Basen gewonnen, werden. Von letzteren wiederum lassen sich durch Umsetzung

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mit Säuren, die zur Bildung therapeutisch verwendbarer ■ Salze geeignet sind,'-Salze gewinnen, wie z.B. solche mit anorganischen- Säuren, wie Halogenwasserstoffsäuren, beispielsweise Salzsäure oder Bromwasserstöffsäure, Perchlorsäure, Salpetersäure oder Thiocyansäure, Schwefel- oder Phosphorsäuren, oder organischen Säuren, wie Ameisensäure, ■Essigsäure, Propionsäure, Glykolsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure,. Oxalsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure,.Maleinsäure, Fumarsäure, Aepfelsäure,-Weinsäure, Zitronensäure, Ascorbinsäure, Hydroxymaleinsäure, Dihydroxymaleinsäure, Benzoesäure,-Phenylessigsäure, 4-Aminobenzoesäure, 4-Hydroxybenzoesäure, Anthranilsäure, Zimtsäure,'Mandelsäure, -Salicylsäure, 4-Amino-salicylsäure, 2-Phenoxybenzoesäure, 2-Äcetoxybenzoesäure, Methansulfonsäure, Aethansulfonsäure, Hydroxyathansulfonsäure, Benzolsulfonsäure, p-Toluolsulfonsä'ure, Naphthalinsulfonsäure oder SuIfanil·?- säure, ■ ■

Die verfahrensgemäss erhaltenen -Peptide können in Form von pharmazeutischen Präparaten Verwendung, finden. Diese enthalten die Peptide in Mischung mit einem .für die enterale oder parenteral© Applikation geeigneten pharmazeutischen, organischen oder anorgaischen Trägermaterial, Für dasselbe kommen solche Stoffe in Frage, die mit den Polypeptiden nicht reagieren, wie-z.B. Gelatine, •Milchzucker, Glukose, Kochsalz, Stärke, Magnesiumstearat, .Talk, pflanzliche OeIe, Benzylälkohole, Gummi, Polyalkylen-

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glykole, Vaseline, Cholesterin oder andere bekannte Arzneimittel träger. Die pharmazeutischen Präparate können z.B. als Lyophilisat oder in flüssigsr Form als Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen vorliegen. Gegebenenfalls sind · sie sterilisiert und bzw. oder enthalten ■Hilfsstoffe, wie 'Konservierungs-, Stabilisierungs-, Netz- oder Emulgiermittel. Sie können auch noch andere therapeutisch wertvolle Stoffe enthalten. .

•So kann man sie beispielsweise auch mit den in der • ACTH-Therapie üblichen Zusätzen zur Verlängerung der Wirkung, wie z.B. Oxypolygelatine, Polyphloretinphosphat, Carboxymethylcellulose, oder den oben erwähnten schwerlöslichen " Metallverbindungen, Insbesondere Phosphaten, Pyröphosphaten oder Hydroxyden des Zinks,'kombinieren.

rWeiter kann man zur Verlängerung der Wirksamkeit die neuen Peptide in ihre Komplexe mit RüynBrisaten oder •Copolymerisaten von Aminosäuren, insbesondere solchen, die .einen überwiegenden Anteil an sauren α-Aminosäuren, wie ■ Glutaminsäure oder Asparaginsäure der L-, D- oder. D,L-Konflguration, aufweisen, überführen. Die genannten Polymerisate und Copolymerisate weisen in den Seitenketten freie Carboxylgruppen auf, während die.terminale Carboxylgruppe frei oder funktionell abgewandelt sein, z.B. als Estergruppe oder als eine unsubstltuierte oder durch Kohlenwasserstoffreste, , vor allem niedere Alkylgruppen, substituierte Amiägruppe vorliegen kann. Das Molekulargewicht der Polymerisate kann

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zwischen 10 000 und 100 000liegen, vorzugsweise beträgt es 20 000 - 80 000. Man.verwendet für die Herstellung der Präparate zweckmässig ein wasserlösliches, physiologisch verträgliches Salz, z.B.'das Natrium- oder Ammoniumsälz, oder ein Salz mit einer.-organischen Base, wie Triäthylamin, Procain, "Dibenzylamin, oder anderen tertiären Stickstoff basen.

Die Polymeren sind bekannt oder können nach bekannten Verfahren hergestellt werden, beispielsweise nach dem von M. Idels.on.e-t al-, J.Am.Chem.Soc.SO^ 4631 et seq. ■(1958) beschriebenen Verfahren. So kann man z.B. Glutaminsäure -α-carboxyanhydrid-^-benzylester oder -tert.-butylester in Dioxän mit Ammoniak oder einem AmIn in einem bestimmten Molverhältnis, z.B. 100:1 (je nach dem gewünschten Polymerisationsgrad),, reagieren lassen und nach beendeter Polymerisation die Schutzgruppen abspalten, z.B. die Bensyloxygruppe mit Bromwasserstoff in Eisessig, die terfc.-Butyloxygruppe mit Trifluoressigsäure. Zwecks Herstellung von Polymeren mit einheitlicher, definierter Kettenlänge kann man die Polymeren auch durch Synthese nach den in.ader Peptidchemie bekannten Verfahren (Cärbodiimidmethode, Azidmethode etc.) aufbauen. ■ y\ · * '

Die Konzentration des Polymeren in den pharmazeutischen Präparaten hängt von der Löslichkeit des betreffenden Salzes und von der .Viskosität ab» Das Polymere soll in den Präparaten .in gelöster· Form'vorliegen können und injizierbar sein·: .' ■■■-,·■ ;.. ■ ^: ;'.-.-.-. V." . .

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Die Konzentration des adrenocorticotrop wirksamen Peptids beträgt beispielsweise 0,1 bis 5 mg/ml.

- Die Erfindung wird in dem. folgenden Beispiel beschrieben. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben, i

Die dünnschichtchromatographischen Systeme werden wie folgt bezeichnet; · · · , . ' ·;'. . '.'■'■

System 4o System 43A System 45 System 52 System 52A System $4.

System 100 System. 101 System lOlB

: n-Butanol-Aethanol-Wasser ■ ·. ■■■

i tert,-Ämylalkohol-Isopropanol-Wasser (67s 26:7) . '

ϊ sek.-Butänol-3 (70O0)

Ammoniak

:' n-Butanol-Eisessig-V/asser (100:1000)

: n-Butanol-Eisessig-Wasser-J6)

ä sek.-Butanol-Isopropanol^

Monochloressigsäure ■ (58:8:34) ..

wässrige

ϊ Aethyiacetat-Pyridin-Eisessig-Wasser (β2:21ί6ί11)

% n-Butanol-Pyridin-Eisessig-Wasser· . (38s24i8:30) ■

ί n-Butanol-Pyridin-Eisessig-Wasser¹ (44ί24:2ί30) ' ·..... -

Folgende Abkürzugen werden verwendets Z s Carbobenaoxy . BOG . " β 'tert.-Butyloxycarbonyl tBu · » tert.-Butyl. .

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Beispiel 1ί

1) H-NIe-OCH^ ■" .. ; ' . · ·

18,4 s L-Norleucin werden in 57 ^m^ Methanol suspendiert und unter Rühren bei -15° innert JO Minuten 11 ml Thionyl-' Chlorid hinzugefügt. Man rührt noch weitere 30 Minuten bei -15°> dann je 90 Minuten bei 0 und bei Zimmertemperatur. Nach 3-stündigem Stehen bei kÖ°, dampft man die Lösung bei 35° zur Trockne ein und kristallisiert den Rückstand aus Aceton-Hexan (2:1) um. P. l40-l4l^o. .

18,1 g des Hydrochloride werden in 20 ml Wasser gelöst, mit 200 ml Aether überschichtet und bei 0° mit 40 ml kalter gesättigter Kaliumcarbonatlösung versetzt. Man extrahiert die wässerige Phase mehrmals mit Aether, vereinigt die • ätherischen Lösungen, trocknet sie über Natriumsulfat und dampf sie am Hochvakuum bei 0° ein. Der freie Ester wird als klares OeI erhalten, . - -

2) BOC-Ser-Nle-OCH, · ."' .. · . · ; "^;

'Eine Lösung von 22,3 S BOC-L-serin-hydrat in 270 ml Acetonitril wird mit einer Lösung von l4,3 g L-Norleucinmethylester in 65 ml Acetonitril versetzt, Man kühlt auf -5° ab, gibt 22,7 S Dicyclohexylcarbodiimid in 35 ml Acetonitril hinzu, rührt, noch 1 Stunde bei.-5°, dann über Nacht bei 0°, befreit vom Dicyclohexylharnstoff und dampft die Lösung bei 35° ein. Den

. Rückstand nimmt man in Essigester auf, wäscht die Lösung mit

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N-Salzsäure, N-Natriumbicarbonat und gesättigter Natriumchloridlösung und dampft sie ein. Der kristalline Dipeptidester schmilzt bei 69-7I⁰. · ■ ' '

3) H-Ser-Nle-OCH,

28/0 g BOC-Ser-Nle-OCH, v/erden in 320 ml 90 #iger Trifluoressigsäure gelöst und 2 Stunden bei Zimmertemperatur belassen. Nach Einengen der Lösung auf das halbe Volumen versetzt man sie mit 500 ml Aether., wobei das Trifluoracetat auskristallisier.t. Dieses (24,2 g) wird in 35 ml Wasser gelöst, die Lösung mit 7OO ml Chloroform unterschichtet und unter Rühren bei 0 mit 210 ml gesättigter Kaliumcarbonatlösung versetzt. Aus der Chloroformphase werden 16,1 g kristalliner Dipeptidester vom P. 84-85° gewonnen. / ' .

4) BOC-Tyr-Ser-Nle-OCH, - . - ^;

I9/6 S BOC-Tyr-OH und 16,1 g H-Ser-Nle-OCH, werden in einem Gemischt von 350 ml Acetonitril und 17,5 ml Dimethylformamid gelöst, bei -5° mit einer Lösung von 15,9 S Dicyclohexylcarbodiimid in I75 ml Acetonitril versetzt und 1 Stunde bei -5°, dann über Nacht bei 0° gerührt. Man befreit vom Dicyclohexylharnstoff, wäscht wie oben angegeben und dampft die Lösung ein. Der geschützte Tripeptidester schmilzt nach Umkristallisieren bei 143-145°.- ·

5) H-Tyr-Ser-Nle-OCfL

27,3 g des geschützten Tripeptidestera werden in 82,5 ml N--

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Salzsäure in Methanol gelöst, 2 Stunden bei Zimmertemperatur

BAD

stehen gelassen und dann mit 1,5 1 Aether versetzt. Man erhält das Hydrochlorid des freien Tripeptldesters, das nach' Umkristallisation bei 218-220° (Zersetzung) schmilzt. 14,2 g des Hydrochlorides werden in 20 ml Wasser gelöst, mit 400 ml Chloroform unterschichtet und bei 0 mit 100 ml gesättigter Kaliumcarbonatlosung versetzt. Die freie Base schmilzt nach Umkristallisieren bei 84-86°.

6) BOC-D-Ser-Tyr-Ser-NIe-OCH,

13,4 g H-Tyr-Ser-Nle-OCEL werden in 250 ml Acetonitril gelöst und nach Zugabe von 15 ml Dimethylformamid mit 7#35 g BOC-D-Serin versetzt* Bei -5 fügt man eine Lösung von 7,45 g Dicyclohexylearbodiimid in 3° ^ml Acetonitril zu und

• rührt dann 1 Stunde bei -5° und über Nacht bei 0°. Man befreit vom Dicyclohexylharnstoff, dampft die Lösur-3 ein. Der

. geschützte Tetrapeptidester schmilzt nach Umkristallisieren bei 149-151° (Zersetzung).

7) BOC-D-Ser-Tyr-Ser-Nle-NH-NlU

11*65 S Tetrapeptidester werden in 50 ml Methanol gelöst, 4,8 ml Hydrazinhydrat zur Lösung hinzugefügt und die Mischung 24 Stunden beim Zimmertemperatur stehen gelassen. Man gibt 50 ml Wasser hinzu und rührt, bis das gallertige Produkt vollständig durchkristallisiert ist. Es schmilzt bei 205-207°.

8) BOC-D-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu(OtBu)-His-Phe-Arg-Try-GIy-OH

8,75 S BQC-D-Ser-Tyr-Ser-Nle-NH-NHp werden in 75 ml Dimethyl-

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formamid gelöst und unter Rühren bei -15 mit 20 ml einer 2-N

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Lösung von Chlorwasserstoff in Eisessig versetzt. Nach Zugabe von 1,65 g tert.Butylnitrit wird die Lösung 10 Minuten bei -15° gerührt und dann mit 5,5 ml Triäthylamin· versetzt. Die so erhaltene: Lösung des BOC-Tetrapeptidazids wird tropfenweise zu einer auf -10° abgekühlten Lösung von 10 g H-GIu(OtBu)-His-Phe-Arg-Try-GIy-OH in 225 ml Dimethylformamid und 12 ml V/asser gegeben; das Reaktionsgemisch wird 20 Stunden bei 0° gerührt und darauf mit 900 ml Wasser versetzt. Das amorphe DekapeptidwLrd abgenutscht und mit Dimethylformamid-Wasser (1:5) und Acetonitril gewaschen. Nach Umfallen aus wässerigem Acetonitril und Aequilibrierung mit Luftfeuchtigkeit erhält man 12,9 g reines geschütztes Dekapeptid-tetrahydrat vom P. 215-2l8°{Zersetzung); [a}^° « 18° + 2° (c « 0,5 in Pyridin-Wasser IiI). Die Verbindung ist im Dünnschicht chromatogramm auf Silicagel einheitlich; Rf (52) «.

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9) BOC-D-Ser-Tyr-Ser-Nle-GluCOtBuj-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys(BOC)-Pro-VaI-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Pro-Val-Lys(BOC)-VaI-Tyr-Prο-OtBu. ' ' ,-,

1 g BOC-D-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu(OtBu)-His-Phe-Arg-Try-Gly-OH und 1,05 g H-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(fiOC>.•..Lys(BOC)-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr-Pro-OtBu .(das erhalten wird durch Kondensation von Z-Lys(BOC)-OH mit H-Lys(BOC)-OCH, in Gegenwart von Dicyclohexylcarbodiimid, Ueberführung des geschützten Dipeptidesters in das Hydrazid, Kondensation mit L-Prolin nach der Azidmethode zum Z-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Pro-0H> Kondensation dieses Derivates mit H-VaI-Lys(BOC)- ·

VaI-Tyr-Pro-OtBu in Gegenwart von Dicyclofiexylcarbodi'imid,.

Abspaltung der Carbobenzoxygruppe aus dem,erhaltenen

Octapeptidderiva'u mittels Wasserstoff · in Gegenwart von

Palladiumkohle und· Kondensation des so erhaltenen H-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Pro-Val-Lys(BOC)-VaI-Tyr-Pro-OtBu mit dem in der deutschen 'Patentschrift 1 214 242 beschrieben Z-Lys(BOC)-

'■·-·. i . - ί Pro-VaI-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC)-NH-NH₀ nach'der Azidmethode,

vgl. Nr. C 40 617, Case 5805/5503/1+2) werden mit 15 ml Pyridin, 1 ml Wasser und 0,47 ml 1-n» Salzsäure versetzt.

ι .

ί·

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I !

ORIGINAL! INSPECTED

Man gibt 3OO mg Dicyclohexylcarbodiimiil zu, rührt bei 50° während 3 Stunden, gibt dann nochmals JOO mg Dicyclohexylcarbodiimid zu und rührt weitere 6 Stunden bei 5Q°. Hierauf wird auf ein Volumen von ungefähr 5 ml eingeengt und durch Zugabe von viel Aether ausgefällt. Das Aether-unlösliche Pulver wird mit V/asser zerrieben, abgenutscht und getrocknet. Das so gev/onnene Rohprodukt wird zur "Vorreinigung in.'je 50 ml Ober- und Unterphase des Lösungsmittelsystems Methanol-. Puffer-Chloroform-Tötrachlorkohlenstoff (10:3:5:4) [Puffer: 28,5 ml Eisessig + 19,25 g Ammoniumacetat in 960 ml Wasser] suspendiert, mehrere Stunden geschüttelt und dann vom Unlöslichen durch Filtration befreit. Die löslichen Anteile . werden zur weiteren Reinigung einer Craig-Verteilung im gleichen Lösungsmittelsystem unterworfen. Der Reinheitsgrad der einzelnen Fraktionen wird durch Dünnschichtchromatographie auf Silicagelplatten in den Systemen 100 und Chloroform-■ Methanol (75:25) kontrolliert. Die chromatographisch ein-· heitlichen Fraktionen werden vereinigt und eingedampft. Das. im Rückstand noch.enthaltene Ammoniumacetat wird durch' Absublimieren im Hochvakuum bei 40° entfernt.

10) H-D-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Lys-Lys-Pro-Val-Lys-Val-ijyr-Pro-OHCessigsaures Salz)

100 mg BOC-D-Ser-Tyr-Ser-Nle-GluCOtBuJ-His-Phe-Ars-fry-Giy-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOG)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)- Pro-Val-Lys (BOC )-Val-Tyr-Pro-OtBu werdsn.;ini 3ml 90 % Tri-

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fluoressigsäure gelöst und während 1,5 Stunden.bei 25 belassen. Hierauf wird mit viel Aether ausgefällt, abgenutscht, mit Aether gewaschen und getrocknet. Das so erhaltene Trifluoracetat des Tetrakösapeptids wird 2ur Umwandlung in das Acetat in 5 ml Wasser gelöst und durch eine Säule (0 « 18 mm, 1 « 20 cm) von schwach basischem Ionenaustauscher (M©rcIc Nr. Iljin der Acetatform filtriert. Lyophilisation des Eluats liefert das Acetat des freien Tetrakosapeptids als fast farbloses, leichtes Pulver.

• · ■

Beispiel 2 : "■'■■·.·

1) Z-Val-Tyr-Pro-NH₂ ■ ..

18,8 g Z-VaI-Tyr-Prο-OtBu werden in 95 ml 90 #iger Trifluor** essigsäure gelöst und während 1 Stunde bei Raumtemperatur Steher gelassen. Man engt zur Trockene ein und pulverisiert den Öligen Rückstand durch Zugabe von 100 ml.Wasser und Zerreiben bei 0°. Nach Abfiltrieren wird er bis\zur Gewichtskonsfcanz über Kaliumhydroxyd getrocknet und dann aus Essigester- ' ■■' Petroläther umgefällt. Das amorphe "Pulver (17»01g) wird zusammen mit 5,15 ml Triäthylamin in 170 al absolutem Tetrahydrofuran gelöst,, auf -15° abgekühlt, und während 5 Minuten mit einer· Lösung von 4,44 mi Isobutylchlorcarbonat in 2,5 ml

' absolutem Tetrahydrofuran versetzt. Nach 15-minütigem Rühren bei -10° gibt man langsam 107 ml 0,64-N^Ammoniäk in abs ο-

1098.31/21

lutem Essigester, zu und lässt noch während 1 Stunde bei O⁰ und während 6 Stunden bei 20° rühren. Das Gemisch wird stark eingeengt, der klebrige Rückstand in 500 ml Essigester gelöst und nacheinander mit Wasser, 2-N-Sodalösung' und wiederum Wasser gewaschen und zur Trockne eingeengt. Man erhält nach zweimaligem Umfallen des Rückstandes aus Essigester-Petroläther und Trocknen im Hochvakuum 14,4. g eines amorphen Pulvers, das sich dünnschichtChromatograph!sch einheitlich verhält. Auf Silicagelplatten ergeben sich folgende R^-Wertei .'>'. ·'.*■'

R-Im System Chloroform-Methanol (9 Jl) »0,35

0,63

2).'H-Val-Tyr-Pro-NU₂ . ' ·'·' '" . ._: ; . - ;.·. = /\

. 14,4 g 2-VaI-Tyr-Pro-NHg werden in 150 ml Methanol gelöst und mit 1,5 g 10 #iger Palladiumkohle bei Normaldruck und unter COg-Absorption bis zur Sättigung (Dauer ca. 2 Stunde.n) hydriert. Nach Äbfiltrieren des Katalysators und Einengen . des Filtrates zur Trockne wird der Rückstand in 15 ml Methanol und 40 ml Essigester gelöst, durch Zugabe von 120 ml Petroläther ausgefällt, abfiltriert und im Hochvakuum bei 40° . getrocknet. Man erhält 9,52 g eines amorphen Pulvers, das sich dünnschichtChromatographiech auf Celluloseplatten einheitlich verhält: ■-. -: ■ ■:..■■■.-."■"■'■ :. ' ' ^: ' " ·"' · '.'■-·'■··:

R_f (40) -V-- 0,73' ; ^: .
: R_f (*5) * 0,.72-, -..; _ '■' . ■·"·_ R- (54) ' . 0,70 *
^f ■· 109831/2184 .

ORIGINAL INSPECTED

3) Z-Lys(BOC)-VaI-Tyr-Pro-NH₂ - ■' · 9,7²^ S Z-Lys(BOC)-QH und 9,52 g H-VaI-Tyr-Pro-NH₂ werden in 40 ml' absolutem Dimethylformamid gelöst und mit einer Lösung von 5,76* g Di cyclohexyl carbodiimid in 100 ml Acetonitril versetzt. Man rührt während 12 Stunden bei Raumtemperatur, filtriert dann den·ausgeschiedenen Dicyclohexylharn stoff ab und engt die Lösung zur Trockne ein. Der feste schaumige Rückstand wird zweimal aus Essigester-Petroläther umgefällt und ergibt 16,02 g amorphes Tetrapeptidderivat, . das auf Sillcagel-DünnschichtpXatten die folgenden Hf-Werte aufweist: ·.·.'■ · · · ' ■ ·. .·..· ··

*-R- im System Chloroform-Methanol (9?1) ■ 0,29 .'■" ■ ■■.■···"·■■ V-; ■.,'·■,■;'".■ ■ ■ . -0,68 .^:..

4) H-Lys(BOG)-YaI-Tyr-Pro-IiH₂ . " . .■'/.-. . .·

15*5 g des geschützten Tetrapeptidamids werden in 100 ml Methanol gelöst und nach Zugabe von 1,5 g 10 #iger. Palladiumkohle bei Normaldruck bis zur Sättigung hydriert. (Dauerca. 4 Stunden) Das nach'..Abfiltrieren des Katalysators und Einengen des Filtrates' zur Trockne erhaltene Rohprodukt wird anschliessend in. 10 ml Methanol und 120 ml Essigester gelöst und durch Zugabe'von.120 ml Petroläther ausgefällt und im Hochvakuum bei 40°"getrocknet. Man erhält 11,9 g eines amorphen Pulvers, das im Dünnschichtohromatο-gramm auf Slllcagel folgende R^-Werfce aufweistt ■

10 9 8 3 1/2184

- R_f Im System Chlor of orm-Kethanol (9*1) =· 0,08

R_f (43A) = 0,27

5) Z-Val-Lys(EOC)-VaI-Tyr-Pro-NHg

5*28 s Z-VaI-OH und 3,07 ml Triäthylamin werden in 50 ml ^: • absolutem Essigester gelöst auf -10° gekühlt und mit einer. Lösung von 4,57 ml Isobutylchloroarbonat in 5 ml Essigester versetzt. Man rührt noch während 15 Minuten bei -10° und gibt dann bei ca. -5° eine Lösung von 11,87 g H-Lys(BOC)-Val-Tyr-Pro-NHg in 10 ml Dimethylformamid zu. Die Mischung wird während 30 Minuten bei 0° und während 5 Stunden bei , Raumtemperatur gerührt und dann mit 100 ml V/asser und 200 ml. n-Butanol versetzt. Nach Abtrennung der wässrigen Phase wird

die organische Phase nacheinander mit 10 #iger Weinsäurelösung (bei 0°), gesättigter Natriumbicarbonatlösung und gesättigter Natriumsulfatlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und zur Trockne eingeengt. Der schaumige Rückstand wird zur Vorreinigung einmal." aus Methanol-Essigester-Petroläther und einmal aus Methanol-Acetonitril uagefällt und ergibt 12,15 g eines amorphen Pulvers, das im Lösungsmittelsystem Methanol-0,1 M.-Ammoniumacetatlösung-ChlorQ-form-Tetraohlorkohlenstoff (9:3:4j4) mit Phasenvolumina von Je 25 ml über 250 Stufen multiplikativ verteilt wird. Aus den Verteilungselementen Nr. 81 - 115 (σ* =» Ql; JC * 0,57

max * ■**' ■

■ worden beim Einengen zur Trockne und Wegsublimierer. öss /.m-

10983 1/2184

moniumaeetates im Hochvakuum bei 45° insgesamt 7,94 g chromatographisch -reines geschütztes Pentapeptid als weisses, amorphes Pulver erhalten. Es weist im Dünnschichtchromato- ·. gramm auf Silicagel folgende R_f-Werte auf: R_f im System Chloroform-Methanol (9:1) = 0,42 R_f (43 A) . - 0,68

6) K-VaI-Lys(BOC)-VaI-Tyr-Pro-NH₀ · " · :

5,72 g Z-Val-Lys(BOC)-VaI-Tyr-Pro-NHg werden in 75 ml Methanol gelöst und nach Zugabe von 600 mg 10 $Lger Palladiumkohle bei Zimmertemperatur unter C0_g-Absorption hydriert. Die Wasserstoffaufnahme ist nach ungefähr 5 Stunden beendet, und man filtriert den Katalysator ab und dampft die Lösung zur Trockne ein. Man erhält 4,74 g Pentapeptid-amid als amorphes chromatographisch einheitliches Pulver, das im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel folgende R_f-Werte ■aufweist: . "

R_f (52) * 0,40 . R_f (100) * CP,35

7) Z-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Pro-VaI-Lys(BOC)-VaI-Tyr-Pro-NHg 3*35 ε Z-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Pro-OH (hergestellt wie in Beispiel 1 angegeben)werden in 20 ml absolutem Dimethylformamid gelöst und nach Zugabe von 0,65 ml Triäthylamin auf -15 · abgekühlt. Man lässt dann bei -15° 0,58 ml Pivaloylchlorid zutropfen. Nach 6 Minuten, gibt man eine vorgekühlte Lösung

109831/2184

"²⁴" t66%875

von 3,34 g H-yal-Lys (BOC)-VaI-Tyr-Pro-NHg in 10 ml absolutem Dimethylformamid zu und rührt das Gemisch während 20 Minuten bei -10°, während 5 Stunden bei 0°, und während 2 Stunden bei 20°. Zur Aufarbeitung gibt man 70 ml Essigester und 50 ml V/asser zu und extrahiert die organische Phase nacheinander mit 0,1-M.-Zitronensäure, 2 #iger Ammoniaklösung und Wasser, trocknet über Natriumsulfat und verdampft das Lösungsmittel. Der pulverig-amorphe Rückstand (5*7^ g) weist im Dünnschichtehromatogramm auf Silicagel nur geringe Verunreinigungen auf und wird ohne Reinigung zur Weiterreaktion eingesetzt.

■R_f im System Chloroform-Methanol (9;l) - 0,23

8) H-Lys(BOG)-Lys(BOC)-Pro-VaI-Lys(BOC)-VaI-Tyr-Pro-NHg 5λΊ S des oben beschriebenen Oktapeptidderivates werden in 100 ml Methanol gelöst und nach Zugabe von 550 mg 10 #Lger Palladiumkohle bei Kormaldruck bis zur Sättigung hydriert. Nach Abfiltrieren des Katalysators und Nachspülena mit Methanol wird das Piltrat zur Trockne eingedampft. Der weisse, schaumige Rückstand wird in 100 ml Chloroform gelöst, mit 20 ml 2-n. Essigsäure extrahiert, die Chloroformphase sodann auf 20 ml eingeengt und daraus das Peptid durch Zugabe •von. βθ ml Petroläther ausgefällt und bei 50° im Hochvakuum getrocknet. Nach Aequilibrieren mit der Luftfeuchtigkeit er- · hält man 5/21 g eines amorphen, dünnschichtchromatographisch einheitlichen Pulvers, das laut Titrations- und Elementar-

109831/2184 original injected

analysen pro Mol Qktapeptid-amid 0,63 WoI Essigsäure und - 13 KoI H₀O enthält. Auf Silieagel erhält man folgende Ri,-

dt . I '

Werte: ■' · " · .'

.R_f im System Chloroform-Methanol (9ίΐ) ^β Ο,θ8 R_f (100) .· ' »0,46

9) Z-Lys(BOC)-Pro-VaI-Gly-Lys(30C)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Pro-VaI-Lys(30C)-VaI-Tyr-Pro-NH₂

5,91 s Z-LyS-CBOC)-PrO-VaI-GIy-LyS(BOC)-LyS(BOC)-NKNH₂ (Vgl. deutsches Patent 1 214 242) werden unter leichtem Erwärmen in 40 ml absolutem Dimethylformamid gelöst, auf -20° abgekühlt und bei dieser Temperatur unter Rühren nacheinander . langsam mit 6,58 ml 2,15-n. Salzsäure und mit 0,74 ml 5-n, •Natrlumnitritlö^.ms versetzt. Man rührt zuletzt noch während 15 Minuten la-.·? -10° und gibt dann eine vorgekühlte Lösung von 4,07 ε H>i'v:( OC)-LyS(BOC)-Pro-Val-Lys(BOC)-VaI-Tyr-Pro-NHg (enthaltend 2,5# CH COOH + 15,3# HgO) In 11 ml Dimettylfor Riarnid sowie 1,98 ml Triethylamin zu. Die Mischung wird während 1 Stunde bei 0° gerührt, worauf man <ö&s pH¹ φϊΓΟίϊ/λ-ϋΛ Zugabo von Triäthylarnin auf· 7*5 einstellt und über Nacht bei 0° stehen lässt. Das Reaktionsgemisch wird sodann im Kochvakuum auf ein Volumen von ca. 20 ml eingeengt und mit 100 ml V/aas er versetzt. Dabei fällt das Rohprodukt in gallertiger Form aus. Eg wird abfiltriert, mit^Wasser gewaschen und ansehLi.t:r;üend dreimal aus Methanol-Wasser und zweimal aus

10 9 8 3 1/2184

•Methanol-Benzol-Petroläther umgefällt. Das so vorgereinigte Material (4,72 g) wird in Lösungsmittelsystem Methanol-Puffer-Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff (12:4:9:3) [Puffer 28,5 ml Eisessig += 19,25 g Ammoniumaeetat" in 96O ml V/asser] einer Crais-Verteilung über- ΙβΟ'Stufen mit Phasenvolumina von je 20 ml unterworfen. Aus. den Verteilungselementen Nr.

45 -;74 (r »57; K = 0,55) werden beim Einengen zur Trock· max

ne und V'egsublinieren des Ammoniumacetates bei 45 im Hochvakuum insgesamt' 3# 3 S chromatographisch neines geschütztes Tetradekapeptid alß weisses, amorphes Pulver vom Zersetzungspunkt ca. 210° gewonnen. Es weist im Dünnschiohtchromato- . .gramm auf SiIicagel folgende R^-Werte auf:. ' ·

■ R_f im System Chloroform-Methanol-.!(9Jl) = 0,17 • . R_f '(43 A) ■'■■'" ._-"'■■··■'./' -.." » 0,62

y ; ;; . ■■■■,-■ '■■>'■-.'■·/.· -.0,87

10) H·Lys (BOC)-Pro-VaI-Gly-Lys(BOG)-Lys(BOG)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-NHg ·'

4,97 g des geschützten Tetradekapeptidamids werden unter Erwärmen in 100 ml Methanol gelöst und nach Zugabe von 1 g ld-#igor Palladiumlvohle bei Raumtemperatur und Normaldruck unter Absorption des sich bildenden Kohlendioxyds bis zur Sättigung hydriert» Der Katalysator wird abfiltriert, das Pi-itrat auf ca. I5 ml Jonzentriert und daraus das hydrierte T-Jtradckapeptid durch Äugabe von 50 ml Benzol und I50 ml

• 109^-3 1/21 8 A BADORlGfNAL

- .27 -

Petroläther ausgefällt, abfiltriert und im Hochvakuum bei

45° getrocknet. Man erhält 4,25 ß eines amorphen Pulvers, ' das sich ira Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel einheitlich verhält und folgend? R--Werte aufweist? ■ · .

R_f (52) . ... > 0,41 "·■ -ν ■ . "^; - ' ^: R_f (100) . . - 0,33 :7 ; . · ' ,; Ζ

•11) BOC-D-Ser-Tyr-Ser-Nle-Olu(OtBü)-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys(B0C)-Pro-Val-Gly-Lys (30C) -Ly s (BOC.)-Ly s (BOC) -Lys (BOC) -Pro-Val-Lys- · (BOC)-VaI-TyP-PrO-NH₂ · ' ·" ' * ·

600 mg B0C-D-Ser*Tyr-Ser-Nle-Glu(0tBu)-HJ,s-Fh$-Arg-Try-01y!-'-OH und 630 mg H-LyS(BOC)-PrO-VaI-GIy-LyS(BOC)-LyS(BOC)-LyS-(BOC)-Lys(BOC)-Pro-Val-Lys(BOC)-VaI-Tyr-Pro-NH₂ werden mit 12 ml Pyrldin, 1 ml Wasser und 0,3 ml 1-n,. Salzsäure versetzt. Hierauf wird eine Lösung von 200 mg Dieyelohexylcarbo-• diimid in 1,5 ml Pyridin zugesetzt und 5 Stunden bei 45 50° gerührt. Dann werden weitere 150 mg Dicyclohexylcarbodiimid zugegeben und über Nacht bei 4p° gerührt. Das Öemisoh von Kondensationsprodukt und.Dicyclohexyl-harnstoff wird gesamthaft ducch Zugabe von.160 ml Wasser ausgefällt, ab-'filtriert und getrocknet.. Zur Abtrennung des Dicyclohexyl-harnstoffes wird es zweimal nacheinander heiss in Aethanol suspendiert, bzw. teilweise gelöst, und durch Zugabe, von Benzol und. Petroläther wieder gefällt. Das so vorgereinigte Material wird wio in Beispiel 1_: beschrieben durch Gegenstromverteilung gereinigt. Nach 120 Verteilurigsschritten im Lösungsmittelsystem

t0983J/2184 · - . . .

Kethanol-Puffer-Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff' [Puffer: 28,5 ml Eisessig + 19,25 g Ammoniumacetat In 9£>0 ml Wasser] wird das reine, geschlitzte Tetrakosapeptidamid aus den Fraktionen 46 - 58 erhalten (Verteilungszahl K « 0,82). Bei DUnnschichtchromatographie auf Silikagelplatten zeigt das geschützte Peptidderivat ,folgende Rf-Wertet

• Rf (52) ■·..;" β 0,5^

Rf (100) . »0,35

Rf im System Chloroform-Methanol(7i3)<= 0,4

109831/21.84

12)K-D-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-Phe-Arg-Try«Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Lys-Lys-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-NHg (essigsaures Salz). Die Abspaltung der Schutzgruppen aus dem geschützten Peptid und die Ueberführung des trifluoresslgsauren in das essigsaure Salz geschieht wie in Beispiel 1 beschrieben. Das freie Tetrakosapeptldamid zeigt bei de? Papierelektrophorese (Papier Schleiche & Schüll, 2043/b mgl; Pyridln-Acetat. Puffer, $Ά « 6,35| Laufzeit 1 Stunde; 2000 V) eine Laufstrecke von 8 cm gegen die Kathode iBei «i^.'Dünnschlchtchromatographie weist es folgende Rf-Werte auf: Rf (101) auf Aluminiumoxydplatte '»'"'0,58 Rf (52A) auf Aluminiumoxydplatte ·» 0,44 . ' '% ; Rf (lOlE) auf Celluloseplatte . » 0,46. .."·"..

Beispiel J ! ■ .

Man stellt eine Trookenampulle aus folgenden Komponenten her: · . · ■

D-Ser -Nie -Lys ''^xo-ß^x -Corticotropin-

Hexaacetat ' 0,5 mg

ZnSOi₁ + 7 H₂O "1,23 mg

Na₅PO₄ + 12 H₂O . '1,38 mg

Mannit 40,0 mg

Vor Gebrauch wird der Inhalt des Trockenvials mit 1 ml desti Liiertem Wasser, enthalten In einer Lösunns inipulle, vor-

mischt; Man erhält eine Suspension mit einem pH von 7,6·

Beispiel

Man stellt eine Lösungsampulle aus folgenden Komponenten her: D-Se^-NIe-L; Hexaacetat . ■ ■ 0,5

1 k 17 Ifl 1-P4

D-Ser -Nie -Lys^Xj' °-ß^x -Corticotropin-

Gelatine · . ...'.'■ 280,0 mg

Phenol . . . . · 5»0 mg ·

dest. Wasser . ad .1,0 ml

Beispiel 5 s

Eine steril filtrierte wässrige Lösung von D-

1 4 17"l8 1-24 '

Ser -KIe -Lys "" -ß ^Oorticotropin-Kexaacetat wird unter aseptischen Bedingungen mit Natrium-Polyphloretinphosphat und Natriumchlorid vermischt und in Vials abgefüllt und lyophilisiert, sodass ein Trockenvial erhalten wird, das folgende Komponanten enthält ; - ' D-Ser¹-Nle^2f-Lys¹⁷'^l8-ß""²⁴-Corticotropin-Hexaacetat 0,5 mg Natrium-Polyphloretinphosphat (86,5 ^ig) · 23,20 mg NaCl ■■ · _r ' ' . ; 12,28 mg

Vor Gebrauch wird der Inhalt des Trockenvials mit 2 ml . g destilliertem Viasser, enthalten in einer" Lösungsampulle, • vermischt.' " . · ■ . ■·.."-.-·. ■'·'■ · . - ;

Beispiel 6 :. ... ■ \

Kan löst 11,12 mg Eisessig, 1,21 mg Natriumacetat, 2,5 rns Natriumchlorid und 2,0 mg D-i

ORlGiN^ INSPECTED

109831/218-4

^: . "^: !§68875

CortiGotropin-hexaacetat in 0,7 ml destilliertem Wasser und füllt mit destilliertem Wasser auf 1 ml auf. ßie Lösung wird bei 120° 20 Minuten autoklaviert.'Das pH ist nach der Sterilisation 3*7»' ·■ .'· ' ·.· * .:. · · ■·' '■■:. '·■ ' ·. ■

Beispiel?

• . Man löst in 0,7 ml physiologischer Natriumehlo-.ridlösung 0,5 mgD-Ser^-Nle^-Lys ''^xo-ß ^.-Corticotropin· hexaacetat und säuert die Lösung mit 0,1-n. Salzsäure auf pH >,2 an·' Mit destilliertem Wasser wird auf 1 ml auf ge-.füllt und wie in Beispiel 1 hitzesterilisiert« ·" · ' .;.

■.·..'.·. .' Beispiel 8 : : ■· ·" ■■·.·.

. Man stellt eine Suspension aus folgenden Komponenten 'her? .■ \ '-..;·. ■ ■ ■-' · ■ . / . '-_ ■ ■ ' D-Ser¹-Kle^-Lys¹⁷'^l8-ß¹"²⁴-C.orticotropin-hexa- . acetair . · ' . :,·;.· · ■ 1,0 mg

g^^S H₂O · ^:\\ ..;ΰ\Ύ. " ■;';:■ -■"; _, ■ .· . _:: 1,05 mg :NaCl \. . ' .·:. '. '■'■..:■[{■'. ''<"■' ''.'■/.. 2,0 mg Benzylalkohol · ■·..., ^:. :}.:.' ■'■ ' *'. ν . -C '. 10,0 mg

1 09831/2 1 84 V , <>^RIGINÄL '^^?

"■■" ³³ ·" , TB.6887.5

NaOH ad pH 8,3-V. V ^:··':::' . '. . .;, V ·'■'.. -; ·. . · ... :·. Dest. Wasser ad '··. · " "■ ■■ ": · · ·. ■':.:. . 1,0 ml.

• .· .:.../... Beispiel· 9-J -ν .··■'." '.-Z-'- '-· ■

. '■ Man stellt eine Suspension aus folgenden Komponen

D-Ssr¹-Nle⁴-Lys^17il8-ß¹"²⁴-C.ortiootropinr ';./:*'.■ '·' .;■ · {;; -. - ·. hexaacetat' . ■'." . ·;.''^:.^: ' j-'y-'i -' "■·' ■'".". ■'■'··

:Naci ■'■■.-- ■■-'·.■:. Benzylalkohol ""'.

NaOH^ ad pH. 8,3-·

■■.· · ··. · . "■·- ■,^: V ■■ Pest. Viasser ad

.1,	Q mg
β.	30 mg
ι,	2β mg
X	5. mg .
10,	0 'mg "'.
• Χ	Ö; ml

:· 2,0 g Poly-L-glutaminsäure mit einem mittleren, Molekularsov/icht von ca, 39 βθθ werden in ca, 5*7 ml 10 #iger

,·.Natronlauge gelöst, ■ sodass das pH der Lösung 7,4 beträgt.

" 1 4 17 l8 1-24 In dieser Lösung werden dann 10 mg D-Ser -Nie -Lys -ß CorfcUofcropin-hcxaaoQtat und 0,2 mg MarfchL-jlat aufgelöst luia ι.,'.; dv.i'oilU-J.-ic.ii VLiöSöt¹ uuf 10 ml aui'jufUlU.. X)Li LQ-

1 0 Ü - ·.'"'.·. · 'ö "4 BAD ORIGINAL

sung wird steril filtriert. Sie. enthält pro ml: . ' ■"■'·'". , D-Ser^-Nle -Lys¹^'¹ -ß¹ -Corticotropin-hexaacetat 1,0 mg' Eoly-L-glutaminsäure ' .." ' ..: ■/'."■■ ' 200,0 mg Natronlauge bis pH T,k _■*·._".. ' ."·:, .·. ' \ . = ..-' ^: ' -·.-: Merthiolat . . . ;■ "· ^; ^\\- '·"'- ' · ":"■"'■·.." ·'"-'·"' ^0#02

Aqua des t< ad · · '.ν Λ" γ- '■,.·-..· ,; 1*0 ml

:··■■■:'·."-■ ··■".· · Beispiel 11 ?· .'.· " /'' .. [ :'!'■' '■"■

: .·"-:■ -■ -tirn ' , ;". ■■'... . \ . .''.'. ■.;·'''>■ :■..''. /■■:. "■' ■■.'.■ V. Man stellt Präparate her wie in den Beispielen 3 - 10 beschrieben, die aber als aktives Peptid das D-Ser Wle^it-L·ys¹⁷'³:⁸-ß^:l"^2il·-Corticotropin-Pro²*-amid enthalten.^

1 D s η j ·! / 2 1 -8 4

ORiGlNAL INSPECTED

Claims (2)

1-6-68*75 • - 35 -Patentansprüche ϊ

1. Verfahren zur Herstellung neuer Peptide mit ACTH-Wirkung gemäss Hauptpatent, dadurch gekennzeichnet, dass man aus D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-norleueyl-L-glutamyl-(oder L-glutaminy^f-L-hist idyl -L-phenylalanyl -L-arginy1 -L-tryptophyl-glycy1-L-Iysy1-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-Iysy1-L-Iysyl-L-Iysy1-L-lysy1-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin oder ihren C-terminalen Amiden, in welchen Verbindungen mindestens die a-Aminogruppe und die Seitenketten-aminogruppen sowie gegebenenfalls vorhandene Seitenketten- oder terminale Carboxylgruppen geschützt sind, die Schutzgruppen abspaltet und, wenn erwünscht, die erhaltenen Verbindungen in ihre Säureadclitionssalze oder Komplexe überführt.

2. D-Seryl -L-tyrosyl -L-seryl -L-norleueyl -L-glutamyl ■*■ (oder L-glutaminyl)L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginy1-L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-Iysyl-L-lysyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin, ihre Säureadditionssalze und Komplexe.

3* D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-norleucyl-L-glutamyl-(oder L-glutaminyl) L-histidyl-L-phenylanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-

Mlü3 ifntertagQfTr (Art. 7 91 Abs.2 Nr. 1 S *-t 3 d- Änderunetfle·. V.«. 9. Ö6Z1

109831/2184

■ '!668875 - 36 -

L-lysyl-L-lysyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin-amid, und Ihre Säureadditionssalze und Komplexe.

**■· Zinkkomplexe des D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-

norleucyl-L-slutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-lysyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolins oder seines e^afiin&lea Amids oder der entsprechenden Verbindungen, die statt des Glutaraylrestes den Rest des" Glutamine aufweisen^

Komplexe des D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-norleuoyl· .L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophylglycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-lysyl -L-lysyl -L-prolyl -L-valyl -L-lysyl -L-VaIj^1-I -L-tyr osyl L-prolins oder seinem terminalen Amids mit Zinl^phosphat, Zinkpyrophosphat und/oder Zinkhydroxyd, '.. "..· . '

Komplexe des D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-norleucyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophylglycyl-L-Iysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-iysyl-L-lysyl-L-lysyl-L-lysyl-L.-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl -

,09831/2184 _{BAD 0R1G1NAL}

L-prolins, oder seines terminalen Amids mit Gelatine, PoIyphloretinphosphat oder Polyglutaminsäure.

Pharmazeutische Präparate, die als aktiven Bestandteil· D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-norleucyl~L-slutamyl-L-histidyl-L-phenjaalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-slycyl-L-lysyl-L-lysJl-L-lysyl-L-. lysyl-L-prolyl-L-valyl-L·-lysyl·'L·-valyl-L-tyrosyl~J_J-prolin oder dessen; terminales Amid oder, die entsprechenden Verbindunseiii die statt des Glutamylrestes den Rest des Glutamine aufweisen, ihre Säureadditionssalze oder Komplexe enthalten.

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