DE1543501C3 - Neue Peptide mit ACTH-Wirkung und Verfahren zu ihrer Herstellung - Google Patents

Description

In der deutschen Offenlegungsschrift 1 493 559 sind Peptide beschrieben, die sich durch eine verstärkte ACTH-Wirkung auszeichnen und die sich von den bekannten Peptiden mit ACTH-Wirkung dadurch unterscheiden, daß sie am Aminoende als erste α-Aminosäure eine D-Aminosäure aufweisen.

Als Peptid mit sehr guter ACTH-Wirkung ist im genannten Patent das H-D-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg - Pro - OH _; (D - Ser¹ - ß¹ ~¹⁹ - Corticotropin) beschrieben.

Es wurde nun gefunden, daß ein Octadecapeptidamid, das an Stelle der Argininreste in 17,18-Stellung Lysinreste enthält, eine höhere und längere adrenocorticotrope Wirkung aufweist.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind das D - Seryl -L-tyrosyl-L- seryl - L - methionyl-R- L - histidyl L - phenylalanyl - L - arginyl - L - tryptophyl - glycyl-L - lysyl - L - prolyl - L - valyl - glycyl - L - lysyl - L - lysyl-L-lysyl-L-lysin-amid, wobei R den L-Glutamin- oder L-Glutamylrest bedeutet, ihre Säureadditionssalze und Komplexe und Verfahren zu ihrer Herstellung.

Als Säureadditionssalze sind besonders Salze von therapeutisch anwendbaren Säuren, wie Salzsäure, Essigsäure, vor allem aber schwerlösliche Salze, wie Sulfate, Phosphate oder Sulfonate, zu nennen.

Unter Komplexen sind die komplexartigen, in ihrer Struktur noch nicht abgeklärten Verbindungen zu verstehen, die beim Zusatz gewisser anorganischer oder organischer Stoffe zu adrenocorticotrop wirksamen Peptiden entstehen, und vor allem diejenigen, die ihnen eine verlängerte Wirkung verleihen. Solche anorganische Stoffe sind Verbindungen, die sich von Metallen, wie Calcium, Magnesium, Aluminium, Kobalt und insbesondere von Zink ableiten, vor allem schwerlösliche Salze, wie Phosphate und Pyrophosphate sowie Hydroxyde dieser Metalle. Organische Stoffe, die eine Verlängerung der Wirkung hervorrufen, sind beispielsweise nicht antigene Gelatine, z. B. Oxypolygelatine, Polyvinylpyrrolidon und Carboxymethylcellulose, ferner Sulfonsäure- oder Phosphorsäureester von Alginsäure, Dextrin, Polyphenolen und Polyalkoholen, vor allem Polyphloretinphosphat und Phytinsäure, sowie Polymerisate und Copolymerisate von Aminosäuren, z. B. Protamin und insbesondere von Aminosäuren, die einen überwiegenden Anteil an sauren α-Aminosäuren, wie Glutaminsäure oder Asparaginsäure, aufweisen.

Die neuen Verbindungen besitzen, wie bereits erwähnt, eine wesentlich stärkere ACTH-Aktivität als die entsprechenden Verbindungen mit L-Konfiguration an der ersten Aminosäure. Sie sollen dementsprechend in der Human- und Veterinärmedizin verwendet werden, z. B. an Stelle des natürlichen Hormons.

Die neuen Peptide werden nach den für die Herstellung von Peptiden mit großer Kettenlänge bekannten Methoden hergestellt unter Verwendung von D-Serin als N-terminaler Aminosäure. Dabei werden die Aminosäuren in der erwähnten Reihenfolge einzein oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten verknüpft. Am Schluß der Synthese werden die Schutzgruppen in einer einzigen oder gegebenenfalls in mehreren Stufen abgespalten.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist daher dadurch gekennzeichnet, daß man aus D-Seryl-L-tyrosyl-L - seryl - L - methionyl - R - L - histidyl - L - phenylalanyl-L - arginyl - L - tryptophyl - glycyl - L - lysyl - l - prolyl-L - valyl - glycyl - L - lysyl - L - lysyl - L - lysyl - L - Iy sin - amid, wobei R den L-Glutamin- oder L-Glutamylrest bedeutet, in welchen Peptiden mindestens die a-Aminogruppe und die Seitenkettenaminogruppen . sowie eine gegebenenfalls vorhandene Seitenkettencarboxylgruppe geschützt sind, die Schutzgruppen abspaltet und, wenn erwünscht, die erhaltenen Verbindungen in

45. ihre Säureadditionssalze oder Komplexe überführt. Die Verknüpfung der Aminosäure- und/oder Peptideinheiten erfolgt in der Weise, daß man eine Aminosäure oder ein Peptid mit geschützter a-Aminogruppe und aktivierter terminaler Carboxylgruppe mit einer Aminosäure oder einem Peptid mit freier a-Aminogruppe und freier oder geschützter, z. B. veresterter oder amidierter terminaler Carboxylgruppe, umsetzt oder daß man eine Aminosäure oder ein Peptid mit aktivierter a-Aminpgruppe und geschützter terminaler Carboxylgruppe mit einer Aminosäure oder einem Peptid mit freier terminaler Carboxylgruppe und geschützter a-Aminogruppe umsetzt. Die Carboxylgruppe kann beispielsweise durch überführung in ein Säurehalogenid, -azid, -anhydrid, -imidazolid, -isoxazolid oder einen aktivierten Ester, wie Cyanmethylester, Carboxymethylester, p-Nitrophenylester, oder durch Reaktion mittels eines Carbodiimide (gegebenenfalls unter Zusatz von N-Hydroxysuccinimid) oder N,N' - Carbonyl - diimidazols aktiviert werden, die Aminogruppe beispielsweise durch Reaktion mit einem Phosphatamid aktiviert werden. Als gebräuchlichste Methoden sind zu nennen die Carbodiimidmethode, die Azidmethode, die Methode der

aktivierten Ester und die Anhydridmethode. Hervorzuheben ist auch die sogenannte Feststoffträgersynthese, bei der das Peptid vom Carboxylende, das esterartig an ein Polymeres gebunden ist, aufgebaut wird, indem man die Aminosäuren der Reihe nach ankondensiert.

An der Reaktion nicht beteiligte, freie, funktioneile Gruppen werden zweckmäßigerweise geschützt, insbesondere mittels durch Hydrolyse oder Reduktion leicht abspaltbarer Reste, die Carboxylgruppe vorzugsweise durch^: Veresterung, z. B. mit Methanol, tert.-Butanol, Benzylalkohol, p-Nitrobenzylalkohol, oder Amidbildung, die Aminogruppe beispielsweise durch Einführung der Tosyl-, Trityl-, Formyl-, Trifluoracetyl-, o-Nitrophenylsulfenyl-, Phthalyl- oder Carbobenzoxygruppe oder farbiger Schutzgruppen, wie der p-Phenylazo-benzyloxycarbonylgruppe und der p-(p'-Methoxy-phenylazo)-benzyloxycarbonylgruppe, oder insbesondere des tert.-Butyloxycarbonylrestes. Zum Schutz der Aminogruppe in der Guanidogruppierung des Arginine ist die Nitrogruppe geeignet; die genannte Aminogruppe des Arginins muß aber bei der Reaktion nicht notwendig geschützt werden. Die Iminogruppe des Histidins kann durch den Benzyl- oder Tritylrest geschützt werden.

Die Umwandlung einer geschützten Amino- oder Iminogruppe in eine freie Gruppe sowie die Überführung einer funktionell abgewandelten Carboxylgruppe in eine freie Carboxylgruppe im Verlauf des Verfahrens erfolgt nach an sich bekannten Methoden durch Behandlung mit hydrolysierenden bzw. reduzierenden Mitteln.

Ein bevorzugtes Verfahren besteht darin, daß man das die ersten 3 Aminosäuren, H-D-Ser-Tyr-Ser-OH enthaltende Tripeptid (die abgekürzte Schreibweise bezieht sich auf L-Aminosäuren, wenn das D-nicht besonders bezeichnet ist), oder das außerdem die 4. Aminosäure enthaltende Tetrapeptid mit dem Heptapeptid bzw. Hexapeptid der folgenden Aminosäuren bis zur Aminosäure 10 kondensiert, vorzugsweise nach der Azidmethode, und dann das Decapeptid mit dem Octapeptidamid der Aminosäuren 11 bis 18 kondensiert. .

Bei dieser Kondensation wird als Kupplungsmethode vorzugsweise die Carbodiimidmethode oder die Methode der aktivierten Ester, vor allem mittels des p-Nitrophenylesters, verwendet. Im letzten Falle braucht der p-Nitrophenylester des Decapeptids nicht als solcher isoliert zu werden, sondern kann auch in der Kondensationsstufe selbst aus dem Decapeptid mit freier Carboxylgruppe, p-Nitrophenol und Dicyclohexylcarbodiimid gebildet werden. Das Decapeptid liegt also als α-amino-geschütztes Peptid mit freier Carboxylgruppe oder mit einer p-Nitrophenylestergruppe vor. Die in den zu kondensierenden Peptidbruchstücken vorhandenen Seitenketten-Aminogruppen werden vorzugsweise durch die tert.-Butyloxycarbonylgruppe, die Seitenkettencarboxylgruppen durch die tert-Buty!estergruppe geschützt. Diese Schutzgruppen können in der letzten Stufe mit Trifluoressigsäure abgespalten werden.

Je nach der Arbeitsweise erhält man die neuen Verbindungen in Form von Basen oder ihren Salzen. Aus den Salzen können in an sich bekannter Weise die Basen gewonnen werden. Von letzteren wiederum lassen sich durch Umsetzung mit Säuren, die zur Bildung therapeutisch verwendbarer Salze geeignet sind, Salze gewinnen, wie z. B. solche mit anorganischen Säuren, wie Halogenwasserstoffsäuren, beispielsweise Salzsäure oder Bromwasserstoffsäure, Perchlorsäure, Salpetersäure oder Thiocyansäure, Schwefel- oder Phosphorsäuren, oder organischen Säuren,' wie Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Glykolsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Oxalsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Äpfelsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Ascorbinsäure, Hydroxymaleinsäure, Dihydroxymaleinsäure, Benzoesäure, Phenylessigsäure, 4-Aminobenzöesäure, 4-Hydroxybenzoesäure, Anthranilsäure, Zimtsäure, Mandelsäure, Salicylsäure,^-Amino-salicylsäure, 2-Phenoxybenzoesäure, 2-Acetoxybenzoesäure,' Methansulfonsäure, Äthansulfonsäure, Hydroxyäthansulfonsäure, Benzolsulfonsäure, p-Toluolsulfonsäure, Naphthalinsulf onsäure oder Sulfanilsäure. ''-

Die verfahrensgemäß erhaltenen Peptide können in Form von pharmazeutischen Präparaten Verwendung finden. Diese enthalten die Peptide in Mischung mit einem für die enterale oder parenterale Applikation geeigneten pharmazeutischen, organischen oder anorganischen Trägermaterial. Für dasselbe kommen solche Stoffe in Frage, die mit den Polypeptiden nicht reagieren, wie z. B. Gelatine, Milchzucker, Glukose, Kochsalz, Stärke, Magnesiumstearat, Talk, pflanzliche öle, Benzylalkohol, Gummi, Polyalkylenglykole, Vaseline, Cholesterin oder andere bekannte Arzneimittelträger. Die pharmazeutischen Präparate können z. B. als Lyophilisat oder in flüssiger Form als Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen vorliegen. Gegebenenfalls sind sie sterilisiert und bzw. oder enthalten Hilfsstoffe, wie Konservierungs-, Stabilisierungs-, Netzoder Emulgiermittel. Sie können auch noch andere therapeutisch wertvolle Stoffe enthalten.

So kann man sie beispielsweise auch mit den in der ACTH-Therapie üblichen Zusätzen zur Verlängerung der Wirkung, wie z. B. Oxypolygelatine, Polyphloretinphosphat, Carboxymethylcellulose oder den obenerwähnten schwerlöslichen Metallverbindungen, insbesondere Phosphaten, Pyrophosphaten oder Hydroxyden des Zinks, kombinieren. ^{7 s}

Weiter kann man zur Verlängerung der Wirksamkeit die neuen Peptide in ihre Komplexe mit Polymerisaten oder Copolymerisaten von Aminosäuren, insbesondere solchen, die einen überwiegenden Anteil an sauren «-Aminosäuren, wie Glutaminsäure oder Asparaginsäure der L-, D- oder D, L-Konnguration, aufweisen, überführen. Die genannten Polymerisate und Copolymerisate weisen in den Seitenketten freie Carboxylgruppen auf, während die terminate Carboxylgruppe frei oder funktionell abgewandelt sein,' z. B. als Estergruppe oder als eine unsubstituierte oder durch Kohlenwasserstoffreste, vor allem niedere Alkylgruppen, substituierte Amidgruppe, vorliegen kann.

Das Molekulargewicht der Polymerisate kann zwischen 1000 und 100000 liegen, vorzugsweise beträgt es 2000 bis 15000. Man verwendet für die Herstellung der Präparate zweckmäßig ein wasserlösliches, physiologisch verträgliches Salz, z. B. das Natrium- oder Ammoniumsalz, oder ein Salz mit einer organischen Base, wie Triäthylamin, Procain, Dibenzylamin, oder anderen tertiären Stickstoffbasen.

Die Polymeren sind bekannt oder können nach bekannten Verfahren hergestellt werden, beispielsweise nach dem von M. I d e 1 s ο η et al., J. Am. Chem. Soc. 80, 4631 et seq. (1958), beschriebenen Verfahren. So kann man z. B. Glutaminsäure-a-carboxyanhydridy-benzylester oder -tert.-butylester in Dioxan mit

Ammoniak oder einem Amin in einem bestimmten Molverhältnis, z. B. 100: 1 (je nach dem gewünschten Polymerisationsgrad), reagieren lassen und nach beendeter Polymerisation die Schutzgruppen abspalten, z. B. die Benzyloxygruppe mit Bromwasserstoff in Eisessig, die tert.-Butyloxygruppe mit Trifluoressigsäure. Zwecks Herstellung von Polymeren mit einheitlicher, definierter Kettenlänge kann man die Polymeren auch durch Synthese nach den in der Peptidchemie bekannten Verfahren (Carbodiimidmethode, Azidmethode usw.) aufbauen.

Die Konzentration des Polymeren in den pharmazeutischen Präparaten hängt von der Löslichkeit des betreffenden Salzes und von der Viskosität ab. Das Polymere soll in den Präparaten in gelöster Form vorliegen können und injizierbar sein.

Die Konzentration des adrenocorticotrop wirksamen Peptids wird so gewählt, daß das Präparat beispielsweise pro ml 10 bis 50 I. E. aufweist.

Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen beschrieben. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben.

Die dünnschichtchromatographischen Systeme werden wie folgt bezeichnet:

System 43 A: tert.-Amylalkohol-Isopropanol-

Wasser (100:40:10)
System 43 C: tert.-Amylalkohol-Isopropanol-

Wasser (100:40:55)
System 52: n-Butanol-Eisessig-Wasser

(100:10: 30)
System 52 A: n-Butanol-Eisessig-Wasser

(67:10:23)
System 100: Äthylacetat-Pyridin-Eisessig-

Wasser (62:21:6:11)
System 101: n-Butanol-Pyridin-Eisessig-

Wasser (30:20: 6 :24)

Folgende Abkürzungen werden verwendet:

Z = Carbobenzoxy,
BOC = tert.-Butyloxy carbonyl,
tBu = tert.-Butyl.

2. H-Lys(B OC)-Lys(B OC)-NH₂ 3 g Z-Lys(B OC)-Lys(B OC)-NH₂ werden unter leichtem Erwärmen in 100 ml Methanol gelöst und mit 500 mg Palladiumkohle (10% Pd) in der Schüttelente unter Absorption des sich bildenden Kohlendioxyds bei Raumtemperatur hydriert. Die Wasserstoffaufnahme ist nach etwa einer Stunde beendet, und nach einer weiteren Stunde wird der Katalysator abfiltriert und das Filtrat zur Trockne eingeengt. Das in quantitativer Ausbeute erhaltene Rohprodukt wird aus Essigester-Petroläther umkristallisiert und weist dann einen F. von 110 bis 112° auf. Auf Silicagel ergeben sich folgende Rf-Werte: ;

Rf (Chloroform—Methanol = 8:2) = 0,32

Rf (43A) = 0,35

Rf (52) = 0,65

3. Z-LyS(BOC)-PrO-VaI-GIy-LyS(BOC)-LyS(BOC)-Lys(B OC)-Lys(B OC)-NH₂

5,13g Z- Lys(B OC) - Pro - VaI - GIy - Lys(B OC)-LyS(BOC)-NHNH₂ (G. No. 2209/63 [Case 5247/5123]) werden in 60 ml absolutem Dimethylformamid gelöst und auf —25° abgekühlt. Bei dieser Temperatur gibt man tropfenweise unter Rühren 8,8 ml 2,115n-Salzsäure hinzu und zuletzt noch 0,973 ml 5 n-Natriumnitritlösung. Die Reaktionslösung wird während 15 Minuten bei —10° gerührt, worauf man eine auf —10° vorgekühlte Lösung von 2,0 g H-Lys(BOC)-Lys(BOC)-NH₂ in 10 ml Dimethylformamid zufügt und dann noch 2,6 ml Triäthylamin zutropft. Man rührt während 30 Minuten bei 0° und läßt dann während etwa 20 Stunden bei 0° stehen. Zur Isolierung des Rohproduktes engt man auf etwa 30 ml ein, fällt durch Zugabe von 150 ml Wasser und filtriert den flockiggallertigen Niederschlag ab. Nach zweimaligem Umkristallisieren aus Methanol-Wasser (2: 1) wird das geschützte Octapeptid in feinkristallisierter und chromatographisch reiner Form vom F. = 220 bis 22 Γ

(Zersetzung) erhalten. Es weist auf Silicagel folgende Rf-Werte auf: .·.·....-

Rf (Chloroform—Methanol = 9:1).. = 0,47 Rf (43 A) = 0,75

Beispiel 1
; 1. Z-Lys(B OC)-Lys(B OC)-NH₂

5 g Z-Lys(BOC)-Lys(BOC)-OCH₃ werden in 100 ml absolutem Methanol gelöst, bei Zimmertemperatur mit Ammoniakgas gesättigt und während 30 Stunden im verschlossenen Kolben stehengelassen. Die Lösung wird dann auf etwa 25 ml eingeengt und zur Kristallisation über Nacht in den Eisschrank gestellt. Man filtriert ab, wäscht mit ein wenig kaltem Methanol und trocknet die Kristalle im Vakuum. Man erhält 3,95 g Z-Lys (B OQ-Lys (B OC)-NH₂ vom F. = 165°. Die Verbindung zeigt bei der Dünnschichtchromatographie auf Silicagel folgende Rf-Werte:

. Rf (Chloroform—Methanol = 95:5) = 0,11

. . Rf (Chloroform—Methanol = 8:2) = 0,75

Rf (43A) = 0,76

Das als Ausgangsmaterial verwendete Z-Lys(BOC-Lys(BOC)-OCH₃, F. 78 bis 84° kann aus Z-Lys(BOC)-OH und H-Lys(BOC)-OCH₃ (vgl. belgisches Patent 594 338) durch Kondensation mittels Dicyclohexylcarbodiimid hergestellt werden.

4. H-LyS(B OC)-Pro-Val-Gly-Lys(B OC)-Lys(B OC)-Lys(B OC)-Lys(B OC)-NH₂

1,0 g der oben beschriebenen Carbobenzoxy-Verbindung wird in 250 ml Methanol gelöst und mit 200 mg Palladiumkohle (10% Pd) in der Schüttelente bei Zimmertemperatur und unter Kohlendioxyd-Absorption hydriert. Nach 6 Stunden wird der Katalysator abfiltriert, das Filtrat zur Trockne eingeengt und der Rückstand noch zweimal aus Methanol— Wasser umgefällt. Man erhält 738 mg chromatographisch einheitliches Octapeptidderivat, das auf Silicagel die folgenden Rf-Werte aufweist:

: Rf (Chloroform—Methanol = 9:1)..= 0,14 •Rf(52) ...v.......:.......;;..... =0,63

5. BOC-D-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu(OtBu)-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys(B OC)-PrO-Val-Gly-Lys(B OC)-

Lys(B OC)-Lys(B OC)-Lys(B OC)-NH₂

988 mg BOC- D-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu(OtBu)-His-Phe-Arg-Try-Gly-OH und 736 mg H-Lys(BOC)-Pro - VaI - GIy - Lys(BOC) - Lys(BOC) - Lys(BOC)-

7 8

LyS(BOC)-NH₂ werden in 20 ml Pyridin suspendiert Bei der Papierelektrophorese (16 Volt/cm) bei pH

und nach Zugabe von 0,3 ml Wasser und 0,835 ml 6,1 (Pyridinacetatpuffer) läuft die Verbindung in

1 η-Salzsäure während 15 Minuten bei 50° gerührt. 2 Stunden 11,5 cm gegen die Kathode.

Nach Zugabe von 378 mg Dicyclohexylcarbodiimid

rührt man während 3 Stunden bei 50°, gibt dann 5 B e i s ρ i e 1 2

nochmals gleich viel Dicyclohexylcarbodiimid zu, _ΛΛ . „. ~ , ■ « . <· ι j

-U₄ ·* ι cu j u ■ crvo j * j u· Man stellt eine Trockenampulle aus folgenden

rührt weitere 3 Stunden bei 50 und engt dann bis Komoonenten h

zur Bildung eines halbfesten Rückstandes ein. Durch .. .

Erwärmen mit 20 ml Dimethylformamid werden die Acetat des D-Ser¹-Lys^17>18-/i¹~¹⁸-Cor- '

Peptide gelöst und durch Filtration vom unlöslichen io : . ticotropin-Lys¹⁸-amids '... 0,5 mg

Dicyclohexylharnstoff abgetrennt. Das Filtrat wird ZnSO₄ + 7H₂O 1,23 mg

bis zur Bildung eines dickflüssigen Rückstandes ein- Na₃PO₄ + 12H₂O 1,38 mg

geengt und daraus durch Zugabe von 50 ml Wasser Mannit 40,0 mg

ein schmieriges Rohprodukt ausgefällt das von der _{Vor Gebrauch wird der Inhalt des Trockenvials}

Mutterlauge abgetrennt und getrocknet wird. Durch 15 _mk j _m, _{destilliertem Wasser)} enthalten in einer

zweimaliges Umfallen aus Dimethylformamid-Me- _Lösungsarnp_ulle, vermischt. Man erhält eine Suspen-

thanol-Essigester erhalt man 1,29 g Rohprodukt, das _sion mit einem pH von 7,6.

zur endgültigen Reinigung einer Craig-Verteilung im ■ ·

Lösungsmittelsystem Methanol-Puffer-Chloroform- Beisoie13

Tetrachlorkohlenstoff (10: 3: 7: 4) (Puffer = 28,5 ml 20 ^v

Eisessig + 19,25 g Ammoniumacetat in 960 ml Was- Man stellt eine Trockenampulle aus folgenden

ser) mit Phasenvolumina von je 10 ml unterworfen Komponenten her:

ψ wird. (Zu Beginn wird die Substanz gleichmäßig Acetat des D-Ser¹-Lys^17il8-rt¹~¹⁸-Cor-

) verteilt in die ersten fünf Elemente eingefüllt.) Nach ticotropin-Lys¹⁸-amids 0,5 mg

171 Stufen isoliert man aus den Elementen Nr. 50 25 ZnSO +7HO 1 23 me

bis 74 (_Tmax = 62; K = 0,57) durch Einengen zur Mannit ². 4θΌ mg

Trockne und Absublimieren des Ammoniumacetates ' ' bei 40° im Hochvakuum das dünnschichtchromato- und eine Lösungsampulle mit folgender Zusammengraphisch einheitliche geschützte Octadecapeptid- Setzung der Lösung: amid als reines, amorphes Pulver vom F. = etwa 30 ^. _pn , _{nHfl l18}

²¹⁰H^biS _Rf²w° Ρ⁶"?^2Ung)· ^{ES WeiSt aUf SÜiCagel foI}- 34%ige wäßrige Lösung Von ' '

gende Rf-Werte auf: äthylendiamintetraessigsaurem

_Λ Natrium + 7 Gewichtsprozent

Rf (Chloroform-Methanol Mononatriumsalz von N,N-Di-

nf7*?rv ' ⁼ η ft? ³⁵ (2-hydroxyäthyl)-glycin 0,1 mg

Ri(S)I::::::::::::::::::::::: =0,55 ^DeLWuBr-^ad. ¹^¹

Rf(IOO) = 0,43 Vor Gebrauch werden der Inhalt der Trockenampulle und der Lösungsampulle vermischt. Die

Das als Ausgangsstoff verwendete Decapeptidderi- 40 erhaltene Suspension hat ein pH von 7,6.

vat ist im Hauptpatent beschrieben. . _r; .

. B e i s ρ i e 1 4 .

⁶',^H'D"^Sev^T,^yr?^er;^MeT^t'^G1l^I'^Hir^Phxm^r?^TT^Ci^ly" Man stellt eine Lösungsampulle aus folgenden

Lys-Pro-Val-Gjy-Lys-Lys-Lys-Lys-NH, (d-Ser¹- Komponenten her:

fi\ Lys¹⁷·¹⁸-/?^{1 18}-Corticotropin-Lys¹⁸-amid) 45 ^

ψ ■ . Acetat des D -Se^-Lys¹⁷·¹⁸-^¹ "¹⁸-Cor-

400 mg geschütztes Octadecapeptid-amid werden ticotropin-Lys¹⁸-amids 0,5 mg

in 8 ml 90%iger Trifluoressigsäure gelöst und während Gelatine 280,0 mg

30 Minuten bei 25° stehengelassen. Man engt sodann Phenol 5,0 mg

auf ein Volumen von etwa 3 ml ein, gibt 20 ml Wasser ₅₀ Dest. Wasser, ad 1,0 ml

zu, engt nochmals ein und lyophiliert. Das so erhal- .^ _R ■ · 1 <: ^; tene Trifluoracetat des Octadecapeptid-amides wird ei spie ... zur Umwandlung in das Acetat in wenig Wasser Eine steril filtrierte wäßrige Lösung von D-Ser¹-gelöst und langsam durch eine Säule (Durchmesser Lys¹⁷'¹⁸ - /J¹ ~¹⁸ - Corticotropin - Lys¹⁸ - amid - acetat = 11 mm, 1 = 16 cm) von schwach basischem Ionen- ₅₅ wird unter aseptischen Bedingungen mit Natriumaustauscher (z. B. Merck Nr. II) in der Acetatform Polyphloretinphosphat und Natriumchlorid vermischt filtriert. Das Eluat wird auf ein kleines Volumen kon- und in Vials abgefüllt und lyophilisiert, so daß ein zentriert, lyophilisiert und bei 40° im Hochvakuum Trockenvial erhalten wird, das folgende Komponachgetrocknet. Man erhält 301mg chromatogra- nenten enthält: : phisch und elektrophoretisch einheitliches Acetat des 60 Arrt*t ή™ η ς_ΡΓι τ ν«"·« λ¹"¹⁸ Γογ

:L^a„^mÄ b:r«™ Bis s. ™ä,ä: Na,n»nÄo_lyP ^yh,o_K«inphospha, _{23 2o m} ^g

chromatogramm an Aluminiumoxyd werden folgende w-n' 1 V->s

Rf-Werte erhalten: 65 ^AZ8mg

Vor Gebrauch wird der Inhalt des Trockenvials

Rf (52A) = 0,13 mit 2 ml destilliertem Wasser, enthalten in einer

Rf(IOl) = 0,32 Lösungsampulle, vermischt.

Beispiel 6

Man stellt eine Suspension aus folgenden Komponenten her:

Acetat des y/

ticotropin-Lys¹⁸-amids 1,0 mg

ZnCl₂ 10,5 mg

Na₂HPO₄ 1,7 mg

Benzylalkohol 17,0 mg

NaCl 2,5 mg

NaOH ad pH 8,0

Aqua dest. ad 2 ml

B e i s ρ i e 1 7

2,0 g Poly-L-glutaminsäure mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 11 000 werden in etwa 5,7 ml 10%iger Natronlauge gelöst, so daß das pH der Lösung 7,4 beträgt. In dieser Lösung werden 5,0 mg D - Ser¹ - Lys¹⁷'¹⁸ - ß^l ~¹⁸ - Corticotropin - Lys¹⁸-amid-acetat und 0,2 mg Merthiolat aufgelöst und mit destilliertem Wasser auf 10 ml aufgefüllt. Die Lösung wird steril filtriert. Sie enthält pro ml .

Acetat des D-Ser¹-Lys^17>18-/i¹~¹⁸-Cor-

ticotropin-Lys¹⁸-amids 0,5 mg

Poly-L-glutaminsäure 200,0 mg

Natronlauge bis pH 7,4

Äthylmercurithiosalicylsaures

Natrium 0,02 mg

Aqua dest 1,0 ml

IO

20

10

Beispiel 11

Man löst in 0,7 ml physiologischer Natriumchloridlösung 0,5 mg D-Ser¹-Lys¹⁷-¹⁸-ß¹~¹⁸-Corticotropin-Lys¹⁸-amid-acetat und säuert die Lösung mit 0,1 n-Salzsäure auf pH 3,2 an. Mit destilliertem Wasser wird auf 1 ml aufgefüllt und wie im Beispiel 1 hitzesterilisiert. ..-.··..■·. .■·.-·.- ;

■;. Beispiel 12

In 0,8 ml destilliertem Wasser werden 7,05 ml Glycin und 6,08 mg Natriumchlorid gelöst und 0,055 ml 0,1 n-HCl zugefügt. Anschließend wird 1,0 mg D-Ser¹-Lys¹⁷·¹⁸ - Corticotropin - Lys¹⁸ - amidacetat in der Lösung aufgelöst und mit destilliertem Wasser auf 1,0 ml aufgefüllt.

Die Lösung wird auf übliche Weise filtriert, in Ampullen abgefüllt und bei 120°. 20 Minuten autoklaviert. Das pH beträgt 3,6.

B e i s ρ i e 1 13

In 0,8 ml destilliertem Wasser wird eine Lösung von 10,16 mg Zitronensäure (mit 1 Mol Kristallwasser), 0,097 ml 1 n-Natronlauge, 3,54 mg Natriumchlorid und 0,51 ml 0,1 η-Salzsäure hergestellt. In dieser Lösung werden 4,0 mg D-Se^-Lys¹⁷'¹⁸-^¹"¹⁸-Corticotropin-Lys¹⁸-amidacetat aufgelöst und mit destilliertem Wasser auf 1,0 ml aufgefüllt.

Die Lösung wird auf übliche Weise filtriert, in Ampullen abgefüllt und bei 120° 20 Minuten autoklaviert. Das pH beträgt 3,6.

Beispiels Beispiel 14

35 Man stellt eine Suspension aus folgenden Kom-2,0 g Poly-L-glutaminsäure werden in etwa 5,7 ml ponenten her: 10%iger Natronlauge -gelöst, so daß

das pH der

Lösung 7,4 beträgt. In dieser Lösung werden 5,0 mg Acetat des D-Ser¹-Lys^17>18-/S¹~¹⁸-Corticotropin-Lys¹⁸-amids und 0,2 mg Äthylmercurithiosalicylsaures Natrium aufgelöst. Zu dieser Lösung wird 1 ml einer salzsauren Zinkchloridlösung (pH 2,8) mit 5,2 mg Zinkchlorid pro ml gegeben. Das pH wird mit Natronlauge auf 7,8 eingestellt und mit destilliertem Wasser auf ein Endvolumen von 10 ml aufgefüllt.

Beispiel9

2,0 g Poly-L-glutaminsäure werden in etwa 5,7 ml 10%iger Natronlauge gelöst, so daß das pH der Lösung 7,4 beträgt. In dieser Lösung werden 5,0 mg Acetat des D-Ser^t-Lys¹⁷⁴⁸-/3¹~¹⁸-Corticotropin-Lys¹⁸-amids und 0,2 mg Äthylmercurithiosalicylsaures Natrium aufgelöst. Zu dieser Lösung werden 1 ml einer salzsauren Lösung (pH 2,8), enthaltend 5,2 mg Zinkchlorid, und 0,85 mg Dinatriumphosphat (wasserfrei) gegeben. Das pH wird mit Natronlauge auf 7,8 eingestellt. Man füllt mit Wasser auf ein Volumen von 10 ml auf.

Beispiel 10

Man löst 11,12 mg Eisessig, 1,21 mg Natriumacetat, 2,5 mg Natriumchlorid und 2,0 mg D-Ser¹-Lys¹⁷·¹⁸-ß¹ ~ ¹⁸ - Corticotropin - Lys¹⁸ - amid - acetat in 0,7 ml destilliertem Wasser und füllt mit destilliertem Wasser auf 1 ml auf. Die Lösung wird bei 120° 20 Minuten autoklaviert. Das pH ist nach der Sterilisation 3,7.

55

60 D-Se^-Lys¹⁷·¹⁸-/?¹ ~¹⁸-Corticotropin-

Lys¹⁸-amidacetat 1,0 mg

ZnCl₂ 5,25 mg

Na₂HPO₄ ■ 2H₂O 1,05 mg

NaCl 2,0 mg

Benzylalkohol 10,0 mg

NaOH ad pH 8,3

Dest. Wasser, ad 1,0 ml

B e i s ρ i e 1 15

Man stellt eine Suspension aus folgenden Komponentenher:

D-Ser¹-Lys¹⁷-¹⁸-/i¹~¹⁸-Corticotropin-

Lys¹⁸-amidacetat 1,0 mg

ZnCl₂ :...;. 6,30mg

Na₂NPO₄-2H₂O 1,26mg

NaCl 1,5mg

Benzylalkohol 10,0 mg

NaOH ad pH 8,3

Dest. Wasser, ad 1,0 ml

B ei s ρ i e 1 16

Man stellt 0,5 ml einer salzsauren Lösung von 0,5 mg D - Ser¹ - Lys¹⁷·¹⁸ - ß^l ~¹⁸ - Corticotropin - Lys¹⁸-amidacetat,5,25 mgZnCl₂,1,05 mgNa₂HPO₄ · 2H₂O und 2,0 mg NaCl vom pH 3,0 her und gibt die Lösung zu 0,5 ml einer wäßrigen Lösung von 10 mg Benzylalkohol, die so viel Natronlauge enthält, daß eine Suspension vom pH 8,3 erhalten wird.

Beispiel

5 mg Poly-L-glutaminsäure vom mittleren Molekulargewicht 39 600 werden in 5 ml 0,1 n-Natronlauge gelöst. Man filtriert die Lösung, gibt eine Lösung von 2,5 mg D-Ser¹-Lys¹⁷⁴⁸-^¹~¹⁸-Corticotropin-Lys¹⁸-amidacetat hinzu, säuert dann mit Essigsäure oder Salzsäure auf pH 4 an und füllt mit Wasser auf 10 ml auf. Dabei fällt ein Poly-L-glutaminsäure-D-Ser¹-Lys¹⁷·¹⁸-/?¹ ~¹⁸-Corticotropin-Lys¹⁸-amid-Komplex feinverteilt aus. Die Suspension enthält pro ml 0,5 mg Poly-L-glutaminsäure und 0,25 mg D-Sei^-Lys¹⁷'¹⁸-

ß^l -Corticotropin-Lys -amid als Komplexverbindung.

2,0 g Poly-L-glutaminsäure mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 39 600 werden in etwa 5,7 ml 10%iger Natronlauge gelöst, so daß das pH der Lösung 7,4 beträgt. In dieser Lösung werden dann 4,0 mg D- Ser¹ - Lys¹⁷⁴⁸ - ß¹ ~¹⁸ - Corticotropin-Lys¹⁸-amidacetat und 0,2 mg äthylmercurithiosalicylsaures Natrium aufgelöst und mit destilliertem Wasser auf 10 ml aufgefüllt. Die Lösung wird steril filtriert.

B e i s ρ i e 1 Sie enthält pro ml:

yzp

Lys¹⁸-amidacetat 4,0 mg

Poly-L-glutaminsäure 200,0 mg

Natronlauge bis pH 7,4

Äthylmercurithiosalicylsaures

Natrium 0,02 mg

Dest. Wasser, ad 1,0 ml

Claims (3)

Patentansprüche:

1. D- Seryl - L - tyrosyl - l - seryl - L - methionyl-R-L - histidyl - L - phenylalanyl - L - arginyl - l - tryptophyl - glycyl - L - lysyl - L - prolyl -L- valyl - glycyl-L - lysyl - L - lysyl -L- lysyl - L - lysin - amid, wobei R den L-Glutamin- oder L-Glutamylrest bedeutet sowie, falls R den Glutamylrest darstellt, die Komplexe mit Zinkphosphat, Zinkpyrophosphat und/oder Zinkhydroxyd.

2. Verfahren zur Herstellung von Peptiden nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man aus D - Seryl - L - tyrosyl - L - seryl - L - methionyl-R - L - his tidy 1 - L - phenylalanyl - L - arginyl -L- tryptophyl - glycyl - L - lysyl - L - prolyl - L - valyl - glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-lysyl-L-lysin-amid, wobei R den L-Glutamin- oder L-Glutamylrest bedeutet, in welchen Peptiden mindestens die a-Aminogruppe und die Seitenkettenaminogruppen sowie eine gegebenenfalls vorhandene Seitenkettencarbonylgruppe geschützt sind, in an sich bekannter Weise die Schutzgruppen abspaltet und gegebenenfalls die erhaltenen Verbindungen in ihre Säureadditionssalze oder Komplexe überführt.

3. Pharmazeutische Präparate, die als aktiven Bestandteil D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-R-L-histidyl-L-phenyl-alanyl-L-arginyl-L-tryptophyl - glycyl - L - lysyl - L - prolyl - L - valyl - glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-lysyl-L-lysin-amid, wobei R den L-Glutamin- oder L-Glutamylrest bedeutet, ihre Säureadditionssalze und/oder Komplexe enthalten.