DE1543502A1 - Neue Peptide mit ACTH-Wirkung - Google Patents

Description

CIBA AKTIENGESELLSCHAFT, BASEL (SCHWEIZ)

Case 5805/5503/1+2
Deutschland

Neue Peptide mit ACTH-Wirkung

Im Hauptpatent Nr. (G.Nr. 10583/64,

Gase 5503) sind Peptide beschrieben, die sich durch eine verstärkte ACTH-Wirkung auszeichnen und die sich von den bekannten Peptiden mit ACTH-Wirkung dadurch unterscheiden, dass sie am Aminoende als erste α-Aminosäure eine D-Aminosäure aufweisen.

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Als Peptid rait sehr guter ACTH-Wirkung ist im Hauptpatent das H-D-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-OH (D-Ser -ß -Corticotropin) beschrieben.

Es wurde nun gefunden, dass das entsprechende Peptid das an Stelle der Argininreste in 17,18-Stellung Lysinreste enthält, eine etwa gleich gute adrenocroticotrope Wirkung aufweist. Das neue Peptid, D-Ser , Lys ^{* -ß "* -Cortico-

1 1-24 tropin, lässt sich leichter herstellen als D-Ser -ß Corticotropin, weil es die Argininreste in den Stellungen 17,18, die wegen der Guanidinogruppe in der Seitenkette dip Herstellung des Peptids erschweren, nicht enthält.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutamyl-L-histidyl-I»- phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L-propyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-Ii-lysyl-L-lysyl-L-prolyl-I»- valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-proibin sowie die entspreche

.1.

de Verbindung, die statt des Glutaraylrestes den Rest des Glutamine aufweist, ihre Säureadditionssalze, Derivate und :c Komplexe, und Verfahren zu ihrer Herstellung.

Als Säureadditionssalze sind besonders Salze von therapeutisch anwendbaren Säuren, wie Salzsäure, Essigsäure, vor allem aber schwerlösliche Salze, wie Sulfate, Phosphate oder Sulfonate, zu nennen«

Unter Derivaten sind beispielsweise Ester, wie Niederalky!ester, z.B. Methyl-, Aethyl-, Propyl-, tg>rt.-

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Butylester, oder unsubstituierte oder z.B. durch die Nltrogruppe, Halogenatome, Niederalkyl- oder Niederalkoxygruppen substituierte Benzylester, ferner Hydrazide und Amide, insbesondere Peptidamide, in denen die C-terminals Carboxylgruppe amidiert ist, zu verstehen.

Unter Komplexen sind die komplexartigen, in ihrer Struktur noch nicht abgeklärten Verbindungen zu verstehen, die beim Zusatz gewisser anorganischer oder organischer Stoffe zu adrenocorticotrop wirksamen Peptiden entstehen, und vor allem diejenigen, die ihnen eine verlängerte Wirkung verleihen. Solche anorganische Stoffe sind Verbindungen, die sich von Metallen, wie Calcium, Magnesium, Aluminium, Cobalt und insbesondere von Zink ableiten, vor allem schwerlösliche Salze, wie Phosphate und Pyrophosphate sowie Hydroxyde dieser Metalle» Organische Stoffe, die eine Verlängerung der Wirkung hervorrufen, sind beispielsweise nicht antigene Gelatine, z.B. Oxypolygelatine, Polyvinylpyrrolidon und Carboxymethylcellulose, ferner Sulfonsäure- oder Phosphorsäureester von Alginsäure, Dextrin, Polyphenolen und PoIyalkoholen, vor allem Polyphloretinphosphat und Phytinsäure, sowie Polymerisate und Copolymerisate von Aminosäuren, z.B. Protamin und insbesondere von Aminosäuren, die einen überwiegenden Anteil an sauren α-Aminosäuren, wie Glutaminsäure oder Asparaginsäure, aufweisen.

Die neuen Verbindungen besitzen, wie bereits erwähnt, eine wesentlich stärkere ACTH-Aktivität als die ent-

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sprechenden Verbindungen mit L-Konfiguration an der ersten Aminosäure. Sie sollen dementsprechend in der Human- und Veterinärmedizin verwendet werden, z.B. an Stelle des natürlichen Hormons.

Die neuen Peptide werden nach den für die Bers-tellung von Peptiden mit grosser Kettenlänge bekannten Methoden hergestellt unter Verwendung einer D-Aminosäure als N-terminaler Aminosäure. Dabei werden die Aminosäuren in der erwähnten Reihenfolge einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten verknüpft. Am Schluss der Synthese werden die Schutzgruppen in einer einzigen oder gegebenenfalls in mehreren Stufen abgespalten.

Das erflndungsgemässe Verfahren ist daher dadurch gekennzeichnet, dass man aus D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophylglycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-lysyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin oder der entsprechenden Verbindung, die statt des Glutamylrestes den Rest des Glutamins aufweist, in welchen Peptiden mindestens die a-Aminogruppe und die Seitenkettenaminogruppen sowie die terminale Carboxylgruppe und eine gegebenenfalls vorhandene Seitenkettencarboxylgruppe geschützt sind, die Schutzgruppen abspaltet und, wenn erwünscht, die erhaltenen Verbindungen in ihre Säureadditionssalze, Derivate oder Komplexe überführt. Die Verknüpfung der Aminosäure- und/oder Peptideinheiten erfolgt in der Weise, dass

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man eine Aminosäure oder ein Peptid mit geschützter a-Aminogruppe und aktivierter terminaler Carboxylgruppe mit einer Aminosäure oder einem Peptid mit freier a-Aminogruppe und freier oder geschützter, z.B. veresterter oder amidierter terminaler Carboxylgruppe, umsetzt oder dass man eine Aminosäure oder ein Peptid mit aktivierter a-Aminogruppe und geschützter terminaler Carboxylgruppe mit einer Aminosäure oder einem Peptid mit freier terminaler Carboxylgruppe und geschützter a-Aminogruppe umsetzt. Die Carboxylgruppe kann beispielsweise . durch Ueberführung in ein Säurehalogenld, -azid, -anhydrid, -imidazolid, isoxazolid oder einen aktivierten Ester, wie Cyanmethylester, Carboxymethylester, p-Nitrophenylester, oder durch Reaktion mittels eines Carbodiimide (gegebenenfalls unter Zusatz von N-Hydroxy-suecinimid) oder Ν,Ν'-Carbonyl-diimidazols aktiviert werden, die Aminogruppe beispielsweise durch Reaktion mit einem Phosphatamid aktiviert werden. Als gebräuchlichste Methoden sind zu nennen die Carbodiimidmethode, die Azidmethode, die Methode der aktivierten Ester und die Anhydridmethode. Hervorzuheben ist auch die sogenannte Peststoffträgersynthese, bei der das Peptid vom Carboxylende, das esterartig an ein Polymeres gebunden ist, aufgebaut wird, indem man die Aminosäuren der Reihe nach ankondensiert.

An der Reaktion nicht beteiligte, freie, funktionelle Gruppen werden zweckmässigerweise geschützt« insbesondere mittels durch Hydrolyse oder ReduktionMeioht ab-

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spaltbarer Reste, die Carboxylgruppe vorzugsweise durch Veresterung, z.B. mit Methanol, tert.-Butanol, Benzylalko hol, p-Nitrobenzylalkohol, oder .Amidbildung, die Aminogruppe beispielsweise durch Einführung der Tosyl-, Trityl-, Porrayl-, Trifluoracetyl-, o-Nitrophenylsulfenyl-, Phthalyl- oder Carbobenzoxygruppe oder farbiger Schutzgruppen, wie der p-Phenylazo-benzyloxycarbonylgruppe und der p-(p'-Methoxy-phenylazo)-benzyloxycarbonylgruppe, oder insbesondere des tert.-Butyloxycarbonylrestes. Zum Schutz der Aminogruppe in der Guanidogruppierung des Arginine ist die Ntrogruppe geeignet; die genannte Aminogruppe des Arginins muss aber bei der Reaktion nicht notwendig geschützt werden. Die Iminogruppe des Histidins kann durch den Benzyl- oder Tritylrest geschützt werden.

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Die Umwandlung einer geschützten Amino- oder Iminogruppe in eine freie Gruppe sowie die Ueberführung einer funktionell abgewandelten Carboxylgruppe in eine freie Carboxylgruppe im Verlaufe des Verfahrens erfolgt nach an sich bekannten Methoden durch Behandlung mit hydrolysieren" den bzw. reduzierenden Mitteln,

Ein bevorzugtes Verfahren besteht darin, dass man das die ersten J> Aminosäuren, ;:.-B. H-D-Ser-Tyr-Ser-OH enthaltende Tripeptld (die abgekürzte Schreibweise bezieht sich auf L-Amlnosäuren, wenn das D- nicht besonders bezeichnet ist), oder das ausserdem die 4. Aminosäure enthaltende Tetrapeptid mit demHeptapeptid bzw. Hexapeptid der folgenden Aminosäuren bis zur Aminosäure 10 kondensiert, vorzugsweise nach der Azidmethode, und dann das Decapeptid mit dem Tetradeoapeptid der Aminosäuren 11-24 kondensiert, Bei dieser Kondensation wird als Kupplungsmethode vorzugsweise die Carbodiimidmethode oder die Methode der aktivierten Ester, vor allem mittels des p-Nitrophenylesters, verwendet. Im letzten Fall braucht der p-Nitrophenylester des Decapeptids nicht als solcher isoliert zu werden, sondern kann auch in der Kondensationsstufe selbst aus dem Decapeptid mit freier Carboxylgruppe, p-Nitrophenol und Dicyclohexylcarbodiimid gebildet werden. Das Decapeptid liegt also als o-AminogeschUtztes Peptid mit freier Carboxylgruppe oder mit einer p-Nitrophenylestergruppe vor. Das Tetradepapepfcfcd..WlFd_nin eines Esters, vorzugsweise des tert. Butylesters,oder des «ϋ-Amids verwendet. Die in den zu kondensierenden

109852/1882 _0RlGmW.

PeptidbruchstUcken vorhandenen Seitenketten-Anrlnogruppen werden vorzugsweise durch die tert.-Butyloxycarbonylgruppe, die Seitenkettencarboxylgruppen durch die tert.-Butylester» gruppe geschützt. Diese Schutzgruppen können in der letzten Stufe mit Trifluoressigsäure abgespalten werde».

Nach einem weiteren bevorzugten Verfahren wird das die ersten 4 Aminosäuren enthaltende Tefcrapeptid H-B-Ser-Tyr-Ser-Met-OH mit dem Eicosapeptid der Aminosäuren 5-24· kondensiert. Bei dieser Kondensation wird als Kupplungsmethode vorzugsweise die Azidmethode verwendet. Die α-Aminogruppe des Tetrapeptidhydrazids bzw. -azids wird vorzugsweise durch die tert. Butyloxycarbonlygruppe'geschützt. Das Eicosapeptid kann als freies Peptid oder als Ester, insbesondere tert, Butylester,

24
oder als Pro -Amid vorliegen. Auch im Eicosapeptid werden die Seitenketten-Aminogruppen vorzugsweise durch die tert. Butyloxycarbonylgruppe, die Seitenkettencarboxylgruppe durch die tert.¹ ■ "Butylestergruppe geschützt.

Nachdem man durch Kondensation der PeptidbruchstUoke das Tetracosapeptid erhalten hat, dessen α-Aminogruppe und Seltenketten-Aminogruppen durch die tert.Bütyloxycarbonylgrupe und dessen Endcarboxylgruppe und Seitenkettencarboxylgruppe durch die tert.Buty!estergruppe geschützt sind, können alle diese Schutzgruppen gleichzeitig durch äaure Hydrolyse, beispielsweise mit Trifluoressigsäure, abgespalten werden. Liegt

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die Endcarboxylgruppe nicht als tert.-Butylestergruppe, sondern als Amidgruppe vor, so werden Peptidamide erhalten, Peptidhydrazide erhält man beispielsweise, wenn man ein Peptid mit endständiger Niederalkylestergruppe mit Hydrazinhydrat behandelt.

Die Erfindung betrifft auch diejenigen Ausführungsforraen des Verfahrens, bei denen man von einer auf irgendeiner Stufe des Verfahrens als Zwischenprodukt erhältichen Verbindung ausgeht und die fehlenden Verfahrensschritte durch-, führtj oder das Verfahren auf irgendeiner Stufe abbricht, sowie die dabei erhaltenen Zwischenprodukte.

Je nach der Arbeitsweise erhält man die neuen Verbindungen in Form von Basen oder ihren Salzen. Aus den SaI- · zen können in an sich bekannter Weise die Basen gewonnen werden. Von letzteren wiederum lassen sich durch Umsetzung mit Säuren, die zur Bildung therapeutisch verwendbarer Salze geeignet sind, Salze gewinnen, wie z.B. solche mit anorganischen Säuren, wie Halogenwasserstoff säuren, beispielsweise Salzsäure oder Bromwasserstoffsäure, Perchlorsäure, Salpetersäure oder Thiocyansäure, Schwefel- oder Phosphorsäuren, oder organischen Säuren, wie Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Glykolsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Oxalsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Aepfelsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Ascorbinsäure, Hydroxymaleinsäure, Dihydroxymalein-"

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säure, Benzoesäure, Phenylessigsäure, 4-Aminobenzoesäure, 4-Hydroxybenzoesäure, Anthranilsäure, Zimtsäure, Mandelsäure, Salicylsäure, 4-Aminc—salicylsäure, 2-Phenoxybenzoesäure, 2-Acetoxybenzoesäure, Methansulfonsäure, Aethansülfonsäure, Hydroxyathansulfonsaure, Benzolsulfonsäure, p-Toluolsulfonsäure, Naphthalinsulfonsäure oder Sulfanilsäure. .

Die verfahrensgemäss erhaltenen Peptide können in Form von pharmazeutischen Präparaten Verwendung finden, Diese enthalten die Peptide in Mischung mit einem für die enterale oder parenterale Applikation geeigneten pharmazeutischen, organischen oder anorganischen Trägermaterial. Für dasselbe kommen solche Stoffe in Frage, die mit den Polypeptiden nicht reagieren, wie z.B. Gelatine, Milchzucker, Glukose, Kochsalz., Stärke, Magnesiumstearat, Talk, pflanzliche OeIe, Benzylalkohol, Gummi, Polyalkylene glykole, Vaseline, Cholesterin oder andere bekannte Arzneimittelträger. Die pharmazeutischen Präparate können z.B, als Lyophilisat oder in f lüssigeijForm als Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen vorliegen. Gegebenenfalls sind sie sterilisiert und bzw. oder enthalten Hilfsstoffe, .wie Konservierungs-, Stabillsierungs-, Netz- oder Emulgiermittel. Sie können auch noch andere therapeutisch wertvolle Stoffe enthalten.

So kann man sie beispielsweise auch mit den in der ACTH-Therapie üblichen Zusätzen zur Verlängerung der Wir-

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lcungj, wie z.B. Oxypolygelatine, Polyphloretinphosphat, Carboxymethylcellulose, oder den oben erwähnten, schwerlöslichen Metallverbindungen, insbesondere Phosphaten, Pyrophosphaten oder Hydroxyden des Zinks, kombinieren.

Weiter kann man zur Verlängerung der Wirksamkeit die neuen Peptide in ihre Komplexe mit Polymerisaten oder C©polymerisaten von Aminosäuren, insbesondere solchen, die einen überwiegenden Anteil an sauren α-Aminosäuren, wie Glutaminsäure oder Asparaginsäure der L-, D- oder D,L-Konfiguration, aufweisen, überführen. Die genannten Polymerisate und Copolymerisate weisen in den Seitenketten freie Carboxylgruppen auf, während die terminale Carboxylgruppe frei oder funktionell abgewandelt sein, z.B. als Estergruppe oder als. eine unsubstituierte oder durch Kohlenwasserstoffreste, ■ vor allem niedere Alkylgruppen, substituierte Amidgruppe. vorliegen kann. Das Molekulargewicht der Polymerisate kann zwischen 1000 und 100 000 liegen, vorzugsweise beträgt es 2000-15000. Man verwendet für die Herstellung der Präparate zweckmässig ein wasserlösliches, physiologisch verträgliches Salz, z.B. das Natrium- oder Ammoniumsalz, oder ein Salz mit einer organischen Base, wie Triäthylamin, Procain, Dibenzylamin, oder anderen tertiären Stickstoffbasen.

Die Polymeren sind bekannt oder können nach bekannten Verfahren hergestellt werden, beispielsweise nach dem von M, Idelson et al., J. Am.Chem.Soc. 80, 4631 et seq.

BAD

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(1958) beschriebenen Verfahren. So kann man z.B. Glutaminsäure-a-carboxyanhydrld-^benzylester oder -tert.-butylester in Dioxan mit Ammoniak oder einem Amin in einem bestimmten Molverhältnis, z.B, 100:1 (je naoh dem gewünschten Polymerisationsgrad), reagieren lassen und nach beendeter Polymerisation die Schutzgruppen abspalten, z.B. die Benzyloxygruppe mit Bromwasserstoff in Eisessig, die tert.-Butyloxygruppe mit Trifluoressigsäure. Zwecks Herstellung von Polymeren mit einheitlicher, definierter Kettenlänge kann man die Polymeren auch durch Synthese nach den in der Peptidehemie bekannten Verfahren (Carbodiimidmethode, Azidmethode etc.) aufbauen.

Die Konzentration des Polymeren in den pharmazeutischen Präparaten hängt von aer Löslichkeit des betreffenden Salzes und von der Viskosität ab. Das Polymere soll in den Präparaten in gelöster Form vorliegen können und injizierbar sein.

Die Konzentration des adrenocorticotrop wirksamen Peptide wird so gewählt, dass das Präparat beispielsweise pro ml 10-50 I.E. aufweist.

Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen beschrieben. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben.

Die dünnschichtchromatographischen Systeme werden wie folgt bezeichnet ;

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15A3502

System 4j5A · tert.-Amylalkohol-Isopropanol-Wasser

(100:40:10)

System 45 : sec. Butanol-5^ wässriges Ammoniak

(100:44)

System 100 : Aethylacetat-Pyridin-Elsessig-Wasser

(62:21:6:11)

System 101 : n-Butanol-Pyridin-Eisessig-Wasser

(30:20:6:24)

Folgende Abkürzungen werden verwendet : Z a Carbobenzoxy BOC = tert.-Butyloxycarbonyl tBu β tert.-Butyl,

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Beispiel 1 :

1) Z.Lys(BOC)-Lys(BOG).NHNH₂

10 g Z.Lys(BOC)-Lys(BOC).OCH, (hergestellt aus Z.Lys-

(BOC) -OH⁰VHiLyS"cioWote(äW$S^TT9ieyci6hexylcarbodiimid) werden in l60 ml Methanol gelöst und rait 7,8 ml Hydrazinhydrat versetzt. Man lässt die klare Lösung während 24 Stunden bei 25° stehen und engt dann auf ca. 1/3 des ursprünglichen Volumens ein. Beim Versetzen mit 200 ml Wasser fällt ein öliger Niederschlag aus, der sich beim Abkühlen und Zerreiben verfestigt und pulverisiert^ werden kann. Man nutscht ab, wäscht mit Wasser und trocknet das Rohprodukt. Es wird durch einmaliges Umkristallisieren aus Methanol-Essigester-Petroläther gereinigt und weist dann einen P. vqn 118 - 119,5° auf. Auf Silicagel-Dünnschichtplatten werden folgende Rf-Werte erhalten:

Rf (43 A) = 0,40

Rf (Chloroform-Methanol = 5?: 1) e 0,75

2) Z.Lys(BOC) -Lys(BOC) -Pro-OH

1,87 g Z.Lys(BOC)-Lys(BOC).NHNH₂ werden in 15 ml frisch destilliertem Dimethylformamid gelöst und auf -25° abgekühlt. Dazu tropft man langsam 2,07 ml 4,35-n. Salzsäure und anschliessend 0,66 ml 5-n. Natriumnitritlösungr·

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Man rührt während 10 Minuten bei -10° und gibt dann eine Lösung von 692 mg L-Prolin in 4,2 ml DimethyIformamid-. Wasser (2:1) zu. Schliesslich werden noch bei -10° 1,82 ml Triäthylamin zugetropft und dann die Reaktionslösung Über Nacht bei 0° und während weiterer 2 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen. Man engt sodann im Hochvakuunr.aüf ein Volumen von ca. 4 ml ein und versetzt den klebrigen Rückstand mit 25 ml Wasser. Durch Abkühlen auf 0° und Zerreiben kann er pulverisiert werden. Man nutscht ab, wäscht mit wenig Wasser und trocknet im Hochvakuum bei 40 .· Zur Reinigung des nicht kristallisierbären Rohproduktes wird eine multiplikative Verteilung nach Craig im Lösungsmittelsystem Methanol-Puffer-Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff (55:15:15:15) [Puffer - 28,5 ml Eisessig + 19,25 g Ammoniumacetat in 9^0 ml Wasser] mit Phasenvolumina von je 10 ml durchgeführt. Nach 220 Stufen isoliert man aus den Verteilungselementen Nr. 49-73 i/h- =* 6l; K * 0,59) durch Einengen zur Trockne und Wegsublimieren des Ammoniumaeetates chromatographisch reines, jedoch amorphes Tripeptidderivat vom P. ca. 7Ο-8Ο . Im DUnnschichtchromatogramm an Silicagel werden folgende Rf-Werte erhalten:'

Rf (Chloroform-Methanol'« 9:1) »0,19 Rf (45 A) , ' - 0,29

Rf (45) - 0,52

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-Ι'? Pt el

3) Z.Lys(BOC)-Lys(BOC)-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr-Pro.OtBu

2,4 g 2.LyS(BOC)-LyS(BOC)-Pro.OH und 3,12 g H.VaI-Lys(BOC)-Val-Tyr-Pro-OtBu werden In JO ml absolutem Chloroform gelöst. Man gibt bei 0° 0,845 g Dicyclohexylcarbodiimid zu, rührt während 1 Stunde bei 0° und lässt dann während JO Stunden bei 25° stehen. Der ausgeschiedene kristalline Dicyclohexylhar/istoff wird abfiltriert und mit ein we»l;: Essigester gewaschen. Zum Filtrat gibt man 150 ml Essigester nlg und extrahiert die organische Phase bei 0° dreimal mit je 30,-ml 3#iger Weinsäurelösung zur Entfernung des überschüssigen Pentapeptids. Man wäscht noch Mehrmals mit Wasser bis zur neutralen Reaktion und dampft dann zur Trockene ein. Zur Abtrennung von lipbphilen Verunreinigungen löst man den Rückstand in 10 ml Methanol und 20 ml Essigester und fällt

•^ ■ ■ .

das Octapeptid durch Zugabe von 120 ml Petroläther als schmierige Masse aus, die im Vakuum bei 40° getrocknet wird. Das so erhaltene Rohprodukt (3,1 g) wird zur endgültigen Reinigung einer Craig-Verteilung im System Methanol-Puffer-Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff (30M0:3:30) [Puffer wie unter 2) angegeben] über 225 Stufen mit Phasenvolumina von je 10 ml unterworfen. Das chromatographisch einheitliche Octapeptidderivat wird beim Einengen des inhaltes der-Elemente Nr. 65-96 (-^⁴LjO_x * 78» ^K ■ 0*53) zur Trockene und Wegsubllmleren

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W.

des Arhmoniumacetates im Hochvakuum als weisses amorphes Pulver vom P. ca. IjJO - l40° erhalten. Es weist auf Silicagel

folgende Rf-Werte auf : /	O	\*
Rf (43.A) ' - .	a O	,74
Rf (Chloroform-Methanol = 9:1)	-■ ο ' -. -	,54
Rf (Benzol-Aceton - .lsi)	,33
	..." -'■-.-'"■■"...'■ ·■■ ·_ ■-■'/.·:'"" ·ι. -■ ·· . H.Lys(BOC)^Lys(BOC)-PrO-VaI-LyS(BOC)-Val-Tyr-Pro-OtBu»

1,46 g Z.Lys(BOC)-Lys(BOC)-Pro-VaI-Lys(BOG)-VaI-Tyr-Pro-OtBu werden in 40 ml Methanol nach Zugabe von 5Ö0 mg lO^iger Palladiumkohle in einer Schüttelente mit Kohlen-' dioxyd-Absorption hydriert. Die Wa^βerstoffaufnähme ist nach 20 Min. bereits beendet. Nach 1 Stunde wird der Katalysator abfiltriert, mit Methanol iiachgespÜlt und das Piltrat zur Trockene eingedampft. Man erhält in quantitativer Ausbeute das chromatographisch einheitliche·deearbobenzoxylierte Octapeptidderivat als weisses amorphes Pulver vom Fjoa.

= ■ . ■ ■ -*»·■■

110-120°. Es weist im Dünnschichtehromatogramm auf Silioagel

folgende Rf-Werte aüifj ^{! v} ." ■'.·. _:

Rf (4? A) ' . .- 0,53

Rf (Chloroform-Methanol -. 9? 1) «0,34 · ·· ·

109852/1882 BAD

5) Z.Lys(BOC)-Pro-Val-Oly-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr-Pro-OtBu. _:

1,98 g Z-Lys(BOC)-PrO-VaI-GIy-LyS(BOC)-Lys(BOC).NHNHg (O. ^•28209/63 Case 5247/5123) werden in 22 ml absolutem Dimethylformamid gelöst und nach Abkühlen auf -25° tropfenweise ! unter Rühren mit 3,4 ml 2,115-n. Salzsäure und dann mit 0,378 ml 5-n. Natriumnitritlösung versetzt?. Die klare Lösung wird während 15 Minuten bei -10° weitergerührt und dann mit einer auf -5° vorgekühlten Lösung von 1,313 g des oben be schriebenen Octapeptidderivates in 4 ml Dimethylformamid setzt.. Man spült noch mit 1 ml Dimethylformamid nach und

ver

tropft.

dann langsam bei -5° 1,05 m|| Triäthylamin zu. Das Reaktionsgemisoh wird noch während 30 Minuten gerührt u/nd dann während 15 Stunden bei 0° stehen gelassen. Schliesslich wird bis zur Bildung eines viskosen Oeles konzentriert und daraus durch Zugabe von 20 ml Wasser eine schmierige Masse ausgefällt., ,' Diese wird un$er Erwärmen in 20 ml Methanol wieder gelöst ' und das Peptid durch Zugabe von 30 ml Wasser abermals ausgefällt. Beim Kühlen auf 0° und Zerreiben erhält man eine pulverige Aufschlämmung, die filtriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet wird. Dieses Rohprodukt'wird zur Reinigung eintr Craig-Verteilung im System Methanol-Puffer-Chloroform-

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Tetrachlorkohlenstoff (60:20:3 s60) [Puffer wie unter 2) angegeben] mit Phasenvolumina von je 20 ml unterworfen. Nach 218 Stufen isoliert man aus den Elementen Nr. 105 - 134 . m 121; K « 1,25) durch Einengen zur Trockene und

iax

Absublimieren des Ammoniumacetates im Hochvakuum chromatographisch einheitliches geschütztes Tetradecapeptid ale weisses, amorphes Pulver vom P. ca. I8O-19O⁰. Es. weist auf Silioagel golgende Rf-Werte auf t' . :

Rf (43 A) . - 0,80

Rf. (Chloroform-Methanol « 9:1) « 0,49

6) HrLys(BOC) -PrO-VaI-OIy-LyS(BOC) -Lys(BOC) -Lys(BOC) -Lys(BOC)-Pro-Val-Lys(BOG)-VaI-Tyr-Pro-OtBu

■ ■ 1*66 g Z.Lys(BOC) -Pro-Val-Gly-Lys(BOC) -Lye(BOC) -Lye(BOC) LyS(BOC)-PrO-VaI-LyS(BOC)-VaI-TyT-PrO-OtBu werden in 40 «X Methanol mit 300 mg· pmlladiumkohle (10# Pd) wie üblich Krhydriert* Beim Einengen der filtrierten Hydrierlösung zur Trockene erhält man direkt das chromatographisch einheitliche Produkt (1»49 g) als amorphes Pulver, das, unscharf bei ca* 175 - 190° schmilzt, le weist auf Silicagel folgende Rf-Werte auft . ■■·'."- .

Rf {43 A) « 0,41 \

Rf (Chloroform-Methanol * 9:1) - 0,24

BAD ORIG'NAL 1098 52/188 2

7) BOC,D-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu(OtBu)-His-Phe-Arg-Try-GIy-Lys(BOC)-PrO-VaI-GIy-LyS(BOC)-LyS(BOC)-LyS(BOC)-LyS(BOC)-PrO-VaI-Lys(BOC)-VaI-Tyr-Prο-OtBu.

378 mg BOC-D-Ser-Tyr-Ser-Met-GluiOtBuJ-Hls-Phe-Arg-Try-GXy-OH (Case 5503, G.No. 10583/64) und 451 mg H-Lys(BOC)-.. r PrO-VaI-OIy-LyS(BOC)-LyS(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Pro-VaI-Lys(BOC) VaI-Tyr-Pro.OtBu werden In 4 ml absolutem Pyridin suspendiert und nach Zugabe von 0,15 ml Wasser und 0,32 ml 1-n. Salzsäure während 10 Minuten bei 50° gerührt. Zur trüben Suspension gibt man dann 145 mg Dieyclohexylcarbodlimld zu und nach 3 Stunden nochmals eine gleich grosse Menge, Man rührt noch -Λ. während weiterer 3 Stunden bei 50" und lässt dann über Nacht bei 0° stehen. Der ausgeschiedene Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert und 3 mal mit je 0,8 ml 90#igem Pyridin naohge«* waschen. Das FJLtrat wird mit 45 ml Benzol versetzt, wobei ein pulveriges Rohprodukt ausfällt, das abfiltriert und bei 45° getrocknet wird, Durch timfällen aus Methanol-Benzol-Pe troiäther wird der grösete Teil der lipophilen Verunreinigungen abgetrennt, worauf die endgültige Reinigung mittels einer Craig -Verteilung erfolgt im Lösungsmittelsystem Methanol·* ' Pttffer-Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff (10:3,17:5«4) CPuffer wie unter Z) angegeben!] über 300 Stufen, mit Phasenvolumina Von j« 10 ml. Aus den Verteilungselementen Nr. 51-85'("V₁,'*

■ max

BAD ORIGINAL 109852/1882

67; K * 0,29) isoliert man durch Einengen zur Trockene und Wegsublimieren des Arnmoniumacetates bei 40 im Hochvakuum-445 mg chromatographisch reines geschütztes Tetracosapeptidacetat als amorphes Pulver vom P. ca, 205 - 210° (Zersetzung). E3 weist auf Silioagel folgende Rf'Werte auf i

Rf (45 A) ' - 0,65

Rf (100) ,- * 0,60

Rf (Chloroform-Methanol - 75 .s ,25) - 0^2

'■· Beispiel'S",·:^■■'' ^;

8) H.D-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-Oly-Lys-Pro-Val-Giy- Lys-Lys-Lys-Lys-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Bro-OH (D-Ser -Lys*'-'* --

1-24- ■ ■' \ · ■-·■']■ ·

β -CorticotropinJ^.;; ,..·.■ ·,.':■

370 mg geschütztes Tetracosape'ptidderivat werden in

7,4 ml 9O5iiger Trifluoressigsäure gelöst und während 45 Minuten bei 25° stehen gelassen. Die Lösung wird dann,auf ca, 2 ml eingeengt, mit 20 ml Wasser verdünnt, nochmals eingeengt und zuletzt lyophilisiert. Man erhält das Trifluoraoetat des ■ freien Tetracosapeptlds, das zur Umwandlung in das Acetat in wenig Wasser gelöst und durch' eine Säule {/ » 12,5 mmj I ■ 15 cm) von schwach basischem Ionenaustauscher (z.B. Merck. Nr". II) in der Acetatform filtriert wird. Das Eluat wird auf ca, 5 ml konzentriert, lyophilisiert und im Hochvakuum bei 40° nachgetrocknet. Man erhält 316 rag ohromatographlsch und

109852/1882

elektrophoretisch einheitliches Acetat des D-Ser -Iijrs

1-24
β -Corticotropins als weisses, amorphes Pulver.

-Iijrs '' -

DUnnschichtchromatogramm an Aluminiumoxyd im System 101 weist die Verbindung einen Rf-Wert von 0,40 auf. (ß *" -Corticotropin unter gleichen Bedingungen 0,51) · Sie wandert bei der Elektrophorese (16 Vol/cm) bei pH 6,1 (Pyri· dinaoätatpuffer) in 2 Stunden 8,4 cm gegen die Kathode.

Beispiel 2s

Man stellt eine Trookenampulle aus folgenden Komponenten her : .

D-Ser -Lys¹^* -ß " -Corticotropin-Hexaacetat 0,5 mg ZnSO^.+ 7 H₂O 1,23 mg

Na₃PO₄ + 12 HgO · .... . 1,38 mg

Mannit ...... . 40,0 mg

Vor Gebrauch wird der-Inhalt des Trookenvials mit 1 ml destilliertem Wasser, enthalten in einer Lösungsampulle, ver· mischt. Man erhält eine Suspension mit einem pH von 7,6.

10.9852/1882

Beispiel 3 :

Man stellt eine Trockenampulle aus folgenden Komponenten her ι

D-Ser -Lys . -ß -Corticotropin-Hexaacetat 0,5 mg ZnSO^ + 7 HgO 1,23 mg

Mannit 40,0 mg

und eine Lösungsampulle mit folgender Zusammensetzung der Lösung j

Na₃PO₄ + 12 HgO X,38 mg

Versene - Pe-J 0,1 mg

dest. Wasser ad 1,0 ml

Vor Gebrauoh werden der Inhalt der Trockenarapulle. und der Lösungsampulle vermischt. Die erhaltene Suspension hat ein pH von 7,6.

- ' Beispiel4 :

Man stellt eine Lösungsampulle aus folgenden Komponenten her ι

D»Ser j-Lys ^* -ß •Corticotropin-Hexaacetat 0,5 mg

Gelatine Phenol :

dest» Wasser ad

109852/1882

280	,0	mg
5	,0	rag
I 1 I - ■ -	,0	mX
BAD ORtG1NM-

Beispiel 5 :

Eine steril filtrierte wässrige Lösung von D-Ser -Lys '* -ß " -Corticotropin-Hexaacetat wird unter aseptischen Bedingungen mit Natrium-Polyphloretinphosphat und Natriumchlorid vermischt und in Vials abgefüllt und lyophllisiert, sodass ein Trockenvial erhalten wird, das folgende Komponenten enthält ■

D-Ser -Lys '* -ß " -Corticotropin-Hexaacetat 0,5 mg Natrium-Polyphloretinphosphat (86,5#ig) 23*20 mg NaCl . 12,28 mg

Vor Gebrauch wird der Inhalt des Trockenvials mit 2 ml destilliertem Wasser, enthalten In einer Lösungsampulle, vermischt.

Beispiel 6 : Man stellt eine Suspension aus folgenden Korn-,

ponenten her ι . · " . ...

D-Ser -Lys -ß " -Corticotropin-hexaacetat 1,0 mg

ZnCl₂ 10,5 mg

Na₂HPO₄ 1,7 mg

Benzylalkohol 17,0 mg

NaCl 2,5 mg NaOH ad pH 8,0

Aqua dest. ad 2 ml

109852/1882

Beispiel 7 **

2,0 g Poly-L-glutaminsäure mit einem mittleren Molekulargewicht von ca* 11 000 werden in ca. 5*7 ml iger Natronlauge gelöst, sodass das pH der Lösung 7»^ be* trägt. In dieser Lösung werden 5,0 mg D-Ser -Lys '' -ß ^ Corticotropin-hexaacetat und 0,2 mg Merthiolat aufgelöst und mit destilliertem Wasser auf 10 ml aufgefüllt. Die Lösung wird steril filtriert. Sie enthält pro ml :

1 17 "lft 1-24

D-Ser⁴·-Lys '■' -ß -Corticotropin-Hexaacetat 0,5 mg

Poly-L-glutaminsäure . 200,0 mg · Natronlauge bis pH 7,4

Merthiolat . . ' " 0,02 mg

Aqua dest, 1,0 ml

Beispiel 8 ι . " -' .·

2,0g Poly-L-glutaminsäure werden in oa. 5*7 ml

lO^iger Natronlauge gelöst, sodass das pH der Lösung 7,4

ϊ 17 l8 beträgt. In dieser Lösung werden 5*0 mg D-Ser -Lys ' -

1-24 '

β -Corticotropin-hexaacetat und 0,2 mg Merthiolat aufgelöst. Zu dieser Lösung wird 1 ml einer salzsauren "Zinkohlorid· lösung (pH 2,8) mit 5*2 mg Zinkchlorid pro ml gegeben. Das pH wird mit Natronlauge auf 7,8 eingestellt und mit destilliertem Wasser auf ein Endvolumen von 10 ml aufgefüllt, ■

BAD ORIGINAL

109852/1882

Beispiel 9s

2,0 g PoIy-L-glutaminsäure werden in ca. 5#7 ml 10#iger Natronlauge gelöst, sodass das pH der Lösung 7*4 beträgt. In dieser Lösung werden 5,0 mg D-Ser -Lys '' - 1 24

β -Cortieotropin-hexaacetat und 0,2 mg Merthiolat aufgelöst. Zu dieser Lösung werden 1 ml einer salzsauren Lösung (pH 2,8) enthaltend 5,2 mg Zinkchlorid und 0,85 mg Dinatriumphosphat (wasserfrei) gegeben. Das pH wird »it Natronlauge auf 7,8 eingestellt. Man füllt mit Wasser auf ein Volumen von 10 ml auf.

Beispiel 10:

Man löst 11,12 mg Eisessig, 1,21 mg Natriumacetat, 2,5 mg Natriumchlorid und 2,0 mg D-Ser ■'•-Lys¹⁷' ^-ß¹"²*- Corticotropin-hexaacetat in 0,7 ml destilliertem Wasser und füllt mit destilliertem Wasser auf 1 ml auf. Die Lösung wird " bei 120° 20 Minuten autklaviert. Das pH ist nach der Sterilisation 3,7·

Beispiel 11: Man löst in 0,7 ml physiologieoher Natriumohlorid-

1 17 l8 1-24

lösung 0,5 mg D-Ser -Lys " -ß -Cortiootropin-htxaaoetat

109852/188 2 . bad original

und säuert die Lösung mit 0,1-n. Salzsäure auf pH 3,2 an. Mit destilliertem Wasser wird auf 1 ml aufgefüllt und wie in Beispiel 1 hitzesterilisiert.

Beispiel 12z

In 0,8 ml destilliertem Wasser werden 7#05 ml Glycin und 6,08 mg Natriumchlorid gelöst und 0,055 ml 0,1-n. HCl zugefügt. Anschliessend wird 1,0 mg D-Ser -Lye

1-24
β -Cortieotropin-hexaacetat in der Lösung aufgelöst und mit destilliertem Wasser .auf 1,0 ml aufgefüllt.

Die Lösung wird auf übliche Weise filtriert. In Ampullemabgefüllt und bei 120° 20 Minuten autoklaviert. Das pH beträgt 3,6.

Beispiel 13:

In 0,8 ml destilliertem Wasser wird eine Lösung von 10,l6 mg Zitronensäure (mit 1 Mol Kristallwasser), 0,097 ml l»-n. Natronlauge, 3»5^."¹E Natriumchlorid und 0,51 ml 0,1-n·.

Salzsäure hergestellt. In dieser Lösung werden 4,0 mg

1 17 l8 1-24
D-Ser -Lys· " -ß -Gorticotropin-hexaacetat aufgelöst und mit destilliertem Wasser auf 1,0 ml aufgefüllt.

Die Lösung wird auf übliche Weise filtriert, in Ampullen abgefüllt und bei 120° 20 Minuten autoklaviert.

Das pH beträgt 3,6. ,.,...,

109852/1882 bad original

-X-

SX

Beispiel

Man stellt eine Suspension^aus folgenden Komponenten her:

1 17 lfl 1 Ph
D-Ser -Lys" -ß -Corticotropin-hexaacetat 1,0 mg

ZnCl₂ 5,25 mg

Na₂HPO₄.2 H₂O 1,05 mg

NaCl 2,0 mg

Benzylalkohol 10,0 mg NaOH ad pH 8,3

Dest. Wasser ad 1,0 ml

Beispiel 15?

Man stellt eine Suspension aus folgenden Komponenten her:

D-Ser¹-Lys^17il8-ß¹'²⁴-Corticotroin-hexaacetat 1,0 mg

^ZnC12 6,30 mg

Na₂NPO₄.2 H₂O _{1#26 mg}

^NaC1 . 1,5 mg

Benzylalkohol _{1OfO mg}

NaOH ad pH 8,3

Dest. Wasser ad 1 00 ml

10 9 8 5 2/1882

Beispiel 16;
Man stellt 0,5 ml einer salzsauren Lösung von

1 17 lR 1-24

0,5 mg D-Ser -Lys " -ß -Corticotropin-hexaacetat, 5,25 mg ZnCl₂, 1,05 mg Na₂HPO^.2 HgO und 2,0 rag NaCl vom pH 3,0 her und gibt die Lösung zu 0,5 ml einer wässerigen Lösung von 10 mg Benzylalkohol, die; soviel Natronlauge ent hält, dass eine Suspension vom pH 8,3 erhalten wird.

Beispiel 17?

5 mg Poly-L-glutaminsäure vom mittleren Molekulargewicht 39 600 werden in 5 ml 0,1-n. Natronlauge gelöst. Man

1 17

filtriert die Lösung, gibt eine Lösung von 2,5 mg D-Ser -Lys '* -

β -Corticotropin-hexaacetat hinzu, säuert dann mit Essigsäure oder Salzsäure auf pH 4 an unf füllt mit Wasser auf

10 ml auf. Dabei fällt ein Poly-L-glutaminsäure-D-Ser^Lys¹⁷'¹⁸-

1-24
β -Corticotropin-Komplex fein verteilt aus. Die Suspension enthält pro ml 0,5 mg Poly-L-glutaminsäure und 0,25 mg D-Ser «·

in iQ η Oll

Lys -ß " -Corticotropin als Komplexverbindung.

Beispiel 18s

2,0 g Poly-L-glutaminsäure mit einem mittleren Molekulargewicht von ca. 39 600 werden in ca. 5*7 ml

ν 1098 52/1882

3fr

10 #iger Natronlauge gelöst, sodass das pH der Lösung 7,4 beträgt. In dieser Lösung werden dann 4,0 mg D-Ser -Lys '* -

1-24
β -Corticotropin-hexaacetat. und 0,2 mg Merthiolat aufgelöst und mit destilliertem Wasser auf 10 ml aufgefüllt. Die Lösung wird steril filtriert. Sie enthält pro ml:

D-Ser¹-Lys¹⁷'^l8-ß¹"^22t-Corticotropin-hexaacetat

PoIy-L-glutaminsäure Natronlauge bis pH 7,4 Merthiolat

Aqua dest. ad.

4,0	mg
200,0	mg
0,02	mg
1,0	ml

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Claims (6)

Patentansprüche :

1. "Verfahren zur Herstellung neuer Peptide mit ACTH-Wirkung gemäss Hauptpatent, dadurch gekennzeichnet, dass man aus D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L-proly.l -L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-lysyl-L-lysy1-L-proIy1-L-valy1-L-Iysy1-L-valy1-L-tyrosyl-L-prolin oder dessen Amid oder entsprechenden Verbindungen, die statt des Glutamylrestes den Rest des Glutamins aufweisen, ■ in welchen Peptiden mindestens die a-Aminogruppe und die Seitenketten-aminogruppen sowie die terminale Carboxylgruppe und eine gegebenenfalls vorhandene Seitenkettencarboxylgruppe geschützt sind, die Schutzgruppen abspaltet und, wenn erwünscht, die erhaltenen Verbindungen in ihre Säureadditionssalze, Derivate oder Komplexe überführt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man von einem Peptid ausgeht, in dem die Aminogruppen durch die tert.-Butyloxycarbonylgruppe und die Carboxylgruppen durch die tert.-Butylestergruppe geschützt sind.

3. D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-lysyl-L-

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BAD ORiG¹NAL

lysyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin und dessen Amid sowie entsprechende Verbindungen, die statt des Glutamylrestes den Rest des Glutamine aufweisen, ihre Säureadditionssalze, Derivate und Komplexe.

4. Zinkkomplexe des D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methiohyl-L-glutamyl-L-histidyl-L.-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glyeyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysy1-L-lysy1-L-lysyl-L-proly1-L-valy1-L-Iysy1-L-valy1-L-tyrosyl-L-prolins oder seines Amids oder der entsprechenden Verbindungen, die statt des Glutamylrestes den Rest des Glutamins aufweisen.

5. Komplexe des D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glyeyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-lysyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolins oder seines Amids mit Zinkphosphat, Zinkpyrophosphat und/oder Zinkhydroxyd.

6. Pharmazeutische Präparate, die als aktiven Bestandteil D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-lysyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin oder dessen Amid oder entsprechende Verbindungen, die statt

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des Glutamylrestes den Rest des Glutamine aufweisen, ihre Säureadditionssalze, Derivate und/oder Komplexe enthalten.

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■<*