DE1543503A1 - Neue Peptide mit ACTH-Wirkung - Google Patents

Description

Neue für den Bruok der Of^enlsgtmgrBChriit bestimmte Anmeldungeunterlagen - Aktenzeichen? 15 43 503»? uns. Zeichens 21 031-BB/ro

CIBA AKTIENGESELLSCHAFT, BASEL (SCHWEIZ)

Case 5807/I+2

Deutschland

Neue Peptide mit ACTH-Wirkung

Gegenstand der Erfindung sind Peptide, in denen die 17- und l8-ständigen Arginylreste von ACTH-wirksamen Peptiden mit l8 - 24 Aminosäureresten durch Lysinreste ersetzt sind, sowie Säureadditionssalze, Derivate und Metallkomplexe, insbesondere Zinkkomplexe, der genannten Peptide und Verfahren zu ihrer Herstellung.

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Zu den genannten ACTH-wirksamen Peptiden gehören auch solche« in denen einzelne Aminosäuren der natürlichen Sequenz gegen andere Aminosäuren ausgetauscht sind, z.B. die erste Aminosäure« Serin« gegen Glycin« oder die zweite Aminosäure« Tyrosin« gegen Phenylalanin« oder die vierte Aminosäure« Methionin« gegen Norvalin« Leucin oder α-Aminobuttersäure« oder die fünfte Aminosäure« Glutaminsäure« gegen Glutamin« sowie Sequenzen« in denen die erste Aminosäure« Serin« fehlt·

Es wurde gefunden« dass die genannten Peptide« in denen die beiden Argininreste in 17- und 18-Stellung durch Lysinreste ersetzt sind« ebenfalls eine sehr starke

adrenocorticotrope Wirkung aufweisen« gegenüber den Arg ,

18
Arg -haltigen Peptiden aber den Vorteil haben« dass sie leichter zu synthetisieren sind und in besserer Ausbeute erhalten werden. Hervorzuheben sind in dieser Hinsioht besonders das Tetrakosapeptid L-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valy1-glycyl-L-lysyl-L-Iysyl-L-lysyl-L-lysyl-L«prolyl-L-valy1-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin sowie die entsprechende Verbindung, die statt des Glutamylrestes den Rest des Glutamine aufweist« sowie Säureadditionssalze« Derivate und Komplexe dieser Tetrakosapeptide.

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Als Säureadditionssalze sind besonders Salze von therapeutisch anwendbaren Säuren, wie Salzsäure, Essigsäure, vor allem aber schwerlösliche Salze, wie Sulfate, Phosphate oder Sulfonate, zu nennen.

Unter Derivaten sind beispielsweise Ester, wie Niederalkylester, z.B. Methyl-, Aethyl-, Propyl-, tert.-Butylester, oder unsubstituierte oder z.B. durch die Nitrogruppe, Halogenatome, Niederalkyl- oder Niederalkoxygruppen substituierte Benzylester, ferner Hydrazide und Amide, insbesondere Peptidamide, in denen die C-terminale Carboxylgruppe amidiert ist, zu verstehen.

Unter Komplexen sind die komplexartigen, in ihrer Struktur noch nicht abgeklärten Verbindungen zu verstehen, die beim Zusatz gewisser anorganischer oder organischer Stoffe zu adrenocorticotrop wirksamen Peptiden entstehen und vor allem diejenigen, die ihnen eins verlängerte Wirkung verleihen. Solche anorganischen Stoffe sind Verbindungen, die, sich von Metallen, wie Calcium, Magnesium, Aluminium, Cobalt ' und insbesondere von Zink, ableiten, vor allem schwerlösliche Salze, wie Phosphate und Pyrophosphate sowie Hydroxyde dieser Metalle, Organische Stoffe, die eine Verlängerung der Wirkung hervorrufen, sind beispielsweise nicht antigene Gelatine, z.B. Oxypolygelatine, Polyvinylpyrrolidon und Carboxymethylcellulose, ferner Sulfonsäurer oder Phosphorsäureester von Alginsäure, Dextrin, Polyphenolen und PoIy-

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alkoholen, vor allem Polyphloretinphosphat und Phytinsäure, sowie Polymerisate und Copolymerisate von Aminosäuren, z.B. Protamin und insbesondere von Aminosäuren, die einen überwiegenden Anteil an sauren α-Aminosäuren, wie Glutaminsäure oder Asparaginsäure, aufweisen.

Die neuen Verbindungen haben eine hohe adrenocorticotrope und lipolytische Wirkung und sollen in der Human- und Veterinärmedizin entsprechend, z.B. an Stelle des natürlichen Hormons, verwendet werden.

Die neuen Peptide; werden nach den für die Herstellung von Peptiden mit grosser Kettenlänge bekannten Methoden hergestellt. Dabei werden die Aminosäuren in der erwähnten Reihenfolge einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten verknüpft. Am Schluss der Synthese werden die Schutzgruppen in einer einzigen oder gegebenenfalls in mehreren Stufen abgespalten.

Das Verfahren ist daher dadurch

gekennzeichnet, dass man aus ACTH-wirksamen Peptiden mit l8 - 24 Aminosäureresten vom Aminoende des ACTH an gerechnet, in denen die 17- und l8-ständigen Argininreste durch Lysinreste ersetzt sind und in denen mindestens die a-Aminogruppe und die Seitenkettenaminogruppen, sowie die terminale Carboxylgruppe und eine gegebenenfalls vorhandene Seitenkettencarboxylgruppe geschützt sind, die Schutzgruppen., abspaltet, und, wenn erwünscht, die erhaltenen Verbindungen in ihre Säure-

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additionssalze, Derivate oder Komplexe überführt. Die Verknüpfung der Aminosäure- und/oder Peptideinheiten erfolgt in der Weise, dass man eine Aminosäure oder ein Peptid mit geschützter a-Aminogruppe und aktivierter terminaler Carboxylgruppe mit einer Aminosäure oder einem Peptid mit freier a-Aminogruppe und freier oder geschützter, z.B, veresterter oder amidierter terminaler Carboxylgruppe, umsetzt oder dass man eine Aminosäure oder -ein Peptid mit aktivierter a-Aminogruppe und geschützter terminaler Carboxylgruppe mit einer Aminosäure oder einem Peptid mit freier terminaler Carboxylgruppe und geschützter a-Aminogruppe umsetzt. Die Carboxylgruppe kann beispielsweise durch Ueberführung in ein Säurehalogenid, -azid, -anhydride -imidazolid, -isoxazolid oder einen aktivierten Ester, wie Cyanine thyle st er, Carboxymethylester, p-Nitrophenylester, oder durch Reaktion mittels eines Carbodiimids (gegebenenfalls unter Zusatz von N-Hydroxysuccinimid).oder N,N¹-Carbonyl-diimidazols aktiviert werden, die Aminogruppe beispielsweise durch Reaktion mit einem Phosphltamid aktiviert werden. Als gebräuchlichste Methoden sind zu nennen die Carbodiimidmethode, die Azidmethode, die Methode der aktivierten Ester und die Anhydridmethode, Hervorzuheben ist auch die sogenannte Feststoffträgersynthese, bei der das Peptid vom Carboxylende, das esterartig an ein Polymeres gebunden ist, aufgebaut wird, indem man die Aminosäuren der Reihe nach ankondensiert.

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An der Reaktion nicht beteiligte., freie., funktioneile Gruppen werden zwekcmässigerweise geschützt, insbesondere mittels durch Hydrolyse oder Reduktion leicht abspaltbarer Reste, die Carboxylgruppe vorzugsweise durch Veresterung, z.B. mit Methanol, tert.-Butanol, Benzylalkohol, p-Nitrobenzylalkohol, oder Amidbildung, die Aminogruppe beispielsweise durch Einführung der Tosyl-, Trityl-, Formyl-, Trifluoracetyl-, o-Nitrophenylsulfenyl-, Phthalyl- oder Carbobenzoxygruppe oder farbiger Schutzgruppen, wie der p-Phenylazo-benzyloxycarbonylgruppe und der p-(p'-Methoxyphenylazo)-benzyloxycarbonylgruppe, oder insbesondere des tert.-Butyloxycarbonylrestes. Zum Schutz der Aminogruppe in der Guanidogruppierung des Arginine ist die Nitrogruppe

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geeignet; die genannte Aminogruppe des Arginins muss aber bei der Reaktion nicht notwendig geschützt werden. Die Irainogruppe des Histidins kann durch den Benzyl» oder Tritylrestgeschützt werden.

Die Umwandlung einer geschützten Amino- oder Iminogruppe in eine freie Gruppe sowie die^;Heberführung einei|funktionell abgewandelten Carboxylgruppe in eine freie Carboxylgruppe im Verlaufe des Verfahrens erfolgt nach an sich bekannten Methoden durch Behandlung mit hydrolyslerenden bzw. reduzierenden Mitteln,

Zwecks Herstellung des oben erwähnten Tetracosa«· peptids kann man beispielsweise das Dekapep'fcid d€T FormeJL L-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl«L-glutamyl*(oder L-giutaminyl)-L-histidyl-L-phenylalanyl-L--argiKyl-L-trypt^» phyl-glycin, in dem die a-Arninogrurpr¹ etc " P" Λ« ^χι\« ;..?- gebenenfalls die ^Carboxylgruppe r : . . λ 'cliuuzi* sindi mit dem Tetradekapeptid der Povn^ivl L-L;» .'.-L-ftrcIy*« L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-Ir-iysyl-L^l^syi^i-i· . 1 ϊ· ^: prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-va-lyl-L-tyrosyl-L-prolii),, in dem öle Seitenketten-Aminogruppen der Lysinreste geschützt"-sind, kondensieren und aus dem erhaltenen Tetracosapeptidderiv&fc die Schutzgruppen abspalten. Bei dieser Kondensation wird als Kupplungsmethode vorzugsweise die Carbodiimidmethode oder die Methode der aktivierten Ester, vor allem mittels des p-Nitrophenylesters, verwendet, Im letzten Fall bräuobt der p-Nitrophenylester des Dekapeptids nicht als solcher

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isoliert zu werden, sondern kann auch in der Kondensationsstufe selbst aus dem Dekapeptid mit freier Carboxylgruppe, p-Nitrophenol und Dicyclohexylcarbodlimid gebildet werden, Das Dekapeptid liegt also als a-Amino-geschütztes Peptid mit freier Carboxylgruppe oder mit einer p-Nitrophenylestergruppe vor. Als Schutzgruppen für die a-Aminogruppe des Serins und die Seitenketten-Aminogruppen der Lysinreste verwendet man vorzugsweise die tert.-Butyloxycarbony!gruppe} die ^"-Carboxylgruppe der Glutaminsäure und. die Endcarboxylgruppe des Prolins werden vorteilhaft durch die tert.-Butylestergruppe geschützt. Alle diese Schutzgruppen können gleichzeitig durch saure Hydrolyse, beispielsweise mit TrIf luor-* essigsäure, abgespalten werden. Das genannte^ Dekapeptid kann beispielsweise nach den in den Anmeldungen Q.Nr, 6400/60 (Case 4556), 0..Nrι. 2206/63 (Case 5244) oder G.Nr. 2207/63 (Case 5245) beschriebenen Verfahren hergestellt werden.

Statt des Prolin-tert.-butylesters kann in obigem Verfahren auch das Prolinamid eingesetzt werden; in.diesem Fall wird das Tetracosapeptfi&amid' erhalten. Verwendet man einen anderen Niederalkylester oder Benzyle'ster an Stelle des tert.-Butylesters des Prolins, so erhält man entsprechende Tetracosapeptid-niederalkyl- oder -benzylester. Der Methylester kann in bekannter Weise mittels ttydrazinhydrat in das Hydrazid übergeführt werden.

Das Tetracosapeptldhydrazid kann man beispielsweise auch erhalten durch Kondensation des genannten Deka-

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peptide, in dem die α-Aminogruppe des Serins durch die tert.-Bütyloxycarbonylgruppe und gegebenenfalls die xylgruppe der Glutaminsäure durch die tert.-Butylestergruppe geschützt ist, mit dem p-Phenylazobenzylester des genannten Tetradekapeptids, in dem die Seitenketten-Aminogruppen der Lysinreste dutfchsdenr;d.:, ■ ■',;■·.:-..·.'■.-c- '■.· ο".' ca Phthalylrest geschützt sind, Abspaltung der Amino-Schutz'-gruppen und tert,-Butylestergruppe mit Säure, z.B, Trifluoressigsäure, und Ueberführung des Tetracosapeptid-p»· phenylazobenzylesters in das Hydrazid mittels Hydrazinmonoacetat. Das erwähnte Tetradekapeptidderivat erhält man

beispielsweise durch Kondensation von N^-Phthalyl-L-lysyl-

N^f-phthalyl-L-lysyl-N^-phthalyl-L-lysyl-N⁵-phthalyl-I,-lysyl-L-prolyl-L-valyl-N^£-phthalyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin-p-phenylazobenzylester (hergestellt analog dem Dekapeptidderivat in Anmeldung G.Nr. 10599/61 [Case 4923.] unter Ersatz von BOC-Arg(NO₂)-OH durch BOC-Lys(Pht)-OH) mit BOC-L-Valyl-glycin in Gegenwart von Isobutylehlorcarbonat, Abspaltung der BOC-Gruppe mit Trifluoressigsäure, Kondensation des Dodekapeptidesters mit BOC-N^- Phthalyl-L-lysyl-L-prolin in Gegenwart von Isobutylohlorcarbonat und Abspaltung der BOC-Gruppe aus dem Tetradekapeptid mit Trifluoressigsäure.

Nach einem anderen Verfahren zur Herstellung des Tttracosapeptids kann man das Tetrapeptid L-Seryl-L-tyrosyl-

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/ίο

L-seryl-L-methionin, in dem die α-Aminogruppe geschützt ist, beispielsweise durch die tert.-Butyloxycarbonylgruppe, mit dem Eikosapeptid L-01utamyl-(oder Glutaminyl)-L-histi* dyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glyoyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glyoyl-L-lysyl-L-lysyl-L-lysyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin, in dem die Seitenketten-Aminogruppen der Lysin**e^to \v" ^p^h^r..-**»- reste geschützt sind, beispielsweise durch die tert,-Butyloxycarbony!gruppe, und in dem gegebenenfalls die ^Carboxylgruppe der Glutaminsäure verestert ist, beispielsweise durch die.tert.-Butylestergruppe, kondensieren, vorzugsweise nach der Azidmethode.

Die Erfindung betrifft auch diejenigen Au^fUhrungsformen des Verfahrens, bei denen man von einer auf irgendeiner Stufe des Verfahrens als Zwischenprodukt erhäitXichen Verbindung ausgeht und die fehlenden Verfahrens.-schritte durchführt oder das Verfahren auf irgendeiner Stufe abbricht, sowie die dabei erhaltenen Zwischenprodukte, '.-'..

Je nach der Arbeitsweise erhält man die neuen Verbindungen in Form von Basen oder ihren Salzen. Aus den Salzen können in an sich bekannter Weise die Basen gewonnen werden. Von letzteren wiederum lassen sich durch Umsetzung mit Säuren, die zur Bildung therapeutisch verwendbarer Salze geeignet sind, Salze gewinnen, wie z.B. solche mit anorganischen Säuren, wie Halogenwasserstoffsäuren, bei-

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splelsweise Salzsäure oder Bromwasserstoffsäure, Perchlorsäure, Salpetersäure oder Thiocyansäure, Schwefel- oder Phosphorsäuren, oder organischen Säuren, wie Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Glykolsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Oxalsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Aepfelsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Ascorbinsäure, Hydroxymaleinsäure, Dlhydroxymalelnsäure, Benzoesäure, Phenylessigsäure, 4-Aminobenzoesäuren 4-Hydroxybenzoesäure, Anthranilsäure, Zimtsäure, Mandelsäure, Salicylsäure/ 4-Amino-salicylsäure, 2-Phenoxybenzoe-Säurje, 2-Acetoxybenzoesäure, Methansulf onsäure, Aethansulfonsäure,'Hydroxyäthansulfonsäure, Benzolsulfonsäure, p-Toluolsulf'onsäure, Naphthalinsulfonsäure oder SuIfanilsäure .'.■■■*

Die verfahrensgemäss erhaltenen Peptide können in Form von pharmazeutischen Präparaten Verwendung finden. Diese enthalten die Peptide in Mischung mit einem für die enterale oder parenterale Applikation geeigneten pharmazeutischen, organischen oder anorganischen Trägermaterial. Für dasselbe kommen solche Stoffe in Frage, die mit den Polypeptiden nicht reagieren, wie z.B. Gelatine, Milchzucker, Glukose, Kochsalz, Stärke, Magnesiumstearat, Talk, pflanzliche OeIe, Benzylalkohol, Gummi, Polyalkylenglykole, Vaseline, Cholesterin oder andere bekannte Arzneimitteiträger. Die pharmazeutischen Präparate können z.B. als Lyophilisat oder in flüssiger Form als Lösungen, Sus«

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Pensionen oder Emulsionen vorliegen. Gegebenenfalls sind sie sterilisiert und bzw. oder enthalten Hilfsstoffe, wie Konservlerungs-, Stabilisierungs-, Netz- oder Emulgiermittel. Sie können auch noch andere therapeutisch wertvolle Stoffe enthalten, ■

So kann man sie vor allem auch mit den in der ACTH-Therapzle üblichen Zusätzen zur Verlängerung der Wirkung, wie z.B, Gelatine, Polyphloretlnphosphat, Carboxylmethylcellulose, oder den oben erwähnten schwerlöslichen Metallverbindungen, insbesondere Phosphaten, Pyrophosphaten oder Hydroxyden des Zinks, kombinieren.

Weiter kann man zur Verlängerung der Wirksamkeit die neuen Peptide in ihre.Komplexe mit Polymerisaten oder Oopolymerisäten von Aminosäuren, insbesondere solchen, die einen überwiegenden Anteil an sauren α-Aminosäuren, wie Glutaminsäure oder Asparaginsäure der L-, D- oder D,L^--Konfiguration, aufweisen, überführen-: Die genannten Polymerisate und Copolymerisate weisen Inden .«Seitenketten freie Carboxylgruppen auf, während die tezminale Carboxylgruppe frei oder funktionell abgewandelt sein, z.B. als Estergruppe oder als eine unsubstltuierte oder durch Kohlenwasserstoffreste, vor allem niedere Alkylgruppen, substituierte Amidgruppe vorliegen kann. Das Molekulargewicht der Polymerisate kann »wischen 1000 und 100 000 liegen, vorzugsweise beträgt es 2000-15000, Man verwendet für die Herstellung der Präparate zweokmässig ein wasserlösliches, physiologisch verträgliches

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Salz, z.B. das Natrium- oder Ammoniumsalz, oder ein Salz mit einer organischen Base, wie Triäthylamin, Procain, Dibenzylamin, oder anderen tertiären Stickstoffbasen.

Die Polymeren sind bekannt oder können nach bekannten Verfahren hergestellt werden, beispielsweise nach . dem von M.Idelson et al., J.Am.Chem.Soc. 8Ό, 4631 et seq» (1958) beschriebenen Verfahren. So kann man z.B. Glutaminsäure-a-carboxyanhydrid-^benzylester oder -tert.-butylester in Dioxan mit Ammoniak oder einem Amin in einem bestimmten Molverhältnis, z.B. 100:1 (je nach dem gewünschten Polymerisationsgrad), reagieren lassen und nach beendeter Polymerisation die Schutzgruppen abspalten, z.B, die Benzyloxygruppe mit Bromwasserstoff in Eisessig, die tert,-Butyloxygruppe mit Trifluoressigsäure. Zwecks Herstellung von Polymeren mit einheitlicher, definierter Kettenlänge kann man

■·'■■'·" ■ . ί ·. ·

die Polymeren auch durch Synthese nach den in der Peptidchemie bekannten Verfahren (Carbodlimidmethode, Azidmethode etc*) aufbauen. .

Die Konzentration des Polymeren in den.pharmazeutischen Präparaten hängt von der Löslichkeit des betreffenden Salzes und von der Viskosität ab. Das Polymere soll in den Präparaten in gelöster Form vorliegen können und injizierbar sein.

Die Konzentration des adrenocorticotrop wirksamen Peptids wird so gewählt, dass das Präparat beispielsweise pro ml 10-50 I.E, aufweist.

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Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen beschrieben. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben.

Die dtinnschichtchromatographischen Systeme werden wie folgt bezeichnet :

System 4j5A System 45
System 100 System 101

tert.-Amylalkohol-Isopropanol-Wasser (100:40:10)

.see, Butanol-3^ wässriges Ammoniak (100:44)

Aethylacetat-Pyridin-Elsessig-Wasser (62:21:6:11)

n-Butanol-Pyridin-Eisessig-Wasser (30:20:6:24).

ORIGINAL INSPECTED

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Beispiel 1 :

1) Z.Lys(BOC)-Lys(BOC) .NHNH₂ ' *■

10 g Z.Lys(BOC)-Lys(BOC) .OCH, (hergestellt aus Z.Lye-

(BOC) -OH⁰+''Hi 9

werden in ΙβΟ ml Methanol gelöst und mit 7,8 ml Hydrazinhydrftt versetzt. Man lässt die klare Lösung während 24 Stunden bei' 25° stehen und engt dann auf ca. 1/3 des ursprünglichen Volumens ein. Beim Versetzen mit 200 ml Wasser fällt ein öliger Niederschlag aus, der sich beim Abkühlen und Zerreiben verfestigt und pulverisiert werden kann. Man nutsoht ab/ wäscht mit Wasser und trocknet das Rohprodukt. Es wird durch einmaliges Umkristallisieren aus Methanol-Essigester-P^roläther gereinigt und weist dann einen P. vqn 118 - 119*5° auf. Auf Silicagel-DUnnschichtplatten werden folgende Rf-Werte erhalten:

Rf (4J A) « 0,40

Rf (Chloroform-Methanol«.^:!) « 0,75

2) Z.Lys(BOC)-Lys(BOC)-Pro-OH

1,87 g Z.Lys(BOC)-Lys(BOC).NHNH₂ werden in.15 ml frisch destilliertem Dimethylformamid gelöst und auf -25° abgekühlt. Dazu tropft man langsam 2,07 ml 4,35-n. Salzsäure und anschliessend 0,66 ml 5-n. Natriumnitrit lösung»·

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-■»·- 154350**

Man rührt während 10 Minuten bei -10° und gibt dann eine Lösung von 692 mg L-Prolin in 4,2 ml Dimethylformamid-Wasser (2:1) zu. Schliesslioh werden noch bei -10 1,82 ml Triäthylamin zugetropft und dann die Reaktionslösung über Nacht bei 0° und während weiterer 2 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen. Man engt sodann im Hocfavakuunnaflf ein Volumen von ca. 4 ml ein und versetzt den klebrigen Rückstand mit 25 ml Wasser. Durch Abkühlen auf 0° und Zerreiben kann er pulverisiert werden. Man nutscht ab, wäscht mit wenig Wasser und trocknet im Hochvakuum bei 40 .; Zur Reini gung des nicht kristallisierbären Rohproduktes wird eine multiplikative Verteilung nach Craig im Lösungsmittelsystera Methanol-Puffer-Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff (35s13s15«15) [Puffer *■ 28,5 ml Eisessig + 19,25 g Ammoniumacetat in SßO ml Wasser] mit Phasenvolumina von je 10 ml durchgeführt.' Nach 220· Stufen isoliert man aus den Verteilungselementen Nr. 49-73 i\_max * 6l; K » 0,39) durch Einengen zur Trockne und Wegsublimieren des Ammoniumaoetates chromatographisch reines, jedoch amorphes Tripeptidderivat vom P. ca. 70-80°. Im DUnnschichtchromatogramm an Silicagel werden folgende Rf-Werte erhalten:' ■■-'■'.

Rf (Chloroform-Methanol - 9:1) « 0,19

Rf (43 A) , = 0,29

Rf (45) « 0,52

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ORiG¹NAL

3) Z.Lys(BOC)-Lys(BOC)-Pro-Val-Lys(BOC)-VaX-Tyr-Pro.OtBu

2,4 g Z.Lys(BOC)-LyS(BOC)-PrO.OH und 3,12 g H.Val-Lys(BOC)-Val-Tyr-Pro-OtBu werden in 30 ml absolutem Chloroform gelöst. Man gibt bei 0° 0,845 g Dicyclohexylcarbodiimld ' zu, rührt während 1 Stunde bei 0° und Jässt dann während 30 Stunden :bei 25° stehen. Der ausgeschiedene kristalline Dicyolohexylhar,nstoff wird abfiltriert und mit ein we»i.2 Essigester gewaschen. Zum Filtrat gibt man 150 ml Essigestar nig und extrahiert die organische Phase bei 0° dreimal mit. je 30 ml 3#iger Weinsäurelösung zur Entfernung des über- ' schüssigen Pentapeptids. Man wäscht noch Mehrmals mit Wasser bis zur neutralen Reaktion und dampft dann zur Trockene ein. Zur Abtrennung von lipbphilen Veranreinigungen löst man den Rückstand in 10 ml Methanol und 20 ml Essigester und. fällt' das Octapeptid durch Zugabe von 120 ml Petroläther als schmierige Masse aus, die im Vakuum bei 40° getrocknet wird. Das so erhaltene Rohprodukt (3,1 g) wird zur endgültigen Reinigung einer Craig-Verteilung im System Methanol-Puffer* Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff (3O:1O:3$3O) [Puffer wie unter 2) angegeben] über 225 Stufen mit Phasenvolumina von je 10 ml unterworfen. Das chromatographiseh einheitliche Octapeptidderivat wird beim Einengen des Inhaltes der_;Elemente Nr. 65-96 C-^tmax - 78; K ■ 0,53) zur Trockene und Weg^ublimieren

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des Ammoniumacetates im Hochvakuum als weisses amorphe3 Pulver vom P. ca. I30 - l40° erhalten. Es weist auf Silicagel folgende Rf-Werte auf : . <. \

Rf (43 A) . 0,7^

Rf (Chloroform-Methanol =9:1) - 0,5^ Rf (Benzol-Aceton -> 1:1) * 0,33

4) H.Lys(BOC)^Lys(BOC)-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr-Pro-OtBu·

1,46 g 2.Lys(BOC)-Lys(BOG)-Pro-VaI-Lys(BOC)-Tyr-Pro-OtBu werden in 40 ml Methanol nach Zugabe von 300 mg 10#iger Palladiurnkohle in einer Schüttelente mit Kohlendioxyd-Absorption hydriert. Die Wasserstoffaufnähme ist nach 20 Min. bereits beendet. Nach 1 Stunde wird der Katalysator abfiltriert, mit Methanol "nachgespült und das Piltrat zur Trockene eingedampft. Man erhält in quantitativer Aus» beute das chroraatographlsch einheitliche decarbobenzoxylierte Octapeptldderivat als weisses amorphes Fülver vom Fj ca. 110-120 . Es weist im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel folgende Rf-Werte auf? .

Rf (^A) - 0,53

Rf (Chloroform-Methanol « 9:1) «0,34 · > '·-'

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BAD ORlGfNAL

5) Z.Lys(BOC)-PrO-VaI-GIy-LyS(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr-Pro-OtBu. '."■■■

1,98 g Z-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-LysiBOC)-Lys(BOC).NHNH₂ (Q. $&i-s 8209/63 Case 5247/5123) werden in 22 ml absolutem Dimethylformamid gelöst und nach Abkühlen auf -25° tropfenweise unter Rühren mit 3,4 ml 2,115-n. Salzsäure und dann mit 0,378 ml 5-n. Natriumnitritlösung versetzt. Die klare Lösung wird während 15 Minuten bei -10° weitergerührt und dann mit einer auf -5^P vorgekühlten Lösung von 1,313 g des oben beschriebenen Octapeptidderivates in 4 ml Dimethylformamid versetzt. Man spült noch mit 1 ml Dimethylformamid nach und tropft dann langsam bei -5° 1*05 m! Triäthylamin zu. Das Reaktions- ^r gemisch wird noch während 30 Minuten gerührt und dann während 15 Stunden bei 0° stehen gelassen. Schliesslich wird bis zur Bildung eines viskosen Oeles konzentriert und daraus durüh Zugabe von 20 ml Wasser eine schmierige Masse ausgefällt., ,' Diese wird unter Erwärmen in 20 ml Methanol wieder gelöst und das Peptid durch Zugabe von 30 ml Wasser abermals ausgefällt. Beim Kühlen auf 0° und Zerreiben erhält man eine pulverige Aufschlämmung, die filtriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet wird. Dieses Rohprodukt wird zur Reinigung einer Craig-Verteilung im System Methanol-Puffer-Chloroform-

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Tetrachlorkohlenstoff (60:20:2:60) [Puffer wie unter 2) angegeben] mit Phasenvolumina von je 20 ml unterworfen. Nach 218 Stufen isoliert man aus den Elementen Nr. 105 - 134 121; K ■ 1,25) durch Einengen zur Trockene und

Absublimieren des Ammoniumacetates im Hochvakuum chromatographisch einheitliches geschütztes Tetradecapeptld als weisses, amorphes Pulver vom P. ca. 18O-I9O⁰. Es_weist auf Silicagel golgende Rf-Werte auf : ;

Rf (4? A) . 0,80

Rf (Chloroform-Methanol - 9:1) - 0,49

6) H-Lys(BOC)-PrO-VaI-GIy-LyS(BOC)-LyS(BOC)-LyS(BOC)-LyS(BOC)-Pro-Val-Lys(BOG)-VaI-Tyr-Pro-OtBu

1,66 g Z.Lys(BOC)-Pro-Vai-GIy-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Pro-Val-Lys(BOC)~Val-Tyr-Pro-OtBu werden in 40 ml Methanol mit 500 mg. palladiumkohle (1O# Pd) wie üblich ⁷V-hydriert. Beim Einengen der filtrierten Hydrierlösung zur Trockene erhält man direkt das chromatographisch einheitliche Produkt (1,49 g) als amorphes Pulver, das unscharf bei ca. 175 - I9O⁰ schmilzt. Es weist auf Silicagel folgende Rf-Werte auf:

Rf (43 A) . 0,41

Rf (Chloroform-Methanol =9:1) =0,24

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BAD ORIGINAL

Bei β· del- V :■.

7) BOCrÖer-Tyr-Ser-Met-GIu(OtBu)-His-Phe-Arg-Try-Gly-LysiBOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)«Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr-Pro-OtBu

252 mg BOC.Ser-Tyr-Ser-Met-Glu(OtBu)-His-Phe-Arg- " Try-GIy-OH iifld^OO mg des oben' )-'mr^; )00 in,·; deu f-hou beschriebenen Tetradecapeptidesters werden in 2,7 ml abs. Pyridin suspendiert und nach Zugabe von 0,1 ml Wasser und 0,213 ml 1-n. Salzsäure durch Rühren bei 50° während 30 Min. gelöst. Man gibt sodann eine erste Portion von 96 mg Dioyolohexyl-carbodiimid zu und nach 3 Stunden nochmals ein gleich grosse zweite Poütion. Man rührt noch während weiterer 3 Stunden bei 50°, kühlt dann auf 0°, filtriert den ausgeschiedenen kristallinen Dicyclohexyl-harnstoff ab und spUlfc mit"4 Portionen von je 0,5 ml 95#igem Pyridin nach. Aus dem Piltrat wird das Rohprodukt durch Zugabe von 30 ml Benzol als flockiger Niederschlag ausgefällt, bei 0° abfiltriert, mit Benzol und Petroläther gewaschen und getrocknet. Das so erhaltene Material (550 g) wird durch je einmaliges Umfallen aus Methanol-Benzol-Petroläther und aus Methanol-Wasser vorgereinigt und zur endgültigen Reinigung einer Craigverteilung im Lösungsmittelsystem Methanol-Puffer-Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff (10:3:5:4) [Puffer » 28,5 ml Eisessig + 19,25 g Ammoniumacetat in 96O ml Wasser] über PM^- Stufen mit Phasenvolumina von je 10 ml unterworfen. Aus 5.9. ■■ Ye?-

9098 36/154 6

tellungselementen Nr. 61-90 (A_mav ■ 76; K m 0,46) erhält roan beim Einengen zur Trockene und Wegsublimleren des Ammoniumaoetates im Hochvakuum 256 mg reines geschütztes Tetracosapep tid-acetat als amorphes Pulver vom P. ca, 195 - 205°, unter Zersetzung. Es weist auf Silicagel folgende Rf-Werte auf ι Rf (43 A) ' - 0,61

Rf (100) » 0,59

• Rf (Chloroform-Methanol m 75 : 25) * 0,39

8). H.Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro-Val-Qly-Lys-Lys-Lys-Lys-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-OH (Lys¹⁷'*⁸^¹"²⁴-

Cortiootropin) '

■·/'-· ·'.■■■..■· ■ ■ .

*„'■ ;200 mg geschütztes Tetracbsapeptläderivat werden in 4 ml 9Q^iger Triflüoressigsäure gelöst und während 1 Stunde bei 22 ^; stehen gelassen. Man engt sodann auf ca. 1' ml eiri', gibt 10 ml Wasser zu, engt nochmals bis auf'ein Volumen von

' ' ·
ca, 2 ml ein und-'lyophilisiert. Das Lyophillsat (Trifluoracetat) wird zur Ueberführung in das Acetat durch eine Säule (ψ » 7*5 mm; 1 « l8 cm) von schwach basischen Jonenaustauscher (z.B. Merck Nr. H) in der Acetatform filtriert. Das Eluat wird auf ca, 2 ml eingeengt, lyophilisiert und zuletzt im Hochvakuum bei 40° nachgetrooknet. Es resultieren 173 mg chromatographisch

17 1 ft I Pil

und elektrophoretisch einheitliches Acetat des Lys '* -ß -

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Corticotropins als weisses, amorphes Pulver* Jm Dünnschichtchromatogramm an Aluminiumoxyd im

System 101 weist die Verbindung einen Rf-Wert von 0,4l auf

1 24
(p -Corticotropin unter gleichen Bedingungen 0,51)· Sie

■■"■-. >·

wandert bei der Elektrophorese (16 Volt/cm) bei pH 6,1 (Pyridlnacetatpuffer) in 2 Stunden 8,4 cm gegen die Kathode.

Beispiel

Man stellt eine Trockenampulle aus folgenden Komponenten her :

17 l8 1-24
Lys -' -ß -Cortipotropin-Hexaacetat * 0,5 ms

ZnSO₂^ + 7 H₂O 1,23 mg

Na₃PO₄ + 12 HgO 1,38mg

Mannit ,-- ' 40,0 rag

Vor Gebrauch wird der Inhalt des Trockenvials mit l.ml destilliertem Wasser, enthalten in einer Lösungsampulie, ver« mischt. Man erhält eine Suspension mit einem.pH von 7,67"'"

909836/1546 original inspected

Beispiel

Man stellt eine Trockenampulle aus folgenden Komponenten her : >

17 l8 1-24 ·

Lys '>*^w_ß·*· -Corticotropin-Hexaacetat 0,5 mg

ZnSO₄ + 7 HgO 1,23 mg

Mannit 40,0 mg

und eine Lösungsampulle mit folgender Zusammensetzung der Lösung :

Na₅PO₄ + 12. HgO 1,38 mg

Versene - Pe-3 O₄I mg

dest. Wasser; " ad 1,0 ml

■Vor Gebrauch werden der Inhalt der Trockenampulle und der ^: Lösungsampulle vermischt. Die erhaltene Suspension hat ein pH von 7»6, · ^;

·. . - Beispiel 4 : -.0

Man stellt eine LÖsu'ngsampulle aus folgenden Komponenten her ?

17 18 t24

Lys ". -ß -Corticotropin-Hexaaoetat 0,5mg

Gelatine 280,0 mg

Phenol 5,0 mg

dest. Wasser . ad 1,0 ml

909836/1546

sy?

Beispiel 5 ι

17 lft

Eine steril filtrierte wässrige Lösung von Lys '

β -Corticotropln-Hexaacetat wird unter aseptischen Bedingungen mit Natrium-Polyphloretinphosphat und Natrium-. Chlorid vermischt und in Vials abgefüllt und lyophillsiert, sodass ein Trockenvial erhalten·wird, das folgende Komponenten enthält ί

17 l8 1-24
Lys " -ß -Cortlcotropin-Hexaaoetat 0,5 mg

Natrium-Polyphloretinphosphat (86,5#ig) 23,20 mg NaCl 12,28 mg

Vor Gebrauch wird der Inhalt des Trockenvials mit 2 ml destilliertem Wasser,.enthalten in einer Lösungsampulle, vermischt. , ^:* ■, - ,

♦ ■

Beispiel 6 :

Man stellt eine Suspension aus folgenden Komponenten her :

17 l8 1-24

Lys ' -ß -Corticotropin-Hexaacetat 1,0 mg

ZnCl₂ 10,5 mg

Na₂HPO^ 1,7 mg

Benzylalkohol 17 ,,0 mg

NaCl 2,5 mg NaOH ad pH 8,0

Aqua dest. ad ί ml

ORlGiNAHNSFEGTED

it

Beispiel 7 :

2,0 g Poly-L-glutaminsäure mit einem mittleren Molekulargewicht von ca. 11 000 werden in ca. 5,7 ml 10#- iger Natronlauge gelöst, sodass das pH der Lösung 7,^ be-

in iQ ι Oll

trägt. In dieser Lösung werden 5,0 mg Lys -ß -Corticotropin-hexaacetat und 0,2 mg Merthiolat aufgelöst und mit destilliertem Wasser auf 10 ml aufgefüllt. Die Lösung wird steril filtriert. Sie enthält pro ml t

in iQ η ph

Lys -β -Corticotropin-Hexaacetat 0,5 rag

Poly-L-glutaminsäure 200,0 mg

Natronlauge bis pH 7,4 .-<,·.

Merthiolat : . _s . . 0,02 mg

Aqua dest. ad 1,0 ml

. Beispiel- 8..:

2,0 g Poly-L-glutaminsäure werden in ca. 5*7 ml

lO^iger Natronlauge gelöst, sodass das pH der Lösung 7,4

17 l8 1-24 beträgt. In dieser Lösung werden 5,0 mg Lys " -ß Gorticotropin-hexaacetat und 0,2 mg Merthiolat aufgelöst. Zu dieser Lösung wird 1 ml einer salzsauren Zinkchloridlösung (pH 2,8) mit 5,2 mg Zinkchlorid pro ml gegeben. Das pH wird mit Natronlauge auf 7,8 eingestellt und mit destilliertem Wasser auf el* ^nd^oiuinen von 10 ml aufgefüllt«

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ORIGINAL INSPECTED

Beispiel 9 :

2,0g Poly-L-glutaminsäure werden in ca. 5*7 ml 10 #iger Natronlauge gelöst, sodass das pH der Lösung 7,4

Ί 7 1 ft T Pil

beträgt. In dieser Lösung werden 5,0 mg Lys '* -ß Corticotropin-hexaacetat und 0,2 mg Merthiolat aufgelöst. Zu dieser Lösung werden 1 ml einer salzsauren Lösung (pH 2,8) enthaltend 5,2 mg Zinkchlorid und 0,85 mg Dinatriumphosphat (wasserfrei) gegeben. Das pH wird mit Natronlauge auf 7*8 eingestellt. Man füllt mit Wasser auf ein Volumen von 10 ml auf.

Beispiel 10 :

Man löst 11,12 mg Eisessig, 1,21 mg Natriumaoetat,

T 7 1 ft T Oil

2,5 mg Natriumchlorid und 2,0 mg Lys '* -ß -Corticotropinhexaacetat in 0,7 ml destilliertem Wasser und füllt mit destilliertem Wasser auf 1 ml auf. Die Lösung wird bei 120° 20 Minuten autoklaviert. Das pH ist nach der Sterilisa-* tion 3,7.

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Beispiel 11 ϊ Man löst in 0,7 ml physiologischer Natriumchlorid-

■j it ι Q η Oii

lösung 0,5 mg Lys '* -ß " -Corticotropin-hexaacetat und säuert die Lösung mit 0,1-n. Salzsäure auf pH 3*² an. Mit destilliertem Wasser wird auf 1 ml aufgefüllt und wie in Beispiel 1 hitzesterillsterfcc

Beispiel 12 :

In D,8 ml destilliertem Wasser werden 7,05 ml Glycin und 6,08 mg Natriumchlorid gelöst und 0,055 ml

17 lfi 1-P4

0,1-n. HCl zugefügt. Anschliessend wird 1,0 mg Lys '' -ß^x Corticotropin-hexaacetat in der Lösung aufgelöst und mit ''" destilliertem'Wasserlauf i;o.ml aufgefüllt.

Die Lösung wird auf übliche Weise filtriert, in Ampullen abgefüllt und bei 120° 20 Minuten autoklaviert. Das pH beträgt 3,6.

Beispiel 13 :

In 0,8 ml destilliertem Wasser wird eine Lösung

von 10,16 mg Zitronensäure (mit 1 Mol Kristallwasser), 0,09f ml

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1-n. Natronlauge, 3,54 mg Natriumchlorid und 0,51 ml 0,1-n.

Salzsäure hergestellt. In dieser Lösung werden 4,0 mg

17 l8 1-24
Lys '* -ß -Corticotropin-hexaacetat aufgelöst und mit destilliertem Wasser auf 1,0 ml aufgefüllt.

Die Lösung wird auf übliche Welse filtriert, in Ampullen abgefüllt und bei 120° 20 Minuten autoklaviert. Das pH beträgt 3,6.

"' Beispiel 14 :

Man stellt eine Suspension aus folgenden Komponenten

17 l8 1-24

Lys " -ß -Corticotropin-hexaaoetat 1,0 mg

ZnCl₂ . ' ■ 5*25 mg

Na₂HPO₄.2 H₂O 1,05 mg

NaCl 2,0 mg

Benzylalkohol 10,0 mg NaOH ad pH 8,3

Dest. Wasser ad 1,0 ml

Beispiei:.15 :

Man stellt eine Suspension aus folgend; ten her: 9 09836/154 6

¹Jn <j Q η Qil

Lye '* -β " -Corticotropin-hexaacetat 1,0 mg

ZnCl₂ 6,30 mg

Na₂HPO₄.2 HO . 1,26 mg

NaCl 1,5 mg

Benzylalkohol 10,0 mg NaOH ad pH 8,3

Dest. Wasser ad 1,0 ml

Beispiel 16 :

Man stellt 0,5 ml einer salzsauren Lösung von 0,5 mg Lys '' -3 ~ -.Corticotropin-hexaaßetat, 5,25 mg g 1,05 mg Na₂HPO..2 HO und 2,0 mg NaCl vom pH 3*0 her und gibt die Lösung zu 0,5 ml einer wässerigen Lösung von 10 mg Benzylalkohol, die soviel Natronlauge enthält, dass eine Suspension vom pH 8,3 erhalten wird.

Beispiel I7 :

5 mg Poly-L-glutaminsäure vom mittleren Molekulargewicht 39 600 v/erder, in 5 ml 0,1-n. Natronlauge gelöst.

-'ri't die Lösung gibt eine Losung von 2,5 mg Lys ß^x" - -C:??'tiootv-opin-nexaaoetat hinzu, s&x-.rt dann mit Essigsäure ν.Ί.'.Γ Salzsäure auf pH 4 an und fUilt mit Wasser auf 10 ml

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BAD ORIGINAL

auf. Dabei fällt ein Poly-L-glutaminsäure-Lys¹⁷'¹⁸^^1-24-Corticotropin-Komplex fein verteilt aus. Die Suspension enthält pro ml 0,5 mg Poly-L-glutaminsäure und 0,25 mg Lys '* -ß Corticotropin als Komplexverbindung.

Beispiel 18 :

2,0 g Poly-L-glutaminsäure mit einem mittleren Molekulargewicht von ca. 39 600 werden in ca. 5,7 ml 10 #iger Natronlauge gelöst, sodass das pH der Lösung 7,4 beträgt.

•ι w ii Q *t Oii

In dieser Lösung werden dann 4,0 mg Lys '* -ß -Corticotropta-bexaacetat und 0,2 mg Merthiolat aufgelöst und mit destilliertem Wasser auf 10 ml aufgefüllt. Die Lösung wird steril filtriert. Sie enthält pro mlι

T 7 T R T Oil

Lys '* -ß -Corticotropin-hexaacetat . 4,0 mg

Poly-L-glutaminsäure 200,0 mg Natronlauge bis pH 7,4

Merthiolat 0,02 mg

Äqua dest. ad 1,0 ml

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Claims (5)

Patentansprüche :

1. Verfahren zur Herstellung neuer Peptide.mit ACTH-Wirkung, dadurch gekennzeichnet, dass man aus ACTH-wirksamen Peptiden mit 18 - 24 Aminosäureresten vom Aminoende des ACTH an gerechnet, in denen die 17- und l8-ständigen Argininreste durch Lysinreste ersetzt sind und in denen mindestens die a-Aminogruppe und die Seitenkettenaminogruppen sowie die terminale Carboxylgruppe und eine gegebenenfalls vorhandene Seitenkettencarboxylgruppe geschützt sind, die Schutzgruppen abspaltet und, wenn erwünscht, die erhaltenen Verbindungen in ihre Säureadditionssalze, Derivate oder Komplexe überführt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man von Peptiden ausgeht, in denen die a-Aminogruppe und die (υ-Aminogruppen durch die tert.-Butyloxycärbonylgruppe, die Endcarboxylgruppe und die 7-Carboxylgruppe der Glutaminsäure durch die tert.-Butylestergruppe geschützt sind.

3. Peptide, in denen die 17- und l8-ständigen Argininreste von ACTH-wirksamen Peptiden mit l8 - 24 Aminosäureresten durch Lysinreste ersetzt sind, ihre Säureadditionssalze, Derivate und Komplexe.

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4. Das Tetrakosapeptid der Formel L-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-E-methionyl-L-glutajnyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valylglycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-lysyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin und die entsprechende Verbindung, die statt des Glutamylrestes den Rest des Glutamins aufweist, ihre Säureadditionssalze, Derivate und Komplexe.

5. Pharmazeutische Präparate, welche das Tetrakosapeptid der Formel L-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophylglycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-lysyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin oder die entsprechende Verbindung, die statt des Glutamylrestes den Rest des Glutamins aufweist, oder ihre Salze oder Komplexe enthalten.

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