DE2341775C3 - In N-terminaler Stellung den Rest einer Aminooxysäure aufweisende Peptide mit ACTH-Wirkung, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie diese Peptide enthaltende Arzneimittel - Google Patents

Description

Es ist bekannt, daß die Peptidkette des Adrenokortikotrophormons (ACTH) abgeändert werden kann, ohne daß dadurch die adrenokortikotrope Wirkung aufgehoben würde. So kann vom C-terminalen Ende des Moleküls mehr als ein Drittel der Aminosäurekette abgespalten werden, ohne daß ein Absinken der >o spezifischen Aktivität eintritt. Die Abspaltung weiterer Aminosäuren führt jedoch zu einer schlagartigen Abnahme der Aktivität. Das Fragment 1 — 19 verfügt über 30% der Aktivität des Moleküls, das Fragment — 16 demgegenüber nur über ungefähr 1%. Im Gegensatz dazu verursacht am N-terminalen Ende bereits das Abspalten der ersten Aminosäure eine 50°/oige Verringerung der Aktivität (E. Schröder, K. Lübke: The Peptides, Academic Press, New York 1966,246-249). „o

Ferner ist bekannt, daß ACTH-Fragmente, die an Stelle des N-terminalen Serins D-Aminosäuren, in der Natur nicht vorkommende Aminosäuren oder die vom Serin durch Fortlassen von dessen funktionellen Gruppen ableitbaren Acylreste (/J-Hydroxypropionyl-, μ Propionylrest) enthalten, fallweise eine Aktivität zeigen, die selbst die Wirkung des natürlichen ACTH übertrifft, da diese modifizierten ACTH-Fragmente — wie anzunehmen ist — gegenüber den Enzymen vom Typ der Aminopeptidase resistent sind und deshalb im Organismus langsamer abgebaut werden als das natürliche ACTH. Aus diesem Grunde zeigen sie auch dann noch eine starke ACTH-Wirkung, wenn die modifizierende Gruppe die Funktion des Serin-Teiles der natürlichen ACTH nicht vollständig zu erfüllen vermag. Von den substituierten ACTH-Peptiden dieser Typus sind durch die Arbeit Schweizer Forscher D-Serin-Derivate (CH-PS 4 99 497, 4 67 246 und 4 88 663), aus der Arbeit zweier japanischer Forscherkollektive Sarkosin-, ^-Alanin- und «-Aminobuttersäure-Derivate (DE-OS 20 55 151, 20 34 698, 21 14 300, 21 24 549 und 21 12 553) bekannt Die 0-HydroxypropionyI- und Propionyl-Derivate sind ebenfalls aus Schweizer Arbeiten bekannt (FR-PS 15 13 943 und 15 13 944).

Es wurde nun gefunden, daß es zum Erreichen der erwähnten Schutzwirkung gegenüber Eo/men und damit zur Erzielung einer gesteigerten ACTH-Wirkung außerordentlich vorteilhaft ist, wenn der N-terminale Serinrest im ACTH-Molekül oder in dessen Fragmenten durch den Rest einer &-Aminooxysäure ersetzt wird. Über eine besonders hohe Aktivität verfügen die Aminooxyacetyl-, L- und D-«-Aminooxypropionylsowie L- und D-«-Aminooxy-0-hydroxypropionyI-Derivate.

Gegenstand der Erfindung sind Peptide mit einer von der N-terminalen Aminosäure bis wenigstens zur 16. Aminosäure vollständigen ACTH-Sequenz, die in jedem Falle anstelle des N-terminalen Serylrestes den Rest der Aminooxyessigsäure, L- oder D-a-Aminooxypropionsäure oder L- oder D-a-Aminooxy-/?-hydroxypropionsäure enthalten und die gegebenenfalls anstelle einzelner Aminosäurereste der ACTH-Sequenz folgende anderen Aminosäurereste enthalten können:

in Position 25 Asparagyl anstelle von Asparaginyl und/oder

in Position 26 Alanyl anstelle von Glycyl und/oder in Position 27 Glycyl anstelle von Alanyi,

wobei den ausgetauschten Aminosäureresten die Sequenz des natürlichen menschlichen ACTH zugrunde liegt, sowie deren Säureadditionssalze und Amide.

Die erfindungsgemäßen neuen Verbindungen können also beispielsweise substituierte Peptide sein, die auf die erste Aminooxysäure folgend die Sequenzteile 2 bis 16, aber auch 2 bis 39 des natürlichen ACTH enthalten. Im Hinblick auf ihre ACTH-Wirkung sind besonders das [L- und D-OSer¹, Asp²⁵, AIa²⁶, Gly²⁷]-«'-²^ACTH und das [D-OSer']-«'-³²-ACTH zu erwähnen. (OSer bedeutet den Rest der <x-Aminooxy-/J-hydroxypropionsäure, die sich von Serin nur durch das zwischen das a-C-Atom und die Aminogruppe eingeschobene Sauerstoffatom unterscheidet.) Im folgenden werden die mit den entsprechenden Aminosäuren strukturell identischen Aminooxysäuren in analoger Weise bezeichnet, somit OGIy = Aminooxyessigsäure, OAIa = Λ-Aminooxypropionsäure.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Herstellung der Peptide der oben erwähnten Zusammensetzung sowie von deren Säureadditionssalzen und Amiden, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man von Peptiden der obengenannten Art, die wenigstens an der terminalen Aminooxygruppe und den Aminogruppen der Seitenketten, gegebenenfalls auch an der termimalen Carboxylgruppe und den Carboxylgruppen der Seitenketten geschützt sind, jeweils in an sich bekannter Weise die Schutzgruppen abspaltet und die

erhaltenen Verbindungen gewünschtenfalls in ihre Säureadditionssalze oder Amide überführt.

Gegenstand der Erfindung sind schließlich Arzneimittel, die eine Verbindung nach Anspruch 1 oder 2 enthalten.

Die als Ausgangsstoffe verwendeten geschützten Peptide werden, ausgehend von einer der genannten, geschützten a-Aminooxysäuren, in an sich bekannter Weise durch Fragmentkondensation oder durch Kettenverlängerung um jeweils eine Aminosäure hergestellt, wobei nach der Azid-, der Aktivester-, der DCC- oder der Methode des gemischten Anhydrids gearbeitet werden, aber auch die sogenannte Synthese in fester Phase angewandt werden kann, bei der das Peptid mit seiner am Kettenende befindlichen Carboxylgruppe an ein Polymer gekuppelt ist und aufgebaut wird, indem die Aminosäuren und schließlich die «-Aminooxysäure in der entsprechenden Reihenfolge an die an das Polymer gebundene C-terminale Aminosäure angebaut wird.

Die funktioneilen Gruppen, die an der Reaktion nicht teilnehmen, werden zweckmäßig geschützt, und zwar durch Gruppen, die durch Hydrolyse, Acidolyse, Hydrazinolyse oder Reduktion leicht abspaltbar sind. Die Carboxylgruppe kann zum Beispiel vorzugsweise durch Verestern mit Methanol, tert-ButanoI, Benzylalkohol oder p-Chlorbenzylalkohol- oder durch Amidbildung geschützt werden, zum Schütze der Aminooxy- und der Aminogruppen kommen in erster Linie die Tosyl-, Formyl-, Trifluoracetyl-, o-Nitrobenzolsulfonyl-, Phthalyl-, Benzyloxycarbonyl- und p-Chlorbenzyioxycarbonyl-Gruppe, besonders jedoch die tert.-Butyloxycarbonylgruppe in Frage. Die .* rginin-guanidino-Gruppe kann vor allem durch die Nitrogruppe geschützt, jedoch auch in ihrer protoniinen Form verwendet werden. Die Iminogruppe des Histidins kann vor allem durch die Benzyl-, Trityl- oder Dinitrophenylgruppe geschützt werden. Die Hydroxylgruppen der Seitenketten werden fallweise durch Veräthern geschützt, wobei vorzugsweise mit tert-Butanol und Benzylalkohol veräthert wird.

Durch Anwendung einer geeigneten Kombination von Schutzgruppen kann erreicht werden, daß diese Schutzgruppen in an sich bekannter Weise, zum Beispiel durch Hydrolyse, Acidolyse, Hydrazinolyse oder Reduktion gleichzeitig entfernt werden können.

Nach einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird so vorgegangen, daß die geschützte α-Aminooxysäure in 1-Stellung mit dem Tripeptidester Tyr-Ser-Met-OCHj kondensiert, aus 5« dem erhaltenen Peptid-methylester das Azid gebildet und mit diesem das Dekapeptid

Glu(OBu')-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC)-

Pro-Val-Gly

>■>

acyliert wird. Das auf diese Weise erhaltene substituierte Tetradekapeptid wird danach mit der entsprechend geschützten C-terminalen Sequenz kondensiert. Bei der Herstellung eines substituierten Hexadekapeptides wird zum Beispiel mit dem 15— 16-Dipeptid, «j bei der Herstellung eines substituierten Oktadekapeptides mit dem 15—18-Tetrapeptid, bei der Herstellung eines substituierten Oktakosapeptides mit dem 15—28-Tetradekapeptid, bei der Herstellung eines substituierten Dotriakontapeptides mit dem 15 —32-Okta- <,■-, dekapeptid, bei der Herstellung eines substituierten Nonatriakontapeptides mit dem 15—39-Pentakosapeptid kondensiert. Bei diesen Kondensationen wird vorzugsweise das DCC-Verfahren oder die Methode des Aktivesters angewandt. In letzterem Falle, besonders bei der Verwendung von Pentachlorphenyl- oder Pentafluorphenylester, braucht der aktive Ester nicht isoliert zu werden; er kann mit Hilfe von Pentachlorphenol oder Pentafluorphenol aus dem substituierten Tetradekapeptid im Reaktionsgemisch der Kondensationsreaktion gebildet werden (vgl. OE-PS 2 95 051).

Eine alternative Möglichkeit zum Aufbau de. als Ausgangsstoff verwendeten, in 1-Stellung immer eine α-Aminooxysäure enthaltenden Peptide besteht darin, daß die entsprechende C-terminale Sequenz mit dem geschützten 5—14-Dekapeptid acyliert, die N-terminale Schutzgruppe des erhaltenen Peptides entfernt und im letzten Schritt mit dem I —4-substituierten Tetrapeptid acyliert wird. Auf diese Weise können die als Ausgangsstoffe benötigten, in N-terminaler Stellung eine a-Aminooxysäure enthaltenden, geschützten Peptide unmittelbar aus den N-terminalen Tetrapeptid-Derivaten hergestellt werden.

Am Ende der Synthese werden die an der N-terminalen a-Aminooxygruppe und an den Aminogruppen der Seitenketten befindlichen terL-Butyloxycarbonylgruppen, die an der Carboxylgruppe der Seitenketten und an der C-terminalen Carboxylgruppe — sofern diese nicht amidiert ist — befindlichen terL-Butylestergruppen sowie die am Hydroxyl der Seitenketten eventuell vorhandene tert-Butyläthergruppe gleichzeitig mittels Acidolyse, vorzugsweise durch Behandeln mit Trifluoressigsäure, abgespalten. Die Reinigung des von seinen Schutzgruppe« befreiten Endproduktes kann durch Verteilung im Gegenstrom oder durch Säulenchromatographie, beispielsweise durch lonenaustauschchromatographie an unterschiedlichen Carboxymethylcellulose-Arten, vorgenommen werden.

Die im Sayers-Versuch (M. A. Sayers, G. Sayers und L. A. Woodbury, Endocrinology 42,329 (1948): G. Hamburger, Acta Endocrinol. 35, 594 (I960)) gemessene biologische Aktivität der erfindungsgemäßen Verbindungen übetrifft die Aktivität der entsprechenden, nicht durch a-Aminooxysäuren substituierten ACTH-Fragmente. So beträgt die auf die obige Weise gemessene Aktivität von [D-OSer·]-¹ -³²ACTH (Beispiel 6) 127IE/mg, die des handelsüblichen synthetischen ACTH-Präparates Tetracosactrin dagegen nur 100 I E/mg.

Die neuen Verbindungen werden in Abhängigkeit von der bei ihrer Herstellung angewandten Methode in Form der freien Baoe oder als Salz erhalten. Aus den Salzen können die Basen in an sich bekannter Weise freigesetzt werden. Die freien Basen können mit den für pharmazeutische Zwecke verwendbaren Säuren IU Säureadditionssalzen umgesetzt werden. Für diesen Zweck kommen anorganische Säuren, wie Salz-, Schwefel- oder Phosphorsäure, aber auch organische Säuren, wie Ameisensäure, Essigsäure, höhere Fettsäuren sowie Milch-, Wein- oder Citronensäure, in Frage.

Unter Amiden der neuen Verbindungen werden auch die am Stickstoff unterschiedlich substituierten Amide, in erster Linie jedoch die an der Gterminalen Carboxylgruppe amidierten, in der Seitenkette aber gegebenenfalls auch freie Carboxylgruppen enthaltenden Peptidamide verstanden.

Aus den erfindungsgemäßen Peptiden können zur pharmazeutischen Verwendung die üblichen pharmazeutischen Präparate hergestellt werden. Diese Präparate enthalten die erfindungsgemäßen Verbindungen

zusammen mit zur enteralen oder parenteral Verabreichung geeigneten organischen oder anorganischen Streckmitteln. Die pharmazeutischen Präparate können feste Lyophilisate sein, wobei als Streckmittel mit Peptiden nicht reagierende Verbindungen, zum Beispiel Mannit, Milchzucker oder Stärke, in Frage kommen; sie können aber auch in Form von Suspensionen und Emulsionen hergestellt werden, welche verschiedene neutrale Konservierungsmittel und Stabilisatoren enthalten. Besonders zweckmäßig ist es, wenn die pharmazeutischen Präparate die erfindungsgemäßen Verbindungen in Form der weiter oben erwähnten Komplexe enthalten, die eine verzögerte Wirkung des Präparates bewirken.

Entsprechend der üblichen Dosis des Adrenokortikotrophormons enthalten die pharmazeutischen Präparate die erfindungsgemäßen Verbindungen in einer Konzentration von zum Beispiel 0,5—5 mg/ml. Die Präparate können subcutan, intramuskulär oder parenteral 1—7mal pro Woche verabreicht werden.

Die praktische Ausführung des Verfahrens wird an Hand der folgenden Beispiele näher erläutert

In den Beispielen werden zur Bezeichnung der Aminosäuren und der Peptid-Derivate die durch die IUPAC-IUB vorgeschlagenen Abkürzungen benutzt (J. Biol. Chem. 247, 977/1972). Zur Bezeichnung der «-Aminooxysäuren werden die den Abkürzungen der Aminosäuren ähnlichen, weiter oben bereits erwähnten Symbole OGIy, OAIa, OSer benutzt. Die obigen Abkürzungen beziehen sich — GIy und OGIy ausgenommen — falls nicht anders angegeben, auf die L-Antipoden. Als weitere Abkürzungen werden verwendet:

PCPOH	= Pentachlorphenol,
PFPOH	= Pentafluorphenol,
DCC	= Dicyclohexylcarbodiimid,
DCU	= Dicyclohexylcarbamid,
BOC	= tert-Butyloxycarbonyl,
Bu'	= tert.-Butyl,
ONSu	= Succinimidoxy,
Z	= Carbobenzoxy.

Die Bestimmung des Schmelzpunktes wurde mit dem Apparat nach Dr. Tottoli vorgenommen. Die dünnschichtchromatographischen Untersuchungen wurden an dem Adsorbens Silikagel nach Stahl mit folgenden Lösungsmittelgemischen durchgeführt:

1. tssigester :(Pyridin : Essigsäure : Wasser =
20:6:11) = 8:2

2. Essigester :(Pyridin : Essigsäure : Wasser =
20:6:11) = 6:4

3. Essigester : Pyiidin : Ameisensäure : Wasser =
50 : 20 :6 :5,5

4. Chloroform : Methanol = 98 :2

5. Chloroform : Methanol = 95 :5

Beispiel 1

OGly-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-

Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Tyr-

Pro-Asp-Ala-GIy-Glu

0,600 g (0,143 mMol) BOC-OGly-Tyr-Ser-Met-Glu(OBu')-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC)-Pro-Val·
Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Arg-Arg-Pro-Val-Lys(BOQ-VaI-Tyr(Bu')-Pro-Asp(OBu')-Ala-Gly-

Glu(OBu')-OBu' · 3 HCI werden in einem Gemisch aus 4,8 ml Trifluorcssigsäure, 0,6 ml Wasser und 0,6 ml Anisol gelöst. Die Lösung wird bei Zimmertemperatur eine Stunde lang stehen gelassen und danach mit 60 ml Äther verdünnt. Der ausgeschiedene Niederschlag wird abfütriert, mit Äther gewaschen und im Vakuum über Phosphorpentoxyd und Kaliumhydroxyd getrocknet.

Es werden 0,538 g (87%) des substituierten Oktakosapeptid-trifluoracetats erhalten.

Das rohe Trifluoracetat wird in 10 in! Wasser gelöst, die Trifluoracetat-Ionen werden mit Hilfe von Acet&taustauscherharz Dowex® 1 χ 8 gegen Acetat-Ionen ausgetauscht. Die erhaltene Lösung des Oktakosapeptidacetats wird auf eine mit Ionenaustauscher aus Carboxymethylcellulose gefüllte Säule aufgebracht und mit einem linearen Puffergradienten, der aus 0,01 m (pH 4,5) und 0,4 m (pH 6,7) Ammoniumacetat-Puffer bereitet wurde, eluiert. Die den gewünschten Stoff enthaltenden Fraktionen werden gesammelt und lyophilisiert. Es werden 0,22 g (34%) Oktakosapeptid erhalten. Peptidgehalt, bestimmt durch UV-Absorption: 72,3%, Metsulfoxydgehalt: 1,3%. Verhältnis Tyr/Trp: 2,05; Aminosäurenanalyse: Lys 4,05 (4), His 0,93 (1), Arg 3,08 (3),

Asp 0,99 (1), Ser 0,79 (1), GIu ~,01 (2), Pro 3,09 (3), GIy 3,04 (3), AIa 0,92 (!), Va! 3,12 Q), Met 0,60 (1), Tyr 1.88 (2), Phe 0,85(1).

Das als Ausgangsstoff verwendete Hydrochlorid des geschützten substituierten Oktakosapeptiaes wird auf folgende Weise hergestellt:

Schritt 1

tert.-Butyloxycarbonyl-aminooxyessigsäure
^S" (BOC-OGIy)

316,0 g (2,37 MoI) teru-Butyloxycarbonyl-hydroxylamin werden in 2680 ml Äthanol gelöst und der Lösung unter Kühlen 207,8 g (5,19 Mol) Natriumhydroxyd und

3> 350,4 g (2,52 Mol) Monobromessigsäure zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird 20 Minuten lang gekocht und danach das Lösungsmittel abdestilliert. Der Rückstand wird in 1940 ml Wasser gelöst und mit konzentrierter Salzsäure auf pH 3 angesäuert. Nach 2stün-iigem Kühlen und Rühren werden die ausgeschiedenen Kristalle abfiltriert. Das rohe Produkt (419 g) wird aus einem Chloroform-n-Hexangemisch kristallisiert. Ausbeute: 388,8 g (86%) tert.-Butyloxycarbonyl-aminoessigsäure. Schmelzpunkt: 115-116⁰C.

Analyse (C₇H₁₃NO₅= 191,18):

Berechnet: C 44,0, H 6,8, N 7,2%;
gefunden: C 43,9, H 6,9, N 7,1%.

Schritt 2

BOC-OGly-Tyr-Ser-Met-NjHs

1,72 g (9,0 mMol) BOC-OGIy und 4,50 g (10 mMol) Tyr-Ser-Met-OCH₃ · HCI werden in 10 ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird auf 0⁰C gekühlt und zuerst mit 1,11 ml (10 mMol) N-Methylmorpiiolin, danach mit 1,85 g (9,0 mMol) DCC versetzt. Das Reaktionsgemisch wird eine Stunde lang bei 0°C gerührt und bei Zimmertemperatur bis zum folgenden Tag stehen gelassen Danach wird das DCU abfiltriert, das FiI-trat eingedampft und der Rückstand in 200 ml Essigäthylester gelöst. Die Lösung wird zweimal mit 100 ml η Salzsäure und zweimal mit 100 m) 8%iger Natriumhydrogencarbonat-Lösung ausgeschüttelt, danach getrocknet und dann eingedampft. Der erhaltene rohe, substituierte g schützte Tetrapeptidmethylester (4,5 g) wird in 45 ml Methanol gelöst, die Lösung mit 1,26 ml i26.0 mMoll Hvdrazinhvdrat verset7t und Ha«; Hpal·-

tionsgemisch bei Zimmertemperatur über Nacht stehen gelassen. Danach wird die Lösung eingedampft, der Rückstand mit Essigester verrieben, abfiltriert, der Niederschlag mit Essigester und Äther gewaschen und über konzentrierter Schwefelsäure getrocknet. Es wer- ο den 3,30 g (62,5%) Hydrazid des substituierten geschützten Tetrapeptides erhalten. Der Schmelzpunkt des aus Wasser umkristallisierten Produktes liegt bei 137° C. R,' =036.

10

Analyse (C₂^H₃₈N₆O₉S = 586,66):

Berechnet: C 49,1. H 6,5, N 14,4%;
gefunden: C 49.0. H 6,6, N 14,4%.

Schritt 3 r,

BOC-OGIy-Tyr-Ser-Met-GluiOBu'J-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC)Pro-Val-Gly · HCI

0,41 g (0,70 mMol) BOC-OGIy-Tyr-Ser-Met-N^i werden in i> ml Dimethylformamid gelöst. In die auf _"i

— 20⁼C gekühlte Lösung werden 0,64 ml (2,8 mMol) 4.4 π salzsaurer Essigester, danach 0,105 ml (0,85 mMol) tert.-Butylnitrit eingetropft. Das Reaktionsgemisch wird bei -1O⁰C 5 Minuten lang gerührt, dann auf -2O⁰C gekühlt, und es werden 0,96 g (0,70 mMol) GIu(OBu')- -'"> His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC)-Pro-VaI-Gly (ungarische Patentschrift Nr. 1 55 880) und 0,48 ml (2,8 mMo!) Diisopropylamin in 8 ml Dimethylformamid zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird bei einer Temperatur von

— 5 bis O⁰C eine Stunde lang gerührt und bei 0°C über »> Nacht stehen gelassen. Danach wird die Lösung eingedampft und der Rückstand mit 8%iger Natnumhydrogencarbonatlösung verrieben. Nach dem Filtrieren, Waschen mit Wasser und Trocknen werden 0,93 g (69%) substituiertes, geschütztes Tetradekapeptid er- v> halten. Dieses wird in 6 ml Methanol suspendiert und mit einer Pyridinhydrochloridlösung versetzt, die aus 1,35 ml Pyridin und 135 ml konzentrierter Salzsäure bereitet wurde. Die erhaltene Lösung wird mit 50 ml Wasser verdünnt und das ausgefallene Hydrochlorid w des geschützten, substituierten Tetradekapeptides abfiltriert, mit Wasser gewaschen und dann getrocknet.

AiKhpiitp· O7Rcr (57%) Srhmelypnnkt: 202 —2Ο4°Γ Rf =0.18. C₉₀Hn₂N₂₁O₂₁CIS (1959.66).

4-,

Schritt 4

BOC-OGly-Tyr-Ser-Met-GlufOBu'J-His-Phe-Arg-Trp-GIy-LyS(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Arg-Arg-Pro-Val-LysiBOCJ-Val-TyitBuO-Pro-ASp(OBu¹)-

AIa-GIy-GIu-(OBuOOBu' · 3 HCI

0345 g (0,176 r-Mol) BOC-OGIy-Tyr-Ser-Met-Glu(OBu')-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC)-Pro-VaI-GIy - HCl. 0,400 g (0,176 mMol) Lys( BOC)-Lys( BOC)-Arg-Arg-Pro-VaI-Lys(BOC)-Val-Tyr(Bu>)-Pro-

ASp(OBu¹J-AIa-GIy-GIu(OBu¹PBu¹ · 3 HCl (ungarische Patentschrift Nr. 155 880) und 0,28! g (1,05 mMol) PCPOH werden in 33 ml Dimethylformamid gelöst und der Lösung zuerst 0,025 ml (0,18 mMol) Triethylamin, dann 0,074 g (036 mMol) DCC zugesetzt Das μ Reaktionsgemisch wird bei Zimmertemperatur 2 Tage lang stehen gelassen, dann das DCU abfiltriert und das Filtrat mit 30 ml Äther verdünnt. Das ausgefallene Produkt wird abfiltriert mit Äther gewaschen und dann getrocknet Das Hydrochlorid des substituierten geschützten Oktakosapeptides wird in einer Ausbeute von 0,640 g (87%) erhalten. Schmelzpunkt: 2öa—2\TC, Rj =0,22. C₁₉₄H₃HNwO₄₉Cl₃S (41823).

Beispiel 2

OAIa-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-

Pro-Asp-Ala-Gly-Glu

0,600 g (0,142 mMol) BOC-OAIa-Tyr-Ser-Met-Glu(OBu')-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC)-Pro-VaI-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Arg-Arg-Pro-Val-Lys(BOC)-

Val-Tyr(Bu')-Pro-Asp(OBu')-Ala-Gly-Glu(OBu')-OBu¹ · 3 HCI werden in einem Gemisch aus 4,8 ml Trifluoressigsäure, 0,6 ml Wasser und 0,6 ml Anisol gelöst. Die Lösung wird bei Zimmertemperatur eine Stunde lang stehen gelassen und dann mit 60 ml Äther verdünnt. Der ausgeschiedene Niederschlag wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und im Vakuum über Phosphorpentoxyd und Kaliumhydroxyd getrocknet. Das Trifluoracetat des substituierten Oktakosapeptides wird in einer Ausbeute von 0,532 g (86,5%) erhalten.

Das erhaltene rohe Trifluoracetat wird in 10 ml Wasser gelöst, und die Trifluoracetationen werden mittels Acetationenaustauscherharz Dowex®1x8 gegen Acetationen ausgetauscht. Die erhaltene Lösung, die das Acetat des substituierten Oktakosapeptides enthält, wird auf eine mit Ionenaustauscher aus Carboxymethylcellulose gefüllte Säule aufgegeben und mit einem aus 0,01 m (pH 4,5) und 0,4 m (pH 6,7) Ammoniumacetatpuffer bereiteten linearen Puffergradienten eluiert. Die den gewüriithten Stoff enthaltenden Fraktionen werden gesammelt und lyophilisiert. Es werden 0,23 g (42%) Oktakosapeptid erhalten. Peptidgehalt, durch UV-Absorption bestimmt: 85,1%. Gehalt an Met-Sulfoxyd: 2,7%. Verhältnis von Tyr : Trp: 2,10; Aminosäureanalyse: Lys 3,89 (4), His 0.97 (1), Arg 3,00 (3), Asp 1,10 (1), Ser 0,97 (1), GIu 1,94 (2), Pro 3,10 (3), GIy 3,06 (3), AIa 1,15 (1), VaI 2,84 (3), Met 0,68 (1), Tyr 1,94 (2), Phe 1.06(1).

Das als Ausgangsstoff eingesetzte Trihydrochlorid des geschützten substituierten Oktakosapeptides wird in folgender Weise hergestellt:

icnntt 1

tert.- Buty loxycarbonyl- L-a-aminooxypropionsäure
(BOC-OAIa)

4,0 g (29 mMol) D-a-Brompropionsäure, 3,62 g (65 mMol) Kaliumhydroxid und 439 g (33 mMol) tert-Butyloxycarbonyl-hydroxylamin werden auf die im Schritt 1 von Beispiel 1 angegebene Weise zur ReaK· tion gebracht und aufgearbeitet. Das rohe Produkt wird in Äther gelöst und mit 63 ml (32 mMol) Dicyclohexylamin versetzt Auf diese Weise wird das Dicyclohexylaminsalz der tert-Butyloxycarbonyl-L-a-aminooxypropionsäure in einer Ausbeute von 6,7 g (60%) erhalten. Schmelzpunkt: 157⁰C. Das Dicyclohexylaminsalz wird in Äther suspendiert, die Suspension mit 0,2 η Schwefelsäure geschüttelt, die ätherische Phase eingedampft, und auf diese Weise werden 3,05 g (50%) tert-Butyloxycarbonyl-L-a-aminooxypropionsäure erhalten, die bei 110—112°C schmilzt[«]?= -91° (c=\, Äthanol).

Analyse C₈Hi₅NO₅ (205,21):

Berechnet: C 46,4, H 7,4, N 6,8%;
gefunden: C 46,6, H 7,5, N 6,8%.

Schritt ?.
BOC-OAIa-Tyr-Ser-Met-N₂Hj

1,44 g (7,P mMol) BOC-OAIa und 3,50 g (7,8 mMol) Tyr-Ser-Met-OCHi · HCl werden in 12 ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird auf O⁰C gekühlt und mit 0,85 ml (7,8 mMol) N-Methylmorpholin, danach mit ι ^S g (7,2 mMol) DCC versetz!. Das Reaktionsgemisch wird bei 0°C eine Stunde lang gerührt und bei Zimmertemperatur über Nacht stehen gelassen. Anderntags wird das Methanol abdestilliert und der Rückstand mit Essigester verrieben. Das Produkt wird abfütriert, mit Essigester und Äther gewaschen und dann über konzentrierter Schwefelsäure getrocknet. Das Hydrazid des geschützten substituierten Tetrapeptides wird in einer Ausbeute von 2,1 g (50%) erhalten. Schmelzpunkt: 147°C (aus Wasser umkristallisiert). Rf =0,43.

Analyse C₂₅H₄₀N₆O₉S (600,69):
Berechnet: C 50,0, H 6,7 %;
gefunden: C 49,6, H 6,7%.

Schritt 3

BOC-OAIa-TyrSer-Met-Glu(OBuO-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC)-Pro-VaI-GIy · HCl

0,266 g (0,44 mMol) BOC-OAla-Tyr-Ser-Met-NjH! werden in 3,2 ml Dimethylformamid gelöst, und dlv. Lösung wird auf -20°C abgekühlt. Unter Rühren werden 0,41 ml (1,8 mMol) 4,4 η salzsaurer Essigester, danach 0,07 ml (03 mMol) tert-Butylnitrit zugetropft. Das Reaktionsgemisch wird bei — 10⁰C 5 Minuten lang; gerührt, dann auf -20"C gekühlt, und es werden 0,600 g (0,438 mMol) Glu(OBuO-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC)-Pre-Val-Gly sowie 031 (1,8 mMol) Diiso· propyläthylamin in 5 ml Dimethylformamid zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird bei einer Temperatur von -5 bis 0⁰C eine Stunde lang gerührt und dann über Nacht bei 0⁰C stehen gelassen. Anderentags wird das Dimethylformamid abdestilliert und der Rückstand mit 8%iger Natriumhydrogencarbonatiosung verrieben. Nach Filtrieren, Waschen mit Wasser und anschließendem Trocknen werden 0,70 g (Si τι)) lic» gc»i;iiützit ; substituierten Tetradekapeptides erhalten. Aus 1 ml Pyridin und 1 ml konzentrierter Salzsäure wird Pyridinhydrochloridlösung bereitet und zu dem in 5 ml Methanol suspendierten geschützten Tetradekapeptid gegeben. Die auf diese Weise erhaltene Lösung wird mit 50 ml Wasser verdünnt, der ausgefallene Niederschlag abfiltriert, mit Wasser gewaschen und anschließend getrocknet Das Hydrochlorid des geschützten substituierten Tetradekapeptides wird in einer Ausbeute von 0,513 g (59,5%) erhalten. Schmelzpunkt: 200-202⁰C, Rj =0,19. C₉₁Hi₃₄N₂₁O₂₄ClS (1973,68).

Schritt 4

BOC-OAla-Tyr-Ser-Met-GluiOBuO-His-Phe-Arg-Trp-GIy-LyS(BOC)-PrO-Val-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Arg- Arg-Pro-VaI-LyS(BOC)-VaI-TyT(BuO-PrU-ASp(OBuO-

AIa-GIy-GhJ(OBuO^)Bu' - 3 HQ

0348 g (0,176 mMol) BOC-OAla-Tyr-Ser-Met-Glu(OBuO-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC)-Pro-VaI-GIy · HCL 0,400 g (0,176 mMol) Lys(BOC)-Lys(BOC)-

Arg-Arg-Pro-Val-Lys(BOC>^al-Tyr(BuO-Pro-ASP(OBuO-AIa-GIy-GIu(OBuO-OBu' · 3 HCl und 028! _g (1,05 mMol) PCPOH werden in 33 ml Dimethylformamid gelöst Der Lösung werden 0,025 ml (0,18 mMol) Triethylamin, danach 0,074 g (0,36 mMol) DCC zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird bei Zimmertemperatur 2 Tage lang stehen gelassen, dann das DCU abfiltriert und das Filtrat mit 30 ml Äther verdünnt. Das ausgeschiedene Produkt wird abfütriert, mit Äther gewaschen und dann getrocknet. Das Trichlorid des geschützten substituierten Oktakosapeptides wird in einer Ausbeute von 0,658 g (89%) erhalten. Schmelzpunkt: 175-177°C. R? =0,25. C₉₅H₃13N44O49CI3S (4196,36).

Beispiel 3

D-OAla-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-

Pro-Asp-Ala-Gly-Glu

0,600 g(0,142 mMol) BOC-D-OAla-Tyr-Ser-Met-Glu-(OBuO-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Arg-Arg-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-

OBu¹ · 3 HCI werden in einem Gemisch aus 4,8 ml Trifluoressigsäure, 0,6 ml Wasser und 0,6 ml Anisol gelöst. Die Lösung wird bei Zimmertemperatur eine Stunde lang stehen gelassen und dann mit 60 ml Äther verdünnt.

2ί Der ausgeschiedene Niederschlag wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und im Vakuum über Phosphorpentoxyd und Kaliumhydroxyd getrocknet. Die Ausbeute an Trifluoraoetat des substituierten Oktakosapeptides beträgt 0,546 g(88,5%).

Das rohe Trifluoracetat wird in 10 ml Wasser gelöst, und mittels Acetataustauscherharz Dowex® 1 χ 8 werden die Trifluoracetationen gegen Acetationen ausgetauscht. Die auf diese Weise erhaltene Lösung, die das Acetat des substituierten Oktakosapeptides enthält, wird auf eine mit Ionenaustauscher aus Carboxymethylcellulose gefüllte Säule aufgebracht und mit einem aus 0,01 m (pH 4,5) und 0,4 m (pH 6,7) Ammoniumacetatpufferlösung bereiteten linearen Puffergradienten eluiert Die den gewünschten Stoff enthaltenden Fraktionen werden gesammelt und lyophilisiert. Die Ausbeute an Oktakosapeptid beträgt 0,245 g (39%). Peptidgehvlt: 75% (durch UV-Absorption bestimmt). Gehalt an Metsäureanalyse: Lys 435 (4), His 0,97 (1), Arg 3,13 (3), Asp 1,06 (1), Ser 1,00 (1), GIu 1,92 (2), Pro 2,90 (3), Gly 3,00 (3), AIa 1,00 (1), VaI 2,92 (3), Met 0,87 (1), Tyr 2,21 (2), Phe 1,06 (1).

Das als Ausgangsstoff verwendete Trichlorid des geschützten substituierten Oktakosapeptides wird auf folgende Weise hergestellt:

Schritt 1

tert-Butyloxycarbonyl-D-a-aminooxypropionsäure (BOC-D-OAIa)

7,04 g (51 mMol) 1-ä-Brompropionsäure. 63 g (112 mMoi) Kaliumhydroxyd und 7,71 g (58 mMol) tert-Butyloxycarbonyl-hydroxylamin werden auf die im Schritt 1 des Beispiels 1 beschriebene Weise zur Reaktion gebracht und aufgearbeitet Das rohe Produkt wird in Äther gelöst, der Lösung werden 11,0 ml (0,56 mMol) Dicyclohexylamin zugesetzt In einer Ausbeute von 14,85 g (75%) wird das Dicyclohexylaminsalz der tert-Butyloxycarbonyl-D-öc-brompropionsäure erhalten, das bei 157° C schmilzt Die ätherische Suspension des Dicyclohexylaminsalzes wird mit 0,2 η Schwefelsäure geschüttelt, danach die ätherische Phase eingedampft Es werden 6,55 g (62%) tert-Butyloxycarbonyl-D-«-

aminooxypropionsäure erhalten. Schmelzpunkt: 1 ΙΟΙ II⁰C[O]?= +90,0° (c= 1,Äthanol).C₈Hi₅NO₅(205,21).

Schritt 2
BOC-D-OAIa-Tyr-Ser-Met-N₂H3

1,85 g (9,0 mMol) BOC-D-OAIa- und 4,50 g (10 mMol) Tyr-Ser-Met-OCH₃ · HCI werden in 15 ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird auf O⁰C gekühlt und zuerst mit 11,1 ml (10 mMol) N-Methylmorpholin, danach mit 1,90 g (9,2 mMol) DCC versetzt. Das Reaktionsgemisch wird bei 0⁰C eine Stunde lang gerührt und bei Zimmertemperatur über Nacht stehen gelassen. Dann wird das DCU abfiltriert, das Filtrat eingedampft und der Rückstand in 200 ml Essigester gelöst. Die Lösung wird zweimal mit 100 ml η Salzsäure und zweimal mit 100 ml 8%iger Natriumhydrogencarbonatlösung ausgeschüttelt, getrocknet und eingedampft. Der gelartige Rückstand (3,65 g geschützter, substituierter Tetrapeptidester) wird in 40 ml Methanol gelöst, die Lösung mit 1,02 ml (21,2 mMol) Hydrazinhydrat versetzt und das Reaktionsgemisch bei Zimmertemperatur über Nacht stehen gelassen. Anderntags wird aus dem gelartig abgeschiedenen Produkt das Methanol abdestilliert. Der Rückstand wird mit Essigester verrieben, abfiltriert, mit Essigäthylester und Äther gewaschen und über konzentrierter Schwefelsäure getrocknet. Das Hydrazid des geschützten substituierten Tetrapeptides wird in einer Ausbeute von 1,09 g (35%) erhalten. Der Schmelzpunkt des aus Wasser umkristallisierten Produktes liegt bei 184-185°C. Rr =0,43.

Analyse C₂₅H₄₀N₆O₉S (600,69):

Berechnet: C 50,0, H 6,7, N 14,0%;
gefunden: C 49,8, H 6,6, N 14,1%.

Schritt 3

BOC-D-OAla-Tyr-Ser-Met-Glu(OBu')-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC)-Pro-VaI-GIy - HCl

0381g (0,635 mMol) BOC-D-OAla-Tyr-Ser-Met-N2H3 werden in 4,5 ml Dimethylformamid gelöst. In

UlC UUl —ΔΛΛ

gCHUllllC l_AJ3Ullg WCl UCn UlItCI IVUlIt ClI

0,58 ml (2,65 mMol) 4,4 η salzsaurer Essigester, danach 0,095 ml (0,80 mMol) tert-Butylnitrit eingetropft. Das Reaktionsgemisch wird bei —10° C noch 5 Minuten lang gerührt, dann auf —20° C gekühlt und die Lösung von 0,86 g (0,628 mMol) GIu(OBuO-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC)-Pro-VaI-GIy und 0,43 ml (2,50 mMol) Diisopropyläthylamin in 7,2 ml Dimethylformamid zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird bei einer Temperatur von —5 bis 0⁰C eine Stunde lang gerührt und dann bei 0°C bis zum nächsten Tage stehen gelassen. Das Dimethylformamid wird abdestilliert, der Rückstand mit 8%iger Natriumhydroxydlösung verrieben. Nach Filtrieren, Waschen mit Wasser und anschließendem Trocknen werden 0,95 g (77%) geschütztes substituiertes Tetradekapeptid erhalten. Aus 135 ml konzentrierter Salzsäure und 135 ml Pyridin wird eine Pyridinhydrochloridlösung bereitet und diese dem in 6 ml Methanol suspendierten geschützten substituierten Tetradekapeptid zugesetzt Die auf diese Weise erhaltene Lösung wird mit 50 ml Wasser verdünnt, der ausgeschiedene Niederschlag wird abfiltriert, mit Wasser gewaschen und dann getrocknet Das Hydrochlorid des geschützten substituierten Tetradekapeptides entsteht in einer Ausbeute von 0,78 g (63%). Schmelzpunkt: 204-210⁰C, R? =0,20. C₉IHi₃₄N₂IO₂₄QS (1973,68).

Schritt 4

BOC-D-OAIa-Tyr-Ser-Met-Glu(OBu')-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC)-Pro-VaI-GIy-LyS(BOC)-Lys(BOC)-Arg-Arg-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr(Bu·)- PrO-ASp(OBU¹VAIa-GIy-GIu(OBuO-OBu¹

0,348 g (0,176 mMol) BOC-D-OAIa-Tyr-Ser-Met-Glu(OBu')-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC)-Pro-VaI-GIy · HCl, 0,400 g (0,176 mMol) Lys(BOC)-Lys(BOC)-Arg-Arg-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr(Bu')-Pro-Asp(OBuO-PrO-ASp(OBuO-AIa-GIy-GIu(OBuO-OBu' · 3 HCI und 0,281 g (1,05 mMol) PCPOH werden in 3,3 ml Dimethylformamid gelöst und der Lösung nacheinander 0,025 ml (0,18 mMol) Triäthylamin und 0,074 g (0,36 mMol) DCC zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird bei Zimmertemperatur 2 Tage lang stehen gelassen, dann das DCU abfiltriert und das Filtrat mit 30 ml Äther verdünnt. Der ausgeschiedene Niederschlag wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und dann getrocknet. Das Hydrochlorid des geschützten substituierten Oktakosapeptides wird in einer Ausbeute von 0,647 g (87,5%) erhalten. Schmelzpunkt: 166-167°C. Rr =0,25. C₉₅H₃I₃N₄₄CUgS (4196,32).

Beispiel 4

OSer-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-

Tyr- Pro-Asp-Ala-Gly-Glu

J5 0,600 g (0,142 mMol) BOC-OSer-Tyr-Ser-Met-Glu(OBu')-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Arg-Arg-Pro-Val-Lys(BOC)- Val-Tyr(Bu')-Pro-Asp(OBuO-Ala-Gly-Glu(OBu')-

OBu' · 3 HCI werden in einem Gemisch aus 4,8 ml Trifluoressigsäure, 0,6 ml Wasser und 0,6 ml Anisol gelöst.

Die Lösung wird bei Zimmertemperatur eine Stunde stehen gelassen und dann mit 60 ml Äther verdünnt.

wiru auiiiiiicrt, um

Lsci auagcscüicucnc

Äther gewaschen und über Phosphorpentoxyd und Kaliumhydroxyd im Vakuum getrocknet. 0,400 g (65%) Trifluoracetat des substituierten Oktakosapeptides werden erhalten.

Das rohe Trifluoracetat wird in 8 ml Wasser gelöst, und die Trifluoracetationen werden mittels Acetationenaustuascherharz Dowex® 1 χ 8 gegen Acetationen ausgetauscht. Die auf diese Weise erhaltene Lösung, die das Acetat des Oktakosapeptides enthält, wird auf eine mit Ionenaustauscher aus Carboxymethylcellulose gefüllte Säule aufgebracht und mit einem aus 0,01 m (pH 4,5) und 0,4 m (pH 6,7) Ammoniumacetatpuffer bereiteten linearen Puffergradienten eluiert Die den gewünschten Stoff enthaltenden Fraktionen werden gesammelt und Iyophilisiert Es werden 0,240 g (414%) Oktakosapeptid erhalten, dessen Peptidgehalt nach UV-Absorptionsmessungen 81,6% beträgt Gehalt an Met-Sulfoxyd: 4,4%. Verhältnis Tyr : Trp=2,13. Aminosäureanalyse: Lys 332 (4), His 1,00 (1), Arg 3,15 (3), Asp 039 (1), Ser 0,83 (1), GIu 134 (2), Pro 3,00 (3), GIy 3,05 (3), AIa 1,04 (1), VaI 232 (3), Met 0,79 (1), Tyr 1,83 (2), Phe 037(1)-

Das als Ausgangsstoff verwendete Trihydrochlorid des geschützten substituierten Oktakosapeptides wird in folgender Weise hergestellt:

Schritt 1

tert.-Butyloxycarbonyl-L-Ä-aminooxy-/?-benzy!oxypropionsäure

48,4 g (0,364 Mol) tert.-Butyloxycarbonyl hydroxylamin, 40,7 g (0,728 Mol) Kaliumhydroxyd und 94,0 g (0,364 Mol) DL-a-Brom-ß-benzyloxypropionsäure werden in 360 ml Wasser gelöst. Das Reaktionsgemisch wird bei Zimmertemperatur 3 Stunden lang gerührt, dann der pH-Wert auf 3 eingestellt und die Lösung dreimal mit 720 ml Äther ausgeschüttelt. Die ätherische Lösung wird mit 720 ml Wasser ausgeschüttelt, dann getrocknet und mit 78 ml (0,40 Mol) Dicyclohexylamin versetzt. Das erhaltene Dicyclohexylaminsalz der tert.-

ButyOxycarbonyl-DL-a-aminooxy-jS-benzyloxypropionsäure (43,61g, Schmp. 144—146⁰C) wird in 500 ml Ät.ier suspendiert und fünfmal mit 100 ml 0,2 η Schwefelsäure ausgeschüttelt. Die ätherische Lösung wird getrocknet und dann zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in /00 mi Äthanol gelost, der Lösung werden 6,56 g (48,5 mMol) ( + )-Amphetaminbase zugesetzt. Die Lösung wird über Nacht an einem kühlen Ort stehen gelassen, die ausgeschiedenen Kristalle werden anderntags abfiltriert. Zusammen mit dem durch Eindampfen der Mutterlauge gewonnenen Produkt werden 9,33 g (16,5%) tert.-Butyloxycarbonyl-L-aaminooxy-jS-benzyloxypropionsäure erhalten. Schmelzpunkt: 95-97°C, [«]?-36° (C= 1. Äthanol), C₁₅H₂₁NO₆ (311,34).

Schritt 2

tert.-Butyloxycarbonyl-L-a-aminooxy-/S-hydroxy-propionsäure (BOC-OSer)

5,0 g (16,1 mMol) L-tx-tert.-Butyloxycarbonyl-amiciooxy-jS-benzyloxypropionsäure werden in 100 ml Methanol gelöst und in Gegenwart eines 10%igen Palladium-Aktivkohle-Katalysators hydriert. Nach 3 Stunden wird der Katalysator abfiltriert, das nach dem Abdestillieren des Methanols verbleibende öl wird unter Petroläther stehen gelassen. Die Substanz kristallisiert innerhalb einiger Stunden aus. Nach Filtrieren und anschließe,, dem Trocknen werden 3.2 g (90^c'o) L-a-tert.-Butyloxycarbonyl-/?-hydroxypropionsäure erhalten, die bei 94-95°C schmilzt. Rf =0,27. C₈H₁₅NO₆ (221,22).

Schritt 3
BOC-OSer-Tyr-Ser-Met-N₂H₃

2,2 g (10 mMol) BOC-OSer und 4,50 (10 mMol) Tyr-Ser-Met-OCH₃ ■ HCl werden in 15 ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird auf 0° C gekühlt und mit 1,11 ml (10 mMol) N-Methylmorpholin, danach mit 1,90 g (9,2 mMol) DCC versetzt Das Reaktionsgemisch wird bei 0⁰C eine Stunde lang gerührt und über Nacht bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Danach wird das DCU abfiltriert, das Filtrat eingedampft und der Rückstand in 200 ml Essigester gelöst Die Lösung wird zweimal mit 100 ml η Salzsäure, zweimal mit 100 ml 8%iger Natriumhydrogencarbonatiösung ausgeschüttelt getrocknet und schließlich eingedampft Der Rückstand (3,7 g geschützter substituierter Tetrapeptidester) wird in 40 ml Methanol gelöst mit 1,0 ml (20,4 mMol) Hydrazinhydrat versetzt und bis zum nächsten Tage bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Anderntags wird das Methanol abdestilliert, der Rückstand mit Essigester verrieben, abfiltriert, mit Essigester und Äther gewaschen und über konzentrierter Schwefel-

säure getrocknet. Man erhält das Hydrazid des substituierten geschützten Tetrapeptides in einer Ausbeute von 2,5 g (44%). Schmelzpunkt: 141°C, Rf =0,30.

Analyse C₂₅H₄₀N₆O₁₀S (616,69):

Berechnet: C 48,7, H 6,55, N 13,6Vo; gefunden: C 48,3, H 6,7, N 13,3%.

ίο Schritt 4

BOC-OSer-Tyr-Ser-Met-GluiOBu'J-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly · HCI

ι-, 0,274g (0,446 mMol) BOC-OSer-Tyr-Ser-Met-N₂H₃ werden in 3,2 ml Dimethylformamid gelöst. Zu der auf

— 20⁰C gekühlten Lösung werden unter Rühren zuerst 0,41 ml (1,8 mMol) 4,4 η salzsaurer Essigester, danach 0,07 ml (0,59 mMol) tert.-Butylnitrit getropft. Das Reaktionsgemisch wird bei -iÜ"C noch 5 Minuten nachgerührt, dann auf -2O⁰C abgekühlt und eine Lösung von 0,600 g (0,438 mMol) Glu(OBu')-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly und 0,31 (1,8 mMol) Diisopropyläthylamin in 5 ml Dimethylformamid zugegeben.

Das Reaktionsgemisch wird bei einer Temperatur von

— 5 bis 0⁰C eine Stunde lang gerührt und dann bis zum nächsten Tag bei 0⁰C stehen gelassen. Anderntags wird die Lösung eingedampft und der Rückstand mit 8%iger Natriumhydrogencarbonatiösung verrieben. Nach FiI-trieren, Waschen mit Wasser und anschließendem Trocknen erhält man 0,69 g (79%) geschütztes substituiertes Tetradekapeptid. Aus 1 ml konzentrierter Salzsäure und 1 ml Pyridin wird eine Pyridinhydrochloridlösung bereitet und diese zu dem in 5 ml Methanol suspendierten geschützten Tetradekapeptid gegeben. Die auf diese Weise erhaltene Lösung wird mit 50 ml Wasser verdünnt. Der sich abscheidende Niederschlag wird abfiltriert, mit Wasser gewaschen und dann getrocknet. Man erhält das Hydrochlorid des geschützten substituierten TetradrAapeptides in einer Ausbeute von 0,471g (54%). Schmelzpunkt: 198-202°C, Rf =0,16. C₉IH₁₃₄N₂₁O₂₅ClS (1989,68).

Schritt 5

BOC-OSer-Tyr-Ser-Met-Glu(OBu')-His-Phe-Arg-

TrP-GIy-LyS(BOC)-PrO-VaI-GIy-LyS(BOC)-Lys(BOC)-Arg-Arg-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr(Bu·)-Pro-AspiOBuO-Ala-Gly-GluiOBu'J-OBu·

0350 g (0,176 mMol) BOC-OSer-Tyr-Ser-Met-Glu(OBu')-His-Phe-Arg-Trp-GIy-Lys(BOC)-Pro-VaI-GIy · HCl, 0,400 g (0,176 mMol) Lys(BOC)-Lys(BOC)-Arg-Arg-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr(Bu<)-Pro- ASp(OBu')-AIa-GIy-GIu(OBu¹J-OBu¹ · 3 HCl und 0,281 g (1,05 mMol) PCPOH werden in 33 ml Dimethylformamid gelöst und der Lösung zuerst 0,025 ml (0,18 mMol) Tiräthylamin, dann 0,074 g (0,36 mMol) DCC zugesetzt Das Reaktionsgemisch wird bei Zimmertemperatur 2 Tage lang stehen gelassen, danach wird das DCU abfiltriert und das Filtrat mit 30 ml Äther verdünnt Das ausgefällte Produkt wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und danach getrocknet Man erhält das Trihydrochlorid des substituierten geschützten Oktakosapeptides in einer Ausbeute von 0,659 g (88,5%). Schmelzpunkt: 160-166⁰C, R? =0,22. (421233).

Beispiel 5

D-OSer-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-GIy-

Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-

Val-Tyr-Pro-Asp-AIa-GIy-GIu

0,600 g (0,142 mMol) BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met-GluiOBu'J-His-Phe-Arg-Trp-Gly-LystBOC)-Pro-VaI-GIy-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Arg-Arg-Pro-Val-Lys(BOC)-

Val-Tyr(Bu')-Pro-ASp(OBuO-AIa-GyI-GIu(OBu¹)-OBu¹ ■ 3 HCl werden in einem Gemisch aus 4,8 ml Trifluoressigsäure, 0,6 ml Wasser und 0,6 ml Anisol gelöst Die Lösung wird bei Zimmertemperatur eine Stunde lang stehen gelassen und dann mit 60 ml Äther verdrnnt Der ausgefallene Niederschlag wird abfiltriert mit Äther gewaschen und schließlich über Phosphorpentoxyd und Kaliumhydroxyd im Vakuum getrocknet Das Trifluo.-aoetat des substituierten Oktakosapepüdes wird in einer Ausbeute von 0,533 g (86,5%) erhalten.

Das rohe Trifluoracetat wird in 10 ml Wasser gelöst und die Trifluoracetationen werden mit Acetataustauscherharz Dowcx* 1 χ 8 gegen Acetationcn ausgetauscht Die erhaltene Lösung, die das Acetat des substituierten Oktakosapeptides enthält wird auf eine mit Ionenaustauscher aus Carboxymethylcellulose gefüllte Säule aufgebracht und mit einem aus 0,01 m (pH 4,5) und 0,4 m (pH 6,7) Ammoniumacetatpuffer bereiteten linearen Puffergradienten eluiert Die den gewünschten Stoff enthaltenden Fraktionen werden gesammelt und lyophilisiert Man erhält 0,250 g (43%) Oktakosapeptide, das nach UV-Absorptionsrnessungen 81,0% Peptid enthält Gehalt an Met-Sulfoxyd: 4,4%. Verhältnis von Tyr:Trp=2,05. Aminosäureanalyse: Lys 3,76 (4), His 0,8 (1), Arg 3,05 (3), Asp 1,00 (1), Ser 0,73 (1), GIu 134 (2), Pro 3,00 (3), GIy 2,95 (3), AIa 1,05 (1), VaI 2,82 (3), Met 0,78 (l),Tyr 1,6 (2), Phe 0,83(1).

Das als Ausgangsstoff verwendete Trihydrochlorid des geschützten substituierten Oktakosapeptides wird auf folgende Weise hergestellt:

Schritt 1

tert-Butyloxycarbonyl-D-ix-aminooxy-/?-benzyloxy-propionsäure

Das gemäß Schritt 1 des Beispieles 4 gewonnene (+)-Amphetaminsalz der tert-Butyloxycarbonyl-D-aaminooxy-0-benzyloxypropionsäure wird aus Äthanol umkristallisiert. Ausbeute: 13,27 g, Schmelzpunkt: 188— 191°C [α]? = +54° (c=0,5, Methanol). Durch die auf übliche Weise durchgeführte Zersetzung des Salzes werden 7,9 g (14%) tert-Butyloxycarbonyl-D-a-aminooxy-0-benzyloxypropionsäure erhalten. Schmelzpunkt: 96-98°C, [«]? = +38° (C= 1, Äthanol).

55

Schritt 2

tert-Butyloxycarbonyl-D-A-aminooxy-0-hydroxypropionsäure (BOC-D-OSer)

5,5 g (17,7 mMol) D-ix-tert-Butyloxycarbonyl-aminooxy-/J-benzyloxypropionsäure werden in 110 ml Methanol gelöst und in Gegenwart von 2,75 g 10%igem PaIIadium-Aktivkohle-Katalysator hydriert. Nach drei Stunden wird der Katalysator abfiltriert und das nach dem Abdestillieren des Methanols zurückbleibende öl unter Petroläther stehen gelassen. Die Substanz kristallisiert innerhalb einiger Stunden aus. Nach Filtrieren und anschließendem Trocknen werden 3,65 g (96%) D-«-tert-Butyloxycarbonyl-aminooxy-0-hydroxypropionsäure

erhalten. Schmelzpunkt: 94—95°C, Rf =0,27. C₈H isNO, (221,22).

Schritt 3
BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met-N₂H₃

4,4 g (20 mMol) BOC-D-OSer und 9 g (20 mMol) Tyr-Ser-Met-OCH3 werden in 30 ml Dimethylformamid gelöst Die Lösung wird auf 0⁰C abgekühlt und mil 2,22 ml (20 mMol) N-Methylmorpholin, dann mit 3,8 g (18,4 mMol) DCC versetzt Das Reaktionsgemisch wird eine Stunde lang bei 0^cC gerührt dann bei Zimmertemperatur bis zum anderen Tage stehen gelassen. Das DCU wird abfiltriert, das Filtrat eingedampft und der Rückstand in 400 ml Essigester gelöst Die Lösung wird zweimal mit je 200 ml η Salzsäure, zweimal mit je 200 ml 8%iger Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen, dann getrocknet und eingedampft Die als Rückstand erhaltenen 8,10 g Ester des geschützien substituierten Tetrapeptides werden in 85 ml Methanol gelöst mit 2,2 ml (46 mMol) Hydrazinhydrat versetzt und bei Zimmertemperatur bis zum nächsten Tage stehen gelassen. Anderntags wird das Methanol abdestilliert der Rückstand wird mit Essigester verrieben, abfiltriert mit Essigester und Äther gewaschen und schließlich über konzentrierter Schwefelsäure getrocknet Man erhält 7,21 g (63%) Hydrazid des geschützten substituierten Tetrapeptides. Schmelzpunkt: 174— 175° C (aus Wasser umkristallisiert). Rf =030.

Analyse C₂₅H₄₀N₆O₁₀S (616,69):

Berechnet: C 48,7, H 6,55, N 13,6%;
gefunden: C 483, H 6,6, N 13,8%.

Schritt 4

BOC-D-SOer-Tyr-Ser-Met-GIufOBuO-His-Phe-Arg-Trp-GyI-Lys(BOC)-Pro-Val-Giy · HCI

1,25 g (2,13 mMol) BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met-N₂H₃ werden in 15 ml Dimethylformamid gelöst und zu der auf -20° C gekühlten Lösung unter Rühren 2,08 ml (832 mMol) 4 η salzsaurer Essigester, danach 032 ml (2,70 mMol) tert-Butylnitrit getropft. Das Reaktionsgemisch wird bei —10° C 5 Minuten lang gerührt, dann auf -20°C gekühlt und die Lösung von 2,78 g

Glu(OBu')-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC)-Pro-Val-GIy und 1,4 ml (8,13 mMol) Diisopropyläthylamin in 23 ml Dimethylformamid zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird bei einer Temperatur von —5 bis O⁰C eine Stunde lang nachgerührt und bei 0°C bis zurr, nächsten Tage stehen gelassen. Die Lösung wird eingedampft, der Rückstand mit 8%iger Natriumhydrogencarbonatlösung verrieben und abfiltriert. Nach Waschen und Trocknen erhält man 3,49 g (94%) geschütztes substituiertes Tetradekapeptid. Dieses wird in 24 ml Methanol suspendiert und mit einer aus 4,75 ml konzentrierter Salzsäure Und 4,75 ml Pyfidin bereiteten Pyridinhydrochloridlösung versetzt. Die erhaltene Lösung wird mit 240 ml Wasser verdünnt, der ausgefallene Niederschlag abfiltriert, mit Wasser gewaschen und dann getrocknet. Man erhält das Hydrochlorid des geschützten Tetradekapeptides in einer Ausbeute von 2,95 g (73%). Schmelzpunkt: 200-202°C, Rf =0,25.

(1989.68).

030 251/132

Schritt 5

BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met-GIu(OBu-)-His-Phe-Arg-Trp-Gly-LysfBOQ-Pro-Val-Gly-LystBOC)-

Lys(BOC)-Arg-Arg-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr(Bu<)-Pro-ASP(OBuO-AIa-GIy-GIu(OBuO-OBu¹

0350 g (0,176 mMol) BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met-GIu(OBu')-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC)-Pro-Val-GIy - HCl, 0,400 g (0,176 mMol) Lys(BOC)-Lys(BOC)-

Arg-Arg-Pro-VaI-LyS(BOC)-VaI-TyT(Bu¹J-PrO-ASP(OBuO-AIa-GIy-GIu(OBuO-OBu¹ · 3 HCI und 0,281 g (1,05 mMol) PCPOH werden in 3,3 ml Dimethylformamid gelöst und der Lösung 0,025 ml (0,18 mMol) Triäthylamin, danach 0,74 g (036 mMol) DCC zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird bei Zimmertemperatur 2 Tage lang stehen gelassen, dann das DCU abfiltriert und das Filtrat mit 30 ml Äther verdünnt. Das ausgefällte Produkt wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und anschließend getrocknet. Das Trichlorid des geschützten substituierten Oktakosapeptides wird in einer Ausbeute von 0,673 g (90,7%) erhalten. Schmelzpunkt: 158-162°C, Rf =0,25. C₁₉₅H₃I₃NmO₅₀CI₃S (421233).

Beispiel 6

D-OSer-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-GIy-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr- Pro-Asn-Gly-Ala-Glu-Asp-GIu-Ser-AIa

1,00 g (0,214 mMol) BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met-Glu(OBuO-His-Phe-Arg-Trp-GIy-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Arg-Arg-Pro-Val-Lys(BOC)-VaI-TyT(Bu¹)-Pro-ASn-GIy-AIa-GIu(OBuO-ASp(OBu¹)-GIu(OBuO-Ser-AIa-OBu' · 3 HCl werden in einem Gemisch aus 8 ml Trifluoressigsäure, 1 ml Wasser und 1 ml Anisol gelöst. Die Lösung wird bei Zimmertemperatur eine Stunde lang stehen gelassen, und dann mit 200 ml Äther verdünnt. Der ausgeschiedene Niederschlag wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und im Vakuum über Phosphorpentoxyd und Kaliumhydroxyd getrocknet. Das Trifluoracetat des substituierten Dotriakontapeptides wird in einer Ausbeute von 0,90 g (88%) erhalten. Das rohe Trifluoracetat wird in 20 ml Wasser gelöst, und die Trifluoracetationen werden mittels Acetationenaustauscherharz Dowex* 1 χ 8 gegen Acetationen ausgetauscht. Die erhaltene Lösung, die das Acetat des substituierten Dotriakontapeptides enthält, wird auf eine mit Ionenaustauscher aus Carboxymethylcellulose gefüllte Säule aufgebracht und mit einem aus 0,01 m (pH 4,5) und 0,4 m (pH 6,7) Ammoniumacetatpuffer bereiteten linearen Puffergradienten eluiert. Die den gewünschten Stoff enthaltenden Fraktionen werden gesammelt und lyophiiisiert. Es werden 0,46 g (46%) substituiertes Dotriakontapeptid erhalten.

Das als Ausgangsstoff verwendete Trichlorid des geschützten substituierten Dotriakontapeptides kann auf folgende Weise hergestellt werden:

Schritt 1
Z-Glu(OBuO-Ser-Ala-OBu'

23,9 g (100 mMol) Z-Ser und 14,5 g (100 mMol) AIa-OBu¹ werden in 150 ml Methylenchlorid gelöst, die Lösung auf — 10⁰C gekühlt und bei dieser Temperatur 20,6 g (100 mMol) DCC in 100 ml Methylenchlorid zugetropft. Das Reaktionsgemisch wird bei O⁰C zwei Stunden lang gerührt und dann bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Anderntags wird das ausgeschiedene DCU abfiltriert und das Filtrat mit 3 χ 70 ml η Salzsäure und 3,70 ml 5%iger Natriumhydrogencarbonatlösung ausgeschüttelt. Die Methylenchloridphase wird nach dem Trocknen eingedampft, der ölige Rückstand mit 50 ml Essigester aufgenommen und die Lösung bei O⁰C 4 Stunden lang stehen gelassen. Das ausgeschiedene DCU wird abfiltriert, das Filtrat eingedampft und der ölige Rückstand mit η-Hexan verfestigt 30,0 g (82%) rohes Z-Ser-AIa-OBu¹ werden erhalten. Das Produkt wird in 600 ml Methanol gelöst und in Gegenwart von

ίο 2 g 10%igem Palladium-Aktivkohle-Katalysator hydriert Nach Beendigung der Reaktion wird der Katalysator abfiltriert und die Lösung eingedampft Das erhaltene Ser-Ala-OBu¹ wird in 200 ml Essigester gelöst und mit 33,0 g (76 mMol) Z-GIu(OBuO-ONSu zur Reaktion gebracht Am nächsten Tage wird das Reaktionsgemisch dreimal mit je 50 ml η Salzsäure und dreimal mit je 50 ml Natriumhydrogencarbonatlösung ausgeschüttelt Die Essigesterphase wird getrocknet eingedampft und der Rückstand mit Petroläther verrieben. Das rohe Produkt wird aus einem Gemisch aus Essigester und Petroläther umgefällt 314 g (75%) Z-G!u(OBuO-Scr-AIa-OBu¹ werden gewonnen, das bei 72—74° C schmilzt Rf = 0,6.

Analyse C27H41N3O9 (551,84):

Berechnet: C 58,8, H 7,5, N 7,65%;
gefunden: C 58,8, H 7,7, N 7,8%.

Schritt 2
GIu(OBuO-Ser-AIa-OBu'

16,0 g (29 mMol) Z-Glu(OBuO-Ser-Ala-OBu· werden in 350 ml Methanol gelöst und in Gegenwart von 1,6 g 10%igem Palladium-Aktivkohle-Katalysator hydriert Nach Beendigung der Reaktion wird der Katalysator abfiltriert, das Lösungsmittel abdestilJiert und der Rückstand aus einem Gemisch von Methanol und Äther umkristallisiert Man erhält 9,06 g (75%) Tripeptid, das bei 135-136°C schmilzt. Rf =0,15. [α]_ο=-25,9^ο (c-l,

Äthanol).

Analyse Ci₉H₃₅N₃O₇ (417,80):

Berechnet: C 54,6, H 8Λ N 10,1%;
gefunden: C 54,5, H 8,4, N 9,8%.

Schritt 3
Z-AspfOBuO-GluiOBuO-Ser-Ala-OBu¹

8,2 g (19,6 mMol) GIu(OBuO-SeT-AIa-OBu¹ und 8,0 g (19,0 mMol) Z-Asp(OBuO-ONSu werden in 80 ml Essigäthylester zur Reaktion gebracht. Am nächsten Tage wirci das Reaktionsgemisch dreimal mit je 20 ml η Salzsäure und dreimal mit je 20 ml 5%iger Natriumhydrogencarbonatlösung ausgeschüttelt. Die Essigesterphase 3> wird getrocknet und eingedampft, der Rückstand mit Petroläther verrieben. Der Ester des geschützten Tetrapeptides wird in einer Ausbeute von 12,08 g (85,5%) erhalten. Schmelzpunkt: 85-87°C, Rf = 0,55.

Analyse C₃₅H₅₄N₄Oi₂ (722,81):

Berechnet: N 7,3%;
gefunden: N 7,8%.

Schritt 4
Asp(OBuO-GIu(OBuO-Ser-Ala-OBu^l

10,5 g (14,5 mMol) Z-ASp(OBuO-GIu(OBuO-SCr-AIa-OBu¹ werden in 130 ml Methanol gelöst und in Gegen-

wart von 1 g 10%jgem Palladium-Aktivkohle-Katalysator hydriert Nach Beendigung der Reaktion wird der Katalysator abfiltriert, die Lösung eingedampft und der Rückstand mit Petroläther auf ein Filter aufgebracht 835 g (97,5%) Tetrapeptidester werden erhalten. Schmelzpunkt: 80-81°C, Rf=O₁I, [«]_D= -243° ^= 1, Äthanol). C₂₇H₄₈N₄O)₀ (588,68).

Schritt 5
Z-GIu(OBu')-Asp(OBu')-GIu(OBu·)-Ser-AIa-OBu·

5,0 g (11,5 mMol) Z-G!u(OBu')-ONSu und 6,60 g (1U mMol) Asp(OBu')-GIu(OBu')-Ser-AIa-OBu' werden in 100 ml Chloroform zur Reaktion gebracht Das Reaktionsgemisch wird am nächsten Tage dreimal mit je 30 ml η Salzsäure und dreimal mit je 30 ml 5%iger Natriumhydrogencarbonatlösung ausgeschüttelt Die Chloroformphase wird getrocknet und eingedampft der gelartige Rückstand mit Petroläther verrieben. Das rohe Produkt wird «*js einem Gemisch von Essigester und Petroläther umgefällt Man erhält den Ester des geschützten Pentapeptides in einer Ausbeute von 8,45 g (83%). Schmelzpunkt: 168-169°C, Rf=OA [«]o= -29,0° fc= 1, Äthanol).

Analyse C₄₄H₆₉N₅O₁₅ (908,07):

Berechnet: C 58,2, H 7,7, N 7,7%;
gefunden: C 58,4, H 7,7, N 7,5%.

Schritt 6
GIu(OBu')- Asp(O3u')-GIu(OBu')-Ser-Ala-OBu'

8,0 g (8,8 mMol) Z-Glu(OBtfj-Asp(Gflu')-Glu(OBu')-Ser-Ala-OBu¹ werden in 160 ml Methanol gelöst und in Gegenwart von 1,0 g 10%igem Palladiu.-1-Aktivkohle-Katalysator hydriert. Nach Beendigung der Reaktion wird der Katalysator abfiltriert die Lösung eingedampft und der gelartige Rückstand mit einem Gemisch aus Äther und Petroläther auf ein Filter aufgebracht Man erhält 6,40 g Pentapeptidester, der bei 136— 138°C schmilzt Rf=O₁I, [«]_D=--29,7° (c=\, Äthanol), C₃₆H₆₃N₅O₁₃ (773,94).

Schritt 7
Z-AIa-GIu(OBu')-Asp(OBu')-Glu(OBu')-Ser-Ala-OBu'

5,20 g (6,7 mMol) GIu(OBu')-Asp(OBu')-Glu(OBu·)-Ser-Ala-OBu' werden in 50 ml Chloroform mit 2,15 g (6,7 mMol) Z-AIa-ONSu zur Reaktion gebracht. Das Reaktionsgemisch wird am nächsten Tage dreimal mit je 10 ml η Salzsäure und dreimal mit je 10 ml 5%iger Natriumhydrogencarbonatlösung ausgeschüttelt. Die Chloroformlösung wird getrocknet und eingedampft, der gelartige Rückstand wird mit Petroläther verrieben. Man erhält den Ester des geschützten Hexapeptides in einer Ausbeute von 6,10 g (93%). Schmelzpunkt: 194— 195°C, Rf=OA [a]_D=-30,9° (c=\, Äthanol), C₄₇H₇₄N₆Oi₆ (979,14).

Schritt 8
AIa-GIu(OBu')-Asp(OBu')-Glu(OBu')-Ser-Ala-OBu'

6,10 g (6,2 mMol) Z-Als-Glu(OBu')-Asp(OBu<)-Glu(OBu')-Ser-AIa-OBu' werden in 120 ml Methanol gelöst und in Gegenwart von 1,0 g 10%igem Palladium-Aktivkohle-Katalysator hydriert. Nach Beendigung der Reaktion wird der Katalysator abfiltriert, die Lösung eingedampft und der kristalline Rückstand aus einem

Gemisch von Äthanol und Äther umkristallisiert Es werden 4,35 g (83%) Hexapeptidester erhalten, der bei 192-194°C schmilzt Rf =0,25, Rf =0,1, Rf =0,65.

Analyse Cj₉H₆SN₆O)₄ (845,00):
Berechnet: C 55,4, H 8,1, N 9,9%; gefunden: C 55,2, H 7,8, N 9,6%.

Schritt 9

Z-ASn-GIy-AIa-GIu(OBu')-Asp(OBu')-Ser-Ala-OBu'

2,45 g (133 mMol) PFPOH, 131 g (4,02 mMol) Z-Asn-

GIy und 3,40 g (4,02 mMol) Ala-Glu(OBu')-Asp(OBu')-GIu(CBu¹J-SCr-AIa-OBu' werden in 24 ml wasserfreiem Dimethylformamid gelöst die Lösung auf 0⁰C

Dimethylformamid gelöst die Lösung auf 0⁰C abgekühlt und mit 0,915 g (4,43 mMol) DCC versetzt. Das Reaktionsgemisch wird eine halbe Stunde lang bei 0⁰C, dann zweieinhalb Stunden lang bei Zimmertemperatur gerührt Das ausgeschiedene DCU wird abfiltriert und die Lösung eingedampft Der feste Rückstand wird mit Essigester verrieben und abfiltriert Das rohe Produkt wird mit 20 ml Essigester gekocht und auf dem Filter zweimal mit 10 ml heißem Essigester gewaschen. Man erhält den Ester des geschützten Oktapeptides in einer Ausbeute von 4,12 g (89%). Schmelzpunkt: 200—201⁰C,

Rf =0,60. C₅₃H₈₃N₉Oi₉ (115030).

Schritt 10

Asn-Gly-Ala-GIu(OBu')-Asp(OBu')-Glu(OBu·)-Ser-AIa-OBu'

4,0 g (3,48 mMol) Z-Asn-Gly-Ala-GIu(OBu')-Asp(OBu')-Ser-Ala-OBu' werden in 140 ml Methanol gelöst und in Gegenwart von 0,5 g 10%igem Palladium-Aktivkohle-Katalysator hydriert. Nach Beendigung der Reaktion wird der Katalysator abfiltriert, die Lösung eingedampft und der Rückstand mit Äther verrieben. Es werden 3,40 g (96%) Oktapeptidester erhalten, der bei 188-190-C schmilzt. Rf = 0,5,[<x]_D= -6,6° (c= 0,89, Dimethylformamid). C₄₅H₇₇N₉Oi₇ (1016,17).

Schritt 11

Z-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Arg(NO₂)-Arg(NO₂)-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr(Bu')-Pro-Asn-Gly-Ala-Glu(OBu')-5" Asp(OBu')-Glu(OBu')-Ser-Ala-OBu^l

3,0 g (2,95 mMol) Asn-Gly-Ala-GIu(OBu')-Asp(OBu')-Glu(OBu')-Ser-Ala-OBu' und 5,46 g (2,95 mMol) Z-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Arg(NO₂)-Arg(NO₂)-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr(Bu')-Pro (ungarische Patentschrift Nr. 1 55 254) werden in 33 ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird auf O⁰C gekühlt, und es werden 3,35 g (4,42 mMol) DCC-PFPOH-Komplex [J. Koväcs u. a.: J. Am. Chem. Soc. 89, 183 (1967)] zugegeben. Das

bo Reaktionsgemisch wird 15 Minuten lang bei 0^cC gehalten, danach bei Zimmertemperatur sechs Stunden lang stehen gelassen. Das ausgeschiedene DCU wird abfiltriert und das Filtrat in 450 ml wasserfreien Äther eingegossen. Die erhaltene Suspension wird bis zum nächsten Tage an einem kalten Ort stehen gelassen und dann filtriert. Das rohe Piodukt wird aus Methanol und Essigester umgefällt. Es werden 7,18 g (85,1%) Ester des geschützten Oktadekapeptides erhalten. R}=0,35,

O]₀= -26,4°

l'e=0,42,

Chi H₂HNmO,,,, (2849,34).

Dimethylformamid), [λ]₀=-26,Γ

Schritt 12

LysiBOq-LystBOQ-Arg-Arg-Pro-Val-LysiBOQ- ^s Val-TyrfBu')-Pro-Asn-GIy-AIa-Glu(OBu')-Asp(ÖBu')-GIu(OBu')-Ser-Ala-OBu·

6,5 g (2 2S mMol) Z-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Arg(N0₂)-ArgiNO^-Pro-Val-LysiBOCJ-Vai-TyriBuO-Pro-Asn- Gly-Ala-Glu(OBu')-Asp(OBu')-Glu(OBu')-Ser-Ala-OBu' werden in 85 ml Essigsäure gelöst und in Gegenwart von 2 g 10%igem Palladium-Aktivkohle-Katalysator hydriert Nach Beendigung der Reaktion wird der Katalysator abfiltriert, die Lösung eingedampft und der ölige Rückstand mit wasserfreiem Äther verrieben. Nach dem Filtrieren wird das erhaltene Acetat des Oktadekapeptidester in 70 ml Wasser gelöst Die Lösung wird mit verdünnter Salzsäure auf pH 4 eingestellt und das Hydrochlorid des Oktadekapeptidesters mit 30%!ger Natriumchloridlösung ausgefällt Das Produkt wird abfiltriert, in einem Gemisch ve; Äthanol und Chloroform gelöst, die Lösung filtriert, eingedampft und der Rückstand mit Äther verrieben. Das Trihydrochlorid des Oktadekapeptidesters wird in einer Ausbeute von 5,6 g (89,5%) erhalten. Rf =0,35,

(c=U
(2734,60),

Schritt 13

Dimethylformamid).

BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met-Glu(OBu')-His-Phe-Arg-

TrP-GIy-LyS(BOC)-PrO-VaI-GIy-LyS(BOc)-LyS(BOC)-Arg-Arg-Pro-Val-Tyr(Bu^l)-Pro-Asn-GIy-Ala-

GluiOBu'J-AspiOBu'J-GluiOBuO-Ser-Ala-OBu'

0,525 g (0,264 mMol) BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met-

Glu(OBu')-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC)-Pro-VaI-

GIy · HCI und 0,720 g (0,264 mMol) Lys(BOC)-Lys(BOC)-Arg-Arg-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr(Bu <)-

PrO-ASn-GIy-AIa-GIu(OBuO-ASp(OBUt)-GiU(OBu¹)-

Ser-AIa-OBu' · 3 HCI werden in 4,OmI Dimethylformamid gelöst und der Lösung 0,03 ml (0,270 mMol) N-Methylmorpholin, danach 0,23 g (0,40 mMol) DCC-PFPOH-Komplex zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird bei Zimmertemperatur 2 Tage stehen gelassen. Das DCU wird abfiltriert und das Filtrat mit 40 ml Äther verdünnt. Das ausgefällt? Produkt wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und anschließend getrocknet Das Trichlorid des geschützten, substituierten Dotriakontapeptides wird in einer Ausbeute von 1,10 g (89%) erhalten. Schmelzpunkt: 182-186°C, R? =0,27. CHNOClS (4669,77).

Claims (4)

Patentansprüche:

1. Peptide mit einer von der N-terminalen Aminosäure bis wenigstens zur 16. Aminosäure vollständigen ACTH-Sequenz, die in jedem Falle anstelle des N-terminalen Serylrestes den Rest der Aminooxyessigsäure, L- oder D-a-Aminooxypropionsäure oder L- oder D-«-Aminooxy-/?-hydroxy-propionsäure enthalten und die gegebenenfalls anstelle einzelner Aminosäurereste der ACTH-Sequenz folgende anderen Aminosäurereste enthalten können: in Position 25 Asparagyl anstelle von Asparaginyl und/oder in Position 26 Alanyl anstelle von Glycyl und/oder in Position 27 Glycyl anstelle von Alanyl, wobei den ausgetauschten Aminosäureresten die Sequenz des natürlichen menschlichen ACTH zugrunde liegt, sowie deren Säureadditionssalze und Amide.

2. Peptide nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sich ihre Aminosäure-Reihenfolge von der Sequenz des natürlichen menschlichen ACTH dadurch unterscheidet, daß sie anstelle der Asn²⁵-Gruppe eine Asp-Gruppe, anstelle der GIy²⁶-Gruppe eine Ala-Gruppe und anstelle der AIa²⁷-Gruppe eine Gly-Gnippe aufweisen.

3. Verfahren zur Herstellung der Peptide nach Anspruch 1 oder 2 sowie von deren Säureadditionssalzen oder Amiden, dadurch gekennzeichnet, daß man von Peptiden der in Anspruch 1 oder 2 genannten Art, die wenigstens an der terminalen Aminooxygruppe und den Aminogruppen der Seitenketten, gegebenenfalls auch an der terminalen Carboxylgruppe und den Carboxylgruppen der Seitenketten geschützt sind, jeweils in an sich r-> bekannter Weise die Schutzgruppen abspaltet und die erhaltenen Verbindungen gewünschtenfalls in ihre Säureadditionssalze oder Amide überführt

4. Arzneimittel, enthaltend eine Verbindung nach Anspruch 1 oder 2.