DE2341775A1 - Verfahren zur herstellung von neuen, in n-terminaler stellung alpha-aminooxysaeuren enthaltenden peptiden mit acthwirkung - Google Patents

Description

VERPAHREM ZUR HERSTELLUNG VUN NEUEN, IN N-TERMINALER STELLUNG ^ "-AMINOOXYSAUREhIENTIiALTE[JDEIi PEPTIDEH MIT ACTH-WIRiOING

Es ist bekannt, daß die Peptidkette des Adranokortikotrophermops (ACTH) geändert werden kann, ohne daß dadurch die adronokortikotrope Wirkung aufgehoben würde» So kann vom C-terrainalen finde des Moleküls mehr als ein Drittel der Arainosäurekette abgespalten werden, ohne daß ein Absinken der spezifischen Aktivität eintritt. Die Abspaltung weiterer Aminosäuren führt jedoch zu einer schlagartigen Abnahme der Aktivität. Das Fragment 1-19 verfügt über 30 % der Aktivität des Moleküls, das Fragment 1-16 demgegenüber nur über ungefähr 1 fi. Im Gegensatz dazu verursacht am N-terrainalen Ende bereits das Abspalten der ersten Aminosäure eine 50 %-ige Verringerung der Aktivität (E. Schröder, K. Lübke: The Peptides, Academia Press, New York 1966, 246-249)·

Ferner ist bekannt, daß ACTH-Fragmente, die an Stelle des N-terminalen Serins D-Aminosäuren, in der Natur nicht vorkommende Aminosäuren oder die vom Serin durch Fortlassen von dessen funktionellen Gruppen ableitbaren Acylr^tüAM (ß-Hydroxypropionyl-, PropionylrfcAMwHI) enthalten, fallweise eine Aktivität zeigen, die selbst die Wirkung des natürlichen ACTH übertrifft, da diese modifizierten ACTH-Fragmentβ - wie anzunehmen ist gegenüber den Enzymen Vera Typ der Aminopeptidase resistent sind und deshalb im Organismus langsamer abgebaut werden als das natürliche ACTH. Aus diesem Grunde zeigen sie auch dann noch eine starke ACTH-Wirkung, wenn die modifizierende Gruppe die Funktion des Serin-Teiles der natürlichen ACTH nicht vollständig zu erfüllen vermag. Von den substituierten ACTH-Peptiden dieses Typus sind durch die Arbeit Schweizer Forscher D-Serin-Derivate

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(Schweizerische Patentschriften Nr. 493 497, 46? 24b und 488 663)^ aus der Arbeit aweier japanischer Forscherkollekfclve Sarkosin-, fi-Alanin- und tC-Arainobuttersuure-Derivate (Deutsche Offenlegungsschriften Nr. 2 055 151, 2 034 698, 2 114 300, 2 124 und 2 112 553) bekannt. Die ß-Hydrox^-propionyl- und die Prepionyl-Derivate sind ebenfalls von Schweizer Forschern beschrieben werden (Französische Patentschriften Nr. 1 513 943 und 1 513 944).

Es wurde gefunden, daß es zum Erreichen einer Schutzwirkung gegenüber Enzymen außerordentlich vorteilhaft ist, wenn der N-terrainale Serinteil ia ACTH-Molekül oder in dessen Fragmenten durch t^ -Aminooxysäuren ersetzt wird. Über besonders große Aktivität verfugen die Äminooxyacetyl-p die L- und D-^t- -Aminooxypropionyl- sowie die L- und D-^)_n.-Aminooxy-ß-hydroxypropionyl-Derivate. Dies ist um so überraschender, als diese Aminosäuren - obwohl sie mit dem Glycin, Alanin und Serin strukturell nahe verwandt sind, da sie sich von diesen nur durch ein einziges, zwischen dem C^-Kohlenstoffätom und der Aminogruppe eingeschobenes Sauerstoffatom unterscheiden - in ihren chemischen und physikalischen Ei/igenschaften von den entsprechenden Aminosäuren doch beträchtlich abweichen.

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung neuer Peptide mit ACTH-Wirkung, welche aus einer von der N-terminalen bis wenigstens zur 16. Aminosäure kompletten ACTH-Sequenz bestehen, an Stelle einzelner Aminosäuren der ACTH-Sequenz jedoch gegebenenfalls andere Aminosäuren, an Stelle der ersten Aminosäure aber immer eine (%-Aminooxysäure enthalten. Die Erfindung bezieht sich ferner auf die Herstellung der Säure- -additionssalze, Derivate und Komplexe dieser Peptide.

Die erfindungsgemäßen neuen Verbindungen können zum Beispiel substituierte Peptide sein, die auf die erste Amino-

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•xysäure folgend die Sequenzielle 2-16, ab«r auch 2~3£ des natürlichen ACTH enthalt«)!. In diesen substituierten Peptiden können einzelne Aminosäuren der naturlichen Sequenz gegen andere Aminosäuren ausgetauscht sein, soweit dies nicht eine wesentliche ,Senkung der ACTH-Aktivität hervorruft. Se kaan sum Beispiel die zweite Aainosäure, das Tyrosin, gegen Phenylalanin und/oder die dritte Aminosäure, das Serin, gegen Glycin ünd/eder die vierte Aminosäure, das Methionin, ge ,yen Leucin, Norvalin, Norleucin «der ^-Aminobuttersäure und/eder die fünfte Aminosäure, die Glutaminsäure, gegen Glutamin und/oder die 15. und 16. Aminosäure, das Lysin, ge en Ornitin und/oder die 1?. und 18. Aminosäure, das Arginin, gegen Lysin oder OrnitlLn ausgetauscht sein. Diese Austauschbarkeit besteht besonders für die Sequenzteile 25-32, bezüglich welcher sich auch die verschiedenen natürlichen ACTH-Sequenzen voneinander unterscheiden. Tm Hinblick auf ihre ACTH-Wirkung sind besonders das /L- und D-OSer ,-Asp²⁵, Ala²⁶, Gly²⁷7- ^_N ¹"²⁸-ACTH und das /b-OSar¹?- ^"³²-ACTH zu erwähnen. (Die Abkürzung OSer bedeutet die 4* -Aminoexy-ß- -hydrexyprepionsäure, die sich ν·α Serin nur durch das zwischen de» t^-C-At·* und d£ej Aminoj&we; eingeschobene Sauerstoffatom unterscheidet. Ia folgenden werden die mit den Aminosäuren strukturell identischen J^-Amineexysäuren in ähnlicher Weise bezeichnet, zum Beispiel OGIy = Aainooxyessigsäure, OAIa =^- -Aminooxyprepionsäure usw.).

freiensf»-no( öle/¹

»te Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung neuer

Peptide mit ACTH-Wirkung sewie der mit Säuren gebildeten Addi-

cfeis tienssalze, ferner der Derivate und Komplexe dieser Peptide_;>w4

dadurch gekennzeichnet f»*4#^, daß aus von der N-terminalen bis wenigstens der 16. Aminosäure über eine vollständige ACTH-Se-

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quenz verfügenden, an Stelle einzelner Aminosäuren der ACTH- -Sequenz jedoch gegebenenfalls andere Arainosäui-en, an Stelle der ersten Aminosäure aber in jedem Falle eine ^k. "-Arainooxysäure enthaltenden und wenigstens an der terminalen Aminoexygruppe und an den Aminogrui^an der Seitenkette'? gegebenenfalls auch an der tominalen Carboxylgruppe lKäd an den Carboxylgruppen. der Seitenketten geschützten Peptiden die Schutzgruppen abgespalten und die erhaltenen Verbindungen gewünschtenfalls zu ihren mit Säuren gebildeten Additionssalzen, Derivaten oder Komplexen uagesetzt werden.

Die als Ausgangsstofffeverwendeton geschützten Peptide werden ausgehend von einer geschützten ^-Aminooxysäure, in an sich bekannter Weise durch Fragraentkondensation oder durch Kettenverlängerung üb jeweils eine Aminosäure hergestellt, wobei nach der Azid-, der Aktivester-, der ßCC- oder der Methede des gemischten Anhydrids gearbeitet werden, aber auch die sogenannte Synthese in fester Phase angewcmd t werden kann, bei der das Peptid mit seiner am Kettenende befindlichen Carboxylgruppe an ein Polymer gekuppelt ist und aufgebaut wird, indem die Aminosäuren und schließlich die ^jL -Aminoexysäure in der entsprechenden Reihenfelge an die an das Polymer gebundene C-terminale-Aminosäure angebaut wird«

Die funktioneilen Gruppen, die an der Reaktion nicht teilnehmen, werden zweckmäßig geschützt, und zwar durch Gruppen, die durch Hydrolyse, Acidolyse, Hydrazinolyse oder Reduktion leicht abspaltbar sind. Die Carbcxylgruppe kann zum Beispiel vorzugsweise durch Verestern Bit Methanol, tert.-Butanol, Benzylalkohol «der p-Chlorbenzylalkohol oder durch Amidbildung geschlitzt werden, zum Schütze der Arainooxy- und der Aminogruppen

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kommen in orr.ter Linie die Tosy!-, Trityl-, Formyl-, Trifluoracetyl-, o-llitrcySurfcnyl-, Phthalyl-, Bciuiyloxycarbouyl- und ρ -Chlorben -;:/loxyc--irbony l-(Jrupoo, besonders jedoch die tert,- -Butyloxycarbonylgruppc in Fr«_s;o, Die Ar;;inin-_t;uanidino-Grupp« kann vor allem durch >,io iiitro gruppe ι,-erjchützt, jedoch auch in ihrer pro tonierten Form v.'endot werden. Die Iminogruppe des Histidin^ kann vor allem durch als Bensyl-, Trityl- oder Dinitrophonylt.ruppe geschützt v/erden. Die. Hydroxyl Gruppen der SeitenkotLen wurden fallweise durch Verüthtrn geschützt, wobei vorzugsvieine rait tert.-Butanol und Benzylalkohol veräthort wird.

Durch Anwendung einer geeigneten Kombination von Schutzgruppen kann erreicht werden, daß diese Schutzgruppen in an sich bekannter '.'eise, zum Beispiel durch Hydrolyse, Acidelyse, Hydrazinolyse oder Reduktion gleichzeitig entfernt werden können«

Nach einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird so vergegangen, daß die geschützte

äure in 1-Stellung mit dem Tripeptidester Tyr-Ser-

-Met-OCH, kondensiert, aus dem erhaltenen Peptid-raethylester das Azid gebildet und axt diesem das Dekap^ptid GIu(OBu )-His~ -Phe-Arg-Trp-Giy-Iiys( BOC)-PrQ-VaI-GIy acyliert wird« Das auf diese Weise erhaltene substituierte Tetradekapeptid wird danach mit der entsprechend geschützten C-terainalen Sequenz kondensiert. Bei der Herstellung eines substituierton Hexadekapaptides wird zua Beispiel mit dem 15-16-Dipeptid, bei der Herstellung eines substituierten Oktadekapeptides rait de.a 15-18-Tetrapeptid, bei der Herstellung eines substituierten Oktakosapeptides «it de« 15-28-Tetradekapeptid, bei der ¹¹OrStOlIuHg eines sub-

Λ09809/1211 ^ßAD

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stituierten Dotriakontapeptides ait dem 15-32-Oktadekapeptid, bei der Herstellung eines substituierten lionatriakontapeptides

Pent
mit de» 15-39~ie4äfakosapeptid kondensierte Bei diesen Konden-"

sationen wird vorzugsweise das DCC-Verfahren oder die Methode

des Aktivesters angewandt. In letzteres Falls, besonders bei der Verwendung von Pentachlorphenyl- oder Pentafluorphenylester, braucht der aktive Ester nicht isoliert zu werden; er kann axt Hilfe von Pentachlorphenol oder Pentafluorphenol aus dem Substituierten Tetradekapeptid im Reaktionsgemische der Kondensationsreaktien gebildet werden, (vgl. österreichische ^patentschrift Nr. 295 051).

Eine alternative Möglichkeit zum Aufbau der als Ausgangsstoff verwendeten, in 1-Stellung inuaer eine ^K- -Aisinooxysäure enthaltenden Peptide besteht darin, daß die entsprechende C-terminals Sequenz axt dea geschlitzten 5-14-Dekapeptid acylierti die N-terainale Schutzgruppe des erhaltenen Peptides entfernt und im letzten Schritt mit deia 1-4-substituierten Tetrapeptid acyliert wird. Auf diese Weise können die als Ausgangsstoffe benötigten, in N-terutinaler Stellung eine ^-Aiainoexysäure enthaltenden-geschützten Peptide unaittelbar aus den N-terainalen Tetrapeptid -Derivaten hergestellt werden.

An Ende der Synthese werden die an der N-terminalen JLj-Aminoexygruppe und an den Aminogruppen der Seitenketten be~ findlichen tert.-Butyloxycarbonylgruppen, die an der Carboxylgruppe der Seitenketten und an der C-terainalen Carboxylgruppe - sefern diese nicht aminiert ist - befindlichen tert.-Butylestergruppen sowie die am Hydroxyl der Seitenkettafleventuell vorhandene tert.-Butyläthergruppe gleichzeitig Mittels Acido_

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lyse, vorzugsweise durch Behandeln nit Trifluoressigsäure, abgespalten. Die .{einiijung das von seinen Schutzgruppen befreiten Endproduktes kann durch Verteilung im Gegenstron oder durch Säulenchroaatographie, zum Beispiel durch Ionenaustauschchromategraphie an unterschiedlichen Carboxynethylcollulose-Arten. vorgenoraiaen werden·

Die an Sayers- und Saffran-Körpern Gemessene biologische Aktivität der in den Beispielen beschriebenen Verbindungen übertrifft in zahlreichen Füllen die Aktivität der entsprechenden, nicht durch <^. -Aainooxysüuren substituierten ACTH-Fragiaente,

Die neuen Verbindungen werden in Abhängigkeit von der bei ihrer Herstellung angewendeten Mdhode in Fora der freien Base oder des Salzes erhalten. Aus den Salzen können die Basen in an sich bekannter Veise freigesetzt werden. Die freien Basen können lait den für pharnaseutische Zi/ecke verwendbaren Säuren zu Säureadditionssalzen unbesetzt werden. Für diesen Zweck koamen anorganische Säuren, zum Beispiel Salzsäure, Schwefelsäure und Phosphorsäure, aber auch organische Säuren wie zum Beispiel Aaeisensäure, Essigsäure, höhere Fettsäuren, Milchsäure, Weinsäure, Zitronensäure usw., in Frage.

Unter Derivaten der neuen Verbindungen werden hier zum Beispiel deren Ester, Aaide, ferner die au Stickstoff unterschiedlich substituierten Amide, in erster Linie die an dar C-terainalen Carboxylgruppe aiaidierten, in der Seitenkette jedoch gegebenenfalls auch freie Carboxylgruppen enthaltenden Peptidaaide verstanden«

Unter pharmazeutisch am/endbaren Komplexen sind sdche Verbindungen der mit den erfindunGsjGuiSen Vorfahren her-

A 0 9 8 0 9 / 1 2 1 1 ^{BAD 0RIQ}'NAL

gestellten Peptide zu verstehen, die durch Zugabe gewisser anorganischer und organischer Stoffe entstehen und eine verzögerte Wirksamkeit der Peptide horverrufen. Als organische Zusatzstoffe koranen zum Beispiel gewisse Golatinearten, Carbaxyiiie thy !cellulasen, Alcinsäureestor, Polyf loi-etinphosphat, Auinosüurepolyaere oder sonstige Polymere und Copolymere in Frage, Als organische Verbindungen können die Hydroxyde bestimmter Metalle, in erster Linie das Zinkhydroxyd, sowie die schwer löslichen Salze, zum Beispiel die Phosphate und Pyrophospoate dieser Metalle,verwendet werden. Zum Erreichen einer verzögerten Yiirkung sind ferner bestimmte Silikate geeignet, die mit den Peptiden ebenfalls unlösliche Komplexe bilden, deren Struktur noch nicht geklärt ist.

Aus den itaj dem erf indungsgeraäßen Verfahren hergestellten Peptiden können zur pharmazeutischen Verwendung die üblichen pharmazeutischen Präparate hergestellt werden. Diese Präparate enthalten die erfindungsgenäßen Verbindungen zusammen mit zur enteralen ©der parenteralen Verabreichung geeigneten organischen ©der anorganischen Streckmittel. Die pharmazeutischen Präparate können feste Lyophilisate sein, wobei als Streckmittel mit Peptiden nicht reagierende Verbindungen, zum Beispiel Mannit, Milchzucker oder Stärke, in Frage kommen·» sie können _aber auch in Form ν·η Suspensionen und Emulsionen hergestellt werden, welche verschiedene aeutrale Konservierungsmittel und Stabilisatoren enthalten, Besonders zweckmäßig ist es, wenn die pharmazeutischen Präparate die erfindungsgemäßen Verbindungen in Ferm der weiter oben erwähnten Komplexe enthdten, die eine verzögerte Wirkung des Präparates bewirken.

Entsprechend der üblichen Dosis des Adrenokorikotrop-

htraons enthalten die pharmazeutischen Präparate die erfindungs-

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gemäßen Verbindungen in einer Konzentration von zu» B eispiel 0,5-5 mg/ml. Die Präparate können subcutan, intramuskulär oder parenteral 1-7 mal pro Koche verabreicht werden.

Die praktische Ausführung des Verfahrens wird an Hand dar folgenden Beispiele näher erläutert.

In den Beispielen werden zur Bezeichnung der Aminosäuren und der Peptid-Derivate die durch die IUPAC-IUB Vorgeschlagenen Abkürzungen benutzt (J. Biel. Chera, 247» 977 /1972/). Zur Bezeichnung der ^, -Arainooxysäuren werden die den Abkürzungen der Aninosäuren ähnlichen, weiter eben bereits erwähnten Symbele OGIy, OAIa, OSer benutzt. Die obigen Abkürzungen beziehen sich - GIy und OGIy ausgenommen - falls nicht anders angegeben, auf die L-Antipoden. Als weitere Abkürzungen werden verwendet: PCPOH = Pentachlorphenol, PFPOH s Pentafluorphenol, DCC = Dicyclehexylcarbodiiraid, DCU = Dicyclehexylcarbaraid, BOC = tert.-Butyloxycarbonyl, Bu = tert.-Butyl, ONSu = Succiniaidoxy, Z s: Carbobenzoxy♦

Die Bestimmung des Schmelzpunktes wurde mit dem Apparat nach Dr, Tetteli (Büchi, Schweiz) vorgenemraen. Die diinnschichtchroaatographischen Untersuchungen wurden an de» Adsorbens Sillkagel nach Stahl mit folgenden Lösungsmittelgeaischen durchgeführt:

1. Essig ester:(Pyridin:Essigsäure:Wasser = 20 j 6 : 11) = 8 :

2. Essig ester:(Pyridin:EssigBäure:Wasser = 20 : 6 : 11) =6:4

3. Essig ester: PyridinAmeisensäure:Wasser =50 : 20: 6: 5*5

4. Chlor»f»ra : Methanol =98 : 2
5» Chlorofern ι Methan·!'= 95 : 5

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Beispiel 1

OGl .γ -Ty r- So r-H ο t-Gl u- IIL -,- Ph c -, > r.;-- Tr p-Gly - Ly s-PrQ-Val- -GIy-Ly s-L.y s-Ari;-Ar,':-Pro-Val-Ly s-Va 1-Ty r-Pro-Asp-Ala- -GIy-Glu
O_f6üö .; (0,143 niiol) BOC-uGly-Tyr-Gcr-Ho S-GIu(OBu* )-

-Arc-Trp-Gl:/-Lys( 3X )-Pro-Va 1-GIy-Ly s( B0C)-Lys(BOC )_Arg- -A rc-Pro-Vul-Ly G(BOC )-Val-^rryr( Bi^)-PrO-ASpC 0Du^t ^AIa-GIy-GIu(OBu* )- -OBu · 3 HGl werden in einem Gemisch aus 4,8 ml Tiifluoressigsäure, 0,6 ml iiasscr und 0,6 al Anisol c^Qlöst. Die Losung v/ird bei Ziniaarteriperatur eine Stunde lang stehen gelassen und danach Mit 60 al Äther verdünnt. Der ausgeschiedene Niederschtc wird

ti

abfiltriert, mit Äther gewaschen und in Vakuum über Phosphorpentoxyd und Kaliumhydroxyd getrocknet. Es werdeh 0,538 G (87 %) des substituierten Oktakosapeptid-trifluoracetats erhalten.

Das rohe Trifluoracetat wird in 10 ml Wasser gelöst, die Triflueracetat-Ionen werden mit Hilfe des Acetataustauscherharzes Dowex 1x8 gegen Acetat-Ionen ausgetauscht. Die erhaltene Lösung des Oktakosapeptidacetats wird auf eine ait Ionenaustauscher der Marke Whataan CM-52 gefüllte Säule aufgebracht und mit einem linearen Puffergradienten, der aus 0,01 m (pH 4,5) und 0,4 a (ph 6,7) Aattoniumacetat-Puffer bereitet wurde, eluiort. Die den gewünschten Stoff enthaltenden Fraktionen werden gesanraelt und lyophilisiert. Es werden 0,22 g (34 fo) Oktakosapeptid erhalten. Peptidgehalt, bestiaat durch UV-Absorption: 72,3 %% Het-sulfoxydgehalt: 1,3 %. Verhältnis Tyr/Trp: 2,05i Aminosäurcnanalyse: Lys 4,05 (4), His 0,93 (1), Arg 3,08 (3), Asp 0,99 U) Ser O„79 (1), GIu 2,01 (?), Pro 3,09 (3), GIy 3,04 (3), AIa 0,9a (1), VaI 3,12 (3), Met 0,60 (l), Tyr 1,88 (2), Phe 0,85 (1)· Das als Ausgangsstoff verwendete Hydrochlorid des ge-

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schützten substituierten Oktakosgpaptid.es wird auf folgende '•/eise hergestellt: ^r

Schrlttj' tert.-Butyloxycarbonyl-aminooxyesaiKsäure (BQC-

3X6,0 g (2,37 Mol) tart.-Butyloxycarbonyl-hydrexylamin werden in 2680 ml Äthanol gelöst und der Lösung unter KUhlen 20?,8 g (5|19 Mol) Natriumhydroxid und 350,4 g (2,52 Mol) Monobroraessigsäure zugesetzt· Das Heaktiönsgeraisch wird 20 Minuten lang gekocht und danach das Lösungsmittel abdestilliert» Der Rückstand wird in 1940 nil V.'asser gulöst und mit konzentrierter Salzsäure auf pH 3 angesäuert. Nach 2 stündigeis Kühlen und Rühren worden die ausgeschiedenen Kristalle abfiltriert. Das rohe Pr·- dukt (419 ε) wird aus einem Chloroforui-n-Hexangeraisch kristallisiert. Ausbeute: 388,8 g (86 %) tert.-Butyloxycarbonyl-aminoessigs^ure. Schmelzpunkt: 115-116 C»
Analyse (C₇H₁₃NO₅ = I91, 18):
Berechnet: C 44,β H 6,8 N 7|2# Gefunden: C 43,9 H 6,9 H 7,1*

Schritt Zi BOC-OGly-Tyr-Ser-Met-N.-JU l_t72 g (9,0 mMol) BOC-OGIy und 4,50 .g (10 αΜ·1) Tyr- -Ser-Met-OCH, ,HCl werden in 10 ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird auf 0 *C gekühlt und zuerst axt 1,11 ml (10 nHol) N-HethylMorpholin, danach mit 1,85 g (9|O «Mel) DCC versetzt. Das Reaktionsgemisch wird eine Stunde lang bei 0 C gerührt und bei Zimmertemperatur bis zum folgenden Tag stehen gelassen« Danach wird das DCU abfiltriert, das Filtrat eingedampft und der Rückstand in 200 ml Essigäthylester gelöst. Die Lösung wird zweimal mit 100 ml η Salzsäure und zweimal alt 100 ml 8 -S-iger Natriuahydrogencarbonat-Lösung ausgeschüttelt, danach getrocknet

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und dann eingedaapft. Der erhaltene rohe, substituierte geschützte Tetrapeptldnethylester (4,5 g) wird in 45 ml Methanol gelöst, dia Lösung mit 1,26 ml (26,0 uMol) Hydrazinhydrat versetzt und das Reaktionsscraisch bei Zimmertemperatur über Kracht stehen Gelassen. Danach wird die Lösung eingedampft, der Ruckstand mit Essig ester vonieben, abfiltriert, der Niederschlag »it Essig ester und Äther gewaschen und übor konzentrierter Schwefelsäure getrocknet. Es v/erden 3,30 g (62,5 %) Hydrazid des substituierten geschützten Tetrapeptides erhalten. Der Schraelzpunkt des aus Wasser umkristalliesierten Produktes liegt bei 137 °C. R* = 0,36.
Analyse (C^Lgl^O S = 586,6δ)

Berechnet: C 49,1 % H 6,5 % N 14,4 % Gefunden: C 49_tO % H 6,6 % N 14,4%

Schritt 3: BOC-OGly-Tyr--Ser-'MQt-Glu(OBu^t)-His--£he-Arg-» -TrP-GIy-LyS(BOC)-PrQ-VaI-GIy · HCl

0,41 ζ (0,70 mMol) BOC-OGIy-Tyr-S

v/erden in 5 ^l Dimethylformamid gelöst. In d¹^ auf - 20 C gekühlte Lösung werden 0,64 ml (2,8 1.1M0I) 4,4 η salzsau rer Essigäthylester, danach 0,105 ml (0,85 mMol) tert.-Butylnitrit eingetropft. Das Reaktionsgemisch wird bei -10 C 5 Minuten lang gerührt, dann auf -20 C gekühlt, und 0,96 g (0,70 mMol) GIu(OBu )- -His-Phe-A_re-Trp-Gly-Lys(BOC)-Pre-V₈I-GIy (ungarische Patentschrift Nr. 155 880) und 0, 48 ml (2,8 inHol) Diisopropylamin in 8 ml Dimethylformamid zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird bei einer Temperatur von -5 bis O⁰C eine Stunde lang gerührt und bei 0 ⁰C über j^acht stehen gelassen. Danach v;ird die Lösung ein-

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gedampft und der Rückstand mit 8 %~i^er Natriiuahydrogoncarbonatlösung verrieben. Nach dem Filtrieren, Väschen mit Wasser und Trocknen werden 0,93 g (69 #) substituiertes, ^oschutstes Tetradekapeptid erhalten. Dieses wird in 6 ml tldhanol suspendiert und mit einer Pyridinhydrochloridlösung versetzt, die aus 1,35 «1 Pyridin und 1»35 öl konzentrierter Salzsäure bereitet wurde. Die erhaltene Lösung wird mit 50 al Wasser verdünnt das ausgefallene Hydrochlorid des geschützten, substituierten Totradekapeptides abfiltriert, mit Wasser gewaschen und dann getrocknet. Ausbeute: 0,78 g (57 %), Schmelzpunkt: 202-204 ⁰C. R^ = 0, 18, C₉₀H₁₃₂N₂₁O₂₄ClS (1959,66).

Schritt 4: BOC-OGIy-Ty r-Ser-Het-Glu( OBu¹^ )-His-Phe- -Arg-Trp-Gly-Lys( BQC)-PrQ-VaI-GIy-Ly -Ly s( BOC)-Ars-A_rg-Pro-Val-Lys(BOC)- -Tyr(Bu^t)-Pro-Asp(03u^t)-Ala-Gly-Glu- -(OBu )0Bu »

0,345 g (0,176 BMoI) BOC-OGly-Tyr-Ser-Met-Glu(0Bu )- -His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly . HCl, 0,400 g (0,176 αΜβΙ) Lye (BOC)-Lys(BOC)-Arg-Arg-Pro-Val-Lys(BOC)-Val- -Tyr(Bu^t)-Pre-Asp(OBu^t)-Ala-Gly-Glu(OBu^t)OBu^t . 3 HCl (ungarische Patentschrift Nr. 155 880) und 0,281 g (1,05 mMol) PCPOH werden in 3,3 ml Dimethylformamid gelöst und der Lösung zuerst 0,025 ml (0,18 raHol) Triäthylaiain, dann 0,074 g (0,36 mMol) DCC zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird bei Zimsierteaperatur 2 Tage lang stehen gelassen, dann das DCU abfiltriert und das Filtrat mit 30 ml Äther verdünnt. Das ausgefallene Produkt wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und dann getrocknet. Das Hydrochlorid des substituierten geschützten Oktakosapoptides wird in

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einer Ausbeute von 0,640 g (87 $) erhalten/ Schmelzpunkt: 208-212 °C, R^ = 0,22. C₁₉₄H_3nN₄₄O₄₉Cl₃S (4182_S29).

Beispiel 2

OAIa-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-

-Val-Gly-Lys-Lys-Är^-Ar^-Pro-Vai-Lys~VaI-Tyr-Fro-

-Asp-Ala-Gly-Glu

142 t

0,600 g (O.fflHol) BOC-OAIa-Tyr-Ser-Met-Glu(OBu )-

-His-Phe-Arff-Trp-Gly-Lys( BOC)-Pro-Val-Gly-Ly s(BOC )-Lys( BOC)- -Arg-Arß-Pro-Val-Lys( BOC)-VaI-Ty r( Bu* )-Pro-Asp( OBu¹^)-AIa-GIy- -GIu(OBu )-0Bu _f 3 HCl worden in eine« Gemisch aus 4,8 ml Triflueressigsäure, 0,6 ral Wasser und 0,6 al Anisol gelöst. Die Lösung wird bei Ziniuertemperatur eino Stunde lang stehen gelassen und dann wit 60 nilAtier verdünnt. Der ausgeschiedene

It

Niederschlag wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und im Va kuum Über Phosphorpentoxyd und Kaliuuhydroxyd cetrocknete Das Trifluoracetat des substituierten Oktakosapeptides wird in einer Ausbeute von 0,532 g (86,5 %) erhalten.

Das erhaltene rohe Trifluoracetat wird in 10 ral Was- ser gelöst, und die Trifluoracetationen aittels Acetationenaustauscherharz Dowex 1x8 gegen Acetationen ausgetauscht. Die er haltene Lösung, die das Acetat des substituierten Oktakospep- tides enthält, wird auf eine mit Ionenaustauscherharz Whatnan CM-52 gefüllte Säule aufgegeben und mit einem aus 0,01 ra (pH 4,5) und 0,4 « (pH 6,7) Aaiaaniumace tatpuff er bereiteten linearen Puffergradienten eluiert. Die*den gewünschten Stoff enthaltenden Fraktionen werden gesammelt und lyophilisiert. Es werden 0,23 g (42 ^) Oktakospeptid erhalten. Peptidgehalt, durch UV-Absorption bestirnt: 85,1 %. Gehalt an Met-Sulfoxyd: 2,7 5«. Verhältnis von Tyr:Trp: 2,10; Aminosäureanalyse: Lys 3,89 (4),

4098 0 97 121 1

His 0,37 (1), Arc 3,00 (3), Asp 1,10 (1), Ser 0,97 (1), GIu 1,94 (2), Pro 3,10 (j), GIy 3,06 (3), Ala 1,15 (1), VaI 2,84 (3), M< t 0,68 (1), Tyr 1,94 (2), Plie 1,06 (l)_e

Das als Ausgangsstoff eingesetzte Trihydrochlorid

Λ' s OGChUtAtGU substituierten üktakosapeptides wird in folgender '.leir>e hergestellt;:

Schritt 1: "tart.-Butyl oxy carbonyl-L- tjs, -aminooxy-

propicnsuurβ ( 5 ¹ X-OAla j

4,0 g (29 «Mol) D- -J^~Broapropionsäure, 3,62 g (65 laHol) Kaliumhydroxyd und 4,39 S (33 «Mol) tert.-Butylexycarbonyl-hydrexylaciin v/erden auf die im Schritt 1 von Beispiel 1 angegebene Weise zur Reaktion gebracht und aufgearbeitet. Das rohe Produkt wird in Äther ;,elb"st und Mit 6,3 al (32 raMol) Dicyclehexylaain versetzt. Auf diese Weise wird das Dicyclohexylaminsalz der tert.-Butyloxycarbonyl-L- tk-aainooxypro-piensaure in einer Ausbeute von 6,7 g (60 %) erhalten. Schmelzpunkt: 157 °C. Das Dicyclühoxylaminsalz wird in Äther suspendiert, die Suspension mit 0,2 η Schwefelsäure geschüttelt, die äherische Phase eingedampft_;und auf diese Weise 3,05 g (50 %) tert·- -Butylexycarbonyl-L- ^L-aainooxypropionsäure erhalten, die bei 110-112 ⁰C schmilzt. / kMI° = -91 ° (c = 1, Athanol)_o Analyse CgH₁₅NO₅ (205,21)

Berechnet: C 46,4 % H 7,4 fo N 6,8 % Gefunden: C 46,6 % H 7,5 % N 6,8 fo Schritt 2: BOC-OAla-Tvr-Ser-Met-N^H^,

1,44 ε (7,0 bMoI) BOC-OAIa und 3,50 ε (7,8al-lel)

Tyr-Ser-Met-OCH, . HCl werden in 12 ml Dimethyl*ortaaraid selbst.

Die Lösune wird auf 0 ^&C sekUhlt und mit 0,85 al (7,8 «Mel) N-Wethylmorpholiri, danach mit 1,48 g (7,2 κίΊοΙ) DCC vcrsetat.

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Das Reaktiensgemisch wird bei O ⁰C eine Stunde lang gerührt und bei Zimmertemperatur über Macht stehen gelassen. Anderntags wird das Methanol abdestilliert und der Rückstand Mit Essig ester verrieben. Das Produkt wird abfiltriert, alt

ti

Essig ester und Äther gewaschen und dann über konzentrierter Schwefelsäure getrocknet. Das Hydrazid des geschützten substituierten Tetrapeptides wird in einer Ausbeute von 2,1 g (50 %) erhalten. Schneizpunkt: 147 °C (aus Wasser umkristallisiert). R* s 0,43.
Analyse C₂₅H₄₀NgO₉S (600,69):

Berechnet: C 50,0 % H 6,7 ^
Gefunden: C 49,6 % H 6,7 %

Schritt 3: BOC-OAla-Tyr-Ser-Met-Glu(OBu^t)-His-Phe-Are- -Trp-Gly-Lys( BOC)-PrQ-VaI-GIy ' HCl

0,266 g (0,44 mMel) BOC-OAla-Tyr-Ser-

Met-NpH, werden in 3,2 ml Dimethylformamid gelöst und die Lösung ]aj{yo( auf -20 *C abgekUhlt. Unter führen warden 0,41 ml (1,8 mMel) 4,4 η salzsaujirer Essig ester, danach 0,0? ml (0,59 mMel) tert,- -Butylnitrit zugetropft. Das Reaktionsgemisch wird bei -10 C

_β ceS we/ffiew 5 Minuten lang gerührt, dann auf -20 C gekühlt, ufi2h)O,6OO g (0,438 aMol) aiu(OBu^t)-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC>Pre-Val-Gly sowie 0,31 (1,8 mMel) Diisoprepyläthylamin in 5 »1 Diraethylfermsittid zugegeben. Das Raaktiensgemisch wird bei einer Temperatur von -5 bis 0 ⁰C eine Stunde lang gerührt und dann über «acht bei 0 ⁰C stehen gelassen. Anderntags wird das Dimethylformamid abdestilliert und der Rückstand mit 8 %-iger Natriumhydregencarbonatlösung verrieben. Nach Filtrieren, Vaschen mit Wasser und anschließendem Trocknen werden 0,70 g (81 #) des geschützten substituierten Tetradekapeptides erhalten. Aus 1 ml Pyridin und

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1 »1 kenzentrierter Salzsäure wird Pyridinhydrochleridlösung bereitet und zu dem in 5 al Methanol suspendierten geschützten ■ Tetradekapeptid gegeben. Die auf diese V/eise erhaltene Lösung wird »it 50 al Wasser verdünnt, der ausgefallene Niederschlag abfiltriert, mit Wasser gewaschen und anschließend Getrocknet. Das Hydrochlorid des geschützten substituierten Tetradekapeptides wird ii einer Ausbeute von 0,513 g (59»5 %) erhalten. Schmelzpunkt: 200-202 ®C, R^ = 0,19. C₉₁H₁₃₄N₂₁O₂₄ClS (1973t68).

Schritt 4: BQC-OAIa-Tyr-Ser~Het-Glu(OBu*) -His-Phe-

-Arg-Trp-Gly-Lys( BOG )-Pro-Val-Gly-Lys( BOC) -LyS(BOC)-ArR-Ar^-PrP-VaI-LyS(BQC)-VaI- -Tyr( Bu¹^)-PrQ-AsPC OBu^-Ala-Gly-GluC OBu*)~

-OBu* , 3 HCl

0,348 g (0,176 niMol) BOC-OAla-Tyr-Ser-Met-Glu(0Bu*)- -His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC)-PrO-VaI-GIy . HCl, 0,400 g (0,176 mMal) LyXBOC)-Lys( BOC )-ArE-Arg-Pre-Val-Lys( BOC )-Val-Tyr(Bu* )- ~Pre-Asp( QBu* ^AU-GIy-Gl u( OBu* )-0Bu* . 3 HCl und 0,281 g (1,05 mMel) PCPOH werden in 3,3 »1 Diraeth^lfermaraid gelöst. Der Lösung werden 0,025 »1 (0,18 rMol) Triäthylamin, danach 0,074 g (0,36 bMoI) DCC zugesetzt. Das Reaktionsgeraisch wird bei Zimiaerteaperatur 2 Tage lang stehen gelassen, dann das DCU abfiltriert und das Filtrat ait 30 ml Äther verdünnt« Das ausgeschiedene Produkt wird abfiltriert, eit Äther gewaschen und dann getrocknet. Das Triehlorid des geschützten substituierten Oktakosapeptides wird in einer Ausbaute ven 0,658 g (89 %) erhalten. Schmelzpunkt: 175-177 ⁹C, ^ = 0,25.
^C195^H313^N44°49^CX3^S C4196.36).

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Beispiel 3

D-OAIa-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-GIy-Lys-Pra- -Val-Gly-Lys-Lys-Arff-Arg-Pre-Val-Lys-Val-Tyr-PrO" -Asp-Ala-Gly-GIu

0,600 g (0,142 EiHoI) BOC-D-OAla-Tyr-Ser-Met-Gl^OBu*) " -His-Phe-Arg-Trp-Gly -Ly s( BOC)-Pro-Val-Gly-Lys( BOC)-Ly s( BOC>Arg- -Arg-Pro-Val-Lys( BOC )-Val-Tyr-( Bu* )-P,ro-Asp( OBu* )-Ala-Gly- -GIu(GBu^-OBu . 3 HCl werden in einem Gemisch aus 4,8 al Triflueressigsäure, 0,6 ml Wasser und 0,6 ial Anisol gelöst. Die Lösung wird bei Ziamertemperatur eine Stunde lang stehen gelas-. sen und dann mit 60 ml Äther verdünnt. Der ausgeschieden Niederschlag wird abfiltriert, mit 'Äther gewaschen und im Vakuum über Phospherpentoxyd und Kaliurahydroxyd getrocknet. Die Ausbeute an Trifluoracetat des substituierten Oktakosapeptides beträgt 0,546 g (98,5 %)·

Das rohe Trifluoracetat wird in 10 al Wasser gelöst, und aittels des Acetataustauscherharzes Dswex 1x8 die Triflueracetatienen gegen Acetationen ausgetauscht. Die auf diese Weise erhaltene Lösung, die das Acetat des substituierten Oktakosapeptides enthält, wird auf eine mit Ionenaustauscherharz der Marke ivhatman CM-52 gefüllte Säule aufgebracht und nit einem aus 0,01 » (pH 4,5) und 0,4 m (pH 6,7) Ammoniunacetatpufferlösung bereiteten linearen Puffergradienten eluiert. Die den gewünschten "Steff enthaltenden Aktionen werden _Eesa™a*lt und lyephilisiert. Die Ausbeute an Oktakosapeptid betragt 0,245 g (39 *)· Peptidgehalt: 75 % (durch W-Absorption bestiwmt). Gehalt an Met-Sulfexyd: 2,57 *· Verhältnis TyrsTrp = 2,0?. Aminesäureanalyse: Lys 4,35 (4), His 0,97 (1), Ar;; 3^3 (3), Asp 1,06 (1), Ser 1,00 (1), GIu 1,92 (2), Pro ■■',*) (3), ül_S 1,00 (3),

409809/1211 &ß Qmy,\L

Ala 1,00 (1), VaI 2,92 (3), Met 0,87 (l),^yr 2,21 (2), Phe * 1,06 (1).

Das als Au3gangssi.off verwendete Trichlarid

des geschützten substituierten Oktakosapeptides vdrd auf feigende Weise hergestellt:

Schritt 1: tert.-Butyloxycarbony1-D-»^ -aminooxypropionsäure (BOC-D-OAIa)

7,04 g (51 raMol) 1- (^-Brorapropie'nsäure, 6,3 g (112 raMol) Kaliumhydroxyd und 7,71 g (58 mMol) tert.-Butyloxycar-■benyl-hydroxylaain werden auf die iia Schritt 1 das Beispiels beschriebene Weise zur Reaktion gebracht und aufgearbeitet. Das rehe Produkt wird in Äther gelöst^ der Lösung werden 11,0 »1 (0,56 mMol) Dicyclohexylarain zugesetzt. In einer Ausbeute von 14,85 g (75 %) wird das Dicyclohexylarainsalz der tert.-Butylexycarbony 1-D- ^-brerapropionsäure erhalten, das * bei I57 ⁰C schmilzt. Die ätherische Suspensien des Dicyclehexylarainsalzes wird mit 0,2 η Schwefelsäure geschüttelt, danach die ätheriBche Phase eingedampft. Es werden 6,55 g (62 fo) tert.-Butyloxycarbonyl-D-d^-aaineexypropionsäure erhalten. Schmelzpunkt: 110-111 ⁰C, / ^/²jj = + 90,0 * (c = 1, Athanel). CgH₁₅NI₅ (205,21).

Schritt 2: BOC-D-OAIa-Tvr-Ser-Met-NJK₃ 1,85 g (9,0 mMel) BOC-D-OALa-und 4,5.0 g (10 raMel) Tyr-Ser-Met-OCH, · HCl werden in 15 «1 DiKethylforinaraid gelöst. Die Lösung wird auf 0 *C gekühlt und zuerst mit 11,1 al (10 oMol) N-Methylmorpholin, danach mit 1,90 g (9,2 raMel) DCC versetzt. Das Reaktiensgemisch wird bei 0 C eine Stunde land gerührt und bei Zimmertemperatur über i/acht stehen ge^·

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lassen. Dann wird das DCU abfiltriert, das Filtrat eingedampft und der Rückstand in 200 al Essig ester gelöst. Die Losung wird zweimal »it 100 ml η Salzsäure¹* zweimal mit 100 ral 8 <$- iger Natriuahydreu-encarbenatlösuns ausgeschüttelt, getrocknet und eingedampft. Der gelartige Rückstand (3,65 g geschlitzter, substituierter Tetrajpeptidester) wird in 40 ml Methanol gelost, die Lösung mit 1,02 al (21,2r.Kol) HydrazAnhydrat versalzt und das Roaktiensgenisch bei Zi:;iuertenperytür über Aiicht stehen gelassen. Andorntag-s wird aus dem gelartig abgeschiedenen Produkt das Methanol abdestilliert. Der Rückstand wir mit Essig-

w ester verrieben, abfiltriert, mit Essigäthylester und Äther

gewaschen und über konzentrierter Schwefelsäure getrocknet. Das Hydrazid des geschützten substituierten Tetrapeptides wird in einer Ausbeute von 1,09 g (35 f°) erhalten. Der Schmelzpunkt des aus Wasser umkristallisierten Produktes liegt bei 184-185 *C, kJ s 0,43.
Analyse ^c ₂5^H4o^N6°9^S (600,69)

Berechnet: C 50,0 £ H 6,7 % N 14,0 % Gefunden: C 49,8 % H 6,6 fo N 14,1 %

Schritt 3: BOC-D-OAIa-Tyr-Scr~Het-Glu( OBu^-His-Phe- -Arfc-Trp-Gly-Ly_s(BOC)-Pro-Val-Gly .

0,381 g (0,635 nMol) BOC-D-OAIa-Tyr~Ser-Het-N_oH

werden in 4,5 »il Diraethylfariaaraid gelöst. In die auf -20 C gekühlte Lösung werden unter Rühren 0,58 ial (2,65 nKol) 4,4 η. salzsauer Essig .ester, danach 0,095 ml (0,80 mMol) tert.-Butylnitrit^% eingetropft. Das Reaktionsgeiaisch wird bei -10 ⁸C noch 5 Minuten lang gerührt, dann auf -2Ö C cekühlt und die Lösung von 0,86 g (0,628 mMol) GIu(OBu )-His~Phe-Ar--

U 0 9 8 0 9 / 1 2 1 1 BAD ORIQINAl

GIy und 0,43 αϊ (2,50 nuMol)'DiisepropylUthyUmin in 7,2 nl Dimethylformamid zufje-eban. Das Reaktionagemisch wird bei einer Temperutür von -5 bis 0 ⁰C eine Stunde lang fierührt und dann bei 0 ⁰C bis zum nächsten Tai-e stehen gelassen. Dass Dimethylformamid v/ird abdestil Liert, der Rückstand alt 3 {fc-iger Natriunhydroxydlösuns verrieben. Nach Filtrieren, Waschen mit V/asscr und anschließendem Trocknen werden 0,95 S (77 %) Geschütztos substituiertes Tetrade !«peptid erhalten. Aus 1,35 al konzentrierter Salzsäure und 1,35 ml Pyridih wird eine PyridinhydrochloridlÖsuna bereitet und diesa dem in 6 ral Methanol suspendierten geschützten substituierten Tetradokapeptid zugesetzt. Die auf diese Weise erhaltene Lösung wird rait 50 al V/a st; er verdünnt, dar ausgeschiedene iiiederschlac wird abfiltriert, mit V/asser Gewaschen und dann getrocknet* Öas Hydrochlorid des fjoschutzten substituiertön Tetradekapeptides entsteht in einer Ausbeute von 0,78 g (63 %)»

204-210 ⁰C, R^ = 0,20 . Gg₁H₁₃₄N₂₁O₂₄GlS (I973»68)

Schritt 4: BOG-D-OAIu-Tyr-Ser-Met->Glu(

-Arg-Trp-Gly-Lys( BOG 3-PrO"Val-Gly^L,y s(BOC)-

Bu^t )"-Pre-Asj)( Qüvl· )-Ala-gly-Glu( OBü^t

g (0,l?6 aMol) BOG-D-OAla-Tyr-Ser-Met-Gl^OBu*) «His«Ph#«Afg»Trp-Gly-iiys(BOC>Pre-Val*Gly . HGl₁ 0,400 g (Ö_tl?6 (BOG)*Lys(BOG)-Arg-Arg-Pro-Val-Lys(BOC)-VaI-Tyr(Bu*> u^)-Prs-Asp( OBu¹¹ ^Äla^Gly-GiKOBu*^OBu¹⁵ . 3 HCl und

0,281 g (1|Ö5 taMöl) PGPOH werden in 3»3 al Dini^thylforniaald Ge^ loöi und äör Lösuns nacheinander 0,025 »1 (0,13 wMol) Triäthylüftd Ö,Ö74 ö (0j36 ntMesl) OGG zucesetzt. Das Reaktionsseiaiseh

A0S809/1211

BAD ORlGlNAl.

wird bei ,Uminertekiperatur 2 Ta;;e lang stehen gelassen» dann das

Il

DCU abfiltriert .und das Filtrat mit 30 al Äther verdünnt» D>,r ausgeschiedene Niederschlag wird abfiltriert, ait Äther gewaschenund dann getrocknet. Das Hydrochloi*id des geschützten substituierten Oktakosapeptides wird in einer Ausbeute von 0^647 β (87,5 f) erhalten. Schmelzpunkt: 166-167 °G, H* =0,25. C₁₉₅H₃₁₅N₄₄CI₉S (4196,32).

Beispiel 4

OSer-T_vr-Ser-Met-Glu~His-Pho-Arg~Trp-Gly-Lys--Pyo--VaI --GIy-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lye-Vgl-Tyr-Fro-Asp-Ala- -Gly-Glu

0,600 g (0,142 EiMoI) BOC-OSer-Tyr-Ser-Met-GluCOBu¹^)- -His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly~Lys(BOC)-Lys(BOC)-g-*Ape-Pro-Val-Lys( BOQhVaI-Ty r( Bu¹^)-PrO-ASp(OBu* )-Ala-Gly-

Glu(0Bu^t)-0Bu^t · 3 HCl werden in einea Geiiisch aus 4,8 ml Trifluoressigsäure, 0,6 ial Wasser und 0,6 ml Anisol gelöst* Die Lösung wird bei Zimmertemperatur eine Stunde stehen gelassen

und dann mit 60 ml Athor verdünnt. Der ausgeschieden^Niederschlag wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und über Phosphor pentöxyd und Kaliumhydroxyd im Vakuum getrocknet. 0,400 c (65 y5) Trifluoracetat des substituierten Oktakosapepfcides worden erhalten.

Das r©he Trifluoracetat wird in 8 ial Wasser gelöst^ und die Trifluoracetationen mittels Acotationenaustauscherliarz der Marke Döwöx 1x8 gegen Acetationen auscetauscht. Die auf diese Weise erhaltene Lösung, die das Acetat dos Cktakupoptides enthält, wird auf eine mit dem Ionenaustausch·:rlmrc Uhatman CH-52 gefüllte Säule auf gebracht umi uit eino-i aus

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O,Ol ιλ (pH 4,5) und 0,4 α ^I 6,7) Am..oniuniacetatpuffer bereiteten linearen Pufferoradienten eluiert_e Die den gewünschten Steff enthaltenden Fraktionen werden £csai„a^elt und lyophilisiert. Es v/erden 0,240 g (41,5 Ά) Cktakosapeptid erhalten, dessen Peptidgohalt nach UV-Absorptionsr.ionsun_:;o.n Bl,'6 % beträgt. Gehalt an I-iet-Sulfoxyd: 4,4 ',s. Verhältnis i^vyr:Trp = 2,13. Aminosaureanalyso: Lys 3,92 (4), His 1,00 (1), Ar- 3,15 (3), Asp 0,99 (1), Sor 0,83 (1), GIu 1,94 (2), Pro 3,00 (3), GIy 3,05 (3), AIa 1,04 (1), VaI 2,92 (3), Kot 0,79 (1), Tyr 1,83 (2), Pho 0,97 (Ij.

Das als Aus;;ai^stoff verwendete Trihydrochlorid

des geschützten substituierton Oktakosapeptides wird in folgender Weise hergestellt:

Schritt 1: tert«-Butyloxycarb(3nyl-L- <^-arainoQxy~ß~

-benzyl&xypropionsäure

48,4 g (0|364 Mol) tert.-Butyloxycarbonyl-hydrexyl» arain, 40,7 g (0,728 Mol) Kaliumhydroxyd und 94,0 g (0,364 Mol) DL- ^-Brein-ß—benzylGxypropionsiiUre werden in 360 ml Wasser gelöst. Das Reaktiensgemisch wird bei Zimmertemperatur 3 Stunden lang gerührt, dann der pH-Viert auf 3 eingestellt und die Lo-

sung dreimal mit 720 al Äther ausgeschüttelt. Die ätherische Lösung wird mit 720 ml Wasser ausgeschüttelt, dann getrocknet und mit 78 al (0,40 Μ·1) Dicyclohexylaain versetzt. Das erhaltene Dicyclohexylaminsalz der tert.-Butyloxycarbüiiyl_DL- --j(-aniinb*xy-ß-benzyl«xypropionsäure (43,61 g, Sciiap. 144-146 *C) wird in 500 ml Äther suspendiert und fünfmal axt loo ml 0,2 η Schwefelsäure ausceschüttelt. Die ätherische Lösung wird G^e^recknet und dann zur Treckne eingedampft. Der Rückstand wird in 700 ml Äthanol gelöst, der J,os.ang werden i, (48,5 wliol) ( + )-Amphetaainbase zu-gg<· cat« Die Lb^ini-;

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SAD ORIGINAL

wird über flacht an einem kühlen Ort stehen gelassen, die ausgeschiedenen Kristalle werden anderntags abfiltriert» Zusammen mit dem durch Eindampfen der Mutterlauge gewonnenen Produkt werden 9i33 g (16,5 #) tert.-Butyloxycarbonyl- -Ii-g^-aainooxy-ß-benzylexypropionsüure erhalten. Schmelzpunkt: 95-97 C, /^/ I = -36 °(c=l, Äthanol), C₁₅H₂₁NO₆ (311,34).

Schritt 2: tert.-Butyloxycarbonyl-L-cty-amineoxy- -ß-hydroxy-propionsaure (BOC-OSer)

5,0 g (16,1 EiMeI) L-^j-tert.-Butyloxycarbonyl-amine-•xy-ß-benzylexypropionsäure werden in 100 al Methanol gelöst und in Gegenwart eines 10 $-igen Palladia-Aktivkohle-Katalysaters hydriert. Nach 3 Stunden wird der Katalysator abfiltriert, das nach dem Abdestillieren des Methanols verbleibende Öl wird unter Petroläther stehen gelassen. Die Substanz kristallisiert innerhalb einiger Stunden aus. Nach Filtrieren und anschließenden Trocknen werden 3,2 g (90 %) L-J^-tert.-Butylexycarbonyl-ß-hydroxypropionsäure erhalten, die bei 94-95 C schmilzt. R^ = 0,27. CgH₁₅NO₆ (221,22).

Schritt 3: BOC-OSer-Tyr-Ser-Met-N^H, 2,2 g (10 φΜοί) BOC-OSer und 4,50 (10 mMel) Ty*- -Ser-Met-OCH, . HCl v/erden in 15 ωΐ Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird auf 0 ⁰C gekühlt und mit 1,11 ml (10 mMel) N-Methylmerphalin, danach ait 1,9.0 g (9_t2 mMel) DCC versetzt. Das Reaktiensgeaisch wird bei 0 *C eine Stunde lang gerührt und über ikcht bei Ziranerteaperatur stdhen gelassen. Danach wird das DCU abfiltriert, das FiItrat eingedampft und der Rückstand in 200 ml Essig .ester gelöst. Die Lösung wird zweiaal »it lOO αϊ η Salzsäure, zweimal mit IDO ml 8 fS-iger Natriuiahydregencarbonatlösung ausgeschüttelt,

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und schließlich eincedampft. Der Rückstand (3,7 g geschützter substituierter Tetraneptidester) wird in 40 al Methanol gelöst, uit 1,0 .al (20,4· iriMol) Hydrazinhydrat Versetzt und bis zum nächsten Ta₍;a bei Zirnnertemperatur stehen gelassen. Anderntags wird das methanol abdestilliert, dar Rückstand Mit Essig-

ester verrieben, abfiltriert, mit Essig .ester und Äther gewaschen und über konzentrierter Schwefel säure getrecknet. Man erhält das Uydrasid des substituierten geschlitzten Tetrapeptides in einer Ausbeute von 2,5 g (44 #). Schmelzpunkt: 141 °C, R* s 0,30.
Analyse C^H^Ö^S (616,69)

Berechnet: G 48,7 % H. 6,55 % N 13,6 % Gefundeni^ C 48,3% H 6,7 % N 13*3 %

Schritt 4: .BOCrOSer-T»r-Serr-Met"Gltt( OBu¹¹ )-His-Pha*-Arg- -TrP-GIy-LyS(BOC)-PrQ-VaI-GIy . HCl

0,274 g (0,446 jaMol) BOC-OSer-Tyr-Ser-Met-NgH, werden

in 3,2 ml Dinethylfermamid gelöst. Zu der auf -20 ⁶C gekühlten Lösung werden unter Rühren zuerst 0,41 ml (1,8 mMol) 4,4 η salzsauer Essig ester, danach 0,07 ml (0,59 mMol) tert,- -Butylnitrit getropft. Das Heaktiensgemisch v/ird bei -10 G n»ch 5 Minuten nachgerührt, dann auf -20 ⁹C abgekühlt und eine Lösung ν·η 0,600 g (0,438ηΜ·1) Glu(OBu^t)~His-Phe-Arg-Trp-Gly- -Lys(BOC)-Prt~Val-Gly und 0,31 (1,8 mM»l) Diisepropyläthylaain in 5 ml Dimethylfermaaid zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird bei einer Temperatur van -5 bis 0 C eine Stunde lang gerührt und dann bis zum nächsten Tag bei 0 *C stehen gelassen. Anderntags wird die Lösung eingedampft und der Rückstand mit 8 %-iger NatriuBthydrogencarbenatlÖsung verrieben. Nach Piltrie-

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ßAD ORiQJNAL

ren, Waschen rait Wasser und anschließendem Trocknen erhält man 0,69 g (79 %) geschütztes substituiertes Tetradekapeptid. Aus 1 ml kenzentrierter Salzsäure und 1 ml Pyridin wird eine Pyridinhydrochloridlösuni; bereitet und diese zu dea in 5 inl Methanol suspendierton geschützten Tetradekapeptid gegebene Die auf diese Weise erhaltene Lösung wird Eiit 50 ml V/asuer verdUnnt. Der sich abscheidende Niederschlag wird abfiltriert, rait V/asser gewaschen und dann getrocknet. Man erhält das Hydrochlorid des geschützten substituierten Tetradekapeptides in einer Ausbeute von 0,471 g (54 #). Schnelzpunkt: 198-202 ⁰C, |²= 0,16, C₉₁H₁₃₄N₂₁O₂₅ClS (1989.68).

Schritt 5: BOC-OSer-Tyr-Scr-Het-GluCOBu^-His-Phe-Arg-

-Gly-Ly s( BOC )-

-Ly S(BOC )-Arn-Ars-Pro-Val-L.y ^BOC)-VaI-

-Tyr( Bu )-Pro-Asp( OBu VAla-Gly-Glu( 03u

-OBu ¹^

0,350 g (0,176 mHol)

-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly . HCl, 0,400 g (0,176 κΜ·ΐ) LyS(BOC)-LyS(BOC)-
-Tyr(Bu*) -Pre-Asp(OBu^t)-Ala-Gly-Glu(OBu^t)-OBu^t . 3 HCl und 0,281 g (1,05 mMel) PCPOH werden in 3_f3 al Dir.iethylformaaid gelöst und der Lösung zuerst 0,025 »1 (0,18 mMol) Triäthylamin, dann 0,074 g (0,36 mMol) DCC zugesetzt. Das Reaktionssemisch wird bei Zimmertemperatur 2 Tage lang stehen gelassen, danach

ft wird das DCU abfiltriert und das Filtrat ait 30 al Athor ver-

dünnt. Das ausgefällte Produkt wird.abfiltriert, mit Äther gewaschen und danach getrocknet. Man erhält das Trihydrochlorid des substituierten geschützten Oktakosapeptides in einer Aus-

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beute von 0,659 β (88,5 #). Schmelzpunkt: 160-166 ⁰C, R-JJ=O ,22, ^C195^H31?44°5O^C13^S C4212.33).

Beispiel 5

D-OSer-Tyr-Ser-Met~Glu-His-Phe~Arg -Irp-Gly-Lvs-'

-PrO-VaI-¹GIy-Ly s-Lys-Arg-Ar g-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-

-Pro-Asp-Ala-Gly-Glu

0,600 g (0,142 inHol) BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met-Gl^OBu*)- -H is-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys( BOC )-Pro-Val-Gly- Ly <BOC)-Ly s( BOC )- -Arg-Arg-Pro-Val-Ly s( BOC )-Val-Ty r( Bu* )-Pro-Asp( OBu* )-Ala-Gy 1- -Glu(0Bu*)-0Bu . 3 HCl werden in einem Gemisch aus 4,8 ml Trifluoressigsäure, 0|6 al Wasser und 0j6 ml Anisol gelöst. Die Lösung wird bei Zimmertemperatur eine Stunde lang stehen gelassen und dann mit 60 al Äther verdünnt. Der ausgefallene Niederschlag wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und schließlich über Phosphorpentoxyd und Kaliunhydraxyd im Vakuum getrocknet. Das Trifluoracetat des substituierten Oktakosapeptides wird in einer Ausbeute von O|533 g (86,5 %) erhalten.

Das rohe T^riflueracetat wird in 10 ml Wasser gelöst, und die Trifluoracetationen mit Ionenaustauschernarz der Marke Dowex 1x8 gegen Acetationen ausgetauscht. Die erhaltene Lösung, die das Acetat das substituierten Oktakosapeptides enthält, wird auf eine mit Ionenaustauscherharz der Marke Whatman CM-52 gefüllte Säule aufgebracht und mit einem aus 0,01 α (pH 4,5) und 0,4 m (pH 6,7) Ammoniuiaacetatpuffer bereiteten linearen Puffergradienten eluiert. Die den gewünschten Stoff enthaltenden Fraktionen werden gesandelt und lyephilisiert. Man erhält 0,250 _S (43 SS) Oktakosapeptide, das nach UV-Absorptionsmessunsen 31,0 % Peptid enthält. Gehalt an Met-Sulfoxyd: 4,4 ;5. Verhältnis v-n

£09809/1211

BAD ORIGINAL

Tyr:Trp = 2,05. Aminosäureanalyse: Lys 3,76 (4), His 0,8 (l), Arg 3,05 (3),Asp 1,00 (1), Ser 0,73 (1), GIu 1,94 (2), Pro 3,00 (3), GIy 2,95 (3), AIa 1,05 (1), VaI 2,82 (3), Met 0,78 (1), Tyr 1,6 (2), Phe 0,83 (1).

Das als Ausgangstoff verwendete Trihydrochlorid des geschützten substituierten Oktakosapeptides wird auf folgende Weise hergestellt:

Schritt 1} tert.-Butyloxycarbonyl-D-^ ~ariinooxy-ß~ -benzylesy-propionsiure

Das gea'iß Schritt 1 des Beispieles 4 gewonnene.( + )~Araphetaminsalz der tert.-Butyloxycarbonyl-D-tL-aminqoxy-ß-benzyl- ©xypropionsäure wird aus Äthanol umkristallisiert. Ausbeute: 13,27 ε, Schmelzpunkt: 188-191 ⁰C, /öL/^⁶ = +54 ° (c = 0,5, Methanol). Durch die auf übliche Weise durchgeführte Zersetzung des Salzes werden 7,9 g (14 ß>) tert.--^Butyloxycarbonyl-D-dL.-ar.iinoexy-ß-benzyloatypropionsäure erhalten. Schmelzpunkt: 96-98 C, /cC/q⁰ = + 38 °(c=l, Ethanol).

Schritt 2: terti—Butyloxycarbonyl-D- ^-aminooxy-ß- -hydroxypropionsüure (BOG-D-OSer)

5,5 g (17,7 mMol) D-tK-tert.-Butyloxycarbonyl-amino-•xy-ß-benzylexypreionsäure werden in 110 ml Methanol gelöst und in Gegenwart von 2,75 g 10 %-igem Palladium-Aktivkohle-Katalysater hydriert. Nach drei Stunden wird der Katalysator abfiltriert und das nach dem Abdestillieren des Methanols zurückbleibende Öl unter Petroläther stehen gelassen. Die Substanz kristallisiert innerhalb einiger Stunden aus. Nach Filtrieren und anschließendem Trocknen werden 3,65 g (96 %) D-^ -tert.-Bulyloxycarbonyl-aninooxy- -ß-hydroxyprepionsäure erhalten. Schmelzpunkt: 94-95 ^UC, R_f = 0,27. CgH₁₅NO₆ (221,22).

A 0 9809/121 1

Schritt 3: BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met-If Η.»

4,4 E (2o fflMol) BOC-D-OSer und 9 @ (20 mMel) Tyr~ -Ser-Met-OCH^ werden in JO ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird auf O ⁰C abgekühlt und mit 2,22 al (20 raMol) N-Methylraorpholin, dann mit 3,B ι; (.18,4 nMol) DCC versetzt. Das Reaktionsgeraisch wird eine Stunde lang bei 0 ⁰C gerührt, dann bei Zimmertemperatur bis zum anderen Tace stehen gelassen« Das DCU wird abfiltriert, das Filtrnt eingedampft und der Rückstand in 400 al Essig ester gelöst. Die Lösung wird zwoiaal. mit je 200 ml η Salzsäure, zweimal nit je 200 ml 8 #-iger Natriumhydregencarbonatlösung gewaschen, dann getrocknet und eingedampft. Die als Rückstand erhaltenen 8,10 g Ester des geschützten substituierten Tetrapeptides werden in 85 ml Methanol gelöst," mit 2,2 ml (46 mMel) Hydrazinhydrat versetzt und bei Zimmertemperatur bis zum nächsten Tage stehen gelassen. Anderntags wird das Methan·1 abdestilliert, der Rückstand wird mit Essig ester verrieben, abfiltriert, mit Essig ester und Äther gewaschen und schließlich über konzentrierter Schwefelsäure getrocknet. Man erhält 7,21 g (63 %) Hydrazid des geschützten substituierten Tetrapeptides. Schmelzpunkt: 174-175 ⁹C, (aus Wasser umkristallisiert). R_f = 0,30. Analyse C₂5^H40^N6°10^S (^6l6»69):
Berechnet: C 48,7 % H 6,55 % N 13,6 % Gefunden: C 48,3 % H 6,6 JS . N 13,8 % Schritt 4: B0C-D~OSer~Tyr-Ser-Mot-Glu(0Bu^t)-His-Phe-Arg-

-TrP-GyI-LyS(BOC)-PrQ-VaI-GIy- „ HCl 1|25 β (2,13 mMel) BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met-NgH.

werden in 15 al Dimethylformamid gelöst und zu der auf -20 C gekühlten Lösung unter Rühren 2,08 ml (8,32 raMol) 4 η salz-

409809/1211

saurer Essig^ ester, danach 0,32 lal (2,70 «Mol) tort.-ButyI-

nitrit getropft. Das Reaktionsgemisch wird bei -10 °C 5 Minuten lang gerührt, dann _aUf -20 ⁰C gekühlt und die Lösung von 2,78 g ■ GIu(OBu )-His-Phe-Arg-Trp-Glv-Ljs(BOC)-Pro-Val-Oy und 1,4 al (8,13 raMol) Diisopropyläthylanin In 23 al Diiaethylforuqnid augegeben. " Das lieaktionsgeaisch v/ird bei einer Temperatur von -5 bis 0 ⁰C eine Stunde lang nachgerührt und bei 0 °C bis zum nächsten Tage stehen gelassen. Die Lösung wird eingedampft, der Rückstand mit 8 fo-iger Uatriurahydrogencarbanatlösung verrieben und abfiltriert. Nach Waschen und Trocknen erhält aan 3,49 g (94 %) geschütztes substituiertes Tetradekapeptid. Dieses wird in 24 nl Methanol suspendiert und mit einer aus 4,75 ral konzentrierter Salzsäure und 4,75 ml Pyridin bereiteten Pyridinhydrochloridlösung versetzt. Die erhaltene Lösung wird axt 240 nl Wasser verdünnt, der ausgefallene Niederschlag abfiltriert, mit Uasser gewaschen und dann getrocknet. Man erhält das Hydrochlorid des geschützten Tetradekapeptides in einer Ausbeute von 2,95 g (73 >S). Schmelzpunkt: 200-202 ⁹C, R* = 0,25* ^C9i^Hi34^N2l°25^C1S (1989,68).

Schritt 5: BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Het-Glu(OBu^t)-His-Phe-

-Ar£-Trp-Gly-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)- -LysCBOC^-Arg-Arg-Pro-Val-LysCBOCMal-Tyr ( Bu^t )-Pro-Asp( OBu¹¹VAIa-GIy-GIuC OBu* )-0Bu^t

0,350 g (0,176 QMol) BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Het-GlU(O -His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC)-Pre-Val-Gly . HCl, 0,400 g (0,176 mM»l) Lys(BOC )-Lys(BOC)-Arg-Arg-Pre-Val-Lys( BOC)-VaI-Tyr( Bu*)-Pro- -Asp(OBu^t)-Ala-Gly-Glu(OBu^t)-OBu^t . 3 HCl und 0,281 g (1,05'aMol) PCPOH werden in 3,3 ml Dimethylformamid gelöst und der Lösung 0,025 ml (0,18 mMol) Triäthylanin, danach 0,74 g (0,Jb uflol) DCC cuce:;oben.

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Das Reaktionsgeaisch wird bei ZLxaartemperatur 2 Tage lang "stehen gelassen, dann das DCU abfiltriert und das Filtrat mit ml Äther verdünnt. Das ausgefältte Produkt wird abfiltriert, mit.

Äther gewaschen und anschließend getrocknet. Das Trichlorid des ,,opchützten substituierten üktakosapeptides wird in einer Ausbeute von 0,673 g (9O,-7 ;*) erhalten. Schmelzpunkt: 158-162 ⁹C, R^ = 0,25. C₁₃₅H₃₁₃N₄₄O₅₀Cl₃S (4212,33).

Bgispiel 6

D-OSer-Ty r-S6r-Met-Gl u-IIi s-Pho-Arg-Trp-Gly-Ly s-Pro-

-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Ars-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-Asn- -Gly-Ala-Glu-Asp-Glu-Sor-Ala

1,00 ε (0,214 BiHoI) BUC-D-OSer-Tyr-Ser-Met-Gl^OBu*)- -Hi s-Phc-Arg-Trp-Gly-Ly s( BOC )-Pro-Val-Gly-Lys( BOC )-Ly s( BOC )- -Arg-Arg-Pre-Val-Lys( BOC)-VaI-Ty r(Bu^t)-Prc-Asn-Gly~Ala-Glu( OBu*)- -Asp( OBu* )-Asp( OBu* ^GIu(OBu* ^Ser-Ala-OBu* . 3 HCl werden in einem Gemisch aus 8 ml Trifluoressigsüure, 1 ml V/asser und 1 nl Anisol gelöst. Die Lösung wird bei Zimmertemperatur eine Stunde lang stehen gelassen und dann axt 200 ral Äther verdünnt. Der ausgeschiedene Niederschlag wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und im Vakuum über Phosphorpentexyd und Kaliumhydroxyd , getrocknet. Das Trifluoracetat des substituierten Dotriakontapeptides wird in einer Ausbeute von 0,90 g (88 %) erhalten.

Das rohe Trifluoracetat wird in 20 nl Vhsser gelöst^

\A/e/ctev\ . i u ■

und die Trifluoracetationen mittels Acetationenaustauschernara der Marke Dowex 1x8 gegen Acetationen ausgetauscht. Die erhaltene Lösung, die das Acetat des substituierten Dotrialcontapeptides enthalt, wird auf eine mit Ionenaustausch^ der Marke' Whatman CM 52 cefü^llte Säule aufgebracht und mit einem aus 0 01 ti (pH 4,5) und 0,4 κι (pH 6,7) A.mn©niuraacutatpufΓβ-r bcrei-

409809/1211 _{eAD oalalNAL}

teten linearen Puffergradienten eluiert. Die den gewünschten Stoff enthaltenden Fraktionen worden gesammelt und lyophili- * siert. Es werden 0,46 g (46 %) substituiertes Dotriakontapeptid erhalten.

Das alö Ausgangsstoff verwendete Trichlorid des geschlitzten substituierten Dotriakontapeptid.es kann auf folgende Weise hergestellt v/erden:

Schritt 1: Z-GIu(OBu J-^

23,9 S (100 niMol) Z-Ser und 14,5 g (100 mMol) AIa- -OBu werden in IgO ml Methylen chlorid gelöst, die Lösung auf -10 ⁰C gekühlt und bei dieser Temperatur 20,6 g (100 mMol) DGC in 100 al Methylenchlorid zugetropft. Das Reaktiensgenisch wird bei 0 C zwei Stunden lang gerührt und dann bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Anderntags wird das ausgeschiedene

DCU abfiltriert und das Filtrat mit 3x70 ml η Salzsäure und 3»70 ml 5 $-iger Natriumhydrogencarbonatlösung ausgeschüttelt. Die Methylenchloridphase wird nach dem Trocknen eingedampft, dar ölige Rückstand mit 50 ml Essig ester aufgenommen und die Lösung bei 0 C 4 Stunden lang stehen gelassen. Das ausgeschiedene DCU wird abfiltriert, das Filtrat eingedampft und der ölige Rückstand mit η-Hexan verfestigt. 30,0 g (82 ^c/o) rohes Z-Ser-Ala- -OBu werden erhalten. Das Produkt wird in 600 al Methanel gelöst und in Gegenwart νβη 2 g 10 ?S-igem Palladiura-Aktivkohle-Katalysater hydriert. Nach Beendigung der Reaktion wird der katalysator abfiltriert und die Lösung eingedampft. Das erhaltene Ser-Ala-OBu wird in 200 ml Essig ester gelöst und mit 33.0 S (76 mMol) Z-Glu(OBu*)-ONSu zur Reaktion gebracht. Am nächsten Tage wird das Reaktiensgenisch dreimal mit je 50 ml η Salzsaure und dreimal mit je 50 ml Natriumhydrogencarbonatlösung ausgeschüttelt. Die

409809/1211 BAD ORlQSNAL

Essig esterphase wird getrocknet, eingedampft und der Rück-

stand rait Petroläther verrieben. Das rohe Produkt wird aus einem Geraisch aus Essig ester und Petroläther umgefüllt. 31,5 g

(75 %) Z-GIu(OBu VSer-Ala-OBu* werden gewonnen, das bei 72-74*0 schmilzt. Rl = 0,6.
Analyse C₂₇H₄₁H₃O₉(SSlιÖ4)»

.Berechnet! C 58,8% H 7,5% N 7,65% Gefunden: C 58,8 % H 7,7 % N 7,8 %

Schritt 2: Glu(OBu^-Ser-Ala-OBu*

16,0 g (29 mMol) Z-Glu(OBu*VSer-Ala-OBu* werden ' in 35Ο ml Methanol gelöst und in Gegenwart von 1,6 g 10 %-igeM Palladium-Aktivkehle-Katalysator hydriert. Nach Beendigung der Reaktion wird der Katalysator abfiltriert, das Lösungsmittel abdestilliert und der Rückstand aus einem Genisch van Methanol und Äther umkristallisiert. Man erhält 9,06 g (75 %) iripeptid, das bei 135-136 *C schmilzt. R* = 0,15 /W_D = -25,9* (csl, Äthanol).
Analyse G₁₉H₃₅N₃O₇ (417,80):

Berechnet: C 54,6 % H 8,5 % N 10,1 % Gefunden: C 54,5 % H 8,4 % N 9_t8 %

Schritt 3! Z-Asp(OBu*VGIuC

8,2 g (19,6 mMol) Glu(OBu^-Ser-Ala-OBu* und 8,Og (19,0 aMol) Z-Asp(OBu*)-ONSu werden in 80 ml Essigäthylcster zur Reaktion gebracht. Am nächsten Tage wird da» Reaktionsgemisch dreiaal mit je 20 ml η Salzsäure und dreimal mit je 20 ■1 5 96-iger Natriumhydrogencarbonatlösung ausgeschüttelt. Die Essig esterphase wird getrocknet und eingedampft, der Rück stand «it Petroläther verrieben» Der Ester des geschützten,

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Tetrapeptides wird in einer Ausbeute von 12,08 g (85,5 %) erhalten. Schmelzpunkt: 85-87 ⁹C, R* = 0,55. Analyse C₃₅H₅₄N₄O₁₂ (722,81).

Berechnet: N 7,3 %
Gefunden: N 7,8 ^

Schritt 4: Asp(OBu )-Glu(OBit^t)-Ser-Ala-OBu^t 10,5 g (14,5 raMol) Z-Asp( OBu*)-Glu( OBu¹^)-SCr-AIa-OBu* werden in I30 ml Methanol gelöst und in Gegenwart von 1 g 10 %-igea Palladiuci-Aktivkohle-Katalysator hydriert. Nach Beendigung der Reaktion wird der Katalysator abfiltriert, die Lösung eingedampft und der Rückstand mit Petroläther auf ein Filter aufgebracht. 8,35 g (97,5 %) Tetrapepdidester werden erhalten. Schmelzpunkt: 80-81 *C, R* = 0,1 /dk/_ß = -24,3 ° (c = 1, Äthanol), C₂₇H₄₈N₄O^588, 68).

Schritt 5: Z-Glu( OBu*>-Asp(OBu*)-Glu( OBu*)-Ser-Ala- -OBu*

5,0 g (11,5 mMol) Z-Glu(0Bu*)-0NSu und 6,60 g (11,2 »Mol) Asp(0Bu^t)-Glu(OBu^t)-Ser-Ala-OBu^t werden in 100 ml Chlorefora zur Reaktion gebracht. Das Reaktiensgeuisch wird am nächsten Tage dreimal »it je 30 »1 η Salzsaure und dreimal mit je 30 ul 5 %-iger Natriumhydregencarbonatlösung ausgeschüttelt. Die Chleroferaphase wird getrocknet und eingedampft, der gelartige Rückstand mit Petreläther verrieben. Das rehe Produkt wird aus einem Gemisch ν·η Essig^^^ester und Petroläther uagefallt. Man erhält den Ester des geschützten Pentapeptides in einer

ο 4 Ausbeute von 8,45 g (83 #). Schmelzpunkt: 168-169 C, R_f = 0,5 = -29,0 (csl, Äthanol).

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Analyse: G₄₄H₆ N₅O₁₅ (900,0?)

Berechnet: C 58, 2 % H 7,7 % N 7,7 %
Gefunden: G 58,4 % H 7,7 % N 7,5 %

Schritt 6: Glu( OBu¹¹VASpC QBu¹¹VGIuC OBu*)-Ser-AIa-OBu* 8,0 g (8,8 DiMoI) Z-Glu(0Bu*)-Asp(0Bu*)-Glu(0Bu*V -Ser-Ala-OBu werden in 160 ml Heihanoi gelöst und in Gegen- \iart von 1,0 g 10 #-igem Palladiua-Aktivkohle-Katalysator
hydriert, ^ach Beendigung der Reaktion wird der Katalysator· abfiltriert, die Lösung eingedanpft und der gelartige Rückstand mit einem Gemisch aus Äther und Petroläther auf ein
Filter aufgebracht. Man erhält 6,40 g Pentapeptidester, der bei I36-I33 °C schmilzt. P^ = 0,1, /Ji/^ = -29,7 ° (o = 1, Athanel), C₃₆H₆₃N₅O₁₃ (773,94).

Schritt 7: Z-AIa-Glu( OBu^t)~Asp( OBu¹^)-GIuC ¹ -Ser-Ala-OBu

5,20 ε (6,7 ήΜοί) Glu(OBu*)-Asp(OBu⁴V

_Ser-Ala-OBu* werden in 50 ml Chloroform mit 2,15 S (6,7 mMol) Z-Ala-ONSu zur Reaktion gebracht. Das Reaktionsgeaisch wird am nächsten Tage dreimal mit je 10 ml η Salzsäure und dreimal mit je 10 Hl 5 %-iger Natriuahydrogencarbonatlösung ausgeschüttelt. Die Chleroferm-lösung wird getrocknet und eingedampft, der gelartige Rückstand wird mit Petroläther verrieben. Man erhält den Ester des geschützten Hexwpeptides in einer Ausbeute von 6,10 ε (93 #)· Schmelzpunkt: 1^4-195 °C, R^ = 0,5 / el/_D =-30,9° (c=l, Äthanol), C₄₇H₇₄N₆O₁₆ (979,14).

Schritt 8: AIa-GIuC OBu^-AspC üBu^t)-Glu( OBu )-Ser- -AIa-OBu*

6,10 g (6,2eMu1) Z-Ala-GIu(UD₁;"^-Asp^Bu*)_

409809/1211

-GIu(OBu )-Ser-Ala-OBu werden in 120 ral Methanol gelöst und in Gegenwart von 1,0 g 10 %-x^en Palladium-Aktivkohle-Kataly- * sator hydriert. Nach Beendigung der Reaktion wird der Katalysator abfiltriert, die Lösung eingedampft und der krfetalline Rückstand aus einen Geraisch von Äthanol und Äther um-Kristallisiert. Es werden 4,35 g (83 %) Hexapeptidester erhalten, der bei 192-194 ⁰C schmilzt. R^ = 0,25, rf a 0,1, R* = 0,65.
Analyse C₃₉H₆₈NgO₁₄ (845,00)

Berechnet: C 55,4 % H 8,1 % N 9,9 % Gefunden: C 55»2 % H 7,8 £ Ji 9|6 %

Schritt 9: 2-Asn-Gly-Ala-Glu(0Bu^t)-Asp(0Bu^t)-Ser- -^Ala-0Bu^t

2,45 β (13#3 mMol) PFPOH, 1,31 g (4,02 mMol) Z-Asn~ -GIy und 3,40 g (4^2 raMol) Ala-Glu(OBu*)-Asp(OBu*^GIu(OBu*)- -Ser-Ala-OBu werden in 24 al wasserfreiem Dimethylformamid gelöst, die Lösung auf 0 ⁰C abgekühlt und mit 0,915 g (4,43 aMel) DCC versetzt. Das Reakticnsgeraisch wird eine halbe Stunde lang bei 0 C, dann zweieinhalb Stunden lang bei Ziairaertemperatur gerührt. Das ausgeschiedene DCU wird abfiltriert und die Lösung eingedampft. Der feste Rückstand wird mit Essigester verrieben und abfiltriert. Das rohe Produkt wird mit 20 al Essig! .ester gekocht und auf dem Filter zweimal ■it 10 ml heißem Essig ester gewaschen. M«n erhält den Ester des geschützten Oktapeptides in einer Ausbeute von 4,12 g (89 %). Schmelzpunkt: 200-201 ⁹C, R_f = 0,60.
C₅₃H₈₃N₉O₁₉ (1150,30).

Schritt 10: Asn-Gly-Ala-Glu( OBu^-AspC O3u )-ülu( OBu )-

409809/1211 ORfGlMAL [NSPECTED

4,0 g (3,48 inMol) Z-Asn-Gly-Alsi-Glu(0Bu*)rASp(OBu*)-" -Ser-Ala-OBu werden in 140 uL Methanol gelöst und in Gegenwart van 0,5 g 10 %-igea Palladium-Aktivkehle-Katalysator hydriert· Nach Beendigung der Reaktion wird der Katalysator abfiltriert, die Lösung ein^edaapft und der Rückstand mit Äther verrieben. Es werden 3»40 g (96 %) Oktapeptidester erhalten, der bei I88-19O ®C schmilzt. R^ s 0,5 /(J^ /_D = -6,6 ° (c=O,89, DimethylferGiamid). C₄₅H₇₇N₉O₁₇ (1016,17)

Sei. itt 11: Z-Ly s( BOC)-Lys( BOC )-Ar,-;( IJO₂ )-ArpC N0„ )- -Pro-Val-Lys( BQC)-Val-Tyr( Bu^-Pro-Asn- -Gly-Ala-Glu(OBu^t)-Asp( OBu*)-Glu( OBu*)- -Ser-Ala-OBu*

3iO g (2,95 BiMoI) Asn-Gly-Ala-Glu(OBu^t)-Asp(OBu*>-Glu(OBu*)-Ser-Ala-OBu^t und 5,46 g (2,95 nMol) Z-Lys(BOC)- -Lya^BOC)-Arg(HOg)-Arg(NO₂)-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr(Bu*)-Pre (ungarische Patentschrift Nr. 155 254) werden in 33 ^l Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird auf 0 C gekühlt^und 3,35 δ (4,42 mMol) DCC-PFPOH-Xeraplex /J. Kovacs u.a.: J.AaCheia. S*c, 89_, I83 (1967)/ zugegeben. Das Reaktiensgeraisch wird 15 Minuten lang bei 0 ⁰C gehalten, danach bei Zimmertemperatur sechs Stunden lang stehen gelassen. Das ausgeschiedene DCU

ti

wird abfiltriert und das Filtrat in 450 ml wasserfreien Äther eingeg»ssen, Die erhaltene Suspension wird bis zum nächsten Tage

an einem kalten Ort stehen gelassen und dann filtriert. Das rehe Produkt wird aus Methanol und Essigäthylester umgefällt. Es worden 7,18 g (85, 1 %) Ester des geschützten Oktadelcapaptides erhalten. R^ = 0,35,V(^ /_D = -26,4 ° (c = 0,42, Dimethylformamid), C₁₃₁H₂₁₄N₃₀O₄₀ (2849,34),

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Schritt 12: Lys(BOC)-Ly s(BOC)-Arg-Arß-Pro-Val-Ly s( BOG)~ -Val-Yyr( Bu* V-Pro-Asn-Gly-Ala-Gluf OBu^t V -Asp( OBu¹¹ )-Glu( 0Bu^t *

6,5 g (2,28 mMol) Z-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Ar₂

Arg( NO₂ >-Pre-Val-Ly s( BOC )-Val-Tyr( Bu¹¹ )-Pi-o-Asn-Gly-Äla- -GIu(0BuQ-Anp60Bu )-Glu(0Bu^t)-Ser-Ala-OBu^t werden in 85 ml Essigsäure gelöst und in Gegenwart von 2 g 10 jS-igem Palladium-Aktivkohle-Katalysator hydriert. Nach Beendigung der Reaktion wird der Katalysator abfiltriert, die Lösung eingedampft

und der ölige Rückstand rait wasserfreien Äther verrieben« Nach den Filtrieren wird das erhaltene Acetat des Oktadekapeptidester in 70 ml Wasser gelöst. Die Lösung wird mit verdünnter Salzsäure auf pH 4 eingestellt und das Hydrochlorid des Oktadekapeptidesters mit 30 #-iger Natriumchleridlösung ausgefällt-· Das Produkt wird abfiltriert, in einem Gemisch

von Äthanol und Chloroform gelöst, die Lösung filtriert, eingedampft und der Rückstand rait Äther verrieben. Das Trihydrechlorid des Oktadekapeptidesters wird in einer Ausbeute von 5,6 g (89,5 #) erhalten. R^ ₌ ^₃₅ /<^_β = -26,1° (c = 1, Dine thyIforraamid). ⁰ΐ23^Η2]/28^Ο34^Ο3Ι·3 C2734,60).

Schritt 13: BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met-Glui OBu )-His-Phe-Arg-Trp-Glv-LysCBOCVPro-Val-Gly- -Lv s( BOC)-Lys(BOC)-ArE-Arft-Pro-Val- -^yr(Bu^t)-p_ro-.Asn-Gly-Ala-Glu(OBu^t)- -Asp( OBu¹^)-GIuC OBu* ^Ser-Ata-OBu¹¹ 0,525 g (0,264 mMel) BOC-D-rOSer-^yr-Ser-Het- -Glu(OBu^t)-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC)-Pro-Val-Gljf . HCl und 0,720 s (0.264 aMol) Lys(BOC)-LyS(BOC)-Ar₂-Arg-Pro-Val-

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-Ly S(BOC >ν·1-1^ΐ(Βα*>-ΡΓθ-Α8η--01?-Α1β-β1< OBu^AsK OBu*)- -Glu(0Bu^t)-Ser-Al«-OBu^t . 3 HCl werden in 4,0 ■! Biaethylfemamld gelöst und der Lösung 0,03 "1 (0,270 «Η·1) K-Methyl-■•rphelin, danach C₁23 g (0,40 aMel) DCC-PFPOE-Kraplex zugegeben* Das Beaktiensgenisch wird bei Zinaerteaperatur 2 Tage •tehen gelassen· Das DCU wird abfiltriert und das Filtrat »it 40 Kl Äther verdünnt. Das ausgefällte Prednkt vird abfiltriert, ■it Äther gewaschen und anschließend getrocknet« Das Tvichlerid des geschlitzten, substituierten Detriakentapeptides wird in einer Auebeute τ·η 1,10 g (89 *) erhalten. Schmelzpunkt: 182-186 ⁹C, 0,27.

^C214^H344^ll49^O59^Cl3^S

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Claims (6)

PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Herstellung neuer Peptide mit ACTH-Wirkung sowie der nit Sauren gebildeten Additionssalze, ferner der Derivate und Komplexe dieser Peptide, dadurch gekennzeichnet , daß man von Peptiden, veLche aus einer von der N-terminalen bis wenigstens der 16. Aminosäure vollständigen ACTH-Sequenz bestehen, an Stelle einzelner Aminosäuren der ACTH-Sequenz jedoch gegebenenfalls andere Aminosäuren, an Stelle der ersten Aminosäure aber in jedea Falle eine ^-Aminooxy säure enthalten und wenigstens _an der terminal en Arainooxy gruppe und äa den Aminogruppen der Seitenkette^ gegebenenfalls auch an der terminalen Carboxylgruppe und an den Carboxylgruppen der Seitenketten geschützt sind, die Schutzgruppen ab spaltet und die erhaltenen Verbindungen gewünsehtenfalls in ihre Säureadditionssalze, Derivate oder Komplexe überführt«

2· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Ausgangstoff geschützte Peptide verwendet, welche an Stelle der ersten Aminosäure der ACTH-Sequenz Aiaineoxyessigsäure (OGIy), L- oder D-qfe*Aminoexy~ propionsäure (QAIa ) L- oder D- tXeArain&oxy-ü-hydroxypropionsäure (OSer) enthalten.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß man als Ausgansetoff geschütze Peptide verwendet, dren Aminosäurenreihenfolge sich von der Sequenz der nst tür liehen menschlichen ACfH dadurch unterscheidet, daß an

P^- Stelle der Asu -Gruppe eine Asp-Grupp«, an Stelle der GIy -

-Gruppe eine Ala-Smppe und an Stelle der Ala^2?-Grttppe eine GIj-—Gruppe steht«

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4* Verfahren nach den Ansprüchen 1- 3-. d a d u r c -h gekennze ichne t , daß man als Ausgangsstoff Peptide vorwendet, deren Aminooxygruppen und Aminogruppen rait tert·—
-Butyl oxy carbonyl gruppe η und deren Ca ibox-yl gruppen Qit tert«- -Butylestergruppen geschützt sind*

5· Verfahren nach Anspruch 4» dadurch gekennzeichnet, daß sämtliche Schutzgruppen, durch
Acidolyse abgespalten werden.

6. Verfahren nach den Ansprüchen 4 und 5, dadurch gekennzeichnet , daß sämtliche Schutzsruppen mit Trifluoressigsäure abgespalten worden.

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