DE2341775B2 - In Nterminaler Stellung den Rest einer Aminooxysäure aufweisende Peptide mit ACTH-Wirkung, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie diese Peptide enthaltende Arzneimittel - Google Patents

Description

Es ist bekannt, daß die Peptidkette des Adrenokortikotrophormons (ACTH) abgeändert werden kann, ohne daß dadurch die adrenokortikotrope Wirkung aufgehoben würde. So kann vom C-terminalcn Ende des Moleküls mehr als ein Drittel der Aminosäurekette abgespalten werden, ohne daß ein Absinken der spezifischen Aktivität eintritt. Die Abspaltung weiterer Aminosäuren führt jedoch zu einer schlagartigen Abnahme der Aktivität. Das Fragment 1 — 19 verfügt über 30% der Aktivität des Moleküls, das Fragment 1-16 demgegenüber nur über ungefähr 1%. Im Gegensatz dazu verursacht am N-terminalen Ende bereits das Abspalten der ersten Aminosäure eine 50%ige Verringerung der Aktivität (E. Schröder, K. Lübke: The Peptides, Academic Press, New York 1966. 246-249).

Ferner ist bekannt, daß ACTH-Fragmente, die an Stelle des N-terminalen Serins D-Aminosäuren, in der Natur nicht vorkommende Aminosäuren oder die vom Serin durch Fortlassen von dessen funktioneilen Gruppen ableitbaren Acylrcste (ß-Hydroxypropionyl-, Propionylrest) enthalten, fallweise eine Aktivilät zeigen, die selbst die Wirkung des natürlichen ACTH iihrririffl, da diese modifizierten ACTH-Fragmente — wie anzunehmen ist — gegenüber den Enzymen vom Typ der Aminopeptidase resistent sind und deshalb im Organismus langsamer abgebaut werden als das natürliche ACTH. Aus diesem Grunde zeigen sie auch dann noch eine starke ACTH-Wirkung, wenn die modifizierende Gruppe die Funktion des Serin-Teiles der natürlichen ACFH nicht vollständig zu erfüllen vermag. Von den substituierten ACTH-Peptiden dieses Typus sind durch die Arbeit Schweizer Forscher D-Serin- Derivate (CH-PS 4 99 497, 4 67 246 und 4 88 663), aus der Arbeit zweier japanischer Forscherkollektive Sarkosin-, ^-Alanin- und a-Aminobuttersäure-Derivate (DE-OS 20 55 151, 20 34 698, 21 14 300, 1\ 24 549 und 2112 553) bekannt. Die /?-Hydroxypropionyl- und

is Propionyl-Derivate sind ebenfalls aus Schweizer Arbeiten bekannt (FR-PS 15 13 943 und 15 13 944).

Es wurde nun gefunden, daß es zum Eri eichen der erwähnten Schutzwirkung gegenüber Enzymen und damit zur Erzielung einer gesteigerten ACTH-Wirkung außerordentlich vorteilhaft ist, wenn der N-terminale Serinrest im ACTH-Molekül oder in dessen Fragmenten durch den Rest einer a-Aminooxysäure ersetzt wird. Ober eine besonders hohe Aktivität verfügen die Aminooxyacetyl-, L- und D-a-Aminooxypropionyl sowie L- und D-Ä-Aminooxy-^-hydroxypropionyl- Derivate.

Gegenstand der Erfindung sind Peptide mit einer von der N-terminalen Aminosäure bis wenigstens zur 16. Aminosäure vollständigen ACTH-Sequenz, die in

jo jedem Falle anstelle des N-terminalen Serylrestes den Rest der Aminooxyessigsäure, L- oder D-a-Aminooxypropionsäure oder L- oder D-«-Aminooxy-/?-hydroxypropionsäure enthalten und die gegebenenfalls anstelle einzelner Aminosäurereste der ACTH-Sequenz fol-

r> gende anderen Aminosäurereste enthalten können:

in Position 2j Asparagyl anstelle von Asparaginyl und/oder

in Position 26 Alanyl anstelle von Glycyl und/oder in Position 27 Glycyl anstelle von Alanyl,

wobei den ausgetauschten Aminosäureresten die Sequenz des natürlichen menschlichen ACTH zugrunde liegt, sowie deren Säurcadditionssalze und Amide.

Die erfindungsgemäßen neuen Verbindungen können also beispielsweise substituierte Peptide sein, die auf die erste Aminooxysäure folgend die Sequenzteile 2 bis 16, aber auch 2 bis 39 des natürlichen ACTH enthalten. Im Hinblick auf ihre ACTH-Wirkung sind besonders das [L- und D-OSer', Asp", Ala», GIy²⁷J-*¹ »ACTH und das [D-OSer¹]-«¹ "ACTH zu erwähnen. (OSer bedeutet den Rest der «-Aniinooxy-ß-hydroxypropionsäure, die sich von Serin nur durch das zwischen das a-C-Atom und die Aminogruppc eingeschobene Sauerstoffatom unterscheidet.) Im folgenden werden die mit den entsprechenden Aminosäuren strukturell identischen Aminooxysäuren in analoger Weise bezeichnet, somit OGIy = Aminooxyessigsäure, OAIa = Λ-Aminooxypropionsäure.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Herstellung der Peptide der oben erwähnten Zusammensetzung sowie von deren Säureadditionssalzen und Amiden, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man von Peptiden der obengenannten Art, die wenigstens an der terminalen Aminooxygruppe und den Aminogruppen der Scitenketlen, gegebenenfalls auch an der termimalen Carboxylgruppe und den Carboxylgruppen der Seitenketten geschützt sind, jeweils in an sich bekannter Weise die Schtitzgruppen abspaltet und die

erhaltenen Verbindungen gewünschtenfalls in ihre Säureadditionssalze oder Amide überführt.

Gegenstand der Erfindung sind schließlich Arzneimittel, die eine Verbindung nach Ansp.iich 1 oder 2 enthalten.

Die als Ausgangsstoffe verwendeten geschützten Peptide werden, ausgehend von einer der genannten, geschützten a-Aminooxysäuren, in an sich bekannter Weise durch Fragmentkondensation oder durch Kettenverlängerung um jeweils eine Aminosäure hergestellt, wobei nach der Azid-, der Aktivester-, der DCC- oder der Methode des gemischten Anhydrids gearbeitet werden, aber auch die sogenannte Synthese in fester Phase angewandt werden kann, bei der das Peptid mit seiner am Kettenende befindlichen Carboxylgruppe an ein Polymer gekuppelt ist und aufgebaut wird, indem die Aminosäuren und schließlich die Λ-Aminooxysäure in der entsprechenden Reihenfolge an die an das Polymer gebundene C-terminale Aminosäure angebaut wird.

Die funktioneilen Gruppen, die an der Reaktion nicht teilnehmen, werden zweckmäßig geschützt, und zwar durch Gruppen, die durch Hydrolyse, Acidolyss, Hydrazinolyse oder Reduktion leicht abspaltbar sind. Die Carboxylgruppe kann zum Beispiel vorzugsweise durch Verestern mit Methanol, terL-Butanol, Benzylalkohol oder p-ChlorbenzylalkohoI oder durch Amidbildung geschützt werden, zum Schütze der Aminooxy- und der Aminogruppen kommen in erster Linie die Tosyl-, Formyl-, Trifluoracetyl-, o-Nitrobenzolsulfonyl-, Phthalyl-, Benzyloxycarbonyl- und p-Chlorbenzyloxycarbonyl-Gruppe, besonders, jedoci: die tert.-Butyloxycarbonylgruppe in Frage. Die Arginin-guanidino-Gruppe kann vor allem durch die Jitrogruppe geschützt, jedoch auch in ihrer protonierten Form verwendet werden. Die Iminogruppe des Histidins kann vor allem durch die Benzyl-, Trityl- oder Dinitrophenylgruppe geschützt werden. Die Hydroxylgruppen der Seitenketten werden fallweise durch Veräthern geschützt, wobei vorzugsweise mit tert.-Butanol und Benzylalkohol veräthert wird.

Durch Anwendung einer geeigneten Kombination von Schutzgruppen kann erreicht werden, daß diese Schutzgruppen in an sich bekannter Weise, zum Beispiel durch Hydrolyse, Acidolyse, Hydrazinolyse oder Reduktion gleichzeitig entfernt werden können.

Nach einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird so vorgegangen, daß die geschützte Λ-Aminooxysäure in 1-Stellung mit dem Tripeptidester Tyr-Ser-Met-OCHj kondensiert, aus dem erhaltenen Peptid-mcthylester das Azid gebildet und mit diesem das Dekapeptid

GluiOBu'J-His-Phe-Arg-Trp-Gly-LysiBOC)-Pro-Val-Gly

acyliert wird. Das auf diese Weise erhaltene substituierte Tetradekapeptid wird danach mit der entsprechend geschützten C-terminalen Sequenz kondensiert. Bei der Herstellung eines substituierten Hexadekapeptides wird zum Beispiel mit dem 15-16-Dipeptid. bei der Herstellung eines substituierten Oktadekapcptides mit dem 15—18-Tetrapeptid, bei der Herstcl lung eines substituierten Oktakosapeptides mit dem 15 —28-Tetradckapeptid, bei der Herstellung eines substituierten Dotriakontapeptides mit dem 15 —J2-Oktadckapcptid, bei der Herstellung eines substituierten Nonatriakonlapeptides mit dem 15—39-Pentakosapeptid kondensiert. Hei diesen Kondensationen wird vorzugsweise das DCC-Verfahren oder die Methode des Aktivesters angewandt. In letzterem Falle, besonders bei der Verwendung von Pentachlorphenyl- oder Pentafluorphenylester, braucht der aktive Ester nicht isoliert zu werden; er kann mit Hilfe von Pentachlorphenol oder Pentafluorphenol aus dem substituierten Tetradekapeptid im Reaktionsgemisch der Kondensationsreaktion gebildet werden (vgl. OE-PS 2 95 05 i).
Eine alternative Möglichkeit zum Aufbau der als

ίο Ausgangsstoff verwendeten, in 1-Stellung immer eine a-Aminooxysäure enthaltenden Peptide besteht darin, daß die entsprechende C-terminale Sequenz mit dem geschützten 5 —14-Dekapeptid acyliert, die N-termina!" Schutzgruppe des erhaltenen Peptides entfernt und im letzten Schritt mit dem 1 —4-substituierten Tetrapeptid acyliert wird. Auf diese Weise können die als Ausgangsstoffe benötigten, in N-ierminaler Stellung eine Λ-Aminooxysäure enthaltenden, geschützten Peptide unmittelbar aus den N-terminalen Tetrapeptid-Derivaten hergestellt werden.

Am Ende der Synthese werden die an der N-terminalen a-Aminooxygruppe und an den Aminogruppen der Seitenketten befindlichen terL-Butyloxycarbonylgruppen, die an der Carboxylgruppe der Seitenketten

r> und an der C-terminalen Carboxylgruppe — sofern diese nicht amidiert ist — befindlichen tert.-Butylestergruppen sowie die am Hydroxyl der Seitenketten eventuell vorhandene tert.-Butyläthergruppe gleichzeitig mittels Acidolyse, vorzugsweise durch Behandeln mit

»ι Trifluoressigsäure, abgespalten. Die Reinigung des von seinen Schutzgruppen befreiten Endproduktes kann durch Verteilung im Gegenstrom oder durch Säulenchromatographie, beispielsweise durch Ionenaustauschchromatographie an unterschiedlichen Carboxymethyl-

)■> cellulose-Arten, vorgenommen werden.

Die im Sayers-Versuch (M. A. Sayers, G. Sayers und L. A. Woodbury, Endocrinology 42,329 (1948); G. Hamburger, Acta Endocrinol. 35, 594 (I960)) gemessene biologische Aktivität der erfindungsgemäßen Verbin-

4(i düngen übetrifft die Aktivität der entsprechenden, nicht durch «-Aminooxysäuren substituierten ACTH-Fragmente. So beträgt die auf die obige Weise gemessene Aktivität von [D-OSeri]-'-"ACTH (Beispiel 6) 127 ΙΕ/mg, die des handelsüblichen synthetischen

4Ί ACTH-Präparates Tetracosactrin dagegen nur 100 I E/mg.

Die neuen Verbindungen werden in Abhängigkeit von der bei ihrer Herstellung angewandten Methode in Form der freien Base oder als Salz erhalten. Aus

-,ο den Salzen können die Basen in an sich bekannter Weise freigesetzt werden. Die freien Basen können mit den für pharmazeutische Zwecke verwendbaren Säuren zu Säureadditionssalzen umgesetzt werden. Für diesen Zweck kommen anorganische Säuren, wie Salz-,

ο Schwefel- oder Phosphorsäure, aber auch organische Säuren, wie Ameisensäure, Essigsäure, höhere Fettsäuren sowie Milch-, Wein- oder Citronensäure, in Frage.
Unter Amiden der neuen Verbindungen werden auch

mi die am Stickstoff unterschiedlich substituierten Amide, in erster Linie jedoch die an der C'terniinalen Carboxylgruppe amidiertcn, in der Seitenkette aber gegebenenfalls auch freie Carboxylgruppen enthaltenden Peptidamide verstanden.

h". Aus den erfindungsgcmäßen Pcptiden können zur pharmazeutischen Verwendung die üblichen pharmazeutischen Präparate hergestellt werden. Diese Präparate enthalten die erfindungsgemäßen Verbindungen

zusammen mit zur enteralen oder parenteralen Verabreichung geeigneten organischen oder anorganischen Streckmitteln. Die pharmazeutischen Präparate können feste Lyophilisate sein, wobei als Streckmittel mit Peptiden nicht reagierende Verbindungen, zum Beispiel Mannit, Milchzucker oder Stärke, in Frage kommen; sie können aber auch in Form von Suspensionen und Emulsionen hergestellt werden, welche verschiedene neutrale Konservierungsmittel und Stabilisatoren enthalten. Besonders zweckmäßig ist es, wenn die pharmazeutischen Präparate die erfindungsgemäßen Verbindungen in Form der weiter oben erwähnten Komplexe enthalten, die eine verzögerte Wirkung des Präparates bewirken.

Entsprechend der üblichen Dosis des Adrenokortikotrophormons enthalten die pharmazeutischen Präparate die erfindungsgemäßen Verbindungen in einer Konzentration von zum Beispiel 0,5—5 mg/ml. Die Präparate können subcutan, intramuskulär oder parenteral 1— 7mal pro Woche verabreicht werden.

Die praktische Ausführung des Verfahrens wird an Hand der folgenden Beispiele näher erläutert.

In den Beispielen werden zur Bezeichnung der Aminosäuren und der Peptid-Derivate die durch die IUPAC-IUB vorgeschlagenen Abkürzungen benutzt (J. Biol. Chem. 247, 977/1972). Zur Bezeichnung der ot-Aminooxysäuren werden die den Abkürzungen der Aminosäuren ähnlichen, weiter oben bereits erwähnten Symbole OGIy, OAIa, OSer benutzt. Die obigen Abkürzungen beziehen sich — GIy und OGIy ausgenommen — falls nicht anders angegeben, auf die I.-Antipoden. Als weitere Abkürzungen werden verwendet:

PCPOH	= Pentachlorphenol,
PFPOH	= Pentafluorphenol,
DCC	= Dicyclohexylcarbodiimid,
DCU	= Dicyclohexylcarbamid,
BOC	= tert.-Butyloxycarbonyl,
Bu'	= lert.-Butyl,
ONSu	= Succinimidoxy,
Z	= Carbobenzoxy.

Die Bestimmung des Schmelzpunktes wurde mit dem Apparat nach Dr. Tottoli vorgenommen. Die dünnschichtchromatographischen Untersuchungen wurden an dem Adsorbens Silikagel nach Stahl mit folgenden Lösungsmittelgemischen durchgeführt:

1. Essigester :(Pyridin : Essigsäure : Wasser = 20:6:11) = 8:2

2. Essigester : fPyridin : Essigsäure : Wasser = 20:6:11) = 6:4

3. Essigester : Pyridin : Ameisensäure : Wasser = 50 : 20 :6 : 5,5

4. Chloroform : Methanol = 98 : 2

5. Chloroform : Methanol = 95 :5

Beispiel 1

OGIy-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Tyr-

Pro-Asp-Ala-Gly-Glu

0.600 g (0.143 mMol) BOC-OGIy-Tyr-Ser-Met-Glu(OBu')-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys( BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Arg-Arg-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr(Bu <)-Pro-Asp(OBu')-AIa-GIy-

Glu(OBu')OBir i HCl werden in einem Gemisch aus 4,8 ml Tnfluores igsäiire. 0,6 ml Wasser und 0.6 ml Anisol gelöst. Die Lösung wird bei Zimmertemperatur eine Stunde lang stehen gelassen und danach mit 60 ml Äther verdünnt. Der ausgeschiedene Niederschlag wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und im Vakuum über Phosphorpentoxyd und Kaliumhydroxyd getrocknet.

ί Es werden 0,538 g (87%) des substituierten Oktakosapeptid-trifluoracetats erhalten.

Das rohe Trifluoracetat wird in 10 ml Wasser gelöst, die Trifluoracetat-Ionen werden mit Hilfe von Acetataustauscherharz Dowex® 1 χ 8 gegen Acetat-Ionen aus-

Hi getauscht. Die erhaltene Lösung des Oktakosapeptidacetats wird auf eine mit Ionenaustauscher aus Carboxymethylcellulose gefüllte Säule aufgebracht und mit einem linearen Puffergradienten, der aus 0,01 m(pH 4.5) und 0,4 m (pH 6,7) Ammoniumacetat-Puffer bereitet

ι") wurde, eluiert. Die den gewünschten Stoff enthaltenden Fraktionen werden gesammelt und lyophilisiert Es werden 0,22 g (34%) Oktakosapepiid erhalten. Peptidgehalt, bestimmt durch UV-Absorption: 723%, Metsuiioxydgehalt: 1,3%. Verhältnis Tyr/Trp: 2,05; Aminosäurenanalyse: Lys 4,05 (4), -His 0,93 (1), Arg 3,08 (3), Asp 0,99 (1), Ser 0,79 (1), GIu 2,Ci (2), Pro 3,09 (3), GIy 3,04 (3), AIa 0,92 (1), VaI 3,12 (3), Met 0,60 (1), Tyr !,8g (2), Phe 0,85(1).

Das als Ausgangsstoff verwendete Hydrochloric des

2) geschützten substituierten Oktakosapeptides wird auf folgende Weise hergestellt:

Schritt 1

tert.-Butyloxycarbonyl-aminooxyessigsäure
(BOC-OGIy)

316,0 g (2,37 Mol) tert.-Butyloxycarbonyl-hydroxylarnin werden in 2680 ml Äthanol gelöst und der Lösung unter Kühlen 207,8 e (5,19 Mol) Natriumhydroxyd und

π 350,4 g (2,52 Mol) Monobromessigsäure zugesetzt Das Reaktionsgemisch wird 20 Minuten lang gekocht und danach das Lösungsmittel abdestilliert. Der Rückstand wird in 1940 ml Wasser gelöst und mit Lonzentrierter Salzsäure auf pH 3 angesäuert. Nach 2stündigem Küh-

4Ii len und Rühren werden die ausgeschiedenen Kristalle abfiltriert. Das rohe Produkt (419 g) wird aus einem Chloroform-n-Hexangemisch kristallisiert. Ausbeute: 388,8 g (86%) tert.-Butyloxycarbonyl-aminoessigsäure. Schmelzpunkt: 1!5-116°C.

Analyse (C₇H_nNO₅= 191,18):

Berechnet: C 44,0, H 6,8. N 7.2%;
gefunden: C 43,9. H 6,9, N 7.1%.

-." Schritt 2

BOC-OGIy-Tyr-Ser-Met-NzHj

1,72g (9,0 mMol) BOC-OGIy und 4.50g (10 mMol) Tyr-Ser-Met-OCH₃ · HCI werden in 10 ml Dimethyl-

ij formamid gtlöst. Die Lösung wird ai/^f 0°C gekühlt und zuerst mit 1,11 ml (10 mMol) N-Methylmorpho!in, danaich mit 1,85 g (9,0 mMol) DCC versetzt. Das Reaktionsgemisch wird eine Stunde lang bei 0°C gerührt und bei Ziiiimertemperatur bis zum folgenden Tag stc-

w) hen gelassen. Danach wird das DCU abfiltriert, das FiI-tr.jt eingedampft und der Rückstand in 200 ml Essigäthvlester gelöst. Die Lösung wird zweimal mit 100 ml μ Salzsäure und zweimal mn 100 ml 8%iger Natriu-nhydrogencarbonat-Lösung ausgeschüttelt, danach ge-

h) trocknet unu dann eingedampft. Der erhaltene rohe, substituierte geschütze Tetrapeptidmethylestei· (4,5 g) wird in 45 ml Methanol gelöst, die Lösun,? mit 1.26 ml (2'b.O mMol) Hvdrazinhvdrat versetzt und das Reak-

tionsgemisch bei /.immerUmperaüir iihcr Nacht stehen gelassen. Danach wird die Lösung cirigcilampfι. der Rückstand mit Lssigester verrieben, abfillriert, der Niederschlag mit Lssigester und Äther gewaschen und über konzentrierter Schwefelsäure getrocknet. Ls wer den 3,30g (62,^r>%) Hydrazid des substituierten geschützten Tetrapeptides erhalten. Der Schmelzpunkt des aus Wasser iimkristallisierten Produktes liegt bei 137 C. R,¹ =0,36.

Analyse (C\<l I i«NhO„S = 586,66):

lierechnet: C 49.1, llfc.5, N 14.4%;
gefunden: C 49.0, Il W₁ N 14.4%.

Schritt S

BOC-OGIy-T)r-Ser-Met Glu(OBii) His Phe-Arg-Trp-Gly I.ys(BOC)-Pro-Val-GK HC I

0.41g (0.70 mMol) BOC-OGIy-Tw-Ser Met-N.>lli werden in 5 ml Dimethylformamid gelöst. In die auf .'' -20C gekühlte Lösung werden 0.64 ml (2.8 mMol) 4.4 η salzsaurer Lssigestcr. danach 0.10") ml (0.85 mMol) tert.-Biitylnitrit eingetropft. Das Reaktionsgemiseh wird bei -IOC 5 Minuten lang gerührt, dann auf -20 C gekühlt, und es u erden 0.96 g (0.70 mMol) CiIu(OBu')- .' Ilis-Phe-Arg-Trp Gly-Lvs(BOC) I'm-VaI-GK (ungarische Patentschrift Nr. I 55 880) und 0,48 ml (2,8 mMol) Diisopropylamin in 8 ml Dimethylformamid zugegeben. Das Reaktionsgemist l< wird bei einer Temperatur von — 5 bis OC eine Stunde lang gerührt und hei Of über : Nacht stehen gelassen. Danach wird die Losung eingedampft und der Rückstand mit 8%iger Natriumhydrogencarbonatlösung verrieben. Nach dem filtrieren. Waschen mit Wasser und Trocknen werden 0,93g (69%) substituiertes, geschütztes Tetradekapeptid erhalten. Dieses wird in 6 ml Methanol suspendiert und mit einer Pyridinhydrochloridlösung versetzt, die aus 1.35 ml Pyridin und 1.35 rnI konzentrierter Salzsäure bereitet wurde. Die erhaltene Lösung wird mit 50ml Wasser verdünnt und das ausgefallene Hydrochlorid μ des geschützten, substituierten Tetradekapeptides abfiltriert, mit Wasser gewaschen und dann getrocknet. Ausbeute: 0.78 g (57%). Schmelzpunkt: 202-204⁷C. R: =0.18. Cu₁₁H₁₀N₂₁Oj₄CIS (1959.66).

Schritt 4

BOC-OGIv -Tyr-.Ser-Met-Glu(OBu')-His-Prie-Arg-Trp-GIv -1,VS(BOC)- Pro- Val-Gly-Lys(BOC)-Lys( BOQ-Arg-

Arg-Pro-Val-L\s(BOC)· Val-fyrfBu-J-Pro-AspiOBu¹)-

Ala-Gly-Glu-(OBu')ÖBir ■ 3 HCI

0.5*5 g (0.17b mMol) BOC-OGly-Tyr-Ser-Met-GIu(OBu)-HiS-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys( BOC)-PrO-VaI-Gh ■ HCl. 0.400g (0.176 mMol) Lys(BOC)-Lys(BOC)-

Arg-.A rg-Pro-Val-Lys(BOC)-Va'l-Tyr(Bu')-Pro-AspiOBu'J-Ala-Gly-GlutOBu'JOBu¹ . 3 HCI (ungarische Patentschrift Nr. 155 880) und 0.281g (1.05 mMol) PCFOH werden in 3.3 ml Dimethylformamid gelöst und der Lösung zuerst 0.025 ml (0.18 mMol) Triethylamin, dann 0.074 g (0.36 mMol) DCC zugesetzt. Das t< Reaktionsgemisch wird bei Zimmertemperatur 2 Tage lang stehen gelassen, dann das DCU abfiltriert und das Filtrat mit 30 ml Äther verdünnt. Das ausgefallene Produkt wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und dann ^iTCirf!ckns! Das H*'droch!orid des substituierten ^CTe- -~- schützten Oktakosapeptides wird in einer Ausbeute von 0.640 s (87%) erhalten. Schmelzpunkt: 208-212⁰C, R:^! =0.22. Co₄Hi:.N.uO«CI₃S (-182.29).

■ I 2

OAIa I >r Scr-Met-GIu His Phe Arg-Trp-Gh-I.ss-

Pro-Val-Gh-I.ss -l.ss Arg-Arg PmVaI I as VaI ivr

Pm-Asp-Ala-Gh-Glii

0.600g (0.142 mMol) IKK OAIa I vr-SerMel-CiIu(OBu¹)-His-Phe-Arg-Trp-Cils-Lys(IHK )-Pro-VaI
CIIv-1λS(HOC)-LyS(MOC>Arg Arg Pro·VaI-Lss(HOC)

Vai-T>r( Du·)- Pro -AsP(ODu)-AIa-GK -GIu(C )ΗιΓ)
OHu' ■ 3 MC "I u erden in einem Gemisch aus 4.8 ml Γ π fluoressigsäure. 0.6 ml Wasser und 0.6 ml Anisol gelost. Die Losung wird bei Zimmertemperatur eine Stunde lang stehen gelassen und dann mn 60ml Äther verdünnt. Der ausgeschiedene Niederschlag wird abfiltnert. mit Äther gewaschen und im Vakuum über Phos phorpenUAsd und Kaliumhydroxyd getrocknet. Das Τι-ίΠιι«»Γ-ι/ ->lit *t<*t mhititiu^rtmi ÖL· I *L , tt;i ntinl utpt. Viii.I - - _.._ r-r -

in einer A isbeute sein 0.532 g (86.5'Vn) erhalten.

Das erh iltene rohe Trifluoracetat wird in 10 ml Wasser gelost, und die Irifluoracetationen werden mittels Acetatl· )iienaustaus( herharz Dosvex* I χ 8 gegen Acetationci ausgetauscht. Die erhaltene Lösung, die das Aceta¹ des substituierten Oktakosapeptides enthält, wird auf e.ne mit Ionenaustauscher aus Carboxymethylcellulose gefüllte Säule aufgegeben und mit einem aus 0,01 ni (ρΓ 4.5) und 0,4 m (pH 6.7) Ammoniumacetatpuffer bereiteten linearen Puffergradienten cluiert. Die den gewünschten Stoff enthaltenden Lraktioncn werden gesammelt und Ivophilisiert. Ms werden 0.23 g (42%) Oktakosapeptid erhalten, ."eptidgchalt. durch UV-Absorption bestimmt: 85,1%. Gehalt an Met-Sulfoxyd: 2.7"(i Verhältnis von Tyr : Trp: 2.10: Aminosäureanalyse: l.ys 3.89 (4). His 0.97 (1), Arg 3.00 (3). Asp LIO (1), Scr 0.97 (1). GIu 1.94 (2). Pro 3.10 (3). Gh 3.06 (3). AIa 1.1-5 (1). VaI 2.84 (3). Met 0.68 (1). Tsr 1.94 (2). Phe 1.06 (I).

Das als Ausgangsstoff eingesetzte Trihvdrochlorid des geschützten substituierten Oktakosapeptides svird in folgender Weise hergestellt:

Schritt 1

tert. -Butvloxs carbonyl- L- vaminooxy prn ρ κ msäure
(BOC-OAIa)

4.0 g (29 mMol) D- vBrompropionsäure. 3.62 g (65 mMol) Kaliumhydroxid und 4.39 g (33 mMol) te^r .-Butyloxycarbonyl-hydroxylamin werden auf die im Schritt I von Beispiel 1 angegebene Weise zur Reaktion gebracht und aufgearbeitet. Das rohe Produkt wird in Äther gelöst und mit 6.3 ml (32 mMol) Dicvclohexylamin versetzt. Auf diese Weise wird das Dicyclohexylaminsaiz der tert.-Butyloxycarbonyl-L-it-aminooxypropionsäure in einer Ausbeute von 6.7 g (60⁰O) erhalten. Schmelzpunkt: 157^:C. Das Dicyclohexylaminsalz wird in Äther suspendiert, die Suspension mit 0.2 η Schwefelsäure geschüttelt, die ätherische Phase eingedampft, und auf diese Weise sverden 3.05 g (50%) tert.-Butyloxycarbonyl-L-A-aminooxypropionsäure erhalten, die bei"llO-112"C schmilzt.[χ]- = -9P (c=\. Äthanol).

Analyse CiHi₅NO₅ (205.21):

Berechnet: C 46.4. H 7.4. N 6.8%:
gefunden: C 46.6. H 7.5. N 6.8%.

Sl

ItOf-OAIa Im Svr Ml-I-NjH ,

1.44 g (7.0 mMol) H(K-OA!,! und 3,50g (7.8 mMol) Tyr-Ser-Met-OCH, ■ HCI werden in 12ml Dimethylformamid gelost. Die Lösung wird auf OC gekühlt und mit 0.85 ml (7.8 mMol) N-Metliylmorpholin. danach mit 1.4« ". (7.2 mMol) D(C versetzt. Das Reaktionsgemisch wird bei 0 C eine Stunde lang gerührt und bei Zimmertemperatur über Nacht stehen gelassen. Anderntags wird das Methanol abdcstilliert und der Rückstand mit Lssigt'sier ·.errieben. Das Produkt wird abfiltriert. mit t.ssigesler und Äther gewaschen und dann über konzentrierter Schwefelsäure getrocknet. Das llydrazid des geschützten substituierten Tetrapeptides wird in einer Ausbeute vn 2.1 g (50%) erhalten. Schmelzpunkt: 147 C (aus Wa-ser umkristallisiert). R| =0.4 3.

Anakse ( \>,l I„,N,(),S (600.69):
Berechnet: C 50,0, H 6.7 %:
gi !linden: C 49,6. H 6.7%.

Schrill 3

H(K -ΟΛΙ,ι fyr-Ser-Mct-Glu(OBu')-llis-Phe-Arg-Trp C,ly-Lys(BOC)Pro-Val-Gly HCI

0.266g (0.44 mMol) BOC-OAIa-Tyr-Scr Met N,H, werden in 3.2 ml Dimelhvlformamid gelöst, und die Lt)SUiIg wird auf —20 C abgekühlt. Unter Rühren werder 0,41 ml (1.8 mMol) 4,4 η salzsaurer Rssigester, danach 0.07 ml (0.59 mMol) tert.-Butylnitrit zugetropft. Das Reaktionsgemisch wird bei - !0⁰C 5 Minuten lang gerührt, dann auf -20"C gekühlt, und es werden 0.600 g (0,438 mMol) Glu(OBu')-His-Phe-Arg-Trp-Glyl.ys(BOC)-Pre-Val-Gly sowie 0.31 (1.8 mMol) Dnsopropyläthylamin in 5 ml Dimethylformamid zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird bei einer Temperatur von -5 bis OC eine Stunde lang gerührt und dann über Nacht bei 0 C stehen gelassen. Anderentags wird das Dimethylformamid abdestilliert und der Rückstand mit 8%iger Natriumhydrogencarbonatlösung verrieben. Nach Filtrieren, Waschen mit Wasser und anschließendem Trocknen werden 0,70 g (81%) des geschützten substituierten Tetradekapeptides erhalten. Aus I ml Pyridin und I ml konzentrierter Salzsäure wird Pyridinhydrochloridlösung bereitet und zu dem in 5 ml Methanol suspendierten geschützten Teiradekapeptid gegeben. Die auf diese Weise erhaltene Lösung wird mit 50 ml Wasser verdünnt, der ausgefallene Niederschlag abfiltriert. mit Wasser gewaschen und anschließend getrocknet. Das Hydrochlorid des geschützten substituierten Tetradekapeptides wird in einer Ausbeute von 0,513 g (59.5%) erhalten. Schmelzpunkt: 200-202⁰C, Rf =0.19. Cq₁H₁PN₂IO₂₄CIS (1973.68).

Schritt 4

BOC-O.AIa-Tyr-Ser-Met-GIu(OBu')-His-Phe-Arg-Trp-Gly-LysfBOQ-Pro-Val-GIy-LysiBOq-LysCBOQ-Arg- Arg-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr(Bu')-Pro-Asp(OBu')-

Ala-GIy-Glu(OBu')-OBu' · 3 HCI

0.348 g (0.176 mMol) BOC-OAIa-Tyr-Ser-Met-Glu(OBu')-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC)-Pro-Val-GIy ■ HCl. 0.400 g (0,176 mMol) Lys( BOC)-Ly s( BOC)-

ArgArg-Pro-Val-Lys(BOC)-Va!-Tyr(Bu')-Pro-AspiOBuO-Ala-Gly-GluiOBu-J-OBu¹ . 3 HCl und 0,281 g (1.05 mMol) PCPOH werden in 3,3 ml Dimethylformamid gelöst. Der Lösung werden 0,025 ml (0,18 mMol) Tn.itlnlamin. danach O.O74g (0,36 mMol) D(C züge setzl. Das Reaktionsgemisch wird bei Zimmertemperatur 2 I agc lang stehen gelassen, dann das DCl I abfiltriert und das I iltrat mit 30 ml Äther verdünnt. Das ausgeschiedene Produkt wird abfiltriert. mit Äiher gewiisi heu und dann getrocknet. Das Trichlorid des ge schützten substituierten Oktakosapeptides wird in einer Ausbeute von 0,658 g (H9%) erhalten. Schmelzpunkt: 175-177 C. R,'-0.25. C, .-,11,,,N₄₁O₁₁₁C-I₁S (419h,36).

H e 1 s ρ i e I 3

D-OAIa-Iyr Ser-Met Glu-Ilis-Phe-Arg-Trp-Gly-I.ys-Pro-VaI (ily-1 \sl.ys-Arg-Arg-Pro-VaI-1.ys-Val-Tyr-

l'ro-Asp-A la-G Iy-G Iu

0.600 g(O,l42 mMol) BOC D-OAIa-Tyr-Ser-Met-Glu-(OBu')-1 Iis-Phe-Arg-Trp-Gly-I.ys(BOC)-Pm-VaI-GIy-I.Vs(BOC)Lvs(HOC)-Arg-Arg-Pro-VaI 1.VS(BOC)-VaI

Tyr-(Iiu')-Pro-Asp(OBu')-Ala-Gly-Glu(OBu<)-OBu' · 3 HCl werden in einem Gemisch aus 4,8 ml Trifluoressigsiiure. 0.6 ml Wasser und 0,6 ml Anisol gelöst. Die Lösung wird bei Zimmertemperatur eine Stunde lang stehen gelassen und dann mit 60 ml Äther verdünnt. :". Der ausgeschiedene Niederschlag wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und im Vakuum über Phosphorpentoxyd und Kaliumhydroxyd getrocknet. Die Ausbeute an Trifluoracctat des substituierten Oktakosapeptides beträgt 0,546 g (88,5%).

in Das rohe Trifluoracctat wird in 10 ml Wasser gelöst, und mittels Acetataustausi herharz. Dowcx^s 1 χ 8 werden die Trifluoracetationen gegen Acetationcn ausgetauscht. Die auf dii se Weise erhaltene Lösung, die das Acetat des substituierten Oktakosapeptides enthält, 1. wird auf eine mit Ionenaustauscher aus Carboxymethylcellulose gefüllte Säule aufgebracht und mit einem aus 0.01 m (pH 4.5) und 0,4 m (pH 6,7) Ammoniumacetatpufferlösung bereiteten linearen Puffergradienten eluiert. Die den gewünschten Stoff enthaltenden Fraktio-1.1 nen werden gesammelt und lyophilisiert. Die Ausbeir .· an Oktakosapeptid beträgt 0,245 g (39%). Peptidgehalt: 75% (durch UV-Absorption bestimmt). Gehalt an Met-Sulfoxyd: 2,57%. Verhältnis Tyr : Trp = 2,07. Aminosäureanalyse: Lys 4,35 (4), His 0.97 (I). Arg 3,13 (3), Asp ..-, 1.06 (1), Ser 1,00 (1), GIu 1,92 (2). Pro 2,90 (3), GIy 3,00 (3). AIa 1.00 (1). VaI 2.92 (3), Met 0,87 (I), Tyr 2,21 (2), Phe 1,06 (1).

Das als Ausgangsstoff verwendete Trichlorid des geschützten substituierten Oktakosapeptides wird auf folgende Weise hergestellt:

Schritt 1

tert.-Butyloxytarbonyl-D-«-aminooxy propionsäure (BOC-D-OAIa)

7,04 g (51 mMol) l-nc-Brompropionsäure, 6,3 g (112 mMol) Kaliumhydroxyd und 7,71 g (58 mMol) tert,-Butyloxycarbonyl-hydroxylamin werden auf die im Schritt 1 des Beispiels 1 beschriebene Weise zur Reak-

bo tion gebracht und aufgearbeitet. Das rohe Produkt wird in Äther gelöst, der Lösung werden 11,0 ml (0,56 mMol) Dicyclohexylamin zugesetzt. In einer Ausbeute von 14,85 g (75%) wird das Dicyclohexytaminsalz der tert.-Butyloxycarbonyl-D-a-brompropionsäure erhalten, das

t>5 bei 157°C schmilzt. Die ätherische Suspension des Dicyclohexylaminsalzes wird mit 0,2 π Schwefelsäure geschüttelt, danach die ätherische Phase eingedampft. Es werden 6,55 g (62%) tert-Butyioxycarbonyl-D-a-

Il

aminooxypropionsiiiire erhalten. Schmelzpunkt: I ΙΟΙ I I (:,|λ|>'= +40.0 (V = I, Äthanol). CtI I:-,NO-, (205.21).

Schritt 2
H()C'-D-(JAI.i-ryr-Scr-ML-t-N:Hi

Schritt 4

1.85 g (4.OmMoI) ¹H)C-DOAIa- UiIiU TyrScr-Met OClI₁ ■ HCI werden in 15 ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird auf OC gekühlt und zuerst mit I 1.1 ml (IO mMol) N-Mcthylmorpholin. danach mit 1.90 g (9,2 mMol) DCC versetzt. Das Reaktionsgemisch wird bei OC eine Stunde lang gerührt und bei Zimmertemperatur über Nacht stehen gelassen. Dann wird das DCL) abfiltriert, dar, FiItrat eingedampft und der Rückstand in 200 ml Fssigestcr gelöst. Die Lösung wird zweimal mit 100 ml η Salzsäure und zweimal mit IuO ml 8%iger Natriumhydrogencarbonatlösung ausgeschüttelt, getrocknet und eingedampft. Der gelartige Rückstand (3.65 g geschützter, substituierter Tetrapeptidester) wird in 40 ml Methanol gelöst, die Lösung mit 1.02 ml (21.2 mMol) Hydrazinhydrat versetzt und das Reaktionsgemisch bei Zimmertemperatur über Nacht stehen gelassen. Anderntags wird aus dem gelartig abgeschiedenen Produkt das Methanol abdestilliert. Der Rückstand wird mit [issigester verrieben, abfiltriert, mit Rssigäthylcstcr und Äther gewasi hen und über konzentrierter Schwefelsäure getrocknet. Das llydra/id des geschützten substituierten Tetrapeptides wird in einer Ausbeute von LOS g (55%) erhalten. Der Schmelzpunkt des aus Wasser umkristallisierten Produktes liegt bei 184-185 C. Ri =0.43.

Analyse C₂^I_4nNhOi₁S (600.69):

Berechnet: C 50.0. H 6.7. N 14.0%; gefunden: C 49.8. 116.6. N 14,1%.

Schritt 3

BOC-D OAIa-Tyr-Ser-Met-GUKOBu'J-HisPhe-Arg-Trp-Gly-Lys( BOC)-Pro- VaI-GIy HCI

0.381 g (0.635 mMol) BOC-D-OAIa-Tyr-Ser-Met-N_ >H| werden in 4,5 ml Dimethylformamid gelöst. In die auf — 20⁰C gekühlte Lösung werden unter Rühren 0,58 ml (2,65 mMol) 4.4 η salzsaurer Essigester, danach 0.095 ml (0,80 mMol) tert.-Butylnitrit eingetropft. Das Reaktionsgemisch wird bei — 1O⁰C noch 5 Minuten lang gerührt, dann auf — 20⁰C gekühlt und die Lösung von 0,86 g (0,628 mMol) Glu(OBu')-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC)-Pro-VaI-GIy und 0,43 ml (2,50 mMol) Diisopropyläthylamin in 7,2 ml Dimethylformamid zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird bei einer Temperatur von —5 bis 0⁰C eine Stunde lang gerührt und dann bei 0⁰C bis zum nächsten Tage stehen gelassen. Das Dimethylformamid wird abdestilliert, der Rückstand mit 8%iger Natriumhydroxydlösung verrieben. Nach Filtrieren, Waschen mit Wasser und anschließendem Trocknen werden 0,95 g (77%) geschütztes substituiertes Tetradekapeptid erhalten. Aus 1,35 ml konzentrierter Salzsäure und 1,35 ml Pyridin wird eine Pyridinhydrochloridlösung bereitet und diese dem in 6 ml Methanol suspendierten geschützten substituierten Tetradekapeptid zugesetzt. Die auf diese Weise erhaltene Lösung wird mit 50 ml Wasser verdünnt, der ausgeschiedene Niederschlag wird abfiltriert, mit Wasser gewaschen und dann getrocknet. Das Hydrochlorid des geschützten substituierten Tetradekapeptides en.-iteht in einer Ausbeute von 0,78 g (63%). Schmelzpunkt: 204-210⁰C, Rj =0,20. C₁HImN₂₁O₂₄CIS (1973,68).

U(K -D-OAIa I γι-Scr-MCt-GIu(OHu¹)-His-Phe-

Arg-IVp-GIy-Lys(BOC)-Pro-Val-Gl\-Lys(BOC)-

Lys(BOC)-Arg-Arg-Pri>-Val-l.ys(BOC)-Val-Tyr(Bu')-l'ro-Asp(OBu')-AIa-GIy-GIu(OBu¹K)Hu¹

0.348 g (0.176 mMol) BOC-D-OAIa-Tyr-Ser-Met-Glu(OBir)-His-Phc-Arg-Trp-Gly-1.ys( IK)C)-Pro-Valin GIy ■ HCI, 0.400 g (0,176 mMol) Lys(BOC)-I.ys(BOG)-Arg-Arg-Pro-VaI-Lys( BOC)-Val-Tyr( Bu¹)-Pro-Asp(OBu')-Pro-Asp(OBu')-Ala GIy-GIu(OBu¹)-OBu¹ ■ 3 HCI und 0.281 g (1,05 mMol)'PCPOII werden in J.3 ml Dimethylformamid gelöst und der Lösung '· nacheinander 0,025 ml (0,18 mMol) Triüthylamin und 0,074 g (0,36 mMol) DCC zugesetzt. Das Reaktion*- gemisch wird bei Zimmertemperatur 2 lage lang stehen gelassen, dann das DCU abfiltriert und das Filtrat mit 30 ml Äther verdünnt. Der ausgeschiedene Nieder-■i' schlag wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und dann getrocknet. Das Hydrochlorid des geschützten substituierten Oktakosapeptides wird in einer Ausbeute von 0,647g (87,5%) erhalten. Schmelzpunkt: 166-I67°C. R₁ ¹ =0.25. C,q-,ΙΊ HiNuCUS (4196.32).

Beispiel 4

"' OSer-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-VaI-GIy-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-VaI-Tv r-Pro-Asp-A Ia-G Iy-G Iu

r, 0,600 g (0,142 mMol) BOC-OSer-Tyr-Ser-Met-GIu(OBu')-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys( BOC)-Pm-VaI-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Arg-Arg-Pro-Val-Lys(BOQ-

y^

OBu¹ · 3 HCI werden in einem Gemisch aus 4,8 ml Trifluoressigsäure, 0,6 ml Wasser und 0,6 ml Anist)! gelöst. Die Lösung wird bei Zimmertemperatur eine stunde stehen gelassen und dann mit 60 ml Äther verdünnt. Der ausgeschiedene Niederschlag wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und über Phosphorpentoxyd und Kaliumhydroxyd im Vakuum getrocknet. 0,400 g (65%) Trifluoracetat des substituierten Oktakosapeptides werden erhalten.

Das rohe Trifluoracetat wird in 8 ml Wasser gelöst, und die Trifluoracetationen werden mittels Acetationenaustuascherharz Dowex® 1 χ 8 gegen Acetationen ausgetauscht. Die auf diese Weise erhaltene Lösung, die das Acetat des Oktakosapeptides enthält, wird auf eine mit Ionenaustauscher aus Carboxymethylcellulose gefüllte Säule aufgebracht und mit einem aus 0,01 m (pH 4,5) und 0,4 m (pH 6,7) Ammoniumacetatpuffer bereiteten linearen Puffe;gradienten eluiert. Die den gewünschten Stoff enthaltenden Fraktionen werden gesammelt und lyophilisiert. Es werden 0,240 g (41,5%) Oktakosapeptid erhalten, dessen Peptidgehalt nach UV-Absorptionsmessungen 81,6% beträgt. Gehalt an Met-Sulfoxyd: 4,4%. Verhältnis Tyr : Trp = 2.13. Aminosäureanalyse: Lys 3.92 (4). His 1,00 (1), Arg 3,15 (3), Asp 0,99 (I), Ser 0.83 (1), GIu 1,94 (2), Pro 3,00 (3), GIy 3,05 (3), AIa 1,04 (1), VaI 2,92 (3), Met 0,79 (1), Tyr 1,83 (2), Ph.- 0,97 (!).

Das als Ausgangsstoff verwendete Trihydrochlorid des geschützten substituierten Oktakosapeptides wird in folgender Weise hergestellt:

Schrill I

I crt -liiitylnxycarbons I-L- viminooxy ₍/-be η zyloxy propionsäure

-18,4 g (0.364 MoI) terl.-Biityloxycarbonyl-hydioxyliiinin, 40.7 g (0,728 MoI) Kaliumhydroxyd und 44.0 μ (0.364 MoI) Dl,- vBrom-/J-benzyloxypropionsäurc werden in 360 ml Wasser gelöst. Das Reaktionsgemisch wire¹ bei Zimmertemperatur 3 Stunden lang gerührt, dann der pl I-Wcrl auf 3 eingestellt und die Lösung drei mal mit 720 ml Äther ausgeschüttelt. Oic ätherische Lösung wird mit 720 ml Wasser ausgeschüttelt, dann getrocknet und mit 78 ml (0,40 Mol) Dicydohcxy'airin vcrsct/i. Das erhaltene Dicyclohexylaminsalz der tcrt,-

Ikityloxycarbonyl-DL-ivaminooxy /f-benzyloxypropionsäurc (43.6Ig. Schmp. 144—146 C) wird m 500 ml Äther suspendiert und fünfmal mit 100 ml 0.2 η Schwefelsäure iuis^esch'j'.tt¹!'.. Die ätherische Lov,!"'¹ wird getrocknet und dann zur Trockne eingedampft. Der .aickstand wird in 700 ml Äthanol gelöst, der Losung werden 6,56 g (43,5 niMol) ( +■ J-Amphetaminbase zugesetzt. Die Lösung wird über Nacht an einem kühlen Ort stehen gelassen, die ausgeschiedenen Kristalle werden anderntags abfiltriert. Zusammen mit dem durch Eindampfen der Multi lauge gewonnenen Produkt werden 9.33 g (Ib.V¹., tert.-Butyloxvcarbonyl-L- \- aminooxy/Mienzvlov. propionsäure erhalten. Schmelzpunkt: 95-97'C.[\] - '6 (C= L Äthanol). CV.H.-iNO, (31 1.34).

Schritt 2

tert.-Butyloxycarbonyl-L- vaminooxv-,]-hydroxy -prop ionsäure (BOC-OSe r)

5.0 g (16.1 mMol) Ι.-Λ-tert.-Butyloxycarbonyl-aminooxy-^-benzyloxypropionsäure werden in 100 ml Methanol gelöst und in Gegenwart eines IO%igen Palladium-Aktivkohle-Katalysators hydriert. Nach 3 Stunden wird der Katalysator abfiltriert, das nach dem Abdestiliieren des Methanols verbleibende öl wird unter Petroläther stehen gelassen. Die Substanz kristallisiert innerhalb einiger Stunden aus. Nach Filtrieren und anschließendem Trocknen werden 3.2 g (90%) Lvvtert.-Butyloxycarbonyl-/?-hydroxypropionsäure erhalten, die bei 94-95⁰C schmilzt. Rf =0.27. CH,-,NO,. (221,22).

Schritt 3
BOC-OSer-Tyr-Ser-Mct-NjHi

2,2 g (10 mMol) BOC-OSer und 4.50 (10 mMol) Tyr-Ser-Met-OCHj · HCI werden in 15 ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird auf 0^DC gekühlt und mit 1,11 ml (10 mMol) N-Methylmorpholin. danach mit 1.90 g (9.2 mMol) DCC versetzt. Das Reaktionsgemisch wird bei 0^cC eine Stunde lang gerührt und über Nacht bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Danach wird das DCU abfiltriert, das Filtrat eingedampft und der Rückstand in 200 ml Essigester gelöst. Dia Lösung wird zweimal mit 100 ml η Salzsäure, zweimal mit 100 ml 8%iger Natriumhydrogencarbonatlösung ausgeschüttelt, getrocknet und schließlich eingedampft. Der Rückstand (3.7 g geschützter substituierter Tetrapeptidester) wird in 40 ml Methanol gelöst, mit 1.0 ml (20.4 mMol) Hydrazinhydrat versetzt und bis zum nächsten Tage bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Anderntags wird das Methanol abdestilliert, der Rückstand mit Essigester verrieben, abfiltriert, mit Essigester und Äther gewaschen und über konzentrierter Schwefel- !4

säure getrocknet. Man erhält das llvdraz.id des subitituierten geschüt/ien Tetrapeptides in einer Ausbeute um 2.5g*(44",.( Schmcl/p mkt: 141 C. R₁' =0.50.

Analyse C>,l I,„N,.O;, S (616.641:

Berechnet: C 48.7. Il 6.^ΓΛ Ν 13.6%: gefunden: C 48.Ϊ. Il 6,7. N 1 3.3%.

Schrill 4

BOC-OSer-Tyr Scr-Mel-CIu(OBu¹)-His·Phe-Arg-Trp-(".l\-l.vs(BO( (-Pm-VaI-GIy ■ HCI

0.274 g (0.4 16 mMnl) ΒΟΓ ()Scr-Ty r Ser-\.et-N_:l I, werden in 3.2 mi Dimethylformamid gelost. Zii der auf -20 C gekühlten Lesung weiden unter Rühren zuerst r>4! I₁₁] i\ « ..,.\.i,.u λ λ .. ..,!..^.^j.j.j. r.v.-:„„„.„_ j..j-.^-ι.

0.07 ml (0.39 mMol) tert.-Butvlnilrit getropft. Das Reak tionsgei'iisch wird bei 10 C noch 5 Minuten nachgerührt, dann auf -20 C abgekühlt und eine Lösung von 0.600 g (0.4 38 mMnl) Glu(OBu')-His-Phe-A'g-~l .·:·- GIy-LyS(BOC)-Pm-VaI GIy und 0.31 (1.8 mMol) Düsopropyläthvlamin in 5 ml Dimethylformamid zugegeben. Das Rcaktionsgemisch wird bei einer Temperatur von - 5' bis 0 C eine Stunde lang gerührt und dann bis /um nächsten Tag bei 0 C stehen gelassen. Anderntags u · I die Lösung eingedampft und der Rückstand mit 8%iger Nalriumhvdrogencarbonatlösung verrieben. Nach Filtrieren. Waschen mit Wasser und anschließendem Trocknen erhält man 0.69 g (79^ll'n) l sclnit/tes suhstiluiertes Tetradekapeptid. Aus 1 ml konzentrierter Salzsäure und 1 ml Pyridin wird eine Pyndinhydrochloridlosiing bereitet und diese zu dem in 5 ml Methanol suspendierten geschützten Tetradekapeptid gesehen. Die auf diese Weise erhaltene lösung wrd mn 50 mi Wasser verdünnt. Der sich abscheidende Niederschlag wird abfiltriert, mit Wasser gewaschen und dann getrocknet. Man erhält das Hydrochlorid de~ cesch.itz/en substituierten Tetradekapeptides in einer Ausbeute von 0.471g (54%). Schmelzpunkt: 1 »8-202 C. R^: =0.1 tv C₁HiMN:,O:,C1S (1989.68).

Schritt 5

BOC-OSer-Tv-Ser-Met-GluiOBuO-His-Phe-Are--Trp-G!y-Ly s(BOC)-Pro-\'al-GI>-l-ys( BOC)-

Lys(BOC)-Ärg-Arg-Pro-Val-Lys(BOC)-\'al-Tyr(BL) , Pro-Asp(OBu')-Ala-Gly-Glu(OBu')-OBir

0.350 g (0.176 mMol) BOC-OSei-Tyr-Ser-Mc··- Giu(OBii^;)-His-Phe-Arg-Trp-Gh -Lys(BOC)-Pro-Val-GIy ■ HCl. 0.400 g (0,176 mMol) Lys(BOC)-Lys(BOC )-

Arg-Arg-Pro-VaI-Lv S(BOC)^aI-Ty r(Bu-)-"Pro-Asp(OBu^!)-Ala-Gly-Glu(OBu^:)-OBu· ■ 3 HCI und 0.2Si g (1.05 mMol) PCPÖH werden in 3.3ml Dimethylformamid gelöst und der Lösung zuerst O.025 ml (0.18 mMcll Tiräthylamin. dann 0.074 g (0.36 mMo!) DCC zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird bei Zimnenemperati;r 2 Tage lang stehen gelassen, danach wird das DClJ asfihrien und das Filtrat mi: 30 ml Äther verdünnt. Das ausgefällte Produkt wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und danach getrocknet. Man erhält das Trihydrochlond des Substituierten gcSCHütZtcn OkiäköSdpcptidcs in einer Ausbeute von 0.659 g (88.5%). Schmelzpunkt: 160-166^:C. R-'=0.22. "Ci^HiuNiiOv.C'iiS (4212.33).

Beispiel 5

D-OSer-Tyr-Ser-Mei-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-

Lys-Pro-Val-Gly-L>!>-Lys-ArgArg-Pro-Val-Lys-

VaI-Ty: -Pro-Asp-Ala GIy-GIu

O.bOOg (0.142 mMol) BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met-Glu(OBu')-Hi5-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys( BOC)-Pm-VaI-Gly-LysiBOCJ-LysiBOCJ-Arg-Arg-Pro-Val-LysiBOC)-

Val-TyitBu'J-Pro-AsptOBuO-Ala-Gyl-GluiOBu')-OBu' · 3 HCI werden in einem Gemisch aus 4,8 ml Tnfiuoressigsäure. 0,6 m! Wasser und 0.6 ml Anisol gelöst. Die Lösung wird bei Zimmertemperatur eine Stunde la ig stehen gelassen und dann mit 60 ml Äther verdünnt. Der ausgefallene Niederschlag wiri abfiltriert, mit Äther gewaschen und schließlich über Phosphorpentoxyd u.;J Kaliumhydroxyd im Vakuum getrocknet. Das Trifluoracetat des substituierten Oktakosapeptides wird in einer Ausbeute von 0,533 g (86,5%) erhalten.

Das rohe Trifluoracetat wird in 10 ml Wasser gelöst,

lind die Tni!üur5Ci:i5iiünCn 'A'crdcn mit ACci3taü5t5U-scherhaxz Dowex* 1 χ 8 gegen Acetationen ausgetauscht. Die erhaltene Lösung, die dus Acetat des substituierten Oktakosapeptides enthält, wird auf eine mit Ionenaustauscher aus Carboxymethylcellulose gefüllte Säule aufgebracht und mit einem aus 0,01 m (pH 4,5) und 0,4 m (pH 6,7) Ammoniumacetatpuffer bereiteten linearen Puffergradienten eluiert. Die den gewünschten Stoif enthaltenden Fraktionen werden gesammelt und lyophilisiert. Man erhält 0,250 g (43%) Oktakosapeptide, das nach UV-Absorptionsmessungen 81,0% Peptid enthält. Gehalt an MetSulfoxyd: 4,4%. Verhältnis von Tyr : Trp = 2,05. Aminosäureanalyse: Lys 3,76 (4), His 0.8 (1), Arg 3,05 (3), Asp 1.00(1). Ser 0,73 (1), GIu 1.94 (2). Pro 3,00 (3), GIy 2,95 (3), AIa 1.05 (1). VaI 2,82 (3), Met 0.78(1), Tyr 1,6(2). Phe 0.83(1).

Das als Ausgangsstoff verwendete Trihydrochlorid des geschützten substituierten Oktakosapeptides wird auf folgende Weise hergestellt:

Schritt I

tert.-Butyloxycarbonyl-D-a-aminooxy-/?-benzyloxy-propionsäure

Das gemäß Schritt I des Beispieles 4 gewonnene ( + )-Amphetaminsalz der tert.-Butyloxycarbonyl-D-aaminooxy-/9-benzyloxypropionsäure wird aus Äthanol umkristallisiert. Ausbeute: 13,27 g, Schmelzpunkt: 188— 191°C, [λ]?= +54° fc=0,5, Methanol). Durch die auf übliche Weise durchgeführte Zersetzung des Salzes werden 7,9 g (14%) tert.-Butyloxycarbonyl-D-a-aminooxy-/?-benzyloxypropionsäure erhalten. Schmelzpunkt: 96-98°C, [λ] ' = +38° (c= 1. Äthanol).

Schritt 2

tert.-Butyloxycarbonyl-D-a-aminooxy-0-hydroxypropionsäure (BOC-D-OSer)

5,5 g (17,7 mMol) Dot-tert.-Butyloxycarbonyl-aminooxy-^-benzyloxypropionsäure werden in 110 ml Methanol gelöst und in Gegenwart von 2.75 g 10%igem Palladium-Aktivkohle-Katalysator hydriert. Nach drei Stunden wird der Katalysator abfiltriert und das nach dem Abdestillicrcn des Methanols zurückbleibende öl unter Petroläther stehen gelassen. Die Substanz kristallisiert innerhalb einiger Stunden aus. Nach Filtrieren und anschließendem Trocknen werden 3.65 g (96%) D"X-tert.-Butyloxycarbonyl-aminooxy/j-hydroxy propionsäure erhalten. Schmelzpunkt: 94-95³C, R₁' =0,27. C₈H,₅NO, (221,22).

Schritt 3
BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met-N.Hi

4,4 g (20 mMol) BOC-D-OSer und 9 g (20 mMol) i» Tyr-Ser-Met-OCI I werden in 30 ml Dimethylformamid geiöst. Die Lösung wird auf 0°C abgekühlt und mit 2,22 ml (20 mMol) N-Methylmorpholin, dann mit 3,8 g (18,4 mMol) DCC versetzt. Das Reaktionsgemisch wird eine Stunde lang bei 0°C gerührt, dann bei Zimmerii temperatur bis zum anderen Tage stehen gelassen. Das DCU wird abfiltriert, das FiItrat eingedampft und der Rückstand in 400 ml Essigester gelöst- Die Lösung wird zweimal mit je 200 ml η Salzsäure, zweimal mit je 200 ml 8%iger Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen, dann getrocknet und eingedampft. Die als Ruckstand erhaltenen 8,10 g Ester des geschützten substituierten Tetrapeptides werden in 85 ml Methanol gelöst, mit 22 ml (46 mMol) Hydrazinhydrat versetzt und bei Zimmertemperatur bis zum nächsten Tage stehen gelassen. Anderntags wird das Methanol abdestilliert, der Rückstand wird mit Essigester verrieben, abfiltriert, mit Essigester und Äther gewaschen und schließlich über konzentrierter Schwefelsäure getrocknet. Man erhält 7,21 g (63%) Hydrazid des geschützten

jo substituierten Tetrapeptides. Schmelzpunkt: 174— 175° C (aus Wasser umkristallisiert). R} =030.

Analyse C₂₅H₄₀N₆Oi₀S (616,69):

Berechnet: C 48,7, H 6,55, N 13.6%:
η gefunden: C 483. H 6,6, N 13,8%.

Schritt 4

BOC-D-SOer-Tyr-Ser-Met-Glu(OBu')-His-Phe-Arg-Trp-Gyl-Lys(BOC)-Pro-VaI-GIy · HCI

1,25 g (2,13 mMol) BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met-N₂Hj werden in 15 ml Dimethylformamid gelöst und zu der auf -2O⁰C gekühlten Lösung unter Rühren 2,08ml (8,32 mMol) 4 η salzsaurer Essigester, danach 0,32 ml (2,70 mMol) tert.-Butylnitrit getropft. Das Reaktionsgemisch wird bei — 10°C 5 Minuten lang gerührt, dann auf -20°C gekühlt und die Lösung von 2,78 g Glu(OBu')-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC)-Pro-VaI-GIy und 1,4 ml (8.13 mMol) Diisopropyläthylamin in 23 ml Dimethylformamid zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird bei einer Temperatur von - 5 bis 0° C eine Stunde lang mchgerührt und bei 0°C bis zum nächsten Tage stehen gelassen. Die Lösung wird eingedampft, der Rückstand mit 8%iger Natriumhydrogencarbonatlösung verrieben und abfiltriert. Nach Waschen und Trocknen erhält man 3,49 g (94%) geschütztes substituiertes Tetradekapeptid. Dieses wird in 24 ml Methanol suspendiert und mit einer aus 4.75 ml konzentrierter Salzsäure und 4,75 ml Pyridin bereiteten Pyridinhydro-Chloridlösung versetzt. Die erhaltene Lösung wird mit 240 ml Wasser verdünnt, der ausgefallene Niederschlag abfiltriert, mit Wasser gewaschen und dann getrocknet. Man erhält das Hydrnchlorid des geschützten Telradekapeptides in einer Ausbeute von 2,95 g (73%). Schmelzpunkt: 200-202 C. Rl-0.25.

C,H,μΝ,,O₂CIS (1989.68).

030 117/130

Schritt 5

BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met-Glu(OBu')-His-Phe-AFg-TrP-GIy-LyS(BOC)-PrO-VaI-GIy-LyS(BOC)-

Lys(BOC)-Arg-Arg-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr(Bu')-Pro-Asp(OBu')-Ala-Gly-Glu(OBu')-OBu'

0,350 g (0,176 mMol) BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met-Glu(OBu')-His-Phe-Arg-Trp GIy-LvS(BOC)-Pro-Val-GIy ■ HCI, 0,400 g (0,176 mMol) Lys(BOC)-Lys(BOC)-

Arg-Arg-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr(Bu')-Pro-Asp(OBu')· Ala-Gly-Glu(OBu')-OBu' · 3 HCI und 031 g (1,05 mMol) PCPOH werden in 33 ml Dimethylformamid gelöst und der Lösung 0,025 ml (0,18 mMol) Triethylamin, danach 0,74 g (036 mMol) DCC zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird bei Zimmertemperatur 2 Tage lang stehen gelassen, dann das DCU abfiltriert und das Filtrat mit 30 ml Äther verdünnt. Das ausgefällte Produkt wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und anschließend getrocknet Das Trichlorid des geschützten substituierten Oktakosapeptides wird in einer Ausbeute von 0,673 g (90,7%) erhalten. Schmelzpunkt: 158-162°C, Rj =0,25. C195H313N44O50CI3S (421233).

Beispiel 6

DOSer-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Giy-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr- Pro-Asn-Gly-Ala-Glu-Asp-Glu-Ser-AIa

1,00 g (0,214 mMol) BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met-Glu(OBu')-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Arg-Arg-Pro-VaI-LyS(BOC)-Val-TyttBuO-Pro-Asn-Gly-Ala-GluiOBu'J-AspiOBu')-G:u(OBu')-Ser-Ala-OBu' · 3 HCl werden in einem Gemisch aus 8 ml Trifluoressigsäure, 1 ml Wasser und I ml Anisol gelöst. Die Lösung wird bei Zimmertemperatur eine Stunde lang stehen gelassen, und dann mit 200 ml Äther verdünnt. Der ausgeschiedene Niederschlag wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und im Vakuum über Phosphorpentoxyd und Kaliumhydroxyd getrocknet. Das Trifluoracetat des substituierten Dotriakontapeptides wird in einer Ausbeute von 0,90 g (88%) erhalten.

Das rohe Trifluoracetat wird in 20 ml Wasser gelöst, und die Trifluoracetationen werden mittels Acetationenaustauscherharz Dowex® 1 χ 8 gegen Acetationen ausgetauscht. Die erhaltene Lösung, die das Acetat des substituierten Dotriakontapeptides enthält, wird auf eine mit Ionenaustauscher aus Carboxymethylcellulose gefüllte Säule aufgebracht und mit einem aus 0,01 m (pH 43) und 0,4 m (pH 6,7) Ammoniumacetatpuffer bereiteten linearen Puffergradienten eluiert Die den gewünschten Stoff enthaltenden Fraktionen werden gesammelt und lyophilisiert. Es werden 0,46 g (46%) substituiertes Dotriakontapeptid erhalten.

Das als Ausgangsstoff verwendete Trichlorid des geschützten substituierten Dotriakontapeptides kann auf folgende Weise hergestellt werden:

Schritt I
Z-Glu(OBu')-Ser-Ala-OBu'

23,9 g (100 mMol) Z-Ser und 14,5 g (100 mMol) AIa-OBu' werden in 150 ml Mcthylenchlorid gelöst, die Lösung auf - I0¹ " gekühlt und bei dieser Temperatur 20.6 g (100 mMol) DCC in 100 ml Methylenchlorid zugetropft. Das Reaktionsgemisch wird bei 0⁰C zwei Stunden lang gerührt und dann bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Anderntags wird das ausgeschiedene DCU abfiltricrt und das Filtrat mit 3 χ 70 ml η Salzsäure und 3,70 mi 5%iger Natriumhydrogencarbonatlösung ausgeschüttelt. Die Methylenchloridphase wird nach dem Trocknen eingedampft, der ölige Rückstand mit 50 ml Essigester aufgenommen und die Lösung bei 0°C 4 Stunden lang stehen gelassen. Das ausgeschiedene DCU wird abfiltriert, das Filtrat eingedampft und der ölige Rückstand mit η-Hexan verfestigt. 30,0 g (82%) rohes Z-Ser-AIa-O Bu' werden erhalten. Das Produkt wird in 600 ml Methanol gelöst und in Gegenwart von

in 2 g 10%igem Palladium-Aktivkohle-Katalysator hydriert. Nach Beendigung der Reaktion wird der Katalysator abfiltriert und die Lösung eingedampft Das erhaltene Ser-Ala-OBu' wird in 200 ml Essigester gelöst und mit 33,0 g (76 mMol) Z-Glu(OBu')-ONSu zur Reaktion gebracht. Am nächsten Tage wird das Reaktionsgemisch dreimal mit je 50 ml η Salzsäure und dreimal mit je 50 ml Natriumhydrogencarbonatlösung .usgeschüttelt Die Essigesterphase wird getrocknet, eingedampft und der Rückstand mit Petroläther verrieben. Das rohe Produkt wird aus einem Gemisch aus Essigester und Petroläther umgefällt. 313 g (75%) Z-Glu(OBu')-Ser-AIa-OBu' werden gewonnen, das bei 72—74°C schmilzt. R|=0,6.

₂, Analyse C27H41N3O, (551,84):

Berechnet: C 58,8, H 7,5, N 7,65%;
gefunden: C 58,8, H 7,7, N 7,8%.

Schritt 2
"' Glu(OBu')-Ser-Ala-OBu'

16,0 g (29 mMol) Z-Glu(OBu')-Ser-Ala-OBu' werden in 350 ml Methanol gelöst und in Gegenwart von 1,6 g 10%igem Palladium-Aktivkohle-Katalysator hydriert.

r> Nach Beendigung der Reaktion wird der Katalysator abfiltriert, das Lei ingsmittel abdestilliert und der Rückstand aus einem Gemisch von Methanol und Äther umkristallisiert. Man erhält 9,06 g (75%) Tripeptid, das bei |35-I36°C schmilzt. R? =0,15. [α]_σ=-25,9° (c=\,

Äthanol).

Analyse
Berechnet:
gefunden:

(417,80):
C54.b. H 8,5, N 10.1%;
C 54,5, H 8,4, N 9.8%.

Schritt 3

Z-Asp(OBu')-Glu(OBu¹)-Ser-Ala-OBu¹

8,2 g (19,6 mMol) Glu(OBu')-Ser-/üa-OBu' und 8,0 g w (19,0 mMol) Z-Asp(OBu')-ONSu werden in 80 ml Essigäthylester zur Reaktion gebracht. Am nächsten Tage wird das Reak:ionsgemisch dreimal mit je 20 ml η Salzsäure und dreimal mit je 20 ml 5%iger Natriumhydrogencarbonatlösung ausgeschüttelt Die Essigesterphase y> wird getrocknet und eingedampft, der Rückstand mit Petroläther verrieben. Der Ester des geschützten Tetrapeptides wird in einer Ausbeute von 12,08 g (853%) erhalten. Schmelzpunkt: 85-87°C, R* = 0,55.

W) Analyse C»H	*N.	(Oi2 (722,81):
Berechnet:	N	7.J%;
gefunden:	N	7.8%.

Schritt 4
Asp(OBii')-Glu(OBu')-Scr-Ala-OBu'

10,5 g (14.5 mMol) /Asp(OBu')-Glu(()Bu^l)-.Ser-Ala-OBu' werden in 1 30 ml Methanol gelöst und in Gegen-

wart von 1 g 10%igem Palladium-Aktivkohle-Katalysator hydriert. Nach Beendigung der Reaktion wird der Katalysator abnitriert, die Lösung eingedampft und der Rückstand mit Petroläther auf ein Filter aufgebracht 8,35 g (973%) Tetrapeptidester werden erhalten. Schmelzpunkt: 80-81⁰C, R? =0,1, [a]_o= -24,3° (c= 1, Äthanol). C₂₇H₄₈N₄Oi₀ (588,68).

Schritt 5
Z-GIu(OBu¹)- ASP(OBuO-GIu(OBu¹J-Se₁-AIa-OBu¹

5,0 g (11,5 mMol) Z-Glu(OBu')-ONSu und 6,60 g (1U mMol) AspfOBu'J-GluiOBuO-Ser-Ala-OBu¹ werden in 100 ml Chloroform zur Reaktion gebracht. Das Reaktionsgemisch wird am nächsten Tage dreimal mit je 30 ml η Salzsäure und dreimal mit je 30 ml 5°/oiger Natriumhydrogencarbonatlösung ausgeschüttelt. Die Chloroformphase wird getrocknet und eingedampft, der gelartige Rückstand mit Petroläther verrieben. Das rohe Produkt wird aus einem Gemisch von Essigester und Petroläther umgefällt. Man erhält den Ester des geschützten Pentapeptides in einer Ausbeute von 8,45 g (83%). Schmelzpunkt: 168-169° C, Rf = OA [ä]d= -29,0° (c= 1, Äthanol).

Analyse C₄₄H₆₉N₅O₁₅ (908,07):

Berechnet: C 58,2, H 7,7, N 7,7%; gefunden: C 58,4, H 7,7, N 7,5%.

Schritt 6
GIu(OBu¹)- AsptOBuO-GlufOBuO-Ser-Ala-OBu'

Gemisch von Äthanol und Äther umkristallisiert. Es werden 4,35 g (83%) Hexapeptidester erhalten, der bei

■ =0,1, Rf =0,65.

192-194° C schmilzt. R? =0,25, Rf

8,0 g (8,8 mMol) ifOi)

Ser-AIa-OBu¹ werden in 160 mi Meth nol gelöst und in Gegenwart von 1,0 g 10%igem Palladium-Aktivkohle-Katalysator hydriert. Nach Beendigung der Reaktion wird der Katalysator abfiltriert, die Lösung eingedampft und der gelartige Rückstand mit einem Gemisch aus Äther und Petroläther auf ein Filter aufgebracht. Man erhält 6,40 g Pentapeptidester, der bei 136—138°C

schmilzt. Rf=O₁I, [α]_υ 29,7° fc=1, Äthanol),

Cj₆H₆₁N₅O₁, (77334).

Schritt 7
Z-Ala-GluiOBu'J-AsptOBu'J-GI^OBuO-Ser-Ala-OBu'

5,20 g (6,7 mMol) Glu(OBu')-Asp(OBu')-Glu(OBu')-Ser-Ala-OBu' werden in 50 ml Chloroform mit 2,15 g (6,7 mMol) Z-AIa-ONSu zur Reaktion gebracht. Das Reaktionsgemisch wird am nächsten Tage dreimal mit je 10 ml η Salzsäure und dreimal mit je IOml 5%iger Natriumhydrogencarbonatlösung ausgeschüttelt. Die Chloroformlösung wird getrocknet und eingedampft, der gelartige Rückstand wird mit Petroläther verrieben. Man erhält den Ester des geschützten Hexapeptides in einer Ausbeute von 6,10 g (93%). Schmelzpunkt: 194-195°C, Rf=OA [λ]ο=-30,9° (c=1, Äthanol). C₄₇H₇₄N₆O₁₆ (979,14).

Schritt 8
Ala-GluiOBti'J-AspiOBuO-GliiiOBuO-Ser-Ala-OBu'

6,10 g (6,2 mMol) Z-Λls-Glu(OBu')-Asp(OBu¹)-GIu(OBu¹J-SCr-AIa-OBu¹ werden in 120 ml Methanol gelöst und in Gegenwart von I₁Og IO%igem l'alladium-Aktivkohlc-Katalysator hydriert. Nach Beendigung der Reaktion wird der Katalysator abfiltriert, die Lösung eingedampft und der kristalline Rückstand aus einem Analyse Cj₉H₆₈N₆Oi₄ (845,00):

Berechnet: C 55,4, H 8,1, N 9,9%;
gefunden· C 55,2, H 7,8, N 9,6%.

, Schritt 9

Z-ASn-GIy-AIa-GIu(OBu¹)-AspiOBuO-Ser-Ala-OBu¹

2,45 g (13,3 mMol) PFPOH, 1,31 g (4,02 mMol) Z-Asn-

GIy und 3,40 g (4,02 mMol) AIa-GIu(OBu¹J-ASp(OBu¹)-GiuiOBu'J-Ser-Ala-OBu¹ werden in 24 ml wasserfreiem Dimethylformamid gelöst, die Lösung auf 0°C

Dimethylformamid gelöst, die Lösung auf 0°C abgekühlt und mit 0,915 g (4,43 mMol) DCC versetzt. Das Reaktionsgemisch wird eine halbe Stunde lang bei 0°C, dann zweieinhalb Stunden lang bei Zimmertemperatur gerührt. Das ausgeschiedene DCU wird abfiltriert und die Lösung eingedampft. Der feste Rückstand wird mit Essigester verrieben und abfiltriert. Das rohe Produkt wird mit 20 ml Essigester gekocht und auf dem Filter zweimal mit 10 ml heißem Essigester gewaschen. Man erhält den Ester des geschützten Oktapeptides in einer Ausbeute von 4,12 g (89%). Schmelzpunkt: 200-201°C, R| =0,60. C₅₅H₈₃NqO₁₉ (1150^0).

Schritt IO

Asn-Gly-Ala-G!u(OBu')-Asp(OBu')-Glu(OBu')-Ser-Ala-OBu¹

4,0 g (3,48 mMol) Z-ASn-GIy-AIa-GIu(OBu¹)-Asp(OBu^c)-Ser-Ala-OBu· werden in 140 ml Methanol gelöst und in Gegenwart von 0,5 g iO%igem Palladium-Aktivkohle-Katalysator hydriert. Natii Beendigung der Reaktion wird der Katalysator abfiltriert, die Lösung eingedampft und der Rückstand mit Äther verrieben. Es werden 3,40 g (96%) Oktapeptidester erhalten, der bei 188-190°Cschmilzt.Rr=0,5,[(x]o=-6,6^o fc=0,89, Dimethylformamid). C₄₅H₇₇N₉O₁₇ (1016,17).

Schritt 11

Z-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Arg(NO₂)-Arg(NO₂)- Pro- VaI-Lys(BOC)-Val-Tyr(Bu')-Pro-Asn-Gly-Ala-Glu(OBu')-

AspiOBuO-GluiOBuO-Ser-Ala-OBu·

3,0 g (2,95 mMol) Asn-Gly-Ala-Glu(OBu¹)-Asp(OBu^t)-Glu(OBu')-Ser-Ala-OBu' und 5,46 g (2,95 mMol) Z-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Arg(NO₂)-Arg(NO₂)-Pro-Val-LysiBOCJ-Val-TyriBuO-Pro (ungarische Patentschrift Nr. 1 55 254) werden in 33 ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird auf 0⁰C gekühlt, und es werden 335 g (4,42 mMol) DCC-PFPOH-Komplex [J. Kovacs u. a.: J. Am. Chem. Soc. 89. 183 (1967)] zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird 15 Minuten lang bei 0°C gehalten, danach bei Zimmertemperatur sechs Stunden lang stehen gelassen. Das ausgeschiedene DCU wird abfiltricrt und das Filtrat in 450 ml wasserfreien Äther eingegossen. Die erhaltene Suspension wird bis /um nächsten Tage an einem kalten Ort stehen gelassen und dann filtriert. Das rohe Produkt wird aus Methanol und Essigester umgefällt. Es werden 7,18 g (85,1%) Ester des geschützten Oktadekapeptides erhalten. Rj =0,35,

"a]_D=-26,4° i'c=0,42,

Ct3iH₂HN₃₀O₄₀ (2849,34).

Schritt 12

Dimethylformamid), [α];;=-26, Γ

Lys(BOC)-Lys(BOC)-Arg-Arg-Pro-Val-Lys(BOC)-

Val-Tyr(Bu')-PrO-ASn-GIy-AIa-GIu(OBu¹)-

Asp(OBu')-GIu(OBu^:)-Ser-Ala-OBu'

6,5 g (2,28 mMol) Z-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Arg(NO₃)-Arg(NO₂)-Pro-Val-Lys(B0C)-Val-Tyr(Bu')-Pro-Asn-GIy-AIa-Glu(OBu')-Asp(OBu')-Glu(OBu')Ser-Ala-OBu¹ werden in 85 ml Essigsäure gelöst und in Gegenwart von 2 g 10%igem Palladium-Aktivkohle-Katalysator hydriert. Nach Beendigung der Reaktion wird der Katalysator abfiltrieit, die Lösung eingedampft und der ölige Rückstand mit wasserfreiem Äther verrieben. Nach dem Filtrieren wird das erhaltene Acetat des Oktadekapeptidester in 70 ml Wasser gelöst. Die Lösung wird mit verdünnter Salzsäure auf pH 4 eingestellt lind das Hydrochlorid des Oktadekapeptidesters mit 30%iger Natriumchloridlösung ausgefeilt. Das Produkt wird abfiltriert, in einem Gemisch von Äthanol und Chloroform gelöst, die Lösung filtriert, eingedampft und der Rückstand mit Äther verrieben. Das Trihydrochlorid des Oktadekapeptidesters wird in einer Ausbeute von 5,6 g (89^%) erhalten. Rf = 0,35,

(c=l,
ι (2734,60).

Schritt 13

ÜimethylfonnHffi'd).

BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met-GIuiOBu'J-His-Pr.e-Arj-TrP-GIy-LyS(BOC)-PrO-VaI-GIy-LyS(BOC)-LyS(BOC)- Arg-Arg-Pro-Val-Tyr(Bu')-Pro-Asn-Gly-Ala-Glu(OBu')-Asp(OBu')-Glu(OBu')-Ser-Ala-OBu

0,525 g (0,264 mMol) BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Mel-Glu(OBu')-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys( BOC)-Pr₀- VaI-GIy HCI und 0,720 g (0,264 mMol) Lys(BOQ-Lys(B0C)-Arg-Arg-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr(Bir)-

Pro-Asn-Gly-Ala-Glu(OBu')-Asp(OBu')-Glu(OBu')-Ser-Ala-OBu' · 3 HCl werden in 4,0 ml Dimethylformamid gelöst und der Lösung 0,03 ml (0,270 mMol) N-Methylmorpholin, danach 0.23 g (0,40 mMol) DCC-PFPOH-Komplex zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird bei Zimmertemperatur ? Tage stehen gelassen. Das DCU wird abfiltriert und das Fütrat mit Ί0 rn! Äther verdünnt. Das ausgefällte Produkt wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und anschließend getrocknet. Das Trichlorid des geschützten, substituierten Dotriakontapeptides wird in einer Ausbeute von 1.10 g (o9%) erhalten. Schmelzpunkt: 182-186°C, R, =0,27. C21.1H34.1N49O59CI3S (4669,77).

Claims (4)

Patentansprüche:

1. Peptide mit einer von der N-terminalen Aminosäure bis wenigstens zur 16. Aminosäure vollständigen ACTH-Sequenz, die in jedem Falle anstelle des N-terminalen Serylrestes den Rest der Aminooxyessigsäure, L- oder D-A-Aminooxypropionsäure oder L- oder D-a-Aminooxy-0-hydroxy-propionsäure enthalten und die gegebenenfalls anstelle einzelner Aminosäurereste der ACTH-Sequenz folgende anderen Aminosäurereste enthalten können: in Position 25 Asparagyl anstelle von Asparaginyl und/oder in Position 26 Alanyl anstelle von Glycyl und/oder in Position 27 Glycyl anstelle von Alanyl, wobei den ausgetauschten Aminosäureresnen die Sequenz des natürlichen menschlichen ACTH zugrunde liegt, sowie deren Säureaddiüonssalze und Amide.

2. Peptide nach Anspruch 1. dadurch gekennzeichnet, daß sich ihre Aminosäure-Reihenfolge von der Sequenz des natürlichen menschlichen ACTH dadurch unterscheidet, daß sie anstelle der Asn²⁵-Gruppe eine Asp-Gruppe, anstelle der GIy²⁶-Gruppe eine Ala-Gruppe und anstelle der AIa²⁷-Gruppe eine Gly-Gruppe aufweisen.

3. Verfahren zur Herstellung der Peptide nach Anspruch 1 oder 2 sowie von deren Säureadditionssalzen oder Amiden, dadurch gekennzeichnet, daß man von Peptiden der in Anspruch 1 oder 2 genannten Art, die wenigstens an der terminalen Aminooxygruppe und den Aminogruppen der Seitenketten, gegebenenfalls auch an der terminalen Carboxylgruppe und den Carboxylgruppen der Seitenketten geschützt sind, jeweils in an sich bekannter Weise die Schutzgruppen abspaltet und die erhaltenen Verbindungen gewünschtenfalls in ihre Säureadditionssalze oder Amide überführt

4. Arzneimittel, enthaltend eine Verbindung nach Anspruch 1 oder 2.