DE2629067A1

DE2629067A1 - Chromogene enzymsubstrate

Info

Publication number: DE2629067A1
Application number: DE19762629067
Authority: DE
Inventors: Leif Erik Dr Aurell; Karl Goeran Dr Claeson; Bo Thuresson Af Dr Ekenstam; Stig Ingemar Dr Gustavsson; Birgitta Gunilla Karlsson; Geb Skale Gun Anita Olausson
Original assignee: Kabi AB
Current assignee: Chromogenix AB
Priority date: 1975-07-11
Filing date: 1976-06-29
Publication date: 1977-01-13
Also published as: NL187693B; ES449738A1; AU1530476A; JPS5615238B2; AU497546B2; FI762009A; IL49830A0; SE407571B; CA1081212A; NL187693C; AT349648B; NL7607433A; JPS5224581A; IT1062604B; DK312776A; PL103098B1; IL49830A; DE2629067C2; FR2317278A1; NO762406L

Description

AKTIEBOLAGET KABI, Lindhagensgatan 133, 104 25 Stockholm,

Schweden

Chromogene Enzymsubstrate

Die Erfindung betrifft chromogene Substrate für Enzyme vom Typ der Serinproteasen (EC 3.4.21). Die Substrate der Erfindung sind insbesondere zur quantitativen Bestimmung der oben genannten Enzyme geeignet, die die Peptidketce an der Carboxylseite von Arginin oder Lysin spalten. Weiterhin können die Substrate für die Untersuchung von Reaktionen, bei denen die genannten Enzyme gebildet, inhibiert oder verbraucht werden, oder für die Bestimmung von derartige Reaktionen beeinflussenden oder an diesen teilnehmenden Faktoren verwendet werden. Synthetische Substrate für die Enzymbestimmung weisen im Vergleich zu natürlichen Substraten erhebliche Vorteile auf, vorausgesetzt daß sie verschiedene Anforderungen erfüllen können, beispielsweise eine große Empfindlichkeit und Spezifizität für das Enzym, eine gute Löslichkeit in Wasser oder der biologischen Testflüssigkeit und einer leichten Nachweisbarkeit für einige ihrer Spaltprodukte.

Substrate mit guten Eigenschaften für die Bestimmung von beispielsweise Plasmin, Thrombin, Trypsin, Kallikrein und Urokinase sind unter anderem in dem schwedischen Patent Nummer 3bO.256 beschrieben worden. Sie stellen prinzipiell chromogene Tripeptidderivate dar. Zu den besten dieser Substrate zählen solche mit einem benzoylierten N-terminalen Ende und einer chromophoren Gruppe, welche an das C-terminale Ende gekoppelt ist, z.B.

Benzoyl-A,-Ap-A^-p-nitroanilid I

in dear A-^, A₂ und A₃ Aminosäuren darstellen.

Mit spezifischen Aminosäuresequenzen bei den genannten Substraten ist es möglich, eine besondere Sensitivität für ein bestimmtes oder für bestimmte Enzyme zu erhalten. Bei der enzymatischen Hydrolyse bilden die Substrate das chromophore Produkt p-Nitroanilin, das in leichter Weise spektrophotometrisdh bestimmt werden kann. Diese Substrate weisen jedoch einen Nachteil auf, und zwar infolge ihrer relativ geringen Löslichkeit (_< 1 mg/ml) . Eine geringe Löslichkeit erfordert ein Arbeiten in der Nähe der Sättigungsgrenze für das Substrat, um eine befriedigende Konzentration desselben zu erreichen. Bei Enzymbestimmungen in unterschiedlichen biologischen Systemen kann es daher vorkommen, daß entweder das Substrat selbst oder eine Kombination Protein/Substrat ausgefällt werden. Diese Ausfällungen führen zu verfälschten Spektrophotometermessungen und somit zu falschen Enzymbestimmungen.

609882/117fl

-3- 262906?

Die benzoylierten Enzymsubstrate gemäß Typ I können erheblich löslicher gemacht werden, wenn man die N-terminale Benzoylgruppe durch H ersetzt. Die nunmehr freie protonierte Aminogruppe der Aminosäure A, vergrößert die Löslichkeit, führt jedoch auch dazu, daß die Geschwindigkeit der Spaltung durch das Enzym verringert wird (cf. Tabelle II). Weiterhin können nunmehr die Substrate in biologischen Testlösungen in unerwünschter Weise zersetzt werden, und zwar durch Aminopeptidasen am N-terminalen Ende.

Erfindungsgemäß wird ein Substrat gemäß Formel I bereitgestellt, das unter dem Gesichtspunkt der Aktivität für ein bestimmtes Enzym befriedigende Eigenschaften aufweist, bei dem jedoch die Benzoylgruppe durch Wasserstoff und gleichzeitig die bisher verwendete L-Form der Aminosäure A, (L-A ) durch ihre D-Form (D-A,) ersetzt sind. Das so erhaltene Substrat ist sehr leicht löslich, und überraschenderweise wird die Aktivität des Substrats in bezug auf das Enzym durch die Einführung einer D-Aminosäure nicht verringert, sondern im Vergleich zu einem entsprechenden, ausschläe ßlich aus L-Aminosäuren bestehenden Substrat mehrfach gesteigert. Seine Aktivität ist häufig sogar erheblich besser als das gut wirkende benzoylierte Ausgangssubstrat gemäß Formel I. Die N-terminale freie D-Aminosäure in dem Substrat der Erfindung verhindert außerdem einen unerwünschten Angriff von Aminopeptidasen, da diese für L-Aminosäuren spezifisch sind.

-4- 262906?

Die chromogenen Enzymsubstrate gemäß der Erfindung entsprechen der folgenden allgemeinen Formel

H - D-A₁ - A₂ - A₃ - NH -

in der A, und A„ die Aminosäuren Gly, Ala, VaI, Leu, He, Pip, Pro oder Aze und A« weiterhin Phe, A- Arg, Lys oder Orn und R eine Nitrophenyl-, Naphthyl-, Nitronaphthyl-, Methoxynaphthyl-, Chinolyl- oder Nitrochinolylgruppe bedeuten. Die Erfindung betrifft weiterhin die Salze der vorgenannten Substrate. (Die Abkürzungen werden weiter unten erläutert).

Für die Synthese der chromogenen Enzymsubstrate der Erfindung können herkömmliche Schutzgruppen und Kopplungsverfahren verwendet werden, die sämtlich in der Peptidchemie geläufig sind.

Für die öC-Aminoschutzgruppe ist es vorteilhaft, Carbobenzoxy- oder t-Butyloxycarbonylgruppen oder verwandte Reste einzusetzen, beispielsweise p-Methoxy-, p-Nitro- oder p-Methoxyphenylazoc arbobe η ζ oxygr uppe η.

Zum Schutz der cf-Guanidogruppe der Arginylfunktion ist es vorteilhaft, die Protonierung oder die NO«- oder p-Toluolsulfonylgruppe zu verwenden.

Für d.ie <f-Aminogruppe im Ornithin und die £-Aminogruppe im Lysin werden vorzugsweise die Carbobenzoxy-, t-Butyloxycarbonyl- oder p-Toluolsulfonylgruppe verwendet.

609802/1Ϊ79

Als abspaltbare jC-Carboxy-Schutzgruppe eignet sich vorzugsweise der Methyl-, Ethyl- oder Benzylester.

Die Kupplung zwischen zwei Aminosäuren oder einem Dipeptid und einer Aminosäure kann durch Aktivierung der^-Carboxygruppa erfolgen. Da3 aktivierte Derivat kann entweder isoliert oder in situ erzeugt werden; es kann beispielsweise der p-Nitrophenyl-, Trichlorphenyl-, Pentachlorphenyl-, N-Hydroxyouccinimid- oder N-Hydroxybenztriazolester, ein symmetrisches oder asymmetrisches Anhydrid oder ein Säureazid sein.

Die Aktivierung zu dem oben genannten Esterderivat kann vorzugsweise in Gegenwart eines Carbodiimide durchgeführt werden, beispielsweise N, N'-Dicyclohexylcarbodiimid, das auch direkt als aktivierendes Kupplungsreagenz zwischen den Carboxy- und Aminokomponenten dienen kann.

Das Prinzip der Substratsynthese kann darin bestehen, daß die Aminosäuren stufenweise an die C-terminale Arginy!gruppe gekoppelt werden, welche entweder von Anfang an mit einer angekoppelten chromophoren Gruppe, die dann als Carboxyschutzgruppe wirkt, oder mit einer abspaltbaren Carboxyschutzgruppe ausgestattet ist. Im letzteren Falle wird die chromophore Gruppe dann an das geschützte Tripeptidderivat angekoppelt. Alternativ ist es prinzipiell möglich, das N-terminale Dipeptidfragment selbst zu erzeugen, das anschließend mit der gegebenenfalls mit einer chromophoren Gruppe ausgestatteten Arginy!gruppe gemäß dem oben diskutierten Prinzip gekuppelt

^wira· 609882/1179

Unabhängig von dem gewählten Prinzip erfolgt die Reinigung der Zwischen- und Endprodukte vorzugsweise durch GelfiltrationsChromatographie, da diese Methode ein rasches synthetisches Arbeiten ermöglicht und maximale Ausbeuten ergibt.

Die Erfindung wird im folgenden durch bevorzugte Ausführungsbeispiele näher erläutert.

Abkürzungen

Aminosäuren (wenn nichts anderes angegeben ist, handelt es sich um die L-Form):

Arg	= Arginin
Aze	= 2-Azetidincarbon3äure
AIa	= Alanin
GIy	= Glycin
He	= Isoleucin
Leu	= Leucin
Ly s	= Lysin
Phe	= Phenylalanin
Pip	= Pipecolsäure
Pro	= Prolin
VaI	= Valin
AcOH	= Essigsäure
Bz	= Benzoyl
CbO-	= Carbobenzoxy-
DCCI	= Dicyclohexylcarbidiimid
DMF	= Dimethylformamid

6098Ö2/ 1 179

2629087

Et-N = Triethylamin

StOAc = Ethylacetat

GPC = Gelfiltrationschromatographie

HBT = N-Hydroxybenztriazol

HMPTA = N, N, N■, N', N'', N»'-Hexamethylphosphorsäuretriamid

HONSu = N-Hydroxysuccinimid

MeOH = Methanol

-OpNP = p-Nitrophenoxy

-pNA = p-Nitroanilid

tBoc = t-Butyloxycarbonyl

TFA = Trifluoressigsäure

TLC = Dünnschichtchromatografie

Für die Synthese verwendete Reaktionstypen

Für die Synthese der in Tabelle II aufgeführten Enzymsubstrate der Erfindung werden verschiedene Reaktionsschritte in weitgehend ähnlicher Weise durchgeführt. Aus diesem Grunde wird eine allgemeine Beschreibung der unterschiedlichen Reaktionstypen und nachfolgend in Tabelle I eine Beschreibung von Zwischen- und Endprodukten, der für verschiedene Reaktionstypen zu verwendenden Aufarbeitungsverfahren und bestimmter physikalischer Daten angegeben.

Reaktionstyp 1

Kupplung der chromophoren Gruppe (R)

609882/1179

20 mMol N^, N -geschütztes Arginin oder N¹S N'^-geschütztes Ornithin oder Lysin oder eines in entsprechender Weise geeignet geschützten Peptidderivats, vermählen und gut getrocknet, werden in 50 ml trockenem frisch destilliertem HMPTA bei Raumtemperatur gelöst. Danach werden 20 mMol Et^N und 3O mMol des chromophoren Amins in Form seines Isocyanatderivats unter wasserfreien Bedingungen und unter Rühren zugegeben. Nach einer Reaktionszeit von einem Tag wird die Reaktionslösung in 0, 5 2 %-iger Natriumbicarbonatlösung unter Rühren eingegossen. Der erhaltene Niederschlag wird durch Filtration entfernt und gründlich mit Bicarbonatlösung, Wasser, 0,5 N-Salzsäure und wiederum Wasser gewaschen. Aus dem Niederschlag wird das gewünschte Produkt extrahiert, z.B. mit Methanol, wobei bestimmte Nebenprodukte nicht gelöst werden. Der Methanolextrakt kann nach dem Eindampfen aus einem geeigneten Medium kristallisiert oder durch GPC gereinigt werden.

Reaktionstyp 2

Abspaltung einer Carbobenzoxyschutzgruppe (Cbo-)

lO mMol des gründlich getrockneten Cbo-Derivats werden in 25 ml trockenem AcOH suspendiert. 15 ml 5,6 N HBr in AcOH werden unter wasserfreien Bedingungen bei Raumtemperatur zugegeben. Nach einer Reaktionszeit von 45-60 Minuten wird die Lösung tropfenweise unter heftigem Rühren in 300 ml trockenen Ether gegeben. Die Etherphase w⁴.rd von dem erhaltenen Niederschlag

609882/1179

abgesaugt, der mit 2-3 Portionen von jeweils lOO ml Ether gewasehen wird. Das so erhaltene Hydrobromid der in L^-Ftellung von der Pchut^gruppe befreiten Verbindung wird über NaQH- -PlStzchen 3-15 Stunden im Vakuum bei 40 C getrocknet.

Peaktionstyp 3 Abspaltung einer t-Butyloxycarbony!schutzgruppe (tBoc-)

lO KiMoI de j gut getrockneten tBoc-Derivats werden in 200 ml 25 %-iger TFA in CiLjCIp unter wasserfreien Bedingungen bei Raumtemperatur gelöst. Nach einer Peaktion3zeic von 20 Minuten wird die Lösung tropfenweise, in 500 ml trockenen Ether gegeben. Der erhaltene Niederschlag wird durch Filtration entfernt und mit Ether gründlich gewaschen. Da.5 öo erhaltene Trixluor-c.--te c der in N¹ -Stellung von der Schutzgruppe befreiten Verbindung wird über NaOH-PIgtschen bei 30°C 2-3 Ftunden lang im Vakuum getrocknet.

Reaktionstyp 4 Kupplungsverfahren Freisetzung der .jd-Ar.iinogruppe

Für die Acylierung der bei den Reaktionstypeη 2 oder 3 erhaltenen Derivate muß die ^L-Aminogruppe in Form der freien Base vorliegen. Die Freisetzung kann au? zahlreichen unterschiedlichen Wegen erfolgen. Unter anderem ist es möglich, ein Äquivalent eines

. . .10

609882/1179

ßAD

trockenen tertiären Amins (z.B. Et-N oder N-Ethylmorpholin) zu einer auf -10 C gekühlten DMF-Lösung des HBr- oder TFA-Derivats zu geben. In den Fällen deö Einsatzes von Et^N und den HBr-Derivaten wird das ausgefällte 3t_N*HBr durch Filtration entfernt. Alternativ kann das HBr- oder TFA-Derivat in 5 %-iger Natriuinbicarbonatlösung gelöst werden, aus der das freigesetzte Derivat beispielsweise mit EtOAc oder Butanol extrahiert wird. Anschließend wird die organische Phase getrocknet und eingedampft.

a) Bei N^-geschützten aktiven Esterderivaten

Zu einer Lösung von 10 mMol Peptid oder Amxnosäurederivat, gemäß den obigen Verfahren freigesetzt, in 20-50 ml frisch destilliertem DMF werden 11 mMol des N^-geschützten p-Nitrophenyl- oder N-Hydroxysuccinimidesterderivats der anzukuppelnden Aminosäure bei -10 C gegeben. Nach e iner Reaktionszeit von einer Stunde bei -10 C wird die Lösung mit 5 mMol· eines tertiären Amins gepuffert. Man läßt sie dann sich langsam auf Raumtemperatur erwärmen. Der Reaktionsverlauf wird zweckmäßigerweise durch TLC-Analyse verfolgt. Falls erforderlich, gibt man weitere 5 mMol· Base nach erneutem Kühlen hinzu. Wenn die Reaktion beendigt ist, wird die Lösung in einem Rotationsfilmverdampfer zu einem öligen Rückstand eingedampft, der mit einigen Portionen Wasser gerührt wird. Der Rückstand wird durch GPC oder Umkrista^isation gereinigt. Falls man für die Reinigung des

. .

6098S2/1179

Kopplungsproduktes GPC verwendet und dieses ein Eluatvolumen aufweist, das vollständig oder teilweise mit dem aktiven Esterderivat der gekuppelten Aminosäure übereinstimmt, kann die Verunreinigung des Kupplungsproduktes vermieden werden, wenn nach Beendigung der Reaktion, jedoch vor dem Eindampfen, das nichtverbrauchte aktive Esterderivat durch einen Überschuß (3-5 mMol) eines primären Amins, z.B. n-Butylamin, innerhalb von 30 Minuten bei Raumtemperatur ersetzt wird. Danach erfolgt die Aufarbeitung in der oben beschriebenen Weise.

b) bei N^-geschützten Aminosäuren oder Peptiden und Herstellung des aktiven Esters in situ

Zu einer Lösung von 10 mMol des oben genannten freien Peptids oder des Aminosäurederivats in 20-50 ml frisch destilliertem DMF werden 11 mMol der N^-geschützten Aminosäure oder des in entsprechender Weise geschützten Peptidderivats mit einer C-terminalen freien Carboxygruppe, 11 mMol HBT oder HONSu und 11 mMol DCCI bei -l0°C gegeben. Nach 1-3 Stunden bei -l0°C läßt man die Reaktionslösung sich auf Raumtemperatur erwärmen. Der Reaktionsverlauf wird zweckmäßigerweise durch TLC-Analyse verfolgt. Nach Beendigung der Reaktion wird die Lösung unter R*ühren in 100-300 ml 5 %-iger NaHCO₃ (aq) gegossen.

Der erhaltene Niederschlag wird nach der Filtration oder Dekantierung mit Wasser gewaschen. Der Rückstand wird durch GPC oder Umkristallisation gereinigt.

609882/1179

Reaktionstyp 5

Abspaltung sämtlicher Schutzgruppen, Reinigung und Ionenaustausch

0,2-1,0 mMol des geschützten Peptidderivats mit der gewünschten chromophoren Gruppe werden von den Schutzgruppen befreit, indem man es in einem Sakakibara-Apparat 60 Minuten bei 0 C mit 5-20 ml trockenem HF in Gegenwart von 0, 2-1, 0 ml Anisol umsetzt. Nach Beendigung der Reaktion und nach Destillation der gesamten HF wird das rohe Produkt in 33 %-iger wässriger AcOH gelöst und durch GPC gereinigt. Das Produkt wird durch Gefriertrocknung von der verdünnten AcOH befreit und einem Ionenaustausch unterworfen, und zwar an einer Kolonne, die aus

einem schwach basischen Ionenaustauscherharz Sephadex

QAE-25 in der Chloridform, gequollen in Me0H:Wasser 95:5, wobei das gleiche Medium als Lösungs- und Eluatmittel dient. Das reine Produkt wird durch Gefriertrocknung von Wasser befreit.

Gelfiltrationschromatografxe

Die GPC von geschützten Peptiden oder Aminosäurederivaten, Rohprodukten oder nach der Kristallisation eingedampften Mutterlaugen ergibt ein vereinfachtes Aufarbeitungsverfahren und optimale Ausbeuten. Die Substanz wird anschließend in MeOH gelöst und in eine Kolonne überführt, die eine geeignete Größe

(R)

aufweist (Volumen 0,5-7,5 1, Länge lOO cm), mit Sephadex ^K ' LH-20, gequollen in Methanol, gefüllt ist und mit dem gleichen

809882/1179

Lösungsmittel eluiert wird. Das Eluat wird in geeignete Partialvolumina fraktioniert, wobei seine UV-Absorption (254 mn) kontinuierlich bestimmt wird. Produkthaltige Teilfraktionen werden durch TLC hinsichtlich ihrer Reinheit überprüft. Die reinen Fraktionen werden vereinigt und eingedampft.

Für die Reinigung von Peptidderivaten nach Abspaltung der Schutzgruppen mit HF entsprechend der obigen Ziffer 5 wird die 30 %-ige AcOH (aq)-Lösung des Rohprodukts in eine Kolonne

überführt, die eine geeignete Größe (Volumen 0, 5-2,0 1,

(R) Länge 60 cm) aufweist, mit Sephadex^v ' G-15, gequollen in

30 %-iger wässriger AcOH, gefüllt ist und mit dem gleichen Lösungsmittel eluiert wird. Nach der Aufarbeitung in der oben beschriebenen Weise werden die produkthaltigen reinen Teilfraktionen gefriergetrocknet, gegebenenfalls nach teilweiser Verdampfung in einem Rotationsfilmverdampfer bei 25 C.

Dünnschichtchromatografie

Für die TLC-Analyse werden als Absorptionsmittel mit "Kieselgel F₂ri" (Merck) beschichtete Glasplatten verwendet. Es werden die folgenden Lösungsmittelsysteme (Volumenverhältnisse) verwendet:

A: n-Butanol: AcOHrWasser (3:2:1)

P₁: Chloroform: MeOH (9:1) P 1/2: Chloroform: MeOH (19:1)

. ..14

609882/1179

Nach Beendigung der Chromatografie wird die Platte im UV-Licht (254 nm) untersucht und mit Cl/o-Toluidinreagenz in üblicher Weise entwickelt. Die angegebenen R^-Werte stellen die Ergebnisse getrennter Chromatografien dar.

Bestimmung von Serinproteasen durch chromogene Substrate

Die gemäß der Erfindung und den Beispielen hergestellten Substrate werden für die Bestimmung von verschiedenen Enzymen verwendet, und zwar gemäß dem im folgenden beschriebenen Verfahren.

Das Prinzip für die Bestimmung beruht auf der Tatsache, daß das bei der enzymatischen Hydrolyse gebildete Spaltprodukt ein UV-Spektrum aufweist, das sich von dem des Substrats wesentlich unterscheidet. So haben beispielsweise sämtliche p-Nitroanilidaubotrate gemäß der Erfindung Äbsorptionsmaxima bei etwa 310 nm, wobei der molare Extinktionskoeffizient etwa 1200 beträgt. Bei 405 nm ist die Absorption dieser Substrate nahezu vollständig beendet. p-Nitroanilin, das während der enzymatischen Hydrolyse von dem Substrat abgespalten wird, weist ein Absorptionsmaximum bei 3 80 nm und einen molaren Extinktionskoeffizienten von 13200 auf, der bei 405 nm lediglich auf 9620 abgesunken ist. Durch die spektrophotometriache Bestimmung bei 405 nm ist es somit leicht, die gebildete p-Nitroanilinmenge zu verfolgen. Diese Menge ist proportional zu dem Ausmaß der enzymatischen Hydrolyse, die ihrerseits durch

609882/1179

die aktive Enzymmenge bestimmt wird. Tabelle II zeigt einen Vergleich von relativen Reaktionsgeschwindigkeiten zwischen bekannten Substraten gemäß Formel I, ihren nichtbenzoylierten Formen und Substraten gemäß der Erfindung. Aus dieser Tabelle geht eindeutig die Überlegenheit der Substrate der Erfindung hervor.

Dementsprechend sind Substrate der Erfindung um ein Mehrfaches besser als entsprechende Substrate mit N-terminalen L-Aminosäuren. Sie sind weiterhin mindestens so gut wie die zuvor bekannten, am besten wirkenden Substrate, nämlich die benzoylierten Substrate gemäß Formel I. Weiterhin stellt die bessere Löslichkeit der Substrate der Erfindung (20-300 x) einen sehr großen Vorteil für die EnzymbeStimmung, insbesondere in biologischen Systemen, dar, bei denen die geringe Löslichkeit von bisher bekannten Substraten zu Schwierigkeiten führte, und zwar teils infolge des Umstands, daß eine Substratsättigung nicht erreicht werden konnte, und teils infolge der Gefahr unerwünschter Ausfällungen.

Das für die Gelfiltration verwendete Gel Sephadex^v ' G-15

fR) ist ein quervernetztes Dextrangel. Das Gel Sephadex ' LH-2O ist ein hydroxypropyliertes quervernetztes Dextrangel. Der

(R)
Ionenaustauscher Sephadex^v ' QAE-25 ist ein quervernetztes Dextrangel rait Diethyl-(2-hydroxypropy1)-aminoethylresten als funktioneile Gruppen. Diese Gele sind Produkte der Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden.

609882/1179

	t	Produkt	No.	Tabelle I	Synthese gemäß Reakt.	Ausb. typ(%)	Auf- . arb.	Γ 1 ^24></ L^aJ ο	TLC	Cl -Gehalt gef. /ber.	CD CD Q
		Cbo-Arg(N0₂)-pNA	I	Ausgangsmaterial							OD
				Cbo-Arg(NO₂)-OH	1	63	GPC	+20.5(D)	P₁(O.34)		12.1(12.6)
		tBoc-Lys(Cb&)-pNA	II	p-NOp-Phenylisocyanat	1	67	Cryst. (EtOH)	-8.5(M)	P₁(O.72)
	Cbo-Pro-Arg(N0₂)-pNA	III	tBoc-Lys(Cbo)-pNA p-NOp-Phenyli socyanat	2, 4a	96	GP^	-33.0(D)	P₁(O.28)
	Cbo-D-VaI-Pro-Arg(N0₂)-pNA	IV	I, Cbo-Pro-OpNP .	2, 4a	75		+26.2(D;	P₁(O₁SS)
CD	Cbo-Pip-Arg(N0₂)-pNA	V	Ill, Cbo-D-Val-OpNP	. 2, 4a	86	GPC	-26.2(D)	P^O.30)
OO 00	Cbo-Val-Pip-Arg(NO₂)-pNA	VI	I, Cbo-Pip-OpNP	2, 4a	23	GPC	-24.0(D)	P₁(O.40)
	Cbo-Leu-Arg(N0₂)-pNA Boc-D-Ile-Leu-Arg(N0₂)-pNA	VII VIII	V₅ Cbo-D-Val-OpNP	2, 4a 2, 4b	85 94	GPC ■ GPf	+3.7(D) -33.4(M) -2.5(M)	VO.38) P₁(0.38)	I
1 179	Cbo-D-Val-Leu-Arg(N0₂)-pNA	IX	I, Cbo-Leu-OpNP VII, tBoc-D-Ile-OH	2, 4a	54	Cryst. (MeOH)	+1.7(D)	P₁(0.42)
	tBoc-Leu-Lys(Cbo)-pNA	X	VII, Cbo-D-VM-OpNP	3, 4a	74	UPC	-4.7(D)	Pl/2(0.62)
	tBoc-D-Ile-Leu-Lys(Cbo)-pNA	XI	II, tBoc-Leu-OpNP	3, 4b	77	GPC+ +Cryst. (MeOH)	-27.1(M)	P₁(OJO)
Cbo-D-Val-Leu-Lys(Cbo)-pNA	XII	X, tBoc-D-Ile-OH	3, 4a	90	Cryst. (EtOH)	+17.1(D)	Pl/2(".68)
H-D-VaI-Pro-Arg-pNA·2 HCl	XIII	X, Cbo-D-Val-OpNP	5	87	GPC	-117(A)	A(O.38)
	IV (1.46 mmol)

rö	M
	ω
Q)
O
ι
,	ω
CJ	Ln

CJ <+■ -J Oi 1—- ■'

CM Q I

ro

0)

s; g ΐυ

-H M (U -P ro

tn C rö tn (O

O 1-Cl

03

LD

CM	CTi	¹—	lh	cn
CM	r—	CM	CM I	CM
	■SI	l>.	O	*—. Ln
ι—	CM	₍	CO	CM

O	(XJ	•	■	I	■	co
		O	O		O
•						O
O	O	ST
•=c				ro	(J-
<*	cc	■	•	•
	CM	co
•	■	LO		IO	CD
*r—·*	oo	I	I	*
co	IX)		CVJ
I	I		4-

CM

t—

ΩΟ

in

co

cn

CM

O LT)

ΓΟ LX)

CD

ι— CL

'i·

IX)	O	IX) IX)	CM CO
CD	CL	O	O
CL	CL	Γ Ou

CM

CJl

CM

CX)

o cn oo oo

co

IX)

CM

in r-

-J-

CM

οο

Π3

CM

co

ra

CM

CTi

ca

CM

Ti

(O

CM

CO

1—

fO

CM

609882/1 179

CJ

ι *

l_

CJ

+-)

~T~

O

CJ

+j

ZLZ

CJ

Cl

Q-

CL

('")

r>

Q-

(/)

O

Q.

n.

a.

ω

O

Q.

Cl

O-

CJ

CD

-T

O

;U

CD

οι

CD

CT'

-* )

(JJ

CD

CL

S-

z*

?>-

s:

CD

CJ

Cj

rf-—

.—.

γ-

.—.

CL

Cl

Q-

CL

Ω

Q-

Cl

CL

Q.

Q-

Ι

ι—

ο

~- "■

s:

-^r

^. ^

rf '^T

Ο

ZiZ

■ζ.

O

z:

Ο

O

F

O

ή.

Ο

ά.

Q-

I

Ο

I

Ο

ε

t -

<n

Ο

O

3

Ο

O

Ο

r—

Ο

E

B

E

t

1

I

0)

I

rö

I

. ,

co

ca

>1

CU

_J

r—

Ol

>

Cu

I

00

co

r—

QJ

f

I

ca

0)

N

I

_c

O

ro

•

CM

CC

«a:

CD

_1

I 1

Q

_J

<c

CL

ε

•

«

O

■

I

E

O

* '

CJ

O

(2

O

Q

O

+•^^^

N ■*

^ ^

X)

I

JD

;

.Ω

J3

XJ

I

ja

XJ

O

I—t

CJ

O

CJ

O

CJ

O

CJ

CM

*—i

X

*—ι

-Q

Jj

XJ

•

K-I

I 1

CJ

#\

CJ

Λ

*\

CJ

«\

O

K-H

X

1—ι

t—ι

I—I

I—H

Ι—ί

I—I

t—i

«s

I 1

X

I 1

:>

I—I

I 1

X

:>

X

ι—ι Χ

X	X	X	X	X	X	X	X	X	X
X	X	X	X	X	X	X	X	X	X

O

CJ

O

CJ

cc

cC

CM

<c

-i

CM

cc

CM

I

cC

cc

CVJ

et

CC

CM

cC

CM

CJ

ZC

nr

ZC

rc

^^

"ci

O

'El.

O

^^

CZL

O

¹TJ-

O

Q.

O

ZC

CM

Cl.

I

Ο

I

z;

Ο

I

fl

I

Ο

I

Ο

CM

•

I

Ι

> ■

Ι

* r

O

1

ι

*. ^

Ι

■

cC

<C

CC

<c

, *

cn

rf—t

cn

rf—.

cn

JJ

^—.

cn

rf.—^

cn

cC

ζ:

^~rf*

2:

CM

S-

CM

S-

CM

S-

CJ

C\J

S-

CM

S-

Q.

O.

Ο

O

cC

O

cC

O

cc

O

cC

O

cC

Ο

I

Ι

I

z:

I

7^**

I

Ι

cn

</)

ro

—*

^>)

*. -■

OJ

's rf

Γ-

* rf·

CU

Ol

cn

S-

S.-

>^

1.1)

I

cn

I

cn

r—

cn

M

sz

cC

I

1

S-

cC

S-

I—ι

S-

z>»

S-

riC

Ο

<j;

I

c"C

<C

I

<c

I

<C

I

cC

I

Ι

I

3

i

ro

I

3

I

"3

I

r—

O

Q.

CU

ω

CU

ro

r—

>^

HJ

'.υ

ω

r—

'JJ

CU

ca

JD

• r—

I

—J

I

cC

r—

I

r- —

\

ca

- J

NJ

O

Ο

I

*X

I

CD

I-

I—r

z^>

I

Ι

CU

I

CU

r—

I

Q

I

CZl

I

Q

ρ—

ι—

(O

Γ

ca

O

I

O

I

O

I

O

I

ca

I—I

Ι 1

O

JD

O

JZl

Xi

O

XJ

O

^»

I

CJ

JZI

CJ

JZl

CJ

JD

CJ

f~\

ι

Q

α

Q

CJ

O

Q

I

nc

DC

ZC

Tabelle I (Forts.)

Produkt

No.

Ausgangsmaterial

Synthese

gemäß . Ausb. Auf-

Reakt.typ (%) arb.

^x/ TLC
D (R_f)

OT O CO CO CD

Cbo-D-Pro-Phe-Arg(N0₂)-pNA Cbo-D-Pip-Phe-Arg(N0₂)-pNA Cbo-D-Leu-Leu-Arg(N0₂)-pNA Boc-Phe-Lys(Cbo)-pNA

Cbo-D-Pro-Phe-Lys(Cbo)-pNA

H-D-Ala-Ala-Arg-pNA.2HCl H-D-Leu-Gly-Arg-pNA-2HCl H-D-Leu-Ile-Arg-pNA-2HCl H-D-Leu-Val-Arg-pNA-2HCl H-D-VaI-Aze-Arg-pNA-2HCl H-D-Pro-Phe-Arg-pNA-2HCl H-D-P^r ?-Phe-A;-g-pNA'2HCl 'H-D-Leu-Leu-Arg-pNA-2HCl H-D-Pro-Phe-Lys-pNA-2HCl

Cl - Gehalt gef./ber.

XXX XXIX, Cbo-D-Pro-OH 2, 4b 61 GPC

XXXI XXIX, Cbo-D-Pip-OpNP 2, 4a 57 GPC

XXXII VII, Cbo-D-Leu-OpNP 2, 4a 91 GPC

XXXIII II, Boc-Phe-OpNP 3, 4a 65 Cryst.

EtOAc

XXXIV XXXIII, Cbo-D-Pro-OH 3, 4b 62 Cryst,

MeOH

XXXV XX (0.5 mmol) 5 87 GPC

XXXVI XXII (0.3 mmol) 5 79 GPC

XXXVII XXIV {0.35 mmol) 5 75 GPC

XXXVIII XXVI (0.43 mmol) 5 80 GPC

XXXIX XXVIII (0.25 mmol) 5 72 GPC Al XXX (0.4 nvnol) 5 70 GPC XLI XX I (0.3 mmol) 5 65 GPC XLII XXXII (0.3 mmol) 5 72 GPC XLIII XXXIV (0.4 mmol) 5 63 GPC

P^O.36)

P₁(O.37) P₁(O.78)

P₁(0.78)

-42.0(A) A(O.44)

-51.0(M) A(O.44)

-64.3(A) A(O.46)

-53.0(A) A(O.46)

-133(A) A(O.42)

-l.O(A) A(O.40)

-32.1(A) A(O.44)

-47.0(A) A(O.47)

-6.0(M) A(O.50)

13.2(13.8) 13.0(13.!) 12.3(11.9) 11.6(12.1} 12.2(12.9) 10.9(11.6) 11.0(11.3) 11.6(12.0) „12.1(12.1)

X/ ·

Bestimmung von

ΟΛ

[a]t ^H: C = 0.5-1.0; Lsgrn. : (D) = DMF, (M) = MeOH, (A) = 50% AcOH (aq)'

-to ο cn

	(XIII	Tabelle II	KeI	6	Reactions	PI	'-	geschw.	UK
		Löslichkeit mg/ml	T	6	Try			Kai	15
Substrat		Puffer ^x/	80	60				15
Bz-VaI-Pro-Arg-pNA		0.3	4	55			95
H-VaI-Pro-Arg-pNA		40	4	li.-";			30
H-D-VaI-Pro-Arg-pNA		) 100	100	45			45
Bz-VaI-Pip-Arg-pNA	(XVI)			35			100
H-VaI-Pip-Arg-pNA				70	100
H-D-VaI-Pip-Arg-pNA					25	100
Bz-VaI-Leu-Arg-pNA	(XVII	0.2			100	50
H-VaI-Leu-Arg-pNA					55	100
H-D-Val-Leu-Arg-pNA		600			10
Bz-VaI-Leu-Lys-pNA	(XV)	0.5			75
H-VaI-Leu-Lys-piiA					130
H-D-VaI-Leu-Lys-pNA		I) >100			35	100
Bz-Ile-Leu-Arg-pNA	(XVII	0.2			100	20
H-Ile-Leu-Arg-pNA					100
H-D-Ile-Leu-Arg-pNA	4
Bz-Ile-Leu-Lys-pNA	1
H-Ile-Leu-Lys-pNA
H-D-Ile-Leu-Lvs-pNA	) 20

Puffer = Tris, pH 8.2, I 0.15

609882/1 179

BAD ORIGINAL

In der obigen Tabelle sind die relativen Reaktionsbesclwindigkeiten für die verseil ie dene η Substrate in bezug auf ein für jede.D Enzym ausgewähltem Vergleichs substrat angegeben. Abkürzungen, Bezugssubstrate und ihre Empfindlichkeit für die jeweiligen Enzyme ergeben sich aus der folgenden Aufstallung:

Snzyra (Symbol) Bezugssubstrat

Eensitivität A0D/min=0, 0254 (angegebene Enzymmenge ergibt die Aktivität in 0,1 nkat)

Thrombin (T)
Trypsin (Try)
Plasmin (Pl)
Kai lucre in (Kai)
Urokinase (UK)

XIV	0,06	IHH	(Novo)
XIII	O, 03	/ig
XVIII	0,01	CU
XVI	0,2	BS	LQ E
XIV	40	Ρίου

...21

609882/1179

Claims

Patentanspruch

Chromogene Enzymsubstrate der allgemeinen Formel

H - D-A₁ - A₂ - A₃ - NH - R

in der A^ und A_ die Aminosäuren GIy, Ala, VaI, Leu, lie, Pip, Pro oder Aze und A₃ weiterhin Phe, A₃ die Aminosäuren Arg, Lys oder Orn und R eine Sfitrophenyl-, Naphthyl-, Nitronaphthyl-,
Methoxynaphthyl-, Chinolyl- oder Nitrochinolylgruppe bedeuten, sowie ihre Salze.

609882/1179