FI56524C - Nya komogena substrat foer serinproteaser - Google Patents
Nya komogena substrat foer serinproteaser Download PDFInfo
- Publication number
- FI56524C FI56524C FI762009A FI762009A FI56524C FI 56524 C FI56524 C FI 56524C FI 762009 A FI762009 A FI 762009A FI 762009 A FI762009 A FI 762009A FI 56524 C FI56524 C FI 56524C
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- substrates
- group
- pna
- reaction
- enzyme
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/56—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving blood clotting factors, e.g. involving thrombin, thromboplastin, fibrinogen
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/08—Tripeptides
- C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
- C07K5/0804—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
- C07K5/0808—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 2 to 4 carbon atoms, e.g. Val, Ile, Leu
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2337/00—N-linked chromogens for determinations of peptidases and proteinases
- C12Q2337/10—Anilides
- C12Q2337/12—Para-Nitroanilides p-NA
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Hematology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
___ΤΙ ...ν KUULUTUSJULKAISU ΓΓΓΟΛ ^ (11) UTLÄGGNINGSSKRIFT 56524 C Μ5> Pii*srvtti myönnetty II 02 1930 *iÖ3Lä Patent neddelnt ^ (51) Kv.ik.»/Int.ci.* c 07 c 103/52 G 01 N 31/14 SUOH I FINLAND (21) Patenttihakemus — PstantaiuBIcnlng 762009 (22) HakemispUvi — Ansttknlngsdag 09. 07.76 (23) Alkupilvi — Glltightttdag O9.O7.76 (41) Tullut julkiseksi — Bllvlt offantllj 12.01.77
Patentti· ja rekisterihallitus Nihtiviksipwon j. kuuLjuikaisun pvm. -
Patent· och registerstyrelsen ' ' An*ök»n utltgd oeh utl.skrlfien publlcerad 31.10.79 (32)(33)(31) Pyydetty etuoikeus —Begird pHorltet H. 07.7 5
Ruotsi-Sverige(SE) 750797I1-9 (Tl) Aktiebolaget Käbi, S-IOU 25 Stockholm, Ruotsi-Sverige(SE) (72) Bo Thuresson af Ekenstam, Mölndal, Leif Erik Aurell, Särö,
Karl Göran Claeson, Särö, Birgitta Gunilla Karlsson, Mölndal,
Stig Ingemar Gustavsson, Mölndal, Gun Anita Olausson, Västra Frölunda, Ruotsi-Sverige(SE) (7^) Berggren Oy Ab (5*0 Uusia kromogeenisia substraatteja seriiniproteaaseille -Nya kromogena substrat för serinproteaser Tämä keksintö koskee uusia kromogeenisia substraatteja seriini-proteaasityyppisille entsyymeille (EC 3.4.21). Keksinnön mukaiset substraatit ovat erityisen sopivia edellämainittujen entsyymien kvantitatiiviseen määritykseen, jotka lohkaisevat peptidiketjun arginiinin tai lysiinin karboksyylipuolelta. Edelleen kasvualustoja voidaan käyttää niiden reaktioiden tutkimiseen, joissa sanottuja entsyymejä muodostuu, jossa ne inhiböituvat tai joissa niitä käytetään, tai niiden tekijöiden määrittämiseen, jotka vaikuttavat tai ottavat osaa tällaisiin reaktioihin. Synteettisillä entsyymimääri-tykseen tarkoitetuilla substraateilla on suuria etuja verrattuna luonnon kasvualustoihin edellyttäen, että ne täyttävät tietyt ehdot, kuten suuren herkkyyden ja spesifisyyden ko. entsyymille, hyvän liukoisuuden veteen tai biologiseen koenesteeseen ja joidenkin loh-keamistuotteiden helpon todettavuuden.
Erinomaisia substraatteja esimerkiksi plasmiinin, trombiinin, tryp-siinin, kallikreiinin ja urokinaasin määrittämiseen on kuvattu mm. ruotsalaisessa patentissa n:o 380258 (vastaa FI-patenttihakemusta 1308/73) ja ne ovat periaatteessea kromogeenisia tripeptidijohdan- 2 66524 naisia. Parhaita tämän tyyppisiä kasvualustoja ovat ne, joissa on bentsoyloitu N-ketjun pääte ja kromoforinen ryhmä, joka on liittynyt ketjun C-päätteeseen, esim:
Bentsoyyli-A^-A2“Ä2-p-nitroanilidi 1 jossa A.j, A2 ja A^ ovat aminohappoja.
Sanottujen substraattien tietyillä aminohapposarjoilla on mahdollista saada aikaan erikoinen herkkyys tiettyyn tai tiettyihin entsyymeihin nähden. Entsymaattisen hydrolyysin jälkeen substraatit muodostavat kromoförisen tuotteen, p-nitroaniliinin, joka voidaan helposti määrittää spektrofotometrisesti. Näillä substraateilla on kuitenkin liukoisuudesta (- 1 mg/ml) johtuvia rajoituksia. Pieni liukoisuus tekee välttämättömäksi työskentelyn erittäin lähellä substraattien kyllästysrajaa tyydyttävän substraatin väkevyyden saavuttamiseksi. Entsyymimäärityksissä erilaisissa biologisissa systeemeissä saattaa näin ollen tapahtua, että joko kasvualusta sellaisenaan tai proteiinin ja substraatin yhdistelmä saostuu. Sanotut saostumiset aiheuttavat virheellisiä spektrofotometrisiä lukemia ja näin ollen virheellisiä entsyymimäärityksiä.
Tyypin I mukaiset bentsoyloidut entsyymisubstraatit muuttuvat huomattavasti liukoisemmiksi, jos N-päätteinen bentsoyvliryhmä korvataan vetyatomilla. Aminohapon A^ nyt vapaan protonin sisältävä ami-noryhmä lisää liukoisuutta, mutta aikaansaa kuitenkin myös, että se nopeus, jolla entsyymi lohkaisee substraatteja, pienenee (vert. taulukko II). Edelleen aminopeptidaasit voivat nyt hajottaa epämiellyttävällä tavalla kasvualustat biologisessa koeliuoksessa ketjun N-päästä.
Helposti liukenevia substraatteja ja niiden valmistusta on kuvattu, paitsi edellä mainitussa ruotsalaisessa patentissa, suomalaisissa patenttihakemuksissa 1299/73 ja 753246 sekä julkaisuissaFEBS Letters 11 (1970) Dec. 249-253, Bull.Chem. Soc. Japan 46 (1973) No.2, 572-576 .
Tämän keksinnön mukaisesti on aivan odottamatta todettu, että jos kaavan I mukaisessa substraatissa, joka on aktiivisuuden kannalta tyydyttävä tietylle entsyymille, bentsoyyliryhmä vaihdetaan vetyatomiksi ja samanaikaisesti aminohapon A^ tähän saakka käytetty L-muoto (L-A^) korvataan sen D-muodolla (D-A^), on näin saatu substraatti erittäin 3 56524 helposti liukeneva. Substraatin aktiivisuus entsyymin suhteen ei myöskään pienene D-aminohapon mukaanliittämisen vaikutuksesta, vaan on aivan yllättäen useita kertoja parempi kuin vastaavalla substraatilla, jossa on pelkästään L-aminohappoja ja usein jopa huomattavasti parempi kuin kaavan I mukaisella bentsoyloidulla hyvällä lähtökasvu-alustalla. Uuden substraatin N-pään vapaa D-aminohappo estää myös aminopeptidaasien ei-toivotun vaikutuksen, sillä nämä ovat spesifisiä L-aminohapoille.
Keksinnön mukaisille uusille kromogeenisille substraateille on luonteenomaista seuraava yleinen kaava: h-d-a1-a2-a3-nh-r tai sen suolat, jossa A1 ja A2 on jokin aminohapoista Ala, Vai, Leu, Ile/Pip ja Pro, minkä lisäksi A2 voi olla Gly, Aze tai Phe, A3 on jompikumpi aminohapoista Arg tai Lys, ja R on nitrofenyyliryhmä (lyhennysten suhteen kts sivu 4).
Uusien kromogeenisten entsyymisubstraattien syntetisoimiseksi käytetään tavanomaisia suojaavia ryhmiä ja kytkentämenetelmiä, jotka kaikki ovat hyvin tunnettuja peptidikemiassa.
α-Aminoryhmää suojaavana ryhmänä on edullista käyttää karbobentsoksi-tai t-butyylioksikarbonyyliryhmää tai jotakin näihin verrattavaa ryhmää, kuten esimerkiksi p-metoksi-, p-nitro- tai p-metoksifenyyliatso-karbobentsoksiryhmää.
On edullista käyttää protonointia, N02~ tai p-tolueenisulfonyyliryh-miä arginyyliryhmän δ-guanidoryhmän suojaamiseen.
Ornitiinissä olevan δ-aminoryhmän ja lysiinissä olevan ε-aminoryhmän suojauksena on edullista käyttää ennen kaikkea karbobentsoksi-, t-butyylioksikarbonyyli- tai p-tolueenisulfonyyliryhmiä.
Lohkeavana α-karboksiryhmää suojaavana ryhmänä on sopivaa käyttää metyyli-, etyyli-, tai bentsyyliesteriä.
Kytkentä kahden aminohapon tai dipeptidin ja aminohapon välillä saadaan aikaan aktivoimalla α-karboksiryhmä. Aktivoitu johdannainen voidaan joko eristää tai muodostaa itse seoksessa ja se voi olla esimerkiksi p-nitrofenyyli-, trikloorifenyyli-, pentakloorifenyyli-, 4 S6S24 N-hydroksisukkinimidi- tai N-hydroksibentsotriatsoliesteri, symmetrinen tai asymmetrinen anhydridi tai happoatsidi.
Aktivointi yllä mainituksi esterijohdannaiseksi saavutetaan edullisesti karbodi-imidin, esim. N,N'-disykloheksyylikarbodi-imidin läsnäollessa, joka voi myös toimia aktivoivana kytkentäaineena suoraan karboksi- ja aminoryhmien välillä.
Substraatin synteesi perustuu aminohappojen vaiheittaiseen lisäykseen C-pään arginyyliryhmään, johon on joko alusta saakka kytketty kronaoforinen ryhmä, joka sitten toimii karboksiryhmää suo jäävänä ryhmänä, tai joka on varustettu lohkeavalla karboksiryhmää suo-jaavalla ryhmällä, jolloin kromoforinen ryhmä kytketään suojattuun tripeptidijohdannaiseen. Vaihtoehtoisesti on periaatteessa mahdollista syntetisoida N-pään dipeptidiosa, joka sitten kytketään arginyyliryhmään kromoforisen ryhmän kanssa tai ilman sitä edellä selostetulla tavalla.
Riippumatta valmistusmenetelmästä suoritetaan väli- ja lopputuotteiden puhdistus geelisuodatuskromatografisesti, sillä tämä menetelmä tekee mahdolliseksi nopean synteesityöskentelyn ja antaa maksimisaannot.
Keksintöä kuvataan yksityiskohtaisemmin seuraavissa esimerkeissä.
Lyhenteet
Aminohapot (ellei toisin mainita tarkoitetaan L-muotoa):
Arg = Arginiini
Aze = 2-atsetidiinikarboksyylihappo
Ala = Alaniini
Gly = Glysiini
Ile = Isoleusiini
Leu = Leusiini
Lys = Lysiini
Phe = Fenyylialaniini
Pip = Pipekoliinihappo
Pro = Proliini
Vai = Väliini
AcOH = Etikkahappo
Bz = Bentsoyyli 56524 5
Cbo- = Karbobentsoksi- DCCI = Disykloheksyylikarbodi-imidi DMF = Dimetyyliformamidi
Et^N = Trietyyliamiini
EtOAc = Etyyliasetaatti GPC = Geelisuodatuskromatografia HBT = N-hydroksibentsotriatsoli HMPTA = Ν,Ν,Ν,Ν',Ν', N", N"-heksametyylifosforihappotriamidi HONSu = N-hydroksisukkinimidi
MeOH = metanoli -OpNP = p-nitrofenoksi- -pNA = p-nitroanilidi- tBoc = t-butyylioksikarbonyyli- TFA = Trifluorietikkahappo TLC = Ohutlevykromatgografia
Synteesiin käytetyt reaktiotyypit
Taulukossa I lueteltujen uusien entsyymisubstraattien synteesissä suoritetaan eri reaktiovaiheet suurin piirtein samalla tavoin. Tästä syystä esitetään eri reaktiotyyppien yleiskuvaus ja tämän jälkeen taulukossa I selostus väli- ja lopputuotteista, eri reaktiotyypeille käytetyistä puhdistusmenetelmistä ja tietyistä fysikaalisista arvoista.
Reaktiotyyppi 1
Kromoförisen ryhmän (R) kytkentä.
20 mmol Na, NG-suojattua arginiinia tai Να,Νω-suojattua ornitiinia tai lysiiniä jauhettuna ja hyvin kuivattuna liuotetaan 50 ml:aan kuivaa, juuri tislattua HMPTA:a huoneenlämpötilassa, minkä jälkeen 20 mmol Et^t^a ja 30 mmol kytkettävää kromof orista amiinia sen iso-syanaattijohdannaisen muodossa lisätään kosteudelta suojatuissa olosuhteissa ja sekoittaen. Yhden päivän reaktioajan jälkeen reaktio-liuos kaadetaan 0,5 litraan 2-%:sta natriumbikarbonaattiliuosta sekoittaen. Saatu sakka poistetaan suodattamalla ja pestään hyvin bikarbonaattiliuoksella, vedellä, 0,5-N kloorivetyhapolla ja jälleen vedellä. Sakasta uutetaan haluttu tuote esim. metanolilla, johon tietyt sivutuotteet eivät liukene. Metanoliuute voidaan haihdutuksen jälkeen saattaa kiteytymään sopivasta väliaineesta tai puhdistaa GPC-tekniikalla.
6 56524
Reaktiotyyppi 2
Karbobentsoksisuojaryhmän (Cbo-) poislohkaisu.
10 mmol hyvin kuivattua Cbo-johdannaista lietetään 25 ml:an kuivaa AcOH:a ja 15 ml 5/6 -N HBr:a liuotettuna AcOHrin lisätään kosteudelta suojatuissa olosuhteissa huoneenlämpötilassa. 45-60 minuutin reak-tioajan kuluttua liuos syötetään tipoittain 300 ml:an kuivaa eetteriä vilkkaasti sekoittaen. Eeetterifaasi imetään saadusta sakasta, joka pestään 2-3:lla 100 ml:n erällä eetteriä. Näin saatua Na -aseman suojaryhmästä vapautetun yhdisteen hydrobromidia kuivataan NaOH-tablettien yläpuolella tyhjössä 40°C:ssa 3-16 tunnin ajan.
Reaktiotyyppi 3 t-Butyylioksikarbonyylisuojaryhmän (tBoc-) poislohkaisu.
10 mmol hyvin kuivattua tBoc-johdannaista liuotetaan 200 ml:aan 25 %: sta TFA:a liuotettuna Cl^C^ien kosteudelta suojatuissa olosuhteissa huoneenlämpötilassa. 20 minuutin reaktioajan kuluttua liuos syötetään tipoittain 500 ml:aan kuivaa eetteriä. Saatu sakka poistetaan suodattamalla ja pestään runsaalla eetterillä. Näin saatua Na-aseman suojaryhmästä vapautetun yhdisteen trifluoriasetaattia kuivataan NaOH-tablettien yläpuolella tyhjössä 30°C:ssa 2-3 tuntia.
Reaktiotyyppi 4 Kytkentäreaktiot. α-Aminoryhmän vapauttaminen.
Reaktiotyypeissä 2 tai 3 saatujen johdannaisten asyloimiseksi «-ami-noryhmän on oltava vapaana emäksenä. Vapauttaminen voidaan suorittaa monilla eri tavoilla. Muun muassa on mahdollista lisätä yksi ekvivalentti kuivaa tertiääristä amiinia (esim. Et^N:a tai N-etyylimorfo-liinia) HBr- tai TFA-johdannaisen DMF-liuokseen, joka on jäähdytetty -10°C:een. Käytettäessä Et^N- ja HBr-johdannaisia, saostunut Et^N’HBr poistetaan suodattamalla. Vaihtoehtoisesti HBr- tai TFA-johdannainen voidaan liuottaa 5-%:seen natriumkarbonaattiliuokseen, josta vapautettu johdannainen uutetaan esim. EtOAc:lla tai butanolilla, minkä jälkeen orgaaninen faasi kuivataan ja haihdutetaan.
a) Na-suojattujen aktiivisten esterijohdannaisten käyttö.
Liuokseen, jossa on 10 mmol peptidiä tai aminohappojohdannaista, joka on vapautettu yllä esitetyllä tavalla, 20-50 ml:ssa juuri tislattua DMF:a lisätään 11 mmol kytkettävään aminohapon Na-suojattua $6524 7 p-nitrofenyyli- tai N-hydroksisukkinimidiesterijohdannaista -10°C:ssa. Yhden tunnin reaktioajan kuluttua -10°C:ssa liuos puskuroidaan 5 mmol: 11a tertiääristä amiinia ja liuoksen annetaan sitten hitaasti lämmetä huoneenlämpötilaan. Reaktion kulkua on sopivaa seurata TLC-ana-lyysillä. Tarvittaessa lisätään vielä 5 mmol emästä uuden jäähdytyksen jälkeen. Kun reaktio on päättynyt, liuos haihdutetaan kierto-haihdut time 11a öljymäiseksi jäännökseksi, jota sekoitetaan parin vesierän kanssa. Jäännös puhdistetaan GPC:lla tai kiteyttämällä uudelleen. Kun GPC:a käytetään kytkentätuotteen puhdistukseen ja tällä on eluointitilavuus, joka kokonaan tai osittain sopii yhteen kytketyn aminohapon aktiivisen esterijohdannaisen tilavuuden kanssa, kytkentätuotteen saostuminen voidaan välttää, jos päättyneen reaktion jälkeen, mutta ennen haihdutusta kulumaton aktiivinen esterijohdannainen korvataan ylimäärällä (3-5mmol) primääristä amiinia, esim, n-butyyli-amiinia 30 minuutin aikana huoneenlämpötilassa. Tämän jälkeen puhdistus suoritetaan edellä kuvatulla tavalla.
b) Na-suojatun aminohapon tai peptidin käyttö ja aktiivisen esterin valmistus in situ.
Liuokseen, jossa on 10 mmol yllä mainittua vapaata peptidi- tai aminohappo johdannaista 20-50 ml:ssa juuri tislattua DMF:a, lisätään 11 nmol Na-suojattua aminohappoa tai vastaavalla tavalla suojattua peptidi-johdannaista, jonka C-päässä on vapaa karboksiryhmä, 11 mmol HBT:a tai HONSu:a ja 11 mmol DCCI:a -10°C:ssa. 1-3 tunnin kuluttua -10° C:Ssa reaktioliuoksen annetaan lämmetä huoneenlämpötilaan. Reaktion kulkua voidaan sopivasti seurata TLC-analyysillä. Reaktion päätyttyä liuos kaadetaan sekoittaen 100-300 ml:an 5-%:sta NaHCO^sa (vesi-liuos) .
Saatu sakka pestään vedellä suodatuksen tai dekantoinnin jälkeen. Jäännös puhdistetaan GPC-tekniikalla tai kiteyttämällä uudelleen.
Reaktiotyyppl 5
Kaikkien suojaryhmien lohkaiseminen, ja puhdistus ja ioninvaihto. 0,2-1,0 mmol suojattua peptidijohdannaista , jossa on haluttu kromo-forinen ryhmä, vapautetaan suojauksesta antamalla sen reagoida 5-20 ml:n kanssa kuivaa HF:a, kun läsnä on 0,2-1,0 ml anisolia Sakakibara'n mukaisessa laitteistossa (S.Sakakibara et ai, Bull.Chem.Soc., Japan 8 56524 40 (9), 2164-67 (1967)) 60 minuutin ajan 0°C:ssa. Reaktion päätyttyä ja kun kaikki HF on tislattu, raakatuote liuotetaan 33-%seen AcOH:n vesiliuokseen ja puhdistetaan GPC:lla. Tuote eristetään kylmäkui-vaamalla laimennetusta AcOH:sta ja se käsitellään ioninvaihtokolon-nissa, joka koostuu heikosti emäksisestä ioninvaihtohartsista Sepha- ro) dexwQAE-25, joka on kloridimuodossa paisutettuna MeOH/vesiseokseen suhteessa 95:5 saman väliaineen ollessa liuotin- ja eluointiväliai-neena. Puhdas tuote kylmäkuivataan vedestä.
Geelisuodatuskromatografia
Suojattujen peptidi- tai aminohappojohdannaisten, raakatuotteiden tai haihdutettujen emäliuosten kiteytystä seuraavalla GPC-tekniikalla saavutetaan yksinkertainen puhdistusmenettely ja optimaaliset saannot. Materiaali liuotetaan sitten MeOH:in ja siirretään sopivan kokoiseen kolonniin (tilavuus 0,5-7,5 1, pituus 100 cm), joka on täytetty Sepha-dex w LH-20-geelillä paisutettuna MeOHrin, ja se eluoidaan samalla liuottimena. Eluaatti jaetaan sopiviksi osatilavuuksiksi ja sen UV-absorptio (254 nm) määritetään jatkuvasti. Tuotetta sisältävät jakeet tarkastetaan puhtauden suhteen TLC:lla ja puhtaat fraktiot yhdistetään ja haihdutetaan.
Peptidijohdannaisten puhdistamiseksi sen jälkeen, kun ne on vapautettu suojaryhmästä HF:llä edellä mainitun kohdan 5 mukaisesti raakatuot-teen 30-%:nen AcOH (vesi) liuos siirretään sopivan kokoiseen kolonniin
O
(tilavuus 0,5-2,0 1, pituus 60 cm), joka on täytetty Sephadexw G-15-geelillä paisutettuna 30-%:seen AcOH:n vesiliuokseen, ja eluoidaan samalla liuottimena. Sen jälkeen, kun on menetelty yllä esitetyn mukaisesti, tuotetta sisältävät puhtaat jakeet kylmäkuivataan mahdollisesti osittain kun ne on haihdutettu kiertohaihduttimella 25° C:ssa.
Ohutlevykromatograf ia TLC-analyysiä varten käytetään absorbtioaineina "Kieselgel F254" (Merck) piihapolla päällystettyjä lasilevyjä. Käytetyt liuotin-systeemit (tilavuussuhteina) ovat: A: n-butanoli: AcOH:vesi (3:2:1) P-Ι: kloroformi: Me OH (9:1) P 1/2: kloroformi: MeOH (19:1) 9 56524
Kromatografiän jälkeen levyä tutkitaan UV-valossa (254 nm) ja se kehitetään Cl/o-toluidiinireagenssilla yleisen käytännön mukaisesti. Esitetyt R^-arvot ovat tuloksia erillisistä kromatografiakokeista.
Seriiniproteaasien määritys kromogeenisten substraattien avulla Edellä olevien esimerkkien mukaisesti valmistettuja substraatteja käytetään eri entsyymien määrittämiseen seuraavasti! Määritys perustuu seikkaan, että entsymaattisessa hydrolyysissä muodostuneella lohkeamistuotteella on UV-spektri, joka on oleellisesti erilainen kuin substraatilla. Niinpä esimerkiksi kaikilla keksinnön mukaisilla p-nitroanilidisubstraateilla on absorptiomaksimi lähellä 310 nm:a molaarisen ekstinktiokertoimen ollessa n. 12 000. Aallonpituudella 405 nm näiden substraattien absorptio on lähes kokonaan lakannut. p-Nitoraniliinilla, joka on lohjennut substraatista ent-symaattisen hydrolyysin aikana, on absorptiomaksimi kohdassa 380 nm ja molaarinen ekstinktiokerroin 13200, joka aallonpituudella 405 nm on laskenut vain arvoon 9620. Spektrofotometrisellä määrityksellä aallonpituudella 405 nm on näin ollen helppoa seurata muodostuneen p-nitroaniliinin määrää, joka on suhteessa entsymaattiseen hydro-lyysiasteeseen, joka puolestaan määräytyy aktiivisen entsyymimäärän mukaisesti. Taulukko II esittää suhteellisten reaktionopeuksien vertailun kaavan I mukaisten aikaisemmin tunnettujen substraattien, niiden bentsoyloimattomien muotojen ja tämän keksinnön mukaisten substraattien välillä. Tämä taulukko osoittaa selvästi keksinnön mukaisten substraattien paremmuuden.
Näin ollen keksinnön mukaiset substraatit ovat moninkertaisesti parempia kuin vastaavat substraatit, joissa on N-päätteinen L-amino-happo ja edelleen vähintään yhtä hyviä kuin aikaisemmin tunnetut parhaat kasvualustat, jotka ovat kaavan I mukaisia bentsoyloituja substraatteja. Edelleen näiden uusien substraattien suurempi liukoisuus (n. 20-300 kertaa suurempi) on erittäin suuri etu entsyymimääritykeille ennen kaikkea biologisissa systeemeissä, joissa aikaisemmin tunnettujen substraattien huono liukoisuus on aiheuttanut vaikeita ongelmia osittain siksi, että substraatin kyllästystä ei ole voitu saavuttaa ja osittain johtuen ei-toivottujen saostumien vaarasta.
10 56524
Geelisuodatukseen käytetty Sephadex ^G-l 5-geeli on silloitettu deks-traanigeeli. Sephadex ®LH-20-geeli on hydroksipropyloitu silloitettu dekstraanigeeli. Käytetty ioninvaihtaja Sephadex ® QAE-25 on silloitettu dekstraanigeeli, jossa funktionaalisena ryhmänä on dietyyli-(2-hydroksipropyyli)-aminoetyyliryhmiä. Näiden geelien valmistaja on Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Ruotsi: hl 56524 ^ p q i f-ί 11 a · ’"l
I1 3 b «M
rl 3 ® H
ο ω .o ^ cm oo ^ ^ .—.. " . —i ' > *" * ^ \o s-' vo jq- CM CO (Xl O O CO OOCM · O · 21
m f— CM m m p- m m -=r O C— O CO
• · · λ »v « ·· ^ ^ ΓΌ
^-N OO OOOOOOOCMO C\J
r\ C4 f v^/ w vy w w v-/ N s—^ S O
Jj0C rH r—\ 1—I ί—I rH iH fH 1—ί *—I I—f r-H w pc Oh Oh OhOl.Ol.OhOh CHCHOhOH Oh < q qj a o a q q· 2 q? q· q· π a -q
\ 2 W V_H Q 2 Q Q '-f C
X IP. l-' O CM CM O --HL3- w rH H ^ · in · · · r— · m r— r— · t— cm q 0 · m vo vo -=r · m ··. c— t-- h ,_, cm 00 m cm cm cm mm cm p -3· cm h h 8, + 1 1 + 1 1 + 1 1 + 11 +1 ’—* «0 I W >J w
Id) >> P >> •H § H L K >>S 5? 2 >>2 I WH O P M P O O 0.0 O O P ,02 0 0¾¾ P P 0
O 3 (U Oh -H >)W Oh Oh Oh Oh Oh O. ;HS (¾ :HW S
(Sh-P-P O XP'-'OttOCSO OX — OO+'-'X^O
O
P
JQ m c— vomvomm-a--=r.=rc— 0 t~- — vo vo cr\ r~- oo cm co cr\ vo t— t— ovco .5
•H ^ C
tn 0 eg μ <d p .x <dcdcdcdcd.ocdcd.o cd p V 3 .;}· -=r Lq- jq- ρ- -=Τ L3-p- 8 pro E ««««««««« „ 2 w S 1 p p cm" cm im* cm" cm cm cm mm mm
rH
3 ^ OH Oh I I ^ 0<0 D. OH O Ph Oh Oh W 2 M G 2 1022 2 2 -H a P Oh I Ph Ph Oh (D I ä O Oh Q I II 2 1—I 2 Q 2 P P O T O'-' T ρ ^ ·η o, cd α T a, nod 1 φ i p
^ P OH Ο > Ο P O I > 3 P P Q
cm >5 .a >j 1 1 1 id jl Q 1 (uh cd E
o S υ b ρ α a > 3 1 o h 1 >E
Φ 2 CP— cf'rH H I HI CD OI I Q I
q —(U P W Φ P Oh O Oh Q P OO OI n VO
H bO H P >3 H p I p I I I CQ-pOO 1-3-
Cd fnlcdPlICdOOOOO pooqq O
:o «3 cmS i cmS p ppp p cq pH
P IOC00CO"OOO »> ·> P 0 ^ P O 2 Cd Q 2 CO H h m « .
la p I >> m i >> * h « « « Hb H .: * >
P OQ.CO pawn M M > M i> MX X H
H H
O M M H M H
2 h ti Ki3>se!iH*a as < < < 2 <£
2 2 2 Qu 2 H
ο. < α o. I a 0 I 2 II — I 2 Λ Ω< O ^
ΓΜ I CM CM < .Q O CM
<< O < ^ < OO 2 0 P
2 2 2 CM 2 2 2 O. ^ G < ft X, ft O D. vc vc IW —' 2 < I bO I 2 I M M 'L >) coo.
< 2 ^ Η — -χ· £7 in 0 2 >> .1 2 Oh CM^ (MbO cm <C^c .01 .-] ¢0
Oh I OIOShO IIO.'3 1 U
I 2 O 2 2 3 3 s.h φ 3 <
^ ο '~-ί M —' I '—C CUCUWO CD I
CM p W) Oh hO Oh bO .Μ P >3 I P Q
O H LitH-Hq I I u.] d) lift 2 CD I 1—I .—I Oh w I cd I I I h nj pm id 1
U) >> P > Q. H 3 Μ>ΦΙ >P
Ϊ7 p p i h cd Q iiP n I id <υ ·3 I α.οθΗ>ρηηιι q> p 1 0 1 1 1 - 1 1 1 1 0 cj 11 ο ο 0 ooooooopg oa 3 p efi ppppppjorom so 1 H o p oGooorrio pp 02 12 r—i
H
I α> •η φ (Μ σι μ ιη σ\ -UO f\J H (M (M (M £ & 3 rt •Η -X '—I ι—I ι—I ι—I ι—I 4C, t , I to S-ι C— 3Γ Γ— Ο m I d ο .....
Md φ Η ΙΜ Η κ> rg
Cd W U (—I ι—I f—t ι—( r—ι ^ ^ ^ ^ ^ c\i en o m ο insintM^ocnsoo ο η md 31- cm m r-t . (m tn ιλ -ϊ .3--3-31-.3-^- · .... .......
ooooo° ° oooo oooooooo fcd y '—' '—' ^—' '—Μ Γ—I <—I 1—1 ι—I ’—I ι—I (—l t—I r—I ι—i (—4 ι—I r—I ,—( M < < «t «t «t Oi 0.0. 0.0.0,0, 0-.0.0.(1.0-10-10.0-, <<<<<^-' ε
v—' ^N^ --—y -—' id ^ Q O O
in cm t-— m m o — - >- .....O rH CO Ol t~- X .π oo m vo o- in =r no n co m md cm κι cm 3r in CM Q I I I I I + I ++ +
[ a I
I WWW w I 0> >>>,>> >> WC -P -P 4-> +>
•HW:pJ >> >j X >sO
Ό L· t φ κ φ rc φ rc φ < -C w rH Cd O O O O P O O P Q O O Cd P O Cd o o o o Cd o -p o d d Φ Ο. ο. Ο, Ο. Ο, ·Η Φ Ο. ·Η φ Ο. O. Ο, ·Η Φ O, D-. Ο. Ο. Ο. Οι Ο. ·Η +> o.+>+> οοοοαχεοχεουοχεοοοοοοοχω o +> ra o”. nnncMt^n ocr\ co n m -3- σ\ cr\ n o m m n
CO '— CO t— C— C— CO t"- OOCO N N CO CO C--VOC^OOOnCr\VO
✓""N
CO C
s £ "cO δ
•-3 -HUC
'w' w o ro
Φ *H cO
Μ Φ -P .¾ cO cOcO cOcOcOcO cOcOcöcOPcOcOcO
_ ydsjd -3- Ή 3T 3Γ 3Γ 3Γ 33333333 9 p w ε pC ί>5 Λ) *\ rs 9\ r\ .3 co u ι nnnnncM cmcm ojcmcmcm cMCMCMCMCMCMCMrn
Eh O. O.
!S iS O
O, O. O. O, O, is O.
rs rs o rs o rc o. is s· 8 4 8 Λ ? 9 8 j, s i gs a & s s s g j s i i i ® b g 1 v f? -f H f g CO g g cti Ω X Ω φ O M ΩΦΟΦΙΐώρ Φ n C— M I -H | M p CO I N p .e. O O I o.
C o 00 (O Λ1 < OO OMÖ> OCOO.JQPOI
•H CM O CM .—I · I p I PI I PI I O O P O
cO · ·>— · · o o 00 Ö O "O O O " o 00 :θ o O Own X) ο I—* P X)MX)r>« q5 P M —-. —- O « O «OMO »< O H O X X « p M M X M l-l d> b> IH H M «
3 SBKSad 0 H 0 M- 0 M- 0 „ 0 M- 0 0 B H
H M MM MM
^ MM M M M X MKIM
O. > t H H H X M M M H ί> >>>θΙχχχχ
ss ' S^SS§P ö s ^ s ^SS^PPPP
•t 'X <C < .1: .1: ri; . o M ι—I M ,—I rH *,S * i - ", " " \ \ · \ - ’ * - yayyy P< O. a a o. aan.
LC ;n w CP rr; ι l ι ι ι ι ι ι
CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CMCMCM
.....< o< o<o< o ei o < o o o < •X ·χ <t «e et is :s is “s ; ; ;s ’-s ;·; * --· ·-.· .» rs ’s d: ".; f; :s ’.s o. a. >< o, °* *·' a ^ n. ^ ^ a ο. o. n, o. n, ι w) ι 1.0 ι <>o ι t,o ι ι,η ι f.o ho '·ο ι ι ι ι ι I r-x u ^ f. ^ p ^ r, ^ S-, ^ f, s, 5. ^
liO hO bO CO W CM CM -3; cm -tl CM . CM Ό cm h; h; 'f. O
S-. P P X >> O I O I Cd I O I O I O I I I £> <il <c <d p p rs cO rs x ’.s a> x .h rs φ :s φ φ d o I I II I M —' Γ-Ι^-rrH— cO --- N -C -C Φ v-^ a d d d d to < W) c.o oo m »>o > ho --t i.o o. n. p w H Φ Φ Φ Φ H I P | S. I ¢-, I p I S. I I I >j
OiPPPP< C0< d < d < deCM<ÖQ,dp llllll Ml ΦΙΦΙ Φ I CO I P ·Η Φ I
H Φ M Φ M CO <>3 ΡΦΡΜ ΡΦ>ΦΟ.Ο,ΡΦ cOMcOMcOm im jLPIp INI -Cl I IP Φ >M>M><t Q cd Q M n > QctQO. QQOO.
u ΛΛΛΛΛ1 11 1 1 1 1 11111111 o öaaano 00 0000 ooooooocj d I I I I I P p n P P .O p .O .0 JD JD JD JD JD Ö Μ Ϊ K Ϊ a a υ 00 id Cd O O CdCdCdCdOOOuj H 13
I—I
• HO) CO Η σν H OV VO K O H
5 O KVKVHCvJ CVIHrICMOJ £ C C O Λ
•Ηϋ ^Hr-lrHrHrHr-HrHr-1 JUifcT
*?* co O rvjOKvvorvicrvovoH
I 3 O .........
H 3 1) XV KV C\l 1—I Cvj O r f 1—I (M
O W -P 1—I 1—I 1—I 1—I 1—I 1—I r -t 1—I f—I
?2· ^r^rvovocuon-h-o o..........
o a3 w 000000000 D-i <;<<<<<<;<<< \ w .— — <cC-^wn.
X O O KV O Ν—' Ή O —'
J- .... KV O ·· O
(MO OJr-I KV XV · (M K- · r-v ,-. -3" LTV VO LT» H H KV -3“ VO tn a,' 1 1 1 1 1 1 1 1 1 o I-1 3 1 tn ·η I Φ >i 1—1 tn C -P ---1 •H <u Λ >>„ tn fl E t Φ 33 Φ ,C Wrl -POOOOOOOOOO > 5 o φ ·ΗΦΡΜθ,αι<χια,α,α.αια. ^
S Φ P XJSOOOUCJUOOO
o ö £ s
fl VI (M t'-OvirVOCMOirvCVJKV
tn '— VO CO t— t— CO f— t-- VO C*— VO
s .s g λ: o. " «j S ^ - •f—3 Ή -P C3 «ΐ — tn o tn 0) -H m M 0) O ^ O "
p Λ 3 -=t S
o g λ ε o X >5 m n Φ
32 co O 1 kv trvLcvuvirvirvLrvLrvLrvLrv S
H n 3
rt Q
En S
? fe
S ~ ~ % ~ ~ B
Oh 1—I f—I g ' ' r~\ rH
o s 6 0 in kv · E kv .=3- ^
E ΙΛ KV ΐ O KV
C . . . '-r' . O O
H «IfVOOO •O'-r^-r C
rt) M .v_^-_.wHO-^ ·Η
(O HO H w H ί> P
O M _8 ^ · Λ
O
I—)
H I
H H irv ίπ b> 5 S ^ S MH o"
O :><: y y y y HMM II
ä S sS«SS^333 ^ p o <C rt) Γ3 Φ
O. 1—I 1—I 1—I H H H H H rl *H
1 yyyyyyyyy ^ r—s 33 33 33 33 33 33 33 3. ,.13 tn O CVIOJCMOJCVJOJOJOjCvl >, O ·Η ·—- 223232233 ft tn (30.0,0. O. O. O. O. Q. :¾
bOfcoioioifliohObOW E
Φ C
£3 l 1 I I I I I L I o CP Πΐ>>ΦΗΦΦΦ3Φ >
I HHHcöN3333(DjC O
o <οΗ><(χ,α.μ3α. (3
£. I I I I I I I I I I
CU aJ333HÖQ.3P -=r 1 ΗφφΦα)0·Ηφί-ι (\J Ω Φ Q <Hi-3H>P-,CPHCl, ,__ o ö ΛάΛήΛάΛώΛ ^ 6 iiiiiiiii 'x 14
Taulukko II 66524
Substraatti Liukoisuus Suhteelliset reaktionopeudet
mg/rnl . Rel Try P1 Kai UK
puskuria T
Bz-Val-Pro-Arg-pNA 0.3 6 60 15 H-Val-Pro-Arg-pNA iJO 6 55 15 H-D-Val-Pro-Arg-pNA 100 80 100 95 (XIII)
Bz-Val-Pip-Arg-pNA 1*5 30 H-Val-Pip-Arg-pNA ^ 35 05 H-D-Val-Pip-Arg-pNA 100 70 100 (XIV)
Bz-Val-Leu-Arg-pNA 0.2 100 H-Val-Leu-Arg-pNA 50 H-D-Val-Leu-Arg-pNA 600 100 (XVI)
Bz-Val-Leu-Lys-pNA 0.5 100 H-Val-Leu-Lys-pNA 25 H-D-Val-Leu-Lys-pNA >100 100 (XVIII)
Bz-Ile-Leu-Arg-pNA 0.2 55 100 H-Ile-Leu-Arg-pNA 10 20 H-D-Ile-Leu-Arg-pNA 4 75 100 (XV)
Bz-Ile-Leu-Lys-pNA 1 130 H-Ile-Leu-Lys-pNA 35 H-D-Ile-Leu-Lys-pNA 20 100 (XVII) x/ Puskuri = Tris, pH 8.2, I 0.15 15 S6524
Edellä olevassa taulukossa eri substraattien suhteelliset reaktio-nopeudet on esitetty kullekin entsyymille valitun referenssisubst-raatin suhteen. Symbolit, referenssisubstraatit ja niiden herkkyys vastaaville entsyymeille ovat seuraavat:
Entsyymi Referenssi- Herkkyys (esitetty määrä ent- (symboli) substraatti n:o syymiä antaa aktiivisuuden 0,1 nkat)Δ OD/min = 0,0254
Trombiini (T) XIV 0,06 INH -15
Trypsiini (Try) XII 0,03 ^ug (Novo) ^
Plasmiini (PI) XVIII 0,01 CU 3*
Kallikreiini (Kai) XVI 0,2 BE 4)
Urokinaasi (UK) XIV 40 Ploug E 5) 1) Ks. Thrombos.Diathes haemorrh.(Stuttg.) 34, s. 3-5 (1975) 2) Trypsiini saatu Novo Industri A/S:lta, Bagsvoerd, Tanska 3) Ks. Vox Sang, 5 s. 539 (1950) 4) Ks. Methoden der enzymatischen Analyse, julk. H-V Basgmeyer, s. 881, Verlag Chemie, Berliini 1962 5) Ks. Biochem. Biophys. Acta 24, s. 279 (1957)
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE7507974 | 1975-07-11 | ||
| SE7507974A SE407571B (sv) | 1975-07-11 | 1975-07-11 | Nya kromogena enzymsubstrat for serinproteaser |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI762009A FI762009A (fi) | 1977-01-12 |
| FI56524B FI56524B (fi) | 1979-10-31 |
| FI56524C true FI56524C (fi) | 1980-02-11 |
Family
ID=20325115
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI762009A FI56524C (fi) | 1975-07-11 | 1976-07-09 | Nya komogena substrat foer serinproteaser |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4214049A (fi) |
| JP (1) | JPS5224581A (fi) |
| AT (1) | AT349648B (fi) |
| AU (1) | AU497546B2 (fi) |
| BE (1) | BE843969A (fi) |
| CA (1) | CA1081212A (fi) |
| CH (1) | CH622285A5 (fi) |
| CS (1) | CS199631B2 (fi) |
| DD (1) | DD127320A5 (fi) |
| DE (1) | DE2629067A1 (fi) |
| DK (1) | DK146937C (fi) |
| ES (1) | ES449738A1 (fi) |
| FI (1) | FI56524C (fi) |
| FR (1) | FR2317278A1 (fi) |
| GB (1) | GB1510925A (fi) |
| IL (1) | IL49830A (fi) |
| IT (1) | IT1062604B (fi) |
| NL (1) | NL187693C (fi) |
| NO (1) | NO142812C (fi) |
| PL (1) | PL103098B1 (fi) |
| SE (1) | SE407571B (fi) |
| SU (1) | SU700060A3 (fi) |
| ZA (1) | ZA763585B (fi) |
Families Citing this family (31)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CH634662A5 (de) * | 1976-05-28 | 1983-02-15 | Pentapharm Ag | Verwendung von tripeptidderivaten zur quantitativen bestimmung von plasminogen-aktivatoren. |
| SE7801373L (sv) * | 1978-02-07 | 1979-08-08 | Kabi Ab | Lett spjelkbara substrat for kvantifiering av proteaser |
| DE2964956D1 (en) * | 1978-07-18 | 1983-04-07 | Kabi Ab | Bradykinin inhibiting tripeptide derivatives, process for their preparation and pharmaceutical preparations containing them |
| US4275153A (en) * | 1978-08-03 | 1981-06-23 | American Hospital Supply Corporation | Analytical fluorogenic substrates for proteolytic enzymes |
| JPS5537120A (en) * | 1978-09-06 | 1980-03-15 | Kanji Tsuchiya | Method and device for preparation of food from oilseed |
| JPS5559149A (en) * | 1978-10-30 | 1980-05-02 | Torii Yakuhin Kk | Aminoacid derivative |
| JPS59499B2 (ja) * | 1978-11-02 | 1984-01-07 | 味の素株式会社 | ペプチド誘導体 |
| US4327178A (en) | 1979-05-01 | 1982-04-27 | University Of Miami | Urinary kallikrein assay: specific substrates and assay method |
| CA1161431A (en) * | 1979-05-11 | 1984-01-31 | Lars G. Svendsen | Tripeptide derivatives |
| DE2936543A1 (de) * | 1979-09-10 | 1981-04-09 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Chromogene verbindungen |
| CA1161432A (en) * | 1980-02-12 | 1984-01-31 | Lars G. Svendsen | Tripeptide derivatives and their application in assaying enzymes |
| DE3108322A1 (de) | 1980-03-18 | 1981-12-24 | Immuno Aktiengesellschaft für chemisch-medizinische Produkte, 1220 Wien | Chromogenes enzymsubstrat |
| DK155051C (da) * | 1980-05-06 | 1989-07-03 | Pentapharm Ag | Tripeptidderivater samt fremgangsmaade til kvantitativ analyse for proteolytiske enzymer under anvendelse deraf |
| US4568636A (en) * | 1981-03-25 | 1986-02-04 | Pentapharm Ag | Tripeptide derivatives |
| JPS57177985U (fi) * | 1981-04-30 | 1982-11-11 | ||
| US4406832A (en) * | 1981-09-03 | 1983-09-27 | Mallinckrodt, Inc. | Peptide-type substrates useful in the quantitative determination of endotoxin |
| US4510241A (en) * | 1981-09-03 | 1985-04-09 | Mallinckrodt, Inc. | Peptide-type substrates useful in the quantitative determination of endotoxin |
| JPS5863399A (ja) * | 1981-10-14 | 1983-04-15 | Nitto Boseki Co Ltd | 新規なプラスミン測定用基質 |
| ATE17262T1 (de) * | 1981-11-02 | 1986-01-15 | Pentapharm Ag | Verfahren zur quantitativen bestimmung von blutgerinnungsfaktor xii in humanplasma. |
| US4448715A (en) * | 1981-11-02 | 1984-05-15 | University Of Miami | Tagged pyroglu-L-Phe-L-Arg derivatives, substrates and assays for kallikrein |
| NL8201987A (nl) * | 1982-05-13 | 1983-12-01 | Tno | Werkwijze voor het bepalen van de activiteit van plasminogeenactivator van het weefseltype, alsmede voor gebruik bij deze werkwijze geschikte combinatie van het "kit"-type. |
| DE3244030A1 (de) * | 1982-11-27 | 1984-05-30 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Chromogene verbindungen, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung |
| DK201084A (da) * | 1983-04-28 | 1984-10-29 | Kimberly Clark Co | Fremgangsmaade til bestemmelse af cathepsin b i naervaerelse af andre proteolytiske enzymer, og forbindelser til anvendelse ved fremgangsmaaden |
| EP0182929A1 (de) * | 1984-11-26 | 1986-06-04 | American Hospital Supply Corporation | Koaktivator zur Aktivierung von Protein C |
| DE3536903A1 (de) * | 1985-10-16 | 1987-04-16 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur photometrischen bestimmung von protein c |
| JPS62126196A (ja) * | 1985-11-26 | 1987-06-08 | Nitto Boseki Co Ltd | 新規なα１−アンチトリプシン測定用化合物 |
| DE3710937A1 (de) * | 1987-04-01 | 1988-10-13 | Boehringer Mannheim Gmbh | Chromogene verbindungen, ihre herstellung und verwendung als enzymsubstrate |
| JPH01112157A (ja) * | 1987-07-10 | 1989-04-28 | Yamanouchi Pharmaceut Co Ltd | 組織プラスミノーゲンアクチベーター活性の測定法，測定具及び測定用キット |
| JPH0383093U (fi) * | 1989-12-09 | 1991-08-23 | ||
| WO1996021740A1 (en) * | 1995-01-10 | 1996-07-18 | Hendrik Coenraad Hemker | Methods of determining endogenous thrombin potential (etp) and thrombin substrates for use in said methods |
| JPWO2021045182A1 (fi) * | 2019-09-05 | 2021-03-11 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE380257B (sv) * | 1972-05-02 | 1975-11-03 | Bofors Ab | Nya diagnostiskt verksamma substrat med hog specificitet till trombin och andra proteolytiska enzymer av typen peptidyl-peptid-hydrolaser |
| IL42124A (en) * | 1972-05-02 | 1977-02-28 | Kabi Ab | Substrate for the determination of proteolytic enzymes |
| DE2527932C2 (de) * | 1974-07-02 | 1983-04-21 | Pentapharm AG, 4052 Basel | Säureadditionssalze von Tripeptidderivaten und deren Verwendung als Substrate zur Bestimmung von Plasmakallikrein |
| SE407058B (sv) * | 1974-12-05 | 1979-03-12 | Kabi Ab | Nya kromogena enzymsubstrat for serinproteaser |
| CH622286A5 (fi) * | 1975-06-23 | 1981-03-31 | Pentapharm Ag |
-
1975
- 1975-07-11 SE SE7507974A patent/SE407571B/sv not_active IP Right Cessation
-
1976
- 1976-06-16 ZA ZA763585A patent/ZA763585B/xx unknown
- 1976-06-17 IL IL49830A patent/IL49830A/xx unknown
- 1976-06-18 GB GB25411/76A patent/GB1510925A/en not_active Expired
- 1976-06-25 AU AU15304/76A patent/AU497546B2/en not_active Expired
- 1976-06-25 AT AT464076A patent/AT349648B/de not_active IP Right Cessation
- 1976-06-29 DE DE19762629067 patent/DE2629067A1/de active Granted
- 1976-07-06 NL NLAANVRAGE7607433,A patent/NL187693C/xx not_active IP Right Cessation
- 1976-07-08 CS CS764543A patent/CS199631B2/cs unknown
- 1976-07-09 IT IT50363/76A patent/IT1062604B/it active
- 1976-07-09 DD DD193794A patent/DD127320A5/xx unknown
- 1976-07-09 SU SU762379653A patent/SU700060A3/ru active
- 1976-07-09 FR FR7621195A patent/FR2317278A1/fr active Granted
- 1976-07-09 NO NO762406A patent/NO142812C/no unknown
- 1976-07-09 CH CH887176A patent/CH622285A5/de not_active IP Right Cessation
- 1976-07-09 BE BE168773A patent/BE843969A/xx not_active IP Right Cessation
- 1976-07-09 PL PL1976191067A patent/PL103098B1/pl unknown
- 1976-07-09 FI FI762009A patent/FI56524C/fi not_active IP Right Cessation
- 1976-07-09 CA CA256,705A patent/CA1081212A/en not_active Expired
- 1976-07-09 ES ES449738A patent/ES449738A1/es not_active Expired
- 1976-07-09 DK DK312776A patent/DK146937C/da not_active IP Right Cessation
- 1976-07-10 JP JP51082441A patent/JPS5224581A/ja active Granted
-
1978
- 1978-10-27 US US05/955,441 patent/US4214049A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI56524C (fi) | Nya komogena substrat foer serinproteaser | |
| US4137225A (en) | Novel chromogenic enzyme substrates | |
| US4279810A (en) | Easily split substrates for the quantification of proteases | |
| US4061625A (en) | Novel chromogenic thrombin substrates | |
| US4457866A (en) | Chromogenic compounds and their use as enzyme substrates | |
| US4508644A (en) | Chromogenic compounds, a process for their preparation and their use | |
| US4703107A (en) | Water-soluble acylated derivatives of peptides or amino acids, their preparation and their use | |
| US4016042A (en) | Substrate for the quantitative determination of enzymes | |
| NO142074B (no) | Nye kromogene enzymsubstrater for serinproteaser | |
| US4428874A (en) | Tripeptide derivatives | |
| US4247454A (en) | Novel chromogenic thrombin substrates | |
| FI56525C (fi) | Nya kromogena trombinsubstrat | |
| US4568636A (en) | Tripeptide derivatives | |
| Filippova et al. | Fluorogenic peptide substrates for assay of aspartyl proteinases | |
| US4244865A (en) | α hydroxy tripeptide substrates | |
| US4169015A (en) | Novel chromogenic thrombin substrates | |
| US5097014A (en) | Chromogenic tripeptides | |
| Harnois-Pontoni et al. | Hydrosoluble fluorogenic substrates for plasmin | |
| US4434096A (en) | Substrates for the quantitative determination of proteolytic enzymes | |
| KR840001485B1 (ko) | 펩타이드의 제조방법 | |
| Kasafírek et al. | N-Acylated phenylalanine p-nitroanilides: New substrates for chymotrypsin | |
| EP0513863B1 (en) | Substrates for determination of enzyme activity and intermediates for synthesis of the substrates as well as process for producing the intermediates | |
| JPH0244839B2 (fi) |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM | Patent lapsed |
Owner name: AKTIEBOLAGET KABI |