CS199631B2 - Method of producing new chromogen enzyme substrate - Google Patents
Method of producing new chromogen enzyme substrate Download PDFInfo
- Publication number
- CS199631B2 CS199631B2 CS764543A CS454376A CS199631B2 CS 199631 B2 CS199631 B2 CS 199631B2 CS 764543 A CS764543 A CS 764543A CS 454376 A CS454376 A CS 454376A CS 199631 B2 CS199631 B2 CS 199631B2
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- group
- lysine
- substrates
- reaction
- terminal
- Prior art date
Links
- 239000000758 substrate Substances 0.000 title claims description 49
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims description 24
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims description 24
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 13
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 13
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims abstract description 10
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 15
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical group NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 10
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 claims description 9
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 claims description 8
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 claims description 6
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N ornithyl group Chemical group N[C@@H](CCCN)C(=O)O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 6
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 5
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 5
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 claims description 4
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 claims description 4
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 claims description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 3
- HXEACLLIILLPRG-RXMQYKEDSA-N l-pipecolic acid Natural products OC(=O)[C@H]1CCCCN1 HXEACLLIILLPRG-RXMQYKEDSA-N 0.000 claims description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 3
- HXEACLLIILLPRG-UHFFFAOYSA-N pipecolic acid Chemical compound OC(=O)C1CCCCN1 HXEACLLIILLPRG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 244000137850 Marrubium vulgare Species 0.000 claims description 2
- IADUEWIQBXOCDZ-UHFFFAOYSA-N azetidine-2-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)C1CCN1 IADUEWIQBXOCDZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 claims description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 2
- 125000006501 nitrophenyl group Chemical group 0.000 claims description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 17
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 abstract description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 2
- GFNKTLQTQSALEJ-UHFFFAOYSA-N 1-isocyanato-4-nitrobenzene Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=C(N=C=O)C=C1 GFNKTLQTQSALEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 2
- UYWQUFXKFGHYNT-UHFFFAOYSA-N phenylmethyl ester of formic acid Natural products O=COCC1=CC=CC=C1 UYWQUFXKFGHYNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 22
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 15
- 239000000047 product Substances 0.000 description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 14
- -1 t-butyloxycarbonyl group Chemical group 0.000 description 14
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 10
- 238000006757 chemical reactions by type Methods 0.000 description 9
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 9
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 8
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 7
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 7
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 5
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 5
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 5
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 5
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 4
- 102000003990 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 description 4
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 4
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 4
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N trifluoroacetic acid Substances OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960005356 urokinase Drugs 0.000 description 4
- TYMLOMAKGOJONV-UHFFFAOYSA-N 4-nitroaniline Chemical compound NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 TYMLOMAKGOJONV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 3
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 125000003236 benzoyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C(*)=O 0.000 description 3
- 125000001584 benzyloxycarbonyl group Chemical group C(=O)(OCC1=CC=CC=C1)* 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 3
- 235000019439 ethyl acetate Nutrition 0.000 description 3
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 3
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 3
- 102000004400 Aminopeptidases Human genes 0.000 description 2
- 108090000915 Aminopeptidases Proteins 0.000 description 2
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 150000008574 D-amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- 108010088842 Fibrinolysin Proteins 0.000 description 2
- 108060005987 Kallikrein Proteins 0.000 description 2
- 102000001399 Kallikrein Human genes 0.000 description 2
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical compound CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 150000003862 amino acid derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- RDOXTESZEPMUJZ-UHFFFAOYSA-N anisole Chemical compound COC1=CC=CC=C1 RDOXTESZEPMUJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- GNOIPBMMFNIUFM-UHFFFAOYSA-N hexamethylphosphoric triamide Chemical compound CN(C)P(=O)(N(C)C)N(C)C GNOIPBMMFNIUFM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 2
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- RNVCVTLRINQCPJ-UHFFFAOYSA-N o-toluidine Chemical compound CC1=CC=CC=C1N RNVCVTLRINQCPJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 2
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000001953 recrystallisation Methods 0.000 description 2
- UQDJGEHQDNVPGU-UHFFFAOYSA-N serine phosphoethanolamine Chemical compound [NH3+]CCOP([O-])(=O)OCC([NH3+])C([O-])=O UQDJGEHQDNVPGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 150000003512 tertiary amines Chemical class 0.000 description 2
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- GQAAGJRJCUHPEZ-GLKKMWKASA-N (2s)-6-amino-2-[[2-[[(2r)-2-amino-3-methylbutanoyl]amino]-3-methylpentanoyl]amino]-n-(4-nitrophenyl)hexanamide Chemical compound CC(C)[C@@H](N)C(=O)NC(C(C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 GQAAGJRJCUHPEZ-GLKKMWKASA-N 0.000 description 1
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 1-Hydroxybenzotriazole Chemical compound C1=CC=C2N(O)N=NC2=C1 ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HVCNXQOWACZAFN-UHFFFAOYSA-N 4-ethylmorpholine Chemical compound CCN1CCOCC1 HVCNXQOWACZAFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JQFZHHSQMKZLRU-IUCAKERBSA-N Arg-Lys Chemical group NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N JQFZHHSQMKZLRU-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- 101800005309 Carboxy-terminal peptide Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 125000000998 L-alanino group Chemical group [H]N([*])[C@](C([H])([H])[H])([H])C(=O)O[H] 0.000 description 1
- 125000000174 L-prolyl group Chemical group [H]N1C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[C@@]1([H])C(*)=O 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- FBNPMTNBFFAMMH-UHFFFAOYSA-N Leu-Val-Arg Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(C)C)C(=O)NC(C(O)=O)CCCN=C(N)N FBNPMTNBFFAMMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 description 1
- 108010062796 arginyllysine Proteins 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 description 1
- HQABUPZFAYXKJW-UHFFFAOYSA-N butan-1-amine Chemical compound CCCCN HQABUPZFAYXKJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 239000012847 fine chemical Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N hydrogen chloride Substances Cl.Cl IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000041 hydrogen chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N hydroxybenzotriazole Substances O=C1C=CC=C2NNN=C12 NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000012948 isocyanate Substances 0.000 description 1
- 150000002513 isocyanates Chemical class 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000000401 methanolic extract Substances 0.000 description 1
- UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N methoxybenzene Substances CCCCOC=C UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- HOGDNTQCSIKEEV-UHFFFAOYSA-N n'-hydroxybutanediamide Chemical compound NC(=O)CCC(=O)NO HOGDNTQCSIKEEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006225 natural substrate Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N phloretic acid Chemical compound OC(=O)CCC1=CC=C(O)C=C1 NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 1
- 230000005588 protonation Effects 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 239000010802 sludge Substances 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001322 trypsin Drugs 0.000 description 1
- 238000002211 ultraviolet spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/56—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving blood clotting factors, e.g. involving thrombin, thromboplastin, fibrinogen
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/08—Tripeptides
- C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
- C07K5/0804—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
- C07K5/0808—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 2 to 4 carbon atoms, e.g. Val, Ile, Leu
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2337/00—N-linked chromogens for determinations of peptidases and proteinases
- C12Q2337/10—Anilides
- C12Q2337/12—Para-Nitroanilides p-NA
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
Vynález se týká způsobu výroby . nových chromogenní enzymových substrátů pro typ serinproteáz (EC 3. 4. 21). Substráty, vyrobené způsobem podle vynálezu jsou zvláště vhodné pro kvantitativní stanovení svrchu uvedených enzymů, které štěpí peptidový řetězec u karboxylové části orgininu nebo· lysinu. Mimoto je možno substráty, vyrobené způsobem . podle vynálezu užít k výzkumu reakcí, při nichž uvedené enzymy jsou tvořeny, inhibovány nebo spotřebovávány, nebo ke zjišťování faktorů, které tyto reakce ovlivňují nebo se jich účastní. Syntetické substráty pro stanovení enzymů mají velké výhody ve srovnání s přírodními substráty za předpokladu, že splňují určité podmínky, například velkou citlivost a specifičnost pro určitý enzym, dobrou rozpustnost ve vodě nebo v kapalině, která se k biologickému pokusu užívá, a snadnou detekci některých štěpných produktů.
Velmi dobré substráty pro stanovení . například plasminu, thrombinu, trypsinu, kalikreinu a urokinázy jsou popsány například ve švédském patentu č. 380 258. Jde v podstatě o chromogenní tripeptidové deriváty. Z nejvýhodnějších substrátů tohoto typu je možno uvést ty, které mají na jednom konci benzooyiovanou N-termlnální skupinu a chomoforní skupinu, . která · se nachází na O-erminálním konci,. například benzoyl—Ai—A2—A3—p—nitroanilid (I), kde
Ai, A2, A3 jsou aminokyseliny.
Při použití specifického sledu aminokyselin je · možné získat takové substráty, které mají specifickou senzitivitu pro některý enzym nebo skupinu enzymů. Při enzymatické hydrolýze těchto substrátů se .tvoří. p-nitroanilin, který je možno snadno stanovit spektrofotometricky. Tyto substráty . mají však určité omezení vzhledem . . ke své poměrně nízké rozpustnosti, přibližně 1 .mg/ml nebo nižší. . Vzhledem k nízké rozpustnosti je nut-, no reakce provádět blízko hranice nasyce, ní pro substrát, aby bylo možno dosáhnout dostatečné koncentrace substrátu. Při stanovení enzymu v různých biologických systémech může z tohoto. důvodu dojít k tomu, že se vysráží substrát jako takový nebo komplex bílkoviny a substrátu. . Tyto sraženiny jsou příčinou chybného odečítání spektrofotometrických hodnot a tím i chybných výsledků .při stanovení enzymu.
Benzoylované enzymové substráty vzorce I jsou daleko rozpustnější v případě, že se N-terminální benzoylová skupina nahra199831
199В31 dí atomem vodíku. Tím se uvolní protonizovaná aminoskupina aminokyseliny Ai, čímž se současně zvýší i rozpustnost substrátu, snižuje se však rychlost, čímž dochází ke štěpení substrátu enzymem, jak je zřejmé z tabulky II. Mimoto může docházet v případě použití takto pozměněného substrátu к jeho rozkladu nežádoucím způsobem v biologických roztocích, protože N-terminální konec může být rozložen také aminopeptidázou.
Nyní bylo zjištěno, že v případě, že se v substrátu obecného vzorce I, který je uspokojivý vzhledem к účinnosti některých enzymů nahradí benzoylová skupina atomem vodíku a současně se nahradí až dosud užívaná L-forma aminokyseliny Ai (L—Ai) D-formou (D—Ai), je takto získaný substrát velmi snadno rozpustný, avšak aktivita substrátu vzhledem к enzymu se zavedením D-aminokyseliny nesnižuje, ale je neočekávaně několikrát lepší než aktivita odpovídajícího substrátu s L-aminokyselinou a často i podstatně lepší než benzoylovaný původní substrát obecného vzorce I. N-terminální volná D-aminokyselina nového substrátu je také odolná proti nežádoucímu rozložení aminopeptidázami, protože tyto enzymy jsou specifické pro L-aminokyseliny.
Předmětem vynálezu je tedy způsob výroby nového chromogenního enzymového substrátu pro diagnostické účely s dobrou rozpustnosti a vysokou specifičností к serinproteázám s obecným vzorcem
M—D—Ai—Аг—Аз—NH—R, kde
Ai а Аг jsou aminokyseliny Gly, Ala, Val, Leu, Ile, kyselina pipekolinová, Pro, kyselina
2-azetidinkarboxylová, přičemž Аг může ještě znamenat Phe,
Аз znamená aminokyseliny Arg, Lys a Orn a
R znamená nitrofenyl, jakož i farmaceuticky přijatelných solí těchto substrátů, vyznačující se tím, že se postupně uvádějí v reakci aminokyseliny s C-terminální arginylovou lysinovou nebo ornithinovou skupinou, která je opatřena chromoforní skupinou R, sloužící současně jako ochranná skupina na karboxylové skupině, nebo s C-terminální arginylovou, lysinovou nebo ornithinovou skupinou, opatřenou odštěpltelnou ochrannou skupinou na karboxylové skupině, přičemž se na chráněný trlpeptidový derivát naváže chromoforní skupina R, popřípadě se nejprve vytvoří N-terminální dipeptidový fragment, načež se tento fragment naváže na arginylovou, lysinovou nebo ornithionovou skupinu, popřípadě opatřenou chromoforní skupinou R, načež se meziprodukty i výsledné produkty čistí filtrací na gelu a popřípadě chromatografií na iontoměniči.
Při syntéze nových chromogenních enzymových substrátů je možno užít běžných chránících skupin a známých reakčních metod, tak, jak jsou prováděny v chemii peptidů.
Jako chránící skupinu na oí-aminoskupině je výhodné užít karbobenzoxyskuplnu, t-butyloxykarbonylovou skupinu nebo některou z příbuzných skupin, například p-methoxyskupinu, p-nitroskupinu nebo p-methoxyfenylazokarbobenzoxy skupinu.
Je výhodné užít protonizace, skupiny NO2 nebo p-toluensulfonylovou skupinu pro chránění á-guanidoskupiny arginylskupiny.
Pokud jde o chránění <J-aminoskuplny ornithinu a ε-aminoskupiny lysinu, Je výhodné užít především karbobenzoxyskupinu, p-t-butyloxykarbonylovou skupinu nebo p-toluensulfonovou skupinu.
Oštěpitelnou ochrannou skupinou na a-karboxylóvé skupině je s výhodou methyl-, ethyl- nebo benzylester.
Reakce mezi dvěma aminokyselinami nebo mezi dipeptldem a aminokyselinou se provádí aktivací w-karboxylové skupiny. Aktivní derivát je možno izolovat nebo je možno jej vytvořit přímo v reakční směsi. Může jít například o p-nitrofenylester, trichlorfenylester, pentachlorfenylester, N-hydroxysukcinimidester nebó N-hydroxybenzotriazolester, symetrický nebo asymetrický anhydrid nebo o kyselý azid.
Aktivace svrchu uvedeného esteru se s výhodou provádí za přítomnosti karbódiimidu, například N,N‘-dicyklohexylkarbodiimldu, který může současně sloužit jako aktivační činidlo, zrychlující průběh reakce mezi karboxyskupinou a aminoskupinou.
Nezávisle na způsobu syntézy se výsledný produkt nebo i meziprodukt čistí gelovou filtrací, protože tento způsob umožňuje velmi rychlou syntézu, přičemž se současně dosahuje maximálních výtěžků.
Vynález bude osvětlen následujícími příklady.
V průběhu popisné části v příkladech se užívá následujících zkratek:
Zkratky:
Aminokyseliny (L-forma, není-li jinak uve-
| děno): | |
| Arg | = arginin |
| Aze | = kyselina 2-azetidinkarbo· |
| xylová | |
| Ala | = alanin |
| Gly | = glycin |
| Ile | = isoleucin |
| Leu | = leucin |
| Lys | = lysin |
| Phe | = fenylalanin |
| Pip | = kyselina pipekolinová |
| Pro | = prolin |
| Val | = valin |
| AcOH | = kyselina octová |
| Bz | = benzoyl |
| Cbo- | = karbobenzoxyskupina |
| DCCI | = dicyklohexylkarbodiimid |
| DMF | = dimethylformamid |
| Et3N | = triethy lamin |
| EtOAc | = ethylacetát |
| GPC | = gelová filtrace |
ΗΒΤ = N-hydroxybenzotriazol
HMPTA = N.NXX.N^N^hexamethyitriamíd kyseliny fosforečné HONSu == N-hydroxysukclnlmdd >
MeOH = methanol —OpNP = p-nitrofenoxyskuplna —pNA = p-nftiOauiflftl tBOC = t-butyloxykarbonyl
TFA = kyseiina trilluoroctová
TLC — chromatografie na tenké vrstvě '
Reakční typy syntézy
Při syntéze nových' enzymových substrátů, tak jak jsou uvedeny v tabulce II se provádějí různé reakční stupně obdobným způsobem. Z tohoto důvodu bude podán obecný popis různých reakčních typů syntézy a pak v tabulce I bude uveden výchozí produkt, meziprodukt a výsledný produkt spolu s typem reakce a některými fyzikálními údaji: Reakční typ 1
Navázání chromoforní skupiny R mmolů N“,Nechráněného arglnínu nebo Na,N“-chráněného . ornithinu nebo lysinu nebo odpovídajícím způsobem chráněného peptidového derivátu se po umletí a důkladném vysušení rozpustí v 50 ml bezvodého, čerstvě destilovaného HMPTA při teplotě místnosti, načež se přidá 20 mmolů EtsN a 30 mmolů chromoforního aminu ve formě jeho isokyanátu za nepřístupu vlhkosti a za stálého míchání. Směs se nechá stát 1 den, načež se vlije do 0,5 litru 2% roztoku hydrogenkarbonátu sodného za stálého míchání. Vzniklá sraženina se oddělí filtrací, důkladně se promyje roztokem hydrogenkarbonátu, vodou, 0,5 N kyselinou C^l^l^irovodíkiovou a vodou. Ze sraženiny se . .žádaný produkt ' extrahuje například methanolem, . který nerozpouští některé vedlejší produkty. Methanolový extrakt je možno po odpaření podrobit krystalizacl z vhodného prostředí nebo je možno jej čistit GPC.
Reakční typ 2
Odštěpení chránící' skupiny karbobenzoxyloi vé (Cbo-j mmolů důkladně vysušeného Cbo-derii vátu še uvede v suspensi ve 25 ml bezvodého AcOH a přidá se 15 ml 5,6 N HBr v AcOH za nepřístupu vlhkosti při teplotě místnost’. Po reakční době 45 až 60 minut se .roztok po kapkách přidá ' za energického míchání ' do 300 ml bezvodého etheru. Etherická fáze se zfiltruje, čímž se za odsávání odstraní vzniklá sraženina. Tato sraženina se promyje 2 až 3X 100 ml etheru. Takto získaný hydrobromld ' N“ideblokované sloučeniny se suší tabletovaným NaOH ve vakuu při teplotě 40 stupňů Celsia po dobu 3 až 16 hodin.
.Reakční typ 3
Odštěpení tlbutyloxykatbonylové . chrániči skupiny (tBoc—) mmolů důkladně vysušeného tBoc-derii vátu se rozpustí ve 200 ml 25% . TFA v CH2CI2 za nepřístupu vlhkosti při teplotě místnosti.. Po reakční době 20 minut se vzniklý roztok. přidává po. kapkách do 500 ml bezvodého etheru. Vzniklá sraženina se O^<^<Slí filtrací a důkladně se promyje etherem. Trifluoracei tát takto získané .. N^deblokované sloučeniny se suší tabletami NaOH ve vakuu při teplotě 30 °C 2 :až . 3 hodiny.
Rsakčnítyp 4
Syntéza
Uvolnění o-aminokyselin
Pro acylac’ derivátů, získaných podle reakčních typů 2 nebo . 3 musí být přítomna α-amlnoskupina ve volné formě. Toto uvolnění je možno provádět celou řadou různých způsobů Je například možno přidat 1 ekvivalent bezvodého terciárního aminu, například EtsN nebo N-ethylmorfolinu к roztoku HBr nebo TFA derivátu v DMF, roztok se předem zchladí na —10 °C. V případě, že se užije Et3N a HBr-derivátů, odstraní se vysrážený Et3N . HBr filtrací. . Je však možno postupovat . také tak, že se HBr nebo TFA-derivát rozpustí v 5% roztoku hydrogenkarbonátu . sodného a takto uvolněný ..derivát se pak extrahuje například EtOAc nebo butanolem, načež se organická fáze vysuší a odpaří.
a)
Při . použití Nechráněného aktivního . esteru
K roztoku . 10 mmolů peptidů nebo derivátu s uvolněnou aminoskupinou se přidá ve 20 až 50 ml čerstvě destilovaného DMF ještě 11 mmolu Nechráněného pinitrofenylestei ru . . nebo N-hydroxysukcinimidu aminokyseliny, kťerá má být použita v syntéze, při teplotě —10 °C. . Po . reakční . době 1 . hodina při teplotě —10 °C se k roztoku přidá 5 mmolů terciárního amiu, . který má . funkci pufru, a . pak se teplota . nechá pomalu stoupnout na teplotu místnosti. Pak se provádí analýza chromatografií na tenké vrstvě. . Jedí to zapotřebí, .přidá se dalších 5 mmolů zásady po dalším zchlazení. Po ukončení .reakce . se roztok odpaří na rotační odparce na olejovitý zbytek, který se . smísí dvojnásobným množstvím vody. Tento materiál se pak čistí gelovou filtrací nebo překrystalováním.
V. případě, že se užije gelové. filtrace a výsledný produkt má eluční objem, který zcela . nebo . zčásti překrývá eluční objem^ktivního esteru aminokyseliny, je možno vyvarovat se znečištění výsledného produktu tak, že po skončení reakce, avčak před odpařením se nahradí aktivní ester přebytkem 3 až 5 mmolů primárního aminu, například n-butylaminu, tato reakce trvá 30 minut při teplotě místnosti. Pak je možno reakční směs zpracovávat svrchu uvedeným způsobem.
b)
Použití Nechráněné aminokyseliny nebo peptidu a tvorba aktivního esteru v reakční směsi
К roztoku 10 mmolů svrchu uvedeného uvolněného peptidu nebo derivátu aminokyseliny ve 20 až 50 ml čerstvě destilovaného dimethylformamidu se přidá 11 mmolů N“-chráněné aminokyseliny nebo odpovídajícím způsobem chráněného pepitidového derivátu s C-terminální volnou karboxyskupinou. Jak se přidá 11 mmolů HBT nebo HONSu a 11 mmolů DCCI při teplotě —10 °C. Po 1 až 3 hodinách při teplotě —10 °C se nechá teplota reakčního roztoku stoupnout na teplotu místnosti. Reakční směs se pak analyzuje chromatografií na tenké vrstvě. Po ukončení reakce se reakční směs vlije za stálého míchání do 100 až 300 ml 5% vodného roztoku NaHCO3.
Vzniklá sraženina se promyje vodou po filtraci nebo po slití. Získaný produkt se pak čistí gelovou filtrací nebo překrystalováním.
Reakční typ 5
Odštěpení všech ochranných skupin a čištění na iontoměnlči
0,2 až 1,0 mmolů chráněného peptidového derivátu s žádanou chromoforní skupinou se zbaví ochranné skupiny reakcí s 5 až 20 mililitry FH za přítomnosti 0,2 až 1,0 ml anisolu v Sakakibarově přístroji, sestaveném pro tento účel, v půběhu 60 minut při teplotě 0°C. Po skončené reakci a po oddestilování veškerého HP se surový produkt rozpustí ve 33% vodném roztoku AcOH a čistí se gelovou filtrací. Produkt se izoluje od zředěného AcOH lyofilizací a nechá se projít sloupcem slabě zásadité iontoměničové pryskyřice Sephadex<R1GAE-25 ve chloridové formě po nabotnání ve směsi MeOH a vody v poměru 95:5, přičemž se téhož prostředí užije к rozpuštění materiálu i jako elučního prostředí. Čistý produkt se pak lyofilizuje z vody.
Filtrace na gelu
Gelovou filtrací chráněného peptidu nebo derivátu aminokyseliny je možno získat surové produkty po krystalizaci nebo jednoduchém dalším zpracování v optimálním výtěžku. Získaný materiál se pak rozpustí v
MeOH a přenese se na sloupec vhodného rozměru, například o objemu 0,5 až 7,5 litru a délce 100 cm, naplněný přípravkem Sephadex(R)LH-20 po nabotnání v MeOH, elučnfm činidlem je totéž rozpouštědlo. Eluát se dělí na vhodné části, přičemž se průběžně stanoví jeho absorpční schopnost v ultrafialovém světle při 254 nm. Frakce, které obsahují žádaný produkt se analyzují na čistotu chromatografií na tenké vrstvě, čisté frakce se slijí a odpaří.
Při čištění peptidového derivátu po odstranění ochranné skupiny působením HF podle reakčního typu 5 se nanese roztok surového produktu v 30% vodném roztoku AcOH na sloupec vhodného rozměru, například o objemu 0,5 až 2,0 litru při délce 60 centimetrů, naplněný přípravkem Sephadex(R) G-15 po nabotnání ve 30% vodném roztoku AcOH, к eluci se užívá téhož rozpouštědla. Postup se provádí stejně jako svrchu, čisté frakce s obsahem výsledného produktu se lyofilizují, popřípadě po částečném odpaření na rotační odparce při teplotě 25 °C.
Chřomatografie na tenké vrstvě
Pro chromatografií na tenké vrstvě к analytickým účelům se užívá předem připravených hladkých desek Kiselgel Fžm [Merck]. Užije se následujícího systému rozpouštědel (objemové poměry):
A: n-butanol: AcOH : voda (3:2:1)
Pi: chloroform : MeOH (9:1)
PV2: chloroform : MeOH (19 : 1)
Po skončené chromatografií se deska prohlíží v ultrafialovém světle při 254 nm a vyvíjí se systémy Cl/o-toluidin běžným způsobem. Uvedené hodnoty Rf byly získány jako výsledky z oddělených chromatografických stanovení.
Stanovení serinproteáz při použití chromogenních substrátů
Substráty ze svrchu uvedených příkladů byly užity ke stanovení různých enzymů svrchu uvedeným způsobem.
Princip stanovení je založen na skutečnosti, že štěpný produkt, tvořící se při enzymatické hydrolýze má spektrum v ultrafialovém světle podstatně odlišné od spektra původního substrátu. Například všechny p-nitroanllidové substráty, vyrobené způsobem podle vynálezu mají absorpční maxima v blízkosti 310 nm při molárním extinkčním koeficientu přibližně 12 000. Při 405 nm absorpce těchto substrátů je téměř nulová. Na rozdíl od tohoto substrátu má p-nitroanllin, odštěpený ze substrátu enzymatickou hydrolýzou, absorpční maximum 380 nm a mo.19 9 6 31 s
lární extinkční koeficient 13 200, již při 405 mn klesá tento koeficient na hodotu 9 620. Spektrofotometrickým stanovením při 405 nm je tedy velmi snadné sledovat množství p-nitroanilinu, které je přímo úměrné stupni enzymatické hydrolýzy, na jejímž podkladě je pak snadno možno stanovit množství účinného enzymu. V tabulce II jsou uvedeny pro srovnání relativní reakční rychlosti dříve známých substrátů obecného vzorce I, jejich nebenzoylovaných forem a substrátů, vyrobených způsobem podle vynálezu. Z tabulky jsou zcela zřejmé přednosti substrátů, vyrobených způsobem podle vynálezu.
Substráty, vyrobené způsobem podle vynálezu jsou mimoto také několikrát výhodnější, než odpovídající substráty s N-terminální L-aminokyselinou a mimoto jsou alespoň tak výhodné, jako dříve známé nejvýhodnější substráty, to znamená, jako benzole ylované substráty obecného vzorce I. Mimoto jsou nové substráty, vyrobené způsobem podle vynálezu výhodné také proto, že jejich 20 až 3Ú0X lepší rozpustnost velmi usnadňuje stanovení enzymu především v biologických systémech, v nichž špatná rozpustnost dříve známých substrátů způsobila velké problémy, a to především proto, že nebylo možno dosáhnout nasycenosti substrátu a proto docházelo ke tvorbě nežádoucích sraženin.
Gel Sephadex(R) G-15 pro gelovou filtraci je dextranový gel s příčnými můstky. Sephadex(R) LH-20 je hydroxypropylovaný dextranový gel s příčnými můstky. Iontoměnič Sephadex<R| QAE-25 je dextranový gel s příčnými můstky s diethyl-(2-hydroxypropyljaminoethylovou funkční skupinou. Výrobcem všech přípravků je Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Švédsko.
Tabulka I
Produkt Číslo Výchozí materiál Syntéza Výtěžek Zpracování (a]D24’*TCl Zjištěný podle re- (%) (Rf) obsah akce typu со cm тн in cd
| CM | 00 00 o o oo | оо CM | СО о | со | CM CM rH СМ СМ СМ | |
| co | ь. . | CM CO 00 TJÍ co | СО 'Φ | CD* Γγ | О* | rH rH гН rH rH rH 0Q |
| cd* | CD* | cd* O O* CD* O* | CD О* | Hl* Г^ tx CD LO О | ||
| rH | r-H | ^4 ^4 rH t4 N—( | т-Ч rH | т-Н т-Н | r-H | CM* rH CM* rH СО* СМ* |
| cu | Рч Рч O-ι Рч Сц | Он Рн | ОН Ри | Рч | rH rH τ—1 гН т-Н т-Н Рч |
CM rH CD* cu
CD O CO O CM LO LO cd* od o*
| 00 | ь. | СО Ю СО 00 | ш | тг tJí | ||||||
| СО | СО | СТ) | о | оо | ем | 00 | о | со | О | Гч |
o LO 00 LO CM Γ» CO oo
CD CO 00 (S O co Гч 0000 m rH Гч r> oo 00
| 5 | <с cQ Tfl Tjt | cQ | СО | ДО CQ 'Φ | CQ CD | з | 3 | ,зз | 33$ | cú Tt* | ||
| гН | гН | см* | см* см* | см* | CM* | CM* CM* | 00 co* | 00 | LO LO LO LO Ю LO CM* | CM* CM* | CM* CM CM* | CM* |
a Ξ ž > > > > К x XXXXXXX
Produkt Číslo Výchozí materiál Syntéza Výtěžek Zpracování [a]D 24*’TCl Zjištěný podle re- (%) (Rť) obsah akce typu
Cbo—D—Leu—Val—Arg(NOz) — pNA XXVI XXV, Cbo—D—Leu—OpNP 2,4a 79 GPC Pi(0,65)
Cbo—Aze—ArgfNOžj— pNA XXVII 1, Cbo—Aze—OpNP 2, 4a 69 GPC Pi(0,47)
Tabulka II
| Substrát | Rozpustnost mg/ml pufru *) | Reakční rychlost | ||||
| T | relativní | |||||
| Try | PÍ | Kal | UK | |||
| Bz—Val—Pro—Arg—pNA | 0,3 | 6 | 60 | 15 | ||
| H—Val—Pro—Arg—pNA | 40 | 6 | 55 | 15 | ||
| H—D—Val—Pro—Arg—pNA | 100 | 80 | 100 | 95 | ||
| (ΧΠΙ) | ||||||
| Bz—Val—Pip—Arg—pNA | 4 | 45 | 30 | |||
| H—Val—Pip—Arg—pNA | 4 | 35 | 45 | |||
| H—D—Val—Pip—Arg—pNA | 100 | 70 | 100 | |||
| (XIV) | ||||||
| Bz—Val—Leu—Arg—pNA | 0,2 | 100 | ||||
| H—Val'—Leu—Arg—pNA | 50 | |||||
| H—D—Val—Leu—Arg—pNA | 600 | 100 | ||||
| (XVI) | ||||||
| Bz—Val—Leu—Lys—pNA | 0,5 | 100 | ||||
| H—Val—Leu—Lys—pNA | 25 | |||||
| H—D—Val—Leu—Lys—pNA | >100 | 100 | ||||
| (XVIII) | ||||||
| Bz—Ile—Leu—Arg—pNA | 0,2 | 55 | 100 | |||
| H—Ile—Leu—Arg—pNA | 10 | 20 | ||||
| H—D—Ile—Leu—Arg—pNA | 4 | 75 | 100 | |||
| (XV) | ||||||
| Bz—Ile—Leu—Lys—pNA | 1 | 130 | ||||
| H—Ile—Leu—Lys—pNA | 35 | |||||
| H—D—Leu—Lys—pNA | 20 | 100 |
(XVII) *’ puf г = Tris, pH 8,2, I 0,15
Ve svrchu uvedené tabulce jsou uvedeny ty ve srovnání s referenčními substráty. Byrelativní reakční rychlosti pro různé substrá- lo užito následujících enzymů a symbolů:
Enzym (symbol) Referenční Citlivost substrát č. (stanovené množství enzymu . ; > s účinností 0,1 nkat)
OD/min =' 0,0254
| Thrombin (T) | XIV | 0,06 I NH |
| Trypsin (Try) | XIII | 0,03 (Ug (nový) |
| Plasmin (Pl) | XVIII | 0,01 CU |
| Kallikrein (Kal) | XVI | 0,2 BE |
| Urokináza (UK) | XIV | 40 Ploug E |
PRBDMtT
Claims (1)
- PRBDMtTZpůsob výroby nového chramogenního enzymového substrátu pro diagnostické účely s dobrou rozpustností a vysokou specifičností к serinproteázám s obecným vzorcemM—D—Ai—Až—Аз—NH—R, kdeAi a Až jsou aminokyseliny Gly, Ala, Val,Leu, Ile, kyselina pipekolinová, Pro, kyselina 2-azetidinkarboxylová, přičemž Až může ještě znamenat Phe,VYNAbKXUАз znamená aminokyseliny Arg, Lys a Orn aR znamená nitrofenyl, jakož i farmaceuticky přijatelných solí těchto substrátů, vyznačující se tím, že se postupně uvádějí v reakci aminokyseliny s C-terminální arginylovou, lysinovou nebo ornithinovou skupinou, která je opatřena chromoforní skupinou R, sloužící současně jako ochranná skupina na karboxylové skupině, nebo s C-terminální arginylovou, lysinovou nebo ornlthinovou skupinou, opatřenou odštěpltelnou chránící skupinou na karboxy13199831 lové skupině, přičemž se na chráněný tripeptidový derivát naváže chromoforní skupina R, popřípadě se nejprve vytvoří N-termínální dipeptidový fragment, načež se tento fragment naváže na arginylovou, lysino vou nebo ornithinovou skupinu, popřípadě opatřenou chromoforní skupinou R, načež se meziprodukty i výsledné produkty čistí filtrací na gelu a popřípadě chromatografií na iontoměniči.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE7507974A SE407571B (sv) | 1975-07-11 | 1975-07-11 | Nya kromogena enzymsubstrat for serinproteaser |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS199631B2 true CS199631B2 (en) | 1980-07-31 |
Family
ID=20325115
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS764543A CS199631B2 (en) | 1975-07-11 | 1976-07-08 | Method of producing new chromogen enzyme substrate |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4214049A (cs) |
| JP (1) | JPS5224581A (cs) |
| AT (1) | AT349648B (cs) |
| AU (1) | AU497546B2 (cs) |
| BE (1) | BE843969A (cs) |
| CA (1) | CA1081212A (cs) |
| CH (1) | CH622285A5 (cs) |
| CS (1) | CS199631B2 (cs) |
| DD (1) | DD127320A5 (cs) |
| DE (1) | DE2629067A1 (cs) |
| DK (1) | DK146937C (cs) |
| ES (1) | ES449738A1 (cs) |
| FI (1) | FI56524C (cs) |
| FR (1) | FR2317278A1 (cs) |
| GB (1) | GB1510925A (cs) |
| IL (1) | IL49830A (cs) |
| IT (1) | IT1062604B (cs) |
| NL (1) | NL187693C (cs) |
| NO (1) | NO142812C (cs) |
| PL (1) | PL103098B1 (cs) |
| SE (1) | SE407571B (cs) |
| SU (1) | SU700060A3 (cs) |
| ZA (1) | ZA763585B (cs) |
Families Citing this family (32)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CH634662A5 (de) * | 1976-05-28 | 1983-02-15 | Pentapharm Ag | Verwendung von tripeptidderivaten zur quantitativen bestimmung von plasminogen-aktivatoren. |
| SE7801373L (sv) * | 1978-02-07 | 1979-08-08 | Kabi Ab | Lett spjelkbara substrat for kvantifiering av proteaser |
| AT387393B (de) * | 1978-07-18 | 1989-01-10 | Kabi Ab | Verfahren zur herstellung von neuen tripeptidderivaten |
| US4275153A (en) * | 1978-08-03 | 1981-06-23 | American Hospital Supply Corporation | Analytical fluorogenic substrates for proteolytic enzymes |
| JPS5537120A (en) * | 1978-09-06 | 1980-03-15 | Kanji Tsuchiya | Method and device for preparation of food from oilseed |
| JPS5559149A (en) * | 1978-10-30 | 1980-05-02 | Torii Yakuhin Kk | Aminoacid derivative |
| JPS59499B2 (ja) * | 1978-11-02 | 1984-01-07 | 味の素株式会社 | ペプチド誘導体 |
| US4327178A (en) | 1979-05-01 | 1982-04-27 | University Of Miami | Urinary kallikrein assay: specific substrates and assay method |
| CA1161431A (en) * | 1979-05-11 | 1984-01-31 | Lars G. Svendsen | Tripeptide derivatives |
| DE2936543A1 (de) * | 1979-09-10 | 1981-04-09 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Chromogene verbindungen |
| CA1161432A (en) * | 1980-02-12 | 1984-01-31 | Lars G. Svendsen | Tripeptide derivatives and their application in assaying enzymes |
| DE3108322A1 (de) | 1980-03-18 | 1981-12-24 | Immuno Aktiengesellschaft für chemisch-medizinische Produkte, 1220 Wien | Chromogenes enzymsubstrat |
| DK155051C (da) * | 1980-05-06 | 1989-07-03 | Pentapharm Ag | Tripeptidderivater samt fremgangsmaade til kvantitativ analyse for proteolytiske enzymer under anvendelse deraf |
| US4568636A (en) * | 1981-03-25 | 1986-02-04 | Pentapharm Ag | Tripeptide derivatives |
| JPS57177985U (cs) * | 1981-04-30 | 1982-11-11 | ||
| US4510241A (en) * | 1981-09-03 | 1985-04-09 | Mallinckrodt, Inc. | Peptide-type substrates useful in the quantitative determination of endotoxin |
| US4406832A (en) * | 1981-09-03 | 1983-09-27 | Mallinckrodt, Inc. | Peptide-type substrates useful in the quantitative determination of endotoxin |
| JPS5863399A (ja) * | 1981-10-14 | 1983-04-15 | Nitto Boseki Co Ltd | 新規なプラスミン測定用基質 |
| US4448715A (en) * | 1981-11-02 | 1984-05-15 | University Of Miami | Tagged pyroglu-L-Phe-L-Arg derivatives, substrates and assays for kallikrein |
| EP0078764B1 (de) * | 1981-11-02 | 1986-01-02 | Pentapharm A.G. | Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Blutgerinnungsfaktor XII in Humanplasma |
| NL8201987A (nl) * | 1982-05-13 | 1983-12-01 | Tno | Werkwijze voor het bepalen van de activiteit van plasminogeenactivator van het weefseltype, alsmede voor gebruik bij deze werkwijze geschikte combinatie van het "kit"-type. |
| DE3244030A1 (de) * | 1982-11-27 | 1984-05-30 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Chromogene verbindungen, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung |
| DK201084A (da) * | 1983-04-28 | 1984-10-29 | Kimberly Clark Co | Fremgangsmaade til bestemmelse af cathepsin b i naervaerelse af andre proteolytiske enzymer, og forbindelser til anvendelse ved fremgangsmaaden |
| EP0182929A1 (de) * | 1984-11-26 | 1986-06-04 | American Hospital Supply Corporation | Koaktivator zur Aktivierung von Protein C |
| DE3536903A1 (de) * | 1985-10-16 | 1987-04-16 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur photometrischen bestimmung von protein c |
| JPS62126196A (ja) * | 1985-11-26 | 1987-06-08 | Nitto Boseki Co Ltd | 新規なα１−アンチトリプシン測定用化合物 |
| DE3710937A1 (de) * | 1987-04-01 | 1988-10-13 | Boehringer Mannheim Gmbh | Chromogene verbindungen, ihre herstellung und verwendung als enzymsubstrate |
| JPH01112157A (ja) * | 1987-07-10 | 1989-04-28 | Yamanouchi Pharmaceut Co Ltd | 組織プラスミノーゲンアクチベーター活性の測定法，測定具及び測定用キット |
| JPH0383093U (cs) * | 1989-12-09 | 1991-08-23 | ||
| GB9110298D0 (en) * | 1991-05-13 | 1991-07-03 | Fujisawa Pharmaceutical Co | New peptide compound and a process for the preparation thereof |
| DE69615339T2 (de) * | 1995-01-10 | 2002-07-04 | Hemker, Hendrik Coenraad | Verfahren zum nachweis des endogenen thrombin-potentials und thrombin substrate zur verwendung in diesen verfahren |
| CN114341154B (zh) * | 2019-09-05 | 2024-07-30 | 国立大学法人东京农工大学 | 类胰蛋白酶活性测定用底物 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE380257B (sv) * | 1972-05-02 | 1975-11-03 | Bofors Ab | Nya diagnostiskt verksamma substrat med hog specificitet till trombin och andra proteolytiska enzymer av typen peptidyl-peptid-hydrolaser |
| SE380258B (sv) * | 1972-05-02 | 1975-11-03 | Bofors Ab | Nya diagnostiskt verksamma substrat med hog specificitet till trypsin och andra enzymer av typen peptidyl-peptid-hydrolaser |
| DE2527932C2 (de) * | 1974-07-02 | 1983-04-21 | Pentapharm AG, 4052 Basel | Säureadditionssalze von Tripeptidderivaten und deren Verwendung als Substrate zur Bestimmung von Plasmakallikrein |
| SE407058B (sv) * | 1974-12-05 | 1979-03-12 | Kabi Ab | Nya kromogena enzymsubstrat for serinproteaser |
| CH622286A5 (cs) * | 1975-06-23 | 1981-03-31 | Pentapharm Ag |
-
1975
- 1975-07-11 SE SE7507974A patent/SE407571B/sv not_active IP Right Cessation
-
1976
- 1976-06-16 ZA ZA763585A patent/ZA763585B/xx unknown
- 1976-06-17 IL IL49830A patent/IL49830A/xx unknown
- 1976-06-18 GB GB25411/76A patent/GB1510925A/en not_active Expired
- 1976-06-25 AT AT464076A patent/AT349648B/de not_active IP Right Cessation
- 1976-06-25 AU AU15304/76A patent/AU497546B2/en not_active Expired
- 1976-06-29 DE DE19762629067 patent/DE2629067A1/de active Granted
- 1976-07-06 NL NLAANVRAGE7607433,A patent/NL187693C/xx not_active IP Right Cessation
- 1976-07-08 CS CS764543A patent/CS199631B2/cs unknown
- 1976-07-09 NO NO762406A patent/NO142812C/no unknown
- 1976-07-09 DD DD193794A patent/DD127320A5/xx unknown
- 1976-07-09 SU SU762379653A patent/SU700060A3/ru active
- 1976-07-09 PL PL1976191067A patent/PL103098B1/pl unknown
- 1976-07-09 CA CA256,705A patent/CA1081212A/en not_active Expired
- 1976-07-09 FR FR7621195A patent/FR2317278A1/fr active Granted
- 1976-07-09 IT IT50363/76A patent/IT1062604B/it active
- 1976-07-09 DK DK312776A patent/DK146937C/da not_active IP Right Cessation
- 1976-07-09 BE BE168773A patent/BE843969A/xx not_active IP Right Cessation
- 1976-07-09 FI FI762009A patent/FI56524C/fi not_active IP Right Cessation
- 1976-07-09 ES ES449738A patent/ES449738A1/es not_active Expired
- 1976-07-09 CH CH887176A patent/CH622285A5/de not_active IP Right Cessation
- 1976-07-10 JP JP51082441A patent/JPS5224581A/ja active Granted
-
1978
- 1978-10-27 US US05/955,441 patent/US4214049A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CS199631B2 (en) | Method of producing new chromogen enzyme substrate | |
| CA1136124A (en) | Easily split substrates for the quantification of proteases | |
| US4061625A (en) | Novel chromogenic thrombin substrates | |
| EP0110306B1 (de) | Chromogene Verbindungen, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung | |
| US4137225A (en) | Novel chromogenic enzyme substrates | |
| Hofmann et al. | Studies on polypeptides. XXXIV. Enzymic properties of partially synthetic De (16-20)-and De (15-20)-ribonucleases S'1-3 | |
| US4652552A (en) | Tetrapeptide methyl ketone inhibitors of viral proteases | |
| US4457866A (en) | Chromogenic compounds and their use as enzyme substrates | |
| Diddens et al. | On the transport of tripeptide antibiotics in bacteria | |
| Isowa et al. | The enzymatic synthesis of protected valine-5 angiotensin II amide-1. | |
| PL89227B1 (cs) | ||
| US4428874A (en) | Tripeptide derivatives | |
| US4563305A (en) | Radiolabelled substrates for assaying mammalian enzymes | |
| US4247454A (en) | Novel chromogenic thrombin substrates | |
| US4568636A (en) | Tripeptide derivatives | |
| CA1068261A (en) | Chromogenic thrombin substrates | |
| US4169015A (en) | Novel chromogenic thrombin substrates | |
| US5776903A (en) | Peptide derivatives usable as zinc endopeptidase 24-15 inhibitors | |
| AU602527B2 (en) | Chromogenic compounds, a process for their preparation and their use | |
| US4629695A (en) | Peptide derivatives and use thereof as substrates for quantitatively assaying enzymes | |
| JPH0755942B2 (ja) | 酵素活性測定用ペプチド誘導体及びその使用法 | |
| JPH0244840B2 (cs) | ||
| EP0263214A1 (en) | Tetrapeptide methyl ketone inhibitors of viral proteases | |
| JPS5833223B2 (ja) | 新規ジペプチド誘導体及びその塩 | |
| JPS6041499A (ja) | ペプチドの酵素的合成法 |