Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia nowych chromogennych odczynników diagno- stycznych do oznaczania enzymów typu proteaz se- rynowych (EC 3.4.21). Odczynniki otrzymane sposo¬ bem wedlug wynalazku sa szczególnie przydatne do ilosciowego oznaczania powyzszych enzymów, które rozszczepiaja lancuch peptydu od strony argi- niny lub lizyny. Ponadto odczynniki te mozna sto¬ sowac do badania reakcji, w których powyzsze en¬ zymy powstaja, sa hamowane lub zuzywane, albo do oznaczania czynników wplywajacych na te re¬ akcje lub bioracych w nich udzial. Syntetyczne od¬ czynniki do oznaczania enzymów sa o wiele bar¬ dziej przydatne w porównaniu z naturalnymi, gdyz -spelniaja one calkowicie rózne warunki, takie jak duza czulosc i specyficznosc w stosunku do enzy¬ mu, dobra rozpuszczalnosc w wodzie lub badanych plynach biologicznych oraz latwa wykrywalnosc niektórych produktów rozszczepienia.Doskonale odczynniki do oznaczania np. plazmi- ny, trombiny, trypsyny i urokinazy zostaly opisane w szwedzkim opisie patentowym nr 380 258. Sa to w zasadzie chromogenne pochodne trójpeptydów.Do najlepszych odczynników tego typu naleza ta¬ kie, które zawieraja benzoilowa grupe N-koncowa oraz grupe chromoforowa sprzegnieta z koncem we¬ glowym, np. zwiazek o wzorze 1, czyli Benzoil- -Ai-Aa-Aa-p-nitroanilid, w którym Ai, A2, i A3 oznaczaja aminokwasy. Stosujac odpowiednie se¬ kwencje aminokwasów mozliwe jest otrzymywanie 2 odczynników o specyficznej czulosci wobec róznych enzymów. Podczas enzymatycznej hydrolizy od¬ czynniki tworza zwiazek z p-nitroanilina, zawiera¬ jacy chromofory, który to zwiazek mozna z latwos¬ cia oznaczac spektrofotometrycznie. Stosowanie tych odczynników jest jednak ograniczone w zwiazku z ich stosunkowo mala rozpuszczalnoscia, wynosza¬ ca nie wiecej niz 1 mg/ml. Niska rozpuszczalnosc powoduje koniecznosc pracy blisko granicy nasyce¬ nia dla uzyskania wystarczajacego stezenia odczyn¬ nika. Podczas oznaczania enzymów w róznych ply¬ nach biologicznych moze zachodzic wytracanie sa¬ mego odczynnika lub jego mieszaniny z proteina¬ mi. Powoduje to bledne odczyty spektrofotometrycz- ne i tym samym bledy w oznaczaniu enzymu.Benzoilowane odczynniki na enzymy uzyskuja znacznie lepsza rozpuszczalnosc po wymianie gru¬ py N-benzoilowej na atom wodoru. Wolna grupa aminowa aminokwasu Ax zwieksza rozpuszczalnosc odczynnika ale zmniejsza jednak szybkosc rozszcze¬ piania odczynnika przez enzym (tablica 2). Ponadto takie odczynniki moga byc w niepozadany sposób rozkladane w plynach biologicznych przez peptyda- zy aminowe, od strony koncowej grupy aminowej.Zgodnie ze sposobem wedlug wynalazku, stwier¬ dzono nieoczekiwanie, ze jezeli w odczynniku o wzo¬ rze 1, który jest wystarczajaco aktywny w stosun¬ ku do róznych enzymów, wymieni sie grupe ben¬ zoilowa na atom wodoru i jednoczesnie wymieni sie izomer L aminokwasu Ax (L-AO na izomer D 103 0983 103 098 4 (D-AJ, nowy odczynnik jest nie tylko zgodnie z oczekiwaniem bardzo dobrze rozpuszczalny, ale po¬ nadto jego aktywnosc wobec enzymu nie tylko, ze nie maleje wraz z wprowadzeniem aminokwasu w formie D, ale zupelnie nieoczekiwanie jest on kil¬ kakrotnie bardziej aktywny niz jego odpowiednik zawierajacy L-aminokwas, a czesto nawet znacz¬ nie lepszy niz wyjsciowy zwiazek N-benzoilowany o wzorze 1.Nowe odczynniki chromogenne otrzymywane spo¬ sobem wedlug wynalazku maja strukture okreslo¬ na wzorem H-D-A^Ag-Aa-NH-R, w którym Ax i A2 oznaczaja reszty aminokwasów glicyny, alaniny, waliny, leucyny, izoleucyny, kwasu pipekolinowego, proliny i kwasu 2-azetydynokarboksylowego, przy czym A2 moze takze oznaczac reszte fenyloalaniny.A3 oznacza reszte argininy lub lizyny a R oznacza grupe nitrofenylowa, naftylowa, nitronaftylowa, metoksynaftylowa, chinolinowa lub nitrochinolino- wa, ewentualnie w postaci soli.Podczas syntezy nowych chromogennych odczyn¬ ników do oznaczania enzymów stosuje sie zwykle uzywane grupy ochronne i zwykle sposoby sprze¬ gania, powszechnie znane w chemii peptydów.Do ochrony grupy a-aminowej korzystnie stosu¬ je sie grupe karbóbenzyloksylowa albo Ill-rz.-bu- tyloksykarbonylowa lub niektóre podobne grupy, takie jak p-metoksylowa, p-nitrowa, lub p-meto- ksyfenyloazokarbobenzyloksylowa.Pozadane jest ochronienie grupy S-guanidynowej w reszcie argininy za pomoca protonowania, grupy p-nitrowej lub p-toluenosulfonylowej.Do ochrony grupy a-aminowej w lizynie, korzy¬ stnie stosuje sie grupe karbóbenzyloksylowa, Ill-rz. -butyloksykarbonylowa lub p-toluenosulfonylowa Jako odszczepialna ochrone grupy a-karboksylowej stosuje sie grupe metylowa, etylowa lub benzylo¬ wa.Sprzeganie dwóch aminokwasów lub peptydu i aminokwasu zachodzi po zaktywowaniu grupy a-karboksylowej. Aktywna pochodna mozna izolo¬ wac lub uzywac in situ. Do aktywacji stosuje sie ester p-nitrobenzylowy, trójchlorofenylowy, piecio- chlorofenylowy, N-hydiroksysukcynimid, N-hydro- ksybenzotriazol, symetryczny lub asymetryczny bezwodnik albo azydek kwasowy.Powyzsze pochodne estrowe aktywuje sie dodat¬ kowa obecnoscia kaVbodwuimidu, np. N,N'-dwucy- kloheksylokarbodwuimidu, który takze moze slu¬ zyc jako srodek bezposrednio aktywujacy sprze¬ ganie grupy karboksylowej z amina.Synteza odczynnika polega na kolejnym dobudo¬ wywaniu aminokwasów, poczawszy od C-konco- wej grupy argininy, lub lizyny, która posiada wbu¬ dowana upirzednio grupe chromoforowa, sluzaca zarazem jako ochrona grupy karboksylowej. Grupa karboksylowa argininy lub lizyny moze byc rów¬ niez ochroniona odszczepialna grupa ochronna i wtedy grupe chromoforowa dobudowuje sie do ochronionego trójpeptydu.Mozna równiez najpierw syntetyzowac N-konco- wy fragment dwupeptydu i nastepnie sprzegac go z grupa arginylowa, zawierajaca lub nie zawiera¬ jaca grupy chromoforowej.Niezaleznie od wybranego sposobu syntezy, do oczyszczania produktów przejsciowych i konco¬ wych korzystnie jest stosowac filtracje molekular¬ na na zelu, gdyz umozliwia ona szybka i mala pra¬ cochlonna synteze.Sposób wedlug wynalazku ilustruja nastepujace przyklady.Skróty Jesli nie podano inaczej aminokwasy sa izomerami L.Arg — arginina Aze — kwas 2-azetydynokarboksylowy Ala — alanina Gli — glicyna Ile — izoleucyna Leu — leucyna Liz — lizyna Fe — fenyloalanina Pip — kwas pipekolinowy Pro — prolina Wal — walina Bz — benzoil Kbz — grupa karbobenzoksylowa FM — filtracja molekularna OpNP — grupa p-nitrofenoksylowa pNA — p-nitiroanilid BOC — grupa Ill-rz.-butyloksykarbonylowa TLC — chromatografia cienkowarstwowa Typy reakcji stosowane w syntezie.Do syntezy nowych odczynników do oznaczania enzymów, wymienionych w tablicy 2, rózne etapy reakcji przeprowadza sie w wiekszosci przypad¬ ków w podobny sposób. Dlatego ponizej podano ogólne opisy róznych typów reakcji, a nastepnie podano w tablicy 1 dane dotyczace produktów przejsciowych i koncowych, metody izolacji i o- czyszczania stosowane w iróznych typach reakcji oraz niektóre dane fizyczne.Typ reakcji I. Przylaczanie grupy chromoforowej (R). milimoli Na, NG — ochronionej argininy albo N«, Nw — ochronionej lizyny, albo ochronionego pe¬ ptydu, po rozdrobnieniu i starannym wysuszeniu, rozpuszcza sie w 50 ml swiezo destylowanego NjNjN^N^N^N^szesciometylotrójamidu kwasu fos¬ forowego, w temperaturze pokojowej, a nastepnie dodaje sie 20 milimoli trójetyloaminy i 30 mili¬ moli zawierajacej chromofor aminy, w postaci po¬ chodnej izocyjanianowej zachowujac przy tym wa¬ runki bezwodne i mieszajac calosc. Po uplywie jednego dnia mieszanine reakcyjna wlewa sie, podczas mieszania, do 500 ml 2P/o roztworu wodo¬ roweglanu sodowego. Wytracony osad odsacza sit, i przemywa dobrze roztworem wodoroweglanu, wo¬ da, 0,5 n kwasem solnym i powtórnie woda. Poza¬ dany produkt ekstrahuje sie z osadu, np. metano¬ lem. Niektóre produkty uboczne pozostaja nreroz- puszczone. Ekstrakt metanolowy odparowuje sie i krystalizuje pozostalosc z odpowiedniego rozpusz¬ czalnika lub oczyszcza za pomoca filtracji moleku¬ larnej.Typ reakcji II. Odszczepianie ochronnej grupy karbobenzoksylowej (Kbz). ml dobrze wysuszonej pochodnej karbobenzo¬ ksylowej zawiesza sie w 25 ml bezwodnego kwasu octowego i dodaje w temperaturze pokojowej iw 40 45 50 55 605 103 098 6 warunkach bezwodnych, 15 ml 5,6 n roztworu bro- mowodorowego w kwasie octowym. Po uplywie 45—60 minut mieszanine reakcyjna wkrapla sie podczas dobrego mieszania do 300 ml bezwodnego eteru. Faze eterowa oddziela sie a osad przemywa 2—3 razy 100 ml eteru/Otrzymany bromowodorek N a-odblokowanego zwiazku suszy sie pod zmniej¬ szonym cisnieniem, w temperaturze 40°C. w ciagu 3—16 godzin, nad stalym wodorotlenkiem sodowym.Typ reakcji III. Odszczepianie ochronnej grupy III-rz.-butylooksykarbonylowej (BOC). milimoli dobrze wysuszonej pochodnej III-rz.- -butylooksykarbonylowej rozpuszcza sie w 200 ml % roztworu kwasu trójfluorooctowego w chlorku metylenu, prowadzac operacje w temperaturze po¬ kojowej i w warunkach bezwodnych. Po uplywie minut roztwór wkrapla sie do 500 ml eteru. Wy¬ tracony osad odsacza sie i przemywa eterem. Otrzy¬ many trójfluorooctan Na-odblokowanego zwiazku suszy sie nad stalym wodorotlenkiem sodowym, pod zmniejszonym cisnieniem, w temperaturze 30°C. w ciagu 2—3 godzin.Typ reakcji IV. Reakcje sprzegania.Uwalnianie grupy a-aminowej.Do acylowania ochronnych otrzymanych w re¬ akcjach typu II lub III, niezbednym jest by grupa a-aminowa wystepowala w postaci wolnej zasady Uwalnianie grupy a-aminowej mozna przeprowa¬ dzic w rózny sposób, miedzy innymi dodajac jeden równowaznik bezwodnej aminy trzeciorzedowej, np trójetyloaminy lub N-etylomorfoliny, do roztworu brornowodorku lub trójfluorooctanu pochodnej w dwumetyloformamidzie, ochlodzonego do tempera¬ tury —10°C. W przypadku stosowania trójetylo¬ aminy wytracony bromowodorek trójetyloaminy usuwa sie przez odsaczenie. Bromowodorki lub trójfiuorooctany mozna takze rozpuszczac w 5% roztworze wodoroweglanu sodowego i uwolniona pochodna ekstrahowac, np. octanem etylu lub bu¬ tanolem, po czym faze organiczna suszy sie i od¬ parowuje. a) sprzeganie z Na-ochroniona aktywna pochodna estrowa.Do roztworu 10 milimoli peptydu lub pochodnej aminokwasu, uwolnionej w sposób opisany powy¬ zej, w 20—50 ml swiezo destylowanego dwumety- loformamidu, dodaje sie w temperaturze —10°C, 11 milimoli estru p-nitrofenylowego lub N-hydro- ksysukcynimidowego Na-ochronionej pochodnej aminokwasu. Reakcje prowadzi sie w ciagu 1 go¬ dziny w temperaturze —10°C, a nastepnie buforu¬ je sie mieszanine dodajac 5 milimoli aminy trze¬ ciorzedowej i pozostawia do osiagniecia tempera¬ tury pokojowej. Przebieg reakcji kontroluje sie za pomoca chromatografii cienkowarstwowej. W razie potrzeby dodaje sie jeszcze 5 milimoli zasady i po¬ wtórnie ochladza. Po zakonczeniu reakcji rozpusz¬ czalnik odparowuje sie na wyparce obrotowej i otrzymana oleista pozostalosc miesza sie z mala iloscia wody. Pozostalosc oczyszcza sie za pomoca filtracji molekularnej lub rekrystalizacji. W przy¬ padku gdy do oczyszczenia produktu sprzegania stosuje sie filtracje molekularna i jego objetosc elucji calkowicie lub czesciowo odpowiada objetosci sem, mozna uniknac zanieczyszczen produktu sprze¬ gania, jesli po zakonczeniu reakcji, ale przed od¬ parowaniem mieszaniny, niezuzyty ester aktywny usuwa sie za pomoca dzialania nadmiarem (3—5 milimoli) aminy pierwszorzedowej, w ciagu 30 mi¬ nut w temperaturze pokojowej. Dalszy przerób od¬ bywa sie w sposób opisany uprzednio, b) Sprzeganie Na-ochronionego aminokwasu z es- trem aktywnym wytwarzanym in situ.Do roztworu 10 milimoli opisanego uprzednio wolnego peptydu lub pochodnej aminokwasu w —50 ml swiezo destylowanego dwumetyloforma- midu, dodaje sie w temperaturze —10°C, 11 mili¬ moli Na-chronionego aminokwasu lub odpowied¬ nio ochronionego peptydu z wolna C-koncowa grur pa karboksylowa oraz 11 milimoli N-hydroksyben- zotriazolu lub N-hydroksysukcynimidu i 11 mili¬ moli dwucykloheksylokarbodwuimidu. Po uplywie 1—3 godzin temperature mieszaniny doprowadza sie do pokojowej. Przebieg reakcji kontroluje sie za pomoca chromatograffi cienkowarstwowej. Mie¬ szanine reakcyjna wlewa sie podczas mieszania do 100—300 ml 5% roztworu wodnego wodoroweglanu sodowego. Wytracony osad odsacza sie lub dekan- tuje, przemywa woda i oczyszcza za pomoca filtra¬ cji molekularnej lub rekrystalizacji.Typ reakcji V. Odszczepianie wszystkich grup ochronnych i oczyszczanie za pomoca chromatogra¬ fii jonowymiennej. 0,2—1,0 milimol ochronionego peptydu poddaje sie reakcji odsziczepienia grupy ochronnej w re¬ akcji z 5—20 ml bezwodnego fluorowodoru, w obecnosci 0,2—1,0 ml anizolu, w aparacie wedlug Sakakibara, prowadzac proces w ciagu 60 minut w temperaturze 0°C. Po zakonczeniu reakcji odde- stylowuje sie fluorowodór, po czym surowy pro¬ dukt rozpuszcza sie w 33°/o wodnym roztworze kwasu octowego i oczyszcza metoda filtracji mole¬ kularnej. Po ^liofilizowaniu z rozcienczonego kwa¬ su octowego, produkt poddaje sie chromatografii jodowymiennej na kolumnie zaladowanej slaboza- sadowym wymieniaczem Sephadex QAE-25, w for¬ mie chlorkowej, specznionym w mieszaninie meta¬ nolu i wody (95:5). Do elucji stosuje sie te sama mieszanine rozpuszczalników a produkt liofilizuje sie z wody.Filtracja molekularna na zelu jest, obok krysta¬ lizacji, prosta i wydajna metoda oczyszczania suro¬ wych produktów lub lugów macierzystych, zawie¬ rajacych ochroniony peptyd lub pochodna amino¬ kwasu. Produkt rozpuszcza sie w metanolu i poda¬ je na kolumne o odpowiednich wymiarach (obje¬ tosc 0,5—2,0 litra, dlugosc 100 cm), wypelnionej Sephadexem LH-20, specznionym w metanolu. Do elucji stosuje sie równiez metanol. Kolejne frakcjp oznacza sie spektro fotometrycznie, mierzac absor¬ pcje w nadfiolecie, przy dlugosci fali 254 nm, Czy¬ stosc frakcji zawierajacych wlasciwy produkt bada sie za pomoca chromatografii cienkowarstwowej.Frakcje zawierajace czysty produkt laczy sie i od¬ parowuje.W celu oczyszczenia pochodnych peptydów po od- szczepieniu grupy ochronnej w sposób opisany w punkcie V, za pomoca fluorowodoru w 30% roztwo¬ rze wodnym kwasu octowego, roztwór surowego 40 45 50 55 60 I7 103 098 8 produktu nanosi sie na kolumne o Odpowiednich wymiarach (objetosc 0,5—2,0 litrów, wysokosc 60 cm), wypelniona Sephadexem G—15, specznio- nym 30% wodnym roztworem kwasu octowego. Dc elucji stosuje sie takze kwas octowy. Frakcje za¬ wierajace czysty produkt liofilizuje sie, ewentual¬ nie po zageszczeniu w temperaturze 25°C, za po¬ moca wyparki obrotowej.Do chromatografii cienkowarstwowej stosuje sie plytki szklarnie pokryte zelem krzemionkowym F2B4 (Merck). Do rozwijania chromatogramów stosowane sa nastepujace mieszaniny rozpuszczalników: A — n-butanol:kwas octowy:woda 3:2:1, Pi — chloroform:metanol 9:1, P2 — chloroform :metanol 19:1.Chromatogramy badano w swietle nadfiolkowym przy 254 nm i wywolywano odczynnikiem chlorko- wo-p-toluidynowym. Podane wartosci RF pochodza z kolejnych chromatografii.Odczynniki wytwarzane sposobem wedlug po¬ wyzszych przykladów stosowano do oznaczania róznych enzymów. Wykorzystano tu fakt, ze od- szczepiony podczas hydrolizy enzymatycznej pro¬ dukt ma widmo w nadfiolecie zupelnie rózne od widma odczynnika. Przykladowo, odczynniki za¬ wierajace p-nitroanilid wykazuja maksimum ab¬ sorpcji w okolicach 310 nm a molarny wspólczyn¬ nik absorpcji wynosi wtedy okolo 12000. Przy 405 nm absorpcja odczynników prawie zupelnie zanika.Odszczepiona od odczynnika podczas enzymatycz¬ nej hydrolizy p-nitroanilina wykazuje maksimum absorpcji przy 380 nm z molarnym wspólczynni¬ kiem absorpcji wynoszacym 13 200, który przy 405 nm spada tylko do 9 620. Tak wiec przy pomo¬ cy oznaczen spektrofotometrycznych przy 450 nm mozna latwo oznaczac ilosc powstajacej p-nitro- aniliny, która to ilosc jest proporcjonalna do stop¬ nia hydrolizy enzymatycznej, wyznaczonego iloscia aktywnego enzymu. W tablicy 2 podano porówna¬ nie wzglednych szybkosci reakcji dla znanych od¬ czynników o wzorze 1, ich nie zawierajacych gru¬ py benzoilowej pochodnych oraz odczynników we¬ dlug wynalazku. Z tablicy wyraznie wynika wyz¬ szosc tych ostatnich.Odczynniki otrzymane sposobem wedlug wyna¬ lazku sa kilkanascie razy lepsze od odpowiedników posiadajacych N-koncowa reszte L-aminokwasu, oraz przynajmniej tak samo dobre jak znane do¬ tychczas jako najlepsze odczynniki o wzorze 1.Ponadto, wieksza 20—300 razy rozpuszczalnosc no¬ wych odczynników ma bardzo istotne znaczenie podczas oznaczania enzymów, zwlaszcza w plynach biologicznych, w przypadku których slaba rozpusz¬ czalnosc znanych uprzednio odczynników stwarza wiele powaznych problemów, zwiazanych z nie¬ moznoscia uzyskania odpowiedniego stezenia oraz mozliwoscia niepozadanego stracania sie osadów.Zel Sephadex G-15, stosowany podczas filtracji molekularnej, jest usieciowany zelem dekstrano¬ wym, Sephadex LH-20 to hydroksypropylowany usieciowany zel dekstranowy, a Sephadex QAE-25, to usieciowany zel dekstranowy posiadajacy fun¬ kcyjna grupe dwuetylo-(2-hydroksypropylo)-amino- etylowa. Zele powyzsze sa produkowane przez fir¬ me Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Szwecja. 40 45 50 Zawartosc Cl-znale¬ ziono/teore¬ tyczna 8 Sposób izolacji Wydaj¬ nosc Typ reakcji Zwiazki wyjsciowe - Produkt Oi 00 t- co LO Tt* co cm 1—1 ^ cm co oo o" o co* co^ t- im^ eo co ^ co^ cT cT o~ cT o" cT Pn fu p7 p7 p7 p7 p7 +20,5(D) —8,5(M) —33,0(D) +26,2(D) —26,2(D) —24,0(D) +3,7(D) —33,4(M) FM krystalizacja z etanolu FM FM FM FM FM co r- co iq co co m co co o t- oo cm oo I I II,IVa II,IVa II,IVa II,IVa II,IVa .* << A FU PU tU •? z £ Og ag Pua < £& i S i 8 z. o z. o £ g| S| §^ §^S <£ n r! M incrt'^OrtNN NNN Jo^^O^^WW WWW W a PQ a i-h w rn" io i-T iH ^ M ^ IO (O t- < £ ó z n ^ a bB £z F a a 2 ó ° % § 6 £ » £ W i n i i ^ i i i N ^ NNaNNN ,q o s* ^ ' ,q ,q Xi W PQ W W- WWW103 098 9 10 co CN i-H i-H CM CN i-H r^ i-i os i-H i-H ¦Ct* CN i-H CN i-l r^ i-H lO CN i-H O co Oi CN i-l W CN \ 00 co^ o" Pu cu o PU* Ph" CO CO ^ S SS °£££££SS os o o CN^ lO ^ o" o o" cu,<<<<< co m io^ co^ o" cT cCpT CN CO 00 D- CO^ CO CO^ 00^ cT cT cT cT p7 cC cu p7 Pu Pu 2 P PS 8<<<<< + C~ i—( i—I i-i tjhcn i-irHcomcoco + li + i i i i T CO CN I + P P ocT cT cn~ tjT + + co + < csf T o CC § 5 A! N + ¦3 Z* Ii pH pH pC| pEHJ ,3 Ph o CC CU ¦ B a 2 2 .* a 2 2 ,3 b Ph « 5 Ph pe, Ph N ^ ^ N 22 Ph Ph 2 2 2 2 pH pq pin pL| CC O CD CC cc cc -h» -4J ¦+-• W ZJ t/i i O fri § CC CU B .S N M N t- c- co .O 5 ? i—11—i cC cC cC cC CC cC cC cC cC cC cC cc ni iD te cd ? s Xi hH I-H •—• I—I I—'K.KK^K^K^^hH I-H t—I I—I I—I I—I h—I h—I I—i I—I hH hH I—I hH hH hH I-H I-H •—« I—I hHK*KP"KKl-l hH I-H I—I I—I HH hH hH I-H I—I I—I I—I I—l I—I hH I-H O O Ph PU a O i 'cc N Xi hH Ph SA a O 3 0 hH 1 ,BOC CN W o i CU h-1 1 p 1 n oa'o i—i a O ^ ^ o Y-cc-cc^c^^^g CC O £ a p 9 i B N ,a co W «1 ° 2 § a a s B B S 113 fc -D-Ala-Op Gli-OpNP N 1 -° H Pu -D-Leu-Op Ile-OpNP Wal-OpNP N 1 1 Xi N N k -a ,d * w 14 gg -D-Leu-Op -D-Leu-Op N N Xi Xi ci ni CU Aze-OpNP -D-Wal-Op 1 N N Xi es Fe-OpNP -D-Pro-OH -D-Pip-OpNP D-Leu-OpNP INNI N Xi Xi N £ * ^ M ^ 0? of M -Fe-OpNP O U Ph ^ 0- o o « ^ M t4h CO CO Oi l—I i-H i-H 1-H1-H cvi i-H i-H CNCN i-HCN i-HCNCN Xi 9 « 9 o S 1—1 s Pu Xi CNCO^lfSlOt-COOi CO O 3 o hH O 3 cu hH a X JL N "n" 3 N CU P < A O ' ,a 3 ^ ' ¦ aO O 1 O O Ph Ph < s m !^ a a ^ W tuO W) tuo a ?H ^ UO ^ < < % < O CN a a i-l o a cc CU CU ^ ^ hU ^ M ^ k5 CC CC ' CC ' CC i 9 9 hH K hH P P P I I I Ph Ul K CC CC P A 1 X5 < jz; a O cc a 1 o" a 1 IN O ^ ^" o tuó S < P 1 N Xi 1 1 N N Xi Xi 1 ^ A O o 5 I5-a O W) »"J HH I a 1 O ^ ci < CU hH p^ w w O a < O & iz; . . d a • 1 d < < CU Ph Xi Xi < a 'n' W W 99 < a 1 "n* Xi o PU 1 P 1 N Xi O X CN < a i) Jh < l CC < p I hH11 103 098 12 1-l 00 1—1 o co 05 CO CN i—1 CN i-H CO 05 CN i—1 CN CN co l—1 Oi o co l—1 o i-H o CN i—1 CD rH i—1 CN i—l i—1 CM ^ tO (D N O O O O O O -^ t- O -^ ^ ir^ o" o" o <<<<<<<< . .. W ® °« CO lO i-H i-» CO -^ CO i i i i i T i co^ cT co" co O) IQ O M t- t» 00 f O IO CM CO c- co d- co lfl s a m co m co^ co^ t^ cn^ <=T cT o" o" CN^^COCOOi-HCN"^ CNCNCNCNCOCOCOCO a a ^ 00^ CO^ o" o" o" CO C- 00 OiOi-HCMCO CO COCO CO ^ ^ ^ ^ ^ Ir ^ CU o a I I o o CN CN OJO OJO < < o o CN CN < < W) OJO cd N ' i I ^ o CN o a ^ o M .H (D ^ PLh Ph 1-1 £h PPPPPPPP I I I i I I l l a CD O N O U O o fi CO OJ o CD a T3 3 a CN T ablica Szybkosc reakc Kai Uh Try H Rozpuszczal¬ nosc w buforze* Odczynnik lO lO lO O IO O i-H i-H Oi CO ^ O i-H O O O O O O 1 o ta o o oj o i-H i-H i-H i-H OlOOlOOlOOlOO OCNOlOrHt-COCOO i-H i—1 . ,-j ,_| o «o o la io o CO W O co co o "^ Tt< o 00 O i-H co ca io cn ©~ o © o" o o" ©o ^i-h o "tf O O © CN H CO i-H 1 Bz-Wal-Pro-Arg-pNA H-Wal-Pro-Arg-pNA (H-D-Wal-Pro-Arg-pNA(13) Bz-Wal-Pip-Arg-pNA H-Wal-Pip-Arg-pNA H-D-Wal-Pip-Arg-pNA(14) Bz-Wal-Leu-Arg-pNA H-Wal-Leu-Arg-pNA H-D-Wal-Leu-Arg-pNA(16) Bz-Wal-Leu-Liz-pNA H-Wal-Leu-Liz-pNA H-D-Wal-Leu- Liz-pNA(18) Bz-Ile-Leu-Arg-pNA H-Ile-Leu-Arg-pNA | H-D-Ile-Leu-Arg-pNA(15) 1 Bz-Ile-Leu-Liz-pNA H-Ile-Leu-Liz-pNA H-D-Ile-Leu-Liz-pNA E u W powyzszej tablicy podano wzgledne szybkosci re¬ akcji dla róznych wybranych odczynników, w sto¬ sunku do kazdego enzymu. Symbole wybranych od¬ czynników i ich czulosc w stosunku do poszczegól¬ nych enzymów podano ponizej w tablicy 3.Tablica 3 Enzym (symbol) Trombina (T) Trypsyna (Try) Plazmina (PI) Kalikreina (Kai) Urokinaza (UK) Odczynnik nr 14 13 18 16 14 Czulosc (podana ilosc enzymu na aktywnosc 0,1 nkat) OD/min =0,0254 0,06 INH 0,03 ug(firmy Novo) 0,01 CU 0,2 BE 40 PE13 103 098 14 PL