NO142812B - Nye diagnostisk aktive kromogene enzymsubstrater - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår nye kromogene substrater for enzymer av typen serin-proteaser (EC 3-4.21). Substratene i henhold til oppfinnelsen er særlig egnet for kvantitativ bestemmelse av de ovenfor klassifiserte enzymer, som spaltes i peptidkjeden på carboxylsiden av arginin eller lysin. Videre kan substratene anvendes for å studere reaksjoner i hvilke de nevnte enzymer dannes, inhiberes eller forbrukes, eller for å bestemme faktorer som påvirker eller tar del i en slik reaksjon. Syntetiske substrater for enzymbestemmelse har store fordeler sammenlignet med de naturlige, forutsatt at de oppfyller visse betingelser, som høy sensitivitet for og spesifisitet for enzymet, god oppløse-lighet i vann eller i den biologiske forsøksvæske og en lett på-visbarhet av noen av spaltningsproduktene.

Utmerkede substrater for bestemmelsen av f.eks. plasmin, trombin, trypsin, kallikrein og urokinase er bl.a. beskrevet i svensk patent nr. 380.258 og er prinsipielt kromogene tripeptid-derivater. Blant de beste substrater av denne type er de som har. en benzoylert N-avsluttet ende og en kromofor gruppe koblet til C-avslutningsenden, f.eks.:

benzoyl-A^-Ag-A^-p-nitroanilid I

hvor , A 2 og A^ er aminosyrer.

Med spesifikke aminosyrerekkefølger er det mulig blant de nevnte substrater å finne slike som har en spesiell sensitivitet for et bestemt eller bestemte enzymer. Ved enzymatisk hydrolyse danner substratene det kromofore produkt p-nitroanilin som lett kan bestemmes spektrofotometrisk. Disse substrater har imidlertid en begrensning på grunn av deres relativt lave oppløselighet (lik eller under 1 mg/ml). En lav oppløselighet nødvendiggjør arbeide meget nær metningsgrensen for substratene for å oppnå en tilfredsstillende substratkonsentrasjon. I enzymbestemmelser i forskjellige biologiske systemer kan det således hende at enten selve substratet felles eller en kombinasjon av protein/substrat. Slike feininger bevirker feilaktige spektrofotometriske avles-ninger og således feilaktige enzymbestemmelser„

De benzoylerte enzymsubstrater av type I blir betraktelig mere oppløselige hvis N-avslutnings-benzoylgruppen erstattes med hydrogen. Den nu frie protoniserte aminogruppe av aminosyren A øker oppløseligheten, men bevirker imidlertid også at hastig-heten med hvilken enzymet spalter substratene, avtar (jfr. tabell II). Videre kan substratene nu i en biologisk forsøks-oppløsning på en uønsket måte spaltes fra N-avslutningsenden av aminopept idaser.

I henhold til foreliggende oppfinnelse har det ganske uventet vist seg at hvis et substrat i henhold til formel I, som er tilfredsstillende fra aktivitetssynspunktet for et visst enzym, bytter ut benzoylgruppen med hydrogen og samtidig er-statter den hittil anvendte L-form av aminosyren A-^ (L-A^) med dens D-form (D-A^), vil det således erholdte substrat være meget lett oppløselig som ventet, men aktiviteten av substratet i forhold til enzymet avtar ikke ved innføring av en D-aminosyre, men er helt forbausende flere ganger bedre enn den for det tilsvarende substrat med bare L-aminosyrer og ofte endog betraktelig bedre enn det for det benzoylerte gode utgangssubstrat i henhold til formel I. N-avsluttet fri D-aminosyre i det nye substrat forhindrer også et uønsket angrep på aminopeptidaser da disse er spesifikke for L-aminosyrer.

De nye kromogene.substrater i henhold til oppfinnelsen karakteriseres ved følgende generelle formel:

H - (D-A^ - A2 - A3 - NH - R

eller salter derav, hvor A-^ og A2 er valgt blant aminosyrene Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pip, Pro og Aze, A2 kan videre være Phe, A^ er valgt blant Arg, Lys og Orn, R er valgt blant nitrofenyl, nafthyl, nitronafthyl, methoxynafthy1, kinolyl og nitrokinolyl (med hensyn til forkortelsene se side 4).

For syntesen av de nye kromogene enzymsubstrater anvendes konvensjonelle beskyttelsesgrupper og koblingsmetoder, som alle er velkjent i peptidkjemien.

Som den a-aminobeskyttende gruppe er det fordelaktig å anvende carbobenzoxy eller t-butyloxycarbonyl eller en dertil be-slektet gruppe som f.eks. p-methoxy-, p-nitro- eller p-methoxy-fenylazo-carbobenzoxy.

Det er fordelaktig å anvende protonisering, gruppene N02 eller p-toluensulfonyl for beskyttelse av £-guanidogruppen av arginylgruppen.

For å beskytte £-aminogruppen i ornitin og for £-aminogruppen i lysin er det fordelaktig fremfor alt å anvende gruppene carbobenzoxy, t-butyloxycarbonyl eller p-toluensulfonyl.

Som avspaltbar a-carboxy-beskyttende gruppe er det passende å anvende methyl-, ethyl- eller benzylester.

Koblingen mellom to aminosyrer eller et dipeptid og en aminosyre oppnåes ved å aktivere a-carboxygruppen. Det aktiverte derivat kan enten isoleres eller dannes in situ og kan være f.eks. p-nitrofenyl-, triklorfenyl-, pentaklorfenyl-, N-hydroxysuccinimid- eller N-hydroxy-benzotriazol-ester, symmetrisk eller asymmetrisk anhydrid eller syreazid.

Aktiveringen av det ovennevnte esterderivat oppnåes med fordel med nærværet av et carbodiimid, f.eks. N,N'-dicyclo-hexylcarbodiimid, som også kan tjene som aktiverende koblings-reagens direkte mellom carboxy- og aminkomponentene.

Prinsippet for substratsyntesen kan være trinnvis tilset-ning av aminosyrene til den C-endeavsluttende arginylgruppe, som enten fra begynnelsen er forsynt med en koblet kromofor gruppe som virker som en carboxy-beskyttende gruppe eller er forsynt med en avspaltbar carboxy-beskyttende gruppe, og den kromofore gruppe kobles så til det beskyttede tripeptidderivat, eller alternativt er det i prinsippet mulig å velge å syntetisere det N-endeavsluttende dipeptidfragment for seg som derpå kobles til arginylgruppen med eller uten en kromofor gruppe i prinsippet som omtalt ovenfor.

Uavhengig av det valgte prinsipp er en rensning av mellom-og sluttproduktene ved gelfiltreringskromatografi egnet da denne metode muliggjør et hurtig syntetisk arbeide og gir maksimale utbytter.

Oppfinnelsen er beskrevet mere detaljert i de følgende ikke-

begrensende spesifikke eksempler.

Forkortelser

Aminosyrer (hvor ikke annet er anført, menes L-formen):

Arg = arginin

Aze = 2-azetidin-carboxylsyre

Ala = alanin

Gly = glycin

Ile = isoleucin

Leu = leucin

Lys = lysin

Phe = fenylalanin

Pip = pipecolinsyre

Pro = prolin Val = valin

AcOH .= eddiksyre

Bz = benzoyl

Cbo- = carbobenzoxy-

DCCI = dicyclohexyl-carbodiimid

DMF = dimethylformamid

Et^N = triethylamin

EtOAc = ethylacetat

GPC = gelfiltreringskromatografi

HBT = N-hydroxy-benzotriazol

HMPTA = N,N,N",N<*>,N",N"-hexamethyl-fosforsyre-triamid HONSu = N-hydroxysuccinimid

MeOH = methanol

-OpNP = p-nitrofenoxy

-pNA = p-nitroanilid

tBoc = t-butyloxycarbonyl

TFA = trifluoreddiksyre

TLC = tynnskiktskromatografi

Reaksjonstyper anvendt ved syntesen

For syntesen av de nye enzymsubstrater oppregnet i tabell II, utføres de forskjellige reaksjonstrinn stort sett på lignende måte. Av denne grunn gies en generell beskrivelse av de forskjellige reaksjonstyper, og derpå, i tabell i, en angivelse av mellom- og sluttproduktene, opparbeidelsesmetodene anvendt for forskjellige reaksjonstyper og visse fysikalske data.

Reaksjonstype 1

Kobling av den kromofore gruppe ( R )

20 mmol N<a>,N<G->beskyttet arginin eller N<a>,N<w->beskyttet ornitin eller lysin eller et på tilsvarende måte passende beskyttet peptidderivat, malt og vel tørret, oppløses i 50 ml tørt,

friskt destillert HMPTA ved værelsetemperatur, hvorpå 20 mmol Et^N og 30 mmol av det kromofore amin i form av dets isocyanat-derivat tilsettes under fuktighetsfrie betingelser og under om-røring, Efter 1 døgns reaksjonstid helles reaksjonsoppløsningen i 0,5 1 2%-ig natriumbicarbonatoppløsning under omrøring. Det dannede bunnfall fjernes ved filtrering og vaskes godt med bicarbonatoppløsning, vann, 0,5 N saltsyre og igjen vann. Fra bunnfallet ekstraheres det ønskede produkt med f.eks. methanol, idet visse biprodukter ikke oppløses. Methanolekstraktet, kan, efter inndampning, bringes til å krystallisere fra et passende medium eller renses ved GPC.

Reaksjonstype 2

Avspaltning av en carbobenzoxy- beskyttende gruppe ( Cbo-)

10 mmol av et godt tørret Cbo-derivat oppslemmes i 25 ml tørr AcOH og 15 ml 5,6 N HBr i AcOH tilsettes under fuktighetsfrie betingelser ved værelsetemperatur. Efter en reaksjonstid på 45 - 6o minutter mates oppløsningen dråpevis til 300 ml tørr ether under kraftig omrøring. Etherfasen avsuges fra det erholdte bunnfall som vaskes med 2-3 porsjoner på 100 ml ether. Det således erholdte hydrobromid av Na<->avblokkert forbindelse tørres over natriumhydroxyd-pellets i vakuum ved 4o°C i 3 - l6 timer.

Reaksjonstype 3

Avspaltning av en t- butyloxycarbonyl- beskyttende gruppe ( tBoc-) 10 mmol av det godt tørrede tBoc-derivat oppløses i 200 ml 25%-ig TFA i CH2C12 under fuktighetsfrie betingelser ved værelsetemperatur. Efter en reaksjonstid på 20 minutter mates oppløs-ningen dråpevis i 500 ml tørr ether. Det erholdte bunnfall fjernes ved filtrering og vaskes grundig med ether. Det således erholdte trifluoracetat av Na<->avblokkert forbindelse tørres over natriumhydroxyd-pellets under vakuum ved 30°C i 2 - 3 timer.

Reaksjonstype 4

Koblingsreaksjoner

Frigjøring av a- aminogruppen

For acylering av derivatene erholdt i reaksjonstypene 2 eller 3, må a-aminogruppen være tilstede som en fri base. Fri-gjøringen kan utføres på mange forskjellige måter. Det er bl.a. mulig å tilsette en ekvivalent av et tørt, tertiært amin (f.eks. Et 3 N eller N-ethylmorfolin) toil en DMF-oppløsning av HBr-eller TFA-derivatet avkjølt til -10 C. I tilfeller som omfatter Et^i-og HBr-derivatene, fjernes det utfelte Et^N-HBr ved filtrering. Alternativt kan HBr- eller TFA-derivatet oppløses i 5%-ig natrium-bicarbonatoppløsning fra hvilket det frigjorte derivat ekstraheres med f.eks. EtOAc eller butanol, hvorpå den organiske fase tørres og inndampes.

a) med N°"-beskyttet aktivt esterderivat .

Til en oppløsning av 10 mmol peptid eller aminosyrederivat

frigjort som angitt ovenfor, i 20 - 50 ml friskt destillert DMF tilsettes 11 mmol Na<->beskyttet p-nitrofenyl- eller N-hydroxy-succinimidesterderivat av aminosyren som skal kobles på ved

-10°C. Efter en reaksjonstid på 1 time ved -10°C pufres oppløs-ningen med 5 mmol tertiært amin og tillates så langsomt å anta værelsetemperatur. Reaksjonsforløpet følges passende ved TLC-analyse. Om nødvendig, tilsettes ytterligere 5 mmol base efter en ny avkjøling. Når reaksjonen er ferdig, inndampes oppløs-ningen på en roterende inndamper til et oljeaktig residuum som omrøres med et par porsjoner vann. Residuet renses ved GPC eller omkrystallisasjon. Når GPC anvendes for rensning av det koblede produkt og dette har et elueringsvolum som helt eller delvis faller sammen med det for det aktive esterderivat av den koblede aminosyre, kan forurensning av det koblede produkt unngåes hvis, efter avsluttet reaksjon, men før inndampning, uforbrukt aktivt esterderivat erstattes med et overskudd (3-5 mmol) av et primært amin, f.eks. n-butylamin, i løpet av 30 minutter ved værelsetemperatur. Derpå utføres opparbeidelsen som beskrevet ovenf or. b) med Na<->beskyttet aminosyre eller peptid og dannelse av aktiv ester in situ.

Til en oppløsning av 10 mmol av ovennevnte frigjorte peptid eller aminosyrederivat i 20 - 50 ml friskt, destillert DMF tilsettes 11 mmol Na<->beskyttet aminosyre eller på tilsvarende måte beskyttet peptidderivat med en C-avsluttende fri carboxy-gruppe, 11 mmol HBT eller HONSu og il mmol DCCI ved -10°C. Efter 1-3 timer ved -10°C tillates reaksjonsoppløsningen å anta værelsetemperatur. Reaksjonsforløpet følges passende ved TLC-analyse, Efter avsluttet reaksjon helles oppløsningen under om-røring i 100 - 300 ml 5%-ig vandig natriumbicarbonatoppløsning.

Det erholdte bunnfall vaskes med vann efter filtrering eller dekantering. Residuet renses ved GPC eller omkryst a11isa-sjon.

Reaksjonstype 5

Avspaltning av alle beskyttende grupper og rensning og ionebytte

0,2 - 1,0 mmol av det beskyttede peptidderivat med den ønskede kromofore gruppe avbeskyttes ved omsetning med 5-20 ml tørt HF i nærvær av 0,2 - 1,0 ml anisol i et apparat i henhold til Sakakibara, beregnet på dette formål, i løpet av 6o minutter ved 0°C. Efter avsluttet reaksjon og efter at alt HF er avdes-tillert, oppløses råproduktet i 33%-ig vandig AcOH og renses ved GPC. Produktet isoleres ved frysetørring fra fortynnet AcOH og underkastes ionebytte på en kolonne bestående av en svakt basisk ionebytteharpiks Sephadex QAE-25 i kloridformen, svellet i MeOH:vann, 95:5, med det samme medium som oppløsnings- og eluer-ingsmedium. Det rene produkt frysetørres fra vann.

Gelf iltreringskrornatografi

Ved GPC av beskyttet peptid- eller aminosyrederivater, råprodukter eller inndampede morluter efter krystallisasjon fåes en enkel opparbeidelsesmetode og optimale utbytter. Materialet oppløses så i MeOH og overføres til en kolonne av passende størr-else (volum 0,5 - 7,5 1, lengde lOO cm), pakket med Sephadex<® >LH-20, svellet i MeOH og elueres med det samme oppløsningsmiddel, Eluatet fraksjoneres i passende delvolum, og dets UV-absorpsjon (254 nm) bestemmes kontinuerlig. Produktholdige delfraksjoner kontrolleres på renhet ved TLC, og de rene fraksjoner kombineres og inndampes.

Ror rensning av peptidderivater efter avbeskyttelse med HF i henhold til 5 ovenfor, overføres den 30% AcOH (vandige) oppløs-ning av råproduktet til en kolonne av passende størrelse (volum 0,5 - 2,0 1, lengde 60 cm) pakket med Sephadex G-15, svellet i 30%-ig vandig AcOH og elueres med det samme oppløs-ningsmiddel. Efter å ha gått frem som ovenfor, frysetørres de produktholdige rene delfraksjoner, eventuelt efter en delvis inndampning på en roterende inndamper ved 25°C.

Tynnskikt skromatograf i

For TLC-analyse fremstilte glassplater med "Kiselgel ^254"

(Merck) anvendes som absorpsjonsmidler. Oppløsningsmiddel-systemene anvendt (volumforhold), er:

Efter avsluttet kromatografi undersøkes platen i UV-lys

(254 nm) og utvikles med Cl/o-toluidin-reagens i henhold til van-lig praksis. De angitte R^-verdier er resultatene fra separate kromatografier.

Bestemmelse av serin- proteaser ved kromogene substrater

Substratene fremstilt i henhold til eksemplene ovenfor, anvendes for bestemmelse av forskjellige enzymer i henhold til fremgangsmåten antydet ovenfor.

Prinsippet for bestemmelsen bygger på det forhold at spalt-ningsproduktet anvendt ved enzymatisk hydrolyse, har et UV-spektrura som er vesentlig forskjellig fra det for substratet. Således har f.eks. alle p-nitroanilid-substrater i henhold til oppfinnelsen absorpsjonsmaksima rundt 310 nm med den molare eks-tinksjonskoeffisient på ca. 12.000. Ved 405 nm er absorpsjonen av substratene nesten fullstendig avsluttet. p-nitroanilin som er avspaltet fra substratet under den enzymatiske hydrolyse, har et absorpsjonsmaksimum ved 3S0 nm og en molar ekstinksjoaskoeffi-sient på 13.200, som ved 4o5 nm bare har øket til 9.620. Ved spektrofotometrisk bestemmelse ved 405 nm er det således lett å følge mengden av dannet p-nitroanilin som er proporsjonal med graden av enzymatisk hydrolyse som i sin tur bestemmes av den aktive mengde enzym. Tabell II viser en sammenligning av relative reaksjonshastigheter mellom tidligere kjente substrater i henhold til formel I, deres ikke-benzoylerte former og substratene i henhold til oppfinnelsen. Denne tabell viser klart overlegen-heten av substratene i henhold til oppfinnelsen.

Substratene i henhold til oppfinnelsen er følgelig flere ganger bedre enn tilsvarende substrater med N-avsluttet L-aminosyre og videre minst like god som de tidligere kjente beste substrater som er de benzoylerte substrater i henhold til formel 1. Videre er den større oppløselighet av de nye substrater (ca. 20 - 300 ganger større) meget fordelaktig for enzymbestemmelser fremfor alt i biologiske systemer, ved hvilke den dårlige oppløselighet av tidligere kjente substrater bevirket vanskelige problemer, delvis på grunn av at substratmetning ikke kunne oppnåes og delvis på grunn av risikoen for uønskede fel-ninger.

Gel Sephadex G-15 anvendt for gelfiltreringen, er en

(R)

tverrbunden dextrangel. Gel Sephadex LH-20 er en hydroxy-propylert tverrbunden dextrangel. Den anvendte ionebytter

Sephadex QAE-25 er en tverrbunden dextrangel med diethyl-(2-hydroxy-propyl)-amino-ethyl som funksjonell gruppe. Disse geler er fra Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sverige.

I tabellen ovenfor er de relative reaksjonshastigheter for de forskjellige substrater angitt i forhold til et referansesubstrat valgt for hvert enzym. Symboler, referansesubstrat er og deres sensitivitet for de respektive enzymer, er i henhold til det følgende:

Claims (1)

1. Nye diagnostisk aktive kromogene substrater med god opp-løselighet og høy spesifisitet overfor serin-proteaser, karakterisert ved at de har følgende generelle formel:

   eller salter derav, hvor og A^ er en av aminosyrene Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pip, Pro og Aze, og A2 kan dessuten være Phe, A^ er en av aminosyrene Arg, Lys og Orn, og R er nitrofenyl.