DE19816915A1

DE19816915A1 - Neue Peptide, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese Peptide enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen

Info

Publication number: DE19816915A1
Application number: DE1998116915
Authority: DE
Inventors: Franz Esser; Gerd Schnorrenberg; Horst Dollinger; Wolfram Gaida
Original assignee: Boehringer Ingelheim Pharma GmbH and Co KG
Current assignee: Boehringer Ingelheim Pharma GmbH and Co KG
Priority date: 1998-04-16
Filing date: 1998-04-16
Publication date: 1999-10-21

Abstract

Die Erfindung betrifft Peptide der allgemeinen Formel I DOLLAR F1 und deren pharmazeutisch annehmbare Salze, worin die Reste R·1·, A, B und D die in der Beschreibung angegebenen Bedeutungen besitzen sowie deren Herstellung und Verwendung. Die neuen Verbindungen haben NPY-agonistische und/oder NPY-antagonistische Eigenschaften. Die Erfindung betrifft ferner die neuen Ausgangsverbindungen R·1·NH¶2¶ (II) und DOLLAR A R·1·N(H)-C(O)-A-C(O)OH (III).

Description

Die Erfindung betrifft neue Peptidderivate der allgemeinen Formel I

und deren pharmazeutisch annehmbare Salze. Die Verbindungen haben NPY-agonistische und/oder NPY-antagonistische Eigenschaften.

Die in dieser Beschreibung und den Ansprüchen für die Aminosäuren verwendeten Abkürzungen entsprechen dem üblichen Dreibuchstabencode wie er z. B. in Europ. J. Biochem., 138, 9 (1984) beschrieben ist. Die übrigen Abkürzungen werden nachfolgend erklärt:

Bum = t-Butyloxymethyl
Bzl = Benzyl
Cha = L-Cyclohexylalanin
DCCI = Dicyclohexylcarbodiimid
DC = Dünnschichtchromatogramm
DCH = Dicyclohexylharnstoff
DIC = Diisopropylcarbodimid
DMF = Dimethylformamid
Fmoc = 9-Fluorenylmethoxycarbonyl
HOBt = Hydroxybenztriazol
Hpa = L-Homophenylalanin
HPLC = High Performance Liquid Chromatography
Me = Methyl
Mtr = 4-Methoxy-2,3,6-trimethylphenylsulfonyl
Orn = L-Ornithin
Phg = L-Phenylglycin
RT = Raumtemperatur
tBu = t-Butyl
TFA = Trifluoressigsäure
THF = Tetrahydrofuran
Thi = L-2-(2-Thienyl)alanin
Z = Benzyloxycarbonyl.

Der Ausdruck Aminosäure umfaßt (falls im folgenden Text nicht ausdrücklich etwas anderes angegeben ist) natürliche und unnatürliche Aminosäuren, sowohl der D- als auch der L-Form. Ferner umfaßt der Ausdruck "α-Aminosäure" auch α,α-disubstituierte Aminosäuren.

Wenn eine Aminosäure ohne Präfix angegeben ist (z. B. Orn) steht diese Angabe für die L-Form der Aminosäure. Die D-Form wird ausdrücklich angegeben.

Unter Halogen werden in den Definitionen Fluor, Chlor, Brom und Jod verstanden.

Die Erfindung betrifft neue Peptidderivate der allgemeinen Formel I

oder deren pharmazeutisch annehmbare Salze, worin R¹ die Gruppe

ist, worin
n eine ganze Zahl von 0 bis 6, vorzugsweise 1 bis 4 ist;
Ar Phenyl, durch Halogen oder Trifluormethyl mono- oder disubstituiertes Phenyl, oder Naphthyl ist;
A

(a) ein aus 3 bis 6 Ringatomen bestehender gesättigter oder ungesättigter, verbrückter oder unverbrückter Ring ist, worin alle Ringatome Kohlenstoff sind oder ein Ringatom O, S oder N ist und die anderen Ringatome Kohlenstoff, wobei jeweils 2 benachbarte C-Atome des Ringes an die mit der Gruppe A verbundenen Carbonylgruppen gebunden sind;
(b) die Gruppe
oder
ist;
(c) die Gruppe -CH₂-W-CH₂- ist, worin W für eine Bindung, O, S, NR⁶ (worin R⁶ (C₁-C₆)Alkyl oder Phenyl- (C₁-C₃)-alkyl ist), die Gruppe
(worin R⁴ und R⁵ unabhängig voneinander Wasserstoff, (C₁-C₆)-Alkyl oder Phenyl sind),
oder W für die Gruppe
(worin m 2, 3, 4, 5 oder 6 bedeutet) steht;

B Arg, Lys, Ser, His, Pro, Ala, Val, Phe, Asn, Asp, Gly oder Orn in der L- oder D-Konfiguration gegebenenfalls mit geschützten Seitenketten ist;
D Tyr, Phe, Cha, His, Cys, Thr, Ser, Asp, Glu, Tyr(3,5-di-Br), Phe(p-F), Phe(p-Cl), Phe(p-NO₂

), Phenylglycin, 2-Thienylalanin, Cyclohexylalanin, Homophenylaianin oder N-Methyl-phenylalanin, in der L oder D-Konfiguration, gegebenenfalls mit geschützten Seitenketten ist.

Die Verbindungen können Aminosäuren (siehe Definition der Gruppen B und D) enthalten, deren Seitenketten geschützt sind. Als Schutzgruppen sind dafür die in der Synthese üblichen Gruppen geeignet. Bevorzugt sind solche Schutzgruppen, die homoaromatische Gruppen wie beispielsweise Benzyl enthalten.

Verbindungen der allgemeinen Formel I besitzen Säuregruppen, hauptsächlich Carboxylgruppen, oder phenolische Hydroxygruppen, und/oder basische Gruppen wie z. B. Guanidino- oder Aminofunktionen. Verbindungen der allgemeinen Formel I können deshalb entweder als innere Salze, als Salze mit pharmazeutisch verwendbaren anorganischen Säuren wie Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Sulfonsäure oder organischen Säuren (wie beispielsweise Maleinsäure, Fumarsäure, Zitronensäure, Weinsäure oder Essigsäure) oder als Salze mit pharmazeutisch verwendbaren Basen wie Alkali- oder Erdalkalimetallhydroxiden oder Carbonaten, Zink- oder Ammoniumhydroxiden oder organischen Aminen wie z. B. Diethylamin, Triethylamin, Triethanolamin u. a. vorliegen.

Die Chiralitätszentren in den neuen Peptiden können jeweils R-, S- oder R,S-Konfiguration besitzen.

Bevorzugt sind Peptidderivate der allgemeinen Formel I, worin R¹

ist.

Ferner sind Verbindungen der allgemeinen Formel I bevorzugt, worin A ein in 1- und 2-Stellung verknüpftes Phenyl, ein in 3- und 4-Stellung verknüpftes Furyl oder Thienyl, ein in 2- und 3-Stellung verknüpfter 5-Norbornenring oder die Gruppe

worin
p 1, 2, 3 oder 4 ist, bedeutet; oder
worin A die Gruppe -CH₂-W-CH₂- ist, worin W für eine Bindung, O, S, NR⁶ (worin R⁶ Phenyl-(C₁-C₃)-alkyl ist), die Gruppe

(worin R⁴ und R⁵ unabhängig voneinander Wasserstoff, (C₁-C₃)-Alkyl oder Phenyl sind), oder für die Gruppe

(worin m 3, 4, 5 oder 6 bedeutet) steht; insbesondere solche, worin A die Gruppe -CH₂-W-CH₂- ist, worin W die Gruppe

ist, worin m 4 oder 5 ist.

Ein weiterer bevorzugter Aspekt der Erfindung sind Verbindungen der allgemeinen Formel I, worin
B Arg, Lys, Ser, His, Pro, Ala, Val, Phe, Asn, Asp, Gly oder Orn ist; und
D Tyr, Phe, Cha, His, Tyr(3,5-di-Br), Phe(p-F), Phe(p-Cl), Phe(n-NO₂), Phenylglycin, 2-Thienylalanin, Cyclohexylalanin, Homophenylalanin, N-Methyl-phenylalanin, Tyr(O-Methyl), Tyr(O-Benzyl), Tyr(O-2,6- dichlorbenzyl), Cys(benzyl), Thr(benzyl), Ser(benzyl), Asp(benzyl) oder Glu(benzyl) ist;
insbesondere solche, worin B Arg ist und D Tyr, Tyr(Bzl) oder Phe ist.

Die bevorzugte Verbindung ist

sowie deren pharmazeutisch annehmbare Salze.

Ermittlungen der an einer NPY-Rezeptoren-Präparation und Untersuchungen über den Einfluß der Verbindungen auf den Blutdruck narkotiersierter Ratten ergaben, daß die Verbindungen einerseits NPY-agonistische, d. h. blutdrucksteigernde Wirkung, und in höheren Dosen eine NPY-antagonistische Wirkung haben.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können zur Therapie cardiovasculaerer Störungen wie Hypertension und Hypotension, koronarer, cerebraler und renaler Vasospasmen sowie Obesitas, Bulimie, Asthma und Depression verwendet werden Darüberhinaus können diese Verbindungen als wertvolle Hilfsmittel zur Erzeugung und Reinigung (Affinitätschromatographie) von Antikörpern und in RIA- oder ELISA-Assays Anwendung finden.

Die Erfindung betrifft daher auch die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen als Heilmittel und pharmazeutische Zubereitungen, die diese Verbindungen enthalten. Bevorzugt ist die Anwendung am Menschen. Die Applikation der erfindungsgemäßen Verbindungen kann intravenös, subcutan, intramuskulär, intraperitoneal, intranasal, inhalativ, transdermal, bevorzugt durch Iontophorese oder literaturbekannte Enhancer gefördert, und oral erfolgen. Am Ganztier verschiedener Spezies liegen die Dosen, die eine deutliche Blutdrucksenkung (< 20 mmHg) auslösen bei 1-5 (insbesondere 3) mg/kg i.v.

Zur parenteralen Applikation werden die Verbindungen der Formel I oder deren physiologisch verträglichen Salze, eventuell mit den dafür üblichen Substanzen wie Lösungsvermittler, Emulgatoren oder weitere Hilfsstoffe in Lösung, Suspension oder Emulsion gebracht. Als Lösungsmittel kommen z. B. in Frage: Wasser, physiologische Kochsalzlösungen oder Alkohole, z. B. Ethanol, Propandiol oder Glycerin, Zuckerlösungen wie Glucose- oder Mannit-Lösungen oder auch eine Mischung aus verschiedenen Lösungsmitteln.

Außerdem können die Verbindungen durch Implantate, z. B. aus Polylactid, Polyglycolid oder Polyhydroxybuttersäure bzw. intranasale Zubereitungen appliziert werden.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können nach allgemein bekannten Methoden der Peptidchemie, wie z. B. in "Houben-Weyl, Methoden der organischen Chemie, Bd. 15/2" beschrieben oder nach der Festphasen peptidsynthese (z. B. R.C. Sheppard, Int. J. Pept. Prot. Res., 21, 118 [1983]) oder gleichwertigen bekannten Methoden hergestellt werden. Dabei werden die jeweiligen Aminosäuren oder Aminosäureteilsequenzen schrittweise kondensiert und die so erhaltenen Peptide werden in freier Form oder in Form der gewünschten Salze isoliert. Als Aminoschutzgruppen werden die in "Houben-Weyl, Methoden der organischen Chemie, Bd. 15/1" beschriebenen verwendet, wobei in konventionellen Synthesen die Benzyloxycarbonylgruppe (Z) und in Festphasensynthesen die Fluorenylmethoxy carbonylgruppe (Fmoc) bevorzugt wird. Die Seitenkette des Arginins wurde im Fall der konventionellen Synthese durch Protonierung geschützt, im Fall der Festphasensynthese wurde die Mtr-Gruppe verwendet. In der Festphasenpeptidsynthese wurden z. B. auch folgende seitenkettengeschützte Aminosäuren eingesetzt:
Lys(Boc), His(Bum), Ser(tBu) und Asp(tBu). Die speziellen Synthesebedingungen sind den nachfolgenden Beispielen zu entnehmen.

Zur Synthese der Verbindungen der allgemeinen Formel I nach der Festphasensynthese sind als Ankergruppen alle diejenigen geeignet, die bei der Abspaltung des Peptids vom polymeren Träger Peptidamide liefern. In Kombination mit der BOC-Aminoschutzgruppe werden bevorzugt die Benzhydrylamino-Ankergruppe (P.G. Pietta u. a., J. Org. Chem. 39, 44 (1974)) und die 4-Methylbenzyhdrylaminankergruppe (G.R. Matsueda u. a., Peptides 2, 45 (1981)) verwendet. In Kombination mit der Fmoc-Schutzgruppe sind verschiedene Ankergruppen anwendbar:
p-Aminomethyl-phenoxymethyl-Gruppe (P. Pietta u. a., J. Org. Chem. 40, 2995 (1975) Bis- und Trialkoxybenzylamin-Linker (F. Albericio, G. Barany, Int. J. Pept. Prot. Res. 30, 206 (1987) Benzhydrylalkohol-Linker (G. Breipohl u. a., Tetrah. Lett 28, 5651 (1987)).

Besonders der Dimethoxyphenoxyvaleriansäure-Anker, der an mit Alanin beladenes Benzhydrylamin-Polystyrol über die Carboxygruppe geknüpft wurde, bewährt sich.

Nach Abspaltung der Aminoschutzgruppe der an das Harz gekuppelten Aminosäure mit einem geeigneten Reagenz z. B. Trifluoressigsäure in Dichlormethan im Falle der BOC-Gruppe oder einer 20-50%igen Lösung von Piperidin in DMF im Falle der Fmoc-Gruppe werden die geeignet geschützten Aminosäuren angekuppelt. Dieser Cyclus wird nacheinander so oft durchlaufen bis das gewünschte Harz-gebundene Peptid entstanden ist.

Zur Kupplung können die in der Peptidchemie bekannten Methoden (s. Houben-Weyl, Methoden der organischen Chemie Bd 15/2 angewendet werden. Bevorzugt verwendet werden Carbodiimide, wie z. B. Dicyclohexylcarbodiimid, Diisopropylcarbodiimid oder Ethyl-(3-dimethylamino propyl)-carbodiimid oder O-Benzotriazol-tetramethyl uroniumhexafluorophosphat oder Benzotriazol-1-yl-oxy tris-(dimethylamino)-phosphoniumhexafluorophosphat. Durch Zusatz von 1-Hydroxybenzotriazol (HOBt) oder 3-Hydroxy-4-oxo-3,4-dihydrobenzotriazin (HOObt) kann gegebenenfalls die Racemisierung unterdrückt bzw. die Reaktionsgeschwindigkeit gesteigert werden. Die Aminosäuren Asn und GIn werden bevorzugt in Form ihrer N-geschützten p-Nitrophenylester gekuppelt. Die Kupplungen werden normalerweise mit einem 2- bis 5-fachen Überschuß an N-geschützter Aminosäure und Kupplungsreagenz in Lösungsmitteln wie Dichlormethan, Dimethylformamid, N-Methylpyrrolidon (NMP) oder Gemischen aus diesen durchgeführt. Der Verlauf der Kupplungsreaktion wird durch den Kaiser-Test (E. Kaiser u. a., anal. Biochem. 34, 595 (1970) oder durch den TNBS-Test verfolgt. Falls eine unvollständige Acylierung festgestellt wird, wird die Kupplung bis zur Vollständigkeit wiederholt. Die Festphasensynthese kann sowohl manuell als auch automatisch mit Hilfe eines Peptidsynthesizers erfolgen.

Bevorzugt werden Festphasensynthesen unter Verwendung des Dimethoxyvaleriansäure-Linkers, Fmoc-Aminoschutz gruppen und des automatischen Synthesizers von ABI mit selbst entwickelten Syntheseprogrammen. Es werden Doppelkupplungen durchgeführt, die erste mit DCC/HOBt in DMF, die zweite mit symmetrischen Anhydriden in N-Methylpyrrolidon. Nach der ersten Kupplung wird ein Waschschritt mit N-Ethylmorpholin in NMP zwischengeschaltet. Nach der zweiten Kupplung erfolgt Capping mit Acetanhydrid und N-Ethylmorpholin. Gewaschen wird das Harz nach jedem Kupplungsschritt mit DMF, NMP und Isopropanol.

Die zum Teil bei den Sequenzen der vorliegenden Erfindung auftretende N-terminale Acetylgruppe wird durch Acetylierung des Peptids am Harz mit Acetanhydrid oder Acetylimidazol in DMF oder NMP mit eventuellem Zusatz von Pyridin als Base eingeführt.

Nach Aufbau der Peptide am Harz kann das Peptid mit geeigneten Reagenzien wie flüssigem Fluorwasserstoff im Falle der nach der BOC-Strategie aufgebauten Peptide oder Trifluoressigsäure im Falle der nach der Fmoc-Strategie aufgebauten Peptide vom polymeren Träger abgespalten werden. Bei Verwendung der oben angeführten Ankergruppen erhält man direkt die entsprechenden Peptidamide. Mit diesen Reagenzien werden in der Regel und bei Verwendung der entsprechenden Seitenketten schutzgruppen auch die funktionellen, während der Synthese geschützten Gruppen des Peptids freigesetzt.

Überlicherweise werden bei der Abspaltung des Peptids vom Harz als Kationenfänger Substanzen wie Phenol, Kresol, Anisol, Thiokresol, Thioanisol, Indol, Dimethylsulfid oder Ethylmethylsulfid oder eine Mischung dieser Substanzen dem Fluorwasserstoff bzw. der Trifluoressigsäure zugesetzt.

Die Reinigung der erhaltenen Rohprodukte erfolgt mittels Gelchromatographie z. B. an Sephadex G25 (MR < 1400) oder G15 (MR < 1400) mit 1%iger oder 5%iger Essigsäure. Falls erforderlich erfolgt die weitere Aufreinigung mittels präparativer RP-HPLC mit Methanol- oder Acetonitril-Wasser-Gradienten unter Zusatz von 1 bis 2% Trifluoressigsäure. Zur Reinigung können auch Kationenaustauscher auf Sephadex- oder Polystyrol-Basis angewendet werden.

Analytik

Die Schmelzpunkte wurden an einem Büchi-510- Schmelzpunktgerät gemessen, die Drehwerte an einem Perkin-Elmer-241 Polarimeter. Die FAB-Massenspektren wurden gemessen an einem MAT-90-Massenspektrometer der Fa. Finnigan. R_f-Werte wurden auf Merck Kieselgel-DC- Platten des Typs 60 F₂₅₄ der Schichtdicke 0,25 mm ermittelt, wobei Sakaguchi's Reagens als Indikator verwendet wurde.

Die Verbindungen der allgemeinen Formel I können mittels RP-HPLC auf Reinheit geprüft werden. Es wird jeweils eine Aminosäureanalyse am Ionenaustauscher (LKB) und am Gaschromatographen an chiraler Säule zur zusätzlichen Racemisierungskontrolle durchgeführt. Darüberhinaus werden 13C-NMR-Spektren (Bruker 400 MHz) aufgenommen. Die Prüfung auf Peptidamide erfolgt mittels Resistenzermittlung gegenüber Carboxypeptidase Y.

Die Sequenzbestimmung erfolgt mittels Gasphasensequenzierung.

Die Ausgangsverbindungen der allgemeinen Formel R¹NH₂ (II) und III

sind neue Verbindungen. Diese können nach bekannten Verfahren hergestellt werden. So kann die Verbindung II durch Reduktion einer Verbindung R¹NO₂ (IV) hergestellt werden und dann mit einem reaktiven Derivat der Dicarbonsäure HOOC-A-COOH (V) zu dem Amid der allgemeinen Formel III umgesetzt werden. Die Verbindung R¹NO₂ (IV) kann analog zu der unten beschriebenen ersten Stufe des Beispiels hergestellt werden.

Für die Darstellung der Formeln wird die Art verwendet, worin Methylgruppen nicht ausgeschrieben werden. Zum Beispiel enthält die oben genannte bevorzugte Verbindung endständig die Gruppe CH₃(CM₂)₃NH-.

Beispiel

Herstellung von 2-n-Butylamino-5-nitro-1-phenyl benzimidazol 1

26,4 g (64 mMol) S-Methyl-N-(3-nitrophenyl)-N'-phenyl isothiuronium-jodid, 320 ml Acetonitril und 25,1 ml (127 mMol) 1-Aminobutan werden vereint und 5,5 Stunden unter Rückfluß gekocht. Die Lösung wird eingeengt, der Rückstand aufgenommen in verdünnter Na₂CO₃-Lösung und die wäßrige Lösung mit Ether extrahiert. Die Etherphase wird mit Wasser gewaschen und mit 0,1 N HCl extrahiert. Die wäßrige Phase wird mit Ether gewaschen, durch Zugabe von 1 M Na₂CO₃-Lösung alkalisch gestellt und wiederum mit Ether ausgeschüttelt. Nach dem Einengen der Etherphase wird der Rückstand in Ether gelöst und über eine Kieselgelsäule mit Ether als Fließmittel chromatographiert. So erhält man 10,5 g N-n-Butyl-N'-(3-nitrophenyl)-N''-phenylguanidin (Ausbeute 53%). Fp: 94-97°.

10,5 g (33,5 mMol) N-n-Butyl-N'-(3-Nitrophenyl)-N''- phenylguanidin werden in 50 ml DMSO gelöst und innerhalb von 20 Minuten mit einer Lösung von 1,4 g KOtBu (12,6 mMol) in 50 ml DMSO versetzt. Es wird weitere 8 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, in 400 ml Essigester eingetragen, mit 1 l eiskaltem Wasser und Na₂CO₃ unterschichtet und kräftig durchgerührt. Die Etherphase wird abgetrennt, die wäßrige Phase nochmals mit Ether extrahiert und die vereinigten organischen Phasen zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wird in 200 ml Ether gelöst, mit 225 ml 0,2 N HCl extrahiert, die wäßrige Phase durch Zugabe von 1 M Na₂CO₃- Lösung auf pH 3-4 gestellt und nochmals mit Ether ausgeschüttelt. Die beiden etherischen Phasen werden vereinigt, unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt und mit Petrolether 40/80 verrührt. Man erhält nach Trocknung 5,3 g 1 (Ausbeute 50%) in Form gelber Kristalle. Fp: 120-123°.

Herstellung von Verbindung 2

6,65 g (21 mMol) 2-n-Butylamino-5-nitro-1-phenyl benzimidazol (1) werden in 250 ml Methanol gelöst und mittels Raney-Nickel bei 5 bar/20°C hydriert. Die erhaltene Mischung wird filtriert, das Filtrat eingeengt, der ölige Rückstand in wenig Ether gelöst und mit ca. 200 ml Petrolether 40/80 gefällt. Nach Trocknung des Niederschlages im Exsikkator verbleiben 5,6 g 2 (93%) in Form dunkelgrauer Kristalle. Fp.: 139-140°.

Herstellung von Verbindung 3

0,84 g (5 mMol) 3,3-Tetramethylenglutarsäureanhydrid werden in 20 ml THF gelöst, und die Lösung im Eisbad abgekühlt. Bei 5-10° wird dann unter Rühren eine Lösung von 1,4 g 2 (5 mMol) in 20 ml THF zugetropft. Man läßt 15 Minuten bei 4° und 2,5 Stunden bei Raumtemperatur nachreagieren und engt die klare Lösung am Rotationsverdampfer ein. Der Rückstand wird mit Ether verrührt, abgesaugt, mit Ether und Petrolether 40/80 gewaschen und getrocknet. Man erhält 2,16 g 3 (96%) in Form grauer Kristalle.

Herstellung von H-Arg-Tyr-NH₂

15 g Z-Arg-OH.HCl (43,5 mMol), 7,83 g H-Tyr-NH₂ (43,5 mMol) und 6,66 g HOBt (43,5 mMol) werden in 160 ml absolutem DMF gelöst, die Mischung auf 3-5° abgekühlt und unter Rühren mit 52,2 mMol DCII versetzt. Man beläßt 1 h bei 3-5°, und rührt anschließend über Nacht bei Raumtemperatur. Dünnschichtkontrolle zeigt vollständige Umsetzung. Vom ausgefallenen DCH wird abfiltriert, das Filtrat unter vermindertem Druck und schließlich im Hochvakuum eingeengt und der Rückstand in 600 ml 0,1 n HCl aufgenommen. Vom Ungelösten wird abfiltriert und das Filtrat mit 60 ml 1n NaCH neutralisiert. Nach Zugabe von 150 ml gesättigter NaHCO₃-Lösung wird vom ausgefallenen zähen Öl abdekantiert und filtriert. Das Filtrat wird zur Trockne eingeengt, der Rückstand mit 300 ml einer Mischung aus Acetonitril/Wasser/Methanol im Verhältnis 4 : 1:1 aufgenommen und vom Ungelösten abgesaugt. Das Filtrat wird direkt über Kieselgel mit Acetonitril/ Wasser/Methanol (4 : 1:1) als Fließmittel chromatographiert. Die im DC einheitlichen Fraktionen des Eluats werden vereinigt und im Vakuum bis zur Gewichtskonstanz eingeengt. Man erhält 18,9 g Z-Arg-Tyr-NH₂.HCl (Ausbeute 86%) als weiße Festsubstanz,
Fp.: 96-106°. [α] 20|D (MeOH): -11,6°.

18,9 g Z-Arg-Tyr-NH₂.HCl (37 mMol) werden in 500 ml Methanol gelöst, mit 2 g Pd-Kohle (5%) versetzt und im Autoklaven bei 20° über 3 h bei einem Druck von 5 Bar H₂ der Hydrogenolyse unterworfen. Die Reaktionsmischung wird filtriert und das Filtrat eingeengt bis zur Gewichtskonstanz. Man erhält 13,5 g H-Arg-Tyr-NH₂.HCl (Ausbeute 98%) als weiße Festsubstanz.
Fp.: 114-24° (Zers.); [α] 20|D (MeOH): +24,4°.

Herstellung von Verbindung 4

1,8 g 3 (3,7 mMol), 1,38 g H-Arg-Tyr-NH₂.HCl (3,7 mMol) und 0,57 g HOBt (3,7 mMol) werden in 100 ml DMF gelöst, auf 3-5° abgekühlt und mit 0,92 g DCCI (4,5 mMol) versetzt. Man beläßt 1 h bei 3-5°, läßt auf Raumtemperatur kommen und rührt über Nacht. Vom ausgefallenen DCH wird abfiltriert und das Filtrat zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wird über Kieselgel mit Acetonitril/MeOH/Ameisensäure (16 : 4:1) chromatographiert, die DC-einheitlichen Fraktionen zusammengefaßt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Man nimmt den Rückstand in MeOH auf, filtriert, und engt das Filtrat wiederum zur Trockne ein. Es werden 2,5 g (Ausbeute 80%) der erfindungsgemäßen Verbindung 4 als weiße Festsubstanz erhalten.
Fp.: 126°; [α] 20|D (MeOH): -13,7°.

Pharmazeutische Zubereitungen Injektionslösung

200,0 mg Wirksubstanz *
1,2 mg Monokaliumdihydrogenphosphat = KH₂

PO₄

(Puffer)
0,2 mg Dinatriumhydrogenphosphat = NaH₂

PO₄

.2H₂

O (Puffer)
94,0 mg Natriumchlorid (Isotonans) oder
520,0 mg Glucose
4,0 mg Albumin (Proteasenschutz)
g.s. Natronlauge, ad pH 6
g.s. Salzsäure, ad pH 6
ad 10 ml Wasser für Injektionszwecke

Injektionslösung

200 mg Wirksubstanz *
94 mg Natriumchlorid oder
520 mg Glucose
4 mg Albumin
q.s. Natronlauge, ad pH 9
q.s. Salzsäure, ad PH 9
ad 10 ml Wasser für Injektionszwecke

Lyophilisat

200 mg Wirksubstanz*
520 mg Mannit (Isotonans/Gerüstbildner)
4 mg Albumin

Lösungsmittel 1 für Lyophilisat

10 ml Wasser für Injektionszwecke

Lösungsmittel 2 für Lyophilisat

20 mg Polysorbat®80 = Twen®80 (oberflächenaktiver Stoff)
10 ml Wasser für Injektionszwecke

* Wirksubstanz: erfindungsgemäße Verbindungen, z. B. die des Beispiels 1.
Dosis für Mensch von 67 kg.

Claims

1. Peptid der allgemeinen Formel I
oder dessen pharmazeutisch annehmbares Salz, worin R¹ die Gruppe
ist, worin
n eine ganze Zahl von 1 bis 6, vorzugsweise 1 bis 4 ist;
Ar Phenyl, durch Halogen oder Trifluormethyl mono- oder disubstituiertes Phenyl, oder Naphthyl ist;
A

B Arg, Lys, Ser, His, Pro, Ala, Val, Phe, Asn, Asp, Gly oder Orn in der L- oder D-Konfiguration gegebenenfalls mit geschützten Seitenketten ist;
D Tyr, Phe, Cha, His, Cys, Thr, Ser, Asp, Glu, Tyr(3,5-di-Br), Phe(p-F), Phe(p-Cl), Phe(p-NO₂), Phenylglycin, 2-Thienylalanin, Cyclohexylalanin, Homophenylalanin oder N-Methyl-phenylalanin, in der L oder D-Konfiguration, gegebenenfalls mit geschützten Seitenketten ist.

2. Peptid nach Anspruch 1, worin n in der Gruppe R¹ 4 ist.

3. Peptid nach Anspruch 1 oder 2, worin A ein in 1- und 2-Stellung verknüpftes Phenyl, ein in 3- und 4-Stellung verknüpftes Furyl oder Thienyl, ein in 2- und 3-Stellung verknüpfter 5-Norbornenring oder die Gruppe
worin p 1, 2, 3 oder 4 ist, bedeutet.

4. Peptid nach Anspruch 1 oder 2, worin A die Gruppe -CH₂-W-CH₂- ist, worin W für eine Bindung O, S, NR⁶ (worin R⁶ Phenyl-(C₁-C₃)-alkyl ist), die Gruppe
(worin R⁴ und R⁵ unabhängig voneinander Wasserstoff, (C₁-C₃)-Alkyl oder Phenyl sind), oder für die Gruppe
(worin m 3, 4, 5 oder 6 bedeutet) steht.

5. Peptid nach Anspruch 4, worin A die Gruppe -CH₂-W-CH₂ - ist, worin W die Gruppe
ist, worin m 4 oder 5 ist.

6. Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin
B Arg, Lys, Ser, His, Pro, Ala, Val, Phe, Asn, Asp, Gly oder Orn ist; und
D Tyr, Phe, Cha, His, Tyr(3,5-di-Br), Phe(p-F), Phe(p-Cl), Phe(n-NO₂), Phenylglycin, 2-Thienylalanin, Cyclohexylalanin, Homophenylalanin, N-Methyl-phenylalanin, Tyr(O-Methyl), Tyr(O-Benzyl), Tyr(O-2,6- dichlorbenzyl), Cys(benzyl), Thr(benzyl) Ser(benzyl), Asp(benzyl) oder Glu(benzyl) ist.

7. Peptid nach Anspruch 5, worin B Arg ist und D Tyr, Tyr(Bzl) oder Phe ist.

8. Peptid nach Anspruch 1, das
oder dessen pharmazeutisch annehmbares Salz ist.

9. Verfahren zur Herstellung eines Peptides nach einem der Ansprüche 1 bis 8 oder dessen Salzes, dadurch gekennzeichnet, daß man nach in der Peptidchemie bekannten Methoden schrittweise die jeweiligen Aminosäuren oder Aminosäureteilsequenzen kondensiert und das so erhaltene Peptid in freier Form oder in Form des gewünschten Salzes isoliert.

10. Pharmazeutische Zubereitung enthaltend eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 8.

11. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Therapie von cardiovasculären Störungen.

12. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Therapie von koronaren, cerebralen oder renalen Vasospasmen.

13. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Therapie von Obesitas.

14. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Therapie von Bulimie.

15. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Therapie von Asthma.

16. Verbindung der allgemeinen Formel R¹NH₂ (II) worin R¹ wie in Anspruch 1 oder 8 definiert ist.

17. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung R¹NO₂ (IV) reduziert.

18. Verbindung der allgemeinen Formel III
worin R¹ und A wie in einem der Ansprüche 1 bis 8 definiert sind.

19. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung R¹NH₂ (II) mit einem reaktiven Derivat einer Dicarbonsäure HOOC-A-COOH (V) umsetzt.