DE2344886C3 - Synthetisch modifizierte Derivate des basischen Trypsin-Kalllkrein-Inhibitors aus Säugetierorganen und Verfahren zu ihrer Herstellung - Google Patents

Description

IO

in der X für die Zahl O bis 10 steht, Y Wasserstoff oder einen geradkettigen oder verzweigten In verschiedenen Säugerorganen, besonders in Alkylrest mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, der ge- i₅ Rinderlunge, ist ein Trypsin-Kallikrein-Inhibitor entgebenenfalls durch eine Carboxyl-, Hydroxyl- haken, der auf verschiedene Weise hieraus isoliert •der Carbonamidgruppe substituiert ist, wobei werden kann und der, in reiner Form, seit über <er Rest 15 Jahren als polyvalenter Proteinasen- und Esterasen-NH— CH — CO Inhibitor mit großem Erfolg als Therapeutikum bei I ao Enzymentgleisung eingesetzt wird.
γ . Dieser Trypsin-Kallikrein-Inhibitor ist ein basisches

Polypeptid mit einem Molekulargewicht von 6500

auch den Prolin-Rest bedeuten kann, und wobei und einem isoelektrischen Punkt von etwa 10,5. Er

Y, falls X = 0 ist, besteht aus einer einzigen Peptidkette von 58 Amino-

nxj nnrrti ^a5 sä^¹¹» ^deren Primärstruktur aus Biochemical and

— CHjCOOH Biophysical Research Communication, Bd. 20, S. 463 oder bis 468 (1965) bekannt ist und die durch 3 Disulfid-

— CH, — CH₁ — COOH brücken vernetzt ist.

Der hohe therapeutische Wert des Inhibitors

bedeutet und falls X für die Zahlen 1 bis 10 steht, 30 beruht darin, verschiedene Proteinasen und Esteirasen, zumindest eine Seitenkette Y wie Trypsin, Chymotrypsin, Kathepsin, Plasmin und

Kallikrein zu hemmen. Hierzu werden, hauptsächlich

CH₁ COOH intravenös, bisweilen erhebliche Mengen des Inhi-

oder bitors injiziert. Hierbei ist zu beobachten, daß der

— CH₂ — CH₁ — COOH 35 Inhibitor nach relativ kurzer Zeit bevorzugt in der

Niere des Versuchstieres oder des Menschen gespei-

darstellt, worin weiterhin W —OH bedeutet, chert wird. Es wird heute angenommen, daß dies doch bei Anwesenheit von mindestens zwei darauf beruht, daß das stark basische Inhibitormole-Carboxylgruppen in den Seitenketten auch kül auf unspezifische Weise an saure Mukopoly-

40 saccharide oder Nukleinsäuren gebunden wird. Ledig-

— NH₁, NH — CH₁, Hch 1,5% des nativen Inhibitors werden mit dem NH CH, OCH Όήη ausgeschieden; um eine Ausscheidung der über-

" ' wiegenden Restmenge zu ermöglichen, wird vom

°°^er Organismus zuerst je eine amino- und carboxyl-

OC₂H, 45 ständige Aminosäure (Arginin bzw. Alanin) abgebaut, der Inhibitor aggregiert zu einer höher molebedeuten kann. kularen Form und wird dann erst sehr langsam aus

2. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Niere ausgeschwemmt.

nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Versuche mit chemisch modifiziertem Inhibitor,

man den Trypsin-Kallikrein-Inhibitor, dessen fünf so bei dem über alle freien Aminogruppen eine Maleoyl-

primäre Aminogruppen durch sauer leicht abspalt- gruppe eingeführt worden war, und der sich als inak-

bare Schutzgruppen geschützt sind, mit Amino- tiv bewies, haben gezeigt, daß diese Substanz, deren

säuren oder Peptiden der allgemeinen Formel II, isoelektrischer Punkt wesentlich erniedrigt war, sehr

NH₁-CH-CO- /NH-CH-CO-\ W' ^v'^e* ^{rascner aus} der Niere ausgeschwemmt wurde

ι [ι \ m\ 55 und mit dem Urin ausgeschieden werden konnte.

γ \ Y / ^Em biologisch ^V°U wirksamer Inhibitor, der einen

^ ^lx niedrigeren LP. aufweist, wäre deshalb von erheb-

in der Y und X die angegebene Bedeutung haben, lichem Wert. Es ist nun prinzipiell möglich, durch

vorhandene Carboxylgruppen in Y jedoch als Acylierung der freien Aminogruppen die positiven

tert.-Butylester vorliegen, W' tert-Butoxy bedeu- 60 Ladungen zu verringern und so den isoelektrischen

tet, doch bei Anwesenheit von mindestens 2 tert.- Punkt zu senken. Bei allen diesen Umsetzungen wird

Butylestergruppen in den Seitenketten auch aber ein in der Aktivität zumindest abgeschwächtes,

wenn nicht sogar inaktives Reaktionsprodukt erhalten,

— NH₁, — NH — CH,, da die 5 Aminogruppen des Moleküls 4 gleichberech-NH C₁H , OCH ^6j listen «-Aminogruppen des Lysins und 1 a-Amino-

, ' * gruppe zuzuordnen sind, andererseits aber das an

^otler der Pos. 15 befindliche Lysin entscheidend für die

-OC₁H₈ inhibitorische Wirkung der Substanz ist. Eine Sub-

mtuierung der Aminograppe des Lysin 15 bewirkt bei Anwesenheit von mindestens 2 tert-Butylester-

dcn.Verlust.ta: biologischen Aktivität gruppen _{m den} Seitenketten auch

Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß

durch Verlängerung der 5 vorhandenen Carboxyl- -NH — NH-CH

gruppen mit sauren Peptiden die Aktivität des Inhi- 5 *' _ „ _ *

bitors nur wenig oder nicht verändert wird, dagegen ^Nti — MH₅. —OCH₁

aber durch Senkung des isoelektrischen Punktes der oder

modifizierte Inhibitor viel rascher aus der Niere aus- OC₁H

geschieden wird als das nicht modifizierte Molekül. ^S

Gegenstand der Erfindung sind somit halbsynthe- io bedeuten kann, in Gegenwart von 1-Hydroxybenzo-

tisch hergestellte Derivate des basischen Trypsin- triazol und Dicyclohexylcarbodiimid umsetzt und

Kallikrein-Inhibitors aus Säugerorganen, dadurch anschließend die Schutzgruppen sauer abspaltet

gekennzeichnet, daß die 5 vorhandenen Carboxyl- Um den Trypsin-Kallikrein-Inbibitor an seinen

gruppen des Pephdmoleküls amidarüg durch Peptid- Carboxylgruppen modifizieren zu können, werden

reste der allgemeinen Formel I verlängert sind, 15 zweckmäßig die Aminogruppen durch sauer leicht

NH-CH-CO- /NH CU cn \ w abspaltbare Aminoschutzgruppen, wie z.B. tert-

-Nn γη «-υ /jnh-ch-cu-\ W Alkoxycarbonylgruppen blockiert Die Einführung

' I ' ) ^der h^äufig verwendeten Boc-Gruppen gelingt auf

* \ Y Ix verschiedenen Wegen. Sowohl mit Boc-azid als auch

ao mit Boc-activestern, wie z. B. dem p-Nitrophenyl-

in der X für die Zahl O bis 10 steht, Y Wasserstoff ester oder dem N-Hydroxysuccinimidester lassen sich

oder einen geradkettigen oder verzweigten Alkylrest die Boc-Gruppen einführen. In allen Fällen entsteht

mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, der gegebenenfalls ein papierelektrophoretisch einheitliches Produkt,

durch einen Carboxyl-, Hydroxyl- oder Carbonamid- Diese N-geschützten Verbindungen werden in An-

gruppe substituiert ist, wobei der Rest a₅ Wesenheit von 1-Hydroxy-benzotriazol und Dicyclohexylcarbodiimid mit einer Verbindung der allgemei-

NH — CH — CO nen Formel II in Dimethylformamid oder Dimethyl-

I acetamid umgesetzt. Mit Trifluoressigsäure oder

Y HCl/Eisessig werden die Schutzgruppen abgespalten

30 und das Rohprodukt entweder dialysiert oder über

auch den Prolin-Rest bedeuten kann, und wobei Y, Sephadex G 25®, einem vernetzten Dextrangel, chro-

falls X = O ist, matographiert. Es empfiehlt sich das dialysierte Produkt zur weiteren Reinigung ebenfalls über Sepha-

— CHgCOOH dex G 25® zu chromatographieren oder aber einer oder 35 Verteilungschromatographie an Sephadex LH 20®,

— CH₂ — CH₂ — COOH einem vernetzten alkylierten Dextrangel, zu unter

werfen.

bedeutet und falls X für die Zahlen 1 bis 10 steht, Um den isoelektrischen Punkt des Trypsin-Kalli-

zumindest eine Seitenkette Y krein-Inhibitors zu senken, muß der ankondensierte

40 Aminosäure- oder Peptidrest mindestens zwei Carb-

— CH₂ — COOH oxylgruppen besitzen. Unter den natürlich vorkom« oder menden Aminosäuren kommen nur Asparaginsäure

-CH₂-CH₂-COOH und Glutaminsäure in Frage. Bei Dipeptiden und

höheren Peptiden ist es möglich, neben den sauren

darstellt, worin weiterhin W — OH bedeutet, doch 45 Aminosäuren auch andere aliphatische Aminosäuren, bei Anwesenheit von mindestens zwei Carboxyl- wie z. B. Glycin, Alanin, Leucin, Valin, Isoleucin, gruppen in den Seitenketten auch Serin, Threonin, Asparagin, Glutamin oder Prolin

einzubauen. Vorzugsweise werden aber auch bei -NH₂ NH — CH₉ höheren Peptiden Asparaginsäure und Glutamin-

jqjj Q jj OCH ⁵° säure als Peptidbausteine verwendet. Sund zwei oder

^{25 3} mehr Carboxylgruppen in dem anzukondensierenden

oder Peptid in Form der tert-Butylester vorhanden, kön-

OC₂H₆ nen weitere Carboxylgruppen in Form von Amiden

oder Alkylestern vorliegen. Nach der sauren Behandbedeuten kann, sowie ein Verfahren zur Herstellung 55 lung mit Trifluoressigsäure oder HCl/Eisessig bedieser Peptide, das dadurch gekennzeichnet ist, daß kommt man auf diese Weise Trypsün-Inhibitoren, man den Trypsin-Kallikrein-Inhibitor, dessen fünf die neben einem niedrigen isoelektrischen Punkt zuprimäre Aminogruppen durch sauer leicht abspalt- sätzlich Amidgruppen oder Alkylestergruppcn bebare Schutzgruppen geschützt sind, mit Aminosäuren sitzen.

oder Peptiden der allgemeinen Formel II, 60 Zum Nachweis der Abnahme des !basischen und

Zunahme des sauren Charakters bei den erfindungs-

NH₂-CH-C0-/NH-CH-C0-\ W' gemäß hergestellten Inhibitor-Derivaten wurde der

III Ι (Π) native Inhibitor und modifizierte Präparate der

γ \ Y J_x Mikrozonen-elektrophorese auf Celluloseacetat-Folie

65 im Diäthyl-Barbituratpuffer von pH 8,(5 unterworfen.

in der Y und X die angegebene Bedeutung haben, Der native Inhibitor wandert hierbei zur Kathode,

vorhandene Carboxylgruppen in Y jedoch als tert,- während die modifizierten Präparate je nach modi-Butylester vorliegen, W' tert.-Butoxy bedeutet, doch fizierender Gruppe mehr oder weniger weit zur

Anode wandern. Für den nativen Inhibitor beträgt sammengebracht, eine bestimmte Extinktion bei die kathodische Wanderungsstrecke etwa 3 mm. Für 405 πιμ bewirkt, mit steigenden Mengen des Inhidie modifizierten Präparate, wobei die modifizierende bitors im konstanten Volumen zusammen inkubiert Gruppe in den einzelnen Fällen eine, zwei, drei oder wird. Nach 30 Minuten Vorinkubation wird die vier saure Aminosäuren enthält, betragen die an- 5 Standardmenge BAPA zugesetzt. Die Reaktion wird odischen Wanderungsstrecken etwa 1,5 mm, 8 mm, nach 30 Minuten BAPA-InKubation bei 37°C durch 13,5 mm und 17 mm. Zusatz von verdünnter Essigsäure gestoppt und die

Die Modifizierung des Inhibitors führt demnach aufgetretene Gelbfärbung gemessen. Trägt man in zu Präparaten, deren basischer Charakter vermin- einem Diagramm die zugesetzten Inhibitormengen dert und saurer Charakter vermehrt ist. Die Modi- io gegen die entsprechenden Extinktions-Werte auf, so fizierung nut einer Gruppe, die eine einzige saure erhält man eine Kurve, aus der leicht ermittelt werden Aminosäure enthält, führt bereits zu einer solchen kann, welche Inhibitormenge die stets konstant zuErniedrigung des isoelektrischen Punktes, daß bei gesetzte Trypsinmenge in ihrer Wirkung um die Hälfte pH 8,6 der saure Charakter geringfügig den basischen zu hemmen imstande war. Da bekannt war, welche Charakter überwiegt 15 Aktivität bzw. Menge Trypsin zugesetzt wurde, kann

Die aus den Dissoziationskonatanten der funktio- zurückgerechnet werden, wieviel Milligramm des nellen Gruppen des Inhibitors und seiner erfindungs- Inhibitors wieviel Trypsin zu hemmen imstande waren. gemäß hergestellten Derivate schätzbaren isoelek- In diesem Test sind etwa 1 mg des modifizierten

falschen Punkte betragen für den nativen Inhibitor Inhibitors in der Lage, etwa 3 mg Trypsin zu inaktietwa 10,5 und für modifizierte Präparate, wobei die »o vieren.

modifizierte Gruppe eine, zwei, drei oder vier saure Der erfindungsgemäß modifizierte Trypsin-Kalli-

Aminosäuren enthält, etwa 8,6, 5,1, 4,8 und 4,6. krein-Inhibitor dient als Arzneimittel bei Blutungen

Zum fluoreszenz-mikroskopischen Nachweis der als Folge einer überschießenden Fibrinolyse; so z. B. Nierenspeicherung von Inhibitor und modifiziertem in der Chirurgie bei Prostatablutungen oder Wundinhibitor wurden jeweils 3 Kaninchen mit einem »5 heilungsstörungen, in der Inneren Medizin als Zusatz-Gewicht von 2,5 kg jeweils zur gleichen Zeit mit therapie bei Hämophilen, in der Gynäkologie bei 20 mg nativem bzw. 20 mg erfindungsgemäß modi- Placenta praevia, intrauterinem Fruchttod und atofizierten Inhibitor intravenös injiziert. Nach 2 Tagen nischem Nachbluten und zur Prophylaxe bei Operawurden die Nieren entnommen, geschnitten und mit tionen an parenchymatösen Organen und bei Prostaeinem nuoreszeinmarkierten y-Globulin-Präparat 3° tectomien und Fettembolien.

inkubiert, das aus dem Antiserum von Kaninchen Die neuen erfindungsgemäßen Arzneimittel werden

gewonnen worden war, welche vorher mehrere Male in steriler isotonischer Lösung intravenös injiziert mit Inhibitor und Adjuvans nach Freund zur oder im Dauertropf nach Verdünnen in Infusions-Steigerung der Antikörperbildung geimpft worden lösungen wie z. B. physiologischer Kochsalzlösung waren. 35 gegeben.

Hierbei bot sich unter dem Fluoreszenz-Mikroskop
folgendes Bild: Beispiel 1

Alle Nierenschnitte der mit dem nativen Inhibitor Trypsin-Kallikrein-Inhibitor-penta-L-glutaminsäure behandelten Tiere zeigten über das gesamte Gesichtsfeld verteilt große, zum Teil konfluierende fluores- 4° Zu einer Suspension von 900 mg Pcnta-Boc-Trypzierende Stellen, während die Schnitte aus den Nieren sin-Kallikrein-Inhibitor, 386 mg (1,3 mMol) HCl-H-derjenigen Tiere, die den modifizierten Inhibitor GIu(OBUt)-OBu⁴, 175 mg (1,3 mMol) HOBt und erhalten hatten, meistens keine Fluoreszenz zeigten 0,17 ml (1,3 mMol) N-Äthylmorpholin in 10 ml Di- und nur in einigen wenigen Fällen kleine leuchtende methyiformamid gibt man bei O⁰C 284 mg DCC und Stellen enthielten. Dieser Versuch zeigte auf eindeu- 45 rührt 1 Stunde bei 0° C und 24 Stunden bei Raumtige Weise, daß der Inhibitor, dessen isoelektrischer temperatur. Der Niederschlag wird abgesaugt und Punkt gesenkt ist, weitaus weniger bis gar nicht in das Filtrat eingeengt. Der Rückstand wird mit Äther der Niere gespeichert wird. verrieben und getrocknet. Ausbeute 1,39 g.

In Vorversuchen wurde durch Doppeldiffusion Die so gewonnene Substanz wird in 10 ml Trifluornoch festgestellt, daß das verwendete Antikörper- 50 essigsäure gelöst. Man läßt 30 Minuten bei Raum-Präparat nicht nur gegen den nativen Inhibitor, son- temperatur stehen und engt anschließend im Vakuum dem auch dessen erfindungsgemäße Umsetzungspro- ein. Der Rückstand wird mit Äther verrieben und dukte reagierte. abgesaugt. Ausbeute 1,17 g.

Zur Aktivitätsbestimmung der modifizierten Tryp- Die so gewonnene Substanz wird gegen Wasser

sin-Kallikrein-Inhibitoren wurde wie folgt verfahren: 55 dialysiert und gefriergetrocknet. Ausbeute 710,3 mg.

Die Inhibitorlösung wird mit einer festgelegten 325 mg der dialysierten und gefriergetrockneten

Menge (entsprechend einer bestimmten Aktivität) Substanz werden an Sephadex LH 20® (100 χ 2,5-cm-

Trypsinlösung vorinkubiert; nach kurzer Zeit setzi Säule) in dem System Eisessig/Butanol/Wasser

man ein geeignetes Trypsinsubstrat, z. B. N-Benzoyl- (2:4: 20) Chromatographien. Es werden 228 mg

arginin-4-nitroanilid (BAPA) zu und mißt nach 60 einer reinen Fraktion isoliert.

einiger Zeit und nach Abstoppen der Reaktion die Aminosäureanalyse: Verhältnis GIy zu GIu = 6:8,5

durch nicht gehemmtes Trypsin bewirkte Abspaltung (theoret. 6 : 8).
von p-Nitroanilin bedingte Gelbfärbung quantitativ

am Photometer bei geeigneter Wellenlänge, z. B. B e i s ρ i e 1 2

⁴⁰I ^mV"· 1 Auu· ^u λ η · ⁶⁵ Trypsin-Kallikrein-Inhibitor-penta-(Glu-Glu-OH)

Im einzelnen wird hierbei so verfahren, daß eine

Trypsinmenge (Trypsin, kristallisiert, reinst), die, 900 mg Penta-Boc-Trypsin-Kalükrein-Inhibitor wer-

vorher ermittelt, in 30 Minuten bei 37°C BΑΡΛ zu- den mit 625 mg (1,3 mMol) HCl-H-GIu(OBu')-

Glu(OBut)-OBut analog Beispiel 1 umgesetzt. Nach Glu(Oüu*)-Asp(OBut)-OBut analog Beispiel 1 umBehandlung mit Trifluoressigsäure und anschließender gesetzt. Nach Behandlung mit Trifiuoressigsäui e wer-Dialyse werden 770,4 mg Rohsubstanz gewonnen. den 1,266 g Rohsubstanz gewonnen, die in 0,1 m 500 mg dieser Rohsubstanz werden wie bei Beispiel 1 Essigsäure über Sephadex G 25® (200 χ 4-cm-Säule) gereinigt. Ausbeute 382 mg einer reinen Fraktion. 5 Chromatographien werden. Ausbeute 727 mg einer

Aminosäureanalyse: Verhältnis GIy zu GIu = 6:14,6 reinen Fraktion,

(theoret. 6:13). Aminosäureanalyse: Verhältnis GIy zu GIu zu Asp

= 5,5:13,6:10,0 (theoret. 6 :13 :10). Beispiel 3

Trypsin-Kallikrein-Inhibitor-penta-(Glu-Glu-Glu-OH) ¹⁰ Beispiele

Trypsin-Kallikrein-lnhibitor-penta-(Asp-Glu-Asp)

900 mg Penta-Boc-Trypsin-Kallikrein-Inhibitor werden mit 867 mg (1,3 mMol) HCl · H-GIu(OBu¹)- 900 mg Penta-Boc-Trypsin-Kallikrein-Inhibitor wer-Glu(OBut)-Glu(OBut)-OBut analog Beispiel 1 um- den mit 830 mg (1,3 mMol) HCl · H-Asp(OBu⁴)-gesetzt. Nach Behandlung mit Trifluoressigsäure 15 Glu(OBu^l)-Asp(OBut)-OBut analog Beispiel 1 umwerden 1,355 g Rohsubstanz gewonnen, die in 0,1 m gesetzt. Nach Behandlung mit Trifluoressigsäure wer-Essigsäure über Sephadex G 25® (200 χ 4-cm-Säule) den 1,25 g Rohsubstanz gewonnen, die in 0,1m Chromatographien werden. Ausbeute 674,9 mg einer Essigsäure über Sephadex G 25® (200 X 4-cm-Säule) reinen Fraktion. Chromatographien werden. Ausbeute 628,4 mg einer Aminosäureanalyse-.Verhältnis GIy zu GIu = 6:18,3 20 reinen Fraktion.

(theoret. 6:18). Aminosäureanalyse: Verhältnis GIy zu GIu zu Asp

B e i s ρ i e 1 4 = 6,0: 8,0:15,1 (theoret. 6:8:15).

Trypsin-Kallikrein-Inhibitor-penta-

(Glu-Glu-Glu-Glu-OH) ^ Bei. ρ ie 19

900 mg Penta-Boc-Trypsin-Kallikrein-Inhibitor wer- Trypsin-Kaüikrein-Inhibitor-penta (G Iu-Asp-Glu-Asp)

den mit 1,11g (1,3 mMol) HCI-H-GIu(OBu¹)- ^{}y v} * ^VJ

GIu(OBUt)-GIu(OBUt)-GIu(OBUt)-OBu¹ analog Bei- 900 mg Penta-Boc-Trypsin-Kallikrein-Inhibitor wer-

spiell umgesetzt. Nach Behandlung mit Trifluor- den mit 1,07 g (1,3 mMol) HCl-H-GIu(OBu¹)-

essigsäure werden 1,15 g Rohsubstanz gewonnen, die 30 ASp(OBUt)-GIu(OBUt)-ASp(OBUt)-OBu¹ analog Bei-

in 0,1 m Essigsäure über Sephadex G 25® (200 X 4cm- spiel 1 umgesetzt. Nach Behandlung mit Trifluor-

Säule) Chromatographien werden. Ausbeute 745 mg essigsäure werden 1,54 g Rohsubstanz gewonnen, die

einer reinen Fraktion. in 0,1m Essigsäure über Sephadex G 25® (2C0 χ 4-cm-

Aminosäureanalyse: Verhältnis GIy zu GIu = 6:23,4 Säule) Chromatographien werden. Ausbeute 634 mg

(theoret. 6: 23). 35 einer reinen Fraktion.

Aminosäureanalyse: Verhältnis GIy zu GIu zu Asp

B e i s ρ i e 1 5 = 5,7 :13,0:15,6 (theoret. 6:13:15).

Trypsin-Kallikrein-Inhibitor-penta-asparaginsäure

900 mg Penta-Boc-Trypsin-Kallikrein-Inhibitor wer- 4° B e i s ρ i e 1 10

den mit 365 mg (1,3 mMol) HCl-H-ASp(OBu¹)- Trypsin-Kallikrein-Inhibitor-penta-(Glu-D-Glu-OMe) OBu¹ analog Beispiel 1 umgesetzt. Nach Behandlung

mit Trifluoressigsäure werden 1,083 g Rohsubstanz 900 mg Penta-Boc-Trypsin-Kallikrein-Inhibitor wer-

gewonnen, die in 0,1 m Essigsäure über Sephadex den mit 597 mg (1,3 mMol) HCl · H-GIu(OBu¹)-G 25® (200 χ 4-cm-Säule) Chromatographien wer- 45 D-Glu(OBut)-OMe (J. Chem. Soc. Perkin I, 1972, den. Ausbeute 707,6 mg einer reinen Fraktion. S. 1) analog Beispiel 1 umgesetzt. Nach Behandlung

Aminosäureanalyse: Verhältnis GIy zu GIu zu Asp mit Trifluoressigsäure weiden 1,2 g Rohsubstanz = 6: 3,2:10,5 (theoret 6:3:10). gewonnen, die in 0,1 m Essigsäure über Sephadex

G 25® (200 χ 4-cm-Säule) Chromatographien werden Beispiel6 5° Ausbeute 654 mg einer reinen Fraktion.

_. . „ .... . _T ,.,.. ,. in,, A™.nm Aminosäureanalyse:VerhältnisGIyzuGIu = 6:13,1

Trypsin-Kalhkrein-Inhibitor-penta-(Glu-Asp-OH) (theoret 6 -13)

900 mg Penta-Boc-Trypsin-Kallikrein-Inhibitor wer den mit 610 mg (1,3 mMol) HQ · H-GIu(OBu*)- B e i s ρ i e 1 11

Asp(OBut)-OBu* analog Beispiel 1 umgesetzt Nach 55 Trypsin-KaUikrein-Inhibitor-penta(Asp-Glu-NHi) Behandlung mit Trifluoressigsäure werden 1,1 g Rohsubstanz erhalten, die in 0,1 m Essigsäure über 900 mg Penta-Boc-Trypsin-Kallikrein-Inhibitor wei Sephadex G 25® (2COx 4-cm-Säule) chrornatogra- den mit 533 mg (1,3 mMol) HCl · H-ASp(OBu*] phiert werden. Ausbeute 759,3 mg einer reinen Frak- Glu(OBu*)-NH₂ (gewonnen durch katalytische Hj tion. 60 driening von Z-Asp(OBu*)-Glu(OBu*)-NH₂, das i Aminosäureanalyse: Verhältnis GIy zu GIu zu Asp J. Chem. Soc. C [1968], S. 531 beschrieben ist) anale = 6,0: 8,5:10,5 (theoret 6:8:10). Beispiel 1 umgesetzt Nach Behandlung mit Trifluo:

essigsaure werden 1,18 g Rohsubstanz gewonnen, d B e i s ρ i e 1 7 in 0,1 m-Essigsäure über Sephadex G 25 ® (200 χ 4-cn

900 mg Penta-Boc-Trypsin-Kallikrein-Inhibitor wer- Aminosäureanalyse: Verhältnis GIy: GIu: Asp

den mit 848 mg (1,3 mMol) HCl · H-GIu(OBu*)- = 6,0: 8,6:10,3 (theoret 6:8:10).

Beispiel 12
Trypsin-Kallikrein-Inhibitor-penta (Asp-Ser-Asp-OH)

900 mg Penta-Boc-Trypsin-Kallikrein-Inhibitor werden mit 702 mg (1,3 mMol) HCl · H-Asp(OBut)-Ser-Asp(OBut)-OBut (J. Chem. Soc. C, Org., 1969, S. 2218) analog Beispiel 1 umgesetzt. Nach Behandlung mit Trifluoressigsäure werden 1,3 g Rohsubstanz erhalten, die in O.lm-Essigsäure über Sephadex G 25® (200 χ 4-cm-Säule) chromatographiert werden.

Ausbeute 710 mg einer reinen Fraktion.

Aminosäureanalyse: Verhältnis Gly:Asp:Ser = 6:15,5 : 4,9 (theoret. 6:15: 6).

Herstellung der Ausgangssubstanzen
a. Z-Glu(OBut)-Glu(OBut)-OBut

10,4 g (20 mMol) Z-GIu(OBUt)-OH · DCHA werden a° zwischen 100 ml Äther und 20 ml 1 n-H_;!SO₄ bei 0°C verrührt. Die Atherphase wird mit Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wird in 50 ml Dimethylformamid gelöst. Zu dieser Lösung gibt man 5,91 g (20 mMol) HCl · H-Ghi(OBut)-OBut, *₅ 2,7 g (20 mMol) HOBt, 2,6 ml N-Äthylmorpholin und bei 0⁰C 4,4 g DCC (als Dimethylformamid-Lösung) Man rührt IStunde bei 0⁰C, 2 Stunden bei Raum-S^^{IM Üb N}

Q₉H₆₁N₃O₁₂ (763,94):
^Sdi? '.'.'. C S

2 8A' N

d. HCl · H-GlufOButVGluiOBu^-GlufO'Bu'VOBu» £ ⁶™^Μί> ^Z" °^lu((?^Bu ^HOf n '>

15

S^AnH^t H H^Cti· ^ ^Rtr^temperatUr

stehen. Anderntags wird der Niederschlag abgesaugt

und das Filtrat eingeengt Der Rückstand wird in Essigester gelost und die Lösung nacheinander mit NaHCO₃-Lösung, KHSO.-Lösung, NaHCO₃-Lösung und Wasser gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wird in Essigester über etwa 30 g basisches Al₂O₃ (Woelm Aktivstufe I) ^G !»(01 u')-OBu» werden in M -thanol wie be. b. kat» ^{!ytlSch hyUnert}- ^{Ausbeute 4}-8 g Öl (95 %).
C₃₁H₅₅N₃O₁₀ · HCl (666 3)

^e· Z-GIu(OBUt)-GIu(OBUt)-GIu-(OBu¹)-Glu(OBu^l)-OBut

Zu einer Lösung von 3,9 g (5,85 mMol) HCl · H-GIu(OBu¹) - GIu(OBu⁴) - GIu(OBu⁴) - OBu¹, 0,79 {

⁽⁵·^{85 mMoI}> ^{H0Bt und} °'^{76 ml} (⁵>^{85 mMol}> N-Äthylmorpholin in 50 ml Dimethylformamid gibt mar 3,05 g (5,85 mMol) Z-Glu(OB_Ut)-OTcp. Man rühri IStunde bei Raumtemperatur und arbeitet wie be _c. auf. Ausbeute 4,75 g (86%\ Schmp. 119 bis 120<C [*]? = -29,1° (c = 1, Methanol).

QsH₇₆N₄O₁₅ (949,2):

Berechnet C 60 75 H 8 08 N S 91 ·
gefunden ' C 60 6 H 8 0 N 5 8 '

^f- ^HC1 · H-Glu(OBut)-Glu(OBut)-Glu(OBu')-Glu(OBut)-OBu⁴

⁴'⁴ S (4'^{63 mM}°n Z-GlU(OBUt)-GlU(OBUt)-GIu(OBUt-GIu(OBUt)-OBUt werden wie bei b. in Methanol katalytisch hvdriert

Ausbeute 3 85 ε öl ί98°/ϊ '

70N₄O₁₃ · HCl (851,5).

^g· ^ζ"^Ο!ι1(^οΒ"^ι)-Α5ρ(ΟΒιι')-ΟΒ·α'

Nach eimger Zeit knstalhs.ert das öl, Schmp. 88⁰C

Berechnet ... C 62,26, H 8,01 N 4 84·
gefunden ... C 62,3, H 8,1, N 5,1. '

thaYof SSfSr ÄS^veSund Ä Hilfe eines Autotitrators unter Zugabe von 2 η meS nolischer HQ bei pH 4,5 hydriert. Nach beendeter Hydrierung wird de? Ka'talysator abg^gt^d £s Fütrat eingeengt Ausbeute 7,3 g öl (91 %)

C_nH₁₀N₁O₇ - Ha (481,04).

c. Z-Glu(OBut>Glu(OBut)-Glu(OBat)-OBut
Zu einer Lösung von 6,2 g (12.9 mMol) HQ · H-rührt. Die Ätherphase wird einmal mit Wasse. S^ewascnen. mit Natriumsulfat getrocknet und ein-

_{geengt Der} R_{ückstand wird in 2OO}mi Dimethyl-

formamid gelöst. Zu dieser Lösung gibt man 28,1 g ^⁰-^{1 Mo1}) HCl · H-Asp(OBut)-OBut, 13,5 g HOBI (0,1 Mol), 13 ml N-Äthylmorpholin (0,1 Mol) und bei « O⁰C 22 g DCC (als Dimethylformamid-Lösung). ^{Man verfährt} nun wie bei a. Der Rückstand kristalli-

gunfw^rl L Sh t ^? S^
so f^nt T ■ ^^Stan? ^{m Ather}

Methanol)
Q₉H₄₁N₁O, (564,7):

^Berechnct ... C61,70, H7,86, N4,96;
" ' ^{C 61}'⁷' ^{H 7}'⁸' ^{N 4}'⁹'

Dimethylformamid gibt man 6,65 g (12,9 mMol) 60 ³⁴>5g (62 mMol) ZGIu(OBu^ASp(OBU)OBu

Z-GIu(OBUt)-OTCp, läßt 5 Minuten rühren und engt werden wie bei b. in Methanol katalytisch hydriert.

am Hochvakuum ein. Der Rückstand wird in Ausbeute 29,3 g öl (100%).

Essigester gelöst und wie bei a. ausgeschüttelt

Nach Trocknen über Natriumsulfat wird eingeengt QiH₃₈NjO₇ · HQ (467,01).

und der Rückstand mit Petroläther verrieben. Es

wird auf 0⁰C abgekühlt und abgesaugt

fX ³ T&Ä

- 1, Methanol).

« ™ W B (26,7 mMol) HQ · H-tVAsp(OBut)-OBut, 3,6 g (26,7 mMoO HOBt,

3,5 ml (26,7 mMol) N-Äthylmorpholin in 100 ml Dimethylformamid gibt man bei Raumtemperatur 13,82 g (26JmMoI) Z-Glu(OBu^l)-OTcp. Man läßt 1 Stunde stehen und arbeitet wie bei c. auf. Ausbeute 24,7 g öl. Zur weiteren Reinigung wird das öl in Äther gelöst über 75 g basisches Al₂O₃ chromatographiert. Ausbeute 17,65 g amorphe Masse (88 %). [λ]? = -23,9° (c = 1, Methanol).

C₃₈H₆₉N₃O₁₂ (749,9):

Berechnet ... C 60,86, H 7,93, N 5,61;
gefunden ... C 60,3, H 7,9, N 5,6.

n. HCl ■ H-GIu(OBUt)-ASp(OBUt)-GIu(OBu⁴)-Asp(OBut)-OBut

7 g (7,6 mMol) Z-GIu(OBUt)-ASp(OBUt)-GIu(OBUt)-Asp(OBu^l)-OBut werden analog b. in Methanol katalytisch hydriert.

Ausbeute 6,1 g amorphe Substanz: (97,5%).

ίο C₃₈H₆₆N₁O₁₃ · HCl (823,4).

j. HCl-17 g (22,7 mMol)

Z - GIu(OBu¹) - Glu(OBut) · Asp(OBu^l)-OBut
werden analog b. in Methanol katalytisch hydriert. Ausbeute 14,34 g amorphe Masse (97 %).
C₃₀H₅₃N₃O₁₀ · HCl (652,2).
k. Z-Asp(OBut)-Glu(OBut)-Asp(OBu'}-OBut

Zu einer Lösung von 12,5 g (26,7 mMoi) HC! · H-G u(OBut)-Asp(OBut)-OBut und 3,5 ml (.16,7 mMol) N Äthylmorpholin in 100 ml Dimethylformamid gibt man 11,25 2 (26,7 mMol) Z-Asp(OBut)-ONSu und läßt etwa 20 Stunden bei Raumtemperatur reagieren. Aufgearbeitet wird analog c. Der Rückstand (18,4 g öl) wird zur Reinigung in Äther gelöst und über 50 g basisches Al₂O₃ chromatographiert.

Ausbeute 13,4 g amorphe Substanz (68%).
[χ]? = -23,9° (c = 1, Methanol).

C₃₇H₅₇N₃O_n (735,9):

Berechnet ... C 60,4, H 7,81, N 5,71;
gefunden ... C 60,0, H 7,1, N 5,6.

1. HCl · H-ASp(OBUtVGIu

12,8 g (17,4 mMol) Z-Asp(OBut)-Glu(OBut)-Asp(OBut)-OBut werden analog b. in Methanol katalytisch hydriert.

Ausbeute 10,4 g amorphe Substanz (94%).

C₂₉H₅₁N₃O₁₀ · HCl (638,2).

m. Z-Glu(OBu⁴)-Asp(OBu⁴)-Glu(OBu⁴)-ASp(OBUt)-OBu*

o. Penta-Boc-Trypsin-Kallikrein-Inhibitor

α) 1,3 g Trypsin-Kallikrein-Inhibitor werden in 10 ml Wasser gelöst. Dazu gibt man 50 ml Dimethylformamid und 4,4 ml ges. NaHCO₃-Lösung. Nun gibt man 430 mg Boc-ONSu zu, rührt 1 Stunde bei Raumtemperatur und läßt über Nacht stehen. Andern-

ao tags wird mit 2 η-Essigsäure auf pH 5 angesäuert. Die klare Lösung wird im Hochvakuum eingeengt. Der Rückstand wird mit Wasser verrieben, abgesaugt, mit Wasser gut gewaschen und getrocknet. Mit Essigester wird nochmals verrieben, abgesaugt und getrock-

»5 net. Ausbeute 880 mg.

Die Papierelektrophorese ergab im sauren Medium eine einheitliche Substanz, die vom Trypsin-Kallikrein-Inhibitor verschieden war.
ß) 1,3 g Trypsin-Kallikrein-Inhibitor werden in 20 ml Dimethylformamid suspendiert. Dazu gibt man 270 mg HOBt, 480 mg Boc-ONp und 0,14 ml l.r,4.4'-Tetramethylguanidin. In mehreren Portionen werden noch 0,7 ml l.l',4.4'-Tetramethylguanidin und 480 mg Boc-ONp zugegeben. Man rührt insgesamt 2 Tage bei Raumtemperatur, engt ein und verrührt den Rückstand mit Essigester. Der Niederschlag wird mit Methanol verrieben und abgesaugt. Ausbeute 950 mg. Das gewonnene Produkt ist papierelektrophoretisch identisch mit der nach «) gewonnenen Substanz.

γ) 7 g Trypsin-Kallikrein-Inhibitor werden in 77 ml Wasser gelöst. Dazu gibt man 315 ml Dimethylformamid, 24 ml ges. NaHCO₃-Lösung und 14 ml Boc-azid. Man rührt 5 Stunden bei 35° C. Mit 2 η-Essigsäure wird auf pH 5 angesäuert und engt im Hochvakuum ein. Der Rückstand wird mit Wasser verrieben und abgesaugt. Ausbeute 6,5 g. Das gewonnene Produkt isi papierelektrophoretisch identisch mit der nach a.) gewonnenen Substanz.

Zu einer Lösung von 6,4 g (10 mMol) HCl · H-Asp(OBu⁴) - GIu(OBu⁴) - Asp(OBu⁴) - OBu⁴, 1,35 g (10 mMol) HOBt und 1,3 ml (10 mMol) N-Äthylmorpholin in 40 ml Dimethylformamid gibt man 5 g (10 mMol) Z-Glu(OBu⁴)-OTcp, läßt 1 Stunde bei Raumtemperatur rühren und arbeitet analog c. auf. Der Rückstand wird mit Petroläther verrieben. Ausbeute 7,4 g (80%), Schmp. 196°C. [«]? = -24,6° (c = 1, Methanol).

C«,H₇₂N,C

Berechnet... C 59,98, H 7,88, N 6,08; Befunden ... C59,6, H7,8, N6,1.

Abkürzungen

Boc = tert.-ButyloxycarbonyL

Z = BenzyloxycarbonyL OBu⁴ = tert-Butylester, ONp = 4-Nitrophenylester, ONSu = N-Hydroxysuccmimidester, OTcp = 2.4.5-Trichlorpheaylester, DCHA = Dicyclohexylamin, DCC = Dicyclohexylcarbodiimid, HOBt = 1-Hydroxybenzotriazol.

Claims (1)

ι 2 η ♦ »ο „,„-,λ bedeuten kann, in Gegenwart von 1-Hydroxy- ratentansprucne. benzotriazol und DiQrcIohexylcarbodiimid um-

1. Derivate des basischen Trypsin-Kallikrein- setzt und anschließend die Schutzgruppen sauer

inhibitors aus Säugerorganen, worin die fünf vor- abspaltet.

handenen Carboxylgruppen des Peptidmoleküls 5 3. Pharmazeutische Zubereitungen für Injek-

amidartig durch Peptidreste der allgemeinen For- tioas- und Infusionszwecke, gekennzeichnet durch

mel I verlängert sind, einen Gehalt an einer Verbindung nach Anspruch 1.