DE2344886B2

DE2344886B2 - Synthetisch modifizierte derivate des basischen trypsin-kallikrein-inhibitors aus saeugetierorganen und verfahren zu ihrer herstellung

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Publication number: DE2344886B2
Application number: DE19732344886
Authority: DE
Inventors: Wolfgang Dr. 6238 Hofheim; Zwisler Oswald Dr. 3550 Marburg; Guthörlein Gerhard Dr. 3554 Cappel König
Original assignee: Hoechst AG
Current assignee: Hoechst AG
Priority date: 1973-09-06
Filing date: 1973-09-06
Publication date: 1976-08-12
Also published as: CA1030524A; ES429700A1; JPS5052081A; AU7296374A; BE819639A; SE414172B; EG11583A; GB1462493A; CH608787A5; NL7411563A; FR2242992A1; ATA716374A; DE2344886A1; AT339472B; FR2242992B1; SE7411157L; US3953417A

Description

in der X für die Zahl O bis 10 steht, Y Wasserstoff oder einen geradkettigen oder verzweigten In verschiedenen Säugerorganen, besonders in Alkylrest mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, der ge- 15 Rjnderluiige, ist ein Trypsin-Kallikrein-Inhibitor entgebenenfaDs durch eine Carboxyl-, Hydroxyl- halten, der auf verschiedene Weise hieraus isoliert oder Carbonamidgruppe substituiert ist, wobei werden kann und der, in reiner Form, seit über der Rest 15 Jahren als polyvalenter Proteinasen- und Esterasen-NH — CH — CO Inhibitor mit großem Erfolg als Therapeutikum bei I so Enzymentgleisung eingesetzt wird. Y Dieser rrypsin-Kallikrein-Inhibitor ist ein basisches

Polypeptid mit einem Molekulargewicht von 6500

auch den Prolin-Rest bedeuten kann, und wobei und einein isoelektrischen Punkt von etwa 10,5. Er Y, falls X — 0 ist, besteht aus einer einzigen Peptidkette von 58 Amino-

35 säuren, ceren Primärstruktur aus Biochemical and

— CH₁COOH Biophysical Research Communication, Bd. 20, S. 463 oder bis 468 (.965) bekannt ist und die durch 3 Disulfid-

— CH, — CH* — COOH brücken \ ernetzt ist.

Der hDhe therapeutische Wert des Inhibitors

bedeutet und falls X für die Zahler, 1 bis 10 steht, 30 beruht darin, verschiedene Proteinasen und Esterasen, zumindest eine Seitenkette Y wie Trypsin, Chymotrypsin, Kathepsin, Plasmin und

Kallikreiii zu hemmen. Hierzu werden, hauptsächlich

—'CH, — COOH intravenös, bisweilen erhebliche Mengen des Inhi-

oder bitors injiziert. Hierbei ist zu beobachten, daß der

— CH, — CH, — COOH 35 Inhibitor nach relativ kurzer Zeit bevorzugt in der

Niere des Versuchstieres oder des Menschen gespei-

darstellt, worin weiterhin W —OH bedeutet, chert wird. Es wird heute angenommen, daß dies doch bei Anwesenheit von mindestens zwei darauf beruht, daß das stark basische Inhibitormole-Carboxylgruppen in den Seitenketten auch kül auf unspezifische Weise an saure Mukopoly-

40 saccharide oder Nukleinsäuren gebunden wird. Ledig-

— NH₁, NH-CH₃, lieh 1,5°; des nativen Inhibitors werden mit dem NH c,H , OCH Urin ausgeschieden; um eine Ausscheidung der überwiegenden Restmenge zu ermöglichen, wird vom

^oder Organismas zuerst je eine amino- und carboxyl-

OC₂H₅ 45 ständige Aminosäure (Arginin bzw. Alanin) abge

baut, der Inhibitor aggregiert zu einer höher molebedeuten kann. kularen Form und wird dann erst sehr langsam aus

1 Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Niere ausgeschwemmt.

nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Versuche mit chemisch modifiziertem Inhibitor,

aian den Trypsin-Kallikrein-Inhibitor, dessen fünf 50 bei dem über alle freien Aminogruppen eine Maleoyl-

primäre Aminogruppen durch sauer leicht abspalt- gruppe eingeführt worden war, und der sich als inak-

bare Schutzgruppen geschützt sind, mit Amino- tiv bewies, haben gezeigt, daß diese Substanz, deren

säuren oder Peptiden der allgemeinen Formel II, isoelektrisoher Punkt wesentlich erniedrigt war, sehr

NH,-CH-CO—/NH-CH-CO-\ W' ^vie' ^rascner aus der Niere ausgeschwemmt wurde

j / ι 1 (JJ) SS und mit dem Urin ausgeschieden werden konnte.

Y \ γ / ^^m biologisch voll wirksamer Inhibitor, der einen

^ ^lx niedrigeren I. P. aufweist, wäre deshalb von erheb-

in der Y und X die angegebene Bedeutung haben, lichem W;rt. Es ist nun prinzipiell möglich, durch

vorhandene Carboxylgruppen in Y jedoch als Acylierung der freien Aminogruppen die positiven

Iert.-Butylester vorliegen, W' tert.-Butoxy bedeu- 60 Ladungen zu verringern und so den isoelektriichen

tet, doch bei Anwesenheit von mindestens 2 tert.- Punkt zu senken. Bei allen diesen Umsetzungen wird

Butylestergruppen in den Seitenketten auch aber ein ia der Aktivität zumindest abgeschwächtes,

wenn nicht: sogar inaktives Reaktionsprodukt erhalten,

— NHj, — NH — CH₃, da die 5 A minogruppen des Moleküls 4 gleichberechjsjH CH, OCH ⁶5 ^ι'6^1εη «-Aminogruppen des Lysins und 1 A-Amino-

^{s> a} gruppe zuzuordnen sind, andererseits aber das an

^ocier der Pos. 15 befindliche Lysin entscheidend für die

— OC₂H₅ inhititorisirhe Wirkung der Substanz ist. Eine Sub-

stituierung der Aminogruppe des Lysin 15 bewirkt bei Anwesenheit von mindestens 2 tert-Butylesterckn Verlust der biologischen Aktivität gruppen in den Seitenketten auch

Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß durch Verlängerung der 5 vorhandenen Carboxyl- — NH_t, — NH — CH„

gruppen mit sauren Peptiden die Aktivität des Inhi- 5 _^y qu _OCH,

bitors nur wenig oder nicht verändert wird, dagegen ^s>

aber durch Senkung des isoelektrischen Punktes der oder modifizierte Inhibitor viel rascher aus der Niere aus- — OC₄H₅

geschieden wird als das nicht modifizierte Molekül.

Gegenstand der Erfindung sind somit halbsyntJae- 10 bedeuten kann, in Gegenwart von 1-Hydroxybenzotisch hergestellte Derivate des basischen Trypsin- triazol und Dicyclohexylcarbodümid umsetzt und Kallikrein-Inhibitors aus Säugerorganen, dadurch anschließend die Schutegruppen sauer abspaltet gekennzeichnet, daß die 5 vorhandenen Carboxyl- Um den Trypsin-Kallikrein-Inhibitor an seinen gruppen des Peptidmoleküls amidartig durch Pepüd- Carboxylgruppen modifizieren zu können, werden reste der allgemeinen Formel I verlängert sind, 15 zweckmäßig die Aminogruppen durch sauer leicht

abspaltbare Aminoschutzgruppen, wie z.B. tert-

-NH-CH-CO-/NH-CH-CO-X W Alkoxycarbonylgruppen blockiert Die Einführung

I I j (I) der häufig verwendeten Boc-Gruppen gelingt auf

Y \ Y Ix verschiedenen Wegen. Sowohl mit Boc-azid als auch

ao mit Boc-activestern, wie z.B. dem p-Nitrophenyl-

in der X für die Zahl O bis 10 steht Y Wasserstoff ester oder dem K-Hydroxysuccinimidester lassen ach oder einen geradkettigen oder verzweigten Alkylrest die Boc-Gruppen einführen. In allen Fällen entsteht mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, der gegebenenfalls ein papierelektrophoretisch einheitliches Produkt durch einen Carboxyl-, Hydroxyl- oder Carbonamid- Diese N-geschützten Verbindungen werden in Angruppe substituiert ist wobei der Rest 25 Wesenheit von 1-Hydroxy-benzotriazol und Dicyclo-

hexylcarbodiimid mit einer Verbindung der allgemei-

NH — CH — CO nen Formel II in Dimethylformamid oder Dimethyl- I acetamid umgesetzt. Mit Trifluorecsigsäure oder

γ HCl/Eisejsig werden die Schutzgruppen abgespalten

30 und das Rohprodukt entweder dialysiert oder über

auch den Prolin-Rest bedeuten kann, und wobei Y, Sephadex G 25«, einem vernetzten Dextrangel, chrofalls X = O ist, matographiert. Es empfiehlt sich das dialysierte Pro

dukt zur weiteren Reinigung ebenfalls über Sepha-

— CH₈COOH dex G 25® zu chromatographieren oder aber einer oder 35 Verteilungschromatographie an Sephadex LH 20 ,

-CH₈-CH₈-COOH einem vernetzten alkylierten Dextrangel, zu unter

werfen. .

bedeutet und falls X für die Zahlen 1 bis 10 steht, Um den isoelektrischen Punkt des Trypsin-Kalli-

zumindest eine Seitenkette Y krein-Inhibitors zu senken, muß der ankondensierte

40 Aminosäure- oder Peptidrest mindestens zwei Carb-

— CH. — COOH oxylgruppen besitzen. Unter den natürlich vorkom- oder menden Aminosäuren kommen nur Asparaginsäure

-CH₄-CH₉-COOH und Glutaminsäure in Frage. Bei Dipeptiden und

höheren Peptiden ist es möglich, neben den sauren

darstellt, worin weiterhin W-OH bedeutet, doch 45 Aminosäuren auch andere aliphatische Aminosäuren, bei Anwesenheit von mindestens zwei Carboxyl- wie z.B. Glycin, Alanin, Leucin, Valin Isoleucn, gruppen in den Seitenketten auch Serin, Threonin, Asparagin, Glutamin oder Proto

^{B 1}^ einzubauen. Vorzugsweise werden aber auch bei

-NH, NH-CH₃ höheren Peptiden Asparaginsäure und Glutamin-

x,τ, V, _u nru 50 säure als Peptidbausteine verwendet. Sind zwei oder

NH — C₄H₅ — UL-M_{3 menr} carboxylgruppen in dem anzukondensierenaen

oder Pepüd in Form der tert-Butylester vorhanden, kön-

nr H nen weitere Carboxylgruppen in Form von Amiden

^ ⁶ oder Alkylestern vorliegen. Nach derjauren Behandbedeuten kann, sowie ein Verfahren zur Herstellung 55 lung mit Trifluoressigsäure oder «"·«·—— dieser Peptide, das dadurch gekennzeichnet ist, daß kommt man auf diese Weise "

Zunahme des sauren Charakters bei den biDrit

Zunahme des sauren Charakters bei g NH-CH-CO-/NH-CH-CO-N W' gemäß hergestellten Inhibitor-Derivaten wurde del NH₁₁ CH L-U /rsM lh \ B_{ative Inhibitor und modifizierte} Präparate de,

I ClllttFl

_{ative Inhibitor und modifizierte} p

ν I γ / Mikrozonen-elektrophorese auf Celluloseacetat-FolK

^{Y x /A} 65 im Diäthyl-Barbituratpuffer von pH 8,6 unterworfen

in der Y und X die angegebene Bedeutung haben, Der native Inhibitor wandert hierbei zur Kathode

Vd Cble i Y jdh Ils tert während die modifiziert«, ™£«%*J?^^

in der Y und X die angegebene Bedeutung haben, Der n

Vorhandene Carboxylgruppen in Y jedoch Ils tert, während die modifiziert«, £%J?^^ Butylester vorliegen, W' tert.-Butoxy bedeutet, doch «zierender Gruppe mehr oder weniger weit zu Anode wandern. Für den nativen Inhibitor beträgt sammengebracht eine bestimmte Extinktion bei

dir kathodische Wanderungsstrecke etwa 3 mm. Für 405 πιμ bewirkt, mit steigenden Mengen des Inhi-

die modifizierton Präparate, wobei die modifizierende bitors im konstanten Volumen zusammen inkubiert

Gruppe in den einzelnen Fällen eine, zwei, drei oder wird. Nach 30 Minuten Vorinkubation wird die

vier saure Aminosäuren enthalt betragen die an- s Standardmenge BAPA zugesetzt Die Reaktion wird

odischen Wanderungsstrecken etwa 1,5 mm, 8 mm, nach 30 Minuten BAPA-Inkubation bei 37³C durch

13,5 mm und 17 mm. Zusatz von verdünnter Essigsäure gestoppt und die

Die Modifizierung des Inhibitors führt demnach aufgetretene Gelbfärbung gemessen. Trägt man in

zu Präparaten, deren basischer Charakter vermin- einem Diagramm die zugesetzten Inhibitormengen

dcrt und saurer Charakter vermehrt ist Die Modi- io gegen die entsprechenden Extinktions-Werte auf, so

fiziennjg mit einer Gruppe, die eine einzige saure erhält man eine Kurve, aus der leicht ermittelt werden

Aminosäure enthält führt bereits zu einer solchen kann, welche Inhibitormenge die stets konstant zu- Eroiedrigsng des isoelektrischen Punktes, daß bei gesetzte Trypsinmenge in ihrer Wirkung um die Hälfte

pH 8,6 der saure Charakter genngfügig den basischen zu hemmen imstande war. Da bekannt war, welche

Charakter überwiegt 15 Aktivität bzw. Menge Trypsin zugesetzt wurde, kann

Die aus dec Dissoziationskonstanten der funktio- zurückgerechnet werden, wieviel Milligramm des

netten Gruppen des Inhibitors und seiner erfindungs- Inhibitors wieviel Trypsin zu hemmen imstande waren.

gemäß hergestellten Derivate schätzbaren isodek- In diesem Test sind etwa 1 mg des modifizierten

frischen Punkte betragen für den nativen Inhibitor Inhibitors in der Lage, etwa 3 mg Trypsin zu inakti-

etwa 10,5 und für modifizierte Präparate, wobei die 20 vieren.

modifizierte Gruppe eine, zwei, drei oder vier saure Der erfindungsgemäß modifizierte Trypsin-Kalli-

Aminosäuren enthält etwa 8,6, 5,1, 4,8 und 4,6. krein-Inhibitor dient als Arzneimittel bei Blutungen

Zum fiuoreszenz-mikroskopischen Nachweis der als Folge einer überschießenden Fibrinolyse; so z. B. Nierenspeicherung von Inhibitor und modifiziertem in der Chirurgie bei Prostatablutungen oder Wund- Inhibitor wurden jeweils 3 Kaninchen mit einem 25 heilungsstörungen, in der Inneren Medizin als Zusatz- Gewicht von 2,5 kg jeweils zur gleichen Zeit mit therapie bei Hämophilen, in der Gynäkologie bei 20 mg nativem bzw. 20 mg erfindungsgemäß modi- Placenta praevia, intrauterinem Fruchttod und ato- fizierten Inhibitor intravenös injiziert Nach 2 Tagen nischem Nachbluten und zur Prophylaxe bei Opera- wurden die Nieren entnommen, geschnitten und mit tionen an parenchymatösen Organen und bei Prosta- einem fiuoreszeinmarkierten y- Globulin -Präparat 30 tectomien und Fettembolien.

inkubiert das aus dem Antiserum von Kaninchen Die neuen erfindungsgemäßen Arzneimittel werden gewonnen worden war, welche vorher mehrere Male in steriler isotonischer Lösung intravenös injiziert mit Inhibitor und Adjuvans nach Freund zur oder im Dauertropf nach Verdünnen in Infusions- Steigerung der Antikörperbildung geimpft worden lösungen wie z. B. physiologischer Kochsalzlösung waren. 35 gegeben.
Hierbei bot sich unter dem Fluoreszenz-Mikroskop
folgendes Bild: Beispiel 1

AUe Nierenschnitte der mit dem nativen Inhibitor Trypsin-Kallikrein-Inhibitor-penta-L-glutaminsäure
behandelten Tiere zeigten über das gesamte Gesichtsfeld verteilt große, zum Teil konfluierende fluores- 40 Zu einer Suspension von 900 mg Penta-Boc-Tryp- zierende Steller, während die Schnitte aus den Nieren sin-Kallikrein-Inhibitor, 386 mg (1,3 mMol) HCl-H- derjenigen Tiere, die den modifizierten Inhibitor GIu(OBuO-OBu¹, 175 mg (1,3 mMol) HOBt und erhalten hatten, meistens keine Fluoreszenz zeigten 0,17 ml (1,3 mMol) N-Äthylmorpholin in 10 ml Di- und nur in einigen wenigen Fällen kleine leuchtende methylformamid gibt man bei O⁰C 284 mg DCC und Stellen enthielten. Dieser Versuch zeigte auf eindeu- 45 rührt 1 Stunde bei 0°C und 24 Stunden bei Raum- tige Weise, daß der Inhibitor, dessen isoelektrischer temperatur. Der Niederschlag wird abgesaugt_ und Punkt gesenkt ist weitaus weniger bis gar nicht in das Filtrat eingeengt. Der Rückstand wird mit Äther der Niere gespeichert wird. verrieben und getrocknet. Ausbeute 1,39 g.

In Vorvenuchen wurde durch Doppeldiffusion Die so gewonnene Substanz wird in 10 ml Trifluor-

noch festgestellt daß das verwendete Antikörper- 50 essigsäure gelöst. Man läßt 30 Minuten bei Raum- Präparat nicht nur gegen den nativen Inhibitor, son- temperatur stehen und engt anschließend im Vakuum dem auch dessen erfindungsgemäße Umsetzungspro- ein. Der Rückstand wird mit Äther verrieben und dukte reagierte. abgesaugt. Ausbeute 1,17 g.

Zur Aktivitätsbestimmung der modilvzierten Tryp- Die so gewonnene Substanz wird gegen Wasser

sin-Kallikrein-Inhibitoren wurde wie folgt verfahren: 55 dialysiert und gefriergetrocknet. Ausbeute 710,3 mg.

Die Inhibitorlösung wird mit einer festgelegten 325 mg der dialysierten und gefriergetrockneten

Menge (entsprechend einer bestimmten Aktivität) Substanz werden an Sephadex LH 20® (100 χ 2,5-cm- Trypsinlösung vorinkubiert; nach kurzer Zeit setzt Säule) in dem System Eisessig/Butanol/Wasser mai ein geeignetes Trypsinsubstrat, z. B. N-Benzoyl- (2:4: 20) Chromatographien. Es werden 228 mg

arginin-4-nitroanilid (BAPA) zu und mißt nach 60 einer reinen Fraktion isoliert.

einiger Zeit und nach Abstoppen der Reaktion die Aminosäureanalyse: Verhältnis GIy zu GIu = 6:8,5

durch nicht gehemmtes Trypsin bewirkte Abspaltung (theoret. 6: 8).
von p-Nitroanilin bedingte Gelbfärbung quantitativ
am Photometer bei geeigneter Wellenlänge, z. B. B e i s ρ i e 1 2

405 nut. ....... . . . „ - ^6s Trypsin-Kallikrein-Inhibitor-penta-(Glu-Glu-OH)

Im einzelnen wird hierbei so verfahren, daß eine

Trypsinmenge (Trypsin, kristallisiert, reinst), die, 900 mg Penta-Boc-Trypsin-Kallikrein-Inhibitor wer-

vorher ermittelt in 30 Minuten bei 37°C BAPA zu- den mit 625 mg (1,3 mMol) HCl-H-GIu(OBu')-

10

Glu(OBu^l)-OBut analog Beispiel 1 umgesetzt. Nach Behandlung mit Trifluoressigsäure und anschließender Dialyse werden 770,4 mg Rohsubstanz gewonnen. 500 mg dieser Rohsubstanz werden wie bei Beispiel 1 gereinigt. Ausbeute 382 mg einer reinen Fraktion.

Aminosäureanalyse: Verhältnis GIy zu GIu = 6:14,6 (theoret. 6:13).

Beispiel 3
Trypsin-Kallikrein-Inhibitor-penta-(Glu-Glu-Glu-OH)

900 mg Penta-Boc-Trypsin-Kallikrein-Inhibitor werden mit 867 mg (1,3 mMol) HCl · H-Glu(OBut)-Glu(OBut)-Glu(OBut)-OBu^l analog Beispiel] umgesetzt. Nach Behandlung mit Trifluoressigsäure werden 1,355 g Rohsubstanz gewonnen, die in 0,1 m Essigsäure über Sephadex G 25® (200 χ 4-cm-Säule) Chromatographien werden. Ausbeute 674,9 mg einer reinen Fraktion.

Aminosäureanalyse: Verhältnis GIy zu GIu = 6:18,3 (theoret. 6:18).

Beispiel 4

Trypsin-Kallikrein-Inhibitor-penta-(Glu-Glu-Glu-Glu-OH)

900 mg Penta-Boc-Trypsin-Kallikrein-Inhibitor werden mit 1,11g (1,3 mMol) HCl · H-GIu(OBu⁴)-GIU(OBUt)-GIu(OBUt)-GIu(OBUt)-OBu' analog Beispiel 1 umgesetzt. Nach Behandlung mit Trifluoressigsäure werden 1,15 g Rohsubstanz gewonnen, die in 0,1 m Essigsäure über Sephadex G 25® (200 χ 4cm-Säule) Chromatographien werden. Ausbeute 745 mg einer reinen Fraktion.

Aminosäureanalyse: Verhältnis GIy zu GIu = 6:23,4 (theoret. 6:23).

Beispiel 5
Trypsin-Kallikrein-Inhibitor-penta-asparaginsäure

900 mg Penta-Boc-Trypsin-Kallikrein-Inhibitor werden mit 365 mg (1,3 mMol) HCl · H-Asp(OBut)-OBu* analog Beispiel 1 umgesetzt. Nach Behandlung mit Trifluoressigsäure werden 1,083 g Rohsubstanz gewonnen, die in 0,1 m Essigsäure über Sephadex G 25® (200 x 4-cm-Säule) Chromatographien werden. Ausbeute 707,6 mg einer reinen Fraktion.

Aminosäureanalyse: Verhältnis GIy zu GIu zu Asp = 6: 3,2:10,5 (theoret. 6:3:10).

Beispiel 6
Trypsin-Kallikrein-Inhibitor-penta-(Glu-Asp-OH)

Glu(OBut)-Asp(OBut)-OBut analog Beispiel 1 umgesetzt. Nach Behandlung mit Trifluoressigsäuie werden 1,266 g Rohsubstanz gewonnen, die in 0,1 m Essigsäure über Sephadex G 25® (200 χ 4-cm-Läule) Chromatographien werden. Ausbeute 727 mg einer reinen Fraktion.

Aminosäureanalyse: Verhältnis GIy zu GIu zu Asp ·-= 5,5:13,6:10,0 (theoret. 6:13 :10).

Beispiel 8
Trypsin-Kallikrein-Inhibitor-penta-(Asp-Glu-Asp)

900 mg Penta-Boc-Trypsin-Kallikrein-Inhibitor werden mit 830 mg (1,3 mMol) HCl-H-ASp(OBu¹)-Glu(OBu^l)-Asp(OBut)-OBut analog Beispiel 1 umgesetzt. Nach Behandlung mit Trifluoressigsäure werden 1,25 g Rohsubstanz gewonnen, die in 0,1 m Essigsäure über Sephadex G 25® (200 χ 4-cm-Säule) Chromatographien werden. Ausbeute 628,4 mg einer reinen Fraktion.

Aminosäureanalyse: Verhältnis GIy zu GIu zu Asp = 6,0: 8,0:15,1 (theoret. 6:8:15).

B e i s ρ i e 1 9

Trypsin-Kallikrein-Inhibitor-penta(Glu-Asp-Glu-Asp)

900 mg Penta-Boc-Trypsin-Kallikrein-Inhibitor werden mit 1,07 g (1,3 mMol) HCl · H-Glu(OBut)-ASp(OBUt)-GIu(OBUt)-ASp(OBUt)-OBUt analog Beispiel 1 umgesetzt. Nach Behandlung mit Trifluoressigsäure werden 1,54 g Rohsubstanz gewonnen, die in 0,1m Essigsäure über Sephadex G 25® (200 χ 4-cm-Säule) Chromatographien werden. Ausbeute 634 mg einer reinen Fraktion.

Aminosäureanalyse: Verhältnis GIy zu GIu zu Asp = 5,7:13,0:15,6 (theoret. 6:13:15).

35

45

mg Pecta-Boc-Trypsin-Kaltikrein-lnhibitor wermit 610 mg (U mMol) Ha-H-OIu(OBa')-OBa* analog Beispiel 1 umgesetzt. Nach j mit Trifluoressigsäure werden 1,1 g Rofeerhaftea, die in 0,1 m Essigsäure aber G 25® (2CO X 4-cm-Säöie) chromatogra-Ausbeute 759,3 mg emer reinen Frak-

: Verbatims Cäy m GIh zn Asp

Beispiel 10
Trypsin-Kaliikrein-Inhibitor-penta-(Glu-D-Glu-OMe)

900 mg Penta-Boc-Trypsin-Kallikrein-Inhibitor werden mit 597 mg (1,3 mMol) HCl · H-Glu(OBut)-D-Glu(OBut)-OMe (J. Chem. Soc. Perkinl, 1972, S. 1) analog Beispiel 1 umgesetzt. Nach Behandlung mit Trifluoressigsäure werden 1,2 g Rohsubstanz gewonnen, die in 0,1 m Essigsäure über Sephadex G 25® (200 χ 4-cm-Säule) Chromatographien werden. Ausbeute 654 mg einer reinen Fraktion.

Aminosäureanalyse: Verhältnis GIy zu GIu = 6:13,7 (theoret 6:13).

Beispiel 11 Trypsin-Kaliikrein-inhibitor-penta (Asp-Glu-NHi)

900 mg Penta-Boc-Tryrjsin-KalMcrein-öihiMtor werden mit 533 mg (UmMdT) HCi GIc(OBUt)-NH, (gewonnen durch teatalSHiSsis
driertmg von _

I. Chem. Soc. C [1968], S. 531 beschriet^i ist) anaiog 11 umgesetzt Nach Behandlung naS L.18 g Retenfestanz! ι

SS

H-GIo(OBUt)-

SsMe) ckfonaatogtapiaeit

6,0:8,6:1(U(theoret6:8:

Beispiel 12
Trypsin-Kallikrein-Inhibitor-penta (Asp-Ser-Asp-OH)

900 mg Penta-Boc-Trypsin-Kallikrein-Inhibitor werden mit 702 mg (1,3 mMol) HCl ■ H-Asp(OBu⁴)-Ser-Asp(OBu')-OBu^l (J. Chem. Soc. C, Org., 1969, S. 2218) analog Beispiel 1 umgesetzt. Nach Behandlung mit Trifluoressigsäure werden 1,3 g Rohsubstanz erhalten, die in O.lm-Essigsäure über Sephadex G 25® (200 χ 4-cm-Säule) Chromatographien werden.

Ausbeute 710 mg einer reinen Fraktion.

Aminosäureanalyse: Verhältnis Gly:Asp:Ser = 6:15,5:4,9 (theoret. 6:15: 6).

Herstellung der Ausgangssubstanzen
a. Z-Glu(OBu')-Glu(OBu')-OBu^l

10,4 g (20 mMol) Z-Glu(OBut)-OH · DCHA werden zwischen 100 ml Äther und 20 ml 1 n-H₂SO₄ bei 0⁰C verrührt. Die Ätherphase wird mit Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wird in 50 ml Dimethylformamid gelöst. Zu dieser Lösung gibt man 5,91 g (20 mMol) HCl · H-Glu(OBu*)-OBu<, 2,7 g (20 mMol) HOBt, 2,6 ml N-Äthylmorpholin und bei O⁰C 4,4 g DCC (als Dimethylformamid-Lösung). Man rührt 1 Stunde bei 0⁰C, 2 Stunden bei Raumtemperatur und läßt über Nacht bei Raumtemperatur stehen. Anderntags wird der Niederschlag abgesaugt und das Filtrat eingeengt. Der Rückstand wird in Essigester gelöst und die Lösung nacheinander mit NaHCO₃-Lösung, KHSO₄-Lösung, NaHCO₃-Lösung und Wasser gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wird in Essigester über etwa 30 g basisches Al₂O₃ (Woelm Aktivstufe I) Chromatographien. Das Eluat wird eingeengt und am Hochvakuum getrocknet. Ausbeute 10 g öl (86%). Nach einiger Zeit kristallisiert das öl, Schmp. 88 ⁰C.

C₃₀H₄₆N₂O₈ (578,7):

C 62,26, H 8,01, N 4,84;
C 62,3, H 8,1, N 5,1.

Berechnet ..
gefunden ..

b. HCl

9,6 g Z-GIu(OBu*)-Glu(OBut)-OBut werden in Methanol gelöst, mit Pd-Katalysator versetzt und mit Hilfe eines Autotitrators unter Zugabe von 2 η methanolischer HCl bei pH 4,5 hydriert. Nach beendeter Hydrierung wird der Katalysator abgesaugt und das Filtrat eingeengt. Ausbeute 7,3 g Öl (91 %).

C₀H₄₀N₈O₇ · HO (481,04).

C₃₉H₆₁N₃O₁₂ (763,94):

Berechnet ... C 61.35, H 8,04, N 5,51;
gefunden ... C 61,2, H 8,0, N 5,6.

d. HCl · H-Glu(OBut)-Glu(OBu^l)-Glu(OBut)-OBu^t

5,8 g (7,6 mMol) Z-Glu(OBut)-Glu(OBu¹)-GIu(Ol U¹J-OBu¹ werden in M ;thanol wie bei b. katalytisch hyunert. Ausbeute 4,8 g öl (95%).

ίο C₃₁H₅₅N₃O₁₀ · HCl (666,3).

e. Z-(Hu(OBUt)-GIu(OBUt)-GIu-(OBUt)-GIu(OBuO-OBu'

Zu einer Lösung von 3,9 g (5,85 mMol) HCl · H-Glu(OBut) - Glu(OBut) - GIu(OBu¹) - OBu⁽, 0,79 g

(5,85 mMol) .40Bt und 0,76 ml (5,85 mMol) N-Äthylmorpholin im 50 ml Dimethylformamid gibt man 3,05 g (5,85imMol) Z-GIu(OBUt)-OTCp. Man rührt

1 Stunde bei Raumtemperatur und arbeitet wie bei

so c. auf. Ausbeute 4,75 g (86%V Schmp. 119 bis 120⁰C.

[«]? = -29,1° (c - 1, Methanol).

C₄₈H₇₈N₄O₁₅ (949,2):

Berechnet .. C 60,75, H 8,08, N 5,91;
gefunden .. C 60,6, H 8,0, N 5,8.

f. HCl · 4-GIu(OBu¹KiIu(OBUt)-GIu(OBUt)-Glu(OBu')-OBut

4,4 g (4.63 mMol) Z-Glu(OBut)-Cilu(OBu')-GIu(OBUt-GIu(OBUt)-OBUt werden wie bei b. in Methanol katalytisch hydriert.
Ausbeute 3,85 g öl (98%).

Za einer Lösung von 6,2 g (12,9 mb/bA) HQ · H-GJaTOBn^-GkiiOBu^-OBnt, 1,74 g (12,9 mMoi) HOBt, 1,68 ml (12 mMoi) N-Äthylmorpholin in 60 ml Dimetkylforniainid gibt man 6,65 g (12,9 mMol) E-GIa(OBUt)-OTGp, läßt S Minuten rühren and engt am Hochvatuuin ein. Der Rückstand wird in Essigestej- gelöst und wie bei a. ausgeschüttelt Nach Trocknen ober Natritnnsaifat wird eingeengt und der Raekstand mit Petroiäther verrieben. Es asf ®°C a^geäcüHt und abgesaugt.

Ausbeute 63 g (70%). Schmp. Ui bis H3°C, -. -29,8° (c = t, MetfcaaelJ.

C₁₀H₇₀N₄O₁₃ · HCl (851,5).

g. Z-Glu(OBut)-Asp(OBut)-OBu<

52 g (0,1 Mol) Z-Glu(OBu^l)-OH · DCHA werden zwischen Ätber und 100 ml In H₂SO₄ bei O⁰C verrührt. Die \therphase wird einmal mit Wasser gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wird in 200 ml Dimethylformamid gelöst. Zu dieser Lösung gibt man 28,1 g (0,1 Mol) HCl - H-Asp(OBut)-OBut, 13,5 g HOBt (0,1 Mol), 13 ml N-Äthylmorpholin (0,1 Mol) und bei

0°C 22 g DCC (als Dimethylformamid-Lösung). Man verfährt nun wie bei a. Der Rückstand kristallisiert beim Verreiben mit Petroläther. Ausbeute 42,9 g (76%), Schmp. 128 bis 130⁰C. Zur weiteren Reinigung wurde die Substanz in Äther gelöst und über

120 g basisches Al₂O₃ Chromatographien. Ausbeute 34,7 g₅ Schmp. 131 bis 132°C. [«]? = —17,9° (c = 1, Methanol).

C₄₉H₄₄N₂O₉ (564,7):

Berechnet ... C 61,70, H 7,86, N 4,96; gefunden ... C61,7, H7,8, N4,9.

h. HCl · H-Glu(OBa*>Asp(OBa*)-OBn*

U₀ 34,5 g (62mMoQ Z-GiuiOBu^-AspiOSn^-OBa* werden wie bei b. in Methanol katalytisch iwäEieit. Aasbeute 29,3 g öl (Ι0Θ %).

C₀H₈₈N₈O, · HO (467,01).

i. Z-GlnipSa^HnCOBt^Asp^ßit^Olo*

.,²^L*¹¹? i^« wajl^g (2S.7 mMol) «^H-

CD

OOO

3,5 ml (26,7 mMol) N-Äthylmorpholin in 100 ml Dimethylformamid gibt man bei Raumtemperatur 13,82 g (26,7 mMol) Z-GIu(OBUt)-OTCp. Man läßt 1 Stunde stehen und arbeitet wie bei c. auf. Ausbeute 24,7 g öl. Zur weiteren Reinigung wird das öl in Äther gelöst über 75 g basisches Al₂O₃ chromatographiert. Ausbeute 17,65 g amorphe Masse (88%). [*]? = -23,9° (C = I, Methanol).

n. HCI · H-GIU(OBUt)-ASp(OBUt)-GIu(OBu⁴)-Asp(OBut)-OBu*

C₃₈H₅₈N₃O₁₂ (749,9):

Berechnet ... C 60,86, H 7,93, N 5,61;
gefunden ... C 60,3, H 7,9, N 5,6.

j. HCl · H-GluiOBu'J-GluiOBu^-AspiOBu^OBu*
17 g (22,7 mMol)

Z - Glu(OBut) - GIu(OBu*) · ASp(OBu¹J-OBu¹
werden analog b. in Methanol katalytisch hydriert. Ausbeute 14,34 g amorphe Masse (97 °₀).
C₃₀H₅₅₁N₃O₁₀ · HCl (652,2).
k. Z-ASP(OBUt)-GIu(OBUt)-ASp(OBuO-OBu'

Zu einer Lösung von 12,5 g (26,7 mMol) HCl · H-Cj U(OBiIt)-ASp(OBUt)-OBu¹ und 3,5 ml (26,7 mMol) N Äthylmorpholin in 100 ml Dimethylformamid gibt man 11.25 ε (26,7 mMol) Z-Asp(OBut)-ONSu und !äßt etwa 20 S:unden bei Raumtemperatur reagieren. Aufgearbeitet wird analog c. Der Rückstand (18,4 g öl) wird zur Reinigung in Äther gelöst und über 50 g basisches Al₂O₃ Chromatographien.

Ausbeute 13,4 g amorphe Substanz (68%).
[·■*]? =: -23,9° (c = 1, Methanol).

C₃₇H₅₇NA₈ (735,9):
Berechnet ... C 60,4, H 7,81, N 5,71;
gefunden ... C 60,0, H 7,1, N 5,6.

1. HCl · H-ASP(OBUt)-GIu(OBUt)-ASp(OBUt)-OBu¹

12,8 g (17,4 mMol) Z-Asp(OBut)-Glu(OBut)-AspiOBu^-OBu¹ werden analog b. in Methanol katalytisch hydriert

Ausbeute 10,4 g amorphe Substanz (94%).

C₂₉H₅₁N₃O₁₀ · HCl (638,2).

m. Z-GIu(OBUt)-ASp(OBUt)-GIu(OBUt)-Asp(0But)-0Bu*

Zu einer Lösung von 6,4 g (10 mMol) HCl-H-Asp(OBut) - Glu(OBut) - Asp(OBut) - OBu«, 1,35 g (10 mMol) HOBt and 1,3 ml (10 mMol) N-Äthyliii ia 40 ml Dimethylformamid gjbt man 5 g )SiMol) ZrGIu(OBUt)-OTCp, KBt !Stunde bei imtemperatur rühren and arbeitet analog c. auf. ί Rückstand wijrd mit Petroläiher verrieben. Aas-7,4 g (8O5Ö, Scamp. 196°C t«Jf = -24,6° ■ 1, Methanol).

... C59,98, H7,88, N6,08;
... €59,6, H& N4L

7 g (7,6 mMol) Z-() Asp(OBut)-OBut werden analog b. in Methanoi katalytisch hydriert.

Ausbeute 6,1 g amorphe Substanz (97,5%).

ίο C₃₈H₆₆N₄O₁₃ · HCl (823,4).

o. Penta-Boc-Trypsin-Kallikrein-Inhibitor

>) 1,3 g Trypsin-Kallikrein-Inhibitor werden in 10 ml Wasser gelöst. Dazu gibt man 50 ml Dimethylformamid und 4,4 ml ges. NaHCO₃-Lösung. Nun gibt man 430 mg Boc-ONSu zu, rührt 1 Stunde bei Raumtemperatur und läßt über Nacht stehen. Anderntags wird mit 2 η-Essigsäure auf pH 5 angesäuert. Die klare Lösung wird im Hochvakuum eingeengt. Der Rückstand wird mit Wasser verrieben, abgesaugt, mit Wasser gut gewaschen und getrocknet. Mit Essigester wird nochmals verrieben, abgesaugt und getrocknet. Ausbeute 880 mg.

Die Papierelektrophorese ergab im sauren Medium eine einheitliche Substanz, die vom Trypsin-Kallikrein-Inhibitor verschieden war.
ß) 1,3 g Trypsin-Kallikrein-Inhibitor werden in 20 ml Dimethylformamid suspendiert. Dazu gibt man 270 mg HOBt, 480 mg Boc-ONp und 0,14 ml l.r,4.4'-Tetramethylguanidin. In mehreren Portionen werden noch 0,7 ml l.l',4.4'-Tetramethylguanidin und 480 mg Boc-ONp zugegeben. Man rührt insgesamt 2 Tage bei Raumtemperatur, engt ein und verrührt den Rückstand mit Essigester. Der Niederschlag wird mit Methanol verrieben und abgesaugt. Ausbeute 950 mg. Das gewonnene Produkt ist papierelektrophoretisch identisch mit der nach α) gewonnenen Substanz.

γ) 7 g Trypsin-Kallikrein-Inhibitor werden in 77 ml Wasser gelöst. Dazu gibt man 315 ml Dimethylformamid, 24 ml ges. NaHCO_a-Lösung und 14 ml Boc-azid. Man rührt 5 Stunden bei 35°C. Mit2 η-Essigsäure wird auf pH 5 angesäuert und engt im Hochvakuum ein. Der Rückstand wird mit Wasser verrieben und abgesaugt. Ausbeute 6,5 g. Das gewonnene Frodukt ist papierelektrophoretisch identisch mit der nach <%) gewonnenen Substanz.

Abkürzungen

Boc = tert.-ButyloxycarbonyL

Z = Benzyloxycarbonyl,
OBu* = tert-Batylester,
ONp = 4-Nitrophenyiester,
ONSu = N-Hydroxysuccinimidester,
OTq) = 14.5-TricMorpheiiytesteiv
DCHA = Dicyciofaocylanan,
DCC = DicyelofoexylcaTbodmaid,
HOBt = 1-HydnjxybenzotriazoL

Claims

p_atmf3ncr>rf.₁ . _A bedeuten kann, in Gegenwart von 1-Hydrox.y-

Patentanspruche, benziitriazol und Dicyclohexylcarbodiimid um-

L Derivate des basischen Trypsin-Kallikrein- setzt und anschließend die Schutzgruppen sauer

Inhibitors aus Säugerorganen, worin die fünf vor- abspaltet

haadenen Carboxylgruppen des Peptidmoleküls 5 3. Pharmazeutische Zubereitungen für Injek-

amidartig durch Peptidreste der allgemeinen For- tions- und Infusionszwecke, gekennzeichnet durch

me! I verlängert and, einen Gehalt an einer Verbindung nach Anspruch 1. -NH-CH-CO-/NH-CH-CO-X W

Γ -CH-CO-X W J L ^m