DE2629067C2

DE2629067C2 -

Info

Publication number: DE2629067C2
Application number: DE2629067A
Authority: DE
Inventors: Bo Thuresson Af Dr. Moelndal Se Ekenstam; Leif Erik Dr. Aurell; Goeran Karl Dr. Saeroe Se Claeson; Birgitta Gunilla Karlsson; Stig Ingemar Dr. Moelndal Se Gustavsson; Geb. Skale Gun Anita Froelunda Se Olausson
Original assignee: KABI STOCKHOLM SE AB
Current assignee: Chromogenix AB
Priority date: 1975-07-11
Filing date: 1976-06-29
Publication date: 1989-08-03
Also published as: PL103098B1; SU700060A3; IL49830A0; CA1081212A; SE407571B; AT349648B; IT1062604B; FR2317278A1; DK146937B; FI56524C; US4214049A; FI56524B; JPS5224581A; ES449738A1; DK146937C; SE7507974L; NO762406L; CS199631B2; GB1510925A; IL49830A

Description

Die Erfindung betrifft Tripeptide und deren Verwendung gemäß den voranstehenden Ansprüchen. Diese Tripeptide sind chromogene Substrate für Enzyme vom Typ der Serinproteasen (EC 3.4.21). Die Substrate der Erfindung sind insbesondere zur quantitativen Bestimmung der obengenannten Enzyme geeignet, die die Peptidkette an der Carboxylseite von Arginin oder Lysin spalten. Weiterhin können die Substrate für die Untersuchung von Reaktionen, bei denen die genannten Enzyme gebildet, inhibiert oder verbraucht werden, oder für die Bestimmung von derartige Reaktionen beeinflussenden oder an diesen teilnehmenden Faktoren verwendet werden. Synthetische Substrate für die Enzymbestimmung weisen im Vergleich zu natürlichen Substraten erhebliche Vorteile auf, vorausgesetzt, daß sie verschiedene Anforderungen erfüllen können, beispielsweise eine große Empfindlichkeit und Spezifizität für das Enzym, eine gute Löslichkeit in Wasser oder der biologischen Testflüssigkeit und einer leichten Nachweisbarkeit für einige ihrer Spaltprodukte.

Substrate mit guten Eigenschaften für die Bestimmung von beispielsweise Plasmin, Thrombin, Trypsin, Kallikrein und Urokinase sind unter anderem in SE-PS 3 80 258 beschrieben worden. Sie stellen prinzipiell chromogene Tripeptidderivate dar. Zu den besten dieser Substrate zählen solche mit einem benzoylierten N-terminalen Ende und einer chromophoren Gruppe, welche an das C-terminale Ende gekoppelt ist, z. B.

Benzoyl-A₁-A₂-A₃-p-nitroanilid (I)

in dem A₁, A₂ und A₃ Aminosäuren darstellen.

Mit spezifischen Aminosäuresequenzen bei den genannten Substraten ist es möglich, eine besondere Sensitivität für ein bestimmtes oder für bestimmte Enzyme zu erhalten. Bei der enzymatischen Hydrolyse bilden die Substrate das chromophore Produkt p-Nitroanilin, das in leichter Weise spektrophotometrisch bestimmt werden kann. Diese Substrate weisen jedoch einen Nachteil auf, und zwar infolge ihrer relativ geringen Löslichkeit (1 mg/ml). Eine geringe Löslichkeit erfordert ein Arbeiten in der Nähe der Sättigungsgrenze für das Substrat, um eine befriedigende Konzentration desselben zu erreichen. Bei Enzymbestimmungen in unterschiedlichen biologischen Systemen kann es daher vorkommen, daß entweder das Substrat selbst oder eine Kombination Protein/Substrat ausgefällt werden. Diese Ausfällungen führen zu verfälschten Spektrophotometermessungen und somit zu falschen Enzymbestimmungen.

Die benzoylierten Enzymsubstrate gemäß Formel I können erheblich löslicher gemacht werden, wenn man die N-terminale Benzoylgruppe durch H ersetzt. Die nunmehr freie protonierte Aminogruppe der Aminosäure A₁ vergrößert die Löslichkeit, führt jedoch auch dazu, daß die Geschwindigkeit der Spaltung durch das Enzym verringert wird (cf. Tabelle II). Weiterhin können nunmehr die Substrate in biologischen Testlösungen in unerwünschter Weise zersetzt werden, und zwar durch Aminopeptidasen am N-terminalen Ende.

Erfindungsgemäß werden Tripeptide bereitgestellt, die unter dem Gesichtspunkt der Aktivität für ein bestimmtes Enzym befriedigende Eigenschaften aufweisen, und bei denen jedoch die Benzoylgruppe durch Wasserstoff und gleichzeitig die bisher verwendete L-Form der Aminosäure A₁ (L-A₁) durch ihre D-Form (D-A₁) ersetzt sind. Die so erhaltenen Substrate sind sehr leicht löslich, und überraschenderweise wird die Aktivität der Substrate in bezug auf das Enzym durch die Einführung einer D-Aminosäure nicht verringert, sondern im Vergleich zu einem entsprechenden, ausschließlich aus L-Aminosäuren bestehenden Substrat mehrfach gesteigert. Die Aktivität ist häufig sogar erheblich besser als das gut wirkende benzoylierte Ausgangssubstrat gemäß Formel I. Die N-terminale freie D-Aminosäure in dem Substrat der Erfindung verhindert außerdem einen unerwünschten Angriff von Aminopeptidasen, da diese für L-Aminosäuren spezifisch sind.

Die chromogenen Enzymsubstrate gemäß der Erfindung entsprechen der folgenden allgemeinen Formel

H-D-A₁-A₂-A₃-NH-R

in der A₁ und A₂ die Aminosäuren Ala, Val, Leu, Ile, Pip, Pro oder Aze und A₂ Gly oder Phe, A₃ Arg oder Lys und R eine Nitrophenyl-, Naphthyl-, Nitronaphthyl-, Methoxynaphthyl-, Chinolyl- oder Nitrochinolylgruppe bedeuten. Die Erfindung betrifft weiterhin die Salze der vorgenannten Substrate. (Die Abkürzungen werden weiter unten erläutert.)

Für die Synthese der chromogenen Enzymsubstrate der Erfindung können herkömmliche Schutzgruppen und Kupplungsverfahren verwendet werden, die sämtlich in der Peptidchemie geläufig sind.

Für die α-Aminoschutzgruppe ist es vorteilhaft, Carbobenzoxy- oder t-Butyloxycarbonylgruppen oder verwandte Reste einzusetzen, beispielsweise p-Methoxy-, p-Nitro- oder p-Methoxyphenylazocarbobenzoxygruppen.

Zum Schutz der δ-Guanidogruppe der Arginylfunktion ist es vorteilhaft, die Protonierung oder die NO₂- oder p-Toluolsulfonylgruppe zu verwenden.

Für die ε-Aminogruppe des Lysins werden vorzugsweise die Carbobenzoxy-, t-Butyloxycarbonyl- oder p-Toluolsulfonylgruppe verwendet.

Als abspaltbare α-Carboxy-Schutzgruppe eignet sich vorzugsweise der Methyl-, Ethyl- oder Benzylester.

Die Kupplung zwischen zwei Aminosäuren oder einem Dipeptid und einer Aminosäure kann durch Aktivierung der α-Carboxygruppe erfolgen. Das aktivierte Derivat kann entweder isoliert oder in situ erzeugt werden; es kann beispielsweise der p-Nitrophenyl-, Trichlorphenyl-, Pentachlorphenyl-, N-Hydroxysuccinimid- oder N-Hydroxybenztriazolester, ein symmetrisches oder asymmetrisches Anhydrid oder ein Säureazid sein.

Die Aktivierung zu dem obengenannten Esterderivat kann vorzugsweise in Gegenwart eines Carbodiimids durchgeführt werden, beispielsweise N,N′-Dicyclohexylcarbodiimid, das auch direkt als aktivierendes Kupplungsreagenz zwischen den Carboxy- und Aminokomponenten dienen kann.

Das Prinzip der Substratsynthese kann darin bestehen, daß die Aminosäuren stufenweise an die C-terminale Arginylgruppe gekoppelt werden, welche entweder von Anfang an mit einer angekoppelten chromophoren Gruppe, die dann als Carboxyschutzgruppe wirkt, oder mit einer abspaltbaren Carboxyschutzgruppe ausgestattet ist. Im letzteren Falle wird die chromophore Gruppe dann an das geschützte Tripeptidderivat angekoppelt. Alternativ ist es prinzipiell möglich, das N-terminale Dipeptidfragment selbst zu erzeugen, das anschließend mit der gegebenenfalls mit einer chromophoren Gruppe ausgestatteten Arginylgruppe gemäß dem oben diskutierten Prinzip gekuppelt wird.

Unabhängig von dem gewählten Prinzip erfolgt die Reinigung der Zwischen- und Endprodukte vorzugsweise durch Gelfiltrationschromatographie; da diese Methode ein rasches synthetisches Arbeiten ermöglicht und maximale Ausbeuten ergibt.

Die Erfindung wird im folgenden durch bevorzugte Ausführungsbeispiele näher erläutert.

Abkürzungen
Aminosäuren (wenn nichts anderes angegeben ist, handelt es sich um die L-Form)
Arg
= Arginin
Aze	= 2-Azetidincarbonsäure
Ala	= Alanin
Gly	= Glycin
Ile	= Isoleucin
Leu	= Leucin
Lys	= Lysin
Phe	= Phenylalanin
Pip	= Pipecolinsäure
Pro	= Prolin
Val	= Valin
AcOH	= Essigsäure
Bz	= Benzoyl
Cbo-	= Carbobenzoxy-
DCCI	= Dicyclohexylcarbidiimid
DMF	= Dimethylformamid
Et₃N	= Triethylamin
EtOAc	= Ethylacetat
GPC	= Gelfiltrationschromatographie
HBT	= N-Hydroxybenztriazol
HMPTA	= N,N,N′,N′,N′′,N′′-Hexamethylphosphorsäuretriamid
HONSu	= N-Hydroxysuccinimid
MeOH	= Methanol
-OpNP	= p-Nitrophenoxy
-pNA	= p-Nitroanilid
Boc	= t-Butyloxycarbonyl
TFA	= Trifluoressigsäure
TLC	= Dünnschichtchromatografie

Für die Synthese verwendete Reaktionstypen:

Für die Synthese der in Tabelle I aufgeführten erfindungsgemäßen Tripeptide werden verschiedene Reaktionsschritte in weitgehend ähnlicher Weise durchgeführt. Aus diesem Grunde wird eine allgemeine Beschreibung der unterschiedlichen Reaktionstypen und nachfolgend in Tabelle I eine Beschreibung von Zwischen- und Endprodukten, der für verschiedene Reaktionstypen zu verwendenden Aufarbeitungsverfahren und bestimmter physikalischer Daten angegeben.

Reaktionstyp 1 Kupplung der chromophoren Gruppe (R)

20 mMol N^α,N^G-geschütztes Arginin oder N^α,N^ε-geschütztes Lysin oder eines in entsprechender Weise geeignet geschützten Peptidderivats, vermahlen und gut getrocknet, werden in 50 ml trockenem, frisch destilliertem HMPTA bei Raumtemperatur gelöst. Danach werden 20 mMol Et₃N und 30 mMol des chromophoren Amins in Form seines Isocyanatderivats unter wasserfreien Bedingungen und unter Rühren zugegeben. Nach einer Reaktionszeit von einem Tag wird die Reaktionslösung in 0,5 l 2%iger Natriumbicarbonatlösung unter Rühren eingegossen. Der erhaltene Niederschlag wird durch Filtration entfernt und gründlich mit Bicarbonatlösung, Wasser, 0,5-N-Salzsäure und wiederum Wasser gewaschen. Aus dem Niederschlag wird das gewünschte Produkt extrahiert, z. B. mit Methanol, wobei bestimmte Nebenprodukte nicht gelöst werden. Der Methanolextrakt kann nach dem Eindampfen aus einem geeigneten Medium kristallisiert oder durch GPC gereinigt werden.

Reaktionstyp 2 Abspaltung einer Carbobenzoxyschutzgruppe (Cbo-)

10 mMol des gründlich getrockneten Cbo-Derivats werden in 25 ml trockenem AcOH suspendiert. 15 ml 5,6 N HBr in AcOH werden unter wasserfreien Bedingungen bei Raumtemperatur zugegeben. Nach einer Reaktionszeit von 45-60 Minuten wird die Lösung tropfenweise unter heftigem Rühren in 300 ml trockenen Ether gegeben. Die Etherphase wird von dem erhaltenen Niederschlag abgesaugt, der mit 2-3 Portionen von jeweils 100 ml Ether gewaschen wird. Das so erhaltene Hydrobromid der in N^α-Stellung von der Schutzgruppe befreiten Verbindung wird über NaOH- Plätzchen 3-16 Stunden im Vakuum bei 40°C getrocknet.

Reaktionstyp 3 Abspaltung einer t-Butyloxycarbonylschutzgruppe (Boc-)

10 mMol des gut getrockneten Boc-Derivats werden in 200 ml 25%iger TFA in CH₂Cl₂ unter wasserfreien Bedingungen bei Raumtemperatur gelöst. Nach einer Reaktionszeit von 20 Minuten wird die Lösung tropfenweise in 500 ml trockenen Ether gegeben. Der erhaltene Niederschlag wird durch Filtration entfernt und mit Ether gründlich gewaschen. Das so erhaltene Trifluoracetat der in N^α-Stellung von der Schutzgruppe befreiten Verbindung wird über NaOH-Plätzchen bei 30°C 2-3 Stunden lang im Vakuum getrocknet.

Reaktionstyp 4 Kupplungsverfahren Freisetzung der α-Aminogruppe

Für die Acylierung der bei den Reaktionstypen 2 oder 3 erhaltenen Derivate muß die α-Aminogruppe in Form der freien Base vorliegen. Die Freisetzung kann auf zahlreichen unterschiedlichen Wegen erfolgen. Unter anderem ist es möglich, ein Äquivalent eines trockenen tertiären Amins (z. B. Et₃N oder N-Ethylmorpholin) zu einer auf -10°C gekühlten DMF-Lösung des HBr- oder TFA-Derivats zu geben. In den Fällen des Einsatzes von Et₃N und den HBr- Derivaten wird das ausgefällte Et₃N · HBr durch Filtration entfernt. Alternativ kann das HBr- oder TFA-Derivat in 5%iger Natriumbicarbonatlösung gelöst werden, aus der das freigesetzte Derivat beispielsweise mit EtOAc oder Butanol extrahiert wird. Anschließend wird die organische Phase getrocknet und eingedampft.

a) Bei N^α-geschützten aktiven Esterderivaten

Zu einer Lösung von 10 mMol Peptid oder Aminosäurederivat, gemäß den obigen Verfahren freigesetzt, in 20-50 ml frisch destilliertem DMF werden 11 mMol des N^α-geschützten p-Nitrophenyl- oder N-Hydroxysuccinimidesterderivats der anzukuppelnden Aminosäure bei -10°C gegeben. Nach einer Reaktionszeit von einer Stunde bei -10°C wird die Lösung mit 5 mMol eines tertiären Amins gepuffert. Man läßt sie dann sich langsam auf Raumtemperatur erwärmen. Der Reaktionsverlauf wird zweckmäßigerweise durch TLC-Analyse verfolgt. Falls erforderlich, gibt man weitere 5 mMol Base nach erneutem Kühlen hinzu. Wenn die Reaktion beendigt ist, wird die Lösung in einem Rotationsfilmverdampfer zu einem öligen Rückstand eingedampft, der mit einigen Portionen Wasser gerührt wird. Der Rückstand wird durch GPC oder Umkristallisation gereinigt. Falls man für die Reinigung des Kupplungsproduktes GPC verwendet und dieses ein Eluatvolumen aufweist, das vollständig oder teilweise mit dem aktiven Esterderivat der gekuppelten Aminosäure übereinstimmt, kann die Verunreinigung des Kupplungsproduktes vermieden werden, wenn nach Beendigung der Reaktion, jedoch vor dem Eindampfen, das nichtverbrauchte aktive Esterderivat durch einen Überschuß (3-5 mMol) eines primären Amins, z. B. n-Butylamin, innerhalb von 30 Minuten bei Raumtemperatur ersetzt wird. Danach erfolgt die Aufarbeitung in der oben beschriebenen Weise.

b) Bei N^α-geschützten Aminosäuren oder Peptiden und Herstellung des aktiven Esters in situ

Zu einer Lösung von 10 mMol des obengenannten freien Peptids oder des Aminosäurederivats in 20-50 ml frisch destilliertem DMF werden 11 mMol der N^α-geschützten Aminosäure oder des in entsprechender Weise geschützten Peptidderivats mit einer C-terminalen freien Carboxygruppe, 11 mMol HBT oder HONSu und 11 mMol DCCI bei -10°C gegeben. Nach 1-3 Stunden bei -10°C läßt man die Reaktionslösung sich auf Raumtemperatur erwärmen. Der Reaktionsverlauf wird zweckmäßigerweise durch TLC-Analyse verfolgt. Nach Beendigung der Reaktion wird die Lösung unter Rühren in 100-300 ml 5%iger NaHCO₃ (aq) gegossen.

Der erhaltene Niederschlag wird nach der Filtration oder Dekantierung mit Wasser gewaschen. Der Rückstand wird durch GPC oder Umkristallisation gereinigt.

Reaktionstyp 5 Abspaltung sämtlicher Schutzgruppen, Reinigung und Ionenaustausch

0,2-1,0 mMol des geschützten Peptidderivats mit der gewünschten chromophoren Gruppe werden von den Schutzgruppen befreit, indem man es in einem Sakakibara-Apparat 60 Minuten bei 0°C mit 5-20 ml trockenem HF in Gegenwart von 0,2-1,0 ml Anisol umsetzt. Nach Beendigung der Reaktion und nach Destillation der gesamten HF wird das rohe Produkt in 33%iger wäßriger AcOH gelöst und durch GPC gereinigt. Das Produkt wird durch Gefriertrocknung von der verdünnten AcOH befreit und einem Ionenaustausch unterworfen, und zwar an einer Kolonne, die aus einem schwach basischen Ionenaustauscherharz Sephadex® QAE-25 in der Chloridform, gequollen in MeOH : Wasser 95 : 5, wobei das gleiche Medium als Lösungs- und Eluatmittel dient. Das reine Produkt wird durch Gefriertrocknung von Wasser befreit.

Reaktionstyp 6 Kupplung der chromophoren Gruppe R

55 mMol des chromophoren Amins werden in 150 ml trockenem Pyridin gelöst und im Eisbad gekühlt. Anschließend werden 22,5 mMol (2,45 ml) Phosphortrichlorid in 50 ml trockenem Pyridin gelöst und unter Feuchtigkeitsausschluß langsam und unter Rühren zugegeben. Man läßt etwa 45 min bei Umgebungstemperatur reagieren, wonach man 50 mMol N-alpha, N-omega-geschütztes Ornithin oder Lysin bzw. ein anderes, entsprechend geschütztes, gut getrocknetes Peptidderivat zusetzt. Man läßt solange unter Rühren und Umgebungstemperatur reagieren, bis ein Dünnschichtchromatogramm zeigt, daß die Reaktion abgeschlossen ist.

Die Reaktionszeit ist verschieden; sie beträgt für p- Nitroanilin mehrere Tage, für beta-Naphthylamin dagegen nur etwa eine Stunde.

Das erhaltene Reaktionsgemisch wird im Vakuum in einem Rotationsfilmverdampfer vom Lösemittel befreit. Das erhaltene Öl wird mit 2%iger NaHCO₃-Lösung, danach mit 2%iger NaHSO₄-Lösung und schließlich mit reinem Wasser durchgearbeitet.

Normalerweise kristallisert das Produkt gut, wenn man die durchgearbeitete Masse in warmem Methanol löst; beim Abkühlen unter Umrühren fällt das Produkt aus. In bestimmten Fällen kann es erforderlich sein, zur vollständigen Ausfällung des Produkts Wasser zuzusetzen. Das kristallisierte Produkt wird abfiltriert und getrocknet.

Gelfiltrationschromatographie

Die GPC von geschützten Peptiden oder Aminosäurederivaten, Rohprodukten oder nach der Kristallisation eingedampften Mutterlaugen ergibt ein vereinfachtes Aufarbeitungsverfahren und optimale Ausbeuten. Die Substanz wird anschließend in MeOH gelöst und in eine Kolonne überführt, die eine geeignete Größe aufweist (Volumen 0,5-7,5 l, Länge 100 cm), mit Sephadex® LH-20, gequollen in Methanol, gefüllt ist und mit dem gleichen Lösungsmittel eluiert wird. Das Eluat wird in geeignete Partialvolumina fraktioniert, wobei eine UV-Absorption (254 nm) kontinuierlich bestimmt wird. Produkthaltige Teilfraktionen werden durch TLC hinsichtlich ihrer Reinheit überprüft. Die reinen Fraktionen werden vereinigt und eingedampft.

Für die Reinigung von Peptidderivaten nach Abspaltung der Schutzgruppen mit HF entsprechend der obigen Ziffer 5 wird die 30%ige AcOH -(aq)-Lösung des Rohprodukts in eine Kolonne überführt, die eine geeignete Größe (Volumen 0,5-2,0 l, Länge 60 cm) aufweist, mit Sephadex® G-15, gequollen in 30%iger wäßriger AcOH, gefüllt ist und mit dem gleichen Lösungsmittel eluiert wird. Nach der Aufarbeitung in der oben beschriebenen Weise werden die produkthaltigen reinen Teilfraktionen gefriergetrocknet, gegebenenfalls nach teilweiser Verdampfung in einem Rotationsfilmverdampfer bei 25°C.

Dünnschichtchromatographie

Für die TLC-Analyse werden als Absorptionsmittel mit "Kieselgel F₂₅₄®" (Merck) beschichtete Glasplatten verwendet. Es werden die folgenden Lösungsmittelsysteme (Volumenverhältnisse) verwendet:
A: n-Butanol : AcOH : Wasser (3 : 2 : 1)
P₁: Chloroform : MeOH (9 : 1)
p 1/2: Chloroform : MeOH (19 : 1)

Nach Beendigung der Chromatographie wird die Platte im UV-Licht (254 nm) untersucht und mit Cl/o-Toluidinreagenz in üblicher Weise entwickelt. Die angegebenen R_f-Werte stellen die Ergebnisse getrennter Chromatographien dar.

Bestimmung von Serinproteasen durch chromogene Substrate:

Die erfindungsgemäßen Substrate werden für die Bestimmung von verschiedenen Enzymen verwendet, und zwar gemäß dem im folgenden beschriebenen Verfahren.

Das Prinzip für die Bestimmung beruht auf der Tatsache, daß das bei der enzymatischen Hydrolyse gebildete Spaltprodukt ein UV-Spektrum aufweist, das sich von dem des Substrats wesentlich unterscheidet. So haben beispielsweise sämtliche p-Nitroanilidsubstrate gemäß der Erfindung Absorptionsmaxima bei etwa 310 nm, wobei der molare Extinktionskoeffizient etwa 1200 beträgt. Bei 405 nm ist die Absorption dieser Substrate nahezu vollständig beendet. p-Nitroanilin, das während der enzymatischen Hydrolyse von dem Substrat abgespalten wird, weist ein Absorptionsmaximum bei 380 nm und einen molaren Extinktionskoeffizienten von 13 200 auf, der bei 405 nm lediglich auf 9620 abgesunken ist. Durch die spektrophotometrische Bestimmung bei 405 nm ist es somit leicht, die gebildete p-Nitroanilinmenge zu verfolgen. Diese Menge ist proportional zu dem Ausmaß der enzymatischen Hydrolyse, die ihrerseits durch die aktive Enzymmenge bestimmt wird. Tabelle II zeigt einen Vergleich von relativen Reaktionsgeschwindigkeiten zwischen bekannten Substraten gemäß Formel I, ihren nichtbenzoylierten Formen und Substraten gemäß der Erfindung. Aus dieser Tabelle geht eindeutig die Überlegenheit der Substrate der Erfindung hervor.

Dementsprechend sind Substrate der Erfindung um ein Mehrfaches besser als entsprechende Substrate mit N-terminalen L-Aminosäuren. Sie sind weiterhin mindestens so gut wie die zuvor bekannten, am besten wirkenden Substrate, nämlich die benzoylierten Substrate gemäß Formel I. Weiterhin stellt die bessere Löslichkeit der Substrate der Erfindung (20-300×) einen sehr großen Vorteil für die Enzymbestimmung, insbesondere in biologischen Systemen, dar, bei denen die geringe Löslichkeit von bisher bekannten Substraten zu Schwierigkeiten führte, und zwar teils infolge des Umstands, daß eine Substratsättigung nicht erreicht werden konnte, und teils infolge der Gefahr unerwünschter Ausfällungen.

Das für die Gelfiltration verwendete Gel Sephadex® G-15 ist ein quervernetztes Dextrangel. Das Gel Sephadex® LH-20 ist ein hydroxypropyliertes quervernetztes Dextrangel. Der Ionenaustauscher Sephadex® QAE-25 ist ein quervernetztes Dextrangel mit Diethyl-(2-hydroxypropyl)-aminoethylresten als funktionelle Gruppen.

Tabelle II

In der Tabelle II sind die relativen Reaktionsgeschwindigkeiten für die verschiedenen Substrate in bezug auf ein für jedes Enzym ausgewähltes Vergleichssubstrat angegeben. Abkürzungen, Bezugssubstrate und ihre Empfindlichkeit für die jeweiligen Enzyme ergeben sich aus der folgenden Aufstellung:

Claims

1. Tripeptide der allgemeinen Formel H-D-A₁-A₂-A₃-NH-Rin der A₁ und A₂ Ala, Val, Leu, Ile, Pipecolinsäure, Pro oder Aze, A₂ Gly oder Phe, A₃ Arg oder Lys und R eine Nitrophenyl-, Naphthyl-, Nitronaphthyl-, Methoxynaphthyl-, Chinolyl- oder Nitrochinolylgruppe bedeuten, sowie ihre Salze.

2. Verwendung von Tripeptiden nach Anspruch 1 zur Bestimmung von Serinproteasen.