DE2322115A1 - Substrate mit hoher empfindlichkeit fuer trypsin und andere proteolytische enzyme - Google Patents
Substrate mit hoher empfindlichkeit fuer trypsin und andere proteolytische enzymeInfo
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Description
DR.-ING. RICHARD GLAWE
MÜNCHEN
PATENTANWALT·=
DIPL-ING. KLAUS DtLHS · DIPL-PHYS. DR. WALTER MOLL
HAMBURG MÖNCHEN
8 MÖNCHEN 26 POSTFACH 37 UEBHERRSTR. 20
TEL (0811)22 6548
TELEX 522506ip«z
2 HAMBURG WAITZSTR. TEL (0411) »22 TELEX 212921 HMZ
BETRIFFT:
A 61
Aktiebolaget Bofors
Bofors / Schweden
Bofors / Schweden
MÖNCHEN
Substrate mit hoher Empfindlichkeit für Trypsin
und andere proteolytische Enzyme
Die Erfindung betrifft Substrate der allgemeinen Formel
-N-X-CH-C-NH-CH-C-NH-CH-C-NH-E
(CH9)
2'n
NH
309847/1172
in der E1 ein Wasserstoff atom, eine Acylgruppe "mUTT "bis* 12
232211S1,
■■ mit τ DiS 1;
Kohlenstoffatomen, eine ιλ>
-Aminoacylgruppe mit 1 "bis 12 Kohlenstoffatomen,
eine Cyclohexylcarbonylgruppe, eine \ju -Cyclohexylacylgruppe,
eine 4-Aminomethylcyclohexylcarbonylgruppe,
eine Benzoylgruppe, eine z.B. mit einem Halogenatom oder einer Methyl-, Amino- oder Phenylgruppe od.dgl. oder mit mehreren
dieser Substituenten substituierte Benzoylgruppe, eine
Uj-Phenylacylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen im Acylteil und gegebenenfalls mit Substituenten in dem Phenylrest, eine Benzolsulfonylgruppe oder eine 4-Ioluolsulfonylgruppe,
Ε« ein Wasserstoff atom, eine Phenylgruppe, eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder eine Cyclohexylgruppe,
I eine Einfachbindung oder eine Methylengruppe,
E, eine geradkettige, verzweigte oder cyclische.Alkylgruppe mit 3 bis 8 Kohlenstoffatomen,
Uj-Phenylacylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen im Acylteil und gegebenenfalls mit Substituenten in dem Phenylrest, eine Benzolsulfonylgruppe oder eine 4-Ioluolsulfonylgruppe,
Ε« ein Wasserstoff atom, eine Phenylgruppe, eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder eine Cyclohexylgruppe,
I eine Einfachbindung oder eine Methylengruppe,
E, eine geradkettige, verzweigte oder cyclische.Alkylgruppe mit 3 bis 8 Kohlenstoffatomen,
E. eine geradkettige, verzweigte oder cyclische Alky!gruppe
mit 3 bis 8 Kohlenstoffatomen oder eine Phenyl- oder Benzylgruppe,
η die Zahlen 2, 3 oder 4,
Ec ein Wasserstoff atom oder eine G-uanylgruppe und
Eg eine Phenyl-, Nitrophenyl-, Methylnitrophenyl-, Dinitrophenyl-, Haphthyl-, Nitronaphthyl-, Ohinolyl- oder Uitrochinolylgruppe bedeuten, sowie deren Salze.
Eg eine Phenyl-, Nitrophenyl-, Methylnitrophenyl-, Dinitrophenyl-, Haphthyl-, Nitronaphthyl-, Ohinolyl- oder Uitrochinolylgruppe bedeuten, sowie deren Salze.
"2" 309847/1175
ORIGINAL INSPECTED
Die Substrate der Erfindung weisen eine hohe Empfindlichkeit
bezüglich Trypsin und andere proteolytische Enzyme vom Typ der Peptid-Peptidohydrolasen auf. Die Substrate der Erfindung
können zur quantitativen Bestimmung von klassifizierten und bisher nicht klassifizierten Enzymen vom Typ
E.C. 3.4.4·, insbesondere von solchen Enzymen, die "Peptide
oder Proteine in der Peptidkette an der Carboxylseite. von Arginin oder Lysin abbauen, z.E<
Trypsin, Thrombin, Plasmin, Reptilase (Pentapharm, Basel, Schweiz), Arvine (Ferring AB,
Malmö, Schweden) und das bisher nicht klassifizierte Enzym
Brinase (AB Astra, Södertälje, Schweden). Die Substrate der
Erfindung können weiterhin zur Untersuchung von Reaktionen
verwendet werden, bei denen derartige Enzyme gebildet, inhibiert oder verbraucht werden, und auch für die Bestimmung von
Faktoren, die derartige Reaktionen beeinflussen oder daran teilnehmen, beispielsweise für die Bestimmung von Proenzymen,
Aktivatoren, Antienzymen und Enzyminhibitoren.
Die von der International Union of Biochemistry Elsevier,
Amsterdam, 1965, empfohlene Enzymnomenklatur wurde bei der Klassifizierung der Enzyme angewendet.
Verbindungen (Substrate), die bisher zur quantitativen Bestimmung der oben genannten Enzyme verwendet worden sind,
sind in "Methoden der enzymatischen Analyse1} Vol. I, Seite 1023 (Hrgs. Bergmeyer, H.U., Verlag Chemie, 1970) beschrieben
worden. In Abhängigkeit von der jeweils statt-
309847/1172
findenden katalytischen Reaktion des proteolytischen Enzyms —
die esterolytische oder die amidolytisclie Reaktion - können
diese synthetischen Substrate prinzipiell in zwei Hauptgruppen unterteilt werden: Estersubstrate und Amidsubstrate. Die
größte Gruppe der bisher verwendeten synthetischen Substrate ist diejenige der Estersubstrate. Dies liegt in dem Umstand
begründet, daß diese wesentlich schneller durch die Peptid-Peptidohydrolasen
umgewandelt werden als die bisher hergestellten Amidsubstrate. Die wesentlichste biologische Wirkungsweise
der als Peptid-Peptidohydrolasen klassifizierten Enzyme besteht, wie sich aus dem Namen ergibt, aus der Hydrolyse von
Peptid- oder Amidbindungen natürlicher Substrate, nicht jedoch von Esterbindungen. In der Literatur (Blood Clotting
Enzymology, Seite 36 und 42 - 44, Hrgs. Seegers W.H.,
Academic Press, 1967) ist berichtet worden, daß das Verhältnis zwischen den Reaktionsgeschwindigkeiten der esterolytischen
und der amidolytisehen Katalysen des Thrombins unter verschiedenen
Reaktionsbedingungen nicht konstant ist. Aus diesem Grunde besteht ein Bedürfnis für synthetische Amidsubstrate,
die bezüglich der in Rede stehenden Enzyme eine wesentlich größere Empfindlichkeit aufweisen und die auch schneller zu
meßbaren Produkten als die bisher bekannten abgebaut werden können.
Zur Untersuchung und Verfolgung des Reaktionsverlaufs der
enzymatischen Hydrolyse sind die Amidsubstrate besonders ge-
309847/117a
eignet, da sie folgendes ergeben:
a) Chromophore Produkte, die leicht spektrophotometriscli gemessen werden können und Lichtabsorptionsmaxima aufweisen,
die nicht mit denjenigen der ursprünglichen Amidsubstrate zusammenfallen;
b) fluoreszierende Produkte, die mittels Fluoreszenzspektrophotometrie
gemessen werden können;
c) Produkte, die nach der Kupplung mit einem geeigneten Reagens Kupplungsprodukte ergeben, welche photometrisch
mit hoher Empfindlichkeit gemessen werden können.
Einige synthetische Amidsubstrate mit hydrolyeierbaren
chromophoren Gruppen sind bereits verwendet worden. Diese stellen im wesentlichen N^-unsubstituierte und N0^-substituierte
Monoaminosäure-p-nitroanilidderivate sowie Monoaminosäure-ß-naphthylamidderivate
dar. Von diesen Substanzen kann N^-Benzoyl-DL-axginin-p-nitroanilid-Hydrochlorid (BAPNA) als
Reagens für Trypsin (E.C. 3.4.4.) sowie für Reaktionen, in denen Trypsin teilnimmt, genannt werden. Die enzymatische
Hydrolyse dieses Substrats liefert das chromophore Produkt p-Nitroanilin, das in leichter Weise spektroskopisch bestimmt
werden kann.
Diese bekannten Amidsubstrate weisen jedoch nicht die gewünschte Spezifizität und Empfindlichkeit auf. Dies stellt
309847/1172
einen erheblichen Nachteil dar, der ein komplexeres Verfahren "bei der Probenentnahme begründen kann, da man dann eine erhebliche
Menge an biologischem Material benötigt. Weiterhin ist die enzymatisch^ Reaktionszeit lang und die Genauigkeit
der EnzymbeStimmung kann unbefriedigend sein.
Die Substrate der Erfindung können gemäß zwei prinzipiell unterschiedlichen Methoden hergestellt werden.
Das erste Verfahren beruht auf der Kopplung der chromophoren Gruppe E1- mit der betreffenden Aminosäure und anschliessend
einem stufenweisen Aufbau der gewünschten Peptidstruktur mittels stufenweiser Ankopplung der übrigen Aminosäuren. Die
chromophore Gruppe wird hier als Blockierungsgruppe für die C-terminale Carboxylgruppe der ersten Aminosäure verwendet.
Das andere Verfahren beruht auf einem stufenweisen Aufbau der gewünschten Peptidstruktur und auf der anschließenden
Entfernung der verwendeten Blockierungsgruppen, wobei man
schließlich die chromophore Gruppe E,- an die Peptidstruktur
ankoppelt.
Pur die stufenweise Synthese der Peptidderivate sind solche
Kopplungsmethoden verwendet worden, die bekannt und in der Peptidchemie üblich sind. Bekannte und in der Peptidchemie
übliche Schutzgruppen sind z.B. Cbo (Carbobenzoxy), MeOCbo
309847/1172
(p-Methoxycarbobenzoxy), NOpCbo (p-Uitrocarbobenzoxy),
MCbo (p-Methoxyphenylazo-carbobenzoxy), BOC (tert-Butyloxycarbonyl),
TPA (Trifluoracetyl) oder Formyl. Diese werden als Aminoschutzgruppen verwendet. Die 'S- -Carboxylgruppe kann durch
die Umwandlung in verschiedene aktivierte, in der Peptidchemie bekannte und häufig verwendete Derivate aktiviert werden,
die entweder isoliert oder in situ erzeugt werden, z.B. p-Nitrophenylester, Trichlorphenylester, Pentachlorphenylester,
N-Hydroxysuccinimidester, Säureacide sowie Säureanhydride,
die entweder symmetrisch oder unsymmetrisch sein können. Die Aktivierung kann auch mit einem Carbodiimid, z.B. N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid,
durchgeführt werden. Die C-terminalen Carboxylgruppen in dem Aminopeptid- oder dem Aminosäurederivat
können geschützt werden, indem man sie beispielsweise zu dem Methyl-, Äthyl- oder Isopropylester oder durch Überführung in
das chromophore Anilinderivat überführt, welches somit als Schutzgruppe während des Aufbaus der Peptidkette wirkt. Diejenigen
freien funktioneilen Gruppen, die an der Reaktion nicht teilnehmen, können während der Synthese der Peptide
oder der Peptidderivate in der folgenden Weise geschützt werden:
Zum Zwecke des Schutzes der Arginyl- C*-guanidogruppe und
der Lysyl-i-aminogruppe kann man solche Aminoschutzgruppen
verwenden, die in der Peptidchemie üblich sind, beispielsweise NO2, Tos (p-Toluolsulfonyl) oder lediglich die Proto-
309847/1172
nierung als Schutz für die Guanidogruppe, und Cbo (Carbobenzoxy), BOC (tert.-Butyloxycarbonyl) oder auch Tos für die
£ -Aminogruppe. Zum Schütze der Hydroxylgruppe im Tyrosin
kann man in der Peptidchemie übliche Schutzgruppen, beispielsweise Benzyl und tertiäre Butylschutzgruppen, verwenden.
Bei der stufenweisen Synthese der Peptidstruktur kann nach jeder Ankopplung einer neuen Aminosäure eine systematische
Reinigung mittels Gelfiltration durchgeführt werden. Für diese Gelfiltration verwendet man eine Kolonne, die mit einem
für die Gelfiltration geeigneten Material gefüllt ist, z.B. ein vernetztes Dextrangel vom Typ Sephadex G oder LH
(Pharmacia Pine Chemicals, Uppsala, Schweden). Andere geeignete Gele bestehen aus Vinylacetat-Copolymeren, z.B. vom Typ
■p
Merckogel OR-PVA (AG E. Merck, Darmstadt, Westdeutschland).
Das Gelmaterial wird äquilibriert mit einem geeigneten Lösungsmittel
eingesetzt. Die Eluierung wird dann mit dem gleichen Lösungsmittel durchgeführt, z.B. mit Methanol, Äthanol,
Aceton, Dimethylformamid, Dime thyIacetamid, Dimethylsulfoxid
oder Hexamethylphosphorsäuretriamid.
Die. Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen
näher erläutert, die die Herstellung von verschiedenen Substraten der Erfindung durch stufenweise Synthese zeigen.
Der Gegenstand der Erfindung ist jedoch nicht auf diese Ausführungsbeispiele beschränkt.
- 8 - 309847/1172
Pur die dünnschiehtchromatographische Analyse der Eluate
und der Produkte wurden Glasplatten mit Silicagel (F 254, AG E. Merck, Darmstadt, Westdeutschland) als Absorptionsmedium verwendet. Für die Entwicklung der Dünnschicht ehr omatogramme
wurden die folgenden Lösungsmittelsysteme verwendet»
A: n-Butanol : Essigsäure : Wasser (5:1ί1)
C: n-Propanol : Äthylacetat : Wasser (7ί1ί2)
D: n-Heptan : n-Butanol : Essigsäure (3*2:1)
P1I Chloroform : Methanol (9:1)
Nach der Dünnschichtchromatographie wurden die Platten zunächst im UV-Licht (254 nm) und anschließend mit der Chlor/
Toluidin-Reaktion (G. Pataki, DünnschichtChromatographie in
der Aminosäure- und Peptidchemie, Walter de Gruyter & Co., Berlin, 1966, Seite 125) entwickelt.
Falls nichts Gegenteiliges angegeben ist, weisen sämtliche Aminosäuren die L-Konfiguration auf. Es werden die folgenden
Abkürzungen verwendet:
AIa = Alanin
Arg = Arginin
He = Isoleucin
Leu = Leucin
Lys = Lysin
VaI a Valin
Arg = Arginin
He = Isoleucin
Leu = Leucin
Lys = Lysin
VaI a Valin
309847/1172 - 9 -
Weitere in den Beispielen verwendete Abkürzungen "sind die folgenden:
| Ac | = Acetyl |
| Ac2O | = Acetanhydrid |
| AcOH | = Essigsäure |
| BOC | = tert.-Butyloxycarbonyl |
| Bz | = Benzoyl |
| BzI | = Benzyl |
| Bz2O | = Benzoesäureanhydrid |
| Cbo | = Carbobenzoxy |
| DCCI | = Dicyclohexylcarbodiimid |
| DCHA | = Dicyclohexylamin |
| DGU | = Bicyclohexylcarbamid |
| DMP | s= Dimethylformamid |
| Bt-H | = Triäthylamin |
| HMPTA | = N,N,N' ylV ,2T",N"-Hexamethylphosphorsäuretriamid |
| MCbo | = p-Methoxyphenylazocarbobenzoxy |
| MeOH | = Methanol |
| UA | = Naphthylamin |
| OtBu | ss tert. -Butyl oxy |
| OEt | = Äthyloxy |
| OMe | = Methyloxy |
| OpNP | s= p-Nitrophenoxy |
| OisoPr | s= iso-Propyloxy |
| pNA | = p-ITitroanilid |
- 10 -
309847/117a
| = Trifluoracetyl | 2322115 | |
| TFA | = p-Toluolsulfonyl | |
| Tos | . = Dünnschichtchromatographie | |
| TLC | ||
Die Gele SephadexR G-15 und G-25, die für die Gelfiltration
eingesetzt wurden, sind jeweils vernetzte Dextrangele mit unterschiedlichem Vernetzungsgrad und bei Pharmacia Pine
Chemicals, Uppsala, Schweden, erhältlich. Das Gel Sephadex LH-20 ist ein hydroxypropyliertes vernetztes Dextrangel der
Pharmacia Pine Chemicals, Uppsala, Schweden.
Beispiel I : H - Leu - Leu - Arg - pNA - 2 HCl
Beispiel Ia ; Cbo - Arg (ITOn) - pNA
35,5 g (0,1 Mol) trockenes Cbo - Arg (NO2) - OH werden
in 200 ml frisch destilliertem HMPTA bei Raumtemperatur gelöst. Dazu werden 10,1 g (0,1 Mol) Et5N und 24,6 g (0,15 Mol)
p-Nitrophenylisocyanat unter Rühren und unter völligem Feuchtigkeitsausschluß
zugegeben. Nach 24 Stunden bei Raumtemperatur wird die Reaktionsmischung in 2 1 einer 2 #igen Natriumbicarbonatlösung
unter Rühren eingegossen. Der sich abscheidende Niederschlag wird abfiltriert und dreimal mit 0,5 1
einer 2 jGigen Natriumbicarbonatlösung, zweimal mit 0,2 1
309847/1172
destilliertem Wasser, zweimal mit 0,5 1 einer 0,5 N Salzsäure und schließlich fünfmal mit 0,2 1 destilliertem Wasser gewaschen.
Nach dem Trocknen wird das Rohprodukt in warmem Methanol suspendiert. Der unlösliche Teil, der aus N,N1-bisp-Nitrophenylcarbamid
besteht, wird abfiltriert. Das 3?iltrat wird durch Gelchromatographie an einer Sephadexi^ LH-20 Kolonne,
äquilibriert mit Methanol, gereinigt.
Ausbeute 29,8 g (63,0 ^) Ia, Smp.185 - 1880C, homogen
nach TLG in P. und C.
Ac0H)
Beispiel Ib ϊ Cbo - Leu - Arg (NOo) -
Herstellungsverfahren: 5,0 g (10,6 mMol) Ia werden in
21 ml Essigsäure und 22 ml 4 N HBr in Essigsäure unter vollständig
trockenen Bedingungen gelöst. Die Reaktionsmischung wird 1 Stunde lang gerührt und danach in 200 ml Äther unter
heftigem Rühren eingegossen. 1,5 HBr· H - Arg (HO2) - pNA
fällt aus. Die ätherische Lösung wird dekantiert und der körnige Rückstand weitere dreimal mit 100 ml Äther behandelt,
um Benzylbromid und überschüssiges HBr und AcOH zu entfernen. Nach dem Trocknen im Vakuum über P2Qc ^s^ d^e -A^8^0^^6 des
Hydrobromids des Aminosäurederivats quantitativ (4»87 g).
4,87 g (10,6 mMol) 1,5 HBr. H - Arg (NO2) - pNA werden in
50 ml destilliertem DMF gelöst. Die Lösung wird auf - 100C
- 12 -
309U7/1172
gekühlt. Dann werden 1,6 g (15,9 mMol) lt,N zugegeben, um H - Arg (NOp) - pNA aus seinem Hydrobromid freizusetzen. Man
läßt die Mischung 1 Stunde lang unter Feuchtigkeitsausschluß reagieren. Ausgefallenes Triäthylamin-Hydrobromid wird abfiltriert
und das Piltrat auf - 1O0C gekühlt. Man setzt 4,3 g
(12,7 mMol) Cbo - Leu - OpNP zu und die Lösung kann sich nun langsam auf Raumtemperatur erwärmen. Nach 3 Stunden wird die
Lösung erneut auf - 100C gekühlt und mit 0,55 S (5 mMol) Et,N
gekühlt. Die Pufferprozedur wird ein weiteres Mal nach 2-3 Stunden wiederholt. Nach einer Reaktionszeit von 24 Stunden
wird die Lösung bei 400C im Vakuum zur Trookne eingedampft.
Der Rückstand wird dreimal mit 100 ml destilliertem Wasser behandelt
und wird danach im Vakuum getrocknet. Reinigung: Der trockene Rückstand wird in Methanol gelöst und durch Gelchromatographie
an einer Sephadex:^ LH-20 - Kolonne, äquilibriert mit Methanol, gereinigt. Ausbeute: 6,1 g (°/8 $>)
amorphes Ib, homogen gemäß TLC in P.. J I5 = - 33,3° (c = 1,0; MeOH)
Beispiel Ic : Cbo - Leu - Leu - Arg (NOO - pNA
Ausgangsmaterial: 2,8 g (4,77 mMol) Ib und 2,22 g (5,72 mMol) Cbo - Leu - OpNP.
Herstellungsverfahren: Gemäß Beispiel Ib.
Reinigung: Gelchromatographie an Sephadex LH-20 in Methanol.
- 13 -
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Ausbeute 2,5 g (80 fi) amorphes Ic, homogen gemäß ILC
in P1.
\jj τ) - -9»9°(c=1,O$ DMP)
Beispiel Id : H - Leu - Leu - Arg - pNA · 2 HCl
134,2 mg (0,192 mMol) Ic werden in das Reaktionsgefäß
einer Sakakibara-Apparatur gegeben. In das Reaktionsgefäß werden 5 ml trockenen Fluorwasserstoffs destilliert. Man läßt
1 Stunde unter Rühren reagieren. Dadurch wird die die Guanidinofunktion des Arginine schützende Nitrogruppe und die
Cbo-Gruppe abgespalten. Danach destilliert man den Fluorwasserstoff unter vermindertem Druck ab und löst den trockenen
Rückstand in DMF. Um das erhaltene Hydrofluoridderivat des Peptide in sein Hydrochlorid zu überführen, werden 0,25 ml
konzentrierter Salzsäure zu der DMF-Lösung gegeben. Nach dem
Verdampfen wird das Umwandlungsverfahren ein weiteres Mal
wiederholt.
Reinigung: Der Rückstand nach der letzten Verdampfung wird in einer Lösung von 50 #iger Essigsäure gelöst und durch Gelchromatographie
an einer Sephadex^ G-25 - Kolonne, äquilibriert mit 50 #iger Essigsäure, gereinigt. Die das reine
Tripeptid-Hydro Chloridderivat enthaltende Eluatfraktion wurde
lyophilisiert.
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- 14 -
Ausbeute 80,0 mg (71 #) amorphes I, Chlorgehalt 11,83
homogen gemäß TLC in A.
C<-k.J ψ = - 29,9° (c = O,59j 50 # AoOH)
Die Aminosäureanalyse zeigt das folgende Verhältnis: Leu: 2,0; Arg: 0,95.
Beispiel II : Ν°° - Bz - Leu - Leu - Arg - pNA · HCl
Beispiel Ha : I'A - Bz - Leu - Leu - Arg (UO 2 ) - pNA
Ausgangsmaterialien; 703 mg (1 mMol) Ic und 272 mg
(1,2 mMol) Bz2O.
Syntheseverfahren: Die Decarbobenzoxylierung von Ic wird
gemäß Beispiel Ib durchgeführt. Das trockene Produkt H - Leu Leu
- Arg (ITO2) - pNA · HBr wird abfiltriert. Das Piltrat wird
auf - 100C gekühlt und mit 272 mg (1,2 mMol) Bz2O versetzt.
Nach einer Reaktionszeit von 3 Stunden hat die Lösung Raumtemperatur erreicht. Sie wird erneut gekühlt und mit 0,07 ml
(0,5 mMol) Et5N gepuffert. Die Pufferprozedur wird nach 3 Stunden
wiederholt. Nach einer Reaktionszeit von 24 Stunden wird die Lösung im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand
wird gemäß dem im Beispiel Ib beschriebenen Verfahren aufgearbeitet und getrocknet.
Reinigung: Gelchromatographie an Sephadex LH-20 in Methanol.
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Ausbeute: 550 mg (82 #) amorphes Ha, homogen gemäß
TLC in P1.
pXj |5 = -3,6° (c = 1,01 j DMF)
pXj |5 = -3,6° (c = 1,01 j DMF)
II ι Έ^ -Bz - Leu - Leu - Arg - pUA · HCl (II)
Ausgangsmaterial: 554,8 mg (0,828 mMol) Ha.
Syntheseverfahren: Gemäß Beispiel Id.
Reinigung: Gelchromatographie an Sephadex G-15 in 20 i>
AcOH und SephadexR LH-20 in Methanol.
Ausbeute 476 mg (87 fo) lyophilisiertes, amorphes II,
Chlorgehalt 5,30 j6, homogen gemäß TLC in A.
D^J I3 = -73,0° (c = 0,66\ 50 # AcOH)
Die Aminosäureanalyse zeigt die folgenden Anteile:
Leu: 2,0} Arg: 0,95.
Beispiel III : H - ß - Cyclohexyl - Ala - VaI - Arg -
pNA » 2 HCl (III)
Cbo - VaI - Arg (NOo) - pHA (IHa)
Ausgangsmaterialien: 20,6 g (43,5 mMol) Ia und 20,3 g (54,3 mMol) Cbo - VaI - OpNP.
Syntheseverfahren: Gemäß Beispiel Ib.
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- 16 -
Reinigung: Umkristallisation des Rohprodukts aus Methanol.
Die Mutterlauge wird mittels Gelchromatographie an SephadexT
LH-20 in Methanol gereinigt.
Auebeute» 23,2 g (93,3 $) IHa, Smp. 200 - 2020C, homogen
TLC in P1 und C.
S = +5,8° (c = 1,0j DMP)
S = +5,8° (c = 1,0j DMP)
Cbo - β - Cyclohexyl - Ala - YaI - Arg* ( W 2 ) - PEA (IIIb)
Auegangsmaterialien: 0,48 g (0,83 mMol) IHa und 0,53 g
(1,24 mMol) Cbo - β - Cyclohexyl - Ala - OpNP mit einem Smp. yon 105 - 1060C und /j^J ^ = -28,8° (c ■ 1,0; DMP).
Syntheseverfahrens Gemäß Beispiel Ib.
Reinigung» Gelchromatographie an Sephadesr LH-20 in
Methanol.
Ausbeute» 531 Bg (88 Ji) amorphes IHb, homogen gemäß
TIC in P1.
ß*-J 23 e _7f3o (o m 2>0| DMp)
ß*-J 23 e _7f3o (o m 2>0| DMp)
H - ß - Oyolohexyl - AIa - VaI - Arg - pHA · 2 HOl (III)
Ausgangsmaterialt 120,4 mg (0,165 mMol) HIb.
17 " 309847/1172
Syntheseverfahren: G-emäß Beispiel Id.
Reinigung: Gelohromatographie an Sephadex G--15 in
20 #iger Essigsäure.
Ausbeute: 56,6 mg (55 #) lyophilisiertes, amorphes III,
Chlorgehalt 11,32 #, homogen gemäß !ELC in A. l'r^J ψ = -36,8° (c m 0,62f 50 # AcOH)
Die Aminosäureanalyse zeigt die folgenden Verhältnisse: VaI: 1,0} ß-Cyclohexyl-Ala: 1,1; Arg: 1,0.
Beispiel'IV : N - Bz - ß - Cyclohexyl - Ala - VaI -
Arg - pNA « HOl (IV)
Ausgangsmaterialien} 243 ag (0,335 mMol) HIb und 93
(0,41 mMol)
Syntheseverfahren: Gemäß Beispiel Ha.
Reinigung: Grelohromatographie an Sephadex LH-20 in
Methanol.
Ausbeute: 147 mg (63 $·) IVa, Sap. 148 - 1520C, hOMOgen gemäß SLC in P1. -
7$? - -6,33° (c ■ 0,84| DMP)
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— 18 —
H- Bz - ß - Cyclohexyl - Ala - VaI - Arg - pNA . HOl (IV)
Ausgangsmaterial: 10β,0 mg (0,152 mMol) IVa.
Syntheseverfahren: Gemäß Beispiel Id.
T>
Reinigung: Gelchromatographie an Sephadex G-I5 in
20 i> AcOH.
Ausbeute: 86,7 mg (84 #) lyophilisiertes, amorphes IV,
Chlorgehalt 5f10 #, homogen gemäß TLC in A.
C^J ψ = -77° (c = 0,3J 50 # AcOH)
Die Aminosäureanalyse zeigt die folgenden Anteile: VaI: 1,0; ß-Cyclohexyl-Ala: 1,2; Arg: 1,0.
Beispiel V : N-Bz-N-Cyclohexyl-ß-Ala-Val-Arg-pNA'HCl (V)
H-Cbo-N-Cyclohexyl-ß-Ala-Val-Arg(NO 2 )-pNA (Va)
Ausgangsmaterial: 286 mg (0,5 mMol) IHa und 300 mg (0,7 mMol) N-Cbo-N-Cyclohexyl-ß-Ala-OpNP.
Syntheseverfahren: Gemäß Beispiel Ib.
Reinigung: Gelchromatographie an Sephadex I»H-20 in
Methanol.
_ 19 J
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Ausbeute; 313 mg (86 fi) amorphes Va, homogen gemäß
TLC in P1.
£= + o°(c=i,oj
ir-Bg-N-Oyolohexyl-p-Ala-Val-Arg (UOn)-PHA (Vb)
Ausgangsmaterialϊ 300 mg (0,413 mMol) Va und 123 mg
(0,544 mMol)
Syntheseverfahren: Gemäß Beispiel Ha.
Reinigung: Gelchromatographie an Sephadex LH-20 in Methanol.
Ausbeute: 243,5 mg (87 ^) amorphes Vb, homogen gemäß
TLC in P1.
/el·* 7 τι — 0,5 (c = 0,43J DMP)
/el·* 7 τι — 0,5 (c = 0,43J DMP)
™* SJ
H-Bz-H-Cyolohegyl-p-Ala-Val-Arg'pHA'HCl (V)
Ausgangsmaterial: 170 mg (0,242 mMol) Vb.
Syntheseverfahren: Gemäß Beispiel Id.
Reinigung: Gelchromatographie an Sephadex LH-20 in Methanol.
"20" 309847/1172
Ausbeute: 126 mg (76 $) lyophilisiertes, amorphes V,
Chlorgehalt 5» 11 5^, homogen gemäß 03LC in A.
CcLj £5 = -38,5° (c = 0,69; 50 ?έ AcOH)
Die Aminosäureanalyse zeigt die folgenden Anteile:
VaIi 1,0ι H-Cyelohexyl-ß-Ala: 1,3J Arg: 0,9.
Beispiel YI : ür^-Bz-Val-Val-Arg-pHA'HCl (VI)
CbO-YaI-YaI-ATg(NO 2 )-ρΚΑ (Via)
Ausgangsmaterial: 1,97 g (3,43 mMol) IIIa und 1,6 g
(4,2 mMol) Cbo-Yal-OpHP.
Syntheseverfahren: Gemäß Beispiel Ib.
Reinigung: Gelehromatographie an Sephadex^ LH-20 in
Methanol.
Ausbeute: 1,9 g (82 #) amorphes YIa, homogen gemäß TLC
in P1 und C.
ff01 -.Bz-Yal-Val-Arg( W 2 ) -pNA (VIb)
Ausgangsmaterial: 1,9 g (2,83 mMol) VIa und 0,77 g (3,40 mMol)
Syntheseverfahren: Gemäß Beispiel Ha.
309847/1172
- 21 -
Reinigung: GelChromatographie an Sephadex LH-20 in
Methanol.
Ausbeute: 1,45 g (80 $>) amorphes VIb, homogen gemäß
TLC in P1.
C^J'f B + 5»6° (° '- 1»01' DMP)
^ -Bz-Val-Val-Arg-pHH'HCl (VI)
Ausgangsmaterial: 362 mg (0,564 mMol) VIb.
Syntheseverfahren: Gemäß Beispiel Id.
. Reinigung: Ge!Chromatographie an Sephadex G--15 in
33 i> AcOH.
Ausbeute: 248 mg (69,7 $>) lyophilisiertes, amorphes VI,
Chlorgehalt 5,54 #> homogen gemäß TLC in A. I'clJ 24 = -57,o° (c = 0,65 J 50 $>
AcOH) Die Aminosäureanalyse zeigt die folgenden Verhältnisse:
VaI: 2,Oj Arg: 0,9.
Beispiel VII : N0^-Bz-LeU-Val-Arg-pNA*H01 (VII)
Cbo-Leu-Val-Arg( FO 2 )-pHA (VIIa)
Ausgangsmaterial: 1,97 g (3,43 mMol) IHa und 1,7 g (4,2 mMol) Cbo-Leu-OpNP.
309847/1172 - 22 -
Syntheseverfahren: Gemäß Beispiel Ib.
-ρ
Reinigung: GelChromatographie an Sephadex LH-2O in
Methanol.
Ausbeute: 2,05 g (87 #) amorphes VIIa, homogen gemäß
TLC in P1 und C.
H ^ -Bz-Leu-Val-Arg;( NOn) -pffA (VIIb)
Ausgangsmaterialien: 1,75 g (2,55 mMol) VIIa und 695 mg
(3,06 mMol) Bz2O.
Syntheseverfahren: Gemäß Beispiel Ha.
TS
Reinigung: Gelchromatographie an Sephadex LH-20 in Methanol.
Ausbeute: 1,49 g (91 #) amorphes VIIb, homogen gemäß TLC
in P1.
• __, , ο Λ ( f\ — Ί Λ Ί ·
— D ~ » ν — » ι
• __, , ο Λ ( f\ — Ί Λ Ί ·
— D ~ » ν — » ι
H ^-Bz-Leu-Val-Arg-pUA'HCl (VIl)
Ausgangsmaterial: 319 mg (0,486 mMol) VIIb. Syntheseverfahren: Gemäß Beispiel Id.
•n
Reinigung: GelChromatographie an Sephadex G-15 in
309847/1172
Ausbeute: 276 mg (88 <$>) lyophilisiertes, amorphes VII,
Chlorgehalt 5,41 #, homogen gemäß TLC in A. C^-J |4 = -52,0° (c = 0,65? 50 £ AcOH)
Die Aminosäureanalyse zeigt die folgenden Verhältnisse:
Vali 1,Oj Leu: 1,1; Arg: 0,95.
Beispiel VIII : Ή^ -Bz-Ile-Val-Arg-pffA HCl (VIII)
Cbo-Ile-Val-Arg(Jro2)-pNA (Villa)
Ausgangsmaterial: 1,97 g (3,43 mMol) IHa und 1,7 g (4,2 mMol) Cbo-Ile-OpHP.
Syntheseverfahren: Gemäß Beispiel Ib.
Reinigung: G-elchromatographie an Sephadesr LH-20 in
Methanol.
Ausbeute: 2,0 g (85 $> amorphes Villa, homogen gemäß
TLC in P,.
U ^-Bz-Ile-Val-ArgCIQ2)-pNA (VIIIb)
Ausgangsmaterial: 1,75 g (2,55 mMol) Villa und 695 mg (3,06 mMol) Βζ£0.
Syntheseverfahren: Gremäß Beispiel Ha.
- 24 -
309847/1 172
Reinigung: Gelchromatographie an Sephadex LH-20 in Methanol.
Ausbeute: 1,46 g (89 $>) amorphes VIIIb, homogen gemäß
TLC in P..
N^-Bz-Ile-Val-Arg-pNA'HOl (VIII)
Ausgangsmaterial: 319 mg (0,486 mMol) VIIIb. Syntheseverfahren: Gemäß Beispiel Id.
Reinigung: Gelchromatographie an Sephadeasr G-15 in
33 #iger AcOH.
Ausbeute: 264 mg (84 ^) lyophilisiertes, amorphes VIII,
Chlorgehalt 5»43 $>>
homogen gemäß TLC in A. C*-J ψ = -29,9° (c = 0,59} 50 $ AcOH)
Die Aminosäureanalyse zeigt die folgenden Verhältnisse:
VaL: 1f0f He: 0,9? Arg: 1,1.
Beispiel IX : K^-Bz-Val-Ile-Arg-pNA'HCl (IX)
Cbo-Ile-Arg(NO2)-pNA (IXa)
Ausgangsmaterialien: 4,9 g (10,4 mMol) Ia und 6,2 g
(16 mMol) Cbo-Ile-OpNP.
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Synth.es ever fahr en: Gemäß Beispiel Ib.
Reinigung: GelChromatographie an Sephadex 1H-20 in
Methanol.
Ausbeute: 4,75 g (78,1 fo) teilweise kristallines IXa,
homogen gemäß TLC in P1.
3 2'5° (° = 1'°*
Cbo-Val-Ile-ArgC HOo)-PlTA (IXb)
Ausgangsmaterialien: 800 mg (1,37 mMol) IXa und 615 mg
(1,65 mMol) Cbo-Val-OpEP.
Syntheseverfahren: Gemäß Beispiel Ib.
T)
Reinigung» Gelchromatographie an Sephadex LH-20 in Methanol.
Ausbeute: 833 mg (88,5 $) amorphes IXb, homogen gemäß
TIC in P1.
7 = —3 23^ (c = 1 1t SMF)
N'* -Bz-YaI-IIe-ATg(IfO2)-pNA (IXc)
Ausgangsmaterialien: 500 mg (0,73 mMol) IXb und 198 Big
(0,876 mMol)
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- 26 -
Syntheseverfahren: Gemäß Beispiel Ha.
Eeinigung: Gelchromatographie an SephadexT LH-2O in
Methanol.
Ausbeute: 374 mg (78 $>) amorphes IXc, homogen gemäß
TLC in P1.
P = + 1,9° (c = 0,99;
N -Bz-Val-Ile-Arg-pNA-HCl (IX)
Ausgangsmaterial: 200 mg (0,305 mMol) IXc.
Syntheseverfahren: Gemäß Beispiel Id.
Eeinigung: Gelchromatographie an Sephadex G-15 in
33 $ AcOH.
Ausbeute: 153 mg (77,5 #) lyophilisiertes, amorphes IX,
Chlorgehalt 5»40 #, homogen gemäß TLC in A.
/S<J Jp = -56,4° (c = 0,64} 50 # AcOH)
Die Aminosäureanalyse zeigt die folgenden Verhältnisse:
VaI: 1,01 He: 1,1} Arg: 1,1.
Beispiel X : N^-Bz-Val-Leu-Arg-pNAΉ01 (X)
Cbo-Val-Leu-Argf NO 2 ) -pNA (Xa)
Ausgangsmaterial: 880 mg (1,5 mMol) Ib und 670 mg (1,8 mMol) Cbo-Val-OpNP.
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- 27 -
Syntheseverfahren: Gemäß Beispiel Ib.
Reinigung: Gelchromatographie an Sephadex* LH-20 in
Methanol.
Ausbeute: 882 mg (86 ^) amorphes Xa, homogen gemäß
TLC in P1.
^5 = -6,6° (c = 1,01} DMP)
N °" -Bz-Val-Leu-Arg(NO 2 ) -pNA (Xb)
Ausgangsmaterial: 400 mg (0,583 mMol) Xa und 160 mg
(0,707 mMol)
Syntheseverfahren: Gemäß Beispiel Ha.
Reinigung: GelChromatographie an Sephadex LH-20 in
Methanol.
Ausbeute: 279 mg (73 $>) amorphes Xb, homogen gemäß
TLC in P1.
P = -0,4° (c /1,04} DMP)
N -Bz-Val-Leu-Arg-pNA-HCl (X)
Ausgangsmaterial: 150 mg (0,23 mMol) Xb.
Syntheseverfahrenι Gemäß Beispiel
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- 28 -
23221
ag: Gelchromatographie an Sephadex
33 # AcOH.
Ausbeutet 126 mg (84,5 $> ) lyophilisiertes, amorphes X,
Chlorgehalt 5,45 $>, homogen gemäß TLC in A.
J3 = -54,0° (c « O,64| 50 Ji AcOH).
D
Die Aminosäureanalyse zeigt die folgenden Verhältnisse: VaI: 1,Of Leu» i,if Arg: 1,0.
Die Aminosäureanalyse zeigt die folgenden Verhältnisse: VaI: 1,Of Leu» i,if Arg: 1,0.
Beispiel XI χ T^ -Bz-Ile-Ile-Arg-pffA HCl (XI)
Obo-Ile-Ile-Arg(NO2)-pNA (XIa)
Ausgangsmaterial: 800 mg (1,37 mMol) IXa und 640 mg (1,66 mMol) Cbo-Ile-OpNP.
Syntheseverfahrenj Gemäß Beispiel Ib.
Reinigung: Gelchromatographie an Sephadex LH-20 in Methanol.
Ausbeute: 836 mg (87,5 #) teilweise kristallines XIa,
homogen gemäß ILC in P1.
|3 - -5,7° (c = 1,04» DMP)
Ausgangsmaterialj 440 mg (0,63 mMol) XIa und 171 mg
(0,76 aMol) Bz2O.
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Synthese verfahren» Gemäß Beispiel Ha.
■ Eeinigung* Gelchromatographie an Sephadex LH-20 in
Methanol.
Ausbeute» 409 mg (97 $>) teilweise kristallines XIb,
homogen gemäß TLC in P1.
N^ -Bz-Ile-Ile-Arg-pNA-HCl (XI)
Ausgangsmaterial: 201 mg (0,3 mMol) XIb.
Syntheseverfahren; Gemäß Beispiel I.
TO
Reinigung: Grelchromatographie an Sephadex G-15 in
33 $ AcOH.
Ausbeute; 172 mg (87 &) lyophilisiertes, amorphes XI,
Chlorgehalt 5,33 £, homogen gemäß TLC in A. p*-J ψ = -57,0° (c = 0,67} 50 $ AcOH).
Die Aminosäureanalyse zeigt die folgenden Verhältnissei
lie» 2,0} Arg» 0,9.
Beispiel XII ; Ν** -Bz-Leu-Ile-Arg-pITA'HCl (XII)
CbO-LeU-He-ATg(FO2 )-pUA (XIIa)
Ausgangsmaterialt 800 mg (1,37 mMol) IXa und 640 mg
(1,66' mMol) Cbo-Leu-OpNP.
. 30 _ 309847/ 11 72
Syntheseverfahren: Gemäß Beispiel Ib.
Heinigung: Gelchromatographie an Sephadex LH-2O in
Methanol.
Ausbeute: 772 mg (81 #) amorphes XIIa, homogen gemäß
TLC in P1.
C<**J j? β -7»3° (c m 1,02} DMF)
C<**J j? β -7»3° (c m 1,02} DMF)
N0^-Bz-Leu-Ile-Arg(N0 2 )-pKA (XIIb)
Ausgangsmaterial: 500 mg (0,72 mMol) XIIa und 205 mg (0,86 mMol) BZpO.
Syntheseverfahren: Gemäß Beispiel ITa.
Reinigung: Gelchromatographie an Sephadex LH-20 in Methanol.
Ausbeute: 482 mg (82 $) amorphes XIIb, homogen gemäß
TLC in P1.
*_7 jp = +0,5° (c = 1,03; DMF)
N -Bz-Leu-Ile-Arg-pKA »HCl (XII)
Ausgangsmaterial: 193 mg (0,288 mMol) XIIb.
Syntheseverfahren: Gemäß Beispiel I.
_ 31 _ 309847/ 1 172
Reinigung: Gelchromatographie an Sephadex G-15
33 # AcOH.
Ausbeute: 166 mg (86 $>) lyophilisiertes, amorphes XII,
Chlorgehalt 5,34 fi, homogen gemäß TLO in A. C<*-J β5 = -51,4° (c = 0,67? 50 # AcOH)
Die Aminosäureanalyse zeigt die folgenden Verhältnisse: Leu: 1,0; He: 1,2$ Arg: 0,9.
Beispiel XIII : W*~ -Bz-Ile-Leu-Arg-pNA'HOl (XIII)
Cbo-Ileu-Leu-Arg-(NO 2 )-pNA (XIIIa)
Ausgangsmaterial: 880 mg (1,5 mMol) Ib und 696 mg (1,8 mMol) Cbo-Ileu-OpNP.
Syntheseverfahren: Gemäß Beispiel Ib.
Reinigung: Gelchromatographie an Sephadex LH-20 in
Methanol.
Ausbeute: 750 mg (71 %>) amorphes XIIIa, homogen gemäß
TLO in P1.
I3 * -9,85° (c = 1,05| DMF)
H^-Bz-Ileu-Leu-Arg(NO 2 ) -pHA (XIIIb)
Ausgangematerial: 498 mg (0,71 mMol) XIIIa und 193 mg
(0,85 mMol) Bz9O.
_ 32 _ 309847/1172
Syntheseverfahren: Gemäß Beispiel Ha.
Reinigung} Gelchromatographie an Sephadexr LH-20 in Methanol.
Ausbeute: 345 mg (73 /^) teilweise kristallines XIIIb,
homogen gemäß TLC in P..
CdLJ <p = - 5,7° (c = 1,04| BMP)
CdLJ <p = - 5,7° (c = 1,04| BMP)
H01 -Bz-Ile-Leu-Arg-pNA'HCl (XIII)
Ausgangsmaterial: 170 mg (0,254 mMol) XIIIb.
Syntheseverfahrent Gemäß Beispiel I.
Reinigung! Gelchromatographie an Sephadexr G-15 in
33 + AcOH.
Ausbeutet 129 mg (77 1>) lyophilisiertes, amorphes XIII,
Chlorgehalt 5,31 5*, homogen gemäß TLC in A.
C* J jp = - 49,9° (c = 0,68} 50 t AcOH)
Sie Aminosäureanalyse zeigt die folgenden Verhältnissei
Leut 1,0} He: 1,1 j Argi 1,05«
Beispiel XIY t Ν0*" -Bz-Leu-Leu-Arg-2-NA»HCl (XIY)
Obo-Arg(IK) 2 )-2-yA (XIVa)
3»6 g (10 mliol) trockenes Cbo-Arg(N02)-0H werden in 200 ml
TH? gelöst. 1,0 g (10 mMol) Et,N werden zugegeben, wonach man
30m7/1172
- 33 -
die Lösung auf -1O0C unter vollständigem Peuchtigkeitsausschluß
kühlt.
1f3 g (10 mMol) Chlorameisensäureisobutylester, gelöst in
10 ml THf, werden Innerhalb von 10 Minuten zu der gekühlten Lösung gegeben. Danach fügt man nach weiteren 10 Minuten
1i72 g (.10 mMol) 2-Naphthylamin hinzu. Man läßt die Reaktionsmischung Raumtemperatur erreichen und läßt sie bei dieser
Temperatur 24· Stunden lang stehen. Sie Reaktionsmischung wird im Vakuum zur Trockne eingedampft, wird 3- bis 5mal mit
destilliertem Wasser, 3- bis 5mal mit einer 5 ^igen Natriumbicarbonatlösung
und wiederum 3- bis fjmal mit destilliertem
Wasser behandelt und anschließend im Vakuum getrocknet.
Reinigung) Gelchromatographie an Sephadex LH-20 in
Methanol.
Ausbeutet 4,05 g (84 l·) teilweise kristallines XIVa,
homogen gemäß TLC in P^ und C.
C^J D3 a +7f35° (c « 1,0} DMF).
C^J D3 a +7f35° (c « 1,0} DMF).
Obo-Leu-Arg(NO2)-2-NA (XIVb)
Auegangsmaterialt 1,5 g (3,1 mMol) XIVa und 1,43 g
(3,7 mMol) Cbo-Leu-OpHI».
Syntheseverfahrenι Gemäß Beispiel Ib.
3098Λ7/ 1172
Reinigung: Gelchromatographie an Sephadeoc^ IiH-20 in
Methanol.
ILC in P |2
Ausbeute! 1,6 g (86 #) amorphes XIYb, homogen gemäß
- 9,1° (c - 1,0? DMP)
Cbo-Leu-Leu-Arg(NO 2 )-2-KA (XIVc)
AuBgangsmaterial: 1,35 g (2,26 mMol) XIVb und 1,05 g
(2,71 mMol) Cbo-Leu-OpNP.
Syntheseverfahreni Gemäß Beispiel Ib.
Reinigungί Gelchromatographie an SephadexT LH-20 in
Methanol.
Ausbeute: 1,00 g (62,4 f>) teilweise kristallines XIVc,
homogen gemäß TLC in P..
£olJ |4 - - 20,6° (c - 1,0} DMP) · ·
H^-Bz-Leu-Leu-Arg(NO2)-2-NA (XIVd)
Ausgangsmaterialt 990 mg (1,4 mMol) XIVc und 407 mg
(1,8 mMol) Bz2O.
Synthese verfahren: Gemäß Beispiel Ha.
Reinigung * Gelchromatographie an Sephadex^ LH-20 in
Methanol.
309847/1172 - 35 -
Ausbeute: 800 mg (84 $>) amorphes XIVd, homogen gemäß
TLC in P1.
°Λ = -13,4° (c = 1,0} DMP)
K01 -Bz-Leu-Leu-Arg-2-NA'HCl
Ausgangsmaterial: 350 mg (0,52 mMol) XIVd.
Synthese verfahren: Gemäß Beispiel I.
Reinigung: Gelchromatographie an Sephadex G-15 in
33 $> AcOH.
Ausbeute: 260 mg (75 $>) lyophilisiertes, amorphes XIV,
Chlorgehalt 5»30 j£, homogen gemäß TLC in A.
C1^-J d° = -51»e° (c - O,57f 50 <fi AcOH)
Die Aminosäureanalyse zeigt die folgenden Verhältnisse: Leui 2,Of Arg: 0,95·
Beispiel XV : N^-Bz-Leu-Leu-Arg-1~nitro-2-HA«HCl (XV)
CbO-ATg(SO
2
)-1-nitro-2-NA
(XVa)
Außgangsmaterial: 3,6 g (10 mMol) CbO-ATg(NO2)OH und
2,26 g (12 mllol) i-Nitro-2-naphthylamin.
Synthesererfahren: Gemäß Beispiel XIVa.
-36- 309847/1172
Eeinigungt Gelchromatographie an Sephadex LH-20 in Methanol.
Ausbeutet 3,1 g (58,7 #) amorphes XYa, homogen gemäß
TLC in P1UHd C.
I9 = -11,8° (c - 1,0} DMP)
Cbo-Leu-Arg(NOo)-1-nitro-2~NA (XVb)
Auegangsmaterial ι 950 mg (1,8 mlfol) XYa und 850 ag
(2,2 «Mol) Cbo-Leu-OpHP.
Syntheseverfahrenι Gemäß Beispiel Ib.
Eeinigungi Gelchromatographie an SephadexT 3JH-2O in
Methanol.
Ausbeutet 900 mg (78 ^) amorphes XYb, homogen gemäß
TLC in P1.
C^-J j2 " -10,2° (c « 1,02| DMF)
C^-J j2 " -10,2° (c « 1,02| DMF)
Obo-Ieu-Leu-Arg(NO^)-1-nitro-2-HA (XVo)
Auegangematerialt 900 mg (1,4 mMol) XYb und 650 mg
(1,7 *Mol) Cbo-Leu-OpNP.
Syntheseverfahren» Gemäß Beispiel Ib.
T)
Reinigungt Gelchromatographie an Sephadex LH-20 in
Methanol.
309847/1172
- 37 -
Ausbeute: 810 mg (77 #) amorphes XVc, homogen
ILC in P1.
Ed-J j4 » -18,2° (c β 1,011 DMF)
Ed-J j4 » -18,2° (c β 1,011 DMF)
Ausgangsmaterial2 680 mg (0,88 mMol) XVc und 260 mg
(1,15 mMol) Bz2O.
Synthese verfahren t Gemäß Beispiel Ha.
Reinigung» Gelohromatographie an Sephadex LH-20 in Methanol.
Ausbeute: 480 mg (73 $) amorphes XVd, homogen gemäß
TLC in P1.
2* » -31,4° (c = 0,9; DMP)
N^-Bz-Leu-Leu-Arg-i-nitro^-NA^Ol (XV)
Ausgangsmaterialι 74 mg (0,1 mMol) XVd.
Syntheseverfahrenj Gemäß Beispiel I.
Reinigung: GelChromatographie an Sephadex G—15 in
$ AoOH.
Ausbeute: 47 mg (66 #) lyophilisiertes, amorphes XV,
Chlorgehalt 4,94 #, homogen gemäß TLC in A.
309847/1172
= -33,6° (c = 0f72{ 50 $ AcOH)
Die Aminosäureanalyse zeigt die folgenden Verhältnisse: Leu; 2,0; Arg: 0,9.
Beispiel XVI : N^-Bz-Leu-Leu-Arg-^-nitro-i-HA'HCl (XVI)
Obo-Arg( HO2) -4-ni tro-1 -EA (XVIa)
Ausgangsmaterial χ 3»6 g (io mMol) Cbo-Arg(N02)-0H und
2,26 g (12 mMol) 4-Nitro-i-naphthylamin.
Syntheseverfahren: Gemäß Beispiel XIVa.
Vj
Reinigungι Gelchromatographie an Sephadex LH-20 in
Methanol.
Ausbeutet 2,9 g (55 ^) amorphes XVIa, homogen gemäfl
TLC in P1 und C.
J
J
ψ - -11,4° (c » 1,01 j DMP)
Obo-Leu-Arg(NO 2 )-4-nitro-1-HA (IVIb)
Ausgangsmaterial χ 650 ag (1,23 mMol) XVIa und 560 mg
(1,45 mMol) Cbo-Leu-OpHP.
Syntheseverfahren: Gemäß Beispiel Ib.
Reinigung: Gelchromatographie an Sephadex LH-20 in
Methanol.
309847/1172
- 39 -
Ausbeute» 520 mg (66 56) amorphes XVIb, homogen gemäß
TLC in P1.
C*-J ψ = .-11 »8° (c = 0,2? DMF).
C*-J ψ = .-11 »8° (c = 0,2? DMF).
Cbo-Leu-Leu-Arg(N0 2 )-4-nitro-1~NA (XVIc)
Ausgangsmaterial* 520 mg (0,81 mMol) XVIb und 375 mg (0,97 mMol) Cbo-Leu-OpNP.
Syntheseverfahren* Gemäß Beispiel Ib.
Reinigung* Gelehromatographie an Sephadex LH-20 in
Methanol.
Ausbeute» 378 mg (62 <$>) teilweise kristallines XVIc,
homogen gemäß TLC in P1.
Ausgangematerialt 150 mg (0,2 mMol) XVIc und 57
(0,25 alfol)
Sy nt he β ever fahr ent Gemäß Beispiel Ha.
Reinigung! Gelehromatographie an Sephadex LH-20 in
Methanol.
- 40 - 309847/1172
Ausbeutet 120 mg (83 ^) amorphes XVId, homogen gemäß
TLC in P1.
Jp » 30,9° (c = 0,95; DMP)
I^-Bz-Leu-Leu-Arg-4-nitro-i-HA'HCl (XVI)
Ausgangsmaterial: 120 mg (0,165 mMol) XVId.
Syntheseverfahren: Gemäß Beispiel I.
Reinigungt G-elchromatographie an Sephadex^ G-15 in
33 £ AcOH.
Ausbeutet 48 mg (42 #) lyophilisiertes, amorphes XVI,
Chlorgehalt 4,95 J*, homogen gemäß TLC in A.
£hLj ψ β -36|0° (c = 0,71» 50 Ji AcOH)
Die Aminosäureanalyse zeigt die folgenden Verhältnisset
Leut 2,Of Arg: 0,9·
Beispiel XVIIt H00-Bz-Leu-Lys-pNA.HCl (XVII)
If ** -BOC-Lys ( t -Cbo) -pNA (XVIIa)
6,3 g (11,2 mMol) Ii^-BOC-LyS(C -Cbo)-OH·DCHA werden
in 40 ml trockenem, frisch destilliertem HMPTA bei Raumtemperatur gelöst. Danach werden 5 g (30,5 mMol) p-Nitrophenylisocyanat
nacheinander unter Rühren sowie unter Tollständigem Feuchtigkeitsaueachluß zugegeben. Nach 24 Stunden bei Raum-
309847/1172
- 41 —
temperatur wird die Reaktionsmischung gemäß Beispiel Ia aufgearbeitet.
Der unlösliche Teil, der aus N, N -bis-p-Nitrophenylcarbamid
besteht, wird abfiltfiert. Das Mitrat wird
durch ffelchromatographie an einer Sephadex LH-20 - Kolonne,
äquilibriert mit Methanol, gereinigt.
Ausbeute» 4,17 g (74,5 $>) teilweise kristallines XVIIa,
homogen gemäß TLC in P1.
Να-BOC-Leu-Lys( B -Cbo)-pffA (XVIIb)
2,20 g (4,4 mMol) XVIIa werden in 10 ml frisch destillierter
Trifluoressigsäure unter vollständigem Feuchtigkeitsausschluß gelöst. Die Reaktionsmischung wird 1 Stunde lang bei
Raumtemperatur gerührt und danach langsam in 150 ml trockenem A'ther unter heftigem Rühren eingegossen. Dabei fällt
CP-COOH·Η-ΙΰτΒ(£ -Cbo)-pNA nach dem Kühlen aus. Die ätherische
lösung wird abdekantiert und der amorphe Rückstand weitere drei Mal mit 75 ml Äther behandelt. Nach dem Trocknen im Vakuum
über P2^5 und NaOH wird das Trif luoracetat des Amino säure derivate
in quantitativer Ausbeute (2,25 g) erhalten.
2,25 g (4,4 mMol) CP5COOH-H-IyS(^ -Cbo)-pITA werden in
10 ml DMP gelöst. Die Lösung wird auf -100C gekühlt und mit
0,78 ml (5,5 mMol) Et,N versetzt, um die Aminosäure freizusetzen. 2,4 g (6,5 mMol) BOC-Leu-OpNP werden zugesetzt und
309847/1172
- 42 -
man läßt die Lösung Raumtemperatur erreichen. Nach 3 Stunden
wird die Lösung erneut auf -1O0C gekühlt und mit 0,31 ml
(2,2 mMol) Et,N gepuffert. Die Puffermaßnahme wird ein weiteres Mal nach 2-3 Stunden wiederholt. Nach einer Reaktionszeit
von 24 Stunden wird die Lösung bei 4O0C im Vakuum zur
Trockne eingedampft. Der Verdampfungsrückstand wird dreimal mit 20 ml destilliertem Wasser behandelt und dann im Vakuum
getrocknet. Der rohe trockene Rückstand wird in Methanol gelöst und durch Gelchromatographie an einer Sephadex LH-20 Kolonne,
äquilibriert mit Methanol, gereinigt.
Ausbeute: 1,70 g (70 #) amorphes XVIIb, homogen gemäß
TLC in P1 und C.
nn = -4,9° (c = 1,1 j DMF)
H*-BOC-Leu-Leu-LyB(£ -Cbo)-pNA (XVIIc)
Ausgangsmaterial: 950 mg (1,55 mMol) XVIIb und 1,16 g (3,1 mMol) BOC-Leu-OpNP.
Syntheseverfahren: Gemäß Beispiel XVIIb.
Reinigung: Gelchromatographie an Sephadex* LH-20 in
Methanol.
Ausbeute: 985 mg (88 ji) amorphes XVIIc, homogen gemäß
TLC in P1.
= -22,0° (c = 1,Oj DMP)
309847/1172
- 43 -
N"* -Bz-Leu-Leu-Lysf 6 -CTjO)-PlTA (XVIId)
Ausgangsmaterial: 1,25 g (1,4 mMol) XVIIc und 384 mg
(1,7 mMol) Bz2O.
Syntheseverfahren: Die Deearbobutyloxylierung von XVIIc
wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels XVIIb durchgeführt.
Das trockene CF,COOH«H-Leu-Leu-Lys(6 -Cbo)-pHA wird in
20 ml DMF gelöst und auf -1O0C gekühlt. Danach werden 200 ml
(1,45 mMol) Et,N zugegeben, um das Peptidamin aus seinem Salz
freizusetzen. 384 mg (1,7 mMol) BZpO werden bei -100C zu der
Lösung gegeben, wonach die Maßnahmen des Pufferns und Aufarbeitens gemäß Beispiel XVIIb durchgeführt werden.
Reinigung: G-elchromatographie an Sephadex IH-20 in
Methanol.
Ausbeute: 920 mg (90 ^) teilweise kristallines XVIId,
homogen gemäß TIC in P. und C.
1° = -5,95° (c = 1,02j DMF)
*" -Bz-Leu-Ieu-Lya-pNA·HCl (XVII)
Auegangsmaterialt 300 mg (0,41 mMol) XVIId.
Syntheseverfahren: Gemäß Beispiel I.
-44- 309847/1172
Eeinigung: Gelehromatographie an Sephadex Gr-15 in
33 + AcOH.
Ausbeute: 170 mg (66 #) lyophilisiertes, amorphes XVII,
Chlorgehalt 5,51 £, homogen gemäß TLC in A. C&-J ψ = -50,5° (c = 0,62} 50 % AcOH)
Die Aminosäureanalyse zeigt die folgenden Verhältnisse:
Leu: 2,Oj lys: 0,35.
Die gemäß den Beispielen hergestellten Substrate wurden in der folgenden Weise zur Bestimmung von verschiedenen Enzymen
▼erwendet:
Das Prinzip für diese Bestimmung gründet sich auf den Umstand, daß das bei der enzymatischen Hydrolyse gebildete Produkt
ein UV-Spektrum aufweist, welches von dem des Substrats vollständig getrennt ist. Das Substrat gemäß Beispiel II,
H^-Bz-Leu-Leu-Arg-pNA'HCl, weist somit ein Absorptionsmaximum
bei 302 nm mit einem molaren Extinktionskoeffizienten von 12920 auf. Die Absorption des Substrats bei 405 nm ist
unbedeutend. p-Nitroanilin (pNA), das aus dem Substrat während
der enzymatiechen Hydrolyse gebildet wird, weist ein Absorptionemaximum
bei 380 nm mit einem molaren Extinktionskoeffizienten von 13200 auf, der bei 405 nm lediglich auf 9620 verhindert
ist.
- 45 _ 309847/1172
Han kann daher durch spektrophotometrische Messung bei
405 ma in leichter Weise den Grad der enzymatisehen Hydrolyse
verfolgen, der proportional zu der Menge des gebildeten p-Nitroanilins ist. Der vorhandene Substratüberschuß beeinflußt
die Messung bei dieser Wellenlänge nicht. Die Bedingungen sind für die übrigen Substrate der Erfindung nahezu identisch.
Aus diesem Grunde wurden die spektrophotometrischen Messungen durchweg bei 405 iua durchgeführt.
Die enzymatische Reaktion kann schematisch in der folgenden Weise beschrieben werden:
B + S ES ^ES1 + chromophore
E + P2
E = Enzym
S = Substrat
ES « Enzym-Substrat-Komplex
P1 und P2 = Produkte
k1, k2, k, und k. = Geschwindigkeitskonstanten
k2
Dissoziationskonst. für ES = —- = Kn (Michaelia-Konst.)
Dissoziationskonst. für ES = —- = Kn (Michaelia-Konst.)
k1
309847/1172
- 46 -
Wenn (S)» (E) und k.<< k, ist, gilt folgendes»
= C(E) - (ES)] χ (S)
(ES)
Die Bildungsgeschwindigkeit des Chromophors ist:
ν «s k, χ (ES)
k, χ (E) χ (S)
ν = -2 — (2)
Wenn alles E an S gebunden ist, gilt: (ES) = (E) und
Linewe aver-Burk-G-1 e i chung:
i = JS. χ J- + -L·- {4)
v v (S) ν " max ' max
Wie aus Gleichung (2) hervorgeht, bestimmen die Konstanten K und k, die Wirksamkeit des EnzymsubstratB für ein gegebenes
Enzym. Für die Bestimmung dieser Konstanten wird im Prinzip das folgende Verfahren angewendet: Das Enzym und das
Substrat werden in einer Pufferlösung gemischt und die Seak-
309847/1172 - 47 -
tion wird spektrpphotometrisch 5 Minuten lang verfolgt. Die
Konzentration des Substrats (S) wird variiert, während die Enzymkonzentration (E) für jedes Substrat konstant gehalten
wird. Die Extinktion (OD) wird in Abhängigkeit von der Zeit aufgetragen. Aus der so erhaltenen Kurve ergibt der Tangens
(= Differenz der Extinktion pro Minute, l~. OD/min, aus der
die Menge des gebildeten p-NA/min (v) in ^uMoI berechnet werden
kann) zur Zeit Hull die anfängliche Reaktionsgeschwindigkeit v. Wenn — gegen —!— aufgetragen wird, ergeben sich
V (S)
K_ und v_Q„ (aus Gleichung (4)) aus dem Diagramm. K und k,
K_ und v_Q„ (aus Gleichung (4)) aus dem Diagramm. K und k,
ux UiSlX. Iu J
(= max ) für Trypsin und verschiedene Enzymsubstrate sind
WT
in Tabelle 1 und für Thrombin in Tabelle 2 angegeben. Die Daten bezüglich K und k, sind in den Fällen nicht angeführt, in denen sie nicht bestimmt worden sind oder nicht berechnet werden konnten, weil sich keine lineare Abhängigkeit zwischen ν und TWJ erSab·
in Tabelle 1 und für Thrombin in Tabelle 2 angegeben. Die Daten bezüglich K und k, sind in den Fällen nicht angeführt, in denen sie nicht bestimmt worden sind oder nicht berechnet werden konnten, weil sich keine lineare Abhängigkeit zwischen ν und TWJ erSab·
Eine überschlagsmäßige Beurteilung der Enzym-Substrat-Beziehung für verschiedene Substrate kann erreicht werden, indem
man die Menge des pro Minute und pro ml bei der gleichen Konzentration der Substrate gebildeten p-Nitroanilins verfolgt.
Dies ist in Tabelle 3 für Trypsin, in Tabelle 4 für Thrombin und in Tabelle 5 für Plasmin gezeigt.
Die in den Tabellen verwendete Abkürzung FIH bezieht sich
auf Einheiten des national Institute of Health. Die Trypsin-
■ 309847/1172
- 48 —
Einheit ist gleich der Hydrolyse eines uMols N "-Tosylarginin-methylester-hydrochlorid
(TAME) pro Minute bei 25°C und einem pH-Wert von 8,1 in Gegenwart von 0,01 M Calciumionen. Das Trypsin wurde von Worthington Biochemical
Corporation, Freehold, N.J., USA, bezogen. Das Plasmin stammte von AB Kabi, Stockholm, Schweden; 1 mg war gleich
3 Kasein-Einheiten (CU).
- 49 " 309847/ 1 172
so
Trypsinaktivität, K und
| Substrat | Substrat- konz. (uMol/1) |
Enzym- konz. (UIH/ml) |
Km χ 10 (Ho 1/1) |
k5 χ 104 (/uMol/min, NIH/ml |
| ΒΑΡΝΑ | 250-666 | 75 | 16 | 8,3 j |
| I | 33,6-112,0 | 6 | 7,40 | 330 j |
| II | 35,0-150,0 | 3,3 | 0,64 | 276 |
| IT | 35,0-150,0 | 3,3 | 0,17 | 71 j |
| Substrat |
Substrat-
konz. (pMol/l) |
Enzym-
konz. (NIH/ml) |
(Mol/l) | k, χ TO4 (iiMo l/min, ΈΠΗ/ml) |
| BAPNA I |
250-666
33,6-112,0 |
50
10 |
2,92 | ^11 40 |
- 50 -
309847/1172
Trypsinaktivit.at
Substrat Substratkonz. nMol pro ml
Enzymkonz. Einheiten, pro ml
Gebildetes p-Nitroanilin nMol pro Min. pro ml
| BAPNA | 333,0 | 50,0 | 1,04 |
| II | 66,9 | 0,0833 | 14,2 |
| III | 66,7 | Il | 16,8. |
| IV | 67,0 | It | 10,2 |
| V | 66,3 | It | 22,7 |
| VI | 66,8 | It | 12,8 |
| VII | 66,2 | ti | 16,6 |
| VIII | 66,7 | η | • · 17,1 |
| IX | 67,0 | η | 12,0 |
| X | 67,1 | η | 15,5 |
| XI | 66,3 | η | 12,4 |
| XII | 65,9 | η | 16,5 |
| XIII | 66,9 | η | 16,7 |
- 51 -
30980/1172
Tlirombinaktivität
Substrat j Substrat- Enzym- Gebildetes p-Uitro- ; ; konz. konz. «m-i-i«
| i | BAPEA | nMol pro ml | MH-Einneiten pro ml |
nMol pro Min. pro ml |
| II | 333,0 | 2,08 | 6,1 | |
| III | • 66,9 | 0,417 | 1,8 | |
| IV | 67,2 | η | 0,5 | |
| V | 67,0 | -' Il | 0,9 | |
| VI | 66,5 | Il | 1,7 | |
| VII | 66,8 | Il | 0,2 | |
| VIII | 66,2 | Il | 0,4 | |
| ΙΣ | 66,7 | Il | 0,1 | |
| X | 67,0 | η | 0,3 | |
| XI | 67,1 | η | 0,4 | |
| XII | 66,3 | It | - 0,2 | |
| XIII | 66,3 | ti | 0,7 | |
| XVII | 66,9 | Il | 0,2 | |
| 67,0 | η | 0,1 |
309847/1172
Plasniinaktivität
| Substrat | Substrat- konz. nMol pro ml |
Enzym- konz. CU-Einheiten pro ml |
Gebildetes p-Nitro- anilin nMol pro Min. pro ml |
| II | 66,9 | 0,167 | 2,7 |
| III | 66,7 | Il | 17,2 |
| IV | 67,0 | η | 2,7 |
| Y | 66,5 | Il | 7,7 |
| VI | 66,8 | Il | 2,8 |
| VII | 66,2 | η | 2,2 |
| VIII | 66,7 | ti | 4,0 |
| IX | 67,0 | η | 1»5 |
| I | 67,1 | η | 17,2 |
| II | 66,3 | N | 2,0 |
| XII | 65,9 | N | 1,5 |
| XIII | 66,9 | η | 17,9 |
| XVII | 67,0 | M | 21,3 |
309847/1172
Aus den Tabellen 1-5 sind die Vorteile der Enzymsubstrate der Erfindung eindeutig ersichtlich, wenn man diese
mit dem bisher für Trypsin verwendeten Amidsubstrat (ΒΑΡΝΑ) vergleicht. Infolge ihrer größeren Empfindlichkeit
ermöglichen die Substrate der Erfindung die Bestimmung von kleinen Enzymmengen, ohne daß dabei die Genauigkeit der Bestimmung
beeinträchtigt wird. Vom klinischen Standpunkt ist dies sehr wichtig, da dadurch die Probenentnahme vereinfacht
wird.
- 54 -
309847/1172
Claims (1)
- Pat ent anspruchSubstrate der allgemeinen FormelO O OIi H1 -N-X-CH-C-NH-CH-C-NH-CH-C-NH-R,I IRg R^ R* (CHg.NHin der R1 ein Wasserstoffatom, eine Acylgruppe mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen, eine U, -Aminoacylgruppe mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen, eine Cyclohexylcarbonylgruppe, eine ^ -Cyclohexylacylgruppe, eine A-Aminomethylcyclohexylcarbonylgruppe, eine Benzoylgruppe, eine z.B. mit einem Halogenatom oder einer Methyl-, Amj.no- oder Phenylgruppe od.dgl. oder mit mehreren dieser Substituenten substituierte Benzoylgruppe, eine u3-Phenylacylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen im Acylteil und gegebenenfalls mit Substituenten in dem Phenylrest, eine Benzolsulfonylgruppe oder eine 4-Toluolsulfonylgruppe, Rp ein Wasserstoffatom, eine Phenylgruppe, eine Alkylgruppe ait 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder eine Cyclohexy!gruppe,- 55 - 309847/1172X eine Einfaehbindung oder eine Methylengruppe,E^ eine geradkettige, verzweigte oder cyclische Alkylgruppe mit 3 "bis 8 Kohlenstoffatomen,E. eine geradkettige, verzweigte oder cyclische Alkylgruppe mit 3 bis 8 Kohlenstoffatomen oder eine Phenyl- oder Benzyl« gruppe,η die Zahlen 2, 3 oder 4,Ec ein Wasserstoffatom oder eine Guanylgruppe undEg eine Phenyl-, Hitrophenyl-, Methylnitrophenyl-, Dinitrophenyl-, Uaphthyl-, Nitronaphthyl-, Chinolyl- oder Nitro-chinoly!gruppe bedeuten, sowie deren Salze.- 56 - 30980/1172
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE7205758A SE380258B (sv) | 1972-05-02 | 1972-05-02 | Nya diagnostiskt verksamma substrat med hog specificitet till trypsin och andra enzymer av typen peptidyl-peptid-hydrolaser |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE2322115A1 true DE2322115A1 (de) | 1973-11-22 |
| DE2322115B2 DE2322115B2 (de) | 1980-01-10 |
Family
ID=20267173
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE2322115A Withdrawn DE2322115B2 (de) | 1972-05-02 | 1973-05-02 | Tripeptide und deren Verwendung zur Bestimmung von Peptid-Peptidohydrolasen |
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