DE2344886A1 - Synthetisch modifizierte trypsininhibitoren und verfahren zu ihrer herstellung - Google Patents
Synthetisch modifizierte trypsininhibitoren und verfahren zu ihrer herstellungInfo
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- Y10S930/01—Peptide or protein sequence
- Y10S930/29—Polyamino acid or polypeptide with an uninterrupted series of peptide repeating units
Description
{ NAOHQEREICHT j
Aktenzeichen: ρ ?j>
44 fcS6. 4 - HOE 73/F 274
DaVjr.: 29. August 1973 Dr. HG/stl
Synthetisch notifizierte Trypsin-Inhibitoren und Verfahren
zu ihrer Herstellung
In verschiedenen Säugerorganen, besonders in Rinderlunge, ist ein
Tryr.i'.in-Kallikr-ein-Inhibitor enthalten, der auf verschiedene
Weise hieraus isoliert werden kann und der, in reiner Form, seit über 15 Jahren als polvvalenter Proteinasen- und Esterasen-Inhibitor
mit großen: Erfolg als Therapeutikurn bei Enzymentgleisurig eingesetzt
wild.
Diener Trypsin-Kallilcrein-Tnhibitor ist ein basisches Polypentid
n:it einen Molekulargewicht von 6500 und einem iqoelektrisehen Punkt
von ca. 10,5. Er besteht aus einer einzigen Pentidkette von 58
AnIn'1'= äuren, df;ren Primärstruktur aus Biochemical and Biophysical
Research Coriinunieatior.s Bd. 20. Seiten ^63 bis 468 (I965) bekannt
ist und die durch 3 Disulfidbriicken vernetzt ist.
Der hohe therapeutische Wert des Inhibitors beruht darin, ver-ε-c'iioaCir.c-I'roteinaser·
und Esteraoen, wie Trynrrin, Chvmotrvpsin,
KuT-y-:r>·:: n, Plaanin und Kallikreiri zu hemnen. Hierzu vrerden, hauntr.äcl.lich
intravenös, bisweilen erhebliche Mengen de.·? Inhibitors
in;* i ::ier-·:. Hierbei ist su beobachten, daß der Infiibitor nach
509814/1179
I nachgereicht]
relativ kurzer Zeit; bevougt-irr Niere des Versuchstieres odor
des Menschen gespeichert wird. Es wird heute angenommen, daß die:,
darauf beruht, daß das stark basische Inhibitorr.olekül auf unspezifische
V/eise an saure Mukopolysaccharide oder Nukleinsäuren gebunden
wird. Lediglich 1,5 % des nativen Inhibitors werden mit dem Urin ausgeschieden; um eine Ausscheidung der überwiegenden
Restmenge zu ermöglichen, wird vom Organismus zuerst je eine amino- und carboxyIständige Aminosäure (Arginin bzw. Alanin)
abgebaut, der Inhibitor aggregiert zu einer höher molekularen Form und wird dann erst sehr langsam aus der Niere ausgeschwemmt.
Versuche mit chemisch modifiziertem Inhibitor, bei dein über al Lp
freien Aminogruppen eine Maleovlgruppe eingeführt worden war, um!
der sich als inaktiv bewies, haben gezeigt, daß diese Substanz, deren isoelektrischer Punkt wesentlich erniedrigt war, sehr viel
rascher aus der Miere ausgeschwemmt wurde und mit dem Urin ausgeschieden
'werden konnte. Ein biologisch voll v/irksaner Inhibitor,
der einen niedrigeren I.P. aufweist, wäre deshalb von erhebliche-:
Wert. Es ist nun prinzipiell möglich, durch Acylierung der freien Aminogruppen die positiven Ladungen zu verringern und so den isoelektrischen
Punkt zu senken. Bei allen diesen Umsetzungen v/i.r-i aber ein in der Aktivität zumindest abgeschwächtes, wenn nicht
sogar inaktives Reaktionsprodukt erhalten, da die 5 Aminogruppen des Moleküls H gleichberechtigten £ -Aminogrunpen des Lvsins und
1 o£-Aminogruppe zuzuordnen sind, andererseits aber das an der
Pos. 15 befindliche Lysin entscheidend für die inhibitorische V/irkung der Substanz ist. Eine Substituierung der Aminogrupne
des Lysin 15 bewirkt den Verlust der biologischen Aktivität.
Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß durch Verlängerung
der 5 vorhandenen Carboxylgruppen mit sauren Peptiden die Aktivität des Inhibitors nur wenig oder nicht verändert wird, dagegen
aber durch Senkung des isoeleictrischen Punktes der modifizierte
Inhibitor viel rascher aus der Miere ausgeschiec'en wird als das nicht modifizierte Molekül.
5098H/1179
BAD ORIGINAL
Gegenstand der Erfindung sind somit halosvnthetisch hergestellte
Derivate des basischen Trynsin-Kallikrein-Inhibitors aus Säugeror;-anen,
dadurch gekennzeichnet, daß die 5 vorhandenen Carboxylgrunnon
des Peptidmoleküls amidartig durch Peptidreste der allgemeinen
Formel I verlängert sind,
-NH-CH-CO-(NH-CH-CO-)χν? (I)
in der X für die Zahl 0 bis 10 steht, Y Wasserstoff oder- einen
geradkettigen oder verzweigten Alkylrest mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen,
der gegebenenfalls durch einen Carboxyl-, Hydroxyl- oder Carbonamidgruppe substituiert ist, wobei der Rest NH-CH-CO
auch den Prolin-Rest bedeuten kann, und wobei Y3 falls X=O ist,
-CH2COOH oder -CH2-CH2-COOH bedeutet und falls X für die Zahlen
1 bis 10 steht, zumindest eine Seitenkette Y -CHp-COOH oder -CHp-CHp-COOH darstellt, worin weiterhin W -OH bedeutet, doch bei
Anwesenheit von mindestens zwei Carboxylgruppen in den Seitenketten auch -NH2, UH-CH , HH-C3H5, -OCH oder OC2H bedeuten kann,
sowie ein Verfahren zur Herstellung dieser Peptide, das dadurch gekonnzeichnet ist, daß man den Trypsin-Kallikrein-Inhibitor,
dessen fünf primäre Aminogruppen durch sauer leicht absnaltbare Schutzgruppen geschützt sind, mit Aminosäuren oder Peptiden der
allgemeinen Formel II,
NH0-CH-CO-(NH-CH-Co-)VW» (II)
in der Y und X die angegebene Bedeutung haben, vorhandene Carboxyl
gruppen in Y jedoch als tert.-Buty!ester vorliegen, W tert,-Butoxy
bedeutet, doch bei Anwesenheit von mindestens 2 tert,-Butylestei'Kruppen
in den Seitenketten auch -NH , -NH-CH-, -NH-C2H1-
-OCH-. oder -OCpHt- bedeuten kann, in Gegenwart von 1-Hydroxybenzotriazol
und Di cvclohexylcarbodiir.id umsetzt und anschließend
die Schutzgruppen sauer abspaltet.
Un den Trypsin-l'allikrein-Inhibitor an seinen Carboxylgruppen
modifizieren ^u können, werden zweckmäßig die Aminogruppen durch
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sau-sr leicht abspaltbare Aminoschutzgruppen, wie z.B. tert.-Alkoxycarbonylgruppen
blockiert. Die Einführung öer häufig verwendeten Bce-Gruppe gelingt auf verschiedenen Wegen. Sowohl mit
Boc-azid als auch mit Boc-activestern, wie z.B. dem p-Mitropheny3-ester
oder dem N-Hydroxysuccinimidestor lassen sich die Boc-Gruppen
einführen. In allen Fällen entsteht ein papierelektrophoretisch einheitliches Produkt. Diese N-geschützten Verbindungen werden in
AnV'/esenheit von 1-Hydroxy-benzotriazol und Dicyclohexylcarbodiinid
mit einer Verbindung der allgemeinen Formel II in Dimethylformamid
oder Dime thy !acetamid umgesetzt. Mit Trifluoressigsäure oder HCl/
Eisessig werden die Schutzgruppen abgespalten und das Rohprodukt entweder dialysiert oder über Sephadex G 25 , einem vernetzten
Dextrangel, chromatographiert. Es empfiehlt sich das dialysierte
(R) Produkt zur weiteren Reinigung ebenfalls über Sephadex G 25
zu chromatographieren oder aber einer Vertei lungs Chromatographie
an Sephadex LH 2Cr ' , einem vernetzten alkylierten Dextrangel,
zu unterwerfen.
Um den isoelektrischen Punkt des Trypsin-Piallikrein-Inhibitors
zu senken, muß der ankondensierte Aminosäure- oder Peptidrest
mindestens Kwei Carboxylgruppen besitzen. Unter den natürlich
vorkommenden Aminosäuren kommen nur Asparaginsäure und Glutaminsäure anfrage. Bei Dipeptiden und höheren Peptiden ist es möglich,
neben den sauren Aminosäuren auch andere aliphatische Aminosäuren,
wie z.B. Glycin, Alanin, Leucin^ Valin, Isoleucin, Serin, Threonin,
Asparagin, Glutamin oder Prolin'einzubauen. Vorzugsweise v/erden aber auch bei höheren Peptiden Asparaginsäure und Glutaminsäure als
Peptiübausteine verwendet. Sind zwei oder mehr Carboxylgruppen
in dem anzukondensierenden Peptid in Forn der tert .-Butylester vorhanden, können weitere Carboxylgruppen in Form von Amiden oder
Alkylestern vorliegen. Nach der sauren Behandlung mit Trifluoressigsäure oder HCI/Kisessig bekommt man auf diese Weise Trypsin-·
Inhibitoren } die neben einem niedrigen isDielektrischen Punkt
zusätzlich Amidgruppen oder Alkylestergi'uppen besitzen.
Zum Nachweis der Abnahme des basischen und Zunahme dss sauren
Charakters bei den erfindungsgemäß hergestellten Inhibitor-Derivaten
wurde der native Inhibitor und modifizierte Präparate der
Mikro^onen-elektronhorese auf CellUltstjeacetat-Folie im Diäthyl- .
Darbituratpuffer von pH 8,6 unterworfen.
Der native Inhibitor wandert hierbei zur Kathode, während die modifizierten Präparate je nach modifizierender Gruppe mehr oder
weniger weit zur Anode wandern. Für den nativen Inhibitor beträgt die kathodische Wanderungsstrecke ca. 3 mm. Für die modifizierten
Präparate, wobei die modifizierende Gruppe in den einzelnen Fällen
eine, zwei, drei oder vier saure Aminosäuren enthält, betragen die anodischen Wanderungs strecken ca. 1,5 mm, 8 mm, 13,5 mm und
17 mm.
Die Modifizierung des Inhibitors führt demnach zu Präparaten, deren
basischer Charakter vermindert und saurer Charakter vermehrt ist. Die Modifizierung mit einer Gruppe, die eine einzige saure
Aminosäure enthält, führt bereits zu einer solchen Erniedrigung des isoelektrischen Punktes, daß bei pH 8,6 der saure Charakter
geringfügig den basischen Charakter überwiegt.
Die aus den Dissoziationskonstanten der funktionellen Grupnen des Inhibitors und seiner erfindungsgemäß hergestellten Derivate
schätzbaren isoelektrischen Punkte betragen für den nativen Inhibitor ca. 10,5 und für modifizierte Präparate, wobei die
modifizierte Gruppe eine, zwei drei oder vier saure Aminosäuren enthält, ca. 8,6, 5,1, 4,8 und 4,6.
Zum fluoreszenz-mikroskopisehen Nachweis der Nierenspeicherung
von Inhibitor und modifiziertem Inhibitor wurden jeweils 3 Kaninchen
mit einem Gewicht von 2,5 kg jeweils zur gleichen Zeit mit 20 mg nativem bzw. 20 mg erfindungsgemäß modifizierten Inhibitor intravenös
injiziert. Nach 2 Tagen wurden die Nieren entnommen, geschnitten und mit einem fluoreszeinmarkierten^-Globulin-Präparat
inkubiert, das aus dem Antiserum von Kaninchen gewonnen worden
war, welche vorher mehrere Male mit Inhibitor und Adjuvans nach Freund nur Steigerung der Antikörperbildung geimpft· worden waren.
Hierbei bot sich unter dem Fluoreszenz-Mikroskop folgende?; Bild:
5098U/1179 ^
Alle Nierenschnit-te der mit dem nativen Inhibitor behandelten
Tiere zeigten über das gesamte Gesichtsfeld verteilt große, zum Teil konfluierende fluoreszierende Stellen, während die
Schnitte aus den Mieren derjenigen Tiere, die den modifizierten Inhibitor erhalten hatten, meistens keine Fluoreszenz zeigten und
nur in einigen wenigen Fällen kleine leuchtende Stellen enthielten.
Dieser Versuch zeigte auf eindeutige V/eise, daß der Inhibitor, dessen isoelektrischer Punkt gesenkt ist, weitaus weniger bis
gar nicht in der Niere gespeichert wird.
In Vorversuchen wurde durch DopOeldiffussion noch festgestellt,
daß das verwendete Antikörper-Präparat nicht nur gegen den nativen Inhibitor, sondern auch dessen erfindungsgemäße Unsetzungsprodukte
reagierte.
Zur Aktivitätsbestimmung der modifizierten Trypsin-Kallikrein-Inhibitoren
wurde wie folgt verfahren:
Die Inhibitorlösung wird mit einer festgelegten Menge (entsprechend
einer bestimmten Aktivität) Trypsinlösung vcrinkubiert; nach
kurzer Zeit setzt man ein geeignetes Trynsinsubstrat, z.B. N-Benzoyl-arginin-^-nitroanilid (BAPA) zu und misst nach einiger
Zeit und nach Abπtonnen der Reaktion die durch nicht gehemmten
Trypsin bewirkte Abspaltung von p-Hitroanilin bedingte Gelbfärbung
quantitativ am Photometer bei geeigneter Wellenlänge, z.B. ^05 mu.
Im einzelnen wird hierbei so verfahren, daß eine Trypsinmenge
(Trypsin, kristallisiert, reinst), dia, vorher* ermittelt, in 30 Minuten bei 37°C BAPA zusammengebracht, eine bestimmte Extinktion
bei 405 mu bewirkt, mit steigenden Mengen des Inhibitors im
konstanten Volumen zusammen inkubiert wird. Nach 30 Minuten Vorinkubation
v;ird die Standardmengo ΒΛΡΑ zugesetzt. Die Reaktion wirn
nach 30 Minuten BAPA-Inkubation bei 37°C durch Zusatz von verdünnter
Essigsäure gestoppt und die aufgetretene Qelbfärbunr, gemessen. Trägt man in einem Diagramm die zugesetzten Inhibitor1-mengen
gegen die entsprechenden Extinktions-V/erte auf, so erhält
man eine Kurve, aus der leicht ermittelt werden kann, welche
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23U886
Inbribitorir.enge die stets konstant zugesetzte Trypsinmenge in
ihrer Wirkung um die Hälfte zu hemmen imstande war. Da bekannt war, welche Aktivität briw. Menge Trypsin zugesetzt wurde, kann
zurückgerechnet werden, wieviel mg des Inhibitors wieviel Trypsin zu hemmen imstande waren.
In diesem Test sind etwa 1 mg des modifizierten Inhibitors in
der Lage, ca. 3 mg Trypsin zu inaktivieren.
Per erfindungsgemSß modifizierte Trypsin-Kallikrein-Inhibitor
dient als Arzneimittel bei Blutungen als Folge einer überschiessetiden
Pibririolyse; so z.B. in der Chirurgie bei Prostatablutungen
oder V/undhei lungs störungen, in der Inneren Medizin als Zusatztherapie
bei Hämophilen, in der Gynäkologie bei Placenta praevia, intrautorinem
Fruchttod und atonischem Nachbluten und zur Prophylaxe " bei Operationen an parenchymatösen Organen und. bei Prostatectomien
und Fettembolien.
Die neuen erfindungsgemäßen Arzneimittel werden in steriler isotonischer Lösung intravenös injiziert oder im Dauertropf nach
Verdünnen in Infusions lösungen wie z.B. physiologischer Kochfsalzlonung
gegeben.
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- 8 -.. "..
Beispiel 1
Beispiel 1
Trypsin-Kallikrein-Inhibitor-penta-L-glutaminsäure
Zu einer Suspension von 900 mg Penta-Boc-Trypsin-Kallikrein-Inhibitor,
386 mg (1,3 mMol) HCl.H-GIu(0But)-0But, 175 mg (1,3 niMol)
HOBt und 0,17 ml (1,3 mMol) N-Äthylmorpholin in 10 ml Dimethylformamid
gibt man bei O0C 284 mg DCC und rührt 1 Stunde bei 0°C und 24 Stunden bei Raumtemperatur. Der Niederschlag wird abgesaugt
und das Piltrat eingeengt. Der Rückstand wird mit Äther verrieben und getrocknet. Ausbeute 1,39 g·
Die so gewonnene Substanz wird in 10 ml Trifluoressigsäure gelöst.
Man läßt 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen und engt anschließend im Vakuum ein. Der Rückstand wirdmit Äther verrieben und abgesaugt.
Ausbeute 1,17 g.
Die so gewonnene Substanz wird gegen Wasser dialysiert und gefriergetrocknet.
Ausbeute 710,3 mg.
325 rog der dialysierten und gefriergetrockneten Substanz werden
an Sephadex LH 2o' ' (100 χ 2,5 cm-Säule) in dem System Eisessig/
Butanol/Wasser (2:4:20) chromatographiert. Es werden 228 mg einer
reinen Fraktion isoliert.
Aminosäureanalyse: Verhältnis Gly:Glu = 6:8,5 (theoret. 6:8)
Trypsin-Kallikrein-Inhibitor-penta-(Glu-Glu-OH)
900 ng Penta-Boc-Trypsin-Kallikrein-Inhibitor werden mit 625 mg
(1,3 mMol) HCl.H-Glu(OBut)-aiu(OBut)-OBut analog Beispiel 1
umgesetzt. Nach Behandlung mit Trifluoressigsäure und anschließender Dialyse werden 770,4 mg Rohsubstanz gewonnen. 500 mg dieser
Rohsubstanz werden wie bei Beispiel 1 gereinigt. Ausbeute 382 mg einer reinen Fraktion.
Aminosäureanalyse: Verhältnis Gly:Glu = 6:14,6 (theoret. 6:13)
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23U886
Trypsin-Kallikrein-Inhibitor-penta-(Glu-Glu-Glu-OH)
900 mg Penta-Boc-Trypsin-Kallikrein-Inhibitor werden mit 867 mg
(1,3 mMol) HCl.H-Glu(OBut)-Glu(OBufc)-Glu(OBut)-OBut analog Beispiel
umgesetzt. Nach Behandlung mit Trifluoressigsäure werden 1,355 g
Rohsubstanz gewonnen, die in 0,1 m Essigsäure über Sephadex G (200 χ k cm-Säule) chromatographiert werden.
Ausbeute 67^,9 mg einer reinen Fraktion
Aminosäureanalyse: Verhältnis Gly:Glu = 6:18,3 (theoret. 6:18) Beispiel *J
Trypsin-Kallikrein-Inhibitor-penta-(Glu-Glu-Glu-Glu-OH)
Trypsin-Kallikrein-Inhibitor-penta-(Glu-Glu-Glu-Glu-OH)
900 mg Penta-Boc-Trypsin-Kallikrein-inhMtor werden mit 1,11 g
(1,3 mMol) HCl.H-Glu(OBut)-Glu(OBut)-Glu(OBufc)-Glu(OBut)-OBut
analog Beispiel 1 umgesetzt. Nach Behandlung mit Trifluoressigsäure
werden 1,15 g Rohsubstanz gewonnen, die in 0,1 m Essigsäure über
(R)
Sephadex G 25 (200 χ 1I cm-Säule) chromatographiert werden, Ausbeute 7^5 mg einer reinen Fraktion.
Sephadex G 25 (200 χ 1I cm-Säule) chromatographiert werden, Ausbeute 7^5 mg einer reinen Fraktion.
Aminosäureanalyse: Verhältnis Gly:Glu = 6:23,*l (theoret. 6:23)
Trypsin-Kallikrein-Inhibitor-penta-asparaginsäure
900 mg Penta-Boc-Trypsin-Kallikrein-Inhibitor werden mit 365 mg
(1,3 mMol) HCl.H-AspiOBu^-OBu1' analog Beispiel 1 umgesetzt. Nach
Behandlung mit Trifluoressigsäure werden 1,083 g Rohaubstanz
(R)
gewonnen, die in 0,1 m Essigsäure über Sephadex 0 25 (200 χ *lem-Säule)
chromatographiert werden.
Ausbeute 707,6 mg einer reinen Fraktion.
Ausbeute 707,6 mg einer reinen Fraktion.
Aminosäureanalyse: Verhältnis Gly:Qlu:Asp = 6:3,2 :10,5
(theoret. 6:3:10)
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23U886
Trypsin-Kallikrein-Inhibitor-penta-(Glu-Asp-OH)
900 mg.Penta-Boc-Trypsin-Kailikrein-Inhibitor werden mit 610 mg
(1,3 mMol) HCl,H-GIu(0Bufc)-Asp(OB^)-OBu* analog Beispiel 1 umge-■
setzt. Nach Behandlung mit Trifluoressigsäure werden 1,1 g Rohsubstanz
erhalten, die in 0,1 m Essigsäure über Sephadex G 25
(200 χ 4 cm-Säule) chromatographiert werden. Ausbeute 759»3 mg einer reinen Fraktion.
Aminosäureanalyse: Verhältnis Gly:Glu:Asp = 6,0:8,5:10,5
(theoret. 6:8:10)
Beispiel 7 '
Trypsin-Kallikrein-Inhibitor-penta-(Glu-Glu-Asp)
Trypsin-Kallikrein-Inhibitor-penta-(Glu-Glu-Asp)
900 mg Penta-Boc-Trypsin-Kallikrein-Inhibitor werden mit 848 mg
α,3 mMol) HCl.H-Glu(OBut)-Glu(OBufc)-Asp(OBufc)-OBut analog Beispiel 1
umgesetzt. Nach Behandlung mit Trifluoressigsäure werden 1,266 g
(R) Rohsubstanz gewonnen, die in 0,1 m Essigsäure über Sephadex G 25
(200 χ 4 cm-Säule) chromatographiert werden. Ausbeute 727 mg einer reinen Fraktion.
Aminosäureanalyse: Verhältnis Qly:Glu:Asp « 5,5:13,6:10,0
(theoret. 6:13:10)
Beispiel 8
Trypsin-Kallikrein-Inhibitor-penta-(Asp-Qlu-Asp)
Trypsin-Kallikrein-Inhibitor-penta-(Asp-Qlu-Asp)
900 ng Penta-Boc-Trypsin-Kallikrein-Inhibitor werden mit 830 mg
(1,3 »Hol) HCl.H-AspOBu fc)-Glu(OBut)-Asp(OBut)-OBufc analog
Beispiel 1 umgesetzt. Nach Behandlung mit Trifluoressigsäure werden
1,25 g Rohsubstanz gewonnen, die in 0,1 m Essigsäure über Sephadex G 25v ' (200 χ 4 cm-Säule) chro*atographiert werden.
Ausbeute 628,4 mg einer reinen Fraktion.
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Aminosäureanalyse: Verhältnis Gly:Glu:Asp = 6,0:8,0:15,1
(theoret. 6:8:15)
Trypsin-Kailikrein-Inhibitor-penta(GIu-Asp-Glu-Asp)
900 mg Penta-Boc-Trypsin-Kallikrein-Inhibitor werden mit 1,07 g
(1,3 mMol) HCl.H-Glu<OBut)-A8p(OBut)<-eiu{OBut)-Asp(OBut)-OBut
analog Beispiel 1 umgesetzt. Nach Behandlung mit Trifluoressigsäure werden 1,5Ί g Rohsubstanz gewonnen, die in 0,1 m Essigsäure über
Sephadex G 25 (200 χ 1I cm-Säule) Chromatograph!ert werden.
Ausbeute 63*1 mg einer reinen Fraktion.
Aminosäureanalyse: Verhältnis GIy:GIu:Asp = 5,7:13,0:15,6
(theoret. 6:13:15)
Trypsin-Kallikrein-Inhibitor-penta-(GlU-D-GlU-OMe)
900 mg Penta-Boc-Trypsin-Kallikrein-Inhibitor werden mit 597 mg
(1,3 «Mol) HCl".H-Glu(OBut)-D-Glu(OBut)-OMe (J. Chem. Soc. Perkin
1972, Seite 1) analog Beispiel 1 umgesetzt. Nach Behandlung mit Trifluoressigsäure werden 1,2 g Rohsubstanz gewonnen, die in
0,1 m Essigsäure über Sephadex G 25 (200 χ M cm-Säule) chromatographiert
werden.
Ausbeute 651I mg einer reinen Fraktion.
Aminosäureanalyse: Verhältnis Gly:Glu = 6:13,7 (theoret. 6:13)
Trypsin-Kallikrein-Inhibitor-penta(Asp-Glu-NH2)
900 mg Penta-Boc-Trypsin-Kallikrein-Inhibitor werden mit 533 mg
(1,3 mMol) HCl.H-Asp(0But)-Glu(0But)-NHo {gewonnen durch kataly-
t t
tische Hydrierung von Z-Asp(OBu )-GIu(OBu )-NH?, das in
5098U/117S
ι log
J. Chem. Soc. C (1968), Seite 531 beschrieben ist) analog
Beispiel 1 umgesetzt. Nach Behandlung mit Trifluoressigsäure werden 1,18 g Rohsubstanz gewonnen, die in 0,1 m Essigsäure über Sephadex
G 25 (200 χ 1J cm-Säule) chromatographiert werden.
Ausbeute 6^0 mg einer reinen Fraktion
-Aminosäureanalyse: Verhältnis Gly:Glu:Asp = 6,0:8,6:10,3 (theoret. 6:8:10).
Trypsin-Kallikrein-Inhibitor-penta (Asp-Ser-Asp-OH)
900 mg Penta-Boc-Trypsin-Kallikrein-Inhibitor werden mit 702 mg
(1,3 mMol) HCl.H-Asp(OBufc)-Ser-Asp(OBut)-OBut (J. Chem. Soc. C,
Org., 1969, Seite 2218) analog Beispiel 1 umgesetzt. Nach Behandlung mit Trifluoressigsäure werden 1,3 g Rohsubstanz erhalten, die
in 0,1 m Essigsäure über Sephadex G 25*R' (200 χ 4 cm-Säule)
chromatographiert werden.
Ausbeute 710 mg einer reinen Fraktion.
Ausbeute 710 mg einer reinen Fraktion.
Aminosäureanalyse: Verhältnis Gly:Asp:Ser = 6:15,5 'Λ ,9
(theoret. 6:15:6)
5098U/1179
Herstellung der Ausgangssubstanzen
a. Z-Glu(0Bu*)-Glu(0Bu*)-0Bu*
a. Z-Glu(0Bu*)-Glu(0Bu*)-0Bu*
10,4 g (2OmMoI) Z-Glu(0Bu*)-0H. DCHA werden zwischen 100 ml Äther
und 20 ml In HpSO4 bei 0 C verrührt. Die Ätherphase wird mit
Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wird in 50 ml Dimethylformamid gelöst. Zu dieser Lösung gibt man 5,91 g (20 mMol)
HCl.H-GIu(OBu*)-OBu*, 2,7 g (2OmMoI) HOBt, 2,6 ml N-Äthylmorpholin
und bei 00C 4,4 g DCC (als Dimethylformamid-Lösung). Man rührt
1 Stunde bei 0 C, 2 Stunden bei Raumtemperatur und läßt über Nacht bei Raumtemperatur stehen. Anderntags wird der Niederschlag abgesaugt
und das Piltrat eingeengt. Der Rückstand wird in Essigester gelöst und die Lösung nacheinander mit NaHCO -Lösung, KHSO^-Lösung,
NaHCO -Lösung und Wasser gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wird in Essigester über etwa 30 g
basisches Al?0, (Woelm Aktivstufe I) chromatographiert. Das Eulat
wird eingeengt und am Hochvakuum getrocknet. Ausbeute 10 g öl (862).
Nach einiger Zeit kristallisiert das öl, Schmp. 880C
C30H46N2O9 (578,7)
| ber. : | C | 62,26 H | 8,01 | N | 4 | ,84 |
| gef. : | C | 62,3 H | 8,1 | N | 5 | ,1 |
| b. HCl. | H-GIu(OBu* | J-GIu(OBu* | )-0Bu* |
9,6 g Z-GIu(OBu*)-GIu(OBu*)-OBu* werden in Methanol gelöst, mit
Pd-Katalysator versetzt und mit Hilfe eines Autotitratore unter
Zugabe von 2 η methanolischer HCl bei pH 4,5 hydriert. Nach been
deter Hydrierung wird der Katalysator abgesaugt und das Piltrat eingeengt. Ausbeute 7,3g öl (91%)
C,oH,inNo07.HCl (481,04)
5098U/1179
C Z-Glu(ODut)-Glu(OBut)-Glu(OBut)-OBut 23 A A 886
Zu einer Lösung von 6,2 g (12,9 mMol) HCl.H-Glu(03ut)-Glu(0But)-
1,74 g (12,9 mMol) HOBt, 1,68 ml (12 mMol) N-Xthylmorpholin
in 60 ml Dimethylformamid gibt man 6,65 g (12,9 mMol) Z-GIu(OBuS-OTcp,
läßt 5 Minuten rühren und engt am Hochvakuum ein. Der Rückstand wird in Essigester gelöst und wie bei a. ausgeschüttelt.
Nach Trocknen über Natriumsulfat wird eingeengt und der Rückstand mit Petroläther verrieben. Es'wird auf 0°C abgekühlt und abgesaugt,
Ausbeute 6,3 g (70 Ji)
Schmp. 111 bis 113°C,
/C^Vp2 = -29,8° (c = 1, Methanol)
C39H51N3O15 (763,9^)
Schmp. 111 bis 113°C,
/C^Vp2 = -29,8° (c = 1, Methanol)
C39H51N3O15 (763,9^)
ber.: C 61,35 H 8,04 N 5,51 gef.: C 61,2 H 8,0 N 5,6
d. HCLH-GIu(OB^)-GIu(0Bufc)-Glu(0But)-03ut
5,8 g (7,6 mMol) Z-GIu(OBu1^)-GIu(OBu* )-Glu(OBut)-OBut werden
in Methanol wie bei b. katalytisch hydriert. Ausbeute 4,8 g öl (95 %).
C31H55N3O10 . HCl (666,3)
C31H55N3O10 . HCl (666,3)
β. Z-aiu(0Bufc)-Glu(0Bufc)-Glu-(0But)-Glu(0Bufc)-0But
Zu einer Lösung von 3,9 g (5,85 mMol) HCl.H-GIu(0Bufc)-GIu(OBu S-GIu(OBu1O-OBuS
0,79 g (5,85 mMol) HOBt und 0,76 ml (5,85 mMol) N-Xthylmorpholin in 50 ml Dimethylformamid gibt man 3,05 g
(5,85 jnMol) Z-GIu(OBuS-OTcP. Man rührt 1 Stunde bei Raumtemperatur
und arbeitet wie bei c. auf. Ausbeute 4,75 g (86 %) Schmp. 119 bi3 1200C
/cC/p2 = - 29,1° (c = 1, Methanol)
Cü8H76N*°15
Cü8H76N*°15
509114/117*
gef.: C 60,6 H 8,0 N 5,8
f. HCl.H-GIu(OBu*)-Glu(0Bu*)-G1u(0Bu*)-G1u(0Bu*J-OBu*
**,4 g (4,63 mMol) Z-Glu(OBut)-Glu(OBufc)-Glu(OBut-Glu(OBut)-OBufc
werden wie bei b. in Methanol katalytisch hydriert. Ausbeute 3,85 g öl (98 Ji)
CHOH7ONH°13 * HC1 (851.5)
g. Z-GIu(OBu*J-ASp(OBu*J-OBu*
52 g (0,1 MoI) Z-GIu(OBu )-0H.DCHA werden zwischen Äther und
100 ml In HpSO^ bei 00C verrührt. Die Ätherphase wir einmal mit-Wasser
gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wird in 200 ml Dimethylformamid gelöst. Zu dieser
Lösung gibt man 28,1 g (0,1 Mol) HCl.H-ASp(OBuS-OBu*, 13,5 g HOBt
(0,1 Mol), 13 ml N-Äthylmorpholin (0,1 Mol) und bei 00C
22 g DCC (als DimethyIformamid-Lösung). Man verfährt nun wie bei
a. Der Rückstand kristallisiert beim Verreiben mit Petroläther. Ausbeute 42,9 g (76 Jf), Schmp. 128 bis 1300C. Zur weiteren Reinigung
wurde die Substanz in Äther gelöst, und über 120 g bas. Al?0,
chromatographiert.
Ausbeute 3^,7 g Schmp. 131 bis 132°C
Ausbeute 3^,7 g Schmp. 131 bis 132°C
| = -17,9° | (c = 1, Methanol) | N | 4 | ,96 | |
| C29H44N | I2O9 (564 | ,7). | N | 4 | ,9 |
| ber. : | C | 61,70 H 7,86 | |||
| gef. : | C | 61,7 H 7,8 | |||
| h. HCl. | H-GIu(OBu* | )-Asp(OBu*)-OBu* | |||
34,5 g (62 mMol) Z-GIu(OBu*)-Asp(OBu*)-OBu* werden wie bei b. in
Methanol katalytisch hydriert. Ausbeute 29,3 g öl (100 JC)
C21H38N2O7 . HCl (467,01)
5098U/1179
i. Z-GIu(OBu )-GIu(OBu )-Asp(OBu )-0Bu
Zu einer Lösung von 12,5 g (26,7 mMol) HCl.H-GIu(OBufc)-Asp(OBut)-OBu*,
3,6 g (26,7 mMol) HOBt, 3,5 ml (26,7 mMol) N-Äthylmorpholin
in 100 ml Dinet hylformamxd gibt man bei Raumtemperatur 13,82 g
(26,7 mMol) Z-Glu(OBufc)-OTcp. Man läßt 1 Stunde stehen und arbeite'
wie bei c auf. Ausbeute 21J., 7 g öl. Zur weiteren Reinigung wird das
öl in Äther gelöst über 75 g basisches Al-O chromatographiert.
Ausbeute 17,65 g amorphe Masse (88 %)
= -23.9° (c = 1, Methanol)
C38H59N3°12 (7l<9>9)
ber.: C 60,86 H 7,93 N 5,61
gef.: C 60,3 H 7,9 N 5,6
j. HCLH-GIu(OBu* J-GluiOBu^-AspCOBu^-OBu*
17 g (22,7 mMol) Z-GIu(OBu* J-GIu(OBu*) .Asp(OBu*)-OBu^ werden
analog b. in Methanol katalytisch hydriert. Ausbeute 1^,3*1 g amorphe Masse (97 %)
C30H53N3O10 . HCl (652,2)
C30H53N3O10 . HCl (652,2)
k. Z-ASp(OBu* J-GIu(OBu1^)-ASp (OB^ J-1^
Zu einer Lösung von 12,5 E (26,7 mMol)' HCl.H-Glu(OBufc)-Asp(OBut)-OBu**
und 3,5 ml (26,7 mMol) N-Äthylmorpholin in 100 ml Dimethylformamid
gibt man 11,25 g (26,7 mMol) Z-Asp(OBufc)-0NSu und läßt
etwa 20 Stunden bei Raumtemperatur reagieren. Aufgearbeitet wird analog c. Der Rückstand (18,4 g öl) wird zur Reinigung in Äther
gelöst und über 50 g bas . AIpO-, chromatographiert.
Ausbeute 13,1J g amorphe Substanz (68 %)
2 = -23,9° (c = 1, Methanol)
509814/1179
C37H57N3O12 (735,9)
23U886
ber. : C 60,H II 7,8l N 5,71
gef.: C 60,0 H 7,1 N 5,6
1. HCl.Η-Asp(OBu*)-GIu(OBu*)-Asp(0Bu*)-0Bu*
12.8 g (17,1I mMol) Z-Asp(0But)-Giu(0But)-Asp(0But)-0But werden
analog b. in Methanol katalytisch hydriert. Ausbeute 10,1J g amorphe Substanz (9^ %)
C29H51N3O10 . HCl (638,2)
m. Z-GIu(OBu*)-Asp(OBu*)-Glu(0Bu*)-Asp(OBu*)-0Bu*
Zu einer Lösung von 6,4 g (10 mMol) HCl.Η-Asp(OBu*)-GIu(OBu*)-Asp(OBu*)-OBu*,
1,35 g (10 mMol) HOBt und 1,3 ml (10 mMol) N-Äthylmorpholin
in 1JO ml Dimethylformamid gibt man 5 g (10 mMol)
Z-GIu(OBu )-OTcp, läßt 1 Stunde bei Raumtemperatur rühren und
arbeitet analog c. auf. Der Rückstand wied mit Petroläther verrieben. Ausbeute 7,1J g (80 %), Schmp. 1960C
/o6/^2 = -24,6° (c = 1, Methanol)
Ci16H72NnO15 (921,1)
ber. : C 59,98 H 7,88 N 6,08 gef. : C 59,6 H 7,8 N 6,1
n. HCl.H-GIu(OBu*)-Asp(OBuVgIu(OBu*)-Asp(OBu*)-0Bu*
7 g (7,6 mMol) Z-Glu(OBu*)-Asp(OBu*)-Glu(OBu*)-Asp(OBu*)-OBut
werden analog b. in Methanol katalytisch hydriert. Ausbeute 6,1 g amorphe Substanz (97,5 Jt)
Cj>8H66Vl3 -HCl (823,*)
509814/1179
- 18 -ο. Penta-Boc-Trypsin-Kallikrein-Inhibitor 2344886
C/O 1,3 g Trypsin-Kallikrein-Inhibitor werden in 10 ml Wasser
gelöst. Dazu gibt man 50 ml Dimethylformamid und 4,4 ml
ges. NaHCO -Lösung. Nun gibt man 430 mg Doc-ONSu zu, rührt
1 Stunde bei Raumtemperatur und läßt über Nacht stehen. Anderntags wird mit 2n Essigsäure auf pH 5 angesäuert. Die
klare Lösung wird im Hochvakuum eingeengt. Der Rückstand wird mit Wasser verrieben, abgesaugt, mit Wasser gut gewaschen und
getrocknet. Mit Essigester wird nochmals verrieben, abgesaugt und getrocknet. Ausbeute 880 mg.
Die Papierelektrophorese ergab im sauren Medium eine einheitliche Substanz, die vom Trypsin-Kallikrein-Inhibitor verschieden
war.
ß) 1,3 g Trypsin-Kaliikrein-Inhibitor werden in 20 ml Dimethylformaraid
suspendiert. Dazu gibt man 270 mg HOBt, 480 mg Boc-ONp und O,l4 ml 1.1'.4.4'-Tetramethylguanidin. In mehreren
Portionen werden noch 0,7 ml 1.I1,4.4'-Tetramethylguanidin und
480 mg Bqc-ONp zugegeben. Man rührt insgesamt 2 Tage bei
Raumtemperatur, engt ein und verrührt den Rückstand mit Essigester. Der Niederschlag wird mit Methanol verrieben und abgesaugt.
Ausbeute 950 mg. Das gewonnene Produkte ist papxerelektrophoretis ch identisch mit der nachcO gewonnenen Substanz.
7g Trypsin-Kallikrein-Inhibitor werden in 77 ml Wasser gelöst.
Dazu gibt man 315 ml Dimethylformamid, 24 ml ges. NaHCO -Lösung
und 14 ml Boc-azid. Man rührt 5 Stunden bei 35°C. Mit 2n Essigsäure wird auf pH 5 angesäuert und engt im Hochvakuum
ein. Der Rückstand wird mit Wasser verrieben und abgesaugt. Ausbeute 6,5 g. Das gewonnene Produkt ist papxerelektrophoretisch
identisch mit der nach^O gewonnenen Substanz.
509814/1179
Abkürzungen
Boc tert.-Butyloxycarbonyl
Z Beηzyloxycarbonyl
03ufc tert.-Butylester
ONp 4-Nitrophenylester
OHSu N-Hydroxysuccinimidester
OTcp 2.Ί,5-Trichlorphenylester
DCHA Dicvclohexylamin
DCC- Dicyclohexylcarbodiimid
HOBt 1-Hydroxybenzotriazol
5098U/1 179
Claims (4)
1. Derivate des basischen Trypsin-Kallikrein-Inhibitors aus Säugerorganen,
worin die fünf vorhandenen Carboxylgruppen des Peptidmoleküls amidartig durch Peptidreste der allgemeinen Formel I verlängert
sind,
-NH-CH-CO-(NH-CH-CO-)χν/ . (I)
Y Y
in der X für die Zahl 0 bis 10 steht', Y Wasserstoff oder einen gerädkettigen oder verzweigten Alkylrest mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen,
der gegebenenfalls durch eine Carboxyl-, Hydroxyl- oder Carbonamidgruppe substituiert ist, wobei der Rest NH-CH-CO
auch den Prolin-Rest bedeuten kann, und wobei Y, falls X=O ist,
-CH2COOH oder -CH2-CH2-COOH bedeutet und falls X für die Zahlen
1 bis 10 steht, zumindest eine Seitenkette Y -CH.-COOH oder
-CH2-CH2-COOH darstellt, worin weiterhin W -OH bedeutet, doch bei
Anwesenheit von mindestens zwei Carboxylgruppen in den Seitenkotten
auch -NHp, NH-CH,, NH-C2H5, -OCH- oder OC2H5 bedeuten kann.
2. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den Try.psin-Kallikrein-Inhibitor,
dessen fünf primäre Aminogruppen durch sauer leicht abspaltbare Schutzgruppen geschützt sind, mit Aminosäuren oder Peptiden der
allgemeinen Formel II,
NH -CH-CO-(NH-CH-CO-)YW (II)
d ι χ Α
Y Y
in der Y und X die angegebene Bedeutung haben, vorhandene Carboxylgruppen
in Y jedoch als tert.-Butvlester vorliegen, V/' tert.-Butoxv
bedeutet, doch bei Anwesenheit von mindestens 2 tert.-Butylesterf-runpen
in den Seitenketten auch -NHp, -NH-CH,, -NH-CpH,-,
-OCH, oder -OC3H5 bedeuten kann, in Gegenwart von 1-Hydroxvben7.otria7.ol
und Dicyclohexvlcarbodiimid umsetzt und anschließend
die Schutzgruppe!! sauer abspaltet.
5098U/1179
3. Pharmazeutische Zubereitungen für Injektions- und Infusion^zwecke,
gekennzeichnet durch einen Gehalt an einer Verbindung nach Anspruch
4. Verfahren zur Herstellung von wäßrigen Injektions- und/oder
Infusionslösungen, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung
nach Anspruch 1, gegebenenfalls zusammen mit physiologisch verträglichen
Zusatzstoffen und/oder Lösungsmitteln in eine für Injektionen und/oder Infusionen geeignete Anwendungsform bringt.
509SU/117·
Priority Applications (15)
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|---|---|---|---|
| DE19732344886 DE2344886C3 (de) | 1973-09-06 | Synthetisch modifizierte Derivate des basischen Trypsin-Kalllkrein-Inhibitors aus Säugetierorganen und Verfahren zu ihrer Herstellung | |
| NL7411563A NL7411563A (nl) | 1973-09-06 | 1974-08-30 | Werkwijze voor het bereiden van synthetisch gemodificeerde trypsine-inhibitoren. |
| ES429700A ES429700A1 (es) | 1973-09-06 | 1974-08-31 | Procedimiento para la preparacion de derivados del inhibidorde tripsina-calicreina basico obtenido de organos de mamife-ros. |
| US05/503,066 US3953417A (en) | 1973-09-06 | 1974-09-04 | Synthetically modified trypsin inhibitors and process for preparing them |
| SE7411157A SE414172B (sv) | 1973-09-06 | 1974-09-04 | Forfarande for framstellning av derivat av basisk trypsin-kallikreininhibitor fran deggdjursorgan |
| AU72963/74A AU482483B2 (en) | 1973-09-06 | 1974-09-04 | Synthetically modified trypsin inhibitors and process for preparing them |
| CA208,541A CA1030524A (en) | 1973-09-06 | 1974-09-05 | Synthetically modified trypsin inhibitors and process for preparing them |
| AT716374A AT339472B (de) | 1973-09-06 | 1974-09-05 | Verfahren zur herstellung von neuen, synthetisch modifizierten trypsin-kallikrein-inhibitoren |
| FR7430332A FR2242992B1 (de) | 1973-09-06 | 1974-09-06 | |
| CH7412190A CH608787A5 (de) | 1973-09-06 | 1974-09-06 | |
| GB3911074A GB1462493A (en) | 1973-09-06 | 1974-09-06 | Trypsin inhibitors and process for the production thereof |
| BE148290A BE819639A (fr) | 1973-09-06 | 1974-09-06 | Inhibiteurs de trypsine modifies et leur procede de preparation |
| JP49102877A JPS5052081A (de) | 1973-09-06 | 1974-09-06 | |
| EG371/74A EG11583A (en) | 1973-09-06 | 1974-09-07 | Synthetically modified trypsin inhibitors and process for preparing them |
| US05/636,728 US3992529A (en) | 1973-09-06 | 1975-12-01 | Method of treating excessive fibrinolysis with synthetically modified trypsin inhibitors |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19732344886 DE2344886C3 (de) | 1973-09-06 | Synthetisch modifizierte Derivate des basischen Trypsin-Kalllkrein-Inhibitors aus Säugetierorganen und Verfahren zu ihrer Herstellung |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE2344886A1 true DE2344886A1 (de) | 1975-04-03 |
| DE2344886B2 DE2344886B2 (de) | 1976-08-12 |
| DE2344886C3 DE2344886C3 (de) | 1977-03-31 |
Family
ID=
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2789628A3 (de) * | 2007-05-29 | 2015-03-04 | Angiochem Inc. | Aprotininähnliche Polypeptide zur Abgabe von an Geweben konjugierten Mitteln |
| US9365634B2 (en) | 2007-05-29 | 2016-06-14 | Angiochem Inc. | Aprotinin-like polypeptides for delivering agents conjugated thereto to tissues |
| US10980892B2 (en) | 2015-06-15 | 2021-04-20 | Angiochem Inc. | Methods for the treatment of leptomeningeal carcinomatosis |
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| EP2789628A3 (de) * | 2007-05-29 | 2015-03-04 | Angiochem Inc. | Aprotininähnliche Polypeptide zur Abgabe von an Geweben konjugierten Mitteln |
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| US10980892B2 (en) | 2015-06-15 | 2021-04-20 | Angiochem Inc. | Methods for the treatment of leptomeningeal carcinomatosis |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| BE819639A (fr) | 1975-03-06 |
| CA1030524A (en) | 1978-05-02 |
| DE2344886B2 (de) | 1976-08-12 |
| EG11583A (en) | 1978-03-29 |
| NL7411563A (nl) | 1975-03-10 |
| SE414172B (sv) | 1980-07-14 |
| GB1462493A (en) | 1977-01-26 |
| US3953417A (en) | 1976-04-27 |
| CH608787A5 (de) | 1979-01-31 |
| FR2242992B1 (de) | 1980-01-11 |
| AT339472B (de) | 1977-10-25 |
| JPS5052081A (de) | 1975-05-09 |
| AU7296374A (en) | 1976-03-11 |
| ES429700A1 (es) | 1977-03-01 |
| FR2242992A1 (de) | 1975-04-04 |
| ATA716374A (de) | 1977-02-15 |
| SE7411157L (de) | 1975-03-07 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C3 | Grant after two publication steps (3rd publication) | ||
| E77 | Valid patent as to the heymanns-index 1977 | ||
| 8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |