DE2112553C3 - 1 -alpha-Aminolsobuttersäurecorticotropinpeptide, deren Derivate, Säureadditionssalze und Komplexe sowie Arzneipräparate - Google Patents

1 -alpha-Aminolsobuttersäurecorticotropinpeptide, deren Derivate, Säureadditionssalze und Komplexe sowie Arzneipräparate

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DE2112553C3 DE2112553A DE2112553A DE2112553C3 DE 2112553 C3 DE2112553 C3 DE 2112553C3 DE 2112553 A DE2112553 A DE 2112553A DE 2112553 A DE2112553 A DE 2112553A DE 2112553 C3 DE2112553 C3 DE 2112553C3
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    • C07K14/665Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans derived from pro-opiomelanocortin, pro-enkephalin or pro-dynorphin
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Description

IO
in der X ein L-Lysin- oder L-Ornithinresi und Y ein L-Prolin-. L-Prolinester- oder i.-Prolinamidrest ist, deren Säureadditionssalze und Komplexe.
10. l-a-Aminoisobuttersäure-corticotropinpeptide der allgemeinen Formel
a-Aminoisobutyryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenyl-
alanyl-L-arginyl-L-tryptophy'l-elycyl-
L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-X-L-lysyl-
L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-
L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-
L-asparagyl-L-alanyl-Y
in der X ein L-Lysin- oder L-Ornilhinrest und Y ein Glycin-, Glycinester- oder Glycinamidrest ist. deren Säureadditionssalze und Komplexe.
11. Arzneipräparate, enthaltend ein 1-a-Aminoisobuttersäure-corticotropinpeptid nach Anspruch 1 bis 10.
35
Die Erfindung betrifft neue l-a-Aminoisobutteriäure-corticotropinpeptide, die an Stelle des Serinrestes im nativen Corticotropin als aminoendständige Aminosäure eine a-Aminoisobuttersäure enthalten, deren Derivate, pharmakologisch verträgliche Säureadditionssalze, Zwischenprodukte und Komplexe.
Die Erfindung beruht auf dem Befund, daß der Ersatz der aminocndständigen Aminosäure in Corticotropinpeptiden durch a-Aminoisobuttersäure deren biologische Eigenschaften erheblich verstärkt und zu einer Wirkungsverlängerung führt. Es wurde ferner festgestellt, daß diese verbesserten Eigenschaften auf einer verminderten Empfindlichkeit der 1-a-Aminoisobuttersäure-corticotropinpeptide gegenüber der Wirkung der intrazellulären Aminopeptidase beruhen. Gegenstand der Erfindung sind 1-a-Aminoisobuttersäure^corticotropinpeptide mit Aminosäurereslen entsprechend der Sequenz 1-16 bis 1-39 des nativen Corticotropins, deren Derivate. Säureadditionssalze und Komplexe.
Die l-a-Aminoisobuttersäure-corticotropinpeptide können nach an sich bekannten Methoden durch aufeinanderfolgende Kondensation der Aminosäuren oder durch Kondensation kleiner Peptidfragmcnte hergestellt werden. Insbesondere können die Verbindungen der Erfindung entweder
(a) durch Umsetzung eines Aminosäureesters oder Peptidesters mit einer freien Aminogruppe mit einer anderen Aminosäure oder einem anderen Peptid mit geschützten Aminogruppen in Gegenwart eines Kondcnsalionsmitlels oder
(b) durch Umsetzung einer Aminosäure oder eines Peptids mit einer freien Aminogruppe und geschützter oder ungeschützter Carboxylgruppe mit einer anderen Aminosäure oder einem anderen Peptid mit einer aktivierten Carboxylgruppe und geschützter Aminogruppe oder
(l) durch Umsetzung einer Aminosäure oder eines Peptids mit freier Carboxylgruppe und geschützter Aminogruppe mit einer anderen Aminosäure oder einem anderen Peptid mit aktivierter Aminogruppe und geschützter Carboxylgruppe und anschließende Abspaltung der Schutzgruppen durch Hydrogenolyse, Acidolyse, Hydrolyse, Hydrazinolyse. Reduktion mit Natrium in flüssigem Ammoniak oder andere Weise hergestellt werden.
Peptidbindungen werden nach üblichen Methoden ausgebildet. Beispiele für diese Methoden sind die Azid-. Dicyclohexylcarbodiimid-, Carbonyldiimidazol-, gemischte Anhydrid- oder aktivierte Estermethode, z. B. die p-Nitrophenylestermethode, die N-Hydroxysuccinimidester-, Cyanmethylester-, p-Nitrophenylthiolester-, Pentachlorphenylester-, Isoxazolium-, N-Carboxyanhydrid-, Tetraäthylpyrophosphit oder Äthylchlorphosphitmethode oder deren Kombinationen. Die Peptide werden auch nach der sogenannten Synthese in fester Phase hergestellt. Die vorgenannten Methoden können zwar zur Ausbildung jeder Peptidbindung bei der Herstellung der Verbindungen der Erfindung angewendet werden, die bevorzugte Methode ist jedoch die Dicyclohexylcarbodiimid-. Azid-. gemischte Anhydrid- und aktivierte Estermethode.
Zur Herstellung der l-ot-Aminoisobuttersäure-corticotropinpeplide werden freie funktionell Gruppen, die an der Reaktion nicht teilnehmen, vorzugsweise geschützt, insbesondere durch solche Gruppen, die durch Hydrogenolyse, Acidolyse, Hydrazinolyse. Hydrolyse oder Reduktion mit Natrium in flüssigem Ammoniak leicht entfernt werden können. Die Carboxylgruppe wird vorzugsweise durch Veresterung, z. B. mit einem niederen aliphatischen Alkohol, wie Methanol, Äthanol. Propanol, Isopropanol oder tert.-Butanol, oder einem durch einen aromatischen Rest substituierten aliphatischen Alkohol, wie Benzylalkohol. p-Nitrobenzylalkohol oder p-Methoxybenzylalkohol, oder durch Amidbildung geschützt. Diese Carboxylschutzgruppen werden in üblicher Weise eingeführt.
Die Aminogruppe wird vorzugsweise mit einer tert.-Butyloxycarbonylgruppe, terl.-Amyloxycarbonylgruppe. o-Nitrophenylsulfenylgruppe, 2-(p-Diphenyl )-isopropyloxycarbonylgruppe. Benzy Ioxycarbonylgruppe. p-Nitrobenzyloxycarbonylgruppe, p-Methoxybenzyloxycarbonylgruppe. Tosylgruppe, Formylgruppc oder Tritylgruppe in üblicher Weise geschützt. Zum Schutz der Guanidylgruppe des Arginins wird vorzugsweise die Nitrogruppe, Tosylgruppe oder Adamantyloxycarbonylgruppe verwendet. Der Schutz der Guanidylgruppe ist jedoch nicht immer erforderlich. Die w-ständigc Aminogruppe des L)SiIiS oder Ornithins wird vorzugsweise durch eine der vorgenannten Aminoschutzgruppen geschützt. Diew-ständigen Carboxylgruppen der Glutaminsäure oder Asparaginsäure werden vorzugsweise durch die vorgenannten Carboxylschutzgruppcn geschützt, und die Imidazolgruppc des Histidins kann z.B. durch eine Tosyl-, Benzyloxycarbonyl- oder Benzylgruppe geschützt weiden. Die Hydroxylgruppe des Serins oder Tyrosins kann z. B. durch eine Acetyl-. Benzyl-
oder tert.-Buty!gruppe geschützt werden, doch ist dieser Schutz nicht immer erforderlich.
Die l-a-Aminoisobuttersäure-corticotropinpeptide der Erfindung enthalten vorzugsweise die Aminosäurereste entsprechend der Sequenz 1-18 bis 1 -27 des nativen Corticotropins.
Außer dem Ersatz der aminoendständigen Aminosäure können einige andere Aminosäurereste der Sequenz durch andere Aminosäuren ersetzt werden, ohne die corticotrope Wirkung wesentlich zu beeinträchtigen. Beispielsweise kann die 4. Aminosäure Methionin durch Norvalin, Norleucin, Leucin oder a-Aminobuttersäure, die 5. Aminosäure Glutaminsäure durch Glutamin, die 15. und bzw. oder 16. Aminosäure Lysin durch Ornithin, die 17. und bzw. oder 18. Aminosäure Arginin durch Lysin oder Ornithin und bzw. oder die 25. Aminosäure Asparaginsäure durch Valin ersetzt werden.
Die bevorzugten Corticotropinpeptide der Erfindung haben die allgemeine Forme! I
a-Aminoisobutyryl-L-tyrosyl-L-seryl-
A-B-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-
L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-
glycyl-C-D-E-F (I)
in der A der L-Methionin-, L-Norvalin-, L-Norleucin-, L-Leucin- oder α-Aminobuttersäurerest, B der L-Glutaminsäure- oder L-Glutaminrest, C und D jeweils der L-Lysin- oder L-Ornithinrest, E der L-Arginin-, L-Lysin- oder L-Ornithinrest und F der L-Arginin-, L-Arginyl-L-prolin-, L-Arginyl-L-prolyl-L-valin-, L-Arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysin-, L-Arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valin-, L-Arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosin-, L-Arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin-, L-Arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-asparaginsäure-, L- Arginy 1-L-proly 1-L-valy 1-L-lysy 1-L-va IyI-L-tyrosyl-L-prolyl-L-valin-, L-Arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-asparagyl-L- alanin-, L-Arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-asparagyl-L-alanyl-glycin-, L-Arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-asparagyl-glycyl-L-glutaminsäure-, L-Arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L- alanyl-glycyl-L-glutaminsäure-, L-Arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-asparagylglycyl-L-glutaminsäure- oder der L-Arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-asparagylglycyl-L-alaninrest oder der entsprechende Ester oder das entsprechende Amid ist.
Die Peptide der allgemeinen Formel I können durch Umsetzung eines Aminosäureesters oder Peptidesters mit freier Aminogruppe mit einer anderen Aminosäure oder einem anderen Peptid mit geschützter Aminogruppe in Gegenwart eines Kondensationsmittels oder durch Umsetzung einer Aminosäure oder eines Peptids mit freier Aminogruppe und geschützter oder ungeschützter Carboxylgruppe mit einer anderen Aminosäure oder einem anderen Peptid mit aktivierter Carboxylgruppe und geschützter Aminogruppe oder durch Umsetzung einer Aminosäure oder eines Peptids mit freier Carboxylgruppe und geschützter Aminogruppe mit einer anderen Aminosäure oder einem anderen Peptid mit aktivierter Aminogruppe und geschützter Carboxylgruppe in der Reihenfolge der vorgenannten Amir.osäurensequenz hergestellt werden.
Die letzte Kupplungsreaktion zur Herstellung des Peptids der allgemeinen Formel I wird z.B. durch Kondensation eines geschützten Decapeptids der allgemeinen Formel
R, -a-Aminoisobutyryl-O-Rz-L-tyrosyl-L-sery 1-
A-y-Ra-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-
L-arginyl-L-tryptophylglycin,
in der R1 eine Aminoschutzgruppe, R2 eine Hydroxylschutzgruppe und R3 eine Carboxylschutzgruppe bedeutet und A die vorstehend angegebene Bedeutung hat, mit einem geschützten Peptid der allgemeinen Formel
Nc-R4-t-Lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-Na>-R5-C-N<"-R6-D-E'-F\
in der R4, R5 und R6 eine Aminoschutzgruppe bedeuten, E' ein geschützter oder ungeschützter L-Arginin-. L-Lysin- oder L-Ornithinrest und F' ein geschützter oder ungeschützter Aminosäure- oder Peptidrest der vorgenannten Art ist, in einem inerten Lösungsmittel bei Temperaturen von -20 bis 6O0C während etwa 2 Stunden bis 7 Tagen kondensiert und anschließend die Schutzgruppen aus dem erhaltenen geschützten Peptid der allgemeinen Formel
R, -a-Aminoisobutyryl-O-Rj-L-tyrosyl-L-seryl-
A-y-Rj-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-
L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-N'-R^-L-lysyl-
L-prolyl-L-valyl-glycyl-N™-R5-C-Nw-R6-D-E'-F',
in der R1, R2, R3, R4, R?, R6^ A, C, D, E' und F' die obige Bedeutung haben, in üblicher Weise bei Temperaturen von etwa -20 bis 6O0C während etwa 30 Minuten bis 24 Stunden abspaltet. Beispiele für verwendbare inerte Lösungsmittel sind Dimethylformamid Dimethylsulfoxid, Dioxan, Hexamethylphosphortriamid, deren Gemische und Gemische mit Wasser.
Die bevorzugten Verfahren zur Herstellung de; Octadecapeptids, des Tetracosapeptids und des Hepta cosapeptids sind in den Tabellen I, Π und III ange geben.
Tabelle I Herstellung des Octadecapeptids
BzI
BOC-Tyr-ONP + H-Ser-OMe
BzI
I 1
BOC-Tyr ■ Ser-OMc
OBzI
BOC-Ghi-ONP + H-His ■ Phe · Arg · Trp GIy-OI
OBzI
BOC-GIu ■ His Phc Ary ■ Trp GIy-OII
Fortsetzung
BzI HCIAcOH
ι ι
Z-Ibu-OH + H-Tvr · Ser-OMc
Z-Ibu'
BzI
BzI
DCC
NH2NH,
Z-lbuTyrSer-NHNH2
Bz] HNO2 OBzI
i
Z-Ibu · Tyr · Scr-N3 + H-MeI · GIu · His · Phe ■ Arg · Trp · GIy-OH
BzI lOBzl
I
Z-Ibu ■ Tyr ■ Ser ■ Met · GIu ■ His · Phe ■ Arg · Trp · GIy-OH
DCC, HOSu
OB?] CK1COOH
BOC-Mct-ONP + H-GIu · His ■ Phe ■ Arg ■ Trp GIy-OH
OBzI
! I
BOC-Met ■ GIu ■ His ■ Phe Arg ■ Trp ■ GIy-OH
CF3COOH
BzI
OBzI
BOC
BOCBOC
Z-Ibu · Tyr ■ Ser · Met · GIu · His · Phe ■ Arg ■ Trp ■ GIy-OSu + H-Lys · Pro · VaI ■ GIy ■ Lys · Lys · Arg · Arg-NH2 BzI OBzI BOC BOCBOC
Il I Il
Z-Ibu ■ Tyr · Ser ■ Met · GIu ■ His · Phe · Arg/"· Trp ■ GIy · Lys · Pro · VaI · GIy · Lys ■ Lys ■ Arg · Arg-NH2
HF
H-Ibu · Tyr · Ser · Met · GIu · His · Phe · Arg · Trp · GIy ■ Lys ■ Pro ■ VaI ■ GIy · Lys ■ Lys · Arg ■ Arg-NH2
Tabelle Herstellung des Tetracosapeptids
NOj
Z-Arg-OH + H-Pro-OMe Z-VaI · Tyr-N, + H-Pro-OMc
DCC
Z-VaI ■ Tyr ■ Pro-OMc
NO2
Z-Arg · Pro-OMe
NO,
NO-
HBr/CH3COOH
Hj/Pd
BOC ,
IM I i
Z-Arg-OH + H-Arg · Pro-OMc Z-Lys-OH + H-VaI · Tyr · Pro-OMc
NO2
M. A. NO2
Z-Arg ■ Arg · Pro-OMc HBrCH3COOH
BOC NO2!
BOC DCC Z-Lys · VaI · Tyr ■ Pro-OMc
NO,
BC
H2ZPd
Z-Lys-OH + H-Arg · Arg ■ Pro-OMc Z-VaI-OH + H-Lys · VaI Tyr ■ Pro-OMc
BOC
M. A.
NO2 NO;
Z-Lys · Arg ■ Arg ■ Pro-OMc
DCC BOC
Z-VaI · Lys · VaI Tyr ■ Pro-OMc
Fortsetzung
!oh
H, IM
BOc:NO, NO, BOC
Z-I..ys ■ Arg · Arg ■ Pm-OH + H-VaI ■ Lys · VaI · Tyr ■ Pm-OMe
BOC NO,
DCC. HOSu NO,
BOC
Z-Lys · Arg · Arg ■ Pro VaI · Lys · VaI · Tyr ■ Pro-OMc
H2/Pd BOC BOC BOC BOC
! i I
Z-Lys ■ Pro ■ VaI ■ GIy ■ Lys-N., + H-Lys · Arg · Arg ■ Pro ■ VaI ■ Lys · VaI · Tyr Pro-OMc
B/l OBzI BOC BOCBOC BOC
Ί I Ii I
Z-Ibu Tyr Scr- Met ■ GIu- His- Phe· Arg-TrpGly-OH Z-Lys · Pro ■ VaI · GIy ■ Lys ■ Lys · Arg · Arg · Pro ■ VaI ■ Lys ■ VaI Tyr Pro-OMc
OBzI
DCC. HOSu
BOC
BOC BOC ! ί
Z-Ibu■ Tyr·Ser· Met GIu-His- Phe Arg-Trp-GIy-OSu + H-Lys ■ Pro · Va! · GIy · Lys ■ Lys ■ Arg · Arg ■ Pro ■ VaI · Lys ■ VaI · Tyr Pm-OMe
BzI
OB?!
BOC
BOCBOC
IH)C
Z-Ibu Tyr· Ser Met GIu His· Phe ArgTrpGly Lys· Pro VaI GIy Lys Lys Arg-Arg-Pro VaI-Lys-VaI Tyr Pm-OMi
H-lbuTyrScr Met GIu- His- Phe- Arg-Trp- GIy Lys Pro- VaIGIy Lys- Lys· Arg- Arg- Pro -VaI- Lys- VaI Tyr- Pro-OMc
Tabelle 111
Herstellung des Heptacosapeptids
rj NO,
I
Z-Arg-OH f H-Pm-OMc
NO, 1)CC
I " i
Z-Arg · Pro-OMc
NO,
NO,
ι Ί
HBrAcOH
Z-Arg-OH + Η-Arg · Pro-OMc
M. A.
NO, NO,
Z-Arg Arg- Pro-OMc
HBr AcOII
BOC NO, NO;
Z-Lys-OH -» H-Arg ■ Arg · Pro-OMc
MA. BOCNO, NO,
Z-Lys · Arg · Arg · Pro-OMc
OH BOCNO- NO, ';
II'!1 Z-Lys Arg-Arg Pm-OH
11
Fortsetzung
OBu'
Z-AIa · GIy-OBu'
! Hj'Pd
Z-Asp-OH + H-AIa · GIy-OBu1
OBu'
Z-Asp ■ AIa ■ GIy-OBu'
H2ZPd
Z-Pro-OH + H-Asp ■ AIa ■ GIy-OBu' DCC
OBu'
OBu1
Z-Pro ■ Asp · Ala · GIy-OBu1
H,'Pu Z OBu' ,
i I
Z-Tyr-ONP + H-Pro ■ Asp ■ Ala · GIy-OBu'
Z jOBu1
Z-Tyr · Pro · Asp ■ AIa ■ GIy-OBu'
OBu'
I *
I-Val-ONP + H-Tyr · Pro · Asp · Ala ■ GIy-OBu'
i OBu1
j
Z-VaI ■ Tyr · Pro · Asp ■ Ala · GIy-OBu1
BOC
I H,/Pd
j "' C)Bu'
ί I
Z-Lys-ONP + H-VaI ■ Tyr ■ Pro · Asp ■ Ala ■ GIy-OBu'
BOC
OBu1
Z-Lys · VaI ■ Tyr · Pro · Asp · Ala · GIy-OBu1
Η·,,· Pd
BOC ι ' OBu'
H-Lys · VaI · Tyr ■ Pro ■ Asp ■ Ala ■ GIy-OBu'
BOC OBu'
I I
Z-VaI-ONP + H-Lys · VaI Tyr ■ Pro · Asp · Ala ■ GIy OBu1
BOC I OBu'
i Z-VaI ■ Lys ■ VaI ■ Tyr · Pro Asp · Ala ■ GIy-OBU1
BOCNO2NO, BOC I OBu1
ill" I I
Z-Lys Arp · Arg · Pm-OH + H-VaI Lys · VaI Tyr · Pro Asp Ala · GIy-OBu'
Fortsetzung
DCC. HOSu
OBu1
BOCNO2NO,
III" i i
Z-Lys · Arg · Arg · Pro · VaI · Lys ■ VaI ■ Tyr · Pro · Asp · AIa ■ GIy-OBu'
BOC
BOC BOC
BOC
H2/Pd
OBu'
Z-Lys · Pro · VaI · GIy · LyS-N3 + H-Lys · Arg ■ Arg · Pro · VaI · Lys · VaI · Tyr ■ Pro ■ Asp · AIa · GIy-OBu'
BzI BzI BOC BOCBOC BOC OBu'
iGluHis· PheArgTrpGly-OH Z-LysProValGlyLysLysArgArg-ProValLysValTyrProAspAla GIy-OBu'
t-IbuTyrSer-Met-
BzI BzI
DCC, HOSu
BOC
BOCBOC
H2/Pd
BOC
OBu1
t-IbuTyr-SerMetGluHisPheArgTrpGly-OSu + H-LysProValGiyLysLysArgA.gProValLysValTyrProAspAlaGly-OBu'
BzI BzI BOC BOCBOC BOC OBu'
Z-IbuTyrSerMctGluHisPheArgTrpGlyLysProValGlyLys-LysArgArgProValLysValTyrProAspAlaGly-OH
H-lbuTyrSerMetGluHisPheArgTrpGlyLysProValGlyLysLysArg-Arg-ProValLysValTyrProAsp AIaGIy-OH
In den Tabellen werden folgende Abkürzungen für und das Tripcptid sind neue Verbindungen, die wertdie Aminosäurereste verwendet: volle Zwischenprodukte zur Herstellung der Cortico-
Ibu = α-Aminoisobuttersäure, Tyr = L-Tyrosin, tropinpeptide der Erfindung sind.
Ser = L-Serin Met = L-Methionin, Glu = L-Glut- Das vorgenannte Verfahren ist zwar das bevor-
»minsäure His = L-Histidin, Phe = L-Phenylalanin, 40 zugte Verfahren zur Herstellung der Corticotropin-Arg = L-Arginin, Trp = L Tryptophan, GIy = Glycin, peptide der Erfindung, man kann jedoch die Scnutz-Lys = L-Lysin, Pro = L-Prolin, Val = L-Valin, Asp =
L-Asparaginsäure, AIa = L-Alanin. BOC = tert .-Butyloxycarbonyl, BzI = Benzyl, OBu1 = tert.-Butoxy DCC = N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid, Z =
benzyloxycarbonyl, HOSu = N-Hydroxysuccinimid,
MA. = gemischte Anhydridmethode. ONP = p-Nitro-
phenoxy.
Aus den Tabellen ist ersichtlich, daß das Tripeptid,
gruppen, die Kupplungsmethoden oder die vorgenannte Abspaltung der Schutzgruppen durch äquivalente Methoden ersetzen und die Stellungen und die 45 Reihenfolge der Kupplung der Peptidfragmente ändern.
Die im Verfahren verwendeten Schulzgruppen können durch Hydrogenolyse. Hydrolyse, Hydrazinolyse.
«us ucu ,„uv,,.., .α. w.o.- —, r-r- -, Reduktion mit Natrium in flüssigem Ammoniak oder
das die eisten drei Aminosäuren enthält, nämlich 50 durch Behandlung mit einer Säure, wie Trifluoressige-Aminosobutyryl-L-tyrosyl-L-serin, oder das Tetra- säure, Ameisensäure, einem Halogenwasserstoff wie peptid, nämlich oc-Aminoisobutyryl-L-tyrosyl-L-seryl- Fluorwasserstoff, Bromwasserstoff oder Chlorwassert-methionin, mit dem Heptapeptid oder dem Hexa- stoff, einer Halogenwasserstoffsäure, wie Fluorwasserpeptid entsprechend der Stellung 4 bis 10 oder 5 bis 10 stoffsäure, Bromwasserstoffsäure oder Chlorwasser-Vorzugsweise nach der Azidmethode umgesetzt wird, . 55 stoffsäure, oder deren Gemisch in üblicher Weise und worauf das erhaltene Decapeptid mit dem Peptid je nach der Art der Gruppe abgespalten werden, entsprechend dem Rest des Moleküls, d.h. dem Die aufdie vorstehend geschilderte Weise hergestell·
Octapeptid (Stellungen 11 bis 18) im Falle der Her- ten Corticotropinpeptide der Erfindung können nach stellung des Octadecapeptids, dem Tetradecapeptid an sich bekannten Methoden gereinigt werden, z.B. (Stellung 11 bis 24) im Falle der Herstellung des 60 durch Säulenchromatographie an lonenaustauscher-Tetracosapeptids, und dem Heptadecapeplid (Stellun- harzen, Ionenaustauschercellulose oder Ionenausgen 11 bis 27) im Falle der Herstellung des Heptacosa- tauschersephadex® oder durch Gegenstromverteilung. peptids kondensiert wird. Die anderen 1-a-Amino- Die Corticotropinpeptide der Erfindung fallen je
isobuttersäure-corticotropinpeptide können in ahn- nach den Reaktionsbedingungen in Form der freien licher Weise durch Kondensation des aminoendstän- 65 Base oder in Form von Säureadditionssalzen an. Die
digen Decapeptids mit dem entsprechenden carboxylcndständigen Rest hergestellt werden.
Das aminoendständige Decapeptid. das Tctrapeptid
Salze können auch durch Umsetzung der Peptide mit anorganischen oder organischen Säuren hergestellt werden. Beispiele für diese Säuren sind Halogcnwasscr-
itoffsäuren. z.B. Fluorwasserstoffsäure, Chlorwasserätoffsäure und Bromwasserstoffsäure, wasserfreie Halogenwasserstoffe, wie Fluorwasserstoff, Bromwasserstoff und Chlorwasserstoff, Schwefelsäure oder Phosphorsäure, Essigsäure, Ameisensäure, Propionsäure, Glykolsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Oxalsäure, Malonsäure. Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Weinsäure, Citronensäure, Benzoesäure, Methansulfonsäure, Benzolsulfonsäure oder Toluolsulfonsäure. Zur Salzbildung kann die Säure in äquimolarer Menge oder im Überschuß verwendet werden.
Die l-oc-Aminoisobuttersäure-corticotropinpeptide der Erfindung zeigen eine starke biologische Aktivität, sie stimulieren die Nebenrinde, sie haben eine lipotrope Wirkung,und sie stimulieren die Melanophoren. Die Verbindungen der Erfindung sind dem nativen Corticotropin und anderen ähnlichen Peptiden überlegen.
Die biologische Prüfung der Corticotropinpeptide der Erfindung im Vergleich zu nativem Corticotropin des Schafs (α,-ACTH) und Gly'-ACTH(1-18)-NH2 (Bull. Chem. Soc. Japan Bd. 43 [1970], S. 196) erfolgte nach fünf verschiedenen Methoden. Der Ascorbinsäureverarmungstest an der hypophysectomierten Ratte wurde nach der United States Pharmacopeia XVII, S. 147 (1965) durchgeführt. Die in vivo Aktivität der Steroidbildung durch intravenöse Verabreichung an hypophysectomierten Ratten wurde nach der Methode von Lipscomb und Nelson (Endocrinol., Bd. 71 [1962], S. 13), geringfügig modifiziert (A.Tanaka und C. H. Li, Endocrinol. Japonica Bd. 13 [1966], S. 180) bestimmt. Die In-vivo-Aktivität der Steroidbildung wurde auch an der mit Dexamethason und PentobarbitalbehandeltenMausbestimmt(A.Tanaka und N.Nakamura, »Integrative mechanism of neuroendocrine system«. Hokkaido University Medical Library Series, Bd. 1 [1968]. S. 49). Außerdem wurde die Aktivität der Bildung von Steroiden durch intramuskuläre Verabfolgung an hypophysectomierte Ratten bestimmt, wobei ein Peptidpräparat in den Oberschenkelmuskel injiziert und 30 Minuten nach der Injektion Blut aus der abdominalen Aorta entnommen wurde. Weiter wurde die Aktivität der Steroidbildung durch intravenöse Verabreichung an hypophysectomierte Ratten derart bestimmt, daß ein Peptidpräparat in die femorale Vene injiziert und 30 Minuten später Blut aus der abdominalen Aorta entnommen wurde. Für alle Versuche wurde der dritte USP Corticotropin Bezugsstandard verwendet, und die Bildung von 1 l-Hydroxycoriicosteroiden (11-OHCS) wurde fluorimetrisch nach Peterson (J. Biol. Chem. Bd. 225 [1957], S. 25) durchgeführt. Für jeden Versuch wurden mehrere Bestimmungen durchgeführt, und die erhaltenen Werte wurden nach der Methode von S h e ρ s und Moore, J. Pharmacol. Exptl. Therap. Bd. 128 (1960), S. 99 statistisch behandelt. Die Ergebnisse dieser Versuche sind in Tabelle IV zusammengestellt.
Tabelle IV
Stimulierende Wirkunu auf die Nebennieren
Methode
Verabreichungsart
Pepiid
III
GIy1-ACTH
(1 -IS)-NII.,
«,-ACTH
Ascorbinsäureverarmung
In-vivo-Steroidbildung im
s. c.
286 250
325
320
26
151
170
177
50
100
Nebennierenkanälchen i.v. 480 305 - 151 180
Dexamethasonnembutal-
blockierte Maus i.v. 757 360
peripheres Blut i.v. 590 ■ 380
* peripheres Blut i.v. 495 318
Anmerkung:
Die Aktivitäten sind ausgedrückt in USP-Einheiten/mg, bezogen auf den 3. USP Corticotropin-Bezugsstandard. 1 = I bu'-ACTH(I 18)-
NH2JI = Ibu'-Ornl5-ACTH(1-I8)-NH2, III = Ibi:1-ACTH(I 27)-OH.
Aus Tabelle IV ist ersichtlich, daß die Corticotropinpeptide der Erfindung eine sehr hohe Aktivität bei der Stimulierung der Nebennieren aufweisen. Die Aktivität ist mehr als zweimal so groß als die von Gly'-ACTH(1-18)-NH2 und natürlichem Corticotropin, bestimmt nach dem Ascorbinsäureverarmungstest und der Methode der In-vivo-Bildung von Steroiden. Außerdem ist festzustellen, daß die Aktivität von I, II und III, bestimmt durch den 11-Hydroxycorticosteroidspiegel im peripheren Blut der Ratte, unverändert ist, unabhängig davon, ob die Peptide intravenös oder intramuskulär verabfolgt werden.
Bei Gly'-ACTH(1-18)-NH2 hat jedoch das Aktivitätsverhältnis von intramuskulärer zu intravenösei Verabfolgung einen Wert von etwa 1:3. Dies bedeutet daß diel -α- Aminoisobuttersäure-corticotropinpeptidt der Erfindung gegenüber der Einwirkung von Amino peptidase im Gewebe beständiger sind als das 1 -GIycinanaloge.
Die Corticotropinpeptide der Erfindung zeiger auch eine starke lipotrope Aktivität. In Tabelle V is diese Wirkung mit der von GIy^ACTH(MS)-NH und natürlichem Schaf-Corticotropin (α,-ACTH) ver glichen.
509 622/16
Tabelle V
Versuchstier
Mindestwirkdosis. IO " mg 50 mg
Gewebe
0.062
0.47
11
0,086
0,013
Hl
0,036
0.001
GIy'-ACTH-Il IS)-NH1
6.3
0,35
.',-ACTH
Rattenfettgewebe
Kaninchenfettgewebe
Anmerkung: .
unk D:„„hv Bd 99 (1967I S. 294. an Fettgewebe der . .en epidid\mis
Die lipotrope Aktivität wurde nach Ta nak a et al.. Arch. Bjochem. Biophy. "^ ^ "'„ FeIlsäurekonzentralion sowohl im Medium und Kaninchennierenfettgewebe bestimmt. Der Parameter ist die Zunahnie der "nv««« und „, haben ^ .fl Tab
als auch im Gewebe. Die Aktivität wird ausgedrückt durch die Mindest«irkdosis pro iumfc ui. angegebene Bedeutung.
Die Prüfung der melanophoren-stimulierenden Ak- ,5 peptide der Erfindung werdenmitGIv^1-/ tivität wurde nach der Methode von K.Shizume. A.B. Lerner und T. B.Fitzpatrick, Endocrinol. Bd. 54 (1954), S. 553, mit isolierten Hautfragmenten von Rana pipiens durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle VI zusammengestellt. Die Corticotropin- 20
Tabelle VI
NH und ACTH(l-24)-OH (Synacthen") verglichen. Als Bezugsstandard wird ein reines Präparat von nativem a-melanophoren-stimulierenden Hormon (as-MSH) verwendet.
MSH-
Testverbindung Aktivität.
Einheiten g
ibu'-ACTH(l-18)-NH2 0.8- 1O10
1 bu' -Orn' 5-ACTH (1 -18)-N H 2 1,1 · 1010
Ibu'-ACTH(l-27)-OH 1.6- 109
ACTH(l-24)-OH 2.1 · 108
Gly'-ACTH(1-18)-NH2 6.7 · ά
Die melanophoren-stimulierende Aktivität der Corticotropinpeptide der Erfindung ist höher als die von Gly'-ACTH(1-18)-NH2 und ACTH(l-24)-OH.
Die biologische Halbwertszeit der Corticolropinpeptide der Erfindung und von natürlichem Corticotropin wurde mit der in vitro lipotropen Aktivität bestimmt (vgl A. Tanaka. B.T.Pickering und C. H. Li. Arch. Biochem. Biophys. Bd. 99 [1962]. S. 294). Die Ergebnisse sind in Tabelle VII zusammengestellt:
Tabelle VII
Peptid In vivo"),
i.v.
in vitro").
Plasma
inkuhicrt mil
Muskel
IbU^ACTH(I-Ie)-NH2 3.5 min 32.4 min 122.9 min
Ibu'-Orn^-ACTHd-lS^NHj 6 0 min 97.6 min 261.8 min
Ibu'-ACTH(l-27)-OH 6,5 min 79,3 min 91.2 min
ACTH 4 4 min 59.2 min 250.9 min
Gly'-ACTH(1-18)-NH, 1,9 min 30,0 min 42.6 min
Anmerkung:
") Eine Peptidprobe wurde intravenös in die Vena cava inferior von Ratten injiziert, und Blutproben, die aus der abdominalen Aorta ir bestimmten Zeitabstänäen entnommen wurden, wurden angesäuert und aiii die in vitro lipotrope Aktivität untersucht.
h) Eine Probe wurde in frischem Plasma von anesthetisicrlen Ratten oder in Krebs-Ringer-Bicarbonalpulter gelost. Rattenoberschenkelmuskcl, Rinderserumalbumin und Glucose enthielt. Diese Gemische wurden bei 37 C in Zeitabständen entnommene Proben wurden auf die in vitro lipolrope Aktivität untersucht.
der Schnitte vor inkubiert, und aus dem Gcmiscr
Aus der Tabelle ist ersichtlich, daß die Halbwertszeit der l-a-Aminoisobuttersäure-corticotropinpeptide nahezu die gleiche ist wie die von natürlichem Cor'icotropin und wesentlich langer ist als die von GIy1-ACTH(I-IS)-NH2. Dies zeigt, daß die aminoendständige Substitution durch a-Aminoisobuttersüurc im Corticotropin die Wirkungsverlängerung und Aktivitätssteigerung erheblich verbessert.
Die l-a-Aminoisobuttersäure-corticotropinpepiide der Erfindung können in Komplexe mit komplexbildenden Schwermetallverbindungen. z.B. Zink-. Kupfer-, Eisen-, Nickel- oder Kobaltverbindungcn. komplexbildenden Polyaminosäuren, wie Polyglut-
aminsäure, Polyasparaginsäure, Copoly-glutamyltyrosin oder Copoly-asparagyl-glutaminsäure, odei mit deren Gemischen umgewandelt werden. Di< Komplexe zeigen gegenüber dem normalen Peptic eine ausgezeichnete lange Wirkung. Die Schwer metallkomplexe können durch Umsetzung des Corti cotropinpeptids mit einer Schwermetallverbindung z.B. einem Schwermetallhalogenid. wie Zinkchlorid Kupferchlorid. Eisenchlorid. Kobaltchlorid oder Nik kelchlorid. einem Acetat, wie Zinkacetat, einem Sulfat wie Zinksulfat, oder einem Hydroxid, wie Zinkhydro xid. im Gewichtsverhältnis 1:0.1 bis 100 unte schwach sauren Bedingungen, vorzugsweise bei pH 6,!
fcis 7.0, >n üblicher Weise hergestellt werden. Das ievorzugte Schwermetall ist Zink. Der Polyaminoeiurekompiex kann durch Umsetzen der Corticotro-•inpeptide der Erfindung mit einer Polyaminosäure |p einem Gewichtsverhältnis von 1:0,l bis 100 unter gehwach sauren Bedingungen, vorzugsweise bei pH 6,5 fcis 7,0, in üblicher Weise hergestellt werden. Die polyaminosäuren können Homopolymerisate oder Copolymerisate von Aminosäuren sein, und sie können die l-, d- oder DL-Konfiguration besitzen. Peispiele für bevorzugte Polyaminosäuren sind PoIy-1,-glutaminsäure, Poly-D-glutaminsäure, Poly-DL-glut- »minsäure, Poly-L-asparaginsäure, Poly-D-asparaginläure, Poly-DL-asparaginsäure, Copoly-L-glutamyll-tyrosin und Copoly-L-asparagyl-L-glutaminsäure. Die Polyaminosäure hat vorzugsweise ein Molekulargewicht von 1000 bis 100000, insbesondere 2000 bis 6000. Vorzugsweise wird eine Polyaminoläure verwendet, die vorher mit einer Base, z. B. Nairiumhydroxid, neutralisiert wurde. Zur Herstellung des Komplexes können noch andere geeignete Zufätze verwendet werden, wie Konservierungsmittel. r.B. Benzylalkohol, Phenol oder Thimerosal, Puffer! z.B. Citrat-, Phosphat- oder Carbonatpuffer. oder Isotonisierungsmittel, wie Natriumchlorid.
Die vorstehend angegebenen Versuchsergehnisse sind lediglich Beispiele. Da die anderen Verbindungen der Erfindung ebenso wie die vorstehend beschriebenen Verbindungen nahezu die gleichen Eigenschaften, and Vorteile als Arzneistoffe aufweisen, sind die 1-a-Aminoisobuttersäure-corticotropinpeptide der Erfindung wertvolle Arzneistoffe. die z.B. zur Behandlung von akutem und chronischem Gelenkrheumatismus, Allergosen oder Nebennierenrindenerkrankungen bei Menschen und Tieren eingesetzt werden können.
Die Corticotropinpeptide der Erfindung, ihre Säureadditionssalze und Komplexe können oral oder parenteral in üblichen Verabreichungsformen. z.B. als Injektionspräparate, Flüssigkeiten, Suspensionen. Emulsionen oder Aerosolen, gegebenenfalls zusammen mit üblichen Trägerstoffen, Stabilisatoren. Emulgatoren, Konservierungsmitteln, Puffern, Isotonisiermitteln und bzw. oder Befeuchtungsmitteln, verabfolgt werden. Typische Verabreichungsdosen betragen etwa 0,2 U/kg bis 0,8 U/kg für einen Erwachsenen. Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1
(a) Benzyloxycarbonyl-a-aminoisobuttersäure
Eine Lösung von 5,16 g a-Aminoisobutlcrsäure und 5,30g wasserfreiem Natriumcarbonat in 50 ml 1 n-Natronlauge wird bei 00C mit 9,39 g Chlorameisensäurebenzylester versetzt, und das Gemisch wird 3 Stunden gerührt. Danach wird das Reaklionsgemisch mit Äther extrahiert, um überschüssiges Reagenz abzutrennen, mit 6 η-Salzsäure angesäuert und in Äthylacetat extrahiert. Der Äthylacetatextrakt wird über Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Der kristalline Rückstand wird aus einer Mischung von Äthylacetat und Petrolather ■mkristallisiert. Ausbeute 8.75 g vom F. 65 bis •6° C.
(b) tert.-Butyloxycarbonyl-u-aminoisobuttersüure
Eine Lösung von 4.75 g a-Aminoisobuttcrsäurc und 4,25 g Natriumbicarbonat in 46 ml 1 n-Natronlauge
und 30 ml Dioxan wird tropfenweise mit einer Dioxanlösung von 7,25 g Azidoameisensäure-tert.-butylester versetzt und 5 Tage bei 40 bis 500C gerührt. Hierauf werden nochmals 6,6 g Azidoameisensäure-tert.-butylesier und 46 ml 1 η-Natronlauge zugegeben, und das Gemisch wird 2 Tage bei der gleichen Temperatur gerührt. Danach wird das Reaktionsgemisch unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird abgekühlt und mit eiskalter 4 η-Salzsäure auf pH 3
ίο angesäuert. Die Lösung wird mit Äthylacetat extrahiert, der Extrakt.über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Nach Umkristallisation aus Äther werden 0.82 g Produkt vom F. 119 bis 1200C erhalten.
•5 (c) tert.-Butyloxycarbonyl-O-benzyl-L-tyrosinp-nitrophenylester
Eine Lösung von 2.97 g tert.-Butyloxycarbonyl-O-benzyl-L-tyrosin und 1.12g p-Nitrophenol in Äthyl-
acetat wird bei 0° C mit einer Äthylacetatlösung von 1,65 g N.N'-Dicyclohexylcarbodiimid versetzt und 3 Stunden bei 4°C stehengelassen. Der Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert und das Filtrat unter vermindertem Druck eingedampft. Der feste Rückstand wird
in heißem Äthanol aufgenommen, und die sich beim Abkühlen abscheidenden Kristalle werden abfiltriert, mit kaltem Äthanol gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Ausbeute 3.39 g vom F. 140 bis 141' C. [a.]j} 2 - 0.3 ± 0.4c (c = 0.983, Äthylacetat).
(d) Benzyloxycarbonyl-u-aminoisobutyryl-L-tyrosin-hydrazid
1,54 g Benzyloxycarbonyl-a-aminoisobuttersäure und 1,27 g L-Tyrosinmethylester werden in Acetonitril gelöst und bei 00C mit einer Acetonitrillösung von 1,34 g Ν,Ν'-Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Das Gemisch wi rd 16 bis 18 Stunden bei 4° C stehengelassen, danach wird der ausgeschiedene Dicyclohexylharnstoff abfiltriert und das Filtrat unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird in Äthylacetat aufgenommen, die Äthylacetatlösung mit 1 n-Salzsäure und 5prozentiger Natriumbicarbonatlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Man erhält den Dipeptidester als sirupösen Rückstand. Der Rückstand wird in 15 ml Äthanol gelöst und mit 0,8 ml Hydrazinhydrat versetzt. Nach 2tägigem Stehen bei Raumtemperatur wird das Reaktionsgemisch mit Wasser versetzt. Hierbei scheidet sich das Dipeptidhydra7id kristallin aus. Ausbeute 2,35 g. Nach Umkristallisation aus wässrigem Äthanol schmilzt das Produkt bei 164 bis 1651C. [ocß7 -31,4 ±0,7° (0 = 1.078. Methanol).
(e) terl.-Butyloxycarbonyl-O-benzyl-L-tyrosyl-L-serin-methylester
Eine eiskalte Lösung von 1.03 g L-Serinmethylcsterhydrochlorid in 8 ml Dimethylformamid wird mit 0.92 ml Triäthylamin versetzt. Das ausgeschiedene Tiiäthylamin-hydrochlorid wird abfiltriert. Das Filtrat wird mit 2.96 g tert.-Butyloxycarbonyl-O-benzyll.-lyrosin-p-nitrophenylester mit etwas Dimethylformamid versetzt und das Gemisch 2 Tage bei 4° C stehengelassen. Danach wird das Lösungsmittel unter vermindertem Druck bei einer Badtemperatur von 45 bis 50 C abdestilliert, der Rückstand in Äthyl-
acetat gelöst und die Lösung nacheinander mit eiskalter 1 η-Salzsäure, Wasser, 2 n-Ammoniaklösung und Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Die erhaltene gelatinöse Masse wird mit einer Mischung von Äthylacetat und Petroläther ausgefällt. Nach nochmaliger Ausfällung mit wäßrigem Methanol werden 2,?5 g reines Dipeptid vom F. 73 bis 77° C erhalten. [α]2,2+ 7,7 ±0,5° (c = 1,046, Methanol).
IO
(0 Benzyloxycarbonyl-a-aminoisobutyryl-O-benzyl-L-tyrosyl-L-serin-hydrazid
2,08 g tert.-Butyloxycarbonyl-O-benzyl-L-tyrosyl-L-serinmethylester werden in 20 ml einer 1 n-Chlor-Wasserstofflösung in Essigsäure gelöst und 30 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Nach dem Abdampfen des Lösungsmittels hinterbleibt ein öliger Rückstand, der nacb Behandlung mit Äther kristallisiert. Die Kristalle werden abfiltriert und in einer Mischung aus 6 ml Wasser und 20 ml Dichlormethan gelöst. Die Lösung wird mit 6 ml eiskalter 50prozentiger Kaliumcarbonatlösung versetzt, gründlich gemischt und die organische Lösung abgetrennt. Die organische Lösung wird über Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft.
Der erhaltene kristalline O-Benzyl-L-tyrosyl-L-serinmethylester wird in Acetonitril zusammen mit 1,04 g Benzyloxycarbonyl-a-aminoisobuttersäure gelöst. Die Lösung wird mit einer Acetonitrillösung von 0,91 g Dicyclohexylcarbodiimid bei 00C versetzt und 16 bis 18 Stunden bei 4°C stehengelassen. Der ausgeschiedene Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert und das Filtrat unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird in Äthylacetat gelöst und die Lösung nacheinander mit 1 η-Salzsäure, Wasser und 5prozentiger Natriumbicarbonatlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Der erhaltene rohe Tripeptidester zeigt im Dünnschichtchromatogramm (in Äthylacetat) die Gegenwart einer geringen Menge einer weiteren Komponente. Der rohe Ester wird in 20 ml Äthanol gelöst und mit 1,0 ml Hydrazinhydrat versetzt. Das Reaktionsgemisch wird 2 Tage bei Raumtemperatur . stehengelassen und hierauf unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird in Äthylacetat gelöst, mit Wasser gewaschen und rasch über Natriumsulfat getrocknet. Die sich beim Stehen abscheidende Fällung wird abfiltriert, mit kaltem Äthylacetat und Äther gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Ausbeute 1,91 g Hydrazid. Nach nochmaliger Umfällung aus Äthanol schmilzt die reine Verbindung bei 151 bis 153° C. [oc]2,2 - 2,2 + 0,4° (c = 1,062, Essigsäure).
(g) tert.-Butyloxycarbonyl-y-benzyl-L-glutaminsäure-p-nitrophenylester
55
9,0 g tert.-Butyloxycarbonyl-y-benzyl-L-glutaminsäure-dicyclohexylaminsalz werden mit Dowex 5OW-8 (H +-Form, feuchtes Volumen 18 ml) in 60prozentigem Äthanol 30 Minuten geschüttelt. Sodann wird das Harz abfiltriert, das Filtrat unter vermindertem Druck eingedampft und der Rückstand in Äther gelöst. Die Lösung wird über Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Man erhält quantitativ die freie Säure. Die Säure wird in Äthylacetat zusammen mit 2.4 g p-Nitroohenol gelöst, und die Lösung bei 0 C mit 3,6 g Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Das Reaktionsgem.sch wird 16 bis 18 Stunden stehengelassen, danach vom ausgeschiedenen Dicyclohecylharnstoff abnltnert. das Filtrat unter vermindertem Druck eingedampft und der Rückstand aus Äthanol umkristalhsiert. Nach nochmaliger Umkristallisation aus Äthanol werden ; Og Ester in reiner Form vom F. 118 bis 119' C erhalten [a]58-33,l +0,7* (c = l,082, Methanol).
(h) tert -Butyloxycarbonyl-y-benzyl-L-glutamyl-
L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-
glycin
Eine Lösung von 1,20 g L-Histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin-acetat in 10 ml Dimethylformamid wird mit 1,03 g tert.-Butyloxycarbonyl-7-benzyl-L-glutaminsäure-p-nitro-phenylester und 25 ml Dimethylformamid versetzt und 3 Tage bei 40C stehengelassen. Die erhaltene Lösung wird tropfenweise in 200 ml eines Gemisches gleicher Volumteile Äthylacetat und Äther gegeben. Die ausgeschiedene Fällung wird abfiltriert, mit Athylacetat und Äther gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Ausbeute 1,86 g. Die Fällung wird in etwa 10 ml 50prozentiger Essigsäure gelöst und mit etwa 100 ml Äthanol versetzt. Die ausgeschiedene Fällung wird abfiltriert und aus Essigsäure lyophilisiert. Ausbeute 1,37 g Produkt, [α]22-23,9 ±0,6° (c= 1.020. 50prozentige Essigsäure).
Das Ausgangs-Pentapeptid, d.h. L-Histidyl-L-pnenvlalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin, kann nach Bull. Chem. Soc. Japan, Bd. 38(1965), S. 1148 oder der japanischen Patentanmeldung Nr. 17117/1969 oder nach folgender Methode hergestellt werden:
tert.-Buiyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-NG-tosyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycinmethylester
5,9 g tert.-Butyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-NG-tosyl-L-argininhydrazid (hergestellt nach Bull. Chem. Soc. Japan, Bd. 37 [1964], S. 1465) wird mit Natriumnitrit behandelt. Das ausgeschiedene Azid wird mit L-Tryptophyl-glycinmethylester in Athylacetat umgesetzt. Der L-Tryyptophyl-glycinmethylester wird durch katalytische Hydrierung von 4,1 g Benzyloxycarbonvl-L-tryptophyl-glycinmethylester erhalten. Ausbeute 5;3gvomF. 115bisl20°C.[a]27 - 14,8 ± 0,3"(c = 2,077. Methanol).
Benzyloxycarbonyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-N°-tosyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycinmethylester
5,0 g des oben erhaltenen Tetrapeptidmethylesters werden 4 Stunden bei Raumtemperatur mit Ameisensäure umgesetzt. Der erhaltene Tetrapeptidester wird mit Benzyloxycarbonyl-L-histidinazid (hergestellt aus 2,7 g des entsprechenden Hydrazide) kondensiert. Nach beendeter Umsetzung wird das Produkt aus Äthanol umkristallisiert. Ausbeute 3,9 g vom F. 188 bis 190° C. [α]2,7 -23,4 ±0.6° (r= 1,037, Dimethylformamid).
Benzyloxycarbonyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-NG-tosyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin
2,2 g des oben erhaltenen Pentapeptidesters werden 30 Minuten in wäßrigem Methanol mil 2 Moläqui-
valenten Natriumhydroxid verseift. Nach beendeter Umsetzung wird das Produkt aus wäßrigem Methanol umkristallisiert. Ausbeute 1,6 g vom F. 175 bis 178°C. [aß7 - 21,4 + 0,6° (f = 1,066, Dimethylformamid).
L-Histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryplophylglycin
1,23 g des oben erhaltenen Pentapeptids werden mit Fluorwasserstoff in Gegenwart von 1,3 ml Anisol 30 Minuten bei 00C umgesetzt. Das von der Schutzgruppe befreite Pentapeptidhydrofluorid wird auf eine Austauschersäure mit Amberlite CG-400® (Acetat-Form) gegeben und in das entsprechende Acetat umgewandelt. Das Acetat wird auf eine Austauschersäule mit Carboxymethylcellulose gegeben und mit einem Ammoniumacetatpuffer mit einem linearen Konzentrationsgradienten von 0,01 bis 0,1 Mol eluiert. Ausbeute 0,76 g; [aß7 -10,5 + 1,0° (c = 1,043, 1 n-Salzsäure).
Aminosäurenverhältnis nach Abbau mit Leucinaminopeptidase: Histidin 1,00, Phenylalanin 1,00, Arginin 1,02, Tryptophan 1,00, Glycin 1,07.
(i) tert.-Butyloxycarbonyl-L-methioninp-nitrophenylester
10,8 g tert.-Butyloxycarbonyl-L-methionin-dicyclohexylaminsalzwerdenmitDowex50W ■ δ*8 (H + -F)OHn) gemäß Beispiel 1 (g) behandelt. Die erhaltene ölige Säure und 3,5 g p-Nitrophenol werden in Äthylacetat gelöst, und die Lösung wird mit einer Äthylacetatlösung von 5,2 g Dicyclohexylcarbodiimid bei 00C versetzt. Das Gemisch wird 16 bis 18 Stunden bei 4°C stehengelassen, der ausgeschiedene Dicyclohexylharnstoff abnitriert und das Filtrat unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird aus Äthanol umkristallisiert. Ausbeute 7,8 g vom F. % bis 97° C. [aß7 -48,3 ± 0.9° (c = 1,020, Methanol).
(j) tert.-Butyloxycarbonyl-L-methionyl-y-benzyl-
L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-
L-tryptophyl-glycin
1,26 g tert.-Butyloxycarbonyl-y-benzyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin werden im 6 ml Trifluoressigsäure gelöst und 30 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Danach wird das Reaktionsgemisch in einem Eisbad abgekühlt und mit Äther versetzt. Hierbei fallen 1,34 g des partiell entblockierten Hexapeptids aus. Die Kristalle werden in 10 ml Dimethylformamid gelöst, und die Lösung wird mit 0,46 ml Triäthylamin sowie 0,74 g tert.-Butyloxycarbonyl-L-methionin-p-nitrophenylester versetzt. Das Gemisch wird 24 Stunden bei 4° C stehengelassen und anschließend in 250 ml eines eiskalten Gemisches von Äthylacetat und Diäthyläther (1:4) eingegossen. Die erhaltene Fällung wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Ausbeute 1,56 g. Das Produktwird in 15 ml Äthanol suspendiert und die Suspension zum Sieden erhitzt. Nach dem Abkühlen werden die ausgeschiedenen Kristalle abfiltriert, mit kaltem Äthanol und Äther gewaschen und aus Essigsäure lyophilisiert. Ausbeute 1,16 g. [aß2 - 18,5 ± 0,5° (( = 1,072, Dimethylformamid).
(k) Benzyloxycarbonyl-u-aminoisobutyryl-
O-benzyl-L-tyrosyl-i.-seryl-L-methionyl-y-benzyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-
L-tryplophyl-glycin 5
Ein Gemisch aus 0,47 g Benzyloxycarbonyl-aaminoisobutyryl-O-benzyl-L-tyrosyl-L-serinhydrazid, 2 ml 1 η-Salzsäure und 2 ml Dimethylformamid wird in einem Eisbad abgekühlt und. tropfenweise mit 0,44 ml einer eiskalten 2 molaren Natriumnitritlösung versetzt. Das Gemisch wird 4 Minuten bei 0° C gerührt und anschließend mit eiskaltem Äthylacetat extrahiert. Der Äthylacetat wird mit eiskalter Natriumbicarbonatlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Die erhaltene Lösung wird mit einer Lösung von L-Methionyl-y-benzyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin-trifluoracetat (hergestellt in quantitativer Ausbeute aus 0,4 mMol Produkt [j] durch Behandlung mit 3 ml Trifluoressigsäure) und 0,25 ml Triäthylamin in 10 ml Dimethylformamid versetzt. Das Gemisch wird unter vermindertem Druck bei einer Badtemperatur von 200C eingedampft, bis eine klare Lösung erhalten wird. Sodann wird die Lösung 24 Stunden bei 4° C stehengelassen. Hierauf wird der größte Teil des Lösungsmittels unter vermindertem Druck bei einer Badtemperatur von 45° C abdestilliert. Der Rückstand wird mit Äther versetzt. Hierbei scheidet sich eine Fällung aus. Ausbeute 0,67 g. Die Fällung wird aus
einem Gemisch von Wasser, Methanol und Äthanol umgefällt. Ausbeute 0,62 g rohes Peptid. Das Peptid wird auf eine Chromatographiersäule mit Silikagel (M erck, 0,05 bisO,2mm, 150g)gegeben und mit einem Lösungsmittelgemisch aus n-Butanol, Essigsäure und Wasser (4:1:1) eluiert. Es werden Fraktionen von jeweils 5 ml aufgefangen. Das Produkt wird durch Messung der Absorption bei 280 nm oder durch Dünnschichtchromatographie im vorgenannten Lö-
. sungsmittelgemisch aus n-Butanol, Essigsäure und Wasser diagnostiziert. Die Fraktionen 66 bis 90, die das Decapeptid enthalten, werden vereinigt und unter vermindertem Druck eingedampft. Der gelatinöse Rückstand wird aus Essigsäure lyophilisiert. Ausbeute 0,51 g. Das Produkt gibt bei der Dünnschichtchromatographie an Silikagel einen einzigen Fleck (Rf= 0,44. Butanol-Essigsäure-Wasser4:1:2). Der optische Drehwert des Hydrochlorids [aß2 beträgt -24,7 ±1,2" (r = 0,534, Dimethylformamid).
(1) a-Aminoisobutyryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-
L-arginyl-L-tryptophylglycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-arginyl-L-argininamid
Eine Lösung von 0,32 g Benzyloxycarbonyl-o-amino isobutyryl-O-benzyl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-ybenzyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin in Essigsäure wird mit 0,4 mi 1 η-Chlorwasserstoff in Essigsäure versetzt und sofort lyophilisiert. Das lyophilisierte Produkt wird übei Natriumhydroxidplätzchen unter verminderten" Druck getrocknet. Das erhaltene Decapeptid-hydro chlorid wird in 3 ml Dimethylformamid zusammer mit 0,083 g N-Hydroxysuccinimid gelöst. Die Lösunj wird mit einer Lösung von 0,15 g Dicyclohexylcarbo diimid in 2 ml Dimethylformamid versetzt und K bis 18 Stunden bei 4° C stehengelassen. Der ausge schiedene Dicyclotiexylharnstoff wird abfiltrierl unc
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das Filtrat in ein eiskaltes Gemisch aus 50 ml Äthylacetat und 50 ml Diäthyläther gegeben. Die erhaltene Fällung wird abfiltriert, mit Äthylacetat und Äther gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Es werden 0,36 g des aktiven Decapeptideslers erhalten.
Das Triacetat von N'-tert.-Butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-NMert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-N'-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginin-amid (hergestellt in quantitativer Ausbeute aus 0,12 mMol des entsprechenden N"-Benzyloxycarbonylderivats durch katalytische Hydrierung nach Bull. Chem Soc. Japan, Bd. 39 [1966], S. 882) wird in 2 ml Dimethylformamid gelöst und mit 0,18 ml Triäthylamin versetzt. Die Lösung wird mit einer Dimethylformamidlösung des obengenannten aktiven Esters versetzt, und das Gemisch (Gesamtvolumen 4 ml) wird 48 Stunden bei 4" C stehengelassen. Sodann wird das Gemisch in 100 ml eiskaltes Äthylacelat eingegossen, die ausgeschiedene Fällung abfiltriert, mit Äthylacetat und Diäthyläther gewaschen, aus Essigsäure lyophilisiert und unter vermindertem Druck über Natriumhydroxidplätzchen getrocknet. Ausbeute 0,56 g des geschützten Octadecapeptids.
Das erhaltene geschützte Octadecapeptid wird in einen Reaktionsbehälter aus fluoriertem Polyäthylen gegeben, mit 0,1 g L-Methionin und 0,5 ml Anisol versetzt und in einem Trockeneis-Acetonbad mit Fluorwasserstoff versetzt. Das Reaktionsgemisch (etwa 10 ml) wird 90 Minuten bei 00C gerührt und sodann unter vermindertem Druck eingedampft. Der sirupöse Rückstand wird in eiskaltem Wasser gelöst, die Lösung mit Äthylacetat gewaschen und anschließend auf eine Austauschersäule (1,7 χ 12 cm) mit AmberliteCG-400* (Acetat-Form) gegeben. Die Säule wird mit Wasser eluiert. Das Eluat wird unter vermindertem Druck auf etwa 20 ml eingedampft und lyophilisiert. Ausbeute 0.65 g rohes entblockiertes Peptid. Zur Reinigung wird das Produkt auf eine Säule (2,7 χ 27 cm) mit Carboxymethylcellulose (Serva Co.. 0.56 mÄq/g) gegeben und mit einem Ammoniumacetatpuffer (pH 6,8. 2000 ml) mit einem linearen Konzentrationsgradienlen von 0.02 bis 0,6 Mol eluiert. Fraktionen von jeweils 10 ml/ Röhrchen werden aufgefangen, und die Absorption wird bei 280 nm bestimmt. Die Fraktionen mit dem Hauptmaximum (Nr. 156 bis 180) und der Schulter (Nr. 181 bis 200) werden aufgefangen, und die Hauptmenge des Lösungsmittels wird unter vermindertem Druck bei einer Badtemperatur von 50 bis 55 C abdestilliert. Die Rückstände werden bis zur Gewichtskonstanz lyophilisiert. Ausbeute 189 mg (F-I) und 76 mg (F-II) farblose Pulver. F-I (189 mg) wird an einer Kolonne (2,2 χ 25 cm) mit Carboxymethylcellulose auf die vorstehend beschriebene Weise nochmals chromatographiert. Es werden 137 mg reines Peptid F-I-I mit einem einzigen Absorptionsmaximum erhalten. Eine kleine Schulter des Absorptionsmaximums liefert 37 mg der Fraktion F-I-2. Die Fraktionen F-II (76 mg) und F-I-2 (37 mg) werden vereinigt, und die Chromatographie wird zweimal wiederholt. Es werden 29 mg des gewünschten Peptids erhalten. Die Gesamlausbeute an Octadecapeptid beträgt 166 mg. [aß3- 58,4 ±1,9" (c = 0,514. 0,1 n-Essigsäure). ;£'"HC1 279 nm (Ej^ = 25.1). 4^' 288 nm (£ *'« = 19,7),λ1'/-Ν"οΙί281 nm(£|:t = 25,2),288 nm (E\JS, = 24,4). Das Peptid verhält sich bei der Dünnschichtchromatographic (Lösungsmittel in n-Butanol-Essigsäure-Pyridin-Wasscr 30:6:20:24) und bei der Papierelektrophorese (600 Volt 36 cm. in 2 n-Essigsäure) einheitlich gegenüber Ninhydrin-. Pauly-. Ehrlich-, Sakaguchi- und Methionin (PtJh") Reagenz. Das Aminosäureverhällnis des sauren Hydrolysais (6 n-HCl, 105"C. 40 Stunden) beträgt: Serin 0,83. Glutaminsäure 1,00. Prolin 1.07.Glycin2,10.a-Aminoisobuüersäure 0.99. Valin 1,00. Methionin 1.02. Tyrosin 0,97. Phenylalanin 1.04. Lysin 3.17. Histidin 0.92. Arginin 2.90. Das Tryptophan :Tyrosin-Verhältnis im intakten Octadecapeptid beträgt spektrophotometrisch 1.12:1.
Bei Verwendung von NMert.-Butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-N'-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-N'-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginin (hergestellt gemäß Bull. Chem. Soc. Japan, Bd. 39 [1966], S. 882) als carboxylendständiges Octapeptid bei der vorstehenden Reaktion wird in ähnlicher Weise das oc-Arninoisobutyryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutamyl-L-hislidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginin erhalten.
Beispiel 2
(a) Na-Benzyloxycarbonyl-N'-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-
N'-tert.-butyloxycarbonyl-L-ornithinmethylester
1,2 N'*-Benzyloxycarbonyl-N0-tert.-butyloxycarbonyl-L-ornithinmethylester (F. 69 bis 700C, [a]£8-10,6±0,5r [r= 1.092. Methanol]) wird 2 Stunden an einem Palladiumschwarz-Katalysator in Methanol, das 10°o Essigsäure enthält, hydriert. Nach dem Eindampfen unter vermindertem Druck hinterbleibt N'-tert.-Butyloxycarbonyl-L-ornithinmethylester-acetat als sirupöser Rückstand, der mit 50prozentiger wäßriger Kaliumcarbonatlösung in Dichlormethan bei 0° C behandelt wird. Die organische Lösung wird über Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck bei einer Badtemperatur von 20"C eingedampft. Der Rückstand wird in 10 ml Dichlormethan gelöst und die Lösung mit 1.83 g N "-Benzyloxycarbonyl-NMert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycin versetzt, das gemäß Bull. Chem. Soc. Japan, Bd. 37. (1964). S. 1471. hergestellt worden war. Die Lösung wird mit einer Lösung von 0.60 g Dicyclohexylcarbodiimid in Dichlormethan bei 0 C versetzt und 2 Tage bei 4 C stehengelassen. Nach dem Abfiltrieren des ausgeschiedenen Dicyclohexylharnstoffs wird das Filtrat unter vermindertem Druck eingedampft. Der sirupöse Rückstand wird in Äthylacetat gelöst, mit eiskalter 1 η-Salzsäure und 1 m-Natriumbicarbonatlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird erneut in 30 ml Äthylacetat aufgenommen und mit 30 ml Äther versetzt. Man erhält den Pentapeptidmethylester in reiner Form. Ausbeute 2,24 g; [aß6-55.9±0.9° (r= 1.062. Methanol).
(b) N'-Benzyloxycarbonyl-N'-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyR-prolyl-i.-valyl-glycyl-
N*-tert.-butyloxycarbonyl-L-ornithinhydrazid
2.2 g des oben erhaltenen Pentapeptidmethylcstcrs werden in 30 ml Methanol gelöst und mit 0.26 ml Hydrazin-hydrat versetzt. Das Reaktionsgemisch wird 3 Tage bei Raumtemperatur stehengelassen und da-
nach das Hydrazid durch Zugabe von Wasser ausgefällt. Die Fällung wird abfiltriert und das wäßrige Methanol umkristallisiert. Ausbeute 2,1 g. F. 175 bis 1800C. [aß5-35,8 ±0,7" (t = 1,040, Dimethylformamid).
(c) N*-Benzyloxycarbonyl-Nf-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-N^tert.-butyloxycarbonyl-L-ornithyl-NMert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-arginyl-L-argininamiddiacetat
Eine eiskalte Lösung von 0,95 g des oben erhaltenen Pentapeptidhydrazids in 10 ml 90prozentigem Tetrahydrofuran wird mit 2,75 ml eiskalter 1 n-Salzsäure und 0,61 ml 2 molarer Natriumnitritlösung versetzt. Das Gemisch wird 5 Minuten bei O0C stehengelassen und sodann mit 0,38 ml Triäthylamin auf pH 7,4 bis 7,6 eingestellt. Danach wird die Lösung mit einer eiskalten Lösung von Nc-tert.-Buty!oxycarbony!-L-Iysyl-L-arginyl-L-argininamid-triacetat (hergestellt aus 0,92 mMol N'-Benzyloxycarbonyl-NMert.-butyloxycarbonyl-L-rysyl-N^nitro-L-arginyl-N^nitro-L-argininamid durch katalytische Hydrierung gemäß Bull. Chem. Soc. Japan, Bd. 39 [1966], S. 882) und 0.42 ml Triäthylaminin7,5ml80prozentigemTetrahydrofuran gegeben. Das Gemisch wird 3 Tage bei 4° C stehengelassen und sodann unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird mit 10 ml Äthylacetat und 10 ml 1 η-Essigsäure versetzt und gründlich durchgeschüttelt. Die wäßrige Phase wird dreimal mit Äthylacetat extrahiert, die vereinigten Äthylacetatextrakte werden unter vermindertem Druck auf etwa 10 ml eingedampft, und das Konzentrat wird mit 1 n-Essigsäure versetzt und gründlich durchgeschüttelt. Das Konzentrat wird mit wassergesättigtem n-Butanol gründlich extrahiert. Der Extrakt wird über Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird aus Essigsäure lyophilisiert. Ausbeute 0,85 g. [aß2 -43,1 ± 1,5° (r= 0,540. 50prozentige Essigsäure).
(d) a-Aminoisobutyryl-L-tyrosyl-i.-servl-
L-methionyl-L-glutamyl-L-histidyl-i.-phenylalanyl-
i-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-i.-proIyl-
i.-valyl-glycyl-L-ornithyl-L-lysyl-i.-arginyl-
i.-argininamid
0.32 g des im Beispiel 1 (k) erhaltenen Decapeptidderivats werden in üblicher Weise in den entsprechenden N-Hydroxysuccinimidester umgewandelt. 0,32 g des erhaltenen aktiven Esters werden dann zu einer Lösung eines Octapeptids (hergestellt aus 0,19 g des im Beispiel 2 (c) erhaltenen Octapeptidderivats durch katalytische Hydrierung) 0,18 ml Triäthylamin in 4 ml Dimethylformamid gegeben. Das Reaktionsgemisch wird 64 Stunden bei 4°C stehengelassen und sodann in 100 ml eiskaltes Äthylacetat eingetropft. Die gebildete Fällung wird abfiltriert, mit Äthylacetat und Äther gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Ausbeute 0,49 g rohes geschütztes Octadecapeptid.
0,29 g des erhaltenen Rohproduktes werden in 5 bis 6 ml flüssigem Fluorwasserstoff zusammen mit 0,06 g Methionin und 0,29 ml Anisol bei der Temperatur des Gemisches aus Trockeneis und Aceton gelöst. Das Gemisch wird 90 Minuten bei 00C gerührt, danach wird der Fluorwasserstoff unter vermindertem Druck abgedampft. Der Rückstand wird in eiskaltem Wasser gelöst und die Lösung zweimal mit Äthylacetat gewaschen. Die erhaltene wäßrige Lösung wird auf eine Austauschersäule(l,7 χ 20cm) von AmberliteCG-400® (Acetat-Form) gegeben, und die Säule wird mit Wasser eluiert. Das Eluat wird vereinigt, unter vermindertem Druck eingedampft und lyophilisiert. Man erhält 0.34 g des entblockierten Octadecapeptids.
0,34 g des rohen Octadecapeptids werden an einer Chromatographiersäule (1,7 χ 36 cm) mit Carboxymethylcellulose (Serva, 0,56 mÄq/g) mit einem Ammoniumacetatpuffer (pH 6,8) mit einem linearen Konzentrationsgradienten von 0,02 bis 0,6 Mol (1500 ml) chromatographiert. Es werden Fraktionen von 7.5 ml/Röhrchen aufgefangen, und es wird die Absorption bei 280 nm aufgenommen. Die Röhrchen entsprechend dem Hauptmaximum werden in zwei gesonderten Fraktionen F-I (Röhrchen 106 bis 130) und F-II (Röhrchen 131 bis 155) vereinigt. Die Hauptmenge des Lösungsmittels wird unter vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand wiederholt bis zur Gewichtskonstanz lyophilisiert. Die Ausbeute an Fraktion F-I beträgt 76 mg und an F-II 84 mg. Die 84 mg der Fraktion F-II werden erneut an einer Carboxymethylcellulosesäule auf die vorstehend beschriebene Weise chromatographiert. Es werden 30 mg der Fraktion F-II-I erhalten. Die Fraktionen F-I und F-II-I werden vereinigt. Man erhält 106 mg teilweise gereinigtes Octadecapeptid. Zur weiteren Reinigung eines 65 mg Anteils wird dieses Produkt erneut an einer Säule(l,7 χ 30 cm) mit Carboxymethylcellulose (Whatman CM-52) mit einem Ammoniumacetatpuffer (pH 6,9) mit einem linearen Konzentrationsgradienten 0,02 bis 0,6 Mol (1500 ml) chromatographiert. Diejenigen Röhrchen, die einem einzigen Maximum entsprechen, werden vereinigt, eingedampft und lyophilisiert. Man erhält das reine Octadecapeptid. d.h. a-Aminoisobutyryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-argmyl-L-tryptophylglycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-ornithyl-L-Iysyl-L-arginyl-L-argininamid-acetat. Ausbeute 52 mg [aß5-57.3 ±1.9 (r = 0.499. 0.1 n-Essigsäure) ^Jf-HCi= 279 nm {Ε\%, 24.0). ^'„ΊίΓ = 288 nm (£]*£ 17.8); A^1/-1*10"= 281 nm (fjl 24.6). 288 nm (E[Jz1 23.8). Das Aminosäureverhältnis im saurer Hydrolysat (6 η-Salzsäure. 1050C. 40 Stunden) hai folgenden Wert: Serin 0.80. Glutaminsäure 0.99. Prolin 1.04, Glycin 2.03. a-Aminoisobuttersäure 0.95, Valin 1,00, Methionin 1,03. Tyrosin 1.04, Phenylalanin 1.05. Ornithin 1.08. Lysin 2.00. Histidin 1.01 Arginin 3.12. Das Tryptophan: Tyrosin-Verhältnis irr intakten Octadecapeptid bei der spektrophotometrisehen Bestimmung hat den Wert 1.19:1. Das Peptid verhält sich einheitlich bei der Dünnschichtchromatographie (n-Butanol-Essigsäure-Pyridin-Wasser 30:6 20:24) und bei der Papierelektrophorese (600 Volt, 36 cm in 2 n-Essigsäure).
Beispiel 3
(a) Bcnzyloxycarbonyl-L-alanyl-glycintert.-butylester
6.70 g Benzyloxycarbonyl-L-alanin und 3,95 g GIy cin-tert.-butylester werden in 30 ml Äthylacetat gelös und mit ejner Lösung von 6,20 g Dicyclohexylcarbodi imid in Äthylacetat bei 0°C versetzt. Das Gemiscl wird 16 bis 18 Stunden bei 4° C stehengelassen, danacl wird der Dicyclohexylharnstoff abfiltriert, das Filtra
mit eiskalter 1 η-Salzsäure und 1 m-Natriumbicarbonatlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird aus Äther und Petroläther umkristallisiert. Ausbeute 7,84g. F. 41 bis 42° C. [aß6 - 41,6 ± 0,8° (c= 1,026, Methanol).
(b) Benzyloxycarbonyl-^-tert.-butyl-L-aspartyl-L-alanyl-glycin-tert.-bulylester
6,73 g des oben erhaltenen Dipeptids werden an Palladium als Katalysator in 10% Essigsäure enthaltendem Methanol 2 Stunden hydriert. Danach wird das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand mit wäßriger Kaliumcarbonatlösung in Gegenwart von Dichlormethan durchgeschüttelt. Die organische Phase wird über Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Man erhält L-Alanyl-glycin-tert.-
butylester als Öl.
Benzyloxycarbonyl-^-tert.-butyl-L-asparaginsäure (hergestellt durch Behandlung von 10,1 g des entsprechenden Dicyclohexylaminsalzes mit Dowex 5OW · 8® [H+-Form] in üblicher Weise) und der oben erhaltene Dipeptidester werden in Dichlormethan gelöst, und die Lösung wird mit einer Lösung von 4,13 g Dicyclohexylcarbodiimid in Dichlormethan bei 0°C versetzt. Das Gemisch wird 16 bis 18 Stunden bei 4° C stehengelassen. Danach wird der ausgeschiedene Dicyclohexylharnstoff abfiltriert, das Filtrat unter vermindertem Druck eingedampft, der Rückstand in Äthylacetat gelöst, mit eiskalter 1 η-Salzsäure und 1 molarer Natriumcarbonatlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Das zurückbleibende Öl wird aus einer Mischung von Äther und Petroläther umkristallisiert. Ausbeute 7,05 g reines Tripeptidderivat vom F. 111 bis 112°C [aß7 -29,4 + 0,7° (c= 1,033, Methanol).
(c) Benzyloxycarbonyl-L-prolyl-ZMert.-butyl-L-asparagyl-L-alanyl-glycin-terl.-butylester
6,10 g des oben erhaltenen Tripeptidesters werden an Palladiumschwarz als Katalysator 5 Stunden in 5% Essigsäure enthaltendem Methanol hydriert. Nach dem Abfiltrieren des Katalysators wird das Filtrat unter vermindertem Druck eingedampft und der ölige Rückstand bei 0°C mit wäßriger Kalium- 5c carbonatlösung in Gegenwart von Dichlormethan durchgeschüttelt. Die organischen Lösungen werden vereinigt und unter vermindertem Druck eingedampft. Man erhält den ß-tert.-Butyl-L-asparagyl-L-alanylglycin-tert-butylester.
2,90 g Benzyloxycarbonyl-L-prolin und der oben erhaltene Tripeptidester werden in 50 ml Dichlormethan gelöst, und die Lösung wird mit einer Lösung von 2,48 g Dicyclohexylcarbodiimid in Dichlormethan bei 0° C versetzt. Das Gemisch wird 30 Minuten bei 0°C gerührt und hierauf 16 bis 18 Stunden bei 4" C stehengelassen. Der ausgeschiedene DicyclohexylharnstofT wird abfiltriert und das Filtrat unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird mit Äther digeriert. Es werden 6,45 g Kristalle erhalten, die in Acetonitril gelöst, und eine geringe Menge Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert. Das Filtrat wird eingedampft und der Rückstand aus Äther umkristallisiert. Ausbeute 6,0 g, F. 148 bis 150° C, [aß7 - 66,0 ± 1,0° (<?= 1,036, Methanol).
(d) Ν,Ο-Dibenzyloxycarbonyl-L-tyrosyl-L-prolyl-/Mert.-butyl-L-asparagyl-L-alanyl-glycin-
iert.-butylester
5,0 g des oben erhaltenen Tetrapeptidesters werden 4 Stunden an Palladiumschwarz als Katalysator in ίο Methanol hydriert, das 1 ml Essigsäure enthält. Nach dem Abfiltrieren des Katalysators wird das Filtrat unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird mit 50prozentiger wäßriger Kaliumcarbonatlösung in Gegenwart von Dichlormethan bei 0° C ausgeschüttelt. Die organischen Lösungen werden vereinigt, über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Man erhält den L-Prolyl-ß-tert.-butyl-L-asparagyl-L-alanyl-glycin-tert.-butylester. Das Produkt ist einheitlich bei der Dünnschichtchromatographie an Kieselgel im Lösungsmittelsystem n-Butanol-Essigsäure-Pyridin-Wasser (30:6:20:24).
55
60 Carbodiimidmethode
0,45 g (1 mMol) Ν,Ο-Dibenzyloxycarbonyl-L-tyrosin und 1 mMol des oben erhaltenen Tetrapeptidesters werden in 10 ml Dichlormethan gelöst. Die Lösung wird mit einer Lösung von 0,206 g Dicyclohexylcarbodiimid in Dichlormethan versetzt und 16 bis 18 Stunden bei 4°C stehengelassen. Der ausgeschiedene Dicyclohexylhamstoff wird abfiltriert, das Filtrat unter vermindertem Druck eingedampft und der Rückstand mit Äther versetzt. Die ausgeschiedene Fällung wird abfiltriert und aus Äthylacetat und Äther umkristallisiert. Das Peptid schmilzt bei 121 bis 123" C. Ausbeute 0,51 g.
Das Produkt verhält sich einheitlich bei der Dünnschichtchromatographie an Kieselgel im Lösungsmittelsystem Chloroform-Methanol-Essigsäure 90:10:3.
Aktive Estermethode
5,77 mMol L-Prolyl-0-tert.-butyl-L-asparagyl-L-alanyl-glycin-tert.-butylester werden in 30ml Dimethylformamid gelöst und mit 3,63 g RO-Dibenzyloxycarbonyl-L-tyrosin-p-nitrophenylester versetzt. Das Gemisch wird 3 Tage bei 4° C stehengelassen, danach unter vermindertem Druck eingedampft und dei Rückstand aus Äthylacetat und Äther umkristallisiert Nach nochmaliger Umkristallisation aus Äthylaceta werden 6,65 g Produkt vom F. 126 bis 127° C erhalten [aß8 - 48,3 ± 1,0° (c = 0,86, Methanol).
(eJBenzyloxycarbonyl-L-valyi-L-tyrosyl-L-prolyl-
/Mert.-butyl-L-asparagyl-L-alanyl-glycin-
tert.-butylester
6,60 g des oben erhaltenen Pentapeptidesters wcrdei an Palladium als Katalysator in 10% Essigsäure ent haltendem Methanol 4 Stunden hydriert. Danaci wird der Katalysator abfiltriert, das LösungsntitU unter vermindertem Druck eingedampft und der Ruck stand in Dichlormethan aufgenommen. Die Losun wird mit 50prozentiger wäßriger Kaliumcarbona lösung bei 0°C durchgeschüttelt, die organische L< sung über Magnesiumsulfat getrocknet und unti vermindertem Druck eingedampft. Der zurückble
)ende kristalline Pentapeptiddiester wird in 50 ml Dimethylformamid gelöst und mit 2,72 g Benzyloxy- :arbonyl-L-valin-p-nitrophenylester versetzt. Das Genisch wird 2 Tage bei 4° C stehengelassen und sodann jnter vermindertem Druck bei einer Badtemperatur /on 40 bis 45° C eingedampft. Das zurückbleibende Rohprodukt wird an Silikagel(Merck,0,05bis0,2mm, 150 g) Chromatographien. Die Kolonne wird mit ;inem Gemisch aus Methanol und Chloroform mit sinem linearen Methanolkonzentrationsgradienten von 0 bis 5% entwickelt. Es werden 56 Fraktionen von jeweils 20 g/Röhrchen erhalten. Anschließend wird die Kolonne mit einem Gemisch aus Methanol und Chloroform (5:95) eluiert. Jede Fraktion wird dünnschichtchromatographisch geprüft. Die Fraktionen der Röhrchen 55 bis 60 werden vereinigt. Die Lösung wird unter vermindertem Druck eingedampft und der Rückstand mit Äther versetzt. Ausbeute 5,25 g Produkt. [<x)2 D 6 - 70,5 ± 1,1° (c= 1,031, Methanol).
20
(0 W-Benzyloxycarbonyl-NMert.-butyloxy-
carbonyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyi-L-prolyi-
/Mert.-butyl-L-asparagyl-i.-alanyl-glycin-
tert.-butylester
25 4,62 g des Hexapeptidesters werden A Stunden an
Palladium als Katalvsator in 10% Essigsäure enthaltendem Methanol hydriert. Danach wird der Katalysator abfiltriert, und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird in Äthylacetat aufgenommen, die Lösung mit Eis abgekühlt und mit 50prozentiger Kaliumcarbonatlösung durchgeschüttelt. Die organische Lösung wird über Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Man erhält den Hexapeptiddiester, der in 40 ml Dimethylformamid gelöst und mit 2,56 g N^-Benzyloxycarbonyl-N'-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysin-p-nitrophenylester versetzt wird. Das Gemisch wird 3 Tage bei 4° C stehengelassen und sodann bei einer Badtemperatur von 40 bis 45° C unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird an Kieselgel (Merck, 0,05 bis 0,2mm, 150g) chromatographiert. Die Kolonne wird mit einer Mischung aus Methanol und Chloroform mit einem linearen Meihanolkonzentrationsgradienten von 0 bis 5% entwickelt. Es werden 50 Röhrchen von jeweils 20 g/Röhrchen aufgefangen. Anschließend wird die Kolonne mit einem Gemisch aus Methanol und Chloroform (5:95) weiter entwickelt. Die Fraktionen 71 bis 80 werden vereinigt und unter vermindertem Druck eingedampft. Der erhaltene Rückstand wird mit Äther versetzt. Es wird eine gelatinöse Masse erhalten, die mit Äther gewaschen und getrocknet wird. Ausbeute 4,38 g Produkt. [aß5 -64,5 ± 1,0° (C= 1,037, Methanol).
(g) Benzyloxycarbonyl-L-valyl-NMert.-butyloxy-
carbonyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-
ß-tert.-butyl-L-asparagyl-L-alanyl-glycin-
tert.-butylester
55
60
3,5 g des oben erhaltenen Heptapeptidesters werden an Palladiumschwarz als Katalysator in 10% Essigsäure enthaltendem Methanol 3 Stunden hydriert. Danach wird der Katalysator abfiltriert und das Lösungsmitteluntervermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird in Äthylacetat aufgenommen und die Lösung bei O0C mit 50prozentiger wäßriger Kaliumcarbonatlösung durchgeschüttelt. Die organische Lösung wird über Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird in 30 ml Dimethylformamid gelöst und mit 1,29 g Benzyloxycarbonyl-L-valin-p-nitrophenylester versetzt. Das Gemisch wird 2 Tage bei 40C stehengelassen und sodann bei einer Badtemperatur von 40 bis 45" C unter vermindertem Druck eingedampft. Der erhaltene Rückstand wird an Silikagel (Merck, 0,05 bis 0,2 mm, 100 g) chrornatographiert und die Kolonne mit einem Gemisch aus Chloroform und Methanol mit einem linearen Methanolkonzentrationsgradienten von 0 bis 5% gewaschen. Es werden 50 Fraktionen von jeweils 20 g/Röhrchen aufgefangen. Sodann wird die Kolonne mit einem Gemisch aus Methanol und Chloroform (5:95) weiter entwickelt. Die Fraktionen 52 bis 62, die das gewünschte Peptid enthalten, werden vereinigt und unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird mit Äther behandelt, gewaschen und getrocknet. Ausbeute 3,35 g Peptid, [ag5 - 69,2 ± 1,0° (c = 1.061, Methanol).
(h) N^-Benzyloxycarbonyl-N^nitro-L-arginyl-L-proiin-methylester
Ein Gemisch aus 1,6 ml Thionylchlorid und 2,0 ml Methanoi, das in einem Eis-Kochsalzbad abgekühlt worden ist, wird mit 2,30 g L-Prolin versetzt und 16 bis 18 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Danach wird das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand in Dichlormethan gelöst. Die Lösung wird mit 2 ml Wasser versetzt und mit 4 ml eiskalter 50prozentiger wäßriger Kaliumcarbonatlösung bei O0C durchgeschüttelt. Die wäßrige Lösung wird wiederholt mit Dichlormethan extrahiert, und die Extrakte werden vereinigt. Der Extrakt wird über Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck bei einer Badtemperatur von 20° C eingedampft. Man erhält den L-Prolinmethylester als sirupösen Rückstand.
6.18 g Na-Benzyloxycarbonyl-NG-nitro-L-arginin werden in Methanol gelöst, und die Lösung wird unter vermindertem Druck zu einem sirupösen Rückstand eingedampft, der in Acetonitril gelöst wird. Danach wird die Lösung mit dem oben erhaltenen L-Prolinmethylester sowie 3,61 g Dicyclohexylcarbodiimid bei 0°C versetzt. Das Gemisch wird 16 bis 18 Stunden bei 4°C stehengelassen. Die ausgeschiedenen Kristalle werden abfiltriert, mit kaltem Acetonitril gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Das erhaltene Produkt (9,98 g) wird in heißem Methanol gelöst und von unlöslichem Dicyclohexylharnstoff abfiltriert. Das Filtrat wird unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird aus Acetonitril umkristallisiert. Ausbeute 5,75 g vom F. 162 bis 163° C. [O]I1 - 50,9 ± 0,4° (c = 2,022, Methanol).
(i) N*-Benzyloxycarbonyl-Nü-nitro-L-arginyl-NG-nitro-L-arginyl-L-prolin-methylester
4,12 g des oben erhaltenen Dipeptidesters werden in 10 ml Essigsäure gelöst, die mit Bromwasserstoff gesättigt ist. Die Lösung wird 60 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Nach Zusatz von Ä'her wird die amorphe Fällung abfiltriert. gründlich mit Äther gewaschen und über Natriumhydroxidplätzchen unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält das NG-Nitro-L-arginyl-L-prolin-methylesierhydrobromid.
509 622/166
IO
2,83 g Na-Benzyloxycarbonyl-NG-nitro-L-arginin werden in 2,5 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran gelöst und mit 1,63 g Tri-n-butylamin versetzt. Die Lösung wird in einem Eis-Kochsalzbad abgekühlt und tropfenweise mit 0,96 g Chlorameisensäureäthylester versetzt. Das Gemisch wird 30 Minuten in der Kältemischung gerührt, danach iait einer Lösung von 2,96 g des oben erhaltenen Dipeptidester-hydrobromids sowie mit Tri-n-butylamin in 40 ml Dioxan, das 1 ml Wasser enthält, versetzt.
Das Reaktionsgemisch wird 3 Stunden bei 00C gerührt und 16 bis 18 Stunden bei 4° C stehengelassen. Danach wird das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand in 10% n-Butanol enthaltendem Äthylacetat gelöst. Die Lösung wird mit 1 n-Salzsäureund 1 molarer Natriumcarbonatlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird in 30 ml einer Mischung von Methanol und Chloroform (5:95) gelöst und an Silikagel (Merck, 0,05 bis 0,2 mm, 60 g) Chromatographien. Die Kolonne wird hintereinander mit 600 ml Chloroform, 200 ml eines Gemisches aus Methanol und Chloroform (5:95), 1000 ml eines Gemisches aus Methanol und Chloroform (7:93), 400 ml eines Gemisches aus Methanol und Chloroform (10:90) und 400 ml eines Gemisches aus Methanol und Chloroform (1:1) eluiert. Jede Fraktion wird dünnschichtchromatographisch geprüft, und die das Peptid enthaltenden Fraktionen w^den vereinigt. Die Lösung wird unter vermindertem Druck eingedampft und der Rückstand mit Äthylacetat versetzt. Die gelatinöse Fällung wird abfiltriert, mit Äthylacetat gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Ausbeute 3,8 g vom F. 115 bis 1200C (Zersetzung). [ocß7-37,l ±0,8° (γ = 0,967, Essigsäure), -30.5 + 0,7° (c= 0.950, Dimethylformamid).
(j) W-Benzyloxycarbonyl-N'-tert.-butylüxy-
carbonyl-L-lysyl-N^nitro-L-arginyl-N^nitro-
L-arginyl-L-prolin-methylester
40
3,7 g des oben erhaltenen Tripeplidesters werden in 10 ml Essigsäure gelöst, die mit Bromwasserstoff gesättigt ist. Die Lösung wird 90 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen und sodann mit wasserfreiem Äther versetzt. Hierbei fallt das TripcptidcHTerhydrobromid aus, das aus einer Mischung von Methanol und Äther umkristallisiert wird. Ausbeute 4,6 g amorpher Feststoff. Das Produkt zeigt bei der Papier-Chromatographie im Lösungsmittelsystem n-Butanol-Essigsäure-Pyridin-Wasser (30:6:20:24) einen Hauptfleck (Rf= 0,64) und kleinere Flecken (Rf= 0,44 und 0,52).
N'-Benzyloxycarbonyl-N'-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysin (hergestellt aus 3,05 g des entsprechenden Dicyclohexylaminsalzes durch Behandlung mit Dowex 50W · 8® in der H +-Form) und 1,11 g Tri-n-butylamin werden in 20 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran gelöst und in einem Eis-Kochsalzbad abgekühlt. Die Lösung wird mit 0,65 g Chlorameisensäureäthylester versetzt und 30 Minuten im Eis-Kochsalzbad gerührt. Danach wird das Gemisch mit einer Lösungdes oben erhaltenen Tripeptidesters und 2,0 g Tri-n-butylamin in 30 ml Dioxan versetzt,das3ml Wasserenthält. Daserhaltenc Gemisch wird 3 Stunden bei 0"C gerührt und danach 16 bis 18 Stunden bei 4 C stehengelassen. Hierauf wird das Gemisch unter vermindertem Druck eingedampft, der Rückstand in 10% n-Butanol enthaltendem Äthylacetat aufgenommen, die Lösung nacheinander mit eiskalter 1 η-Salzsäure und 1 molarer Natriumcarbonatlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Danach wird die Lösung unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird zweimal aus einer Mischung von Athylacetat und Äther umgeßllt. Ausbeute 3,82 g Produkt, [aß9-37,9 ± 0,7° (c· = 1,064. Methanol).
(k)N"-Benzyloxycarbonyl-Nt-tert.-bu«'-i'-xy-
rarbonyl-L-iysyl-NG-nitro-L-arginyl-N' .itro-
L-arginyl-L-prolin
3 8 g des oben erhaltenen Tetrapeptidesters werden in 10 ml Methanol gelöst und 5.1 ml 1 n-Natronlauge verst.-·'- Das Gemisch wird bei Raumtemperatur 90 Minuten stehengelassen und danach mit 5,1 ml 1 η-Salzsäure angesäuert. Hierauf wird das Methanol unter vermindertem Druck abdestilliert und der ölige Rückstand mit 10% n-Butanol enthaltendem Athylacetat extrahiert. Der Extrakt wird unter vermindertem Druck eingedampft und der Rückstand aus einer Mischung von Methanol und Äther umkristallisiert. Ausbeute 2,6 g Produkt, [aß3 - 36.7 ± 0.8' (c = 0.977. Methanol).
(I) N'-Benzyloxycai bonyl-NMert.-butyloxy-
carbonyl-L-lysyl-NG-nitro-L-^rginy]-NG-nitro-
L-areinyl-L-prolyl-L-valyi-NMert.-butyloxycarbonyl-
i'lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-^-tert.-butyl-
L-asparagyl-L-alanyl-glycin-tert.-butylester
1,19 g des oben erhaltenen Tripeptids werden in 1,5 ml Methanol gelöst, und die Lösung wird mit 1 ml Essigsäure versetzt. Danach wird die Lösung an Palladiumschwarz als Katalysator 4 Stunden hydriert. Nach dem Abfiltrieren des Katalysators wird das Lösungsmittel unterverrnindertem Druck eingedampft und der Rückstand in Äthylacetat aufgenommen. Die Lösung wird abgekühlt und mit kalter 50prozentiger wäßriger Kaliumcarbonatlösung durchgeschüttelt. Die organische Phase wird über Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Man erhält den Octapeptiddiester. Dieser Octapeptiddiester wird in 30 nrl Dimethylformamid gelöst und mit einer Lösung von 1,32 g N*-Benzyloxycarbonyl-Nrtert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-N^-nitro-L-arginyl-N0-nit ro-L-arginyl-L-prolin, 0,173 g N-Hydroxysuccinimid und 0.310 g Dicyclohexylcarbodiimid in Dimethylformamid versetzt. Das Gemisch wird 2 Tage bei 4°C stehengelassen und danach wird der Dicyclohexylharnstoff abfiltriert. Das Filtrat wird unter vermindertem Druck bei einer Badtemperatur von 40 bis 45' C eingedampft, und der Rückstand wird an Silikagel (Merck, 0,05 bis 0,2 mm, 40 g) Chromatographien. Die Kolonne, die vorher mit einem Gemisch aus Methanol und Chloroform (2:98) behandelt worden war. wird mit dem gleichen Lösungsmittel entwickelt. Es werden 50 Fraktionen von jeweils 10 ml Röhrchen aufgefangen. Die Kolonne wird hierauf mit einer Mischung aus Methanol und Chloroform (15:85) weiter entwickelt. Die Fraktionen 34 bis 66 werden vereinigt und unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird in Äthylacetat aufgenommen, und mit einer Mischung von Methanol und Allylacetat versetzt. Hierbei fallt ilas Produkt aus.
Ausbeute 1,73 g. [atf - 78,3 ± 1,1' (r = 1,030, Methanol).
/-ijiJ'.tert.-Butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-arginyl- , areinyl-L-Proly1-L-val>'1"N':"tert-'bulyloxycarbon>'1-
reinyl-L-Proly1Lva>yy L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-pΓolyl-/^tert.-bulyl-
L-asparagyl-L-alanyl-glycin-tert.-butylester
577 mg des oben erhaltenen Dodescapeptidesters erden in 15 ml 90prozentiger Essigsäure an Palladium 1 Katalysator 16 bis 18 Stunden hydriert. Danach wird der Katalysator abfiltriert und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abdestilliert. Der Rückstand wird aus Wasser lyophilisiert und über Natriumhydroxidplätzchen unter vermindertem Druck trocknet. Ausbeute 570 mg Produkt. Das Aminofsiireverhältnis im Säurehydrolysat hat folgenden Werf Asparaginsäure 1,19, Prolin 2,29, Glycin 1.00, Alanin 0,99, Valin 2,15, Tyrosin 0,91, Lysin 2.11. Arginin 1.96.
(n) N£-tert.-Butyloxycarbonyl-i.-lysyl-L-prol> I-
L-valyl-glycyl-N^tert.-butyloxycarbonyl-
L-lysyl-NMert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-arginyl-
L-arginyl-L-prolyl-i.-valyl-N£-tert.-butyloxy-
carbonyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-
/l-tert.-butyl-L-asparagyl-L-alanyl-glycin-
tert.-butylester
0,492 g gemäß Bull. Chem. Soc. Japan, Bd. 37 (1964), S. 1471, hergestelltes N"-Benzyloxycarbonyl-N£-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-N'-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysin-hydrazid werden in 4ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird mit Eis gekühlt und mit 1,375 ml eiskalter 1 η-Salzsäure sowie 0,303 ml 2 molarer Natriumnitritiösung versetzt. Das Gemisch wird 4 Minuten bei 00C geschüttelt. Das erhaltene Azid wird mit eiskaltem Äthylacetat extrahiert. Der Äthylacetatextrakt wird mit kalter gesättigter Natriumbicarbonatlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Die erhaltene Lösung des Azids wird zu einer Lösung von 0,275 mMol des oben erhaltenen Dodecapeptids und 0,127 ml Triäthylamin in 4ml Dimethylformamid gegeben, das 0,2 ml Wasser enthält. Das Reaktionsgemisch wird unter vermindertem Druck bei einer Badtemperatur von 10 bis 15C eingedampft, bis man eine klare Lösung erhält. Die Lösung wird 24 Stunden bei 4° C stehengelassen und danach mit dem Pentapeptidazid versetzt, das aus 0,138 mMol des entsprechenden Hydrazids auf die vorstehend beschriebene Weise hergestellt wurde. Das Gemisch wird 16 bis 18 Stunden bei 4° C stehengelassen, danach wird das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand durch Zusatz von Äther ausgefällt. Die Fällung wird in einem Gemisch von n-Butanol und Äthylacetat (1:2) gelöst und mit 1 η-Essigsäure gewaschen. Die organische Lösung wird über Natriumsulfat getrocknet und aus Essigsäure lyophilisiert. Ausbeute 1,12 g Heptadecapcptidester.
Das erhaltene Peptid wird in Methanol und in Gegenwart von Essigsäure 90 Minuten an Palladium als Katalysator hydriert. Danach wird der Katalysator abfiltriert und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abdestilliert. Der Rückstand wird aus Essigsäure lyophilisiert. Ausbeute 1,007 g.
0.37 g des Lyophilisats werden der Gelfiltration an einer Kolonne (2,3 χ 143 cm) von Scphadcx G-25" mit 20prozentiger Essigsäure unterworfen. Es werden 5 ml Fraktionen aufgefangen, und die Absorption bei 275 nm aufgenommen. Die Fraktionen 32 bis 45, die das Peptid enthalten, werden vereinigt, konzentriert und aus Essigsäure lyophilisiert. Ausbeute 0,21 g des Heptadecapeptidesters. [aß3 -74,2+ 1,6° (c = 0.667, 50prozentige Essigsäure).
(o) «-Aminoisobutyryl-L-tyrosyl-L-seryl-i.-methionyl-
L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylaianyl-L-arginyl-
L-trypiophyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-
L-lysyl-L-lysyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-
L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-
L-asparagyl-L-alanyl-glycin
Eine Lösung von 0,32 g Benzyloxycarbonyl-ataminoisobutyryl-O-benzyl-L-tyrosyl-L-seryl-L-rnethio- nyl-y-benzyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin (hergestellt gemäß Beispiel 1 [k]) in Essigsäure wird mit 0,45 ml 1 n-Chlorwasserstofflösung in Essigsäure versetzt und sofort lyophilisiert. Der Rückstand wird unter vermindertem Druck über Natriumhydroxidplätzchen getrocknet. Das erhaltene Decapeptidhydrochlorid wird in 3 ml Dimethylformamid zusammen mit 0,083 g N-Hydroxysuccinimid gelöst und die Lösung mit einer Lösung von 0,15 g Dicyclohexylcarbodiimid in 2 ml Dimethylformamid versetzt. Das Gemisch wird 24 Stunden bei 4 C stehengelassen. Sodann wird der Dicyclohexylharnstoff abfiltriert. Das Filtrat wird in 100 ml eines eiskalten Gemisches aus Älhylacetat und Äther (1:1) eingegossen, und die ausgeschiedene Fällung abfiltriert. Die Fällung wird mit Äthylacetat und Äther gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält den aktiven Decapeptidester.
0,30 g des oben erhaltenen Heptadecapeptidesteracetats werden in 3 ml Dimethylformamid gelöst und mit 0.17 ml Triäthylamin versetzt. Hierauf wird die Lösung mit einer Lösungdes oben erhaltenen Decapeptidesters in Dimethylformamid versetzt und das Gemisch (Gesamtvolumen 5 ml) 3 Tage bei 4° C gerührt. Sodann wird das Reaktionsgemisch in 50 ml eiskaltes Äthylacetat eingegossen und mit 50 ml Äther versetzt. Die gebildete Fällung wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 0.60 g rohes geschütztes Heptacosapeptid.
Das oben erhaltene geschützte Heptacosapeptid wird zusammen mit 0,1 g Methionin und 0,6 ml Anisol in ein Reaktionsgefäß aus fluoriertem Polyäthylen gegeben, in einem Trockeneis-Acetonbad abgekühlt und mit Fluorwasserstoffgas versetzt. Das Reaktionsgemisch (etwa 20 ml) wird 40 Minuten bei Raumtemperatur gerührt und sodann unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird in Eiswasser gelöst, die Lösung mit Chloroform gewaschen und auf eine 55 Austauschersäule (1.4 χ 30 cm) von Amberlite CG-4B* (Acetat-Form) gegeben. Die Kolonne wird mit Wasser eluiert. das Eluat unter vermindertem Druck eingedampft und lyophilisiert. Ausbeute 0,41 g Peptid. Das Peptid wird an einer Kolonne (2.2 χ 30cm) von Carbo-60 xymethylcellulose (Serva. 0.56 mÄq/g) mit Ammoniumaceiatpuflcr (pH 6.5. 2000 ml) mit einem linearen Konzenirationsgradientcn von 0.02 bis U.6 Mol gereinigt. Die Absorption bei 2S0 nm wird aufgenommen und jeweils Fraktionen von 10 ml/Röhrchen aufge-65 fangen. Die Fraktionen F-I (Nr. 91 bis 104) und F-II (105 bis 130). die einem Hauplabsorptionsmaximum ent sprechen, werden gesondert aufgefangen. Die Hauptmenge des Lösungsmittels wird abdestilliert
und der Rückstand wiederholt bis zur Gewichtskonstanz lyophilisiert. Es werden 100 mg F-I und 180 mg F-II entblockiertes Heptacosapeptid erhalten. F-II wird erneut an Carboxymethylcellulose in gleicher Weise, wie vorstehend beschrieben, chromatographiert. Man erhält die Fraktion F-II-I (80 mg) und F-11-2 (85 mg) als erste Hälfte und den Rest des Hauptabsorptionsmaximums. F-I und F-II-I werden vereinigt (180 mg) und nochmals Chromatographien. Man erhält das Peptid in ziemlich reiner Form, was sich aus der Dünnschichtchromatographie an Cellulose mit dem Lösungsmittelsystem n-Butanol-Essigsäure-Pyridin-Wasser (30:6:20:24) ergibt. Ein Anteil von 147 mg des vorgenannten Produktes wird an einer Kolonne (2,0x30 cm) von Carboxymethylcellulose (Whatman CM-52) mit Ammoniumacetatpuffer (pH 6,5, 2000 ml) mit einem linearen Konzentrationsgradienten von 0,02 bis 0,5 Mol Chromatographien. Die Fraktionen, die einem einzigen Maximum entsprechen, werden vereinigt, eingedampft und lyophilisiert. Man erhält 100 mg reines Heptacosapeptid. [aß4 - 89,2 ± 2,5° (c = 0,53,0,1 η-Essigsäure), -1/"" 276 nm (E[0JS1 22,0), 288 nm (E\°£ 15,8), ;£,
282 nm (Ej £ 23,0), 288 nm (EjSi 23,8).
Das Aminosäureverhältnis im Säurehydrolysat hat folgenden Wert: Asparaginsäure 0,99, Serin 0,89, Glutaminsäure 1,00, Prolin 3,93, Glycin 3,00, Alanin 1,02, Valin 2,80, Methionin 1,01, Tyrosin 1,90, Phenylalanin 0,99, a-Aminoisobuttersäure 1,19, Lysin 4,52, Histidin 1,22, Arginin 2,91. Das Tryptophan: Tyrosin-Verhältnis im intakten Heptacosapeptid hat spektrophotometrisch bestimmt den Wert 0,54.
35
Beispiel 4
(a) Benzyloxycarbonyl-L-valyl-L-tyrosinmethylester
5,78 g Benzyloxycarbonyl-L-valin und 4,49 g L-Tyrosinmethylester werden in 10 ml Dimethylformamid gelöst und bei 0° C mit 4,75 g Dicyclohexylcarbodiimid in 50 ml Dichlormethan versetzt. Das Gemisch wird 16 bis 18 Stunden bei 4° C stehengelassen, danach wird der ausgeschiedene Dicyclohexylharnstoff abfiltriert und das Filtrat unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird in Äthylacetat gelöst und die Lösung mit 1 η-Salzsäure und 1 molarer Natriumbicarbonatlösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Nach dem Eindampfen des Lösungsmittels hinterbleibt ein kristalliner Rückstand, der aus einer Mischung von Äthylacetat und Äther umkristallisiert wird. Ausbeute 8,47 g, F. 154 bis 155° C; {a\2D - 18,3 ±0,6° (C = 0,98, Methanol).
(b) Benzyloxycarbonyl-L-valyl-L-tyrosinhydrazid
Eine Lösung von 6,42 g Benzyloxycarbonyl-L-valyl-L-tyrosinmethylester in 10 ml Dimethylformamid und 30 ml Äthanol wird mit 1,8 ml Hydrazin-hydrat versetzt und 24 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Die abgeschiedenen Kristalle werden abfiltriert, mit kaltem Äthanol und Äther gewaschen und über Schwefelsäure unter vermindertem Druck getrocknet. Ausbeute 6,26 g, F. 243 bis 2440C (Zersetzung); [a\l2- 12,0±0.5° (c=l,01. Dimethylformamid).
(c) Benzyloxycarbonyl-L-valyl-L-iyrosj I-L-prolinmethylester
20 ml in einem Eis-Kochsalzbad gekühltes Methanol werden tropfenweise mit 1,5 ml Thionylchlorid und anschließend mit 2,0 g ^-Prolin versetzt. Das Gemisch wird 16 bis 18 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen und hierauf unter vermindertem Druck eingedampft. Der sirupöse Rückstand wird in etwa 5 ml Wasser gelöst und mit 20 ml Dichlormethan versetzt. Das Gemisch wird abgekühlt und mit 10 ml eiskalter 50prozentiger wäßriger Kaliumcarbonatlösung versetzt. Die wäßrige Phase wird wiederholt mit Dichlormethan extrahiert. Die organischen Extrakte werden vereinigt, über Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Es hinterbleibt L-Prolinmethylester als freie Base.
Eine gekühlte Lösung von 6,0 g Benzyloxycarbonyl-L-valyl-L-tyrosin-hydrazidin 20 ml Dimethylformamid und 35 ml Salzsäure wird mit 7,7 ml eiskalter 2molarer Natriumnitritlösung versetzt, 4 Minuten bei 0 C gerührt und danach zweimal mit eiskaltem Athylacetat extrahiert. Die organischen Extrakte werden vereinigt, mit eiskalter 1 molarer Natriumbicarbonatlösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Die erhaltene Lösung des Azids wird zu dem oben hergestellten L-Prolinmethylester gegeben und das Gemisch 2 Tage bei 40C stehengelassen. Danach wird das Reaktionsgemisch mit 1 η-Salzsäure. Wasser und 1 molarer Natriumbicarbonatlösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand (5,9 g) wird in einer Mischung aus Methanol und Chloroform (5:95) gelöst und die Lösung auf eine Silikagelsäule (Merck. 0,05 bis 0,2 mm, 170 g) gegeben, die mit dem gleichen Methanol-Chloroformgemisch vorbehandelt worden war. Dieses Lösungsmittelgemisch wird auch zum Eluieren verwendet. Diejenigen Fraktionen, die eine Hauptkomponente bei der Dünnschichtchromatographie an Silikagel G mit einem Gemisch aus Methanol und Chloroform (1:9) als Lösungsmittel zeigen (Rf =0.57, Schwefelsäure) werden vereinigt und unter vermindertem Druck eingedampft. Es hinterbleibt das Tripeptid als schaumiger Rückstand. Ausbeute 5,44 g, [a]22 - 60,6 ± 1,0° (c = 1,01, Methanol).
(d) N^-Benzyloxycarbonyl-NMert.-butyloxy-
carbonyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin-
methylester
2,63 g Benzyloxycarbonyl-L-valyl-L-tyrosyi-L-prolinmethylester werden in Methanol gelöst und 3 Stunden an Palladium als Katalysator hydriert. Danach wird der Katalysator abfiltriert und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abdestilliert. Es hinterbleibt L-Valyl-L-tyrosyl-L-prolinmethylester als freie Base. N'-Benzyloxycarbonyl-N'-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysin (hergestellt aus 2,82 g des Dicyclohexylaminsalzes in üblicher Weise) und der oben erhaltene Tripeptidester werden in Dichlormethan gelöst und mit einer Dichlormethanlösung von 1,03 g Dicyclohexylcarbodiimid bei 0° C versetzt. Das Gemisch wird 16 bis 18 Stunden bei 4° C stehengelassen, danach vom auskristallisierten Dicyclohexylharnstoff befreit und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abdestilliert. Der Rückstand wird in Athylacetat gelöst und die Lösung mit eiskalter 1 η-Salzsäure, Wasser und 1 molarer Natriumbicarbonatlösung gewaschen, über Magne-
siumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Es hinterbleibt ein farbloser schaumiger Rückstand, der aus einer Mischung von Älhylacetal und Äther umgefällt wird. Ausbeute 3.61 g[a]p2 — 56,3 + 1.0° (c= 1,00, Methanol).
(e) Benzyloxycarbonyl-L-valyl-NMert.-butyloxy-
carbonyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-i.-prolin-
methylester
IO
1,51 g N'-Benzyloxycarbonyl-N'-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolinmethylester werden in Methanol 3 Stunden an Palladium als Katalysator hydriert. Danach wird der Katalysator abfiltriert und das Filtrat unter vermindertem Druck eingedampft. Es hinterbleibt N'-tert.-Butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolinmethylester als schaumiger Rückstand. Der Tetrapeptidester wird zusammen mit 0,50 g Benzyloxycarbonyl-L-valin in Dichlormethan gelöst und bei 0° C mit einer Lösung von 0.41 g Dicyclohexylcarbodiimid in Dichlormethan versetzt. Das Gemisch wird 16 bis 18 Stunden bei 4'C stehengelassen, danach wird der ausgeschiedene Dicyclohexylharnstoff abfiltriert und das Filtrat unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird in Äthylacelat aufgenommen und die Lösung nacheinander mit eiskalter 1 η-Salzsäure, Wasser und 1 molarer Natriumbicarbonatlöjung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird aus einer Mischung aus Äthylacetat und Äther um gefällt. Ausbeute 1,43 g. Nach nochmaliger Umfällung aus Acetonitrit beträgt die Ausbeute 1.14 g. [aß2-66,4+1.Γ (r=1.03. Methanol).
(0 N'-Benzyloxycarbonyl-NMert.-butyloxy-
carbonyl-L-lysyl-NG-nitro-L-arginyl-N -nitro-
L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-Nc-lert.-butyloxy-
carbonyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin-
methylester
35
40
0,51 g Benzyloxycarbonyl-L-valyl-N'-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolinmethylesler in Methanol werden 3 Stunden an Palladium als Katalysator hydriert. Danach wird der Katalysator abfiltriert und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abdestilliert. Der Rückstand wird über Natriumhydroxidplätzchen getrocknet und anschließend in 2 ml Dimethylformamid gelöst. Diese Lösung wird mit 0.53 g N"-Benzyloxycarbonyl-Nc-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-NG-nitro-L-arginyl-NG-nitro-L-arginyl-L-prolin und 0,10 g N-Hydroxysuccinimid sowie bei 00C mit einer Lösung von 0,19 g Dicyclohexylcarbodiimid in 8 ml Dichlormethan versetzt. Das Gemisch wird 2 Tage bei 4° C stehengelassen und anschließend tropfenweise in 100 ml eines Gemisches aus Äthylacetal und Äther (1:1) gegeben. Die entstandene Fällung wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und getrocknet. Ausbeute 1,13 g. Die erhaltene Fällung wird in einer Mischung aus Methanol und Chloroform (1:9) gelöst und auf eine Kolonne mit Silikagel (Merck, 0,05 bis 0,2 mm, 40 g) gegeben, die mit dem gleichen Lösungsmittelgemisch vorbehandelt worden war. Auch die Eluierung wird mit dem gleichen Lösungsmittelgemisch durchgeführt. Fraktionen, die eine Hauptkomponente im Dünnschichtchromatogramm an Silikagel G und mit einem Gemisch aus Methanol und Chloroform (1:9) als Lösungsmittel enthalten (Rf= 0,25. Schwefelsäure) werden vereinigt, unter vermindertem Druck eingedampft und aus Essigsäure lyophilisiert. Man erhält 0,48 gdes Nonapeplids. [a]„2 - 74.8 + 1.2° ((■= 1.00. Methanol).
(g) N'-terl.-Butyloxycarbonyl-L-lysyl-i.-prolyl-
i.-valyl-glycyl-N'-tert.-butyloxycarbonyl-i.-lysyl-
N'-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-arginyl-i.-arginyl-L-prolyl-i.-valyl-N'-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl- i.-valyl-L-tyrosyl-L-prolinrnethylester
0.39 g N'-Benzyloxycarbonyl-N'-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-nitroarginyl-L-nitroarginyl-L-prolyl-L-valyl-N^terl.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolinmethylester in 90prozentiger Essigsäure werden 6 Stunden an Palladium als Katalysator hydriert. Danach wird der Katalysator abfiltriert und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird aus Essigsäure lyophilisiert. Man erhält 0.42 g NMert.-Butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-Nr-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolinmethylester.
Zu einer gekühlten Lösung von 0.32 g N"-Benzyloxycarbonyl-N'-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-N'-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysinhydrazid in 5 ml 90prozentigem Tetrahydrofuran wird nacheinander 0.9 ml eiskalte 1 η-Salzsäure und 0.2 ml 2molare Natriumnitritlösung gegeben, und das Gemisch wird 4 Minuten bei 0°C gerührt. Sodann wird das Gemisch mit 15 ml eiskaltem Äthylacetat und 5 ml Smolarer Natriumbicarbonatlösung versetzt. Die organische Lösung wird erneut mit eiskalter 1 molarer Natriumbicarbonatlösung gewaschen und bei O1C über Magnesiumsulfat getrocknet. Die erhaltene Lösung des Pentapeptidazids wird zu einem Gemisch aus dem oben erhaltenen Nonapeptid und 0.067 ml Triäthylamin in 3 ml Dimethylformamid gegeben. Das Gemisch wird unter vermindertem Druck bei einer Badtemperatur von 200C eingedampft, bis die gebildeten Fällungen wieder verschwinden. Sodann wird das Gemisch 2 Tage bei 4° C stehengelassen. Hierauf wird eine weitere Mengedes Azids (hergestellt aus 0,18 mMol des Hydrazide) zugesetzt. Das Gemisch wird 16 bis 18 Stunden bei 4° C stehengelassen und anschließend in 100 ml Äther eingegossen. Die ausgeschiedene Fällung wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Ausbeute 0,68 g. Nach Umfällung aus einer Mischung von Methanol und Äthylacetat erhält man 0.65 g rohen W-Benzyloxycarbonyl-NMert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyi-glycyl-NMert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-NMert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-NMert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolinmethylester.
Ein Anteil von 0,20 g des oben erhaltenen Tetra decapeptids in 90prozentiger Essigsäure wird 31^ Stun den an Palladium als Katalysator hydriert. Danacr wird der Katalysator abfiltriert, das Lösungsmitte unter vermindertem Druck abdestilliert und der Rück stand aus Essigsäure lyophilisiert. Man erhält rohe: N*-freies Tetradecapeptid. Diese Verbindung wire chromatographisch an einer Säule (1.7 χ 33 cm) vor Carboxymethylcellulosc (Scrva, 0,70 mÄq/g) mi AmmoniumacetatpufTcr (pH 5.9. 2000 ml) mit einen linearen Konzentralionsgradicntcn von 0.005 bi; 0.25 Mol gereinigt. Es werden 8 ml Fraktionen auf gefangen und ihre Absorption bei 275 mn aufgenom men. Die Fraktionen, die einem Hauptabsorplions
509 622/16
.7S
tv ..
maximum entsprechen (Fraktion 111 bis 140). werden vereinigt, und die Hauptmenge des Lösungsmittels wird unter vermindertem Druck abdestilliert. Der Rückstand wird lyophilisiert. Man erhält 0,154 g reines Peptid, [aß1 -67.0 + 2 (r = 0.551. Methanol).
(h) Benzyloxycarbonyl-fi-aminoisobutyryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methioninhydrazid
Eine eiskalte Lösung von 2.3 g Benzyloxycarbonyla-aminoisobutyryl-L-tyrosin-hydrazid in 15 ml 1 n-Salzsäure wird tropfenweise mit 3.0 ml eiskalter 2molarer Natriumnitrillösung versetzt. 4 Minuten gerührt und danach mit eiskaltem Äthylacetat extrahiert. Der organische Extrakt wird dreimal mit eiskalter 1 molarer Natriumbicarbonatlösung gewaschen und bei OC über M agnesiumsulfat getrocknet. Die erhaltene Äthylacetatlösung des Dipeptidazids wird zu einer Lösung von L-seryl-L-methioninmethylester (hergestellt aus 5 mMol tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-methioninmethylester) in 5 ml Dimethylformamid gegeben, und das Gemisch wird 65 Stunden bei 4° C stehengelassen. Nach beendeter Umsetzung wird das Gemisch nacheinander mit 1 η-Salzsäure, Wasser und 1 molarer Natriumbicarbonatlösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Es hinterbleibt ein schaumiger Rückstand, der zweimal aus einer Mischung von Äthylacetat und Äther umgefällt wird. Es werden 2,81 g roher Tetrapeptidmethylester erhalten. Dieser rohe Ester wird in 25 ml Äthanol gelöst und mit 2.4 ml Hydrazinhydrat versetzt. Das Gemisch wird 16 bis 18 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen, danach unter vermindertem Druck eingedampft, der Rückstand mit 10 ml Wasser versetzt und mit 20 ml Äthylacetat ausgeschüttelt. Die wäßrige Lösung wird noch zweimal mit Äthylacetat extrahiert. Die vereinigten Äthylacelatextrakte werden mit Wasser gewaschen und eingedampft. Der gelatinöse Rückstand wird mit kaltem Äthylacetat und Äther gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Ausbeute 2.47 g. Nach nochmaliger Umfällung aus einer Mischung von Äthanol und Äthylacetat wird das reine Tetrapeptidhydrazid erhalten. Ausbeute 1.86 g.
45
(i) Benzyloxycarbonyl-'i-aminoisobutyryl-i -tyrosvli.-seryl-i -methiony]-;-benzyl-i.-glutamyl-i -histidyl-1-phenylalanyi-i -arginyl-t.-tryptophyl-glycin
0.23 g tert.-Butyloxycarbonyl-y-benzyl-L-glutamyl-L-histidyl-i.-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin werden in etwa 1,5 ml Trifluoressigsäure gelöst und 30 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Danach wird das Gemisch mit Äther versetzt, die ausgeschiedene Fällung wird abfiltriert, mit Äther gewäsehen und getrocknet. Es werden 0.24 g N*-freies Hexapeptid erhalten.
0.25 g Benzyloxycarbonyl-oc-aminoisobutyryl-i.-tyrosyl-L-scryl-L-methioninhydrazid werden in 1 ml Dimethylformamid gelöst und mit 1 ml 1 n-Salzsäure versetzt. Das Gemisch wird in Eis abgekühlt und mit 0.22 ml eiskalter 2molarer Natriumnitritlösung versetzt. Das erhaltene Azid wird mit eiskaltem Äthylacetat extrahiert, der Extrakt mit eiskalter 1 molarer NatriumdicarbonallösunggewaschcnundüberMagnesiumsulfat getrocknet. Danach wird diese Lösung mit einer Lösung des oben erhaltenen Hexapeptids und 0.125 ml Triäthylamin in 5 ml Dimethylformamid versetzt. Das Gemisch wird unter vermindertem Druck bei einer Badlemperatur von 15 bis 20 C eingedampft, bis eine klare Lösung entsteht. Sodann wird die Lösung 40 Stunden bei 4 C stehengelassen. Hierauf wird das Gemisch in 100 ml einer Mischung von Äihylacetat und Äther (1:1) eingegossen, die ausgeschiedene Fällungabfiltriert. mit Äthylacetat und Äthei gewaschen und aus Essigsäure lyophilisiert. Ausheute 0.32 g.
(j) "-Aminoisobutyryl-L-lyrüsyl-i-seryl-L-methionyl-
L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-i.-arginyl-
L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-
L-lysyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-i.-valyl-
L-lysyl-L-valyl-i.-tyrosyl-i.-prolinmethylester
Eine Lösung von 0.257 g Benzyloxycarbonyl-aaminoisobutyryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-y-benzyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin in Essigsäure wird mit 0.3 ml einer 1 n-Salzsäurelösung in Essigsäure versetzt und sofort lyophilisierl und unter vermindertem Druck über Natriumhydroxidplätzchen getrocknet. Das erhaltene Decapeptid-hydrochlorid wird in 3 ml Dimethylformamid zusammen mit0.069gN-Hydroxysuccinimid gelöst und mit 0.12 g Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Das Gemisch wird 24 Stunden bei 4 C stehengelassen, danach wird der ausgeschiedene Dicyclohexylharnstoff abfiltriert, das Filtrai in ein eiskaltes Gemisch gleicher Teile Äthylacetat und Äther eingegossen und die gebildete Fällung abfiltriert, mit Äthylacetat und Äther gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 0.29 e des aktiven Decapeplidesters.
0.248 g des Tetradecapeptids N'-tert.-Butyloxycarbonyl-i.-lysyl-i.-proIyl-L-valyl-glycyl-N'-tert.-bulyloxyearbonyl-L-lysyl-N'-tert.-butyloxycarbonyl-i-lysyl-L-arginy-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-Nr-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-valyi-L-tyrosyl-L-prolinmethyiester-acetat werden in 2 ml Dimethylformamid gelost und mit 0.15 ml Triäthylamin versetzt. Die Lösung wird mit einer Dimethylformamidlösung des oben erhaltenen aktiven Decapeptidesters versetzt und 48 Stunden oei 4 (. stehengelassen. Sodann wird das Reaktionsgem.sch in 100 ml eiskaltes Äihylacetat eincesossen. die ausgeschiedene Fällungabfiltriert. mit Äthylacetat und Äther gewaschen, aus Essigsäure lvophilisicrt und unter vermindertem Druck über Natnumhvdrox.dplatzchen getrocknet. Ausbeute 0.48 u rohes ccschutztes Tetracosa peptid.
(\2° Ld»eS °ben erha'tenen ecschützten Peptids werden 90 M.nuten bei OX in üblicher Weise in Gegenwart von 0.05 g Methionin und 0.2 ml Anisol als Radikalfanger mit wasserfreiem Fluorwasserstoff behandelt. Danach wird der Fluorwasserstoff unter vermindertem Druck abgetrennt.der Rückstand in Wasser gelost und die Lösung mit Äthylacctal eewaschen. Die Äu°SUngwird aufeine Kolonne\on Amberlite
· ™ iAcetat-F°rm) gegeben, und die Kolonne wird mit Wasser eluiert. Das Eluat wird unter vermindertem uruck eingedampft und lyophilisiert. Das erhaltene rohe entblockierte Peptid wird an einer Kolonne von Carboxymethylcellulose (Serva. 0.70 mÄq/g) mit einem Ammon.umaeei-jtpuffcr (pH 6.5. 2000 ml) mit eineni linearen Konzentrationsgradicntcn von 0.02 bis
ciäh^ofS A BeiS0ie12 c1»-°™t.*graphiert. Man erhalt 0.074 g «-Amino.sobutyryl-i.-tyrosyl-L-scryl-i methionyl-L-glutamy-.-L.histidvl-L-phenvlalanvl-L-ar-
ginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl -L- prolinmethylester. [a]f,1 - 75 + 2" (c· = 0,5,0,1 n-Essigsäure).
Beispiel 5
0,5 mg Ibu'-ACTH(l-18)-NH2-acetat werden in 0,25 ml 40mmolarer Zinkchloridlösung bei Raumtemperatur gelöst. Die Lösung wird mit 0,25 ml einer 40mmolaren Dinalriumhydrogenphosphatiösung versetzt, die 4,5 mg Natriumchlorid enthält. Man erhält eine Suspension eines Komplexes, der durch Zusatz von 0,1 η-Natronlauge auf pH 7,0 eingestellt wird.
Beispiel 6
0,5 mg lbu'-ACTH(l-18)-NH2-acetat werden in 0,15 ml destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung wird mit 0,1 ml einer Lösung von 0,5 mg Poly-L-glutaminsäure (Molekulargewicht etwa 1500 bis 2000) versetzt, die mit 0,1 η-Natronlauge neutralisiert worden war. Das Gemisch wird mehrere Minuten gerührt und danach mit 0,25 ml eines M/30-Phosphatpuffers versetzt, der 4,5 mg Natriumchlorid enthält. Der erhaltene Komplex wird mit 0,1 η-Natronlauge auf pH 7,0 eingestellt.
Beispiel 7
1,0 mg Ibu'-ACTH(l-18)-NH2-acetat werden in 0.2 ml destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung wird unter Rühren mit einer Lösung von 2 mg PoIy-L-asparaginsäure (Molekulargewicht etwa 3000) versetzt, die mit 0,3 ml 0,1 η-Natronlauge vor der Verwendung neutralisiert worden war. Es bildet sich eine weiße Fällung. Die Suspension wird mit 0.5 ml einer M 15-Dinatriumhydrogenphosphal-Kaliumdihydrogenphosphat-Lösung pH 6,8 versetzt, die 9.0 mg Natriumchlorid enthält und mit 0.1 η-Natronlauge auf pH 7.0 eingestellt.
Beispiel 8
0.5 mg lbu'-ACTH(l-18)-NH2-acetat werden in 0.15 ml lOOmmolarer Zinkchloridlösung gelöst. Andererseits werden 0,5 mg Poiy-L-glutaminsäure (Molekulargewicht etwa 2000 bis 3000) mit 0.1 ml 0.1 n-Natronlauge neutralisiert. Die Lösung wird mit 4.5 mg Natriumchlorid sowie 0.25 ml 40mmolarer Dinatriumhydrogenphosphatlösung versetzt. Die erhaltenen Lösungen werden vereinigt und bei Raumtemperatur gerührt. Es entsteht eine Suspension des Komplexes, der mit 0.1 η-Natronlauge neutralisiert wird.
sung wird mit 0,25 ml einer M/l 5-Kaliumdihydrogenphosphat-Dinatriumhydrogenphosphat-Lösung versetzt, die 4.5 mg Natriumchlorid enthalten. 20 mg Copoly -L- glutamyl - l - tyrosin (Molekulargewicht 21 850) werden mit 0,15 ml 0,1 η-Natronlauge neutralisiert. Die neutralisierte Lösung wird zu der oben erhaltenen Peptidlösung gegeben, und das Gemisch wird gerührt. Die Suspension des erhaltenen Komplexes wird mit 0,1 η-Natronlauge auf pH 7,0 eingestellt.
Beispiel 10
0,5 mg Ibu'-ACTH(l-18)-NH2-acetat werden in 0,1 ml Wasser gelöst. Diese Lösung wird mit 0,25 ml M/15-PhosphalpiuTer pH 7,0 versetzt, die 4,5 mg Natriumchlorid enthalten. 7 mg Copoly-L-glutamyl-L-tyrosin (Molekulargewicht etwa 21850) werden mit 0.1 η-Natronlauge neutralisiert. 0,1 ml der neutralisierten Lösung werden zu der Lösung des erhaltenen Peptids gegeben. Man erhält eine Suspension, die sofort klar wird. Die Lösung wird mit 0,1 mg Thimerosal in 0,05 ml Wasser versetzt und die erhaltene klare Lösung mit 0,1 η-Natronlauge auf pH 7,0 eingestellt.
Beispiel 11
0,5 mg lbu'-Orn15-ACTH(l-18)-NH2-acetat werden bei Raumtemperatur in 0,25 ml 40mmolarer Zinkchloridlösung gelöst. Die Lösung wird mit 0,25 ml einer 4ümmolaren Dinatriumhydrogenphosphatlösung versetzt, die 4,5 mg Natriumchlorid enthalten. Man erhälteine Suspension eines Komplexes, derdurch Zusatz von 0.1 η-Natronlauge auf pH 7.0 eingestellt wird.
55
Beispiel 9
0.5 mg Ibu'-ACTH(l-18)-NH2-acctat werden bei Raumtemperatur in 0,1 ml Wasser gelöst. Diese Lö-
Beispiel 12
0,5 mg Ibu'-ACTHO^J-OCHj-acetat werden bei Raumtemperatur in 0,25 ml 40mmolarer Zinkchloridlösung gelöst. Die Lösung wird mit 0,25 ml einer 40mmolaren Dinatriumhydrogenphosphatlösung versetzt, die 0.45 mg Natriumchlorid enthält. Die erhaltene Suspension des Komplexes wird mit 0.1 n-Natronlauge auf pH 7.0 eingestellt.
Beispiel 13
0.5 mg Ibu'-ACTH(l-27)-OH-acetat werden bei Raumtemperatur in 0.25 ml 40mmolarcr Zinkchloridlösung versetzt. Die erhaltene Lösung wird mit 0,25 ml einer 40mmolaren Dinatriumhydrogenphosphatlösung versetzt, die 0,45 mg Natriumchlorid enthält. Die erhaltene Suspension des Komplexes wird mit 0.1 n-Natronlauge auf pH 7 eingestellt.
In ähnlicher Weise, wie vorstehend beschrieben können andere l-a-Aminoisobuttersäure-corticotro pinpeptide in die entsprechenden Komplexe umgewandelt werden.
./T

Claims (9)

Patentansprüche:
1. !-a-Aminoisobuttersäure-corticotropinpeptide mit Aminosäureresten entsprechend der Sequenz 1-16 bis 1-39 des aativen Corticotropins, deren Derivate, Säureadditionssalze und Komplexe.
2. 1 -a-Aminoisobuttersäure-corticotropinpeptide, in denen die 4. Aminosäure L-Methionin, L-Norvalin, L-Norleucin. L-Leucin oder a-Aminobuttersäure, die 5. Aminosäure L-Glutaminsäure oder L-GIutamin, die 15. und 16. Aminosäure L-Lysin oder L-Ornithin. die 17. und 18. Aminosäure L-Arginin, L-Lysin oder L-Ornithin und die 25. Aminosäure L-Asparagin säure oder L-Valin ist, sowie deren Derivate, Säureadditionssalze und Komplexe.
3. 1 -a-Aminoisobuttersäure-corticotropinpeptide mit Aminosäureresten entsprechend der Sequenz 1-16 bis 1-39 des nativen Corticotropins, in deren 4. Aminosäure L-Methionin, L-Norvalin, L-Norleucin, L-Leucin oder a-Aminobuttersäure. die 5. Aminosäure L-Glutaminsäure oder L-Glutamin, die 15. und 16. Aminosäure L-Lysin oder L-Ornithin, die 17. und 18. Aminosäure L-Arginin. L-Lysin oder L-Ornithin und die 25. Aminosäure L-Asparaginsäure oder L-Valin ist, deren Derivate. Säureadditionssalze und Komplexe.
4. 1-a-Aminoisobuttersäure-corticotropinpeptide mit Aminosäureresten entsprechend der Sequenz 1-18 bis 1-27 des nativen Corticotropins der allgemeinen Formel
a-Aminoisobutyryl-L-tyrosyl-L-seryl-
A-B-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-
L-valyl-glycyl-C-D-E-F
in der A ein L-Methionin-. L-Norvalin-. L-Norleucin-, L-Leucin- oder a-Aminobuttersäurerest. B ein L-Glutaminsäure- oder L-Glutaminrest. C und D jeweils ein L-Lysin- oder L-Ornithinrest, E ein L-Arginin-, L-Lysin- oder L-Ornithinrest und F ein L-Arginin-. L-Arginyl-L-prolin-. L-Arginyl-L-prolyl-L-valin-. L-Arginyl-L-prolyl-L-valyl-i.-lysin-, L-Arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valin-, L-Arginyl-L-prolyl-L-valyl-i.-lysyl-L-valyl-L-tyrosin-. L-Arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-lyrosyl-L-prolin-, L-Arginyl-i.-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-asparaginsäure-, L-Arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-valin-. L-Arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-i,-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-asparagyl-L-alanin-. L-Arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-iysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-aspartyl-L-alanyl-glycin-. L-Arginyl-i,-prolyl-L-valyl-L-lysyl-i.-valyl-L-tyrosyl-i.-prolyl-i.-asparagyl-glycyl-L-glutaminsäure-. i.-Arginyl-iprolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-lyrosyl-L-prolyl-L-alanyl-glycyl-L-glutaminsäurc. L-Arginyl-i.-piolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-i.-asparagyl-glycyl-L-glutaminsäure oder i.-Arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-i.-tyrosyl-i.-prolyl-L-asparagyl-glycyl-L-alaninrcst oder der entsprechende Esteroderdasentspreehende Amid ist.deren Säureadditionssalze und Komplexe.
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5. 1-a-Aminoisobuttersäure-corticotropinpeptide der allgemeinen Formel
a-Aminoisobutyryl-L-tyrosyl-L-seryl-
A-B-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-
L-tryptophyl-glycyl-L-Iysyl-L-prolyl-
L-valyl-glycyl-C-D-E-F
inderAeinL-Methionin-.L-Nonalin-.i.-Norleucin. L-Leucin- oder a-Aminobuttersäurerest. r, .iin l-Glutaminsäure- oder L-Glutaminrest. C u. .: D jeweils ein L-Lysin- oder L-Ornithinrest. E ein L-Arginin-L-Lysin- oder L-Ornithinrest und F ein L-Arginin-. L-Lysin-. L-Ornithin-. L-Argininester-. L-Lysinester-, L-Ornithinester. L-Argininamid-. l-Lysinainid oder L-Ornithinamidrest ist. deren Säureadditionssalze und Komplexe.
6. 1 -a-Aminoisobuttersäure-corticolropinpeptide der allgemeinen Formel
a-Aminoisobutyryl-L-tyrosyl-L-seryl-
A-B-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-argmyl-
L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-
L-valyl-glycyl-C-D-E-F-prolyl-L-valyl-
l1l1trosylG
in der A ein L-Methionin-. L-Norvalin-. L-Norleucin- L-Leucin- oder α-Aminobuttersäureresi. B ein ι-Glutaminsäure- oder L-Gk'taminrest. C und D jeweils ein L-Lysin- oder L-Ornithinrest. E und F jeweils ein L-Areinin-. i.-Lysin- oder L-Ornithinrest und G ein L-Prolin-. L-Prolinester- oder i.-Prolinamidresl ist. deren Säureadditionssalze und Komplexe.
7. l-x-Aminoisobuttersäure-corlicotropinpcptide der allgemeinen Formel
a-Aminoisobutyryl-L-tyrosyl-L-seryl-
A-B-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-
L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-
glycyl-C-D-E-F-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-
L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-G
in der A ein L-Mcthionin-, L-Norvalin-. i.-Norlcucin-. L-Leucin- oder α-Aminobultersäurerest. B ein L-Glutaminsäure-oder L-Glutaminrest. C und D jeweils ein i.-Lysin- oder L-Ornilhinrest. E und F jeweils ein L-Arginin-, L-Lysin- oder L-Ornithinrest und G ein L-Asparagyl-L-alanyl-glycin-. 1.-Asparagyl-glycyl-i.-alanin-, L-Alanyl-glycvl-L-glut· aminsäure-.' L-Asparagyl-glycyl-t.-glutaminsäureodcr L-Valyl-L-alanyl-glycinrest. der entsprechende Ester oder das entsprechende Amid ist. deren Säureadditionssalze und Komplexe.
8. 1 -a-Aminoisobuttersäure-corticoiropinpcptide der allgemeinen Formel
a-Aminoisobutyryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-mcthionyl-L-glutarnyl-L-histidyl-i.-phenyl-
alanyl-'i.-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-
i.-lysyl-i.-prolyl-i.-valyl-glycyl-X-i.-lysyl-
i.-arginyl-Y
in der X ein L-Lysin- oder i.-()rnithinrcst und Y ein L-Arginin-. 1-Argininester- oder i.-Argininamidrest ist. deren Säurcaddilionssal7c und Komplexe.
9. 1 -a-Aminoisobuttersäure-corticotropinpeptide der allgemeinen Formel
a-Aminoisobutyryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-
methionyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenyl-
alanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-"
L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycy'l-X-L-lysyl-
L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-
L-valyl-L-tyrosyl-Y
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